PT81402B

PT81402B - Processo de transformacao de leveduras do genero pichia e de isolamento de genes e sequencia adn das mesmas

Info

Publication number: PT81402B
Application number: PT81402A
Authority: PT
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1984-10-30
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 1987-11-11
Also published as: MX430A; ATE68204T1; DE3584353D1; JPS61108383A; IL76763A; IE852473L; SG43092G; US4879231A; AU4875685A; EP0183070A2; IL76763A0; ZA858180B; FI854145L; FI94428C; NO854334L; DK496485D0; PT81402A; DK496485A; EP0183070B1; NO178975C

Description

Descrição dos Desenhos

A Pig. 1 é A Pig. 2 é A Pig. 3 é A Pig. 4 é A Pig. 5 é A Pig. 6 é

um mapa de um mapa de um mapa de um mapa de um mapa de um mapa de

restrição do restrição do restrição do restrição do restrição do restrição do

plasmideo pYA2. plasmideo YEpl3. plasmideo pYA4. plasmideo pYJ30. plasmideo pYJ32. plasmideo pSAOH5.

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-6As seguintes abreviaturas são usadas ao longo do pedido, e representam os enzimas de restrição utilizados:

Abreviatura

Enzima de Restrição

Hr

Ps

Rr5

S

Sm

Sp

^S3

Xh

BamHI.

BglII

HindIIl

RruI

PstI

EcoRI

EcoRV

Sall

Smal

Sphl

Sau3AI

Xhol

A convenção utilizada nas Eiguras é mostrar entre parêntesis o local do enzima de restrição que foi usado para a construção da sequência de ADN mas que foi destruído depois da ligação da construção (‘'construct").

Descrição Detalhada do Invento

De acordo com o presente invento, fornece-se um proces. so de transformação para o material ADR recombinante em células hospedeiras do género Pichia.

Ainda de acordo com o presente invento, obtém-se novas estirpes de levedura do género Pichia que são úteis como hospe. deiras para introduzir o material ADR recombinante.

De acordo com outro arranjo do invento, apresenta-se um processo de isolamento dos genes funcionais e de outras sequências de ADR funcionais do genoma de leveduras do género Pichia.

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-7Desenvolvimento do Sistema de Transformação da Piohia pastoris

A transformação da Piohia pastoris não foi nunca descrita. Os processos experimentais para transformação da Pichia pastoris estão apresentados mais abaixo (Exemplo III) em maior detalhe. Para desenvolver o sistema de transformação da P. pastoris, isolou-se o mutante auxotrófieo GS115 (NRRL Y-15851) e verificou-se ser defeituoso na síntese da histidina pois que a estirpe não apresentava actividade detectável de histidinol dehidrogenase (Ver processo de avaliação no Exemplo II).

Os peritos da arte sabem que as frequências de mutação podem ser aumentadas de diversas maneiras como por exemplo sujeitando o crescimento exponencial das células à acção de diversos agentes mutagénicos, como por exemplo a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, o metanossulfonato de etilo, irradiação ultravioleta e outros. 0 isolamento e identificação de es. tirpes mutantes defeituosas numa síntese metabólica específica pode conseguir-se determinando o nutriente ou nutrientes necejs sários à estirpe para o seu crescimento, como se detalha, por exemplo, no Exemplo I. 0 gene específico e o produto do gene no qual a estirpe mutante é defeituosa podem então ser determi nados por identificação da actividade enzimática ausente, como se descreve no Exemplo II.

As estirpes de levedura do género Pichia e especialmen te as estirpes mutantes Pichia do invento podem ser transforma das por digestão enzimática das paredes das células para se obterem esferoplastos; os esferoplastos são então misturados com o ADN transformador e incubados na presença de iões de cál cio e polietilenoglicol, depois regenerados num meio selectivo de crescimento. 0 ADN transformador inclui o gene funcional

no qual a estirpe hospedeira é defeituosa, por isso só células transformadas sobrevivem no meio selectivo de crescimento usado.

Para preparar esferoplastos de Pichia, as células são

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primeiro postas em contacto com um agente reductor de grupo sulfidrilo como por exemplo ditiotreitol ou -mereaptoetanol. Um exemplo de uma solução específica contendo um agente redutor de grupo sulfidrilo é o ditiotreitol em tampão SEU des crito nos Exemplos. A digestão enzimática das paredes das células pode ser conseguida pondo em contacto a estirpe a ser transformada com qualquer dos muitos reagentes para degradar as paredes das células, já conhecidos dos peritos na arte, como por exemplo a Zymolyase (láiles Laboratories), Glusulase (En do Laboratories) e outros. Ainda que se possa operar com uma grande diversidade de temperaturas, tempos de contacto e níveis de dosagem, geralmente quando se usa, por exemplo, Zymolyase 60 000 (60 000 unidades/g) empregam-se de cerca de 10 y^g até cerca de 100 yg do reagente degradador da parede da célula, por 10 ml de suspensão de células, quando se pretende formar esferoplastos. De preferência usa-se cerca de 40-50 fg de Zymolyase 60 000 por 10 ml de suspensão de células. A tempera tura é geralmente mantida a cerca de 25 QC ou acima, mas abaixo de cerca de 35²C· De preferência mantém-se a temperatura a cer ca de 3020. 0 tempo de contacto é geralmente superior a- cerca

de 15 minutos e usualmente não excede cerca de 60 minutos.

