PT81384B - Processo de preparacao de um complexo imunogenio e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

0 presente invento refere-se a um. complexo imunogénico de um veículo imunogénico ligado a uma ou mais moléculas que se pretendem tornar imunogénicas ou amplificar a sua imunogeneicidade, de modo a induzir a formação de anticorpos para fins de análise de diagnóstico, mal estar e doença, pesquisa de alvos biológicos ou produção de vacinas.

A vacina tem tradicionalmente consistido de microrganismos globais que se tornaram inócuos ou não patogénicos, por meio da sua morte ou atenuação. Por exemplo, os vírus têm sido atenuados por cultura num hospedeiro ou célula hospedeira estranhos, ou têm sido cultivados em outras condições especiais.

A geração seguinte de vacina baseia-se nos complementos de microrganismos específicos responsáveis pela estimulação da imunidade que causa a protecção contra a infecção. Esses componentes podem ainda obter uma capacidade imunogénica au mentada, dispondo-os em multimerformas fisicamente definidas, tais como micelas de proteínas, em vesículas de lípidos (lipossomas), com a condição de que haja uma região hidrofóbica pre. sente (ffiorein et al, 1978, "Effective subunit vaccines against enveloped animal viruses; Nature, 276, 715-718). Tem-se obti do um efeito imunogénico ainda melhor incorporando as proteínas ou peptídeos hidrofóbicos num complexo, (EPO - pedido 83850273.0) a que foi dado o nome de iscom.

Espera-se que a terceira e a quarta geração de vacinas consistam em peptídeos e proteínas produzidas por técnicas de ADN-recombinante, ou peptídeos ou carbohidratos produzidos sin teticamente. Os últimos podem ser produzidos sinteticamente ou podem ser produzidos na forma pura a partir de, por exemplo, ma terial biológico ou possivelmente ligado a uma proteína de pe£ tídeo ou lípido. Muitos desses produtos são produzidos e são vacinas potenciais. Até aqui todos os esforços para tornar es. ses produtos suficientemente imunogénicos com a ajuda de méto-

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-3dos gerais têm tido insucesso, a não ser que os produtos estejam ligados a uma estrutura veículo, tal como albumina de soro de bovino ou a KLH ("Keyhole Limpet Haemocyanine”) por exemplo, e misturados com um adjuvante, por exemplo um adjuvante oleoso. Esses produtos são, contudo, inaceitáveis como vacinas, inter alia porque a estrutura do veículo não pode ser aceite e porque apresenta efeitos secundários pronunciados. Em adição, na maioria dos casos, a dosagem antigene requerida é de 100 a 1000 vezes superior à requerida quando se utilizam estruturas antigene correspondentes para efeitos de imunização e estão pre. sentes no microrganismo; por vezes a dosagem antigene necessá ria pode ser 1000 vezes superior à acima referida.

Quando utilizados de modo convencional, os adjuvantes conhecidos são apenas eficazes quando utilizados nessas altas dosagens e produzem efeitos secundários inaceitáveis. Tem-se ligado covalentemente um adjuvante designado por muranildipeptí deo (MDP) a um antigene (um peptídeo) numa tentativa para evitar este fenómeno, conseguindo-se assim um efeito de adjuvante com MPD em pequenas doses. Arnon, R., Sela, M., Parant, M et Chedid, 1., 1980, Proc. na. Acad. Sc. USA 77, 6769-6772. Este tipo de conjugado é relativamente difícil ou caro de produzir, e têm sido até aqui restringido à fase experimental.

Verificou-se agora que as proteínas e peptídeos, particularmente os que têm sido preparados sinteticamente, carbo. hidratos, glioolípidos e outras moléculas pequenas, por exemplo biotina, e particularmente as que não são suficientemente imunogénicas, podem tornar-se imunogénicas, ligando as mesmas a um veículo imunogénico complexo, chamado iscom, de acordo com EPC-pedido 83850273.0.

Um iscom é um complexo entre um glicósido (adjuvante) e proteínas ou peptídeos antigénicos hidrofóbicos. Estas proteínas ou peptídeos são tais que podem ser aceites para utilização na preparação de vacinas. 0 adjuvante (o glicósido) é sus. ceptível de funcionar no iscom em concentrações muito abaixo das requeridas quando se utilizam adjuvantes na maneira conven cional, e se misturam com o antigéne. Evita-se assim o proble

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-4ma dos efeitos laterais causados pelo adjuvante.

De acordo com o invento pode agora ligar-se um produto iscom contendo um peptideo imunogénico ou uma proteína imunogé. nica, estimulando assim a resposta à imunização inter alia pro. duzindo anticorpos contra ela, às moléculas acima referidas. 0 iscom primário forma a estrutura veículo à qual as moléculas estão ligadas. Nesta maneira os anticorpos são obtidos contra o peptideo ou proteína presente no iscom primário, e contra as moléculas a ele ligadas.

0 iscom primário para ligação de um veículo que por exemplo vai ser utilizado na vacina deve incluir preferivelmen te uma proteína envelope que é em si própria útil como vacina. Podem ligar-se ao iscom primário vários determinantes represen tantes de peptídeos adicionais (epitopos) de diferentes micror ganismos que em si próprios são uma vacina contra um ou mais microrganismos ou vírus. Da maneira descrita, podem ser preparadas vacinas multivalentes.

0 novo complexo tem a mesma estrutura morfológica da estrutura veículo, em observação por microscopia electrénica, isto é o iscom primário. Observa-se contudo, uma alteração na morfologia quando grandes moléculas são ligadas ao iscom primá rio. Os ratos foram imunizados com o complexo de acordo com o invento em dosagens de aproximadamente 1-10 yjtg e deram origem a resposta imune com ausência de quaisquer efeitos secundários observáveis. Pode ser necessário aumentar ou diminuir a dosagem, e imunizar mais de uma vez.

As moléculas ligadas ao iscom primário podem ser peptí. deos, proteínas, carbohidratos ou outras moléculas que, sendo semelhantes aos peptídeos ou proteínas no iscom primário, tenham sido recuperadas de microrganismos (ver adiante) ou repre. sentam determinantes antigénicos dos microrganismos. Se estão disponíveis grandes quantidades de iscom, pode ser mais prático ligar a um iscom preparado esse peptideo ou essa proteína contra as quais se pretendem anticorpos, em vez de preparar um novo iscom.

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-5Essas proteínas e peptídeos ligados em complexo com um iscom primário devem ser hidrofóbicas (cf EPC-pedido 8385O273.O). Essas moléculas ligadas ao iscom primário de acordo com 0 presente invento não necessitam de ser hidrofóbicas, mas necessitam apenas de ter algumas espécie de moléculas de ligação, das quais se apresentam em seguida alguns exemplos

Existem certos tipos de microrganismos que não podem ser cultivados para a produção de vacinas em larga escala. A malária é um exemplo. Sequências de aminoácidos antigénicos (peptídeos) têm sido sintetizados que correspondem a determinantes antigénicos nas proteínas da malária, que se consideram oferecer uma imunidade protectora. Estes peptídeos, contudo, não têm apresentado efeitos imunogénicos suficientes. Faltam a estes peptídeos frequentemente hidrofobicidade adequada para a formação de iscons. Embora seja possível ligar uma molécula hidrofóbica a peptídeos e preparar a partir deles iscom, pode ser mais adequado inter alia a partir de um aspecto técnico ou imunogénico, ligar os peptídeos a um iscom primário que já tenha sido preparado. Isto permite produzir uma vacina combinada, para a malária e por exemplo, poliomielite (poliopeptídeo ligado a complexo dentro de um iscom primário).

Os peptídeos ligados a um iscom primário são preferivelmente sintéticos ou purificados de microrganismos e são fre. quentemente analisados para assegurar que contêm determinantes antigénicos. Um tamanho clássico para 0 epitopo determinante é de 1 a 4 aminoácidos. Eles contêm preferivelmente até 40 aminoácidos, adequadamente entre 10 e 25 aminoácidos. Os peptídeos que possuam mais que 25 aminoácidos são difíceis de sintetizar e tendem a enrolar e esconder os determinantes anti génicos.

Se os peptídeos forem pequenos e contiverem menos do que cerca de 10 aminoácidos, ou se contiverem grupos hidrofóbi. cos que tendem a enrolar ou a dobrar em partes hidrofóbicas no iscom primário, pode ser adequado retirá-los do iscom primário, extendendo-os eom os assim chamados espaçadores, que são cadei

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-6as alifáticas contendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 átomos de carbono, adequadamente 6, 7, 8 átomos de carbono e contendo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 grupos OH, que torna a cadeia alifá tica hidrofílica e um grupo de ligação funcional (como referido na pág.8 ) no final da cadeia, por exemplo um grupo NHg-, COOH-, SH- ou OH-, tais eomo aminas de glicose, ou um peptídeo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10» 11» 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20 aminoácidos, preferivelmente aminoácidos hidrofílicos, por exemplo glicina ou prolina, tais como po. liglicina ou poliprolina. 0 espaçador é ligado em primeiro lu gar e de preferência ao iseorn primário e em seguida ao peptídeo através dos grupos funcionais terminais, utilizando um dos métodos de ligação a seguir referidos.

Exemplos de moléculas que têm sido ligadas a una molécu la veículo incluem proteínas e peptídeos cíclicos ou lineares derivados dos microrganismos a seguir referidos com respeito à preparação do iscom; peptídeos sintéticos lineares ou cíclicos ou peptídeos preparados com a ajuda de técnicas ALN-híbridas com sequências de aminoácidos, por exemplo representativas de malária, peptídeos derivados de polio-vírus, partieularmente 277-300 peptídeos derivados do vírus da Hepatite-B particularmente peptídeos nas regiões 32-74, 110-156; e particularmente peptídeos contendo as sequências de aminoácidos 144-145; vírus da raiva, particularmente peptídeos nas regiões 1-50, 290-320, e particularmente na região 100-175; peptídeos do ví rus da gripe contendo as sequências de aminoácidos 140-146, 187-196 ou escolhidos na região Oys 52-Cys 278 ou 207-220; ví rus da doença da febre aftosa, particularmente os peptídeos e os vírus da doença da febre aftosa 141-160, 144-160, 146-154, 144-150, 142-158; factores de crescimento de células-T (inter leucina II), preferivelmente peptídeos com sequências de amino. ácidos 79-92, 139-153C, 111-125 e 18-320, peptídeos do vírus

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de Epstein Barr, particularmente as sequências A: Asp, Vai,

Gly,	Gly,	Dys,	Dys, His,	Gin,	Dev,	Asp,	Cys,	Deu,	Deu, B:
His,	His,	Ala,	Glu, Asn,	Gin,	Asn,	Pro,	Cys,	Deu,	Deu, C:
Ala,	Trp,	Pro,	Asn, Asn,	Thr,	Glu,	Thr,	Asp,	Phe,	Dys, Cys,
Deu,	Deu;	determinantes	antigénicos de	vírus HTDV 1, 2 ou 3;

peptídeos nas substâncias dos grupos sanguíneos.

De acordo com o invento, é também possível ligar aos peptídeos do iscom primário, polipeptídeos e proteínas de cadeia longa contra as quais se pretendem produzir anticorpos, e em particular hormonas encontradas nos grupos de hormonas este róides, hormonas de peptídeo e prostaglandinas, dos quais se podem mencionar as seguintes como exemplos: tirotropina, adenocorticotrofina, hormona luteinizante, hormona de libertação da gonadotrofina (DHRH), hormona da estimulação do folículo, prolactina, hormona do crescimento, oxitocina, vasopressina, hormona paratiroideia, calcitonina, insulina, glucagona. LÊ também desejável preparar anticorpos contra enzimas que podem ser ligados de acordo com o invento. Podem mencionar-se como exemplo a lisosima e a peroxidase nesta ligação. Estas enzimas podem incluir mais de 40 aminoácidos.

B também possível ligar aos carbohidratos e estruturas contendo carbohidratos de iscom tais como sacarídeos lipopóli. cos,polissacarídeos derivados de microrganismos encapsulados, como por exemplo E. coli; e em particular aos antigenes-K 1-13, "Haemofilus influenza", meningococos, a parte oligossacarídfca das glicoproteínas, nas substâncias dos grupos sanguíneos em gangliósidos, tais como GM1, e gliongangliósidos. Pode con seguir-se uma vantagem prática na produção de anticorpos contra as substâncias do grupo sanguíneo para análises de grupos sanguíneos. Os gliongangliósidos são formados por alterações que ocorrem nos gangliósidos presentes nos tumores do cérebro, e pode ser possível utilizar anticorpos produzidos contra estes gangliósidos para diagnosticar os tumores do cérebro.

Outros exemplos de substâncias que podem ser ligadas ao veículo são as lipoproteínas, outras glicoproteínas e bioti.

na.

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Estas moléculas podem ser ligadas ao iscom primário

ffl

por meio de grupos de ligação funcionais já existentes ou liga dos às moléculas e grupos funeionais no iscom primário, por exemplo em aminoácidos, em proteínas ou peptídeos ou em grupos HO-, CHO- ou HOOC- no glicósido. Aplicam-se neste aspecto re acções de ligação conhecidas. As reacções de ligação mais adequadas para este efeito são:
Grupo funcional da molécula a ser ligada	Reagente de activação	Grupo funcional de Iscom primário
-NH2 ( x ou t)	Glutaraldeído	-NH2(-SH)
	Carhodiimidas	-c°2h
	Diimidoésteres	-nh2
	Diisocianatos	-hh2(-oh)
	MeO-Cl2-triazina	-OH, -SH, -RH2
	Arilhalogenetos	-HH2, -OH, -SH
-co2h	Carhodiimidas	-eh2(-oh)
-SH	MeO-Cl2-triazina	-OH, -SH, -RH2
	Alquilhaloge ne to s	-SH, (-NH2, His)
	Ácido iodoacético+car	-nh2
	bodiimida
	Maleimidas	-SH
-OH (Tyr)	Me0-Cl2-triazina	-OH, -SH, -EH2
	Arilhalogenetos	-HH2, -OH, -SH
Aromáticos com	Compostos bis-diazó-	Aromático
Tyr, His	nio	Tyr, His, lys
CHO	Ajuste do pH a 8	-eh2
Vicinal	formas periodatadas CHO	-nh2
OH	ajuste do pH acima de 8
CHO	Hidrazina
OH	ajuste do pH a 9-10	-hh2
nh2	como acima	CHO, OH

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ra

-9Encontram-se descritos vários grupos e métodos de ligação no "Journal of Immunological Methods", 59 (1983), 129-143, 289-299; "Methods in Enzymology", Vol 93, páginas 280-333; e "Analytical Biochemistry" 116, 402-407 (1981), que se incorpora aqui como referências.

