PT85306B

PT85306B - Clonagem e expressao do factor de crescimento para fibroblastros acidico

Info

Publication number: PT85306B
Application number: PT85306A
Authority: PT
Inventors: Kenneth A Thomas Jr; David L Linemeyer; Linda J Kelly; Guillermo Gimenez-Gallego
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-07-10
Publication date: 1990-03-30
Also published as: DE3789530D1; DE3789530T2; JP2565666B2; FI98915C; AU7554487A; KR880001817A; DK175786B1; DK358787D0; IE62101B1; ES2062982T3; IL83062A0; EP0259953A1; FI873033L; JPH0714347B2; IL83062A; EP0259953B1; DK358787A; JPH07224096A; KR960009725B1; IE871871L

Description

OBJECTIVOS DO INVENTO

Ê, deste modo, um objectivo do pre^ sente invento proporcionar uma sequência de bases de núcleo, tídeos para aFGF bovino e aFGF humano a partir das sequências de aminoácidos das proteinas especificas. Um outro objectivo é produzir genes codificadores dos aFGFs especificos e incorporar os genes em vectores de clonagem adequados. Um outro objectivo é transformar ura hospedeiro adequado com ca da um dos vectores recombinantes e induzir a expressão dos genes aFGF específicos. Um outro objectivo é isolar e purificar aFGF bovino e aFGF humano biologicamente activos. Estes e outros objectivos do presente invento serão obvios féi ce à descrição que se segue:

SUMÁRIO DO INVENTO

Construiram-se genes únicos codifi_ cadores da sequência de aminoácidos do factor de crescimento para fibroblastos (aFGF) bovino e aFGF humano. 0 gene bc> vino foi obtido por traduçao reversa da sequência de aminoacidos para aFGF enquanto que o gene humano foi obtido por mutações pontuais específicas do gene bovino. Cada construção genética foi inserida num vector de expressão que se usou para transformar um hospedeiro adequado. As células hospedeiras transformadas produziram aFGF recombinante (r-aFGF), humano ou bovino, que foi purificado e possui uma actividade equivalente à proteína nativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA factor de crescimento para fibro, blastos acidico existe em várias formas micro-heterogéneas que sao isoladas de várias fontes de tecidos celulares que se sabe conterem aFGF. Formas micro-heterogéneas conforme aqui é usado refere-se a um produto de um único gene, ou seja um peptídeo produzido a partir de uma única unidade de gene de DNA, que é estruturalmente modificado após traduçao. As modificações estruturais, no entanto, nao resultam em quaisquer alterações significativas da actividade biológica do peptídeo. As modificações podem ter lugar in vivo ou durante o processo de isolamento e purificação. A modifi_ caçao in vivo resulta em proteólise, glicosilação fosforilja çao ou acetilaçao do extremo N mas nao lhes está limitada. A proteólise pode incluir exoproteólise em que um ou mais aminoácidos terminais sao sequenciadamente clivados enzimá-

ticamente para produzir uma forma micro-heterogénea que tem menos aminoácidos do que o produto original do gene. A modi_ ficaçao endoproteolítica resulta da acçao de endoproteases que cortam o peptideo em locais específicos dentro da sequên. cia de aminoácidos. Modificações semelhantes podem ocorrer durante o processo de purificação que também resulta na pr£ duçao de formas micro-heterogéneas. A modificação mais comum que ocorre durante a purificação é proteólise que é geramente mantida num nível baixo pela utilização de inibidores de proteases. Geralmente observa-se uma mistura de formas micro-heterogéneas após purificação do aFGF nativo. aFGF nativo refere-se a aFGF isolado e purificado a partir de tecidos ou células que contêm aFGF.

invento é considerado como incluindo todas as formas micro-heterogéneas do mamífero do factor de crescimento para fibroblastos acidico. As execuções preferidas incluem formas micro-heterogéneas de aFGF humanas e bovinas. As formas micro-heterogeneas de aFGF bovino mais preferidas incluem uma forma de 154 aminoácidos, uma forma de 140 aminoácidos e uma forma de 134 aminoácidos. A forma de 140 aminoácidos está apresentada na TABELA III e é a forma mais preferida das espécies bovinas. A forma de 154 aminoácidos inclui os seguintes aminoácidos adicionais; Ala-Glu-Gli-Glu-Tre-Tre-Tre-Fen-Tre-Ala-Leu-Tre-Glu-Lis, com o extremo carboxilo lisina ligado ao extremo amino Fem na primeira posição da forma de 140 aminoácidos. A forma de 134 aminoácidos é idêntica à forma de 140 aminoácidos excej) to os 6 primeiros aminoácidos do extremo amino terem sido removidos. Quando isoladas as quantidades relativas destas formas micro-heterogéneas variam dependendo do processo usado mas todas as preparações contêm pelo menos uma porção de cada forma.

Ί

Ο aFGF humano apresenta uma micro-heterogeneidade semelhante ao aFGF bovino. As formas micro^ -heterogéneas mais preferidas do aFGF humano incluem uma forma de 154 aminoácidos, uma forma de 140 aminoacidos e uma forma de 139 aminoácidos. A forma de 140 aminoácidos humana difere da forma bovina em onze aminoácidos, como se mostra na Tabela V. A forma de 154 aminoácidos contem a sequência exacta da forma de 140 aminoácidos humana mais 14 aminoácidos adicionais associados à forma de 154 aminoácidos bovina, com uma excepção. 0 aminoácido na quinta posição do extremo N ou na posição -10, conforme determinado a partir da Fen do extremo n da forma de 140 aminoácidos hurna_ na, e isoleucina e substitui a treonina na forma bovina. A sequência adicional de 14 aminoácidos humano do extremo N é: Ala-Glu-Gli-Glu-Ile-Tre-Tre-Fen-Tre-Ala-Lue-Tre-Glu-Lis.