Ainda que muitos meios tamponados sejam adequados, é essencial que as células a serem convertidas em esferoplastos sejam sus. pensas em tampão que seja iso-osmético com as células, como p. ex., o tampão SOE (sorbitol/citrato/EDTA; ver Exemplos).

Os esferoplastos podem ser transformados por contacto com virtualmente qualquer quantidade de material ADN recombinante. Geralmente usam-se pelo menos cerca de 0,01 de ADN

transformador por 100 Al de solução contendo esferoplastos ^z γ

(contendo entre cerca de 1-3x10 esferoplastos por 100 yul). Quando sé há disponíveis pequenas quantidades de material ADN recombinante, pode usar-se ADN de E. coli, tratada por ultra-sons, para suplementar a quantidade de ADN disponível, melhoran do assim as frequências de transformação por minimização de per

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das de manuseamento de material ADN recombinante durante a manipulação experimental.

Os esferoplastos transformados são então tratados em condições de regeneração da parede celular. As condições de regeneração da parede celular compreendem a adição de uma amos, tra contendo esferoplastos transformados, a agar de regeneração fundido, mantido a cerca de 40-6020. Um agar de regeneração típico dá um meio osmótico equilibrado e compreende:

sorbitol cerca de 1 M

dextrose ca. 0,1 M

base azotada de levedura ca. 7 g/1

bacto-agar ca. 3%

Os esferoplastos transformados em agar de regeneração fundido são vertidos sobre uma camada de fundo constituída por agar de regeneração e são então incubados a cerca de 25—35-0 durante cerca de 3-10 dias.

A Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115) tem sido transformada por um certo número de plasmideos. Alguns destes pias, mídeos são novos e portanto têm sido postos à disposição do pú blico por depósito no "Northern Regional Research Center" em Peoria, Illinois. Os plasmideos e os seus números de acesso estão tabelados abaixo (todos os plasmideos têm sido depositados numa hospedeira E. coli).

Designação do

Plasmideo inventor da estirpe

N². de acesso no NRRL

pYA2 LE392-pYA2 B-15874 PYJ30 LE392-pYJ30 B-15890 pYJ32 LS392-pYJ32 B-I589I pSA0H5 M01061-pSA0H5 B-15862

0 plasmideo pYA4 foi também usado para transformar GS115; θΐθ deriva do vector de transporte YEpl3 da S.. cerevisi ae-E. coli (está disponível na ATCC 7^37115; ver Figura 2).

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-10Assim o plasmídeo pYA4 é o YEpl3 mais um fragmento de digestão parcial da Sau3A, de 6,0 kbp, do ADN cromossómico da Pichia pastoris que inclui o gene HIS4 (ver Pigura 3) ligado ao único local BamHI de YEpl3.

0 plasmídeo pYA2 (ver Pigura 1) contém sequências de ADN de pBR325 e um fragmento PstI, de 9,3 kbp, de £!. cerevisiae, que inclui o gene HIS4 da S. oerevisiae. Poi surpreendente descobrir que o gene HIS4 da ,S. oerevisiae no plasmídeo pYA2 actuou na Pichia. Uma outra observação surpreendente foi o facto de pYA2, que transforma S. Oerevisiae a baixa frequência por recombinação integrante, ter transformado a Piohia a elevada frequência e ter-se mantido como elemento extracromossómico na NRRI-Y-15851 durante várias gerações do seu desenvol vimento.

0 plasmídeo pYJ30, que se indica na Pigura 4, tem sequ ências ADN de pBR322, um fragmento BglII de 2,7 kbp do ADN oro, mossómico da Pichia, que tem o gene HIS4 da Pichia e um fragmento Saql de 164 bp do ADN cromossómico da Pichia que tem actividade de sequência de replicação autónoma (PARS1). Este pias, mídeo tem também sido usado para transformar NERI Y-15851 (GS 115) e a transformação ocorre a elevada frequência. Este pias, mídeo é útil para introduzir material ADN recombinante num hos pedeiro Pichia. Por exemplo 0 plasmídeo pSA0H5 (ver figura 6) derivou deste plasmídeo por inserção do gene lacZ da E. coli e da região reguladora da álcool oxidase no único local R-^ de PYJ30. 0 plasmídeo pSA0H5, indicado no Exemplo IV abaixo, é capaz de produzir um produto polipeptidico não nativo à célula hospedeira na Pichia pastoris.

0 plasmídeo pYJ32, indicado na Pig. 5, é semelhante a pYJ30, excepto na actividade de replicação autónoma que é fornecida por PARS2, um fragmento ADN cromossómico, 385 bp Saql, da Pichia. Este plasmídeo é também capaz de transformar a Pichia pastoris NRRI Y-15851 a elevadas frequências.

A transformação das estirpes de leveduras do género

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Pichia, como aqui se demonstrou, torna possível a introdução do material ADN recombinante nas leveduras hospedeiras. Gomo se detalha nos exemplos seguintes, as estirpes de leveduras trans, formadas do género Pichia são úteis por exemplo para a produção de polipéptidos por uma levedura hospedeira.