Prepara-se o novo complexo de acordo com o invento produzindo em primeiro lugar um veículo, iscom primário, e ligando a seguir às moléculas que se pretende tornar imunogéni^ cas ou reforçar a sua imunogeneicidade.

I, Preparação do iscom (Iscom primário)

Prepara-se um complexo imunogénico entre proteínas ou peptídeos antigénicos com regiões hidrofóhicas e glicósido mis turando proteínas ou peptídeos possuindo regiões hidrofóhicas com um ou mais agentes soluhilizantes, em que se forma um complexo entre as proteínas ou peptídeos antigénicos monoméricos carregados e o agente soluhilizante, e em seguida se separam as proteínas ou peptídeos antigénicos monoméricos carregados do agente soluhilizante na presença de uma solução de glicósido que contém um ou mais gloeósidos possuindo regiões hidrofóhicas e hidrofílieas numa concentração pelo menos igual à concen tração micelular crítica ou, alternativamente, se separam do agente soluhilizante e se transferem directamente para a solução de glicósido acima referida, e na qual se forma um complexo entre as proteínas ou peptídeos e o glicósido, sendo este complexo isolado e purificado.

As proteínas ou peptídeos com regiões hidrofóhicas que se ligam às regiões hidrofóhicas do glicósido podem ser

A) proteínas ou peptídeos anfipáticos com grupos hidrofílicos e hidrofóhicos derivados de ou sendo proteínas de memhrana ou peptídeos de memhrana de vírus envelope, bactérias, micoplasmas, parasitas ou células animais, ou proteínas ou peptídeos produzidos pela técnica de ADN híhrido, ou moléculas produzidas sinteticamente.

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-10B) proteínas ou peptídeos hidrofilicos tornadas anfipáticos por meio de grupos hidrofóhicos que estão a elas ligados. Estas proteínas ou peptídeos podem ser derivados de vírus, bactérias, micoplasmas, parasitas, células animais, ou podem ser sintetizadas ou obtidas pela técnica de ADN híbri do.

C) proteínas ou peptídeos anfipáticos obtidos por partes hidrofóbicas inacessíveis de proteínas hidrofílicas tornadas acessíveis por processos químicos. Estas proteínas po dem derivar de microrganismos ou células acima mencionadas ou obtidos pela técnica de ADN híbrido, ou podem ser sinte. tizadas.

a) No que diz respeito à preparação de proteínas de membrana ou peptídeos de membrana derivados de células ou vírus totais, a preparação dos complexos compreende em princípio três fases: purificação ou isolamento das células animais ou microrganismos ou seus fragmentos; solubilizando proteí^ nas hidrofóbicas e removendo o agente solubolizante transferindo simultaneamente o antigene pretendido em complexo por meio de glicósido numa forma imunogénica (complexo imu nogénico).

Purificação e isolamento

Os vírus com envelope, micoplasmas, bactérias, parasitas e células animais são concentrados e purificados de modo conhecido (para referências ver "The Tools of Biochemistry", T G Cooper, John Wiley & Sons (1977) Nova Iorque, que aqui se in corporam como referência), por exemplo centrifugando, ultraeen. trifugando, por electroforese e vários métodos de cromatografia tais como filtração de gel, interacção hidrofóbiea, cromatogra fia de afinidade ou centrifugação através de um gradiente de açúcar ou centrifugação de gradiente através de percol ou com diálise de fibras ocas. Para bactérias, pode ser necessário ou mais vantajoso ligar em primeiro lugar ou decompor as pare64 239

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* C. M

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-lides da célula (para referência ver Cota-Robles e Stein, CRC Handbook of Microbiology, Vol II (1973) pp 833-844, que se incorpora aqui como referência) comopor exemplo o tratamento de ultrassons ou de prensa francesa por exemplo.

Solubilização

As células animais ou microrganismos ou os seus fragmentos são em seguida misturados com detergente não-iónico ou zuiteriónico, que se utiliza em excesso. Exemplos típicos de detergentes não-iónicos são os ésteres de poliglicol e éteres de poliglicol com ácidos alifáticos ou aralilfáticos e álcoois. Exemplos destes compostos são os alquilpolioxietileno éteres com a fórmula geral ^Hg^iíOC^C^^OH, que se abrevia para CE, alquilfenil polioxietileno éteres contendo um anel feni11 A.

lo entre o grupo alquilo e a cadeia de polioxietileno, abrevia do para por exemplo Triton X-100 = terc.-Cg|Eg g (octil

fenol éter ou óxido de polietileno), e ésteres de acilpolioxietileno; ésteres de aeilpolioxietileno sorbitano, abreviado por C sorbitano E , por exemplo Tween 20, Tween 80, A -D-alquilglicósidos, por exemplo £ -L-octilglicósido. Os glicósidos mencionados a seguir podem também ser utilizados, especial mente a saponina. Estes são contudo detergentes fracos e devem ser utilizados juntamente com outros detergentes. Exemplos típicos de detergentes iónicos adequados são os detergentes de ácido gálico tais como por exemplo desoxicolato e colato. Mesmo os detergentes conjugados tais como por exemplo taurodesoxicolato, glicodesoxicolato e glicocolato podem ser utilizados. Possíveis detergentes zuiteriónicos são lisolecitina e lisofosfolípidos sintéticos. Podem utilizar-se também misturas dos detergentes acima mencionados.

A solubilização pode também ser efectuada com álcoois, solventes orgânicos ou pequenas moléculas anfipáticas como por exemplo heptano-1,2,3-triol, hexano-1,2,3-triol, ácido acético, peptídeos solúveis e proteínas ou suas misturas, solúveis em água ou com detergentes.

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0 agente solubilizante é utilizado em excesso em relação à quantidade de lípidos e proteínas hidrofóbicas. As células ou microrganismos adequados e o detergente são misturados na relação em peso de 1:3 a 1:10.

As células ou microrganismos e o agente solubilizante são misturados se possível em solução salina tamponada. A molaridade da solução salina é de entre 0,02 e 0,5 preferível mente entre 0,05 e 0,25 M. Prefere-se 0,1-0,2 M. 0 detergente deve actuar durante cerca de 1 hora à temperatura ambiente.

Prefere-se o cloreto de sódio como sal, mas podem também ser considerados outros sais, especialmente os sais de iões alcalinos, iões alcalino terrosos e iões de amónio e ácidos inorgânicos e orgânicos fortes como por exemplo ácido acético, ácido tricloroacético, ácido fórmico e ácido oxálico. To das as substâncias são adequadas, como tampão, se tamponarem no intervalo de pH 6,5-9· Quando se utilizam eolatos e desoxi colatos, prefere-se pH 8-9» θ quando se utilizam detergentes não-iónicos, pH 7,4. Quando se utilizam ácidos orgânicos para a solubilização de proteínas, pode omitir-se o tampão.

Preparação de complexos imunogénicos

Quando se solubilizaram células ou microrganismos, for ma-se uma mistura de agente solubilizante e fragmentos de célu las ou microrganismos (de agora em diante referidos como fragmentos). De entre os fragmentos existem proteínas antigénicas monoméricas carregadas com regiões hidrofóbicas em complexo com o agente solubilizante. 0 complexo imunogénico (iscom pri. mário) é produzido separando as proteínas antigénicas monoméri. cas carregadas do agente solubilizante na presença de, ou por transferência directa para 1 ou mais glicósidos que devem possuir regiões hidrofóbicas e hidrofílicas e estarem presentes numa concentração pelo menos a concentração de micelas crítica.

0 resto dos fragmentos é removido antes de se produzir o complexo de acordo com o invento, enquanto se está a produzir, ou após, de preferência antes.

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-130 complexo veículo pode ser produzido quer por remoção do agente solubilizante por exemplo por diálise, filtração de gel ou cromatografia da mistura de agente solubilizante, proteínas antigénicas monoméricas carregadas, glicósidos e possivelmente outros fragmentos ou por separação das proteínas anti. génicas monoméricas, carregadas da referida mistura, por exemplo por centrifugação^gradiente, cromatografia ou electroforese. A caracteristica essencial é de que as proteínas antigéni cas monoméricas carregadas sejam separadas do agente solubilizante durante a presença simultânea do glicósido ou sejam direç. tamente transferidas para o glicósido após separação, devendo estar a forma micela deste presente. Quando se separaram as proteínas antigénicas monoméricas do agente solubilizante de modo a que possam entrar directamente em contacto com o glicósido, forma-se o complexo especial de acordo com o invento. Admite-se que a forma de micela do glicósido seja a base para a formação do complexo e que este seja formado por atracção entre as regiões hidrofóbicas das micelas do glicósido e as regiões hidrofóbicas nas proteínas de membrana. A quantidade de glicósido no complexo varia dependendo do glicósido utiliza do e das proteínas de membrana ligadas ao complexo e é de entre 0,5 e 50% em peso, espeeialmente entre 0,5 e 25% em peso, preferivelmente entre 0,5 e 15% e frequentemente entre 0,5 e 10% e espeeialmente entre 2 e 8% em peso. Se se separam as proteínas antigénicas monoméricas carregadas do agente solubilizante na ausência do glicósido, formam-se contudo as micelas de proteína do tipo produzido de acordo com o Pedido EPC No. 81102213.6.

Devem-se remover os outros fragmentos por centrifugação de gradiente dado que a constante de sedimentação para os componentes envolvidos diminui na seguinte ordem: fragmento de célula, complexo de proteína com agente solubilizante ou com glicósido, proteínas monoméricas e agente solubilizante. Assim, podem remover-se os outros fragmentos por centrifugação de gradiente da mistura do agente solubilizante, proteínas monoméricas, e outros fragmentos antes de se adicionar o

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23. ÉE

-14glicósido e de se remover o agente solubilizante, por exemplo por diálise, filtração de gel, cromatografia ou se separarem proteínas monoméricas do agente solubilizante, por exemplo por electroforese, cromatografia ou centrifugação de gradiente. No último método, é também possível remover os outros fragmentos durante a mesma centrifugação de gradiente, quando se forma o complexo. E também possível separar outros componentes de cé. lula após se ter formado o complexo de acordo com o acima referido por exemplo por centrifugação, cromatografia de afinidade ou filtração de gel.

0 glicósido pode ser qualquer glicósido com regiões hidrofóbicas e hidrofílicas. Utilizam-se preferivelmente as saponinas que se descrevem em R. Tschesche and Y/ulf, Chemie und Biologie der Saponine in Portschritte der Chemie Organischer Naturstoffe", publicado por W.Herz , H. Grisebach, G.W. Kirby, Vol 30 (1973), especialmente as saponinas fortemente polares, primariamente as triterpensaponinas polares tais como os bisdesmósidos ácidos polares, por exemplo extracto de sa ponina de "Quillajabark Araloside A, Chikosetsusaponen IV, Calendula-Glycoside C, Chikusetsusaponin V, Achyranthes-Saponin B, Calendula-Glycoside A, Araloside B, Araloside C, Putranjia-Saponin III, Bersamasaponoside, Putranjia-Saponin IV, Trichoside A, Trichoside B, Saponaside A, Triehoside C, Gypsoside, Nutanoside, Dianthoside C, Saponaside D", preferivelmente esci na de "Aesculus hippocastanum" (T. Patt e W. Winkler: "Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforschung" 10 (4), 273-275 (1960) ou sapoalbina de "Gypsophila struthium" (R. Vochten, P. Joos e R. Ruyssen: "Physico-chemical properties of* sapoalbin e their re. lation to the foam stability", J Pharm Belg 42, 213-226 (1968), especialmente extracto de saponina de"Quillaja saponaria Molina", primariamente o extracto DQ que é produzido de acordo com

K.Dalsgaard: "Saponin Adjuvants", Buli Off Int Epiz 77 (7-8), 1289-1295 (1972) e Quil A que é produzido de acordo com K. Dais gaard: "Saponin Adjuvants III, Archiv for die Gesamte Virus64 239

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-15forschung 44, 243-254 (1974). Podem também utilizar-se misturas de glicósidos. A quantidade de glicósidos adicionada deve ser de pelo menos 1 a 3 vezes a sua concentração crítica para a formação de micélas (CMC), preferivelmente pelo menos 5, especialmente pelo menos 7-12 vezes. Admite-se que o glicósido nesse caso possa estar ligado a e prender as formas monoméricas das proteínas de membrana. Utiliza-se preferivelmente Quil A, que tem uma concentração crítica para a formação de mi celas de 0,03% em peso. A quantidade de Quil A deve ser entre pelo menos 0,02% em peso, espeeialmente 0,05-0,5% em peso, pre. ferivelmente 0,2% em peso. As referências acima feitas no que diz respeito aos glicósidos são incorporadas como referências.

A separação das proteínas antigénicas monoméricas carregadas do agente solubilizante têm sido feita por centrífuga ção, electroforese de diálise, e diferentes métodos cromatogra ficos.

Método de centrifugação

A mistura de células ou microrganismos fragmentados e agente solubilizante preparada de acordo com o acima referido é centrifugada por gradiente e colocada no cimo de uma solução de açúcar ou de sal, contendo agente solubilizante, no qual es tá presente um gradiente contendo o glicósido, tal como/gradiente de açúcar ou um gradiente de glicerol ou uma amida metrize ou um sal pesado, por exemplo CsCl (isto é substância relativamente inerte que têm densidade e viscosidade adequada para actuar como material gradiente), por exemplo com as concentrações para um gradiente de açúcar dadas a seguir.

0 sistema de gradiente é centrifugado a pelo menos 100 000 g (dependendo do tempo e do gradiente, escolhido pelas circunstâncias práticas). Podem usar-se como açúcares monossa carídeos tais como glicose, lactose, maltose, dissacarídeos tais como sacarose, mas também trioses, tetroses e glicerina. Utiliza-se de preferência a sacarose. A concentração de açúcar no gradiente é adequadamente de pelo menos 5%, preferivelmente

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de 15-25% em peso como concentração inicial (parte superior do gradiente) e a concentração final é de pelo menos 20%, preferi, velmente 45-60% em peso (parte inferior do gradiente). 0 gradiente pode consistir por exemplo de uma fase superior com 5-25% em peso de açúcar e uma fase inferior com 20-60% em peso de açúcar. Contudo podem também existir várias camadas sendo as diferenças de concentração entre as camadas individuais reduzidas correspondentemente. 0 gradiente de açúcar contém um glicósido ou uma mistura de glieósidos. A quantidade de glic£ sido deve ser 1-3, especialmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 7-12 vezes a CMC para Quil A, pelo menos 0,02, espe. cialmente pelo menos 0,05-0,5, preferivelmente pelo menos 0,02% em peso. Neste gradiente contendo o glicósido, separa-se o agente solubilizante, e transforma-se o complexo entre o agente solubilizante e a proteína no complexo proteína-glicósido.