Uma terceira forma de aFGF humano contem 139 aminoácidos e é equivalente à forma de 140 aminoácidos humana com a feni/L alanina do extremo amino removida. 0 residuo asparagina do extremo amino pode ser desamidado para dar acido aspartico na forma de 139 aminoácidos do aFGF humano.

As formas de

140 e 139 aminoácidos sao as formas preferidas das formas micro-heterogéneas humanas.

Produziu-se r-aFGF de mamífero por clonagem do gene natural a partir de DIíA genomico ou de cDNA, ou por construção de um gene para uma das formas micro-heterogéneas da proteína baseado nas sequências de aminoácidos conhecidos destas formas micro-heterogeneas de aFGF de espécies mamíferas incluindo o homem. 0 DNA genómico é extraido de células do cerebro ou da pituitária de mamífero e preparado para clonagem por fragmentaçao ao acaso do DNA de alto peso molecular seguindo a técnica de Maniatis et al. ,

Cell 5_: 687-701 (1978) ou por clivagem com uma enzima de restrição pelo método de Smithies et al.,

Science

202: 1284-1289 (1978). Ο DNA genómico é então incorporado num vector de clonagem adequado, geralmente fago lambda de jS. coli, ver Maniatis et al. , Molecular Cloning, A Laborato. ry Manual, Cold Spring Ilarbor Laboratory, Cold Spring Ilarbor New York (1982).

Para obter cDNA para aFGF, extraiu, -se RNA poli A de células que expressam aFGF pelo método de Aviv e Leder Proc. Natl. Acad. Sei., 69: 1408-1412 (1972). 0 cDNA é preparado usando transcriptase reversa e DNA polimerase seguindo técnicas convencionais, conforme descrito em Maniatis et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Ilarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). 0 cDHA é dotado de caudas e clonado num vector adequado, geralmente pBR322, por uma técnica semelhante a de Wensink, et al., Cell 3: 315-329 (1974).

As bibliotecas de clones de DNA genómico ou de cDNA testaram-se para identificação dos clones contendo sequências de aFGF, por hibridaçao com uma sonda de oligonucleotídeos. A sequência do oligonucleotídeo da sonda de hibridaçao baseia-se na sequência de aminoácidos do aFGF previamente determinada. Maniatis et al., supra, Anderson e Kingston, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 6838-6842 (1983) e Suggs et al. , Proc. Natl. Acad, Sei. USA 78: 6613-6617 (1981) descreve vários processos para rastreio de clones genómicos e de cDNA.

processo preferido para a obtenção de um gene para aFGF de mamífero é sintetizar o gene. 0 gene pode ser sintetizado com base na sequência de aminoácidos de uma forma micro-heterogénea de aFGF obtida a partir de qualquer mamífero incluindo o homem. 0 método preferido é usar a sequência de aminoácidos bovina para aFGF e fazer quimicamente mutações pontuais das sequências de bases para produzir os genes para outras espécies. As sequências de aminoácidos para aFGF bovino e humano estão divulgadas no Pedido de Patente U.S. N² de Série 868 473 entregue em 30 de Maio de 1986, a qual é uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S, N^e de Série 774 359, entregue em 12 de Setembro de 1985, a qual é uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S. N^s de Série 685 923, entregue em 24 de Dezembro de 1984 (agora abandonadas).

Os genes sintéticos sao baseados na sequência de aminoácidos determinada e subsequentemente descrita por Gimenez-Gallegs et al,, Science 230; 1385-1388 (1985) e na sequência de aminoácidos humana conforme descrita por Ginienez-Gallego et al. , Biochem. Biophugs. Res. Comm., 138; 611-617 (1986). A sequência de nucleotídeos única da forma de 140 aminoácidos do aFGF bovino obteve-se por traduçao reversa da sequência de aminoácidos por uma técnica semelhante à de Itakura et al., Science 198: 1056-1063 (1977). As várias sequências novas de nucleotídeos correspondendo à sequência de aminoácidos nativa do aFGF bovino estão apresentadas na Tabela seguinte:

10 15 20

Phe

Asn

leu

Pro

Leu

Gly

Asn Tyr Lys

Lys

Pro

Lys

Leu

Tyr Cys

Ser

Asn

Gly

TTQ

AAQ

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CTN

GGN

AAQ TAQ AAP

AAP

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AAP

CTN

TAQ TGQ

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GGN

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25

30

35

40

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Leu

Arg

Ile

Leu

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Thr

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Asp

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Arg

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GGN

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CGN

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CAP

TTP

AGP

ATA

TTP

AGP

AGQ

45

50

55

60

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CAQ ATQ CAP CTN CAP CTN TGQ GCN GAP TCN ATQ GGN GAP GTN TAQ ATQ AAP TCN ACN GAP

ATA

TTP

AGQ

ATA

AGQ

65

70

75

80

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Gly

Gin

Phe

Leu

Ala

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Asp Thr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gly

Ser

Gin

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Pro

Asn

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GGN

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CTN

GCN

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GAQ ACN

GAQ

GGN

CTN

TAQ

GGN

TCN

CAP

ACN

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AAQ

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AGQ

85

90

95

100

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Cys

Leu

Phe

Leu

Glu

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Leu

Glu

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His Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ile

