PT85093B

PT85093B - Vector viral e processo para a preparacao de adn recombinante codificando para a proteina f do virus agente causador da s.i.d.a.

Info

Publication number: PT85093B
Application number: PT85093A
Authority: PT
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1986-06-16
Filing date: 1987-06-16
Publication date: 1990-03-30
Also published as: DE3789525T2; JPH01500962A; PT85093A; DK76688A; DE3789525D1; FR2600079A1; AU7514087A; AU614934B2; DK76688D0; ES2062990T3; KR880701285A; FR2600079B1; EP0253693A1; WO1987007642A1; EP0253693B1; ATE103980T1

Description

VECTOR V1RAL E PROCESSO PARA. A PREPARA. ÇÃO DE ADN RECOHBWkNTE CODIFICANDO PARA A PROTEÍNA F DO VIRUS AGENTE CAU

SADCR DA S.I.D.A.»

Na presente invenção descreve-se um vector virai caracterizado por compreender pelo menos:

. uma parte do genoma de um vírus.

. um gene codificando para a proteína F do vírus responsável pela SIDA, . assim como os elementos que asseguram a expressão desta proteína nas células.

Este vector virai pode ser utilizado a título de vacina no tratamento, na prevenção e no diagnóstico da SIDA

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Descrição do objecto do invento que

TRANSGENE S.A., Société Anonyme, francesa, industrial, com sede em 16 rue Ilenri Regnault, 92400 COURBEVOIE, França; e INSTITUT PASTEUR, Instituto nacional francês, com sede em 25 rue du Docteur- Roux, 75θ15, PARIS, França, pretendem obter em Portugal, parai ”VECT0R VTRAL E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ADN RECOMBINANTE CODIFICANDO PARA A PRO ΤΞΙΝΑ F DO VIRUS AGENTE CAUSADOR DA

S.I.D.A.

presente invento refere-se mais particularmente ao processo de preparação de uma vacina destinada à prevenção de SIDA.

A síndroma da imuno-deficiência adquirida (SIDA) é uma afecção virai que apresenta de momento uma maior importância na América do Norte, na Europa e na África central .

As estimativas recentes sugerem que cerca de 1 milhão de americanos podem ter sido expostos ao vírus da SIDA. Os individuos afectados apresentam uma imuno-depressão grave e a doença é, em geral, fatal.

A transmissão da doença efectua-se na maioria dos casos por contacto sexual, se bem que as pessoas que utilizam estupefacientes por via intravenosa representem igualmente um grupo com elevado risco; por outro lado têm sido infectados por este vírus um grande número de indiví-

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duos depois de terem recebido sangue ou produtos sanguíneos contaminados.

agente causador desta afecção é um retrovirus_e Numerosas afecções animais têm sido atribuídas aos retrovirus mas,acontecera apenas recentemente que puderam ser descritos os retrovirus que a.fectam o homem.

Enquanto os retrovirus das células T humanas (HTLV : human T leukemia virus) dos tipos I e II têm estado implicados como agente causador de certas leucemias das células T nos adultos, o retrovirus associado a linfadenopatias (vírus LAV), que é igualmente denominado vírus HTLV III ou vírus relacionado A.I.D.S. (ARV), é agora correntemente aceite como o agente responsável pela SIDA.

genoma de vários isolados do retrovirus LAV ou HTLV III foi caracterizado de maneira muito completa (Wain-Hobson et al. 19855 Ratner et al. 19855 Muesing et al. 1985; Sancliez-pescador et al. 19θ5) θ informações sobre a sequência genómica indicam uma relação estreita com o grupo dos lentivirus. Os lentivirus, cujo protótipo é o vírus ovin Visna, são os agentes de doenças com progressão muito lenta e que apresentam tipicamente um período de incubação prolongada. 0 LAV e o vírus Visna partilham numerosas semelhanças, em particular no seu tropismo para o tecido neural.

Além das três partes de genoma encontradas em todos os retrovirus e designadas por gag. pol e env. o viris LAV compreende pelo menos três outros genes denominados Q ou Ser TAT e F ou 3¹ o^f (llain-Obson et al. 1985; Arya et al. 1986). O produto do gene F foi caracterizado por reac ção com soros de doentes atacados de SIDA e a identidade da proteína confirmada por um processo de sequência directa dos ácidos aminados (Allan et al 1985)·

Segundo os autores, a proteína F é reconhecida por 30 a 9θ% dos soros de doentes. Esta proteína migra sobre um

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D 11686/333 469 gel de acrilamida SDS segundo um peso molecular aparente compreendido entre 26 e 28 KD. Certos autores puseram era evidência um produto do gene V compreendido entre 24 e 25 KD, evocando a possibilidade de uma iniciação da tradução ao segundo ATG.

A proteína F não é glicosilada, se bem estejam presen tes dois locais potenciais de N-glicosilação. Finalmente foi demonstrado que a proteína F é acilada pelo ácido mirístico. Existe na proteína F um tetrapéptido (arg - Phe - asp - Ser), encontrado em algumas proteínas que intervêm na adesão celular, e igualmente numa cadeia do antigene HLA de classe II.

Auffray, (Auffray, 1986) evocou a possibilidade da proteína F desempenhar um papel no reconhecimento e ligação da proteína env e do vírus LAV linfócitos T4, contribuindo assim para a disseminação do víríis. Além disso, a variabilidade elevada (2 a 17%) da proteína F de uma ca· mada para a outra, variabilidade comparável à da glicopro· teína de envolvimento, deixa pensar que a proteína F desempenha efectivarnente um papel na infecção (Ratner et al 1985).

presente invento propõe utilizar como vector de expressão da proteína F um vector virai que permite a expressão da proteína num ambiente que permitirá a sua reestruturação pós-tradução.

lí por este facto que o presente invento se refere a um vector virai, caracterizado por compreender o gene F do vírus responsável pela SIDA.

Entre os vectores virais utilizáveis, devem citar-se mais particularmente os poxvirus e, designadarnente, o vírus da vacina (w) · vírus da vacina é um vírus com ADN de haste dupla que foi utilizado muito largamente em todo o mundo para controlar e eliminar a varíola. Avanços técnicos recen-

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► tes permitiram o desenvolvimento deste vírus como vector de clonagem e os vírus recombinantes vivos permitiram exprimir antigenes estranhos e mesmo obter imunizações contra diferentes doenças virais ou parasitárias.

Assim, vários grupos puseram recentemente em evidência a utilização de recombinantes deste tipo para exprimir o antigene da enxaqueca, da hepatite B e a glicoproteína da raiva para imunizar contra estas doenças (Smith et al. 1983; Panicali et al. 1983; Kiney et al. 1984).