Na parte superior do gradiente de açúcar existe uma ca mada de uma solução de açúcar ou de sal pesado que contém agen, te solubilizante ou uma mistura de agentes solubilizantes; os lipidos permanecem nesta camada. A concentração de agente solubilizante nesta camada é inferior ou igual à mistura aplicada de microrganismos ou células e de agente solubilizante e es. tá adequadamente entre 0,25 e 3% em peso, preferivelmente entre 0,75 θ 1,5% em peso, sendo preferível 1% em peso. A concentração de açúcar ou de sal pode ser a mesma ou inferior à concentração na camada superior do gradiente contendo glicósido inferior, preferivelmente 5-25% em peso, especialmente 15% em peso de açúcar.

Após centrifugar a pelo menos 100 000 g durante pelo menos 16 horas, preferivelmente durante 20 h a 20^0, recolhem-se as fracções proteinaceosas e dialisam-se contra um tampão (0,5 M para 0,001 ffi) preferivelmente Tris-HCl 0,005 ffi, NaCl 0,01 ffi, pH 7,4 ou tampão de acetato de amónio 0,2 ffi, pH 7,0 e concentra-se por exemplo da forma descrita em "The Tools of Bio. chemistry" por T.G. Cooper, editado por John Wiley & Sons (Nova

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-17Iorque 1974), que se incorpora aqui como referência, por exemplo por liofilização, diálise em vazio e ultra-filtração. Durante a centrifugação, todos os constituintes se depositam e o agente solubilizante sai do complexo de proteína e do agente solubilizante, e as proteínas monoméricas são transferidas para o glicósido e formam com ele complexos. Na diálise posterior, separa-se o açúcar.

0 complexo pode possivelmente ser purificado adicionalmente, por exemplo a partir de glicósido livre por gradiente de

) centrifugação nor exemplo por um gradiente de açúcar contendo 26-60% em peso de açúcar, preferivelmente 10-40% em peso de sacarose. Método de diálise

Após purificação das células ou dos microrganismos da forma acima descrita e após terem sido misturados com o agente solubilizante na proporção em peso acima referida, a mistura de células e agente solubilizante, no tampão acima referido, pode alternativamente ser misturada directamente com pelo menos 1-3, preferivelmente 7-12 vezes CMC para Quil A 0,05-2% em peso de glicósido, preferivelmente 0,2% em peso de glicósido, e dialisada contra o tampão tal como 0,5 -0,001 ffi, preferi, velmente Tris-HCl 0,005 M, NaCl 0,01 M, pH 7,4, especialmente

) tampão de acetato de amónio 0,2 M, pH 7,0. Este facto separa o agente solubilizante na presença do glicósido. 0 complexo de proteína de membrana produzido pode em seguida ser isolado por sedimentação por centrifugação de gradiente, da forma descrita na pág. 15 segundo parágrafo, sendo contudo o aditivo glicósido excluído e liberto de outros fragmentos e liberto de glicósido.

A mistura de células e de microrganismos e agente solu bilizante no tampão pode também ser centrifugada por gradiente e por exemplo ser colocada num gradiente de açúcar com 5-60% em peso no tampão acima referido, preferivelmente um gradiente de sacarose com 10-12% em peso, e centrifugada pelo menos a 150 000 g durante pelo menos 20 minutos, preferivelmente 30

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ra

-18minutos a 250 000 g. Os outros fragmentos são em seguida sepa rados no complexo entre agente solubilizante e proteína.

0 líquido superior proteinaceoso, chamado fracção supe rior, é extraído e adiciona-se o glicósido numa quantidade de

1-3, preferivelmente pelo menos 7-12 vezes CMC para Quil A 0,05-0,5% em peso, preferivelmente 0,2% em peso, e é dialisado contra tampão 0,5-0,001 M, especialmente Tris-HOl 0,005 Μ, H01 0,01 M, pH 7,4, preferivelmente acetato de amónio 0,2 M, Remo, ve-se o agente solubilizante na presença do glicósido. Após purificação adicional com centrifugação de gradiente e sedimen tação (ver pag, 15, 22. parágrafo). Pode ser efectuada purifi cação adicional por centrifugação através de um gradiente de açúcar contendo 5-60% em peso de açúcar, preferivelmente 20-50 ou 10-40% em peso de açúcar.

Método de electroforese

Alternativamente, separa-se a mistura de microrganismos ou células fragmentados e de agente solubilizante ou do lí quido superior proteinaceoso (removendo-se outros fragmentos e o agente solubilizante livre) que se obtém, quando esta mistura é centrifugada por gradiente por exemplo por um gradiente de açúcar de 5-60% em peso, preferivelmente 20-50% ou 10-40% em peso em tampão, por electroforese do agente solubilizante e transfere-se para uma solução contendo pelo menos 1-3, preferi, velmente pelo menos 7-12 vezes CMC, para Quil A 0,05-0,5% em peso de glicósidos, preferivelmente 0,2% em peso de glicósido. Separam-se em seguida as proteínas antigénicas monoméricas carregadas do agente solubilizante. Para a separação por ele£ troforese, é adequado que a solução tampão-agente solubilizante não contenha sal extra adicionado que possa interferir com electroforese e produzir uma temperatura excessivamente elevada. É possível usar por exemplo uma zona de electroforese com ou sem veículos e isotaeoforese com ou sem veículos. Pode uti

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-19lizar-se substâncias comuns como veículos tais como poliacril amida, ágar, sílica gel, amido, celulose, policloreto de vinilo, permuta iónica, celite. 0 isolamento e concentração dos complexos é feito como descrito nas pag. 16 e 17_rlinhas 35-34 e l,resp. A purificação a icional com centrifugação por gradientes (ver pág. 17 linhas 8 a 11*

Se estão presentes proteinas de membrana hidrofóbica com várias cargas ou peso no material de partida, é possível com electroforese ou centrifugação separá-las umas das outras e produzir complexos separados delas. Nestas condições é possível separar e enriquecer complexos de várias proteínas de membrana.

Métodos Oromatográficos

As proteínas solubilizadas podem opcionalmente, após serem purificadas de fragmentos de células serem separadas do agente solubilizante por métodos oromatográficos, por exemplo filtração de gel, cromatografia hidrofóbica ou cromatografia de afinidade por exemplo cromatografia de permuta iónica, sendo a estrutura de antigéne adsorvida num substracto insolúvel, (matriz) que pode consistir de por exemplo celulose, agarose, dex trano, acrilamida e vidro. Ligam-se diferentes ligantes à estrutura da matriz que em seguida recebe as propriedades especi ficas que se utilizam durante a separação. A estrutura de antigene é geralmente adsorvida ao mesmo tempo que o agente solu bilizante utilizado passa não adsorvido através da matriz. Em seguida segue-se a desadsorção do antigene. Antes ou durante a desadsorção pode ter lugar uma permuta do agente solubilizan te, sal e substância tampão, sendo o agente solubilizante subss tituível pelo glicósido e formando-se o complexo.

Na cromatografia de permuta iónica, ligam-se as molécu las de ligante carregado como por exemplo dietilaminoetilo (DEAE) à matriz e utilizam-se como permutadores de catiões. 0 método carboxílico (CM) ou grupos fosfato (P) são ligados à ma

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-20triz e utilizados como permutadores aniónicos. Utilizando dife renças na carga bruta entre as estruturas de antigene e do agen te solubilizante, separam-se estas moléculas. 0 agente solubi lizante é em geral neutro e a proteína carregada. Efectua-se a eluição com 0 gradiente de sal comopor exemplo K- ou NaOlou ajuste de pH com um tampão adequado, por exemplo tampão de fosfato na presença de um agente solubilizante (no que diz res. peito à concentração e exemplos ver a secção Solubilização aci ma descrita). Na eluição pode purificar-se a proteína, permutando 0 agente solubilizante ou 0 agente formado se 0 glicósido se adicionar ao eluente em vez do agente solubilizante. Re movem-se em seguida os sais, por exemplo por diálise ou filtra ção de gel.

Na filtração de gel faz-se uso do facto do peso molecu lar do agente solubilizante ser inferior ao das estruturas de antigene e sair em fracções subsequentes. Após a formação de complexo 0 tamanho as estruturas contendo antigene aumentam e saiem da zona que contêm 0 detergente.

Por meio de cromatografia de imunoafinidade os anticorpos podem ser ligados irreversivelmente à matriz acima refe. rida, utilizando em seguida as especificidadee afinidade únicas dos anticorpos para purificar a estrutura de antigene desejada. 0 agente solubilizante não tem afinidade para anticorpos. Efeçj tua-se a eluição por desnaturação moderada, por exemplo redução de pH a cerca de 2,5 e na presença de agente solubilizante ou de glicósido.

Na cromatografia com lectina utilizam-se lectinas, um grupo de proteinas capaz de reagir reversivelmente com grupos de açúcar específico, que tornam possível para eles ligarem-se a glico-proteínas, por exemplo, liga-se a lectina com ligante a por exemplo Sepharose (Pharmacia, Uppsala) ou compra-se já ligado a uma matriz adequada. Os detergentes (agentes solubilizantes) não têm afinidade para a lectina imobilizada. A estrutura de antigene adsorvida é geralmente desadsorvida por

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ISB

-21adição de açúcar de baixo peso molecular, possivelmente metila do, que não tem afinidade para a lectina em questão, como por exemplo manose, metil manósido, glicósido, metil glicósido e N-acetil glicosamina dissolvida em solução salina tamponada na presença de agente solubilizante ou de glicósido.

Na cromatografia covalente, liga-se uma estrutura de antigene como um grupo tiol com uma ligação covalente à matriz. 0 grupo tiol do antigene é selectivamente ligado a um grupo tio-activado ligado a uma matriz adequada por meio de permuta de tio-dissulfureto. Esta ligação é reversível, e após remoção por lavagem do agente solubilizante, a estrutura de antigç ne contendo tiol pode ser eluida por redução do dissulfureto pelo mercapto etanol ou ditiotrietol na presença do agente solubilizante ou glicósido.

Cromatografia bidrofóbica

Esta técnica utiliza a interacção de um ligante hidrofóbico imobilizado do tipo alifático ou aromático como por exemplo alquilo, isto é octilo ou fenilo e superfícies hidrofó bicas da proteína ou de outra estrutura de antigene. Uma adsor ve a força iónica elevada por, por exemplo sulfato de amónio, e eluí a força iónica baixa com água ou etilenoglicol.

Quando os complexos contêm proteínas de membrana de bac térias, pode ser então vantajoso decompor em primeiro lugar as paredes da célula antes do material da célula ser tratado pelo processo acima referido. Exemplos de bactérias a partir das quais se podem obter proteínas hidrofóbicas são por exemplo Escherichia, Staphylococci, Haemaophiluz, por exemplo H. influ enzae, Bordetella, por exemplo B. pertussis, Vibrio, por exemplo V. cholerae, Salmonella, por exemplo S. typhi, S. paratyphi, preferivelmente 0 factor de aderência em Coli, por exemplo pili K 88 e proteína de porin em por exemplo Salmonella ou outras proteínas de membrana de B. pertussis e Neisseria menin. gitidis.

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Exemplos de vírus com envelopes utilizáveis são Orthomyxoviridiae tal como influenza A,B,C, Paramyxoviridiae, especialmente vírus da varicela, vírus da papeira, vírus da para-gripe 1,2,3 e 4, vírus da febre canina e vírus da peste do ga do, Rhabdovidiae, especialmente o vírus da raiva, Retroviridiae, especialmente o vírus da leucemia de felino e vírus da leu cernia de bovino, vírus lymphotrophic das células -T Humanas HT1V 1, 2 e 3, Herpesviridiae, especialmente Pseudorabies, Her pes simplex I e II, vírus Cytomegalo, Coronaviridae, Togaviridae, como por exemplo EEE, WEE, VEE (Encefalite de equinos ori entais, ocidentais e da Venezuela), vírus da febre amarela, es. pecialmente o vírus da diarreia, vírus de bovino e vírus Arena viridae da febre do suíno Europeu, Poxviridae, Bunyaviridae, especialmente vírus Huntan, Iridioviridae, especialmente o vírus da febre do porco Africano e de entre os vírus não classificados, o vírus da hepatite-B humana e o vírus de Iiarburg-Ebola.

Exemplos de parasitas que podem ser utilizados de acor do com o invento são Protoza, como por exemplo Toxoplasma, por exemplo Toxoplasma gondii, Plasmodium, por exemplo Plasmodium vivax, maláriae, falciparium, Teileria parvum, ovale e Eilaroi dae, preferivelmente Parafilaria e Onchocerca, Entamoeba histo. lytica, anaplasma ou vários tipos, Schistosoma como por exemplo Schistosoma haematobium, mansoni, japonicum, e Trypanosoma, por exemplo Trypanosoma gambiense, brusei ou congolesi.

b) E também possível começar de proteínas de não-membrana hidrof óbicas ou de proteínas não-hidrofóbicas ou peptídeos. As proteínas ou peptídeos não-hidrofóbicos podem ser tornados hidrof óbicos ligando os grupos hidrofóbicos a eles. As proteínas não-hidrofóbicas podem derivar de vírus com ou sem envelope, bactérias, microplasma, parasitas. Exemplos de vírus sem envelope com proteínas não-hidrofóbicas são Picornaviridae (tam bém considerados como tendo proteínas hidrofóbicas) por exemplo o vírus da doença da febre aftosa, vírus da poliomielite, Adenoviridae, Parvoviridae, por exemplo vírus da peste felina e

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-2bparvovirus do porco, Reoviridae, por exemplo Rotavirus. Exemplos de microplasma são 1. pneumoniae, mycoides, bovis, suis,

hyorinos, orale, salivarium, hominis e fermantans.

Estas proteínas ou peptídeos podem ser obtidos purificados como descrito em a) Purificação e isolamento.

0 grupo hidrofóbico que pode ser ligado às proteínas não-hidrofóbicas são cadeias alifáticas lineares, ramificadas, saturadas ou insaturadas possuindo preferivelmente 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 1b, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 átomos de carbono ou amino. ácidos ou peptídeos hidrofóbicos ou outras estruturas hidrofóbicas como por exemplo esteroides. 0 comprimento ua estrutura hidrofóbica é adaptada ao tamanho e natureza da proteína. Como exemplo pode mencionar-se que um peptídeo com 10-15 aminoácidos (vírus da doença da febre aftosa) adequado, é obtido com dois tirosinas nos terminais de amino ou carboxi. Uma pro. teína com o peso molecular de 70 000 daltons necessita de cerca de 20 aminoácidos hidrofóbicos. 0 ensaio é feito empiricamente. Assim utilizam-se especialmente peptídeos com um a 20 aminoácidos, preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5 aminoácidos, especialmente escolhidos de entre Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu, Var, especialmente Tyr; derivados de colesterol derivados como por exemplo ácido de colina, ácido de ursodesoxicolina.