Ser

Lys

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CTN

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CTN

GAP

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CTN

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CAQ TAQ

AAQ

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TAQ

ATQ

TCN

AAP

TTP

AGP

TTP

ATA

AGQ

105

110

115

120

Lys

His

Ala

Glu

Lys

His

Trp

Phe

Val

Gly

Leu

Lys

Lys Asn

Gly

Arg

Ser

Lys

Leu

Gly

AAP

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GCN

GAP

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GGN

CTN

AAP

AAP AAQ

GGN

CGN

TCN

AAP

CTN

GGN

TTP

AGP

AGQ

TTP

125

130

135

140

Pro Arg Thr His Phe Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

CCN CGN ACN CAQ TTQ GGN CAP AAP GCN ATQ CTN TTQ CTN CCN CTN CCN GTN TCN TCN GAQ

AGP	ATA TTP	TTP	TTP	AGQ AGQ
= C ou
= A ou	G, e

N = A, T, C ou G

A sequência de nucleotídeos do pre_ sente invento apresenta as seguintes características; codoes preferidos por Escherichia coli e células de mamífero sempre que possível, eliminação de sequências cora complementaridades múltiplas, incorporação de locais de restrição únicos ao longo do gene, extremos coesivos terminais para enzi. mas de restrição para facilidade de inserção do gene nos plasmídeos, um sítio de restrição único em posição central para permitir a montagem do gene em duas metades, de preferência um codao para metionina N-terrainal para ura sítio de iniciaçao da traduçao e codoes de paragem da traduçao em tandem.

Se bem que a descrição e exemplos que se seguem, ilustram o presente invento em relaçao a uiaa sequência de nucleotídeos particular para aFGF bovina, subentende-se que o presente invento poderá incluir qualquer uma das permutações apresentadas na Tabela I. A tabela que se segue contem a sequência de nucleotídeos preferida:

TABELA II

TTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACGGTGGT 60

TACTTTCTCCGCATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAA 120

CATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTATCGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAA 180

ACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGACCCCAAAC 240

GAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAA 300

AAGCATGCTGAGAAACATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGC 360

CCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCTGTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGAC 420 gene constrói-se cora uma porção condutora (leader) contendo um local de clivagem por enzimas de restrição num codão para metionina N-terminal para uma sítio de iniclaçao da traduçao. 0 gene também contem uma cauda possuindo codoes de paragem da traduçao em tandem e dois sítios para clivagem com enzimas de restrição. A característica de complementaridade do DNA permite a escolha de sequências de bases que por sua vez permitem a incorporação sítios únicos de clivagem por enzimas de restrição ao longo do gene. A sequência de bases de gene preferida, com a situaçao dos sítios de clivagem por enzimas de restri çao, está mostrada na tabela seguinte:

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TABELA III

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TABELA III (cont

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	CD		CD	CJ		<
	3		CD	CJ
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	O .		CJ	<3

k sequência do gene para cada cadeia da molécula de cadeia dupla foi dividida ao acaso em 8 sequências de nucleotídeos. Construiram-se os oligonucleo. tídeos com extremos sobreponíveis para permitir a formaçao do DNA de cadeia dupla. A tabela que se segue contem um dos múltiplos arranjos de oligonucleotideos que se usou para produzir o gene para aFGF bovino.

TABELA IV

OLIGO-1 10	20	30	40	50	58
5' AATTCATGTT	CAATCTGCCA CTGGGTAATT ACAAAAAGCC AAAGCTTCTT	TACTGCTC 3'
OLIGO-2 10	20	30	40	45
5' AGAAGCTTTG	GCTTTTTGTA	ATTACCCAGT GGCAGATTGA	ACATG 3'
OLIGO-3 10	20	30	40	50	60
5' TAACGGTGGT	TACTTTCTCC	GCATCCTGCC AGATGGTACC	GTGGACGGCA	CCAAAGATCG 3'
0LIG0-4 10	20	30	40	50	59
5' TGCCGTCCAC	GGTACCATCT	GGCAGGATGC	GGAGAAAGTA	ACCACCGTTA	GAGCAGTAA 3'
OLIGO-5 10	20	30	40	46
5' TTCTGATCAA	CATATTCAAC	TGCAGCTGTG	CGCCGAATCT	ATCGGT 3'
OLIGO-6 10	20	30	40	50	60 65
5' GTAAACTTCA	CCGATAGATT	CGGCGCACAG	CTGCAGTTGA	ATATGTTGAT	CAGAACGATC TTTGG
0LIG0-7 10	20	30	40	50	60 I

5' GAAGTTTACA TCAAATCTAC CGAAACTGGT CAATTCCTTG CCATGGACAC TGATGGCCTG CTGTACG 3

0LIG0-8 10	20	30	40	50	60 62
5' GATCCGTACA	GCAGGCCATC	AGTGTCCATG	GCAAGGAATT	GACCAGTTTC	GGTAGATTTG AT 3
OLIGO-9 10	20	30	40	50	52
5' GATCCCAGAC	CCCAAACGAG	GAGTGCCTTT	TCCTGGAGCG	CCTGGAGGAA	AA 3'
OLIGO-IO 10	20	30	40	50	58
5' GTTGTAATGG	TTTTCCTCCA	GGCGCTCCAG	GAAAAGGCAC	TCCTCGTTTG	GGGTCTGG 3'
0LIG0-11 10	20	30	40	48

5' CCATTACAAC ACCTACATCT CTAAAAAGCA TGCTGAGAAA CATTGGTT 3'

0LIG0-12 10	20	30	40	46
5‘ GGCCTACGAA	CCAATGTTTC	TCAGCATGCT	TTTTAGAGAT	GTAGGT 3'
0LIG0-13 10	20	30	40	50	53
5' CGTAGGCCTT	AAGAAAAATG	GCCGCTCTAA	ACTGGGCCCT	CGTACTCACT	TTG 3’
0LIG0-14 10	20	39	40	50	55
5‘ GCTTTTTGAC	CAAAGTGAGT	ACGAGGGCCC	AGTTTAGAGC	GGCCATTTTT	CTTAA 3*
0LIG0-15 10	20	30	40	50	56
5' GTCAAAAAGC	TATCCTGTTC	CTGCCACTGG	CAGTGAGCTC	TGACTAATAG	ATATCG 3
0LIG0-16 10	20	30	40	50