Â expressão de uma sequência codificando para uma proteína estranha pelo vírus da vacina (w) implica necessariamente duas etapas:

1&.) a sequência codificando deve ser alinhada com um promotor de W e ser inserida num segmento não essencial da ADN de W, clonado num plasmideo bacteriano apropriado;

25.) as sequências de ADN de W situadas de um lado e do outro da sequência codificando devem peiroitir recombinações homólogas in vivo entre o plasmideo e o genoma virai; uma dupla recombinação recíproca conduz a uma transferência do enxerto de ADN do plasmideo no genoma virai no qual se propaga, e exprime (Panicali e Paoletti, 1Ç82;

Smith et al. 1983; Panicali et al. 1983)·

Bem entendido que a utilização deste tipo de vector implica muitas vezes uma delecção parcial do genoma do ví rus vector.

O presente invento refere-se mais particularmente a um vector virai caracterizado por compreender pelo menos:

- uma parte do genoma de um vírus vector,

- um gene codificando para a proteína F do vírus responsável pela SIDA, assim como os elementos que asseguram a expressão deste proteína nas células.

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O invento refere-se igualmente aos ADN recombinantes que correspondem aos referidos vectores virosos.

Por vírus responsável pela SIDA”, pretende-se designar nomeadamente o vírus LAV, o vírus HTLV III ou ARV, do mesmo modo que eventuais mutantes pontuais ou delecçÕes parciais destes vírus, assim como os vírus aparentados.

Os vectores virosos, na parte que corresponde ao genoma do vírus vector (distinto do vírus responsável pela SIDA), podem ser constituídos a partir do genoma de um vírus de qualquer origem. Todavia, será preferível utilizar uma parte do genoma de um poxvirus e mais particúlarmente uma parte do genoma da vacina.

As condições necessárias para a expressão de uma proteína heteróloga no vírus da vacina foram relembradas anteriormente.

De um modo geral, o gene em causa, por exemplo o gene F, deverá, para se poder exprimir, estar sob a dependência de um promotor de um gene da vacina e este promotor será em geral o promotor da proteína 7,5^ da vacina. Por outro lado, a sequência que codifica, deverá ser clonada num gene não essencial da vacina que poderá eventualmente servir de gene marcador. Na maior parte dos casos, tratar-se-à do gene TK.

A proteína F nativa não possui o sinal de excreção e não é glicosilada. Propõe-se aqui modificações deste gene para melhorar a imunogenicidade do produto de expressão.

Propõe-se modificar o gene F de modo a assegurar a sua excreção para fora da célula e, por outro lado, para uma terceira construção, a assegurar a fixação da proteína na membrana.

Para este efeito, o gene poderá ser modificado ao ní35

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vel da sua parte que codifica pela extremidade NHg terminal da proteína adicionando uma sequência sinal que provêm de um vírus heterólogo, por exemplo a sequência sinal da glicoproteína do vírus rábico. Isto permitirá a excreção da proteína para fora da célula.

Bem entendido que se pode utilizar uma sequência sinal proveniente de outras proteínas virais.

Finalmente, pode ser interessante para a imunogenecidade da proteína que esta seja fixa na membrana celular e assim correctaraente apresentada ao sistema imunitário do hospedeiro. É por isso que é proposto, a partir da construção precedente (F + sinal de raiva), adicionar ao nível da parte codificando pa.ra a extremidade COOH terminal da proteína F uma sequência codificando para a porção transmembranária proveniente de ura vírus heterólogo,igual-, mente a da glicoproteína do vírus rábico.

presente invento refere-se em primeiro lugar à utilização dos vectores virosos para a obtenção da proteína codificada pelo gene F do vírus LAV em culturas celulares.

Tyata-se portanto num primeiro tempo de células de mamíferos que foram infectadas por um vector virai segundo o invento ou então que podem conter a ADN recombinante cor respondente; de entre estas células, devera citar-se mais particularmente as células diplóides humanas, culturas pri márias assim como as células Vero. Bem entendido que é possível prever outros tipos de células como se depreenderá de resto dos exemplos seguintes.

As proteínas assim obtidas podem ser utilizadas após purificação pela realização de vacinas.

É igualmente possível prever a utilização directa dos vectores virosos de acordo com o invento a fim de efectuar uma vacinação, sendo a proteína F então produzida in situ e in vivo.

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)

O presente invento refere-se igualmente aos anti-corpos lançados contra as proteínas E precedentes obtidos por infecção de um organismo vivo com um vector virai tal como anteriormente se descreveu e recuperação dos anti-corpos induzidos depois de decorrido um tempo determinado.

Finalmente, o presente invento refere-se à detecção dos anti-corpos lançados contra as proteínas F anteriores assim como ao processo de diagnóstico correspondente que permite, a partir da detecção destes anti-coi-pos na retirada biológica, de um paciente, detectar in vitro a SIDA nesse paciente.

As técnicas utilizadas para a obtenção da proteína F, as culturas celula,res e as técnicas de vacinação são idênticas às que são praticadas actualmente com as vacinas conhecidas e não serão descritas em pormenor.

presente invento compreende-se com a leitura dos métodos e exemplos seguintes.

As figuras seguintes ilustram os exemplos:

. a figura 1 representa a acção da tunicamicina sobre as proteínas sintetizadas pelos recombinantes VV.TG.FLAV.1147 e W. TG. FLAV.1145 e imunoprecipitadas devic-o a um soro anti-LAV; nesta figura, os pesos moleculares são dados em quiloDaltons, e representam-se por:

P : o resíduo celular

S : o sobrenadante

- : os produtos obtidos sem tratamento

-i- : os produtos obtidos depois do tratamento com a tunicamicina ; W.TG.FLAV.1145

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: VV.TG.FLAV.114?

: vírus da vacina, tipo selvagem;

a figura 2 representa a crivagem de soros anti-LAV peln sua capacidade em reconhecerem a proteína F sintetizada pelos vírus recombinante

VV.TG.FLAV.1145; os pesos moleculares são expressos em quilodaltons, e representam-se por:

>

vírus da vacina, tipo selvagem clone C clone D : soro testemunha negativo b, c,

SIDA;

a, d, e : soros de doentes atingidos pela representa recombinante ►

vírus de vacina selvagem

9 . • ~ ·	VV.TG.FLAV	.1147
. a :	a	marcação	das	células	BHE21	35 com a metionira ,
. b :	a	marcação	das	células	BIIE21	32 com PO^
. c :	a	marcação	das	células	BI1K21	com o ácido mirís-
tico	Ti	os pesos	moleculares	são em	daltons;

s a figura h representa a imunoprecipitacão de extractos de células BHIí21 infectadas pelos recombinantes 32 de vacinação depois da marcação com PO^;

nesta figura designa-se por :

. - : a imunoprecipitacão sem adição de TPA . : a imunoprecipitacão com adição de TPA . P : o resíduo celular

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. S í o sobrenadante de cultura os pesos moleculares são em daltons;

a figura 5 representa a imunoprecipitação das proteínas sintetizadas pelo vírus recombinante W.TG.FLAV.1165 ® marcadas com a metionina *5

S ; nesta figura designa-se por :

. 1 : as células infectadas por W.TG.FLAV.1145 . 2 : as células infectadas por W.TG.FLAV. 1165 . 3 : as células infectadas por W.TG.FLAV.1147 os pesos moleculares são em quilodaltons ;

as figuras 6a e 6b representam a reacção dos anti-cor pos de ratos vacinados com os vírus recombinantes era relação à proteína F produzida em E, coli e transferida sobre nitrocelulose;

na figura 6a :

. as faixas 1 e 3 representam o vírus de vacina selvagem . as faixas 2, 4, 5, θ, 9 representam o vírus W.TG.FLAV. 1145 . as faixas 6, 7, 8, 11, 12 representam o vírus W.TG.FLAV.1147 . as faixas 13, 14, 15 representam o vírus

w.tg.flav.1146 j na figura 6b :

. as faixas 1, 2 representam o vírus de vacina selvagem * a faixa 3 representa o vírus VV.TG.FLAV.1146 . a faixa. 4 representa o vírus W.TG.FLAV.1147 . as faixas 5, 6, 7, 8 representam o vírus W.TG.FLAV.H65.