De acordo com outro arranjo do presente invento, apresenta-se um processo para isolamento de genes funcionais e outras sequências de ADN funcionais das estirpes de leveduras do género Pichia. Para isolar os genes funcionais, o processo com preende a complementação de uma estirpe defeituosa de Pichia pastoris com fragmentos clonados de ADN cromossómico de Pichia, a selecção de estirpes transformadas que sobrevivem a condições selectivas de crescimento, onde as condições selectivas de crescimento compreendem meios pobres sem o produto de gene necessário para o crescimento da estirpe hospedeira defeituosa, o isolamento e recolha das inserções de ADN da Pichia dos pias mídeos contidos nas estirpes transformadas seleceionadas. Por exemplo, pode isolar-se o gene DSU2 da Pichia por transformação de um mutante leu2 da P. pastoris com uma colecção de ADN cromossómico da Pichia e escolhendo as estirpes transformadas que sobrevivem na ausência de suplementação de leucina ao meio. De modo semelhante, pode isolar-se o gene ARG-4 da Pichia por transformação de um mutante apropriado da P. pastoris com uma colecção de ADN cromossómico da Pichia e procedendo como acima, excepto o meio de selecção não possuir histidina ou arginina suplementares, respectivamente.

Os peritos da arte reconhecem que outras sequências ADN funcionais podem ser isoladas usando o sistema de transfor mação do presente invento. Tais sequências incluem:

- sequências de replicação autónoma (ARSs)

- sequências centroméricas (CSENs)

- terminii cromossómicos (telómeros)

- sequências promotoras e reguladoras

- terminadores de transcrição e tradução

- e outros.

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-12EYEMPDOS

Os tampões e soluções utilizadas nos seguintes exemplos têm as seguintes composições:

1 ffi tampão Tris	121,1 g de base Tris em 800 ml de H₂0; ajuste do pH até ao desejado valor por adição de HC1 aquoso concentrado (35$); deixar a solução arrefecer até temperatura ambiente antes do ajuste final do pH; diluir até ao volume fi nal de 1 1.
Tampão TE	1,0 mM EDTA em 0,01 M (pH 7,4) tampão Tris
Meio YPD	1$ Bacto-extracto de levedura 2$ Bacto-peptona 2$ Dextrose
Meio SD	6,75 g base azotada de levedura sem aminoácidos (DIPOO) 2$ Dextrose em 1 1 de água.
SED	1 M Sorbitol 25 mM EDTA 50 mM DTT
Tampão SOS	9,1 g Sorbitol 1,47 g Citrato de Sódio 0,168 g EDTA 50 ml H₂0 —pH até 5,8 com HC1
OaS	1 M Sorbitol 10 mM 0aCl₂ esterilize por filtração
Solução PEG	20$ polietilenoglicol 3350 10 mM CaCl₂ 10 mM Tris-HOl (pH 7,4) esterilize por filtração

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-13SOS

1 M Sorbitol 0,3x meio YPD 10 mM CaCl

LM (meio mínimo ou pobre)

0,875	g	EH₂P0₄
0,125	g	n₂hpo₄
1,0 g		(nh₄)₂so₄
0,5 g		MgS0₄.7H₂0
0,1 g		NaOl
0,05 ;	mg	PeCl₃.6H₂O
0,07 .	mg	ZnS0₄.7H₂0
0,01 :	mg	H3BO3
0,01 j	mg	CuSO₄.5H₂O
0,01 j	mg	NI
0,1 g		CaCl₉.2H₉0

MM "minus” Tampão Citrato

>

Solução de Nistatina

Tampão E

Mistura de Vitaminas

por litro de água estéril. Formulação MM sem (SH^^SO^

9»79gCitrato de sódio

3,2 g ácido cítrico

dilua até 500 ml com B^O

ajuste a pH 5,5 eom 1 N NaOH

4,4 mg nistatina (5680 Unidades/mg) 1 ml dimetilformamida diluir até 10 ml com água

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

0,01 mM histidinol

50 Λ MgS0₄

1 mM DTT

ácido p-aminobenzoico ácido p-hidroxibenzóico riboflavina

pantotenato

^B12

ácido fólico

piridoxina

50 mg/100 ml

50

25

50

1

50

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-14"

biotina	5
ti ami na	10
ácido nicotínico	50
inositol	2000

As seguintes abreviaturas são usadas ao longo do exemplo, com o seguinte significado:

RTG R-metil-R’-nitro-R-nitrosoguanidina DTT ditiotreitol

RAD nicotinamida adenina dinucleotido

SDS dodecilsulfato de sódio

ala alanina

arg arginina

asn asparagina

asp ácido aspártico

cys cisteina

glu ácido glutâmico

gin glutamina

gly glicina

his histidina

ile isoleucina

leu leucina

lys lisina

met metionina

phe fenilalanina

pro prolina

ser serina

thr treonina

trp triptofano

tyr tirosina

vai valina

EXEMPLO 1

Isolamento de Lutantes Àuxotróficos

A. Pichia Hutagenesis

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-15Uma cultura de uma estirpe de levedura seleccionada, co. mo por exemplo a Pichia pastoris NRRD Y-11430, foi inoculada num caldo YPD, 100 ml, e incubada a 302 0 num agitador durante 12-20 horas. Cerca de 40 ml da cultura resultante foi centri. fugada a cerca de 2000 g durante 5 minutos, lavaram-se as cê lulas duas vezes com alíquotas de 40 ml de 0,1 M tampão citrato (pH 5,5)· As células lavadas são suspensas em 36 ml de tam pão citrato estéril, tratadas depois com 4 ml de solução NTG contendo 5 mg de NTG por ml, dando assim uma concentração final de NTG de 500 yg/nil. As células na presença de NTG foram deixadas em repouso durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente sem agitação.