5' TCGACGATAT CTATTAGTCA GAGCTCACTG GCAGTGGCAG GAACAGGATA 3'

Os oligonucleotídeos ilustrados na Tabela IV sao apresentados meramente como um exemplo de subunidades oligonucleotji dicas e nao devem ser encarados como limitantes, A sequência de base composta mostrando a sobreposição e o arranjo dos oligonucleotídeos esta ilustrada na Tabela III.

gene bovino e montado em 2 passos: primeiro, a metade correspondente à porcao N-terminal da proteína; e segundo a metade C-terminal. De um modo geral os oligonucleotídeos sao fosforilados com polinucleotídeo

2 cinase de T4 na presença de ATP ou ATP marcado com P. Na primeira reacçao de cada passo os oligonucleotídeos que constituem uma cadeia do gene sao fosforilados com excepçao do oligonucleotídeo 5’. Na segunda reacçao os oligonucleotídeos que constituem a segunda cadeia sao fosforilados, cora excepçao do oligonucleotídeo do extremo 5’. Quando se usam oligonucleotídeos fosforilados, adiciona-se cerca de 1 pmole do oligonucleotídeo marcado com P para posterior identificação dos produtos. 0 emparelhamento é efectuado num tampao adequado, como seja um que contenha, mas nao esteja limitado a 60 mM Tris, cerca de pE 7,6, ditiotreitol (DTT) aproximadamente 5 mM, MgC^ aproximadamente 10 ml-í e ATP cerca de 30 ulí à volta de 90°C durante cerca de 4 minutos seguido de uma transferência rápida para cerca de 60°C e um arrefecimento lento até cerca de 30°C. A ligaçao é efectuada num tampao adequado, como seja um contendo, mas nao estando limitado a Tris aproximadamente 60 mií, cerca de pH 7,6, DTT aproximadamente 10 mií, IlgCl^ aproximadamente 10 mM, ATP aproximadamente 1 mil e cerca de 0,03 unidades de DNA ligase de T4 a cerca de 20°C durante cerca de 1 hora e meia.

Os oligonucleotídeos ligados .foram purificados por electrororese em gel de poliacrilamida após precipitação com etanol. Os oligonucleotídeos foram re dissolvidos num tampao contendo cerca de 20 jul de formamida aproximadamente a 8,?, Tris-borato cerca de 50 mM, a volta de pH 8,3, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) aproximadamente 1 mM, xilenogianol cerca de 1% (p/v) e cerca de 0,1 /s (p/v) de azul de bromofenol. Cada amostra foi aquecida a cerca de 90°C durante cerca de 3 minutos e submetido a ele£ troforese em gel de cerca de 10^ ureia-poliacrilamida a apro. ximadamente 75 Watts durante aproximadamente 5 horas. As bandas N-terminais de 231 bases foram removidas, combinadas e eluidas a cerca de 4 C em acetato de amonio aproximadamen. te 0,5 M contendo EDTA aproximadamente 1 mM a volta de pH 8. As bandas C-terrainais de 209 bases foram tratadas do mesmo modo.

As sequências de genes sintéticos codificadores das porçoes N-terrainais ou C-terminais do aFGF foram incorporadas no plasmideo pBR322. Pretende-se especial, mente que seja incluido no âmbito deste invento o uso de ou tros plasmídeos nos quais o gene para aFGF possa ser incorporado e que permitam a expressão do gene aFGF, Os oligonucleotídeos emparelhados de novo, cerca de 300 fmoles e cerca de 100 fmoles do extremo N de 231 pares recuperados sao cada um ligados a cerca de 100 fmoles de pBR322 cortado com EcoRI-BamHI de 3,9 Iíilobases (Kb) para o extremo N. 0 extre mo C de 209 pb construído do mesmo modo usando pBR322 corta, do com BainHI-SalI. A ligaçao foi efectuada num tampao contendo Tris aproximadamente 25 mM, cerca de pH 7,8, DTT apro. ximadamente 1 mM, MgCl₂ aproximadamente 10 mM, ATP aproxima, damente 0,4 mM, com cerca de 1 unidade de DNA ligase de T4 durante cerca de 1 hora a cerca de 20°C. Cada vector ligado a meio gene foi usado para transformar células bacterianas competentes, tais como E. coli RR1 (Bethesda Research Lab£ ratories, BRL) seguindo os processos dos fornecedores. As células transformadas foram seleccionadas quanto ao crescimento era ampicilina e testadas quanto à presença de uraa inserção EcoRI-BamEI de 231 pares de bases ou de usa inserção BaralII-SalI de 209 pb por análise de restrição de mini-prepji rações de lisado de plasmídeo.

A sequência de DNA dos clones contendo as inserções de tamanho adequado foi determinada usari do as técnicas de sequenciação química de DNA de Maxam e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 560-564 (1977).

gene sintético final para aFGF de tamanho completo foi clonado por clivagem o clone da metade N-terniinal com as enzimas de restrição BamHI e Sall, tratamento com fosfatase alcalina e ligaçao desta à inserção BamHI-SalI de 209 pb purificada em gel do clone da metade C-terminal. Este material ligado foi usado para transformar células RR1 competentes como atrás.

A expressão do gene sintético para aFGF foi conseguida através de uma série de diferentes sistemas de promotores da expressão. Pretende-se que seja incluido no âmbito deste invento a utilização de outros sistemas de promotores de expressão para a expressão do gene para aFGF intacto. A construção preferida usa o promotor tac de E. coli, um hibrido entre as regiões do promotor trp e o promotor lac conforme descrito por de Boer et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80: 21-25 (1983), 0 plasmídeo pKK 223-3 (Pharmacia) que contem o promotor tac e o terminador da transcrição de rrnB rRNA foi modificado para remoção do sítio para a enzima de restrição Sall derivado do pBR322. 0 terminador de rrnB rRIJA verificou-se permitir a expressão de promotores fortes, Gentz et al., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 78: 4936-4940 (1931); Brosius, Gene 27: 161-172 (1984).