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I

MÉTODOS

Clonagem; Maniatis et al. 1982.

Ihizimas í Utilizadas de acordo com as prescrições do fornecedor.

Mutagénese localizada : Método derivado de £oller e Smith, 1983.

Transferência na vacina : Ilieny et al. 19θ4. Unica diferen ça : as células humanas 143B subs tituem as células LMTK .

Preparação da reserva de vírus

As células primárias de frango livres de germes são infectadas com 0,01 pfu/célula durante 4 dias a urna temperatura de 37°C (meio Ι-1Ι5ϊί + 5% NOS) .

Purificação do vírus

Efectua-se uma centrifugação da reserva de vírus acima mencionada durante 15 minutos a 2.5θθ rotações (Rotor GSA Sorvall). 0 sobrenadante é posto de lado. Retoma-se o resíduo num tampão RSB (Tris HC1 10 mM pH 7,4, KC1 10 rm-1, MgCl^ Irm-l) durante 15 minutos a 4°C. Dfectua-se uma trituração em vaso, depois uma centrifugação durante 15 minutos a 2.500 rotações. 0 sobrenadante é adicionado ao produto precedente efectuando-se depois uma s_e gunda trituração da mesma maneira.

Todos os sobrenadantes são depositados sobre 10 ml de base de sacarose a 36'/ (p/v) (Tris 10 rnl-I pl-l 8). Efectua-se uma centrifugação durante 2 horas a 14.000 rotações (Rotor SI.’28, Beckman) .

resíduo é retoma.do, dissociado e remetido sobre uma segunda base idêntica. 0 segundo resíduo é retomado em 5 ml PBS e carregado sobre um gradiente de 20-40*p de sacarose (Tris 10 rnl-í PH 8) (mesmo rotor) . Efectua-se uma

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I )

centrifugação durante 45 minutos a 12.000 rotações.

Recupera-se a faixa de vírus. Ela é enegrecida por centrifugação durante 1 hora a 20.000 rotações. 0 resíduo é retomado no Tris 10 mM pH 8.

Imunoprecipitações

Efectua-se uma infecção de células BHE21 (caixas de 3 cm de diâmetro, 10^ células/caixa, cultivadas em G-'®:i+10% FCS) com 0,2 pfu/célula durante 18 horas. O meio é decantado e substituído por 1 ml de meio sem metionina e 10 jil de metionina 35« (5 mCi/300 ul) (Amersham) por caixa.

Adiciona-se um excesso de metionina não radioactiva após 2 horas.

No fim da marcação, efectua-se uma raspagem das células infectadas, uma centrifugação durante 1 minuto numa centrifugadora Eppendorf, uma separação das fracções' sobrenadantes de resíduo, uma lavagem do resíduo uma vez em tampão ?BS, depois uma imunoprecipitação e um gel (segundo Lathe e outros, 1980).

Imunoprecipitação das proteínas sintetizadas em presença de tunicamicina

Depois da infecção de células BHK21 como se descreveu anteriormente, adicionam-se após 18 horas 1,5 pg de tunicamicina por ml de meio durante 1 hora.

meio é em seguida decantado e substituído por 1 ml de meio NETl sem metionina contendo 1,5 Jig de tunicamicina e 10 jal de metionina 35^ (Amersham). 0 seguimento da manipulação efectua-se como anteriormente.

Tratamento endo-F

Depois da imunoprecipitação das proteínas marcadas por um soro de doente atingido pela SIDA, a fracção proteína-A sefarosa é retomada em:

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0,2 1-1 fosfato de Na, pH 6,1

0,05< SDS

0,1 Nonidet P40

0,1 % Beta-mercaptoetanol

0,1 % EDTA pH 8 e ferve-se durante 5 minutos para desnaturar as proteínas .

Efectua-se uma incubação durante 20 horas a 37°G, com 4 unidades de endo-F, depois uma. precipitação durante 2 minutos em gelo cora 1/5 de volume de TOA a lOOp. Lava-se o resíduo 3 vezes com acetona a 80(p, adiciona-se o tampão de amostras e carrega-se sobre gel SDS.

Dosagem dos anti-corpos pelo testeElisa

Incubam-se placas com 96 orifícios (NUNC) com fundo plano durante 18 horas a 37°C com 10^ pfu de vírus da vacina tipo selvagem em tampão carbonato. As placas são em seguida saturadas com gelatina a 0,01%. Os soros de ratos são então absorvidos sobre as placas e efectua-se o resto do protocolo como para um teste ELISA clássico.

Leituras a 492 nl-l.

EDSMPLO 1

Construção dos plasmídeos híbridos

Os tamanhos combinados dos diferentes elementos necessários para a transferência da sequência codificando para o gene env no genoma de W e sua expressão subsequen te são da ordem de vários Kb. Julgou-se portanto necessário minimizar o tamanho do plasmideo de réplicação no

E. coli utilizado para o trabalho de construção de modo a facilitar as manipulações necessárias.

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► >

O fragmento HindIII (ilinj) do genoma de W contém o gene completo da timidina Kinase (TK.) que já foi anteriormente utilizada para permitir a permuta e a recombinação do AND inserido no genoma de W (Macket et al 1982). Ê importante notar que a transferência de uni enxerto no gene TK do genoma de VV criou um vírus TK deficiente que pode ser seleccionado. Foi primeiro que tudo necessário produzir um plasmideo de pequeno tamanho compreendendo um único local EindIII utilizável para a integração do fragmento Hin-J W. Além disso, é necessário eliminar as sequências de restrição não necessárias do plasmideo de modo a permitir as manipulações seguintes.

A construção foi despoletada a partir do plasmideo pML2 (Lusky e Eotchan, 1981) que é ura vector derivado do plamideo pBR322 por delecção espontânea no qual se perdeu o segmento entre os nucleótidos IO89 e 2491. Em primeiro lugar eliminou-se a sequência de PstI por inserção do fragmento AhalII-AhalII de pUCS (Vieira e Messing, 19?2) entre dois locais AhalII de pT!L2 eliminando 19 pares de bases. Utilizou-se o método do linker-tailing” (resíduo ligante) (Lathe et al 1984) para inserir ura ligante HindIII entre os locais Ilrul e EcoRI tratado por SI deste plasmideo, eliminando o local BairiHT.