NTG foi então removido lavando as células duas vezes com alíquotas de 40 ml de água desionizada estéril. Usou-se suficiente meio YPD para suspender as células lavaaas que foram então transferidas para um balão e levou-se o volume até 100 ml com YPD adicional. Estas células obtidas por mutação foram, então incubadas a 302 0 sob agitação durante cerca de 48 horas.

Após incubação, cerca de 40 ml da solução contendo as leveduras foram centrifugados a 2000 g durante 5 minutos. 0 pe. letizado cie células foi lavado duas vezes com alíquotas de 40 ml de água estéril, desionizada, depois suspenso em 40 ml de meios MM "minus" mais 1$ glucose como fonte de carbono e 5 y*g biotina e incubado a 3020 sob agitação durante 12 a 20 horas.

D· Enriquecimento pela Nistatina

5 ml da cultura acima referida desenvolvida em glucose foi usada para inocular 100 ml de "meio restricto". Meio restricto compreende a formulação MIA mais fonte de carbono (ti picamente 1$ glucose), vitamina/suplemento de amino ácido adequado (tal como a mistura de vitaminas acima referida), excepto em que não se fornece suplemento para o metabólito fornecido

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-16por via biossintética na qual se procura um defeito. Por exem pio onde a leucina auxotrófica é desejada nenhum suplemento de leucina será fornecido. 0 inoculo no meio restricto foi incubado a 3020 num balão agitado e controlado periodicamente por um colorímetro fotoeléctrico Elett-Summerson, equipado com um filtro verde de 500-570 milimicron. A incubação continuou até a leitura da escala (que é proporcional à densidade óptica) au mentar 20-30% em relação à leitura original da escala.

Quando a leitura da escala tiver aumentado o desejado, trata-se a solução com 1 ml de solução de Nistatina, com um teor de Nistatina ("Nystatin") de cerca de 25 unidades/ml na so luçâo. A solução tratada pela Nistatina foi incubada a 30^e du rante 90 minutos sem agitação, ao fim dos quais 40 ml da solução foi centrifugada e as células foram lavadas duas vezes com aliquotas de 40 ml de água desionizada. As células lavadas fo. ram então diluídas conforme for adequado para obter 100-150 co lónias por placa. As colónias são colocadas em placas sobre meio de crescimento mutante que consiste em meio RL, fonte de carbono (tipicamente 1% glucose), 5 yzg biotina e suplementação para qualquer metabôlito produzido pela biossíntese na qual se procura o defeito mutacional.

As colónias foram colocadas em placas sobre o meio de crescimento mutante e foram também colocadas noutras placas onde o meio de formulação não possuia suplementação do metabólito. As placas originais e as de réplica foram incubadas a 3020 durante pelo menos 48 horas. As colónias que cresceram na placa original (no meio de crescimento mutante) mas não nas pia cas de réplica foram escolhidas para posterior caracterização.

Os mutantes auxotróficos seleccionados foram transferi, dos para placas de mistura metabólica e incubadas a 302C duran. te pelo menos 48 horas com vista a determinar em que síntese(s) existiam defeitos mutacionais.

As placas de mistura foram preparadas dissolvendo 10 mg/ml do isómero 1 de cada um dos 5 diferentes aminoácidos seguintes:

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	1	2	3	4	5
6	giy	asn	cys	met	gin
7	his	leu	ileu	vai	lys
8	phe	tyr	trp	thr	pro
9	glu	ser	ala	asp	arg
	Assim a	placa 1 contém 10	mg/ml de	cada: glicina,	his-

tidina, fenilalanina e ácido glutâmico; a placa 2 contém 10 mg/ml de cada: asparagina, leucina, tirosina e serina, e assim por diante. Preparou-se uma décima placa dissolvendo 1 g de ácidos de Oasamino em 1 1 de água estéril.

Uma aliquota de 250 r de cada uma das misturas 1 a 10 foi aplicada a placas contendo meio pobre mais 1% de glucose e deixaram-se as placas a secar durante a noite.

0 defeito mutacional de um dado mutante pode ser deter minado por inspecção do esquema de crescimento nas várias placas de mistura. Assim G-S115, uma mutante defeituosa na síntese da histidina, cresceu somente nas placas 1, 7 e 10, mas não nas outras placas de mistura que não continham suplementação de histidina. De modo semelhante, GS190, um mutante defeituoso na síntese da arginina, cresceu somente nas placas de mistu ra 5, 9 θ 10, mas não cresceu nas outras placas de mistura que não têm suplementação de arginina.

ΕΣΕΜΡ10 II

Identificação de Mutantes da Pichia pastoris Defeituosos na

Actividade de Histidinol Dehidrogenase

A. Ensaio de Placa

A separação inicial de mutantes que necessitam de histidina, preparados como se descreve no Exemplo I, realizou-se para identificar os mutantes defeituosos no local his4C (isto é, falta de actividade histidinol dehidrogenase). Uma "placa-

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-mestra" de mutantes auxotróficos de histidina foi preparada com meio KM, 1$ glucose, mistura de vitaminas (1 ml por 1 de meio) e 0,2$ de ácidos casamino. A "placa-mestra" foi incubada a 302 C durante pelo menos 48 horas e depois prepararam-se 4 placas de réplica a partir da placa-mestra:

(1)	KM "minus" + 5 gik biotina + 1$ glucose histidinol	+ 0,2$
(2)	MM meio + 5 yg biotina + 1$ glucose + histidinol	0,0002$
(3)	KM "minus" + 5 y/g biotina + 1$ glucose histidina	+ 0,2$
(4)	MIá meio + 5 Jbg biotina + 1$ glucose + histidina	0,002$

Estas 4 placas foram incubadas a 302 0 durante pelo menos 48 horas. As colónias que cresceram nas placas (3) e (4), mas que não cresceram nas placas (1) ou (2), foram escolhidas para análises posteriores.