Estes grupos hidrofóbicos devem ser ligados a grupo funcional que pode ser ligado à proteína não-hidrofóbica. 0 grupo funcional pode ser escolhido de entre os mencionados na pág. 8 como por exemplo grupos carboxilo-, amino-, dissulfureto-, hidroxilo-, sulfidrilo- e carbonilo, como por exemplo grupos aldeido.

Como grupos de ligação em estruturas hidrofóbicas escolhem-se preferivelmente grupos carboxilo, aldeido, amino, hi droxilo ou sulfidrilo e peptídeos contendo Cys, Asp, Glu, Lys.

Os grupos hidrofóbicos com um grupo que pode ser ligado devem ser dissolvidos em água com a ajuda de por exemplo agente solu

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bilizante e detergentes acima referidos ou ácido clorídrico, áci do acético, líquido cáustico, amoníaco, dependendo da substância que se pretende dissolver. Ajusta-se o pH para neutro sem precipitar a substância; isto para assegurar que não se obtém um pH que decomponha a proteína à qual se pretende ligar o gru po hidrofóbico.

A molécula hidrofóbica é adicionada à proteína não-hidrofóbica na proporção de 10:1 para 0,1:1 preferivelmente 1:1.

Os grupos hidrofóbicos com um grupo carboxilo como molécula de ligação podem ser ligados à proteína por meio de car bodiimidas ou anidridos mistos soláveis em água. No primeiro caso activa-se o grupo carboxilo a pH 5 com carbodiimida e mis. tura-se com a proteína dissolvida em tampão a pH 8 com um teor elevado de fosfato. No último caso, o composto carboxi é feito reagir com isobutilcloroformato na presença de trietilamina em dioxano ou acetonitrilo e adiciona-se o anidrido resultante à proteína a pH 8 a 9· E também possível converter o grupo carboxilo com hidrazina para hidrazida que juntamente com aldeídos e cetonas em unidades de açúcar oxidadas com periodato na proteína produzem as ligações de hidrazona.

Os grupos amino com vários ácidos nitrosos a baixa tem peratura podem ser convertidos em sais de diazónio, que dão li. gações azo com Tyr, His e Lys.

Os grupos hidroxilo com anidrido succinico podem ser convertidos em derivados hemisuccinatos que podem ser ligados como grupos carboxilo.

Os grupos aldeídos podem ser feitos reagir com grupos amino na proteína para uma base de Schiff.

As proteínas ou peptídeos reduzidos desta maneira tendo recebido grupos hidrofóbicos são em seguida ligadas a complexo com glicósido do modo descrito em a), mas aqui as fases de purificação para a remoção de fragmentos de células podem ser omitidas.

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l_U.

4Heg

-25c) È também possível começar com proteínas hidrofílicas possu indo grupos hidrofóbicos retidos e torná-las em seguida acessí veis por desnaturação de proteínas isto é, com um pH baixo de cerca de 2,5 ureia 3 Ií ou a uma temperatura elevada acima de 7020. Essas proteínas podem ser imunoglobulinas tais como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e certas proteínas de vírus tais como as proteínas do vírus da poliomielite. As imunoglobulinas podem ser utilizadas como anticorpos antidiotípicos. As proteínas são obtidas purificadas como proteínas do modo descrito em b) e em seguida ligadas a um complexo do modo descrito em a) sendo omitidas as fases de purificação para a remoção de fragmentos de células.

Quando se parte de proteínas ou peptídeos purificados ou sintéticos de acordo com b) ou c), eles têm tendência para se agregarem na forma de micélas durante a preparação de iscons. Assim, a adição de um ou mais lípidos, particularmente colesterol ajuda a formação do complexo primário. Os lípidos são adicionados à proteína ou peptídeo como agentes solubilizantes. A quantidade não é crítica. A proporção molar de lípi do em relação à proteína ou peptídeo deve ser de pelo menos líl. Pode em seguida ser utilizado um dos quatro métodos acima referidos. Quando se utilizam lípidos radioactivos, não po. de ser detectada radioactividade no complexo imunogénico primá rio.

Os peptídeos/polipeptídeos hidrofílicos podem ser liga dos covalentemente a ácidos gordos incorporados em lipossomas consistindo de por exemplo colesterol, fosfatidilcolina e ácidos gordos numa proporção de 1:7:2. 0 peptídeo/polipeptídeo é

extraído dos lipossomas com um detergente e separado do lípido em excesso por centrifugação num gradiente de detergente conten. do sacarose (10-30% de sacarose).

Os iscons podem ser obtidos da maneira acima referida, preferivelmente pelo método de centrifugação ou diálise. Utilizando o método de centrifugação, pode utilizar-se Triton X-100

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-26para solubilização do complexo de lipossoma. Utilizando o méto do de diálise deve ser possível ao detergente sair por diálise (por exemplo Octilglicósido).

0 complexo primário imunogénico pode ser utilizado para imuno-estimulação específica em seres humanos e animais. Pode ser assim utilizado como vacina contra doenças causadas por bactérias, vírus, micoplasmas e parasitas e para produzir anti. corpos para investigações contra proteínas de membrana de vári. as células animais.

Podem também ser adicionadas várias misturas de bactérias ou vírus para produzir vacinas contra várias doenças. Po. de também ser utilizado como veículo de acordo com o invento.

II· Preparação do complexo de acordo com o invento

A molécula contra a qual se produzem anticorpos é liga da à molécula veículo com a ajuda de iscom primário liofilizado ou as soluções obtidas na preparação de iscom por centrifugação, diálise, electroforese ou com a ajuda dos métodos de cromatografia acima referidos, ou as soluções que permanecem posteriormente à purificação adicional por centrifugação com so_ lução de sacarose.

Quando preparado de acordo com o método de centrifugação, o iscom primário é obtido numa mistura de tampão de gradi. ente (ver o método de centrifugação), por exemplo uma mistura tampão açúcar. Remove-se o açúcar por diálise contra ou filtração de gel em, por exemplo Sephadex® G 50, para um tampão que é depois utilizado, quando se liga o iscom primário â molécula que se pretende tornar antigénica. Alternativamente, u tiliza-se um tampão volátil como por exemplo acetato de amónio, que se separa quando a mistura é subsequentemente liofilizada.

Na aplicação do método de diálise, pode efectuar-se a diálise contra os tampões acima referidos, ou diálise adicional, ou filtração de gel, para mudança de tampão.

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-27Quando se aplicam métodos cromatográficos ou electroforéticos obtém-se o iscom primário em soluções tampão ou, quando as soluções são posteriormente purificadas, opcionalmente num gradiente, por exemplo em soluções de tampão açúcar. Estas soluções podem também ser tratadas de acordo com o acima mencionado, para permuta de tampão ou liofilização. A solubilidade da molécula que se pretende ligar ao iscom primário decide o pH no qual se pode efectuar a ligação, e em segui da também os processos de ligação que podem ser aplicados.

) Ê frequentemente sabido quais os grupos da molécula

que são relevantes como determinantes de antigene. 0 reagente âe ligação não deve reagir com esses determinantes mas deve ser escolhido de modo que se façam reagir outros grupos funcio. nais durante o processo de ligação. Utilizam-se normalmente grupos amino terminais ou grupos carboxilo no caso de peptídeos ou proteínas naturais. Os peptídeos sintéticos podem ser provi, dos com grupos tirosina ou grupos succinilo por exemplo, e serem ligados a grupos amino primários através de compostos de azónio ou ajustando o pH a aproximadamente 8, respectivamente. Os métodos de ligação seguintes são preferidos.

Os grupos funcionais compreendem grupos cisteina liga| dos uns aos outros por reacção com éster de maleinimido benzoil—N-hidroxi-succinimida, grupos sulfohidrilo, ligados a grupos amino por diazotação, grupos amino ligados a outros grupos amino com cloreto de 4-hidroxi-3-nitro-metil-benzimidato, grupos carboxilo ligados a grupos amino através de carbodi. imidas solúveis em água ou anidridos mistos, grupos amino, que foram convertidos em sais de diazónio e ligadas via ligações azo a Tyr, His e Lys, grupos hidroxilo que foram convertidos com anidrido de ácido succínico a derivados hemisuccinato e li gados a grupos carboxilo, grupos aldeido que foram feitos reagir com grupos de uma base de Schiff, grupos succinilo em peptí deos sintetizados ligados a aminas primárias por ajuste de pH <5, grupos hidroxilo que foram feitos reagir com anidrido de ácido succínico para formarem derivados hemisuccinato que foram

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ligados a grupos carboxilo, grupos OH vizinhos que foram conver tidos em grupos CHO, por exemplo com periodato e ligados a gru pos amino por ajuste do pH >8, grupos amino que foram ligados com gluteraldeido para grupos amino-ou sulfidrilo com diimidoésteres para grupos amino, com diisocianatos para grupos amincou hidroxilo, grupos amino-,hidroxilo·*ou sulfidrilo que foram ligados mutuamente dois a cLois com metoxi-dicloreto-triazina, grupos amino-ou hidroxilo que foram ligados a grupos amino-, hi. droxilo-ou sulfidrilo com aril-halogenetos, grupos sulfidrilo que foram ligados a grupos sulfidrilo ou amino com halogenetos de alquilo a grupos amino com ácido iodo-acético e carbo diimida ou a grupos sulfidrilo como maleimidas, grupos aldeido-, carboxilo-e amida que se ligam com hidrazina para formarem ami. nas primárias com ajuste de pH a 9-10.

Pode ligar-se um grupo amino a outro grupo amino por diazotação da maneira seguinte.

As proteínas ou peptídeos são cada um feito reagir por si com aproximadamente 20 mlví de cloreto de 4-hidroxi-3-nitro-metil-benzimidato (MHNB) em aproximadamente 0,1 M de um tampão de borato (pH 9,0) à temperatura ambiente. 0 grau de modi. ficação de proteína com ffiHNB pode ser controlado pelo tempo de reacção. Após 30 minutos dialisa-se a solução reaccional contra um tampão de borato 0,1 M durante a noite a pH 8,0. Os grupos nitro são em seguida reduzidos com aproximadamente 1 mg/ /ml de ditionito de sódio durante 1 a 2 minutos à temperatura ambiente. Removem-se os reagentes numa coluna de Sephadex-G-25 num tampão de borato 0,1 M, pH 8,0, ou por diálise contra um tam pão de borato 0,1 M, pH 8,0, durante 2-6 horas a +4²C, e contra um tampão de borato 0,1 M pH 4, a +4²C durante a noite. Os gru pos amino são diazotados a 0²C com HalK^ 0,1 M a pH durante um (1) minuto, após o que o pH é rapidamente ajustado a 8,5· Adi. ciona-se em seguida a outra proteína ou peptideo, preferivelmente o iscom, preferivelmente dissolvido num tampão de borato a pH 8,5, à temperatura ambiente. Remove-se o nitrito por diá lise contra um tampão de borato 0,1 M, pH 8,0.

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-29Este método é preferivelmente utilizado quando a molécu la que se pretende ligar ao iscom contêm Tyr ou His, que não necessitam de ser ligados a MHNB. A molécula pode ser directamente ligada ao iscom primário modificado com Ι.ΊΗΝΒ e pode ser recuperada qualquer molécula não reagida. Pode preparar-se MHNB de acordo com o "Journal of Applied Biochemistry" 1, 301-310 (1979).

Os peptídeos sintetizados, podem ser providos com. um terminal de peptídeo de N-hidroxi-succinimida durante o proces.

I so de síntese e ligados a grupos amino primários no iscom.

0 peptídeo succinilado é dissolvido a um pH baixo, pH <5, preferivelmente em ácido acético. Adiciona-se em seguida o iscom primário dissolvido preferivelmente num tampão de fosfa to, e ajusta-se pH a aproximadamente 8,0.

A tirosina de um peptídeo pode ser ligada ã tirosina de outro peptídeo por reacção com bis-diazobenzidina.

Os grupos sulfidrilo nos peptídeos podem ser ligados uns aos outros por reacção eom éster maleinimido-benzoil-N-hidroxi-succinimida.

Os grupos amino podem ser convertidos com ácido nitro) so a baixa temperatura em sais de diazónio que produzem ligações azo eom Tyr, His e Lys.

Pode ligar-se um grupo carboxilo em lípidos, carbohidratos, peptídeos a um grupo amino em peptídeos através de car bodiimidas ou anidridos mistos solúveis em água. No primeiro caso, activa-se o grupo carboxilo a pH 5 com carbodiimida num tampão forte de fosfato aproximadamente 10-15 mM e mistura-se com iscom primário contendo a proteína, dissolvido num tampão, pH 8,0, contendo um alto teor de fosfato (0,4-0,5, preferivelmente 0,2 Lí). No último caso faz-se reagir o composto carboxi com isobutilcloroformato na presença de trietilamina em dioxano ou acetonitrilo e adiciona-se o anidrido resultante ao iscom contendo o grupo amino, a pH 8-9. 0 grupo carboxilo pode

também ser convertido com hidrazina para hidrazida, que nos al deidos e cetonas em unidade de açúcar oxidadas com periodato

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-30presente na proteína produzem ligações de hidrazona.

Os grupos hidroxilo, por exemplo, em carbohidratos, podem ser convertidos com anidrido de ácido succínico para de. rivados hemisuccinato, que são ligados a grupos carboxilo em, por exemplo, peptídeos. Os grupos OH-vizinhos podem ser convertidos para um grupo CHO com periodato por exemplo, pode-se fazer em seguida reagir este grupo CHO com uma amina primária para se obter uma base de Schiff, por ajuste do pH acima de 8,0.

Carrega-se a molécula que se pretende ligar numa proporção molar para a proteína no iscom primário de 50:1 para 0,1:1, preferivelmente 15:1 para 1:1. Pode ser adequado utilizar a imunogeneicidade de conjugado para cada molécula ligada do conjugado de iscom primário, ensaiando a mesma com números diferentes de moléculas ligadas a cada proteína do iscom. Dependendo do método de ligação utilizado, pode-se controlar este processo variando a concentração das moléculas ligadas, a concentração do reagente activante (activa, converte o grupo funcional), tempo de activação e tempo de ligação.