Isto conduz a um plamideo de 2049 pares de bases que compreende o gene betatlactamase funcional (que confere a resistência à ampicilina) e que compreende além disso um princípio de réplicação activa no E. coli e um local de restrição única HindIII.

Esta construção é denominada pTGlH* fragmento Hin-J do ADN de W que comporta o gene TK foi previamente clonado num vector proveniente de pBR327 (Drillien e Spehner, 19θ3)· Este fragmento de

4,6 kb foi novamente clonado no local HindIII de pTGlH. Seleccionou-se um clone no qual o gene TK está distante em relação ao gene codificando para a resistência à ampi-13-

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>

cilina.

Esta construção pTGlH-TK foi utilizada como vector na experiência seguinte.

A etapa seguinte consistiu em isolar um promotor de VV utilizável para comandar a expressão da sequência codificando para o gene a exprimir. 0 promotor de um gene precoce codificando para uma proteína de 7.5θθ daltons (7,5 k) já foi utilizado com êxito cora fira idêntico (Smitli et al 1983) e procedeu-se portanto ao isolamento deste segmento.

gene 7,5k está situado sobre um dos mais pequenos fragmentos Sall (fragmento Sal-S) do genoma de VV tipo UK (Venkatasan e outros, 19θ1)« Como os pequenos fragmentos são clonados de maneira preferencial, uma grande proporção dos clones obtidos por clonagem directa do ADN de W tipo W cortado por Sall no plasmido pBR322 compreende o fragmento Sal-S. Este fragmento é transferido sobre o bacteriófago vector M13mp701 (Kieny et al. 19θ3) por digestão Sall e reunião conduzindo assim ao bacteriófago M13TGSal-S.

Neste clone encontra-se um local Scal imediatamente na proximidade da ATG de iniciação do gene 7,5K. A jusante do gene 7,5K encontram-se situados os locais únicos BairiUI e EcoRI provenientes do vector. Os locais BanJ-IZ e SCal são fundidos por intermédio de um ligante BglTI 5’-CAGATCTG-3’ depois de terem completado as extremidades geradas pela digestão BamHZ com o fragmento Klenow da polimérase de E. coli. Este processo elimina o local ScaZ mas reconstitui o local BamHZ e desloca o local único EcoRZ a jusante. Ao mesmo tempo, o local SalT (AccZ) a jusante é eliminado, tornando-se portanto único o local Sall a montante.

Esta construção é denominada M13TG 7,5K.

No interior do fragmento Hind-J do ADN de VV encon35

-1416 311:1/.007

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trarn-se situados locais Call e EcoRI que são separados por cerca de 30 pares de bases (ifeir e líoss, 1983)· 0 fragmento promotor de 7,5K presente no M13TG7,5K é excisado por Ac cl e EcoRI e clonado entre os locais Çlal e EcoRI de pTGlH-TIi para gerar pTGlH-TI’-P7,5K.

Esta construção conduz s. transferência dos locais BamEI e EcoRI únicos do vector 1113 imediatamente a jusante da sequência cio promotor 7,51. Estes locais únicos EamET e EcoRI são utilizados na construção seguinte.

segmento poli-ligante do bacteriófago M13TG131 (Eieny e outros, 19θ3) θ excisado por EcoRI e BglII e inserido entre os locais EcoRI e BaníHI do plasmideo pTGlIITK-P7,5K, gerando pTG186-poli. Resta construção, estão disponíveis 5 locais de restrição únicos para a clonagem de um gene estranho sob o controle de P7,5^ (PstI, EamEII, SstI. Smal, EcoRI).

Construção do plasmideo que comporta a sequência F // .raeiro lugar, o gene env do LAV envolvido pelas le sinal e transmembx-anário da glicoproteína . inserido num plasmideo (pTG1134) descrito an0 fragmento PstI-PstI do plasmideo pTG1134 > vector ’^lI13mp701 numa orientação adequada. 0 • resultante é o H13TG169: SR Env

IZZZZZZF—í——H—

Kpnl // (SR - sinal de raiva (tER= raiva transmembranária

O fragmento genómico que codifica para a proteína F é obtido por uma digestão BamHI-HindIII do plasmideo pJ19-6, segmento proviral clonado e descrito anteriormente.

— 1 k_

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D 11686/333 469 fragmento Baml-II - HindlTT de pJ19-ó θ clonado no vector M13TG169 aberto aos locais Iípnl e HindITT. 0 local Bamlll é novamente ligado ao local Kpnl por um ligante oligonucleótido simples de sequência:

5’-GATCGTAC-3'

I

chama-se II13TG17O:

PstT SR	F	TMR PstT
	--y
l·----1-----[7777a—1—	—---1-	—1---!/////// J—l—

Kpn° SstI HinrilII

BamIII° )

A fim de poder excisar unicamente a sequência codificante da proteína F, gera-se um local BamHZ a montante da ATG de iniciação da tradução, por mutagénese dirigida por oligonucleótido

ATG F

-->

//TÇ—I' ' ^Jl“ -»// 'I13TG17O (único pedaço)

A sequência do oligonucleótido é:

5’ GAAAGGATCCTGCTATAAG 3’

BaniHI

-16582U3

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Depois de reparação e crivagem dos bacteriofagos pelo oligonucleótido marcado por 32_n, isola-se o bacterió fago 'I13TG173. Ele não difere senão pelo local BamIII situado

çao.	F	TGA í
II	ATG ! 1
• / I EaisEI

do bacteriófago M13TG17O a montante do ATG de inicia

---1--------// (IÍ13TG173)

SstI >

►

A introdução deste local permite clonar o fragmento BamHI-Ssti que contém o gene F no plasmideo de transferência pTG186-poli aberto aos locais BamEII e SstI e cuja construção foi descrita anteriormente. Como se indicou, a expressão de uma proteína. Iieteróloga no vírus da vacina necessita que a sequência que codifica seja alinhada com uma sequência, do promotor da vacina e seja, inserida num segmento não essencial do ADN da vacina. Este ADN situado cie uni lado e doutro permite a recombinação com o genoma ria vacina in vivo por uma, dupla, recombinação recíproca que transfere a. sequência que codifica e o promotor acompanhante para o genoma da, vacina. 0 plasmideo resultante é o plasmideo pTG1147.