DNA do plasmideo pKK223-3 clivoji -se com enzimas de restrição para produzir um fragmento de DNA de 2,7 Kb para gerar o clone pKK 2,7. 0 gene sintético para aFGF foi cortado do seu vector pBR322 e transferido pa_ ra o plasmideo pKK 2,7 após corte de pKK 2,7 com as enzimas de restrição EcoRl e Sall. 0 recombinante resultante, mostrado na Figura 1, usou-se para transformar Ξ. coli JIÍ105 (Pharmacia) ou células DH5 (BRL) e expresso.

A mutagénese específica de sítio é uma maneira eficaz para converter a sequência de aminoácji dos de uma espécie mamífera de aFGF na sequência de aminoácidos de aFGF de uma outra especie. A descrição que se segue relaciona-se com a conversão mutagénica especifica de sítio de aFGF bovino, forma de 140 aminoácidos, em aFGF humano, compreende-se no entanto, que o processo pode ser usa do para converter aFGF de qualquer espécie de mamíferos no de outra espécie qualquer. A única limitaçao à conversão é que as sequências de aminoácidos de ambos os aFGFs devem ser conhecidos. A tabela que se segue apresenta os aminoácidos que devera ser substituídos e a localizaçao no mapa de amino, ácidos do aFGF bovino, Tabela III, onde as substituições sao feitas:

TABELA V
Localizaçao do Aminoácido	Aminoácidos substituídos de
aFGF Bovino	por aFGF Humano
5	Leu	Pro
21	Tyr	His
35	Lys	Arg
47	Cys	Ser
51	Ile	Val

TABELA V (Continuação)

64	Phe	Tyr
106	His	Asn
116	Arg	Ser
117	Ser	Cys
119	Leu	Arg
125	Phe	Tyr

Tal como com a sequência do gene bovino construiram-se oito oligonucleotídeos representando a sequência do gene humano segundo o mesmo processo usado para os oligonucleotídeos bovinos, A tabela que se segue contem ura dos múltiplos arranjos de oligonucleotídos que é usado para produzir o gene para aFGF humano.

TABELA VI

OLIGO-1

5' CTGCCACÇGGGTAATTAC 3'

OLIGO-2

5' CGGTGGTÇACTTTCTCCG 3'

OLIGO-3

5' CGGCACCAGAGATCGTTC 3’

OLIGO-4

5' GCAGCTGTCCGCCGAATCTGTCGGTGAAG 3'

OLIGO-5

5’ CTGGTCAATACCTTGCCATGG 3'

OLIGO-6

5' GCTGAGAAAAATTGGTTCG 3'

OLIGO-7

5' GGCCGÇGTTTAÇAGCTGCCATTTTTCTTAAGG 3'

OLIGO-8

5' CGTACTCACTATGGÇCAAAAAGCTATCC 3'

Converteu-se o gene sintético bovino clonado para o aFGF num gene sintético humano para aFGF por uma série de mutações pontuais dirigidas. A mutagénese dirigida de oligonucleotídeos do gene clonado permite a alteraçao da sequência de bases do aFGF bovino de modo a que a sequência de aminoácidos resultante contenha os ami. noácidos substituídos apresentados na Tabela V e seja aFGF humano. Fez-se uma delecçao no gene bovino para remover a fenilalanina amino-terminai para a produção da forma micro-heterogénea humana de 139 aminoácidos do aFGF. Fez-se uma mutaçao pontual para substituir a asparagina na segunda posição por ácido aspártico. Gomo alternativa, a asparagina é desamidado para dar ácido aspártico. Os métodos para efeç. tuar estes processos sao descritos abaixo ou sao conhecidos. A mutagénsse dirigida de oligonucleotídeos é efectuada usan do processos convencionais conhecidos, Zoller e Smith, Fie — thods in Fuzymology, 100: 468-500 (1983); Norris et al. , Nu. cleic Acids Research, 11; 5103-5112 (1983); e Zoller e Smith DNA, 3.: 479-488 (1984). As mutações pontuais efectuadas por mutagénese dirigida de nucleotídeos convencional estão apre sentadas na Tabela VII que se segue. Na Tabela III pode-se ver a localizaçao das bases mutagenizadas. As mutações pontuais sao apresentadas meramente como um exemplo das altera, çoes que resultarão no gene para aFGF humano e nao devem ser vistas como limitantes.

TABELA VII

Localizaçao Base substituída Aminoãcido Humano da base_____ aFGF Bovino por aFGF Humano Correspondente

22	T	c	Pro
69	T	c	His
112	A	G	Arg
148	G	C	Ser
159	A	G	Val
199	T	A	Tyr
324	c	A	Asn
354	c	A	Ser
358	c	G	Cys
364	T	n U	Arg
365	G	c	Arg
382	T	A	Tyr

Os clones de expressão sao crescidos a cerca de 37°C num meio de crescimento adequado o qual consiste era cerca de 1% de Triptona, cerca de 0,5a de extrato de levedura, cerca de 0,5a de NaCl, cerca de 0,4% de glucose e cerca de 60 jug/ml de ampicilina. Quando a densida, de óptica a 550 nm atingir cerca de o,5, pode-se adicionar isopropil-JB-D-tiogalactopiraniosido (IPTG) para dar uma concentração final de cerca de 1 ml-í e o crescimento continuou a cerca de 37°C durante cerca de 3 horas. As células de 1 litro de meio de cultura foram, colhidas por centrifugação e ressuspensas num tanpao de disrupçao contendo fosfato de sjó dio 10 r.iM a cerca de prl 7,2, aproximadamente 5 mM EDTA, aproximadamente 10,6 jug/ml de N-p-toluenossulfonil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK), cerca de 34,3 jig/ml de pepstatina A, cerca de 87 jug/inl de fluoreto de fenilmetil sulfonilo (PI-íSF), cerca de 15 ug/ml do inibidor da tripsina pancreática bovina (BPTI) e cerca de 25,2 pg/ml de leupeptina. As células ou sao rebentadas imediatamente ou congela, das e guardadas a -70°C e rebentadas imediatamente após des. congelaçao através de aproximadamente três passagens através de uma prensa de células Francesa a cerca de 12 000 psi e à volta de 4°C. 0 sobrenadante foi colhido por centrífuga, çao.