Por razões de natureza puramente prática, carrega-se frequentemente a molécula que se pretende ligar ao iscom primá rio numa quantidade correspondente a 1 mg por mg de proteína, preferivelmente 250-500 ytg por mg de proteína no iscom primá rio. A quantidade de proteína no iscom primário é determinada, por exemplo, pelo método de Bradford-(m.M. Bradford, Analyt Biochem 72 (1976)).

Se se verificar quando a ligação terminar por exame em microscopia electrónica que os isómeros se desintegraram em mi celas, podem ligar-se de novo estas micelas juntamente com um detergente, por exemplo iáEGA 9 e 10-(N-(D-gluco-2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)-N-metil-nonamida e -me tildecanamida, respectivamente, preparadas de acordo com Biochem J (1982) 207, 363-366) ou /5 -octilglucósido ou qualquer outro detergente, por exemplo, os referidos nas págs. 10 a 12em mistura com o glicósi

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-31do, por exemplo Quil A. Removem-se em seguida o reagente e qualquer detergente e glicósido presente em excesso por diálise con tra, ou filtração de gel através de um tampão adequado, por exemplo PBS, ou um tampão volátil, como por exemplo um tampão de acetato de amónio, que se separa quando se liofiliza o produto final, sendo esta liofilização do produto um passo opcional.

0 novo complexo antigénico pode ser armazenado num esta do liofilizado ou na forma de uma suspensão aquosa. 0 invento também se refere a composições médicas para seres humanos e ve terinárias contendo como substância activa um ou mais complexos de acordo com o invento, opcionalmente em conjunto com adi. tivos e extensores convencionais, preferivelmente na forma de uma solução tampão de iscom em, por exemplo uma solução -TN(cf Exemplo 1) ou em solução salina fisiológica, por exemplo NaOl 0,1 M, pH 7,2-7,6. Pode ajustar-se o pH com Tris-HCl 0,05 M.

Os complexos utilizaram-se para imunização de seres hu manos e animais numa quantidade correspondente a aproximadamen. te 0,1 /*g-l mg de complexo por indivíduo em uma ou duas ocasi. ões (com intervalo de 2 semanas entre elas).

Descreve-se em seguida o invento com maior detalhe com referência a um certo número de Exemplos.

EXEMPLO 1« Purificou-se o Parainfluenza-3-virus U23 isolado em Umea, por meio de centrifugação através de uma solução a 30% em peso de sacarose em 100 000 g durante a hora a 4-C. Dis. solveu-se a fase inferior a uma concentração de cerca de 10 mg/ml em Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 e NaCl 0,1 M (TN). Solubilizou-se no mesmo tampão (TN) 1-5 mg/ml de ΡΙ-3-vírus com 2% em peso (concentração final) de Triton X-100 juntamente com vírus

D C

marcados com com cerca de 10^? contagens/minuto (A Luukkonen,

C Gamberg, E Renkonen (1979) Virology 76, pp 55-59, que se incorpora aqui como referência) num tampão TN. Colocou-se um vo. lume de amostra de cerca de 200 /ú. em 300 y«l de sacarose a 15% contendo 1% de Triton X-100 em TN e 12 ml de gradiente de sacarose em TN entre 20 a 50% em peso contendo 0,2% em peso de

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-32Quil A. Efectuou-se a centrifugação a cerca de 250 000 g durante 22 horas a 20^0. Após centrifugação, recolheram-se fracções de 500 da parte inferior e mediram-se amostras (20-50 yííl) para determinação da sua radioactividade. Juntaram-se as fracções de proteína radioactiva e dialisaram-se em Tris-HCl 0,005 M, NaCl 0,01 M, pH 7,4, com dosagens em frascos de 10 ml e concentração por liofilização durante 18 horas num aparelho de liofilização de Edwards.

Esta preparação apresentou um coeficiente de desimen) tação de 24 S.

A purificação adicional do complexo foi feita por centrifugação do complexo através de um gradiente de sacarose de 10-40% em peso.

EXEMPLO 2. Repetiu-se o processo de aeordo com o Exemplo 1 mas usando o vírus da febre equina (Solvalla, isolado de Solvalla, Estocolmo). Repetiu-se a experiência sem adição de glicósido (isto é um princípio de acordo com pedido EPO 81102213.6) e submeteram-se as micelas de proteína assim obtidas e o complexo de proteína obtido com glicósido a uma centrifugação de gra diente de sedimentação através de uma solução de açúcar a 10-40% em peso a 280 000 g durante 4 horas a +4^QC. Apresentam-se os resultados na Eig. 1 que também mostra o coeficiente de sedimentação para tiroglobulina como padrão (19 S na seta). Es ta figura revela que o coeficiente de sedimentação para as micelas de proteína é de 30 S C.J e para o complexo de proteína de glicósido 19 S /oJ⁷· (0 vírus de glicoproteína foi mar

cado eom o método de galactosoxidase-^H-borohidreto).

EXEMPLO 3. Repetiu-se o processo de acordo com o Exemplo 1 utilizando o vírus da varicela em vez do parainfluenza-3-vírus. Obteve-se um complexo que em microscopia electrónica revelou a estrutura característica apresentada na Eig. 2.

EXEMPLO 4. Concentrou-se o vírus da raiva produzido em Biltho ven (Holanda) de aeordo com o método descrito por Van Wezel et

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33al, Develop Biol Standard (1978), 41, 159-168, para 2 mg/ml em TE. Tornou-se solúvel 1 mg de vírus com 100 mM de octil- /i-D-glicósido e incubou-se durante 45 minutos a 202C. Colocou-se a amostra sobre uma solução a 50% de açúcar e centrifugou-se a 250 000 g durante 45 minutos a +4-C. Extraíu-se a solução superior e adicionou-se Quil A a 0,2% em peso.

Colocou-se a amostra num frasco de celulose e dialisou -se a +202C em tampão de acetato de amónio 0,15 M num volume de 1000 ml, que se mudou 3 veses durante 72 horas de constante agi_

| tação. 0 material dialisado contém um complexo do vírus da rai. va. Purificou-se adicionalmente uma parte do material por meio de centrifugação através de uma solução de açúcar a 10-40% em peso a 280 000 g durante 4 horas a +4^eC. A microscopia electró nica revelou a estrutura apresentada na Pig. 3.

EXEMPLO 5 Repetiu-se 0 processo de acordo com 0 Exemplo 4 com vírus da varicela. 0 complexo obtido apresentou a mesma e_s trutura do complexo produzido de acordo com 0 Exemplo 3·

EXEMPLO 6. Purificou-se o parainfluenza-3-virus (U-23) com cen trifugação em gradiente de sacarose e dissolveu-se o vírus purificado por esse processo numa concentração de 10 mg/ml em

) tampão de barbiton 0,02 M pH 8,0, 0,24 M de glicose (BG). Tor

nou-se solúvel 1-5 mg/ml de ΡΙ-3-virus em tampão -BG com 2% de 5

Triton X-100 juntamente com virus marcado com cerca de 10 con tagens por minuto de (de acordo com ref Luukkonen et al,

1977) num tampão-BG. Colocou-se um volume amostra de 1 ml num gel de 1% de agarose contendo tampão de barbiton 0,02 M, pH 8,0, e 0,02% em peso de Quil A. Colocou-se 0 gel de agarose num tubo com uma superfície de 85 mm e uma altura de 25 mm. Ligaram-se cada uma das partes superior e inferior do tubo a um tampão de electroforese de tampão de barbiton 0,02 M, pH 8,0. Ligou-se a parte superior do vaso a um eléctrodo negativo e parte inferior do vaso a um eléctrodo positivo. Efectuou-se a electroforese a 5 V/crn durante 4 horas. Recolheu-se a amostra no lado anódico do gel e mediu-se para determinação da radioa£

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-34tividade. Dialisou-se a amostra em tampão de acetato de amónio 0,15 M, pH 7,0, e concentrou-se por liofilização.

Esta preparação tinha um coeficiente de sedimentação de cerca de 20 S, medida da mesma maneira do Exemplo 2.

Efectuou-se a purificação adicional do complexo, centrifugando o complexo através de gradiente de sacarose de 10-40% em peso.

EXEMPLO 7. Eiltrou-se fluido estomacal obtido de ratos infectados com Toxoplasma gondii através de gase e algodão numa seringa de 10 ml, centrifugou-se a 1000 rpm durante 20 minutos, e dissolveu-se a pastilha de células em PBS e lavou-se duas vezes (1000 rpm 20 minutos). Extraiu-se a pastilha final, com aproximadamente 1-10 mg de proteína (3 vezes 1 hora t.a.) com

1 ml de 5% de MEGA.

Combinaram-se os três líquidos superiores e centrifugaram-se durante 10 minutos a 1000 rpm e adicionaram-se a 0,1% de Quil A ao líquido sobrenadante. Em seguida dialisou-se a mistura contra 0,05% de acetato de amónio durante 48 horas.

EXEMPLO 8. Agitaram-se mecanicamente bactérias E. coli com plasmídeo pili K 88 e precipitaram-se três vezes no ponto isoeléctrico. Tratou-se em seguida o material de modo idêntico ao descrito no Exemplo 1. Obtiveram-se complexos com a estrutura característica apresentada nas Eigs. 2 e 3.

EXEMPLO 9« Repetiu-se o Exemplo 8 com Salmonella, que contém a proteína de porina. Obtiveram-se complexos com a estrutura característica apresentada nas Eigs. 2 e 3.

EXEMPLO 10. Trataram-se células do epitélio dos rins de gatos que tinham sido infectados com o vírus da leucemia dos felinos com o processo de acordo com o Exemplo 1. Obtiveram-se complexos com a estrutura característica apresentada nas Eigs.

2 e 3.

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-35EXEMPLO 11. Trataram-se células do epitélio dos rins que tinham sido transformadas pelo vírus da leucemia de bovino com 0 processo de acordo com 0 Exemplo 1. Obtiveram-se complexos com a estrutura característica apresentada nas Pigs. 2 e 3.

EXEMPLO 12. Purificou-se 0 vírus da paragripe 3 U-23 e prepa rou-se 0 complexo de proteína de acordo com 0 processo referi, do no Exemplo 1 mas com a diferença de 0 gradiente de sacarose em TN de 20 a 50% em peso conter uma saponina diferente de Quil A. Ensaiaram-se duas saponinas comercialmente disponíveis, Merck "Weiss¹’, rein 51400023 e Sc, Lickhardt "S" Schuchardt, Mu nique. (Saponinas na forma pura. 0 fornecedor não quis revelar 0 tipo de produto. Em cromatografia de camada fina elas diferem de Quil A). 0 complexo resultante tinha um coeficiente ue sedimentação de 24 S e apresentavam a mesma estrutura do complexo preparado de acordo com 0 Exemplo 3.

EXEMPLO 13. Solubilizaram-se 5 mg do vírus da varicela de acordo com 0 Exemplo 3 e aplicaram-se a um permutador de catiões do tipo celulose DEAE. Deixou-se 0 permutador de iões numa coluna de 20 ml e equilibrou-se com tampão de fosfato 0,01 M pH 7,2, 0,5% em peso de octil-[b -D-glucósido. Aplicou-se 0 material da amostra ao permutador de iões e lavou-se 0 material não adsorvido após lavagem com 5 vezes 0 volume da coluna com tampão de fosfato 0,01 M, pH 7,2, 0,5% em peso de octil-/4-D-glucósido, e a seguir eluiu-se 0 material adsorvido após adi. ção da coluna de um gradiente salina entre 0 e 0,5 M de NaCl dissolvido em fosfato 0,01 M pH 7,2, 0,5% em peso de octil-^ó -D-glucósido. As fracções nas quais identificaram as proteínas de membrana de vírus da varicela foram combinadas e adicionou-se Quil A a 0,1% em peso e dialisou-se em 0,05 M de acetato de amónio, pH 7,0. Formou-se um complexo com a estrutura carac. terística apresentada nas Figs. 2 e 3.

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-36ΈΧΕΜΡ10 13a. Solubilizou-se de acordo com o Exemplo 3 um vírus da varicela (RIV-Bilthoven). Centrifugou-se o vírus-deter gente durante 2 horas a 100 000 g. Dialisou-se o líquido supe. rior resultante contra um tampão de fosfato de baixo teor sali no (10 mM de fosfato-50 mM de NaCl-pH 7,2) e aplicou-se a um permutador aniónico-DEAE-Sepharose, que estava em equilíbrio em fosfato 10 rnM-pH 7,2-NaCl-50 mM-0,05% TX-100. lavou-se o material não adsorvido com o mesmo tampão. A coluna foi em se. guida levada ao equilíbrio com um tampão contendo 10 mM de fos. fato-50 mM de NaCl-0,1% de Quil A. Eluiu-se o material adsorvido com o mesmo tampão contendo 3000 mM de NaCl. 0 material eluído continha complexos com a mesma estrutura caracteristica da apresentada na Eig. 2.

EXEMPLO 14. Ressuspenderam-se 22 mM do vírus da hepatite-B recebidos da "london School of Tropical Medicine and Hygiéne" (Inglaterra) a uma concentração de 1 mg/ml em TN. Solubilizaram-se 0,3 mg de proteína de 22 mM partículas a 2% em volume de Triton X-100, NaCl 0,5 M e incubaram-se durante 16 horas a +37 20. Repetiu-se em seguida o processo de acordo com o Exemplo

1. 0 complexo resultante tinha 1 coeficiente de sedimentação

de 20 S. A microscopia electrónica revelou um complexo com uma estrutura idêntica à apresentada na Eig. 4. Esta estrutura difere da estrutura apresentada na Eig. 2 consistindo em partes desta estrutura.

EXEMPLO 15 Solubilizaram-se 3 mg de vírus da diarreia de bovino (BDV) dissolvidos em TN, por adição de Triton X-100 a 1% em volume. Agitou-se a mistura durante 2 horas à temperatura ambiente. Este vírus solibilizado foi aplicado a uma coluna de lectina consistindo de lectina Lentil imobilizada em Sepharose 4 B (Pharmacia, Uppsala). A coluna foi equilibrada com TN e após introdução de material do vírus na coluna, foi lavada com 5 vezes o volume de coluna de TN, contendo 0,1% em volu me de Triton X-100 seguido de 10 volumes de coluna TN. As pro. teínas do envelope do vírus foram desadsorvidas eluindo com um

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-37tampão consistindo de 0,2 34 de metil- “í-D-manósido, 0,5$ em peso de octil- ^-D-glucósido dissolvido em TN adicionado às colunas. As fracções contendo as proteínas do envelope do vírus foram recolhidas e foi adicionado Quil A a 0,1$ em peso. Dialisou-se a mistura em acetato de amónio 0,05 M pH 7,0 a +4²C durante 3 dias com três mudanças do volume de tampão de 1 litro.