A transferência da sequência codificando do gene

F e do promotor acompanhante no genoma da vacina é efectuada como se descreveu:

BAELirLO 3

Clonagem no vírus da vacina •para gerar VV.TG.Flav;1147

A estratégia descrita por Sraith et. al. 1983, assenta na permuta in vivo entre um plasmideo que compreende um enxerto no gene W TE e o genoma virai do tipo selvagem de modo a inactivar o gene TK transportado pelo vírus

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Cs vírus TE podem ser seleccionados por espalhamento sobre uma linha celular (TE negativo) em presença de 5-broraodeoxiduridina (5BUDR) (llackett et. al. 1Ç82) . A timidina quinase fosforila o em 5'-monofosfato, que é em seguida convertido em trifosfato. Este composto é um análogo de dTTP e a sua incorporação no ADN bloqueia o de senvolvimento correcto do vírus. Um vrus TE pode todavia replicar o seu ADN normalraente e conduz a bacteriófagos virais visíveis numa linha celular igualmente TK .

vírus da vacina propaga-se 110 citoplasma das células infectadas primeiro que no núcleo. É por isso que não é possível tirar vantagem da maquinaria de replicação e de transcrição do ADN do hospedeiro e é necessário que o vírus possua os componentes para, a expressão do seu genoma. 0 ADN de W purificado não é infeccioso.

A fim de gerar os recorabina.ntes, é necessário efectuar simultaneamente a infecção celular com o vírus VV e una transfecção com o segmento do ADN clonado que apresen te interesse. Todavia, a geração dos recombinantes é limitada á pequena, proporção da.s células que são competentes para a transfecção pelo ADN. JÍ por esta razão que foi necessário por em prática uma estratégia de *'congruência *' indirecta para reduzir o ruído de fundo dos víj?u.s aparentados não recombinantes. Isto foi efectuado utilizando como vírus infecciosos vivos um mutante termosensível (ts) da vacina que não é capaz de se propagar a uma temperatura não permissiva de 39,5°^ (Drillien et Spehner, 1983)· ⁿuando as células são infectadas por um mutante ts em condições não permitidas e transfectadas com o ADN de um vírus do tipo selvagem, a multiplicação virai intervirá somente nas células que são competentes par^a transfecção e nas quais uma recombinação entre o ADN virai selvagem e o genoma do vírus ts terá tido lugar; nenhum vírus se multiplicará nas outras células, não obsta.n te o facto de ela.s terem sido infectadas. Se um plasmi1 Π —lo—

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I deo recombinante contendo um fragmento do ADN de vacina tal como pTGllA? estiver incluído na mistura de transfecção, na concentração apropriada, com o ADN do tipo selvagem, é do mesmo modo possível conseguir que ele participe na recombinação homóloga com o ADN da vacina nas células competentes.

Infectam-se monocamadas de células primárias de fibroblastos de embriões de frangos (CEF) a 33°C com W-Còpenhaga ts'7 (0,1 pfu/célula) e tran.sfectam-se com um coprecipitado com fosfato de cálcio do ADN do vírus de tipo selvagem W-Copenhaga (50 ng/io6 células) e cora o pla_s mideo recombinante (50 ng/io6 células).

Depois de incubação durante 2 horas a uma temperatura que não permite o desenvolvimento do vírus ts (39,5°C), ^as células são incubadas de novo durante 48 horas a 39,5°C. Utilizam-se diluições de vírus ts para infectar novamente uma mono-camada de células humanas 143-B-TE a 37°C que são em seguida incubadas na presença de (15O ^jig/ml) . Obtem-se diferentes placas de vírus TK a partir destas células que receberam o plasmideo recombinante, ao passo que as culturas controladas sem plasmideo não apresentam placas visíveis. Gs vírus TK são em seguida sub-clonados por uma segunda selecção em presença de 5BUDR.

Uma dupla, recombinação recíproca correcta entre o plasmideo híbrido pTG1147 e o genoma de W conduz a permuta do gene TK que comporta o enxerto com o gene TK do vírus, tornando-se assim os recombinantes TK .

Os ADN purificados a partir dos difei^entes vírus recombinantes TE são digeridos por IlindIII e submetidos a uma electroforese sobre gel de agarose. Os fragmentos de ADN são transferidos sobre um. filtro de nitrocelulose segundo a técnica descrita por Southern (1975). 0 filtro é em seguida tomado híbrido com o plasmideo pTG1147

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I nick-trarisladado ao 32_n Depois de lavagem do filtro, este último é fluorografado e são visíveis faixas de 3,θ5, 2,9, 0,8 kb sobre a autoradiografia quando o vírus vacina tem incorporado o gene F do LAV. Um destes recombinantes VV.TG.FLAV.1147 foi seleccionado pelos estudos seguintes.

Proteína F sintetizada a partir de um vírus re combinante vec ina-LAV

Para por em evidência a expressão do gene F do LAV a partir do vírus vacina híbrido, infectam-se as célula.s de roedor, BHK21, que são cultivadas num meio G-2-ΪΞ-ί 4- 10$ de soro de vitelo fetal com o referido' recombinante W. TG.FLAV.1147.

Infectam-se uma mono-camada semi-confluente fresca (10° de células) com 0,2 pfu/célula e incuba-se durante 18 horas.

meio é em seguida eliminado e adiciona-se um meio com fraco teor de metionina (1 ml para 10^ células) suplementado com 10 jul/ml de metionina -⁷¾ (5 mCi/300’ jil). As células são incubadas a 37°C e as proteínas marcadas são reunidas por centrifugação. Depois de separação em resíduo e sobrenadante, as proteínas são incubadas com um soro pertencente a pacientes atingidos pela SIDA. As proteínas que reagem com o soro são recuperadas por adsorção sobre uma resina proteína A-sefarose e espalhadas por electroforese sobre um gel de poliacrilamida SDS e auto-radiografadas segundo uma técnica descrita por Lathe el al. 1980. As autoradiografias mostram que alguns soros de pacientes atingidos pela SIDA ligam específicamente duas proteínas dos extractos celulares infectados. Os pesos moleculares aparentes de 25,5 ^e 27 Ed

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D 11686/333 469 ►

sugerem a equivalência com a proteína F identificada por soros de doentes atingidos pela SIDA, numa preparação de proteína F autêntica e em extractos de células infectadas pelo vírus lAV.

A sequência que codifica para F conduz a um produto de tradução primária de cerca de 23 Kd ao passo que a proteína F obtida pelo processo anterior apresenta um peso molecular aparente compreendido entre 25 e 27 kd.

Esta heterogeneidade pode ser atribuída a uma modificação (acilação) e/ou ser devida ao facto de dois ATG poderem ser utilizados para a iniciação da tradução de F.

EXEMPLO 5

Construção de pTG1145 nlasmideo pTG1145 contém o gene F cuja parte codificando para a extremidade terminal da proteína foi posta era fase com a sequência de sinal da glicoproteína rábica. As construções derivam do bacteriófago X13TG17O descrito atrás.

) zl parte 5’ do gene F é colocado em fase com a sequência sinal da glicoproteína rábica por meio de uma eliminação gerada pelo oligonucleótido.

Os quatro primeiros ácidos aminados da glicoproteína rábica são conservados para favorecer uma boa clivagem do péptido sinal.