aFGF recombinante foi purificado até homogeneidade por um processo cromatografico único de dois passos empregando uma combinação de cromatografia de afinidade em heparina-Sepharose seguido de cromatografia quida de alta resolução (HPLC) em fase reversa. 0 r-aFGF bruto aplicou-se numa coluna de heparina-Sepharose num tampao diluído como seja aproximadaEiente 10 mH fosfato ou Tris entre cerca de pH 6 a 8; a qual é subsequentemente lavada com uma concentração salina baixa, como seja cerca de 0,8 M de NaCl, até a absorvância a 280 nm cair ate valores apr£ ximados do fundo. 0 r-aFGF foi eluido com uma solução tampo, nada de concentração salina alta como seja fosfato de sodio ou Tris 10 mH, cerca de pH6 a 3, contendo aproximadamente 1,5 rn NaCl. 0 eluato purificou-se então por HPLC de fase re versa numa resina consistindo em cadeias de alquilsilano li. gadas covalenteraente com grupos alquilo tendo entre 3 e 8 átomos de carbono, de preferência 4 átomos de carbono. 0 r-aFGF foi directaraente aplicado à coluna de HPLC equilibrada num ácido diluido como seja ácido trifluoroacético, ácido acético ou ácido fosfórico aproximadamente 10 mH e eluido com um gradiente linear de solvente orgânico como seja acetonitrilo ou etanol. 0 aFGF bovino derivado do cerebro foi préviamente descrito como ligando-se a heparina-Sepharo. se por Maciag et al., Science 225: 932-935 (1984) e a colunas de HPLC de fase reversa por Thomas et al Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 81; 357-361 (1984) como parte de protocolos de purificação com passos múltiplos. Baseado, em parte, na abundância relativamente alta de r-aFGF em lisados bacteria_ nos, demonstrou-se aqui estes dois passos sozinhos sao suficientes para se obter r-aFGF homogeneamente puro de cerca de 16 000 daltons conforme estabelecido por electroforese em géis de poliacrilamida. Estes dois passos sozinhos nao dao aFGF puro do cérebro.

Determinou-se a actividade raitogé3 nica de aFGF purificado pela incorporação de H-timidina em DNA por fibroblastos de linha celular, de preferência BALE/ /c 3T3 A31 (American Type Culture Collection). 0 aFGF recombinante mostra um pico de resposta a cerca de 1 mg de proteína ou menos por ml no ensaio de estimulação de fibroblastos .

Uma outra execução deste invento é um método para promover a cura de feridas pela aplicaçao do novo peptídeo, com ou sem heparina, de preferência com hepa_ rina, cerca de 1 a cerca de 500 pg/cm deste invento na área da ferida tópica ou subcutâneamente numa quantidade de cerca de 0,19 100 jug/cm de superfície para aplicações tópi. cas.

Várias formulações farmacêuticas sao úteis para aplicaçao, por exemplo pornadas, pastas, sol_u çoes, géis; polímeros sólidos solúveis em água, como sejam albuminas, gelatinas, hidroxipropilcelulose, plurónicos, te trónicos ou alginatos em que o ingrediente activo é incorpo. rado em quantidades de cerca de 1 a cerca de 100 jig/ml.

A capacidade do aFGF para estimular a divisão em vários tipos celulares incluindo fibroblastos, células endoteliais vasculares e da córnea e similares torna estes peptideos úteis como agentes farmacêuticos. Estes compostos podem ser usados para tratar feridas de mamíferos incluindo humanos pela administraçao do novo r-aFGF a pacientes necessitados de tal tratamento.

Os exemplos que se seguem ilustram o presente invento sem, no entanto, limitar o mesmo a eles.

EXEMPLO I

Síntese de Oligonucleotideos

Sintetizaram-se oligonucleotideos de acordo com a técnica descrita por Matteucci e Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103; 3185-3191 (1981); Beaucage e Caruthers Tetrahedron Letters 22: 1859-1862 (1981). As sequências de bases dos oligonucleotideos sintetizados estão apresentados na Tabela IV.

EXEMPLO 2

Montagem do Gene para o aFGF

Montaram-se os oligonucleotideos do Exemplo 1 em duas unidades separadas, a metade N-terminal (231 pb) e a metade C-terminal (209 pb). As duas metades foram então combinadas para dar o gene sintético completo, ver Tabela III. Inicialmente os oligonucleotideos foram fosforilados na seguinte mistura de reacçao: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mH DTT, 10 mM TígCl^, 33 pM ATP, 0,3 unidades de polinucleo_ tideo cinase de T4 por pl e 2,5 pmoles de oligonucleotideo por pl. A mistura foi incubada 1,5 horas a 37°C e depois mais uma hora após suplementar a mistura com 0,2 unidades/pl de cinase e ATP para dar uma concentração de 100 mM. Para marcaçao radioactiva, a mistura Inicial continha 37 nCi/pl de /γ-³²Ρ7-ΑΤΡ.