B. Análise Enzimática

0 primeiro passo no processo de avaliação da histidinol dehidrogenase, foi desenvolver uma cultura de 200 ml de uma estirpe em meio YPB, sob agitação, a 3020, até uma ΟΒ^θθ de 1,0. A cultura foi então centrifugada a 2000 g durante 5 minutos e as células foram suspensas em 200 ml do meio SB e in cubadas sob agitação a 302 0. Após 6-12 horas a cultura foi re colhida por centrifugação e o peletizado de células foi armaz£ nado a -202C.

0 passo seguinte foi preparar um extracto de células da cultura. Um grama (peso líquido), aproximadamente, de células foi lavado 2 vezes em 10 ml de HgO fria (4²0) e suspenso em 0,83 ml de tampão E frio. Para romper as células, a amostra foi passada através de uma célula de pressão "Amineo _

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-19Erench" equipada com. um pistão de - 1 cm (0,374 inch) de diâmetro e com uma prensa "Aminco Erench" a 20 000 PSI. A célula de pressão foi mantida em gelo até ser utilizada e o processo foi conduzido numa câmara frigorífica (420). Para controlar a ruptura das células, juntou-se uma amostra de 10 y<l a 10 ml de água, determinou-se a sua ΟΡ^θθ θ comparou-se com uma amostra identicamente preparada que não tinha passado pela célula de pressão. Se a densidade óptica da amostra tratada for supe. rior a 50% da do controlo, a amostra é submetida uma segunda vez ao processo de disrupção. Centrifuga-se então o extracto num rotor Beckman SW50.1 a 35 000 rpm e a 4^QC durante 30 minutos para remover restos de células. Retira-se o sobrenadante, misturado com igual volume de glicerol a 4²C e armazena-se a -202G.

A concentração da proteína total num extracto é estima da usando o método de avaliação de proteína dos Laboratories Bio-Rad. Para este fim o Reagente Concentrado Bio-Rad Corante é diluído com quatro volumes de água desionizada e filtrado por papel Y/hatman 3 Mvi. Preparou-se então uma curva padrão de con centrações juntando 3, 10, 30 e 100 yUg de albumina de soro bo. vino (BSA) em 100 yxl de tampão E com 50% glicerol a um conjun to de tubos de vidro 13x100 mm, contendo cada um 2,5 ml do rea gente corante. As amostras foram misturadas e mantidas à temperatura ambiente durante 5 minutos e foram determinadas as su as densidades ópticas a 595 mm. Para analisar o extracto, amos, tras de 3, 10 e 30 jd foram levadas até 100 Λ¹ com a solução contendo tampão E e 50% glicerol, e avaliou-se o teor proteico como acima se descreve. 0 valor para a concentração proteica de cada extracto foi então interpolado usando a curva de concen trações BSA.

0 passo final para avaliar a actividade histidinol dehi drogenase num extracto foi medir essa actividade histidinol de. hidrogenase no extracto em causa avaliando espeetrofotometrica mente a redução de HAD que ocorre na presença de histidinol. Para cada extracto a, ensaiar preparou-se em gelo uma mis tura reagente contendo 3 ml de HgO, 0,5 ml de 0,5 M glicina

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-20(pH 9,4), 0,5 ml de 5 mM MnCl₂ θ 0,5 ml de 0,1 M NAD. Uma alí

quota de 2,25 ml desta mistura foi adicionada a 2 tubos 13x100

mm de vidro, em gelo. Uma amostra que continha entre 50 e 500

Atg de proteína foi adicionada a cada um dos tubos e os tubos /

foram incubados a 252c. Após 5 minutos a reacção foi iniciada pela adição de 0,25 ml de 0,15 M histidinol a um dos tubos e 0,25 ml de H₂0 ao outro tubo. Determinou-se a densidade óptica de cada tubo de reacção a 340 nm a intervalos de 0,0, 0,5, 1,0 e 2,0 horas como controlo foram ensaiados em paralelo extractos preparados da Pichia pastoris NRRD Y-11430 e de Saccharomyces cerevisiae 5799-4D (NRRD Y-15859)· 0 valor real 0D^₀

para cada intervalo de tempo foi determinado subtraindo 0 valor obtido na amostra incubada sem histidinol do valor obtido da amostra incubada com histidinol.

Enquanto que a Pichia pastoris NRRD Y-11430, um tipo de estirpe natural ou bravia que não necessita de suplementação em aminoácidos, deu uma 0D^₀ de cerca de 0,25, 0,38 e 0,75 respectivamente às 0,5, 1,0 e 2,0 horas, 0 mutante his40 de co£ trolo (S.. cerevisiae NRRD Y-15859) deu uma Οΰ^θ de essencialmente zero a todos os intervalos de tempo. Um mutante de Pichi a pastoris, designado por GS115 e depositado no "Northern Regional Research Oenter" com 0 NS. de acesso NRRD Y-15851, deu analogamente uma ΟΌ^θ de essencialmente zero em todos os intervalos. Para ser consistente com a nomenclatura do genotipo mutante utilizado para a S. cerevisiae, 0 G-S115 foi designado como estirpe mutante his4C.