Ser

TCA

Lys 3'

AAA primeiros ácidos aminados da glicoproteina rábica eliminado)

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O oligonucleótido que serve para gerar o anel tem por sequências

5' TTTTGACCACTTGCCACCAATAGGGAATTTCCCAZíA 3 ’

Obtem-se assim o bacteriófago M13TG171. 0 sinal raiva (SFt) da glicoproteína rábica fundida com o gene F é em seguida transferido para o plasmideo pTG-186-poli.

I

Para isto faz-se a clonagem do fragmento Pstf-PstA de H13TG171 em pTG186-poli aberto no local PstI. 0 pias mideo resultante é denominado pTG1145. O gene F fundido com o sinal raiva é transferido ps.ra a vacina como descrito atrás.

EXEMPLO 6

Construção de pTG1146

Neste plasmideo, a sequência codificando para a zona transmembranária da glicoproteína rábica (ΤΙ-R) é fundida com a extremidade gene F. 0 codão TGA (Stop) do gene F está compreendido no anel de eliminação gerado pelo oligonucleótido, que tem por sequências

Glu Tyr Phe Lys Asn Cys

Tyr Vai Leu Leu Ser Ala

GAG TAC TTC

AGT

F TMR

Obtem-se assim o bacterioÇago M13TG172.

gene F fundido a montante com o sinal raiva e a jusante com a porção transmerabranária raiva á transferido para o plasmideo pTG186-poli.

5824-3

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Para isto faz-se a clona.gem do fragmento PstT-PstJL de 1Í13TG172 no plasmideo pTG186-poli, aberto para PstI para gerar o plasmideo pTG-1146.

Imonoprecipitação das proteínas sintetizadas pelos vírus recombinates VV.TG.FLAV.1145 e 1146

Operando como se descreveu anteriormente para o plasmideo pTG1147, obtêm-se os vectores vacina híbridos que correspondem aos diferentes plasrnideos e preparados atrás.

Estes vectores virosos serão denominados respecti vamente :

VV.TG.FLAV.1145

W.TG.FLAV.1146

As proteínas obtidas como se descreveu atrás são testadas por imunoprecipitação (figura 1). Os imunoprecipitados obtidos com o produto de VV.TG.FLAV.1145 fazem aparecer uma proteína cujo peso moleculai’ aparenta estar na proximidade de 28 kd. A proteína posta em evidência no sobrenadante do meio de cultura tem um peso molecular aparente mais elevado. Parece que o produto do gene F é efectivamente expelido no sobrenadante da cultura.

For o aspecto difuso do sinal autoradiográfico sugerir a existência de uma glicosilação conduziu-se uma manipulação cie marcação na tunicamicina. Na. presença

35g nietionina na presença de de tunicamicina, obtém-se uma proteína de peso molecular aparente cie 26 kcl, nitidamente inferior ao descrito atrás. Isto indica que o produ-23-

53243

D 11686/333 ^z*-69 to do vírus VV.TG.FLAV.1145 é glicosilado. A presença do péptido sinal e de locais potenciais de N-glicosilação ocasionou uma glicosilação da proteína F. Como a diferença de peso molecular entre a proteína glicosilada e não glicosilada é de 2 kd, é admissível que seja utilizado apenas um dos dois locais de glicosilação.

A mesma experiência conduzida com o vírus VV.TG. FLAV.1147 mostra que o produto deste vírus não é glicosi1 ado«

Os imunoprecipitados obtidos com o produto de VV.TG.FLAV.1146 fazem aparecer uma proteína de peso molecular aparente superior (3^ kd) aos observados anteriormente. Podia-se esperar este resultado porque o gene F é fundido com a parte terminal da glicoproteína rábica, que compreende a parte transmembranária desta última.

tí igualmente demonstrado, pela marcação com a metionina na presença de tunicamicina, que o produto de

VV.TG.FLAV.1146 é glicosilado. A excreção observada é menor que a constatada com VV.TG.FLAV.1145, indicando que a proteína está bem fixa à superfície das células.

Isto é confirmado por imunofluorescência de acordo com uma técnica descrita atrás. A superfície das células aparece nitidamente fluorescente em relação a um testemunho negativo, o que demonstra a presença da proteína F na superfície das células.

ΕΧΞΪ-ÍPLO 8

Colocação em evidência dos anti-corpos anti-F nos ratos vacinados com os vírus VV.TG.FLAV.1145 1146 e 1147

Vacinam-se ratos Balb/c e G57/BI machos com 7 semanas por injecção sub-cutânea. de 5·1θ^ pfu ou por sacrifício da base da cauda e aplicação de 2.10 7 pfu de vírus VV.TG.FLAV por animal. Recebem uma injecção de reforço

I

582^3

D 11686/333 ^69 com a mesma dose passadas 2 semanas, e sofrem uma colheita de sangue no momento do reforço assim como 2 e 4 semanas depois do reforço. Procura-se presença cie anti-corpos dirigidos contra. determinantes do vírus LAV e do virais da vacina nos seus soros.

Todos os animais vacinados dão soros capazes de reagir com o vírus da vacina num teste ELISA.

Utiliza.ra.m-se técnicas de imunoprecipitação ou de Uestern Blot”. Estes métodos permitem pôr em evidência os anti-corpos capazes de reagir com as proteínas do vírus LAV não desnaturada.s ou desnaturadas ao SDS num gel de electroforese e transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose. Nesta experiência, as membranas de nitrocelulose empregadas são obtidas por transferência das proteínas contidas num extracto celular infectado pelo vírus LAV segundo técnicas conhecidas. Estas membranas são cortadas em faixas e cada faixa é incubada com o soro dos ratos vacinados (diluição a 1/2θ). A proteína A ma.rca.da a permite visualizar as proteínas do vírus LAV que fixaram anti-corpos de ratos.

Utilizaram-se extractos celulares infectados pelo ο ε* _Λ vírus LAV e marca.dos com a cisteína para as experiências de imunoprecipitação.

Vários soros dão uma reacção específica com uma pro teína de peso molecular à volta de 27 kcl, correspondendo à proteína F.

Deve notar-se que o soro de alguns ratos produzem em Vestern Blot” sinais que correspondem a proteína não identificadas da preparação de vírus LAV fixas sobre as membranas.

BXPMPLO 9

Miristilação da proteína F !'ostrou-se que células BIII-Z21 infectadas pelo recom-25

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D 11686/333 46,9 ►

binante VV.TG.FLAV.1147 exprimem uma proteína semelhante à proteína F nativa e que se apresenta sob duas formas de pesos moleculares aparentes de 25 e 27 kd era electroforese em gel de poliacrilarnida SDS (figura 3).

Ser.do miristilada a proteína F sintetizada pelas células infectadas pelo vírus HIV selvagem (Allan e outros, 1985), pro a existência de uma modificação pós-traducional semelhante foi procurada sobre a molécula sinte tizada pelo vírus recombinante por marcação com ácido riirístico tritiado.