Submeteu-se o produto final a liofilização e a microscopia electrónica revelou estruturas complexas fazendo parte

) do complexo apresentado na Eig. 4. Bsta preparação tinha um coeficiente de sedimentação de 20 S.

EXEMPLO 16. Solubilizou-se um poliovirus nor purificado prepa rado em RIV-Bilthoven de acordo com o processo descrito por Van Wezel et al (Develop Biol Standard (1978) 41, 159-168), num tampão adequado, tal como TN, contendo um agente solubilizante, por exemplo 2$ de dodecilsulfato de sódio, por incubação a 37⁹C durante 2 horas. Separaram-se as proteínas "capsid" do vírus por electroforese numa poliacrilamida a 10$ adequada con tendo 0,1$ de dodecil sulfato de sódio. Após identificação das posições das proteínas no gel, cortaram-se fatias adequadas delas e eluiram-se as proteínas por electroforese. VP-3 possuindo um peso molecular de aproximadamente 26 Ii' Dalton é uma das proteínas "capsid". Triton X-100 foi misturado com uma solução contendo VP-3, para uma concentração final de 2$.

A mistura foi em seguida utilizada na preparação de complexos de proteína (iscom) de acordo com o processo de centrifugação referido no Exemplo 1.

A microscopia electrónica revelou a estrutura característica da preparação ilustrada na Eig. 3.

EXEMPLO 17« Dissolveu-se o poliovirus purificado que foi morto com formalina (produzido em RIV Bilthoven) em 67$ em volume de ácido acético contendo 0,1 E de LgCl^. 0 material de ví rus foi em seguida submetido a ultra-centrifugação durante 1 hora a 100 000 g, e recuperou-se o líquido sobrenadante conten

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-38do apenas proteínas de vírus e dialisou-se na presença de 0,1% em peso de Quil A contra Tris 0,01 M, NaCl 0,14 15, pH 7,4. 0

complexo resultante mostrou a mesma estrutura da do complexo preparado de acordo com o Exemplo 3.

EXEMPLO 18. Receberam-se proteínas da membrana exterior da Neisseria meningitidis liofilizadas do National Institute of Health (Holanda) e dissolveram-se em TN contendo 2% em peso de octil- /3-D-glucósido e 0,1% em peso de Quil A e trataram-se de modo idêntico no referido Exemplo 4. 0 complexo resultante ti

nha um coeficiente de sedimentação de 20 S medido de modo idên tico ao referido no Exemplo 2.

EXEMPLO 19« Peptídeo com aminoácidos hidrofóbicos. Peptídeo da doença da febre aftosa 144-169· 0 Kaufbehren. 7tilizou-se

VP 1 sintetizado com 0, 1, 2, 3 e 4 Tirosina ligados numa extremidade (como comereialmente recebidos). Dissolveu-se o pejo tídeo numa pequena quantidade excedente de 67% em volume de ácido acético, neutralizaram-se com 25% de amoníaco e diluíram -se a 0,5 mM acetato de amónio^agua destilada (detergente para uma concentração final de 2%). Adicionaram-se 0,1% de glicósido e dialisou-se a mistura em 0,05 M acetato de amónio, pH 7. (Tubo de diálise Spectra Por 6 MV/CO 1.000).

0 complexo que se formou pode ser observado por micross copia electrónica (ver Eig. 5) revelando uma partícula esférica impermeável aos electrões com um comprimento de 20-40 mm e uma largura de 10 mm. Observaram-se também outros tamanhos.

A Eig. 5a mostra uma figura de microscopia electrónica (EM) do peptídeo ligado a três tirosinas e a Eig. 5b mostra a fotografia EM do peptídeo ligado a quatro tirosinas.

EXEMPLO 20. IgG de ratos, purificado de acordo com métodos conhecidos (M Van den Branden, J L de Coen, L Kanarek e Royscha ert (I98I) e Molecular Immunology 18, pp 621-631 (1981)) ou en riquecido por precipitação com sulfato de amónio (J E Conradie, M Govender, L Visser, Journal of Immunological Methods, Vol 59,

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pp 289-299 (1983); (citações incorporadas como referência) foi dialisado durante a noite contra 1 litro de tampão de fosfato (PC) 0,15 Μ, pH 2,5, numa câmara frigorífica. Adicionaram-se em seguida 2$ de detergente (por exemplo octil-β-D-glucósido). Se se utilizar um detergente possuindo uma concentração micelar crítica (MCil) baixa, deve-se mudar o detergente, antes de iniciar a diálise. A mistura foi dialisada em PC pH 7· Uma hora depois adicionou-se Quil A para a concentração final de 0,05$, e continuou-se a diálise em PC pH 7 durante 24 horas numa cama ra frigorífica.

0 complexo que se formou foi ensaiado por centrifugação através de um gradiente de sacarose de 5 a 30$ durante

3,3 horas a 40 000 rpm num rotor Beckman SW-60. Detectaram-se os complexos no gradiente por meio da técnica de ELISA.

EXEMPLO 21. Preparação dos isconsde Avian Bronchitis^virus (família das coronaviridae). Solubilizaram-se 5 mg de sacarose purificada de avian bronchitisvirus em 0,5 ml de tampão TU

(Tris 0,05 M e NaCl 0,1 M) adicionando o detergente octiloglucó sido a 2$ e incubando durante 1 hora a 37-0 e 2 horas à temperatura ambiente. Depositou-se a mistura na parte superior do gradiente de sacarose consistindo de 3 ml de sacarose a 30$ em TU no fundo de um tubo e por cima disso 1,5 ml de sacarose a 10$ em TN contendo 1$ de octiloglucósido e 0,1$ de Quil A. Efectuou-se a centrifugação no rotor TST 54 Oontron durante 2 horas a 50 000 rpm e a 20^0.

Os dois ml da parte superior do gradiente foram recolhi

dos e dialisados a uma temperatura de 6^0 contra 1 litro de ace tato de amónio 0,05 M, que foi substituído 3 vezes durante um período de 3 dias. Após a diálise centrifugou-se a preparação através de 10 ml de sacarose a 10$ em TU durante 6 horas a 40 000 rpm num rotor TST 41 Oontron a 20^0. Dissolveu-se a pastilha num tampão de 1 ml de TU.

A microscopia electrónica mostrou a morfologia típica dos iscons (ver Pig. 2).

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EXEMPLO 22. Preparação de iscons de vírus da leucemia dos felinos (família dos Retroviridae). Para a produção de PeLV cul tivaram-se ou a linha de células linfobastóide PL 74 ou P422 em suspensão de acordo com Wolff et al. Recolheu-se o meio em intervalos diários e removeram-se os pedaços de células por centrifugação a baixa velocidade. Concentrou-se por ultracentrifugação utilizando um sistema de filtros íáillipore ®·

(a exclusão W 100 000) e purificou-se adicionalmente o vírus por ultracentrifugação duas vezes através de uma fase de sacarose de 30% (p/p). Solubilizou-se a pastilha resultante com um tampão TN (Tris 0,05 Μ θ NaCl 0,1 M, pH 7,4) contendo 2% de Triton X-100 e 0,02% de ditiobis-n~nitropiridina. Preparam-se os iscons com um processo de centrifugação tal como anteriormen te descrito. Em resumo aplicaram-se 200 ytA de virus solubili^ zado numa camada de 200 jXX de sacarose a 8% em TN contendo 1% de Trinton X-100 que foi depositado sobre um gradiente linear de 5 ml de sacarose a 10-40% contendo 0,2% de Quil A. Efectuou-se a centrifugação num rotor SW50 a 150 000 g durante 4 horas a 20²C. Recolheu-se o gradiente em fraeções de 500 e identificaram-se as fraeções contendo gp 70/85 através de ele£ troforese de gel de poliacrilamida com 10% SES (SES-PAGB). A presença de gp 70/85 foi ainda confirmada num sistema de regis. to de pontos. Aplicaram-se amostras de 5 yttl das fraeções a um filtro de nitrocelulose, tratou-se durante 30 minutos em tampão de TN contendo 5% de albumina e lavou-se com um tampão TN. Aplicou-se em seguida um anticorpo anti gp 70/85 monoclonal marcado com uma peroxidase de rábano (HRP) e demonstrou-se a ligação após lavagem no tampão de TN. Confirmou-se a presen. ça de iscom por microscopia electrónica de contraste negativo tal como anteriormente descrito. Eeterminou-se o teor de proteínas total de acordo com Lowry, e estimou-se a quantidade de êP 70/85 por varrimento do gel de poliacrilamida. Liofilizaram-se as preparações para armazenagem.

Nos ensaios de imunização em gatos os iscons produzem anticorpos neutralizantes e protecção contra a infecção de uma

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-41experiência de ensaio.

EXEMPLO 23. Preparação de iscons de Plasmodium Ealciparum (protozoa). Efectuou-se a suspensão de 1 mg de plasmodia fai ciparum (tropozoitas, chizontes e merozoitas) em 500 Λ¹ de TN contendo 1% de KEGA. Submeteram-se células e resíduos de células a centrifugação de baixa velocidade a 3000 rpm durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Incubou-se a suspensão durante 1 hora a 3020 e 2 horas à temperatura ambiente. Depois depositou-se a suspensão na parte superior de um gradiente de sacarose descontínuo consistindo de 3 ml de sacarose a 30% em tampão TN no fundo de um tubo. Na parte de cima esta va 1,5 ml de sacarose a 10% e 1% de MEGA em tampão de TN e 0,1% de Quil A. Centrifugou-se o gradiente durante 3 horas a 50 000 rpm a 202C no rotor TST 55 Contron. Recolheram-se 3 ml da par te superior do gradiente e dialisaram-se contra 1 litro de ace. tato de amónio 0,1 M que foi substituído 3 vezes durante os três dias de diálise. Depois recolheu-se a preparação e depositou-se na parte superior de sacarose a 10% num tubo de centrifugação de 13 ml e centrifugou-se durante 6 horas a 202 C a 40 000 rpm de um rotor TST 41 Contron. Dissolveu-se a pastilha em 500 de tampão de TN. A microscopia electrónica rove lou partículas com a morfologia típica de iscons.

EXEMPLO 24. Preparação de iscons a partir das proteínas da mem brana exterior de Bordetella Pertussis. Efectuou-se uma suspensão de 10 g de Bordetella pertussis liofilizada em 340 ml de água destilada. Desintegram-se as bactérias numa prensa francesa. A seguir aqueceu-se a suspensão a 662C e adicionou-se um volume igual de solução em água de fenol (90% de fenol e 10% de água destilada) à temperatura de 6620. Colocou-se a mistura num agitador durante 20 minutos e em seguida arrefeceu -se para 5²C e centrifugou-se durante 20 minutos a 3000 rpm. Recolheu-se a fase aquosa e adicionou-se MEGA a uma concentração de 2% de 3DS numa concentração de 0,1%. Em seguida centri. fugou-se a preparação durante 20 minutos a 3 000 rpm e recolheu-se o lípido sobrenadante. Concentrou-se a mistura por ul trafiltração utilizando um sistema de filtros Millipore ^E (ex

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-42clusão KW 100 000) e ajustou-se a concentração de proteínas medidas por Lowry (1) a 20 mg de proteína por ml seguida

adicionou-se Quil A numa concentração de 0,2% e dialisou-se a suspensão a 6^0 contra 1 litro de acetato de amónio 0,15 M substituído 3 vezes durante um período de 3 dias. A microscopia electrónica revelou partículas com a morfologia típica de iscons.

EXEMPLO 25. Solubilizaram-se 10 mg do vírus HINI-PR8 com 100 ywl de 20% de N-Becanil-N-metil-glucamina e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Separaram-se as proteínas da membrana solubilizada da estrutura central, por centrifugação através de 20% de sacarose contendo o detergente de uma concentração acima da concentração micelar crítica. Recolheram-se as proteínas de membrana e adicionou-se Quil A para uma concentração final de 0,1% e dialisou-se extensivamente contra 0,9% de NaCl nas primeiras 4-6 horas à temperatura ambiente e em seguida a +4-0.

EXEMPLO 26. Adicionaram-se 300 yug de gp 340, uma proteína de envelope do vírus de Epstein Barr (um vírus herpes) em 200 yu-l de BBS, a um tubo onde se tinham seco na parede 70 ^ag de colesterol. Adicionou-se Triton X-100 e manteve-se ú, mistura à temperatura ambiente durante 2 horas. Colocou-se a mistura no volume de 300 na parte superior do gradiente, que desde a parte superior até à inferior consiste de 200 y<*l de 15% de sa carose com 1% de TX-100 e zvl2 ml de 20% de sacarose em BBS contendo 0,1% de QA. Efectuou-se a centrifugação a 40 000 rpm num rotor Beckman SW qO durante 16 horas e a 20^0. Recolheu-se 0 gradiente do fundo em porções de 500 jÃL. 0 gp 340 misturado com 0 detergente e colesterol pode ser reconstituído em iscons pelo processo da diálise. Nesse caso adiciona-se Quil A a uma concentração final de 0,1% antes da diálise. E em seguida preferível ter um detergente que possa ser facilmente se. parável por diálise por exemplo octilglicósido que foi utiliza do neste caso.

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-43Dialisou-se em seguida a mistura durante 48 horas a 4-620 contra PBS (foi também utilizado tampão TN). Observou-se a formação de iscons em microscopia electrónica. A vantagem de utilizar por exemplo proteínas e envelopes de vírus diferen tes purificados por métodos diferentes, isto é 0 método de escolha é evidente.

EXEMPLO 27. Iscons preparados de peptídeos hidrof óbicos. Iscons preparados de peptídeos com uma cauda hidrofóbica por exemplo

Tyr^-PID

Tyr^-EhiD

ácido palmítico-FlAD ácido mirístico-PlID

Dissolver 1 mg de peptídeo em 100 de 20$ de octilglucósido, N-Lecanil-N-metil glucamina ou qualquer dos detergentes dialisáveis,

adicionar uma quantidade equimolar (^20$) de colesterol em 50 /LL de solução de detergente-tampão,

adicionar tampão e Quil A para se obter uma concentração final de 1 mg/ml de peptídeo e 0,1$ de Quil A,

dialisar (diálise de corte de 1000) extensivamente contra PBS ou qualquer outro tampão adequado nas primeiras 24 horas à temperatura ambiente.

EXEMPLO 28. Sintetizou-se uma sequência de amino^ácidos 139-153 representando uma parte de um factor de crescimento de células—T de Interleucina II com 2 tirosinas no terminal amino.

Ligou-se 0 peptídeo às proteínas de glicol do iscom por diazotização.