EXEMPLO III

Processo de Transformação da Pichia pastoris

A. Crescimento de Células

1. Inocule uma colónia de Pichia pastoris G-S115 (NRRD Y-15851) em cerca de 10 ml de meio YPD e agite a cultura a 302 C durante 12-20 horas.

64 ^4ΐ

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-212. Após 12-20 horas dilua as células até uma ΟΡβθθ de oerea de 0,01-0,1 e mantenha as células em crescimento logarítmico em meio YPD a 302 0 durante cerca de 6 a 8 horas.

3. Após cerca de 6-8 horas inocule 100 ml de meio YPD com 0,5 ml da sementeira a uma de cerca de 0,1 (ou

quantidade equivalente). Agite a 3020 durante cerca de 12-20 horas.

4. Recolha a cultura quando a OD^qq foz* de cerca de 0,2-0,3 (após aproximadamente 16-20 horas) por centrifugação a 1500 g durante 5 minutos.

B. Preparação de Esferoplastos

1. lave as células uma vez em 10 ml de água estéril (todas as centrifugações para as etapas 1-5 são a 1500 g durante 5 minutos).

2. lave as células uma vez em 10 ml de SED recentemen te preparado.

3. lave as células duas vezes em 10 ml de 1 M Sorbitol estéril.

4. Suspenda as células em 10 ml de tampão SCE.

5. Junte 5-10 jbiL de 4 mg/ml Zymolyasa 60 000 (Miles Laboratories). Incube as células a 3020 durante cerca de 30-60 minutos.

Como a preparação de esferoplastos é uma etapa crítica no processo de transformação, deve-se controlar a formação de esferoplastos do modo seguinte: junte alíquotas de 100 yd. de células a 900 yi de 5% SDS e 900 yd âe 1 I Sorbitol antes ou logo a seguir à adição de Zymolyase e a vários intervalos durante o.período de incubação. Pare a incubação no ponto em que as células lisam em SDS mas não em sorbitol (habitualmente entre 30 e 60 minutos de incubação).

6. Lave os esferoplastos duas vezes em 10 ml de Sorbi

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tol 1 M estéril, por centrifugação a 1000 g durante 5-10 minutos (a duração e a velocidade da centrifugação podem variar; centrifugue o suficiente para peletizar os esferoplastos mas não tanto que se quebrem com a força).

7. Lave as células uma vez em 10 ml de CaS estéril.

8. Suspenda as células num total de 0,6 ml de CaS.

C. Transformação

1. Junte amostras de ADN (até 20 yÃL volume) a tubos de 12x75 mm, estereis, de polipropileno. (0 ADN deverá estar em água ou em tampão TE; para frequências máximas de transformação com pequenas quantidades de ADN, é aconselhável juntar cerca de 1 ydL de 5 mg/ml de ADN da E. coli, tratada por ultrasons, a cada amostra).

2. Junte 100 Jí de esferoplastos a cada amostra de ADN e incube à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos.

3. Junte 1 ml de solução PEG a cada amostra e incube à temperatura ambiente durante cerca de 15 minutos.

4. Centrifugue as amostras a 1000 g durante 5-10 minutos e decante a solução PEG.

5· Suspenda as amostras em 150 yUL de SOS e incube durante 30 minutos à temperatura ambiente.

6. Junte 850 A de Sorbitol 1 M estéril e coloque, em placas, aliquotas das amostras como se descreve abaixo.

D. Regeneração de Esferoplastos

1. Receita para meio de Agar de Regeneração:

a.

240 ml H₂0,

Agar-Sorbitol-9 g de Bacto-agar-54,6 g de Sorbitol, autoclave.

b. 10xGlucose-20 g Dextrose, 100 ml H₂0, autoclave.

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-23'

c. IOxSC- 6,75 g Base azotada de levedura sem aminoácidos, 100 ml HgO, autoclave. (Junte qualquer amino^ácido de. sejado ou ácido nucleico até uma concentração de 200 yMg/ml an tes ou depois da operaçao em autoclave).

d. Junte 30 ml de lOxGlucose e 30 ml de lOxSO à solução de Sorbitol-Agar fundido, obtendo-se um total de 300 ml. Junte 0,6 ml de 0,2 mg/ml biotina e qualquer outro aminoácido desejado ou ácido nucleico, até uma concentração de 20 ytg/ml. mantenha o Agar de Regeneração fundido a 55-6020.

2. Colocação em placas de amostras de transformação:

Verta no fundo de uma placa uma camada de agar de rege, neração, 10 ml por placa, pelo menos 30 minutos antes das amos, tras de transformação estarem prontas. Distribua alíquotas de 10 ml de Agar de Regeneração por tubos, em banho a 45-5020, du rante 0 período em que as amostras de transformação estão em SOS. Junte as alíquotas de amostras de transformação acima descritas aos tubos com Agar de Regeneração e verta sobre 0 fundo de agar das placas. Junte uma certa quantidade de cada amostra a alíquotasde 10 ml de Agar de Regeneração fundido, man, tido a 45-5020, e verta sobre placas contendo uma eamada de 10 ml de agar no fundo, Agar de Regeneração.