emparelhamento e ligações foram feitos em duas reacções separadas. Em cada uma das reacções adicionou-se 100 pmoles de cada um dos oito oligonucleotideos. Numa reacçao os oligonucleotideos que constituem uma cadeia da metade C-terminal ou N-terminal do gene foram fosforilados com excepção o oligonucleotideo do extremo 5'. Na segunda reacçao os oligonucleotideos que constituem a cadeia oposta foram fosforilados, de novo coe excepção do oligonucleotideo do extremo 5'. Assim, em cada reacçao 3 oligonucleotideos foram fosforilados e 5 nao foram. Quando se usou os oli gonucleotideos fosforilados adicionou-se também 1 pmole do

2 oligonucleotideo marcado com P para posterior identificação dos produtos. Cada reacçao continha 200 pl com 70 mM Tris pH 7,6, 5 mH DTT, 10 mM MgCl_? e 30 pl·' ATP. Os oligonucleotideos foram emparelhados aquecendo a 90°C durante 4 minutos, depois transferiu-se iiaediatamente a reacçao para 60°C e dei_ xou-se arrefecer lentamente até 30°C. A ligaçao foi feita em 400 pl contendo 60 mM Tris pH 7,6, 10 mM DTT, 10 mM MgCl^, 1 mM ATP e 0,03 unidades de DNA ligase de T4 por pl por incubação a 20°C durante 1,5 horas.

Usou-se electroforese em gel de poliacrilamida para purificar os oligonucleotideos ligados. Os oligonucleoticleos ligados foram precipitados com etanol, redissolvidos em 20 pl de 80% formamida, 50 mM Tris-borato pM 8,3, 1 mM EDTA, 0,1% (p/v) xilenocianol e 0,1% (p/v) de azul de bromofenol. Cada uma das amostras foi aquecida a 90°C durante 3 minutos e submetida a electroforese num gel de 10% ureia-poliacrilamida a 75 watts durante 5 horas. As bandas de oligonucleotideos foram visualizadas por exposição do gel a filme de raios X.

As bandas de 231 pares de bases de cada reacçao para o extremo N foram cortadas do gel, combinadas e eluidas a 4°C em 1 ml de 0,5 ií acetato de amónio, 1 mM EDTA pH 8. 0 DNA eluido foi precipitado com etanol e re dissolvido em 30 jil de 70 mM Tris pIT 7,6, 5 mM DTT e 10 mM MgCl₂. As bandas de 209 bases do extremo C foram eluidas do mesmo modo.

Os oligonucleotideos purificados do gel foram emparelhados antes da transformaçao por aquecimento a 90°C durante 4 minutos e arrefecimento lento até 20°C. Os oligonucleotideos de 209 pb emparelhados foram ligados ao fragmento de DNA BamHI-SalI de 3,9 kb do pBR322 purificado em agarose. As reacçoes de ligaçao foram diluídas a 1:5 em H₂0 e usou-se 1 p.1 da diluição para transformar 20 |il de células competentes E.coli RR1 (BRL) conforme descrito pelo fornecedor. Os transformantes foram seleccionados relativamente ao crescimento em ampicilina e testados quanto à presença da inserção EcoRI-BamHI de 231 pb ou BamHI-SalI de 209 pb por análise de restrição de minipreparações de lisado de plasmideo.

A sequência de DNA dos clones contendo as inserções de tamanho adequado foi determinada usando as técnicas de sequênciaçao química do DNA de Mexam e Gil_

bert, Proc. Ilatl, Acad. Sei. USA 74:560-564 (1977). Uma vez que nenhum dos clones de 231 pb tinha a sequencia correcta, preparou-se como se segue um clone com a sequência correcta. Ura clone com a sequência correcta entre os sitios Kpnl e BamHI foi clivado com Kpnl e cora Sall, a qual cliva no vector pBR322. A banda de 400 pb foi purificada em gel e ligada a banda Kpnl-Sall de kb de ua segundo clone contendo a sequência correcta desde o sitio EcoRl até ao sitio Kpnl da inserção do gene para aFGF. Após transformaçao, sequênciou-se um clone resultante para assegurar que se tinha obtido a sequência pretendida.

Uma vez obtido um clone contendo a sequência de 209 pb correcta nao foi necessária posterior manipulação destes clones. 0 gene sintético final de tamanho completo para aFGF foi clonado por clivagem da metade N-terminal com BamHI e Sall, tratamento com fosfatase alcalina e ligaçao deste à inserção Bamlll-Sall de 209 pb purificada em gel do clone da metade C-terminal. Este material ligado foi usado para transformar células competentes RRI como atrás.

EXEMPLO 3

Expressão do gene sintético para aFGF bovino gene aFGF intacto do Exemplo 2 foi incorporado num plasmideo pEK223-3 modificado. 0 plasraideo pKIC223-3 (Pharmacia) contem o promotor tac que é um híbrido entre regiões do promotor trp e do promotor lac, de Boer et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80; 21-25 (1983). Este

plasmideo também contem o terminador da transcrição de rrnB rRNA, uma sequência de um terminador forte que se verificou permitir a expressão a partir de promotores fortes, Gentz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 4936-4940 (1981); Brosius, Gene 27: 161-172 (1984). 0 plasmideo pKK223-3 foi modificado para remover ,o sitio de restrição da enzima Sall derivado do pBR322. Isto foi conseguido por clivagem do DNA do plasmideo pKK223-3 com Ndel e NarI e recircularizaçao do fragmento de DNA de 2,7 kb para dar o clone pKK2.7. 0 gene aFGF sintético foi então clivado do seu vector pBR322 e transferido para pKK2.7 após cortes deste vector de expressão com as enzimas de restrição EcoRI e Sall. Esta construção coloca a metionina do início do gene sintético, 11 bases a jusante do sitio de ligaçao ao ribossona de Shine-Dalgarno. 0 recombinante resultante, apresentado na Figura 1, foi usado para transformar células Ξ. coli J11105 e também células de E. coli DHS.