0 iscom compreendia glicoproteínas derivadas do vírus da gripe, estirpe H2 N2/PR-8, e foi preparado por centrifugação de acordo com 0 processo referido no Exemplo 1 e 2 acima apresentados.

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-44Dissolveu-se 1 mg da preparação do iscom (calculado co. mo uma quantidade de proteína do iscom) em 0,1 M de tampão de borato, pH 9,5 (1 mg/ml). Efectuou-se a activação adicionando (5 mg/ml.mg) de MHNB sólido (metil-4-hidroxi-3-nitrobenz-imidato). Agitou-se a mistura até que todo o MHNB se dissolveu, incubando-se em seguida a solução durante 2 iiúrets à tempe. ratura ambiente (Ref Imiller, Pleiderer, Hoppe-Seyler's Z Physi ol Chem, Vol 359, pp 407-411 (1978), Muller, Pleiderer, Journal of applied Biochem, Vol 1, pp 301-310 (1979))· Dialisou-se em seguida a mistura durante a noite contra borato 0,1 M (pH 8,0, a +45c, reduziu-se com ditionite (1 mg de ditionite/ml) durante 1-2 minutos à temperatura ambiente, dialisou-se contra bora to 0,1 M, pH 8,0, durante 2-6 horas a +4^SC e dialisou-se contra borato 0,1 14, pH 4,0, durante a noite a +4^QC.

A mistura foi em seguida diazotizada por adição de NaN0₂ (6,9 mg/ml) a partir de uma solução de estirpe (100 mg/ml em Aq dest), incubada durante 1 minuto num banho de gelo, sendo em seguida o pH ajustado rapidamente a 8,5 (borax e NaOH). Dissolveu-se 1 mg de peptideo em 50-100 ^ύ. de borato 0,1 M, pH 8,5, adicionando-se em seguida ã solução e sendo bem misturado elevando-se em seguida a temperatura para a temperatura ambiente e incubando-se a solução durante 2 horas.

A mistura foi em seguida dialisada contra borato 0,1 K pH 8, durante a noite, a +42 0. 0 corte de diálise era igual a

1000. Adicionaram-se em seguida 1% de MEGA (ou 2% de ^3 -octil glucósido) + 0,1% de Quil A, sendo em seguida a mistura incuba da durante 30 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi em seguida dialisada através de PBS (tubo de diálise convencional) durante 2-4 horas à temperatura ambiente e em seguida à temperatura de +4²C durante a noite. A microscopia electrénica con firmou que os complexos de iscom estavam presentes.

Imunizaram-se 5 ratos com aproximadamente 10 g do peptídeo na forma de um complexo de iscom preparado de acordo com um processo descrito por muller, J, Pfleiderer, G A (1979), Journal of Applied Biochem I, pp 301-310. Após a imunização

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dos ratos, avaliou-se a resposta a anticorpos pela técnica de ELISA, utilizando-se unia fosfatase alcalina de enzima. 0 fundo, isto é, a capacidade de leitura, na absorvância 405 era de 0,01% ou inferior com amostras de soro derivadas de ratos que não tinham sido imunizados. 0 soro tomado de ratos imunizados continha anticorpos que podiam ser observados em diluições até 1:100 ou ainda maiores com valores de leitura que eram dez vezes superiores aos do fundo, ou mesmo superiores. Não se obser vou resposta a anticorpos, quando se imunizava apenas com peptídeos.

EXEMPLO 29. Sintetizou-se uma sequência de 20 aminoácidos (141-160 obtidos dos vírus VIP PMP (doença da febre aftosa) em três variantes:

1. 15 aminoácidos sem aditivos adicionais;

2. 15 aminoácidos + 2 tirosinas adicionais no terminal amino;

3. 15 aminoácidos + 1 éster de N-hidroxi succinimida;

Ligaram-se os peptídeos ao iscom produzido de acordo com 0 Exemplo 1 de glicoproteínas do vírus da gripe estirpe H2N2/PR-8 com três processos de ligação.

A variante_l foi ligada a iscom através dos seus terminais | COOH, utilizando 0 processo da carbodiimida (cf ligação de car

bodiimida).

Dissolveram-se 250 ^g em 250 yEL de um tampão de fosfato 25 MM, pH 5·

Dissolveram-se 2,5 mg de EDO (l-e.til-3-(3-dimetilamino. propil)-carbodiimida sigma) em 250 yML Aq Dest e misturou-se com 0 peptídeo. Incubou-se em seguida a mistura durante dois minutos à temperatura ambiente.

Dissolveu-se 1 mg de iscom (calculado como proteína) em 500 jãL de um tampão de fosfato 0,4 I',i, pH 8, adicionando-se em seguida à mistura e fazendo reagir durante a noite à temperatura ambiente. Dialisou-se em seguida a mistura durante a noite contra PBS a +4^0.

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-460 rendimento da ligação foi de 27%, o que corresponde a aproximadamente 5 peptídeos-ELDV para cada proteína no iscom primário.

A variante 2 foi ligada a iscons através das suas tirosinas por meio de diazotização cf Exemplo 28, ligaram-se 55% do P®£ tideo ao iscom primário, o que corresponde a aproximadamente 13 peptídeos por molécula de proteína no iscom primário.

Variante 3 ligação de N-hidroxi succinimida-peptídeo a iscons. Dialisou-se 1 mg da preparação de iscons (H2N2/Pr-8) do vírus da gripe produzido pelo método de centrifugação (cf ligação-dia zo) contra um tampão de fosfato 0,05 M, pH 5·

Dissolveu-se 1 mg de succinil-peptídeo em 25 yól de ácido acético concentrado, e em seguida misturou-se a preparação + iscom e titulou-se durante d-3 minutos com partes menores de Na₂HE0 0,2 fí a pH 8. Incubou—se em seguida a mistura durante 4 horas à temperatura ambiente.

Adicionaram-se em seguida 1% de MEGA 10 (ou 2% de β -octilglucósido) e 0,1% de Quil A e incubou-se a mistura duran te 30-60 minutos á temperatura ambiente, dialisando-se em seguida a mistura contra PBS durante 2-4 horas à temperatura ambiente e em seguida durante a noite a +4^QC.

EXEMPLO 30. Complexo de biotina-iscom. Eormou-se o iscom a partir de glicoproteínas obtidas dos vírus da gripe serotipo A, subtipo AEq2 BEq2 estirpe Solvalla/79· Preparou-se o iscom de acordo com o Exemplo 1 e 2.

Dissolveu-se 1 mg (calculado como proteína) do iscom de Solvalla em 1 ml de NaHCO^, 0,1 Ii, pH 8 e adicionou-se com 100 /«1 (0,2 mg da solução de estirpe de 2 mg/ml em DMSO) de N-hidroxi succinimido biotina (Sigma), incubando-se em seguida a solução resultante durante 4 horas à temperatura ambiente e dialisando-se durante a noite contra PBS a +4^eC. A microseopia electrónica revelou a presença de complexo de iscom.

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-47Imunizaram-se 3 ratos (Balb/c) cada duas vezes com 50 pg do conjugado (calculado como o peso total do conjugado) em intervalos de 14 dias. Verificou-se que 3 dias após a primeira imunização todos os ratos tinham um título de anticorpos ^.1/100 000 medidos de acordo com as técnicas de ELISA. As pa redes nas placas de ELISA foram revestidas com BSA biotiniz.ada (albumina do soro de bovino). Utilizou-se BSA para expor a biotina durante a análise. Nenhum dos anticorpos tomados dos ratos imunizados reagiram com as placas revestidas apenas com BSA. Não se verificou que os animais sofriam de efeitos laterais .

EXEMPLO 31. Ligação da peroxidase ao iscom primário-PR8 de acordo com Nakane Kawaoi (1974). Anticorpo marcado de peroxidase. Um novo método de conjugação, I Histochem Gytochem 22, 1084.

Dissolveu-se 1 mg de HRP (peroxidase) em 200 jXL de NaHCOj 0,o Li, pH 8,1 e adicionaram-se 20 yU-1 de 1$ de PDNB (flu orodinitrobenzeno) que se incubou durante uma hora à temperatu ra ambiente, para blocagem dos grupos amino primários. Adicio. naram-se em seguida 200 /2L de NalO^ 0,08 H e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente, para converter os gru pos-OH vizinhos em grupos CHO. Adicionaram-se 200 ytl de etileno glicol 0,18 Μ e incubou-se durante 1 hora à temperatura

ambiente para remover o NalO, não reagido.

4

A peroxidase activada e 1 mg (calculado como proteína) do vírus da gripe estirpe H2N2 PR-8 iscons (preparado de acordo com 0 Exemplo 1) foram em seguida dialisados durante a noite contra NaHCO^ 0,01 L, pH 9,5 (cada um por si).

histuraram-se as soluções de PR-8 + HRP e incubaram-se pelo menos durante 24 horas à temperatura ambiente. Lavou-se 0 conjugado de HRP não ligado por centrifugação de gradiente em sacarose a 10-40$, seguindo a actividade de HRP dos iscons.

A microscopia electrónica revelou a presença de complexos de iscom.

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-48A ligação das moléculas nos Exemplos acima referidos foi controlada por centrifugação de gradiente. Os peptídeos marcados com radioactividade ligados ao iscom acompanham o complexo de iscom e depositam-se no valor de S de aproximadamente 19 S, isto é o mesmo valor de S do próprio iscom.

EXEMPLO 32. Preparação de iscons com peptídeo da malária, um octapeptídeo (Glu-Glu-Asu-Val-Glu-His-Asp-Ala). Preparou-se o iscom primário do modo descrito no Exemplo 25 com o processo de diálise com as proteínas de envelope do vírus da gripe estirpe PR 8.

x Misturou-se 1 ml do iscom PR 8 em PBS (0,98 mg/ml) com 1,56 mg de peptídeo de malária;

* Adicionaram-se 10 yú. de glutaraldeido a 25% para a concentração de 0,25%;

Efectuou-se a incubação a 24 horas à temperatura ambiente com agitação moderada;

x Dialisou-se a preparação durante 24 horas a 4-C contra PBS.

Estimou-se o teor de proteína total de 1,02 mg/ml de acordo com Bradford (Analyt Biochem 1976, pp 248-254).

Calculou-se que cerca de 25% do peptídeo se ligava ao iscom PR 8. Eoram observados iscons típicos em microscopia electrónica.

Inoeularam-se subcutaneamente 5 ratos com 50 yUg do con. jugado. Passadas 2 semanas recolheu-se sangue para a preparação do soro. Ao mesmo tempo foi dada uma segunda dose de 50yUg do conjugado. Após uma semana retirou-se sangue dos ratos de novo e preparou-se o soro.

A resposta de anticorpos do soro foi ensaiada num ensaio de ELISA utilizando soro armazenado dos ratos.

Efeetuou-se o ensaio de ELISA em tabuleiros de plástico (Pune 96 E 2 - 69620 PS SH).

Efectuou-se o revestimento eom o conjugado de peptídeo

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49na albumina do soro de bovino (BSA) - (1 mg de BSA e 1 mg de peptídeo utilizando glutaraldeído como acima descrito e numa concentração final de 0,25%). Dialisou-se a mistura na forma acima descrita. Utilizou-se 1 yug do conjugado (BSA-peptídeo) por ml do tampão de revestimento, isto é tampão de carbonato 0,05 M pH 9,6 e adicionaram-se 100 I a cada furo do tabuleiro. Efectuou-se a incubação a 4^QC durante a noite.

Após duas lavagens com tampão de fosfato concendo 0,05% de Tween 80, adicionaram-se soros de ensaio a diferentes dilui

} ções. Efectuou-se a incubação durante 1 hora à temperatura am

biente. Após lavagens como descrito acima adicionou-se um soro anti-rato de coelho marcado de peroxidase (Dakopatts, Copenhague). Efectuou-se a incubação durante uma hora à temperatu ra ambiente. Em seguida adicionou-se o substracto de trimetil benzidina. Parou-se a reacção após 10 minutos e efectuou-se a leitura a 405 nm.

Resultados: Buas semanas depois da primeira vacinação os soros armazenados apresentaram um título de diluição de 1: :300. Uma semana após a segunda vacinação o título aumentou para 1:700.

Nenhum dos ratos apresentava quaisquer efeitos lateI rais devidos à imunização. A maneira convencional de imunizar

com peptídeos inclui a ligação do peptídeo a uma proteína, por exemplo BSA ou KLH. Este conjugado é em seguida misturado ou emulsionado com um adjuvante oleoso, por exemplo adjuvante de Preund incompleto ou de Preund completo, que dá origem a efeitos laterais severos na forma de reacções locais ou sistémicas. Estes tipos de adjuvantes são inaceitáveis para vacinas de seres humanos ou animais.

EXEMPLO 33. Preparação da Hormona de Libertação da Hormona Leutenizante (LHRH), um decapeptídeo (Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly). Preparou-se o iscom primário de modo descrito no Exemplo 25 pelo método de diálise, com as proteínas de envelope obtidas do vírus da gripe, estirpe PR 8.

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-50Ro grupo A (ver tabela 1) a ligação foi efectuada com 1 ml de iscom FR 8 em PBS (1 mg/ml) e 1 mg de peptídeo num procedimento de 1 passo tal como referido no Exemplo 32.

Ro grupo B, 0, D e E (ver Tabela 2) a ligação foi efec. tuada com um procedimento a dois passos. Adicionaram-se a 1 mg de iscons FR 8 em 1 ml de PBS a 1,25% de glutaraldeído em água para uma concentração final de 0,25% e dialisou-se a mistura durante a noite ã temperatura ambiente contra RaCl a 0,9%· Adicionou-se 1 mg de peptídeo em 100 ytl de RaCl a 0,9%· Após

) misturar 50 /RL do tampão do carbonato 1 Ii pH 9,5 incubou-se a mistura a 4²C durante 24 horas. Em seguida dialisou-se a mistura contra PBS durante 24 horas.

Feterminou-se o teor de proteínas com o métuu.o de Brad ford e dilui-se para 1 mg/ml.

Calculou-se que cerca de 25% do peptídeo se ligava ao iscom PR 8. A estrutura de iscom típica foi observada em microscopia electrónica.

Imunizaram-se ratos duas vezes subcutaneamente com separação de 4 semanas com doses variando de 0,1 ytx-g a 3 yUg por dose tal como apresentado na Tabela 1. Recolheram-se amostras de sangue no tempo das imunizações e 4 semanas após a segunda imunização.

A resposta de imunização foi medida em ELISA tal como descrito no Exemplo 32 usando conjugado de peptídeo para BSA como antigene de ensaio.

Exprime-se o título como diluição do soro do rato que dá origem a uma leitura positiva a 405 nm.