3. Determinação da qualidade da preparação de esferoplastos:

Retire 10 Λ de uma amostra e dilua 100 vezes pela adi ção de 990 y*l de 1 1 Sorbitol. Retire 10 /*1 da diluição lOOx e dilua mais lOOx pela adição de uma segunda aliquota de 990 yxl de 1 1 Sorbitol. Espalhe por placas, 100 Λ de ambas as dilui, ções sobre meio de agar YPD para determinar a concentração das células inteiras sem esferoplastos, que ficaram na preparação. Junte 100 z¹ de cada diluição a 10 ml de Agar de Regeneração suplementado com 40 ^wg/ml de histidina, para determinar a totalidade de esferoplastos regeneráveis. São valores bons para uma experiência de transformação 1-3x10 esferoplastos totais

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-24regeneráveis/ml e cerca de 1x10 de células inteiras/ml,

4. Incube as placas a 3Q²C durante 3-5 dias.

EXEMPLO IV

Produção da /-Galactosidase in Pichia pastoris

A produção de {$ -galactosidase na Pichia pastoris transformada demonstra a capacidade da levedura do género Pichia de ser utilizada como sistema hospedeiro/vector para a produção de produtos polipeptídicos. A Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) foi transformada com 0 plasmideo pSA0H5 (ver Pi gura 6) e cresceu num meio pobre contendo 0,5 yUg/ml de biotina e 0,1% glucose a 3Q²C até atingir uma fase estacionária. As células foram então mudadas para um meio pobre contendo 0,5/*ê’/ /ml de biotina e 0,5% metanol e cresceram por cerca de 3-5 gera çães a 30²C. Depois deste crescimento inicial em metanol, as células foram mudadas para um novo meio pobre contendo 0,5 ^txg/ /ml biotina e 0,2% metanol como fonte de carbono. As células foram incubadas a 30²C durante 80 horas, retirando-se periodicamente amostras para determinar os níveis de álcool oxidase e de -galac to sidade.

A primeira amostra retirada, imediatamente após as células terem mudado para 0 meio de crescimento, deu por análise mais de 500 unidades de álcool oxidase e mais de 1100 unidades da /•-galactosidase. Os processos de avaliação utilizados es. tão pormenorizados no apêndice.

Estes resultados demonstram a utilidade da Pichia pastoris como sistema hospedeiro/vector para a produção na levedu ra de produtos de genes. 0 plasmideo utilizado para transformar 0 hospedeiro, 0 plasmideo p8AOH5, é um plasmideo da Pichia que codifica a produção da / -galactosidase sob controlo de uma região reguladora que responda ao metanol. A estirpe trans, formada usada para esta demonstração foi depositada no "Northern Regional Research Center", está disponível para 0 público, com 0 número de acesso NRRL Y-15853.

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ro

-25Estes exemplos foram apresentados meramente para ilustrar a prática do nosso invento e não devem limitar o âmbito do nosso invento ou das reivindicações apensas. Variações razoáveis e modificações que nao se afastem da essência e do espíri to do nosso invento, estão contempladas pelo âmbito da patente de protecção desejada e procurada.

ΑΡΕΚΡΙ0Ξ

Avaliação da álcool oxidase

A actividade da álcool oxidase para a reaoção com o me. tanol foi determinada pelo seguinte processo de avaliação (método corante-peroxidase). Preparou-se uma mistura tampão-corante misturando 0,1 ml de uma solução de o-dianisidina (1% em peso de o-dianisidina em água) com 12 ml de tampão 0,1 M de fos. fato de sódio (pH 7,5)· A mistura de avaliação foi preparada com 2,5 ml da mistura tampão-corante, 50 yUl de metanol, 10 X de uma solução de peroxidase (1 mg de peroxidase de rábano-rús tieo-Sigma, Tipo II) e 25 yl da solução de álcool oxidase. A mistura de avaliação foi mantida a 2520 numa "cuvette" 4xlxl cm e 0 aumento de absorvância pelo corante a 460 nm foi registado durante 2 a 4 minutos. A actividade do enzima foi calculada pe. la expressão

min

Actividade ( y.mole/min/ml ou Unidades de Enzima/ml)

x 11,5

onde 11,5 é um factor baseado numa curva padrão preparada com alíquotas conhecidas de HgOg θ Δ A é a variação de absorvância durante 0 intervalo experimental.

Avaliação da fi -galactosidase

A /3 -galactosidade foi determinada do modo seguinte:

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•26A. Soluções necessárias

Tampão-Z:

Ooncentração Pinai

Na₂HP0₄	• 7H₂0	16,1	g	0,06 M
NáH₂P0₄		5,5	g	0,04 M
KOI		0,75	g	0,01 M
MgSO, ·	7H₂0	0,246	g	0,001 M
2-mercaptoetanol	2,7 ml	0,05 M
perfaça	1 litro;	0 pH deverá ser 7
O-Nitrofenil- β -	-D-galactosido (ONPG):
	Dissolva	400 mg de	OITPG (sigma N-1127)	em 100 ml

água destilada para preparar uma solução de 4 mg/ml OEPG

B. Processo de Avaliação:

1. Retire uma alíquota do meio de cultura (0,1-0,5 ΟΒ^θθ úe células de levedura), centrifugue e lave o peletizado de células com água.