Um tapete de células ΞΗΚ21 (10^ células/caixa) é infectado com o vírus recombinante (a 0,2pfu/célula);

horas depois da infeccão adicionam-se 100 ^pCi/ml de ácido mirístico 3e (Amersham) num meio MEI·· suplementado em piruvato de sódio 5 mM. Passadas 4 horas de incuba< ção as proteínas marcadas são recolhidas e imunoprecipitadas com um soro de doentes atingidos pela SIDA. As proteínas que reagiram com os anti-corpos são recuperadas por adsorção sobre uma resina de proteína. A-sefarose e separadas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS.

A auto-radiografia do gel mostra que apenas a forma de peso molecular aparente de 25 kd está miristilada; a forma de 27 kd não aparece (figura 3)·

A expressão da proteína F pelo vírus da vacina recombinante permite portanto obter uma miristilação da molécula semelhante ã da molécula nativa sintetizada pelo vírus IIIV.

miristato é provavelmente responsável pela ligação da molécula nas membranas intracelulares como se observa para outras proteínas miristiladas (Gould e outros, 1985).

““ A-

QUADRO 1

Comparação das sequências da proteína F do HIV-1, do HIV-2 (Guyader e outros, 1987) θ da proteína póOsrc na gua parte

N-terminal, e da parte intracitoplásmica próxima da membrana do receptor EGF ►

F H1V-1_mu

F H1V-2«_O pp50 _src

EGFrec

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O local de fosforilação pela proteína quinase G de FHIV-l, ppóOsrc e EGFrec está indicado pela seta, líyr=ácido mirístico ; tm = parte transmembranária da proteína EGFrec.

Fosforilação da -proteína F

I

A proteína F é rairistilada (exemplo 9) ® encontra-se assim fixa à membrana em contacto com outras proteínas membranárias. Existem anologias de sequência. entre F e a proteína ppóOsrc (Gould e outros, 1985), igualmente miristilada, e com o receptor BGF (Ulrich e outros, 1984), na sua parte intracitoplásmica próxima da membrana (quadro 1). Sendo estas duas últimas proteínas fosforiladas pela proteína quinase 0 sobre uri local próximo da membrana, procurou-se saber se uma tal modificação existia para F. Um local de consenso de fosforilação pela proteína quinase C existe efectivamente sobre a treonina 15 de F (Woodgett e outros, 1986).

Λ

Infecta-se um tapete de células BEK21 (10 células/ caixa) com o recombinante W.TG. 114-7 (θ,1 pfu/célula) ;

► horas depois da infecção, q 9 (Amersham) no meio ϊ-ΤΕΤ-Ι ú|.

ras de incubação, efectua-se adicionam-se 100 juCi/ml de sem fosfato. Passadas 4- liouma imunoprecipitacão e uma electroforese sobre gel, como descrito no exemplo 4.

A figura 3 mostra que a proteína de 25 kd que é miristilada é igualmente fosforilada. Esta proteína e resolvida em duas faixas : P25-I e P25-2, Se se adicionar a mesma ao meio de cultura, 10 minutos antes da imunoprecipitação, o éster de forbol 12-tetradecanoil forbol-13-acetato (TPA), observa-se um aumento muito nítido da fosforilação para a P25-1. Isto está de acordo cora uraa fosforilação para a proteína quinase C cuja actividade é muito fortemente aumentada pelo TPA (figura 4).

Numerosos isolantes de I-ITV possuem um gene F cuja

D 11636/333 469 treonina 15 ® substituída por usna alanina (llatner e outros, 1985). A proteína 1' de tais isolados ó portanto teoricamente não fosforizável. Para verificar este ponto, construiu-se um recombinante que exprime uma proteína F que tem uma alanina em posição 15·

A P25-2 pode corresponder quer a uma forma de P fosforilada sobre um outro ácido aminado que não a Thrl5, quer a uma proteína celular imunoprecipitada com F.

I

EXEMPLO 11

Construção do plasmideo pTG1191 plasmideo pTG-1191 contém o gene F proveniente do plasmideo pJ19-6 mas em que a treonina na posição 15 é substituída por uma alanina. As construções derivam do bacteriófago Ã-113TG17O descrito anteriormente (exemplo 2). A mutação treonina-alanina é efectuada por meio do oligonucleétido de sequência:

► » TCTTTCCCTCACTGCAGGCCATCC 3’

Obtém-se assim, o bacteriófago M13TGH51. 0 gene

F-Ala é era seguida transferido para o plasmideo pTG186-poli. Para isso, faz-se a clonagem do fragmento BaraHI-SstZ de I3TGII5I no pTG186-poli aberto nos raesmos locais. 0 plasmideo resultante é denominado pTG1191. A transferência do gene F-Ala na vacina é efectuada como se descreveu anteriormente.

EXEMPLO 12

Imuno~orecipitação das proteínas sintetizadas pelo vírus recombinante VV.TG.FLAV.li5i

Operando como foi descrito atrás para o plasmideo

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I pTG1147, obtém-se o vector virai VV.TG.FLAV.1191.

Examinam-se as proteínas obtidas por imunoprecipi35 tação depois de marcação com a S metionina corno se descreveu atrás. As proteínas obtidas e visualizadas sobre gel SDS são idênticas às induzidas pelo recombinante VV.TG.FLAV.1147 (não representado).

Se se efectuar uma marcação com fosfato 'POj como se descreveu atrás, já não se visualisa a forma P25-1 induzida pelo recombinante VV.TG.FLAV.1147. Além disso, a adição de TPA no meio não modifica a fosforilação da forma P25-2 (figura 4).

Estes resultados indicam que o local de fosforilação pela proteína quinase C é a treonina 15. O facto de a proteína F de alguns isolados não ser fosforilizável pela PLC pode implicar uma activida.de biológica diferente para estes isolados. Com efeito, a fosforilação pela PKC constitui geralmente uma regulação da actividade dos seus substratos (ver revista por Nishizúka, 1986).

EEEAPLO 13

Construção do plasmideo pTG116g

T;_ostrou-se que a imunidade da proteína F era acrescida se esta fosse ligada a uma zona hidrÓfoba era C-ternina.1 (recombinante VV.TG.FL.iV. 1146) · Contudo, verificou-se que a conformação da proteína. não era correcta por que esta é então muito pouco reconhecida por anti-corpos de indivíduos seropositivos. Foi portanto empreendida a construção de um vírus recombinante exprimindo a proteína Γ ligada a um pêptido hidrófobo em N-terrainal. Este péptido desempenharia assim o panei do ácido mirístico, assegurando ao mesmo tempo uma fixação ma.is sólida da proteína na membrana celular. Este recombinante foi construído a partir do recombinante W.TG.FLAV.1145 descrito

58243

D 11686/333 469 atrás. 0 presente exemplo refere-se portanto à utilização de um vector virai que exprime uma proteína F mais imunogénea que a proteína. F não modificada, e que tem uras conformação similar à da xoroteína nativa.

plasmideo PTG1165 contém portanto o gene F cuja parte codificando para, a extremidade EU^termina.! da. proteína foi posta em fase com a sequência de sinal da glicoproteína rábica, e esta sequência de sinal foi mutada a fim de suprimir a clivagem in vivo entre o péptido de sinal hidrofobo e a proteína F. As construções derivam do bacteriófago 'Í13TG171 descrito atrás (exemplo 5)· local de cliva.gem está situado entre a glicina terminal do péptido proteína rábica. A sinal e a lisina K-termxnal da glicofim de suprimir a clivagem, a glici na situada em -1 do local de clivagem foi mutada em triptofano, a fenila.la.nina em -2 foi mutada. em isoleucina. e a prolina em -5 em leucina. Estas mutações foram realizadas por meio do oligonucleótido com a sequência:

5’ AGGGAATTTCCATAAAGACAATAGAAAAACCAG 3’

Obtém-se a.ssim o bacteriófago 1I13TG1107. A sequência de sinal mutada da glicoproteína rábica fundida com o gene F é em seguida transferida para. o plasmideo pTGlSó poli.