Os resultados são apresentados na Tabela 1. Todos os ratos responderam com títulos de anticorpos de soro. Após uma imunização 3 de entre 5 ratos imunizados com 1 ^g de peptídeo ou mais tinham desenvolvido anticorpos detectáveis a LHRH.

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-51Tabela 1

DILUIÇÃO HE TITULO DE ELISA

PEPTÍDEO	DOSE DE	GRUPO	lâ IMUNIZAÇÃO	2§ IMUNIZAÇÃO f
LHRH i	B 0,1	/g	<100 112 <100 <100 <100	157 149 200 190 126
LHRH	0 0,3	fg	<100 Média de 5 so. ros misturados	292 162 112 100 114
LHRH	D 1,0	fg	112 103 <100 128 <100	283 209 274 240 419
LHRH	E 3,0	fg	134 <100 <100	274 >600 > 600
LHRH	A 1,0	fg	248 100 <100	>600 522 600

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Tabela 2

DILUIÇÃO DE TÍTULO PB ELISA

PEPTÍDEO	DOSE DE GRUPO	1* IMUNIZAÇÃO	2ê IMUNIZAÇÃO '
PMD	A 1,0 /*g	< 100	< 100
		< 100	<100
		<100	<100
		< 100	100
		<100	196
PMD	B 3,0 yxg	0..	400
	0,26	226
		0,10	163

Após duas imunizações todos os ratos responderam com títulos de anticorpos aumentados. Os ratos imunizados com 0,1 pg também responderam com uma boa resposta de anticorpos.

Não se observaram efeitos laterais por exemplo como reacção local ou reacções sistémicas após uma ou duas imunizações.

EXEMPLO 34. Preparação de iscons com o peptídeo da doença da febre aftosa (PMD) (16 aminoácidos (Leu-Arg-Gly-Asp-Leu-Gly-Val-Leu-Ala-Glu-Lys-Val-Ala-Arg-Tyr-Leu)). Preparou-se o iscom primário com as proteínas de envelope do vírus da gripe es. tirpes PR 8 da forma descrita no Exemplo 25.

A ligação foi efectuada com um procedimento a duas fases com glutaraldeído como descrito no Exemplo 33 utilizando 1 mg de iscons PR 8 e 1 mg de peptídeo.

0 teor de proteínas após a ligação foi determinado com. 0 método de Brandford e diluído para 1 mg/rnl.

Calculou-se que cerca de 25% do peptídeo se ligava aos iscons PR 8.

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-53Verificou-se por microscopia electrónica a morfologia típica dos iscons.

Imunizaram-se ratos duas vezes subcutaneameute numa di. ferença de 4 semanas como mostrado na Tabela 2 com 1 ou 2 /*g de peptídeo conjugados no iscom de PR 8.

A resposta de anticorpos dos ratos foram medidas no soro do rato com ELISA da forma descrita no Exemplo 32 e 33 utilizando peptídeo FMD conjugado com BSA como antigene de ensaio. Exprimiu-se o título com diluição do soro do rato que dá uma leitura positiva a 405 nm.

Apresentam-se os resultados na Tabela 2. Os ratos não responderam com qualquer soro detectável de anticorpos após uma imunização quando a resposta de anticorpos foi medida em soro duas e quatro semanas após a imunização. Quatro semanas após a segunda imunização ensaia-se o soro dos ratos imunizados e todos os ratos responderam com anticorpos de soro ao pep. tídeo.

Nenhum dos ratos apresentava efeitos laterais devidos à imunização quer como reacções locais ou reacções sistémicas.

EXEMPLO 35. Preparação dos iscons HTLV-III enriquecidos com gp I 120. Os vírus purificados da família de retrovirus perdem geralmente a parte exterior da proteína de envelope. Essa parte externa é crucial para a indução cia imunidade protectora. Esta parte externa pode ser recuperada de fluido da cultura de tecçL dos obtida da cultura de virus e do fluido obtido durante a pu rificação de virus por exemplo líquido sobrenadante após a ultracentrifugação do virus.

Solubilizou-se 10 mg do virus HTLV-III em 1 ml de PES com 1% de N-decanil-N-metil-glueamina. Incdbou-se a mistura durante 1 hora à temperatura ambiente.

Separam-se as proteínas de membrana solubilizadas do ácido nucleico e proteínas arrastadas por centrifugação através de sacarose por exemplo 20% contendo o mesmo detergente por exemplo 0,5% e 0,1% de Quil A em PBS:

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As fracções de sacarose, detergente e Quil A contendo oroteínas de membrana são dialisadas contra acetato de amónio 0,05 m (o tampão não crítico) nas primeiras 6 hora» à temperatura ambiente e em seguida a +4-0.

Incubaram-se 0,j mg de gp 120 em 1 ml enriquecido com fluido de cultura de tecidos por cromatografia de afinidade com lentes de lectina ou por anti-gp 120 ligado a Sepharose com glutaraldeido de concentração final 0,25% durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida dialisa-se contra NaCl a

I 0,9%.

Adicionaram-se os iscons HT1V-I1I preparados acima num volume de 2 ml e 150 yul de tampão de carbonato 1 M pH 9,5· In cubou-se a preparação durante 24 horas a 4^eC e dialisou-se em seguida contra DBS durante 24 horas a 4^eC.

A formação típica de iscons foi observada em microscopia electrónica.

ΕαΕϊ.ΤΙΟ 36. Conjugaram-se 3 sequências de produtos de ADN híbridos de EelV gp 70 em estearil amina incorporada em lipossomas pelo método a duas fases de glutaraldeido (ver Exemplo 33). Activaram-se 10 mg (10 mg/ml) de lipossomas em DBS pH 7 para uma concentração final de 1,25% de glutaraldeido à temperatura ambiente durante a noite. Removeu-se o glutaraldeido em exces. so por diálise ou filtração de gel.

misturaram-se 3 mg de lipossomas activados com 1 mg ca da de polipeptídeo PeDV gp 70, ajustando-se o volume a 1 ml e subindo o pH por adição de 100 A de NaCOj 1 M pH 9,6. Ineubou-se a mistura durante a noite e purificou-se a partir de po. lipeptídeo não ligado por filtração de gel (por exemplo S-300).

Extraiu-se o polipeptídeo-áoido gordo com N-decanoil-N-metilglucamina (MEGA.-10) e separou-se do lípido em excesso por centrifugação num gradiente de sacarose (5-30% de sacarose) con tendo 0,3% de ME&Á-10.

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-55Recolheu-se o polipeptídeo, adicionou-se Quil A para uma concentração final de 0,1% e dialisou-se extensivamente a mistu ra contra PBS, nas primeiras 4-6 horas à temperaturt* ambiente, e em seguida a +4²C.

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um complexo imunogénico, constituído por uma molécula veículo, caracterizado por se pre.

   ) parar a molécula veículo misturando vírus, micoplasmas, bactérias, parasitas, células animais, proteínas ou peptídeos contendo regiões hidrofóbicas com um ou mais agentes solubilizante s para formarem um complexo entre proteínas ou peptídeos e agente solubilizante; e em seguida se separarem as proteínas e peptídeos do agente solubilizante na presença de uma solução glicósida contendo um ou mais glicósidos contendo regiões hidrofóbicas e hidrofílicas numa concentração igual pelo menos â concentração micelular crítica, ou separarem-se alternativamente as proteínas ou peptídeos do referido agente solubilizan te e se transferirem directamente para a referida solução glicósida, em que se forma um complexo de proteína com glicósido, sendo o complexo isolado e purificado, e em seguida se ligar a molécula veículo a moléculas escolhidas de entre peptídeos, proteínas, carbohidratos, lipoproteínas, glicolípidos ou bioti na ligando entre grupos de ligação funcionais nas moléculas li gadas ao veículo e grupos funcionais nas moléculas veículo.
2. 2 - Processo de acordo oom a reivindicação 1, caracterizado por as moléculas ligadas ao veículo serem seleccionadas de entre peptídeos entre 1-40, particularmente 10-25 aminoácidos, em que quando o numero de aminoácidos é < 10, os peptide. os poderem ser ligados às cadeias alifáticas com 2-12 átomos de carbono e 6-26 grupos OH ou peptídeos contendo 1-20 aminoácidos, preferivelmente aminoácidos hidrofílicos, via grupos funcionais, tendo particularmente sequências de aminoácidos re. presentativos para Malária, Polio, particularmente 277-300,

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   peptídeos obtidos do vírus da Hepatite-B, particularmente peptídeos nas regiões 32-74, 110-156 e particularmente peptídeos contendo as sequências de aminoácidos 144-145, vírus da raiva, particularmente peptídeos nas regiões 1-50, 290-320 e partieularmente na região 100-175, peptídeos do vírus da Gripe conten do a sequência de aminoácidos 140-146, 187-196 ou escolhidos nas regiões Cys 52-Cys 278 ou 207-220, e vírus de doença da f£ bre aftosa, particularmente os peptídeos do vírus ua doença da febre aftosa, 141-160, 144-160, 146-154, 144-150, 14-2-158, faç tores de crescimento de células-T, preferivelmente peptídeos com as sequências de aminoácidos 79-92, 139-1530, 111-125 e 18-32C, peptídeos obtidos do vírus de Epstein Barr, particularmen te as sequências A: Asp, Val, Gly, Gly, lys, Lys, His, Gin, leu , Asp, Cys, leu, leu; B: His, His, Ala, Glu, Asn, Gin, Asn, Pro, Cys, leu, Leu; C: Ala, Trp, Pro, Asn, Asn, Thr, Glu, Thr, Asp, Phe, Lys, Cys, Leu, Leu, determinantes antigénicos de HTLV 1,

   2 ou 3 peptídeos de vírus nas substâncias de grupos sanguíneos; peptídeos, polipeptíueos e grandes proteínas, particularmente hormonas esteróides, hormonas peptídeos e hormonas de prostaglandina, como por exemplo tirotropina, adenocorticotropina, hormonas luteinizantes, hormona da libertação de gonadotropina, hormonas estimulantes do folículo, prolactina, hormonas do

   I crescimento, oxitocina, vasopressina, hormona paratiroideia, cal citonina, insulina, glucagona e enzimas como por exemplo lisosi. ma e peroxidase; carbohidratos e estruturas contendo carbohidratos, como por exemplo lipopolissacarídeos, polissacarídeos de microrganismos com cápsulas, como por exemplo E. coli, particularmente antigenes-E 1-13, influenza I-iaemophilus, meningocoeos, a parte oligossacarídea das glicoproteínas nas substânci. as dos grupos sanguíneos em gangliósidos, tais como GL1, e glio. magangliósidos.
3. 3 - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ca racterizado por 0 veículo se obter escolhendo as proteínas da membrana do vírus revestido, particularmente Orthomyxo-viridae,

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   Ea/nbg

   . -57Paramyxo-viridae, Retroviridae, Rabdo-viridae, Toga-viridae, Herpes-viridae e virus- ^-Hepatite, proteínas da membrana de toxoplasma, Picorna-viridae, Parvo-viridae, Reo-viridae não re. vestidos, e ter-se escolhido 0 glicósido de saponinas como por exemplo extracto de glicósido de, por exemplo, Quillaja sapona ria molina, Aesculus hippocastanum ou Gypophilla struthim, pre. ferivelmente DQ, Quil A, aescina, sapoalbina.
4. 4 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por 0 veículo se ter obtido escolhendo as proteínas e os peptideos de proteínas de membrana hidrofóbica

   ou proteínas de origem não-membrana e proteínas não-hidrofóbicas de vírus, micoplasmas, bactérias, parasitas, células animais, tornando-se hidrofóbicas as referidas proteínas não-hidrofóbicas por meio de ligação a elas de grupos hidrofóbicos escolhidos de entre grupos alifáticos, peptideos hidrofóbicos e outras estruturas hidrofóbicas, por exemplo esteréides como por exemplo ácido eólico e derivados do colesterol, proteínas anfipáti cas que têm sido tornadas disponíveis por desnaturação moderada; ou por proteínas ou peptideos sintéticos ou produzidos por técnicas de ADN híbrido.
5. 5 - Erocesso de acordo com as reivindicações 1 a 4, ca racterizado por se obter o veículo formado por vírus, micoplaç mas, bactérias, parasitas, células animais ou peptideos ou pro. teínas hidrofóbicas misturados com 0 agente solubilizante esco lhido de entre detergentes iónico, não-iónico,"Zwitteriónico"

   ou de ácido gálico, álcoois, pequenas moléculas anfipáticas, pejo tídeos ou proteínas solúveis em água ou suas misturas em solução tamponada, possivelmente salina, sendo a mistura colocada no topo de uma solução contendo um agente solubilizante, que está por sua vez sobre um gradiente contendo glicósido e é ceç trifugada a pelo menos 100 000 g, sendo a fracção de proteína isolada, aialisada contra uma solução tampão ou por células de microrganismos, proteínas ou peptideos, após se terem mistura do com 0 agente solubilizante em solução salina tamponada fazen

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   Fa/nbg

   do reagir com glicósido e dialisada contra tampão preferivelmente acetato de amónio ou colocada directamente num gradiente e centrifugada pelo menos a 100 000 g, e em seguida se recolher a fracção superior contendo proteína, reagir com glicósido e dialisar contra tampão, preferivelmente acetato de amónio ou pela mistura de microrganismos, células animais, proteínas ou peptídeos e agente solubilisante no tampão ou na fracção su perior de proteína obtida quando a mistura de microrganismos, células, proteínas ou peptídeos e agente solubilizante em solu ção salina tamponada é centrifugada através de um gradiente sendo separada por electroforese ou por cromatografia do agente solubilizante e recolhida numa solução contendo o glicósido, e em seguida se concentrar possivelmente o complexo de proteína obtido, por exemplo por liofilização, diálise a pressão reduzida ou ultracentrifugação ou se purificar adicionalmente por centrifugação de gradiente.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir aproximadamente 1 mg, preferivelmen te 250-500 yug da molécula que se pretende ligar com aproximadamente 1 mg (medido como teor de proteína) da molécula veículo na ligação entre os grupos funcionais.
7. 7 - Processo de preparação de uma composição imuno-estimulante, caracterizado por a referida composição conter como substância activa pelo menos um agente imunogénico preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, opcionalmente em mistura com aditivos farmaceuticamente aceitáveis.
8. 8 - Processo de preparação de uma vacina, caracterizado por se incorporar como substância activa pelo menos um complexo imunogénico preparado de acordo com qualquer das reivindi. cações 1-6.

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   Ba/nbg

   -599 - Processo ds preparação de reagentes, caracterizado por se incorporar pelo menos um complexo imunogénico preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1-5·

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