2. Junte 1 al de tampão Z ao peletizado de células, 30 de GHCl^ e 30 yÀL de 0,1$ SDS, vortex, incube 5 minutos a 30^e0.

3. Inicie a reacção juntando 0,2 ml de ONPG (4 mg/ml), vortex.

4. Para a reacção juntando 0,5 ml de uma solução 1 M Na₂C0^

a intervalos apropriados <1).

5. Leia a absorvância do sobrenadante a 420 nm.

0. Cálculo das Unidades da β -galactosidase

1 U = 1 nmole de ortonitrofenol (ONP) formado por minuto a 3O2C e a pH 7·

1 nmole de ONP-tem uma absorvância a 420 nm (A₄₂q) de 0,0045 com uma célula de 1 cm; assim, uma absorvância de 1 a 420 nm representa 222 nmole OITP/ml, ou 378 nmole/1,7 ml uma vez que 0 volume total do sobrenadante em análise,

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é 1,7 ml. Daqui, calcularem-se as unidades do modo seguin te:

^{U =} ^0 _{χ 3?8}t(rnin)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo para transformar uma estirpe de levedura hospedeira do género Pichia, compreendendo o referido processo:

(a) pôr em contacto a estirpe de levedura hospedeira com um agente redutor do grupo sulfidrilo;

(b) pôr em contacto as células do produto da etapa

(a) com um reagente degradador da parede da célula, em condições adequadas à formação e manutenção de esferoplastos;

(c) pôr em contacto os esferoplastos criados na etapa

(b) com material ADN recombinante, em condições adequadas à transformação, e

(d) tratar o produto da etapa (c) em condições de regeneração da parede da célula; e opcionalmente

(e) crescimento das células do produto da etapa (d) sob condições de crescimento selectivas, sendo o dito material ADN recombinante obtido de preferência a partir de estirpes de levedura do género Pichia pelas seguintes etapas:

(f) preparar uma biblioteca tratando o ADN cromossómico de Pichia oom uma enzima de restrição apropriada para obter fragmentos ADN de Pichia e clonando os referidos fragmentos num veetor transportador de Pichia pastoris-Escherichia coli;

(g) transformar com a referida biblioteca uma estirpe de Pichia pastoris hospedeira que seja deficiente em pelo menos um caminho biossintético;

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-28(h) escolher as estirpes transformadas;

(i) promover o crescimento das estirpes transformadas escolhidas na etajoa (h), em condições de crescimento selec. tivas onde as referidas condições de crescimento selectivas compreendam meios contendo todos os nutrientes necessários pa ra o crescimento da levedura estando ausente o nutriente neces. sário para o crescimento da estirpe hospedeira deficiente não-transformada;

(j) isolar o ADN plasmideo a partir das estirpes transformadas, e

(k) recuperar as inserções ADN da Pichia a partir do ADN plasmideo.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 onde o agente redutor do referido grupo sulfidrilo é o ditiotreitol.
3 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde o agente degradador da parede da célula é a Zimoliase.
4 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde as referidas condições adequadas à forma ção de esferoplastos compreendem:

(i) 10-100 de reagente degradador da parede da eé

lula por 10 ml da suspensão de células; onde a referida suspensão de células é preparada suspendendo células crescendo ex ponencialmente em tampão 80Ξ;

(ii) manter a 25-35²0;

(iii) durante 15-60 minutos.
5 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde a referida estirpe de levedura hospedeira está deficiente no caminho hiossintético.
6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações

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precedentes onde a referida estirpe de levedura hospedeira está deficiente no caminho biossintético em pelo menos um aminoácido
7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde a referida estirpe de levedura hospedeira está deficiente no caminho biossintético da histidina.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7 onde o ra ferido caminho biossintético da histidina está deficiente no gene codificador da histidinol desidrogenase.
9 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde a referida estirpe é um membro das espécies Pichia pastoris.
10 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde a referida estirpe de levedura hospedeira é a Pichia pastoris NRRL Y-I585I (G8115).
11 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde as referidas condições de contacto compreendem:

(i) 2-10 volumes de solução de CaClg-polietilenoglicol por volume de suspensão contendo esferoplastos;

(ii) manter a 20-3020;

(iii) durante 5-30 minutos.
12 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde as referidas condições de regeneração da para de da célula compreendem:

(i) juntar esferoplastos transformados a, agar de rege, neração, onde 0 referido agar de regeneração compreende:

cerca de cerca de cerca de cerca de

1 M sorbitol

0,1 Ϊ dextrose

7 g/l de base de azoto da levedura e, 3% agar

(ii) manter a 25-35²0;

(iii) durante cerca de 3-10 dias.

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13 - Processo de acordo corn qualquer das reivindicações precedentes onde o referido material ADN recombinante compreende um gene funcional que preenche a deficiência no caminho biossintétiço, em que estirpe de levedura hospedeira é deficiente.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 13 onde o referido gene funcional é escolhido entre o grupo consistindo no gene Pichia HIS4 e gene Saccharomyces HIS4.
15 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde o referido material ADN recombinante com preende um gene codificador da histidinol desidrogenase.
16 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes onde o referido material ADN recombinante é o plasmídeo pYA2.
17 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 15 onde o referido material ADN recombinante é o plasmídeo pYA4.

>
18 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 15 onde o referido material ADN recombinante é o plasmídeo pYJ3O.
19 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 15 onde o referido material ADN recombinante é o plasmídeo pYJ32.
20 - Processo de acordo com a reivindicação 15, onde as ditas condições de crescimento selectivas compreendem o crescimento num meio de levedura mínimo sem histidina adiciona da.

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