Para isto, faz-se a clonagera do fragmento PstT-PstI de K13TG11O7 no pTG186-poli aberto ao local PstI. 0 plasmideo resultante é denominado pTG1165» 0 gene F fundido com a sequência sinal da raiva mutada é transferido para a vacina como se descreveu atrás.

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WFWLO 14

Imunoprecipitação das proteínas sintetizadas pelo vírus recombinante W.TG.FLAV. 1165

Operando como foi descrito para o plasmideo pTG1147 obtém-se o vírus da vacina recombinante que corresponde ao plasrnideo pTGllóp e denominado W.TG.FLAV. As prOteínas obtidas como foi descrito atrás são testadas por imunoprecipitação (figura 5)·

Os imunoprecipitados obtidos com o produto de W.TG.FLAV. 1165 fizeram aparecer uma. proteína cujo peso molecular aparente é de 26000 daltons. A proteína está ausente nos sobrenadantes de cultura. Uma manipulação

O K de marcação com a. ,3 metionina na presença de tunicamicina indica que a. proteína obtida não é glicosilada.

3XE:n?L0 15

Colocacação em evidencia dos anti-corpos anti-F nos ratos vacinados com os vírus W.TG.FLAV.116^

Vacinam-se ratos Balb/C fêmeas com 7 semanas por escarificação na base da cauda como se descreveu no exemplo

8. A detecção dos anti-corpos efectua-se pela técnica de Uestern blot”. A proteína F produzida no E, coli é transferida sobre nitrocelulose, são recortadas pequenas faixas e incubadas com soros dos animais vacinados (figura 6a). A reacção observada é de cerca de 3 a 5 vezes mais forte para o recombinante W.TG.FLAV.1165 que para o recombinante W.TG.FLAV.1147, e equivalente à do recombinante W.TG.FLAV.II96 (figura 6b). Contudo, prefere-se a utilização do recombinante W.TG.FLAV,1165 porque a proteína sintetizada é perfeitamente reconhecida pelos anti-corpos de indivíduos de seropositivos, e portanto

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D 11636/333 469 |w> JUií. -'AÂy

a sua conformação é correcta. 0 reconíbinante W.TG.FLAV. 1165 parece ser o melhor candidato para uma vacina contra a proteína Γ.

Depósito das estirpes representativas do invento :

bacteriófago M13mp701 e o plasmideo pTG1134 estão descritos no pedido de patente n?. 86 05043 de 8 de Abril de 1986.

plasmideo pJ19-6 foi depositado em 16 de Novembro de 1934 na Colecção Nacional de Culturas de Microorganismos do Instituto Pasteur sob o n5 84 29099»

A estirpe seguinte foi depositada em 6 de Junho de 1986 na Colecção Nacional de Culturasde Hicroorganismos do Instituto Pasteur:

-D. coli transformado pTG1147 sob o n?, I-56I.

1.	\ 11 an u · .o.« Kanki P.J., Science 230	Coligan J.E., Lee T.H., McLane M.F.,
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Claims

21. Ratner L., Stracich B., Josepli S.F., Ilahn B.I-I.,

Reddy F.P., Livak K.J., Petterway S.F.., Pearson

1-I.L. , Haseltine U.A. , Arya K.S. e Hong-Staal F.

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D 11686/333 ^69 _(Ιιν

I ϋ Juh. iOU ·

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0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado em França, em 16 de Junho de 1986 sob o ri⁹. 86 C8698.

L/

I

1« . - Vector virai caracterizado ι^οΐ⁷ compreender pelo menos ϊ . uma parte do genoma de um vírus, . um gene codificando para a proteína F do vírus responsável pela SIDA.

. .'-xssini como os elementos que asseguram a expressão desta nroteína nas células.

. - Vector virai de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a parte cio genoma de um vírus ser uma parte do genoma de um poxvirus. ³
3&. - Vectox- virai de ctcorclo com. a reivindicação 2, caracterizado por o poxvirus ser a vacina.

-36D 11686/333 469
4^. - Vector virai de acordo com urna das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender uma sequência de sinal e/ou uma sequência transmenbranária proveniente de ura vírus heterólogo.
5'·'. - Vector virai de acordo cora a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de sinal e/ou a sequência, transmenbranária proveniente de um vírus heterólogo provir do vírus da raiva.

65. - Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o gene que codifica ser o gene F total que compreende desde a extremidade 5’ 5 . a sequência cie sinal do gene G do vírus da raiva.

. o gene F total.

. a zona transmembranária (TI-^T) do gene G.

5, _ Vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a sequência de ADK codificando para a proteína F estar sob a. dependência de um pro motor de ura gene do poxvírus.

► ga, - Vector virai de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o motor ser ura promotor do gene da vac ina.

95. - Vector virai de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência cie ADxí codificando para a proteína F estar sob o controle do promotor do gene da proteína 7,5k da vacina.

105. _ Vector virai de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caractei'izado por a sequência codificando para a proteína F ser clonada no gene TK da vacina.

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11-. - Processo para, a preparação de ADN recombinante caracterizado por se preparar o ADN correspondente ao vec tor virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 10.

12®. - Cultura de células de mamíferos caracterizada por os mamíferos serem infectados por um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 10 ou por compreender um ADN de acordo com a reivindicação 11.

13- . - Processo para, a preparação da proteína j? do vírus responsável pela SIDA, caracterizado por se cultivarem células de acordo com a reivindicação 12 e de se recuperar a proteína F produzida.

14- 5. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se prepara.r uma proteína que compreende ainda uma parte de glicoproteina da raiva.

15- · - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se prenarar uma proteína, que compreende ainda um péptido hidréfobo em posição N-terminal.

165. - Processo para a preparação de uma vacina caracterizado por se incorporar um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 10 e/ou uma proteína de acordo com uma das reivindicações 13 a 15·

17*. - Anti-corpos lançados contra a proteína F do vrus responsável pela SIDA, caracterizadosnor incluirem um organismo vivo com um vector virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 10 ou com as proteínas obtidas de acordo com uma das reivindicações 13 a 15 e por se recuperarem os anti-corpos formados depois de uia período de tempo determinado.

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