Os clones de expressão cresceram a 37°C em caldo LB(1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl) contendo 0,4% de glucose e 50 ug/ml de ampicilina. Quan do a densidade óptica a 550 nm atingir 0,5, adicionou-se IPTG para dar 1 mM e o crescimento continuou a 37°C durante 3 horas. As células foram colhidas por centrifugação a 10 OOOxg durante 20 minutos e ressuspenderan-se as células de 1 litro de cultura em 20 ml de fosfato de sódio 10 mM pH 7,2, (tampao para heparina-Sepharose) 5 mií EDTA, 10N6 ug/ml de leupeptina. As células ressuspensas foram rápidamente congeladas num banho de neve carbónica etanol e guadadas durante a noite a -70°C.

ι

EXEMPLO 4

Extraçao e purificação de aFGF recombinante

As células congeladas do Exemplo 3 foram descongeladas, adicionou-se mais 87 ^ig/ml de PiiSF e a preparaçao foi passada através de uma prensa Francesa a 12000 psi três vezes a 4^o. 0 lisado resultante foi centrifugado a 93 OOOxg durante 30 minutos para remover os detritos celulares. Removeu-se o sobrenadante, ajustou-se o pH a 7,2 com 1 M NaOII e aplicou-se numa coluna de 1,6 x lOcm contendo heparina-Sepharose (Pharmacia) eluiu-se a 4°C com um fluxo de 20 ml por hora colhendo fracções de 2 ml. 0 sedimento foi ressuspenso em 5 ml de 10 mM fosfato de sodio, 2 M liaCl, pE 7,2, recentrifugado a 93 OOOxg durante 30 minutos e o sobrenadante diluido com três volumes de 10 mM fosfato de sódio, ph 7,2, reajustado a pH 7,2 com 1 M HaOH, se necessário, e aplicado na mesma coluna de heparina-Sepharose. Após aplicaçao lavou-se a coluna com 10 mM fosfato de sodio, 0,81-1 NaCl, pH 7,2 até a absorvância a 280 nm cair ate ao valor do fundo. 0 r-aFGF ligado foi eluido como um pico isolado com 10 ml-í fosfato de sódio, 1,5Γ·ί NaCl, pli 7,2. As fracções reunidas da coluna de heparina-Sepharose foram purificadas por IIPLC de fase reversa usando uma coluna de 4,6 mm x x 25 cm (Separations Group) conforme descrito por Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 357-361 (1984). 0 r-aFGF eluido como um pico principal isolado que foi resolvido de múltiplos pequenos picos contaminantes sugerindo que a proteína estaria horaogéneamente pura. Usou-se electroforese em gel de poliacrilamida para confirmar a pureza. 0 r-aFGF purificado foi submetido a electroforese seguindo a técnica de 0'Fannell, J. 3iol. Chem. 250: 4007-4021 (1975). A coloração com prata revelou uma unica banda com um peso molecu-

O c; □ -/ lar de 16000 daltons. A identidade da proteina corno aFGF foi confirmada por análise de aminoácidos e por determinação da sequência terminal amino.

EXEMPLO 5

Actividade biológica do aFGF bovino recombinante

Avaliou-se a actividade biológica do r-aFGF purificado do Exemplo 4 usando um ensaio mitogénico ea fibroblastos conforme descrito por Thomas et al., J. Biol. Chem. 225: 5517-5520 (1980). Semearam-se fibroblastos BALB/C 3T3 A31 (American Type Culture Collection) a 2 x 10^ células por poço de 35 rara de diâmetro em meio de cultura cori tendo 10% de soro de vitela inactivado pelo calor e incubado em 7% de C0_n (plí 7,35+0,05). As células pararam totalmente a sua multiplicação através da substituição do meio por meio cora 0,5% de soro de vitela inactivado pelo calor ao fim de 6 horas e de novo 24 horas mais tarde. Ãs 55 horas após a sementeira adicionou-se 50 pg de heparina, amostras a testar e 1,1 pg tado com de dexametasona, às 70 horas cada poço foi pCi de / metil- H7-timidina(2O Ci/mraole, suplemeri New Enge às land nuclear) e 3 ug de timidina nao marcada (Sigma)

9a horas as células foram processadas para determinação da radioactividade incorporada no DNA. Cada ponto de dose resposta foi a media de determinações era triplicado. Os resultados estão apresentados na tabela que se segue:

TABELA VIII

Respostas mitogénicas de fibroblastos

BALE/C 3T3 a r-aFGF bovino

Concentração de CPM r-aFGF (ng/ml) ____________r-aFGF_______ aFGF de cérebro

0,003	z n ZUO	231
0,010	498	329
0,031	1550	1017
0,100	7031	3684
0,316	9319	11353
1,000	4718	9050

Λ actividade do aFGF recombinante era igual ou ligeiramente superior à do aFGF derivado do cérebro. 0 r-aFGF purificado tinha uma estimulação de metade do máximo da sintese de DNA a cerca de 71 pg/ml enquanto que o aFGF derivado do cérebro e purificado tinha um valor de 126 pg/ral para metade do máximo de estimulação.

EXEMPLO 6

Mutagenese do gene de aFGF bovino para dar o gene do aFGF humano .Para facilitar a mutagenese do ge37

ne de aFGF bovino, transferiu-se o gene sintético do Exemplo 2 para 1113 mpl9, um vector fágico de DNA de cadeia simples. Usaram-se processos de mutagénese convencional conforme descritos por Zoller e Smith, Ilethods in Enzymology, 100: 468-500 (1983); Norris etal. , Nucleic Acids Research, 11: 5103-5112; e Zoller e Smith, DNA, 3q 479-488. 0 plasmideo pKK-aFGF bovino foi clivado com EcoRI e Sall, ver Tabela III e o fragmento resultante de 440 pb foi purificado em gel de agarose como no Exemplo 2. 0 DNA RF do vector M13mpl9 (BRL) foi clivado com as mesmas duas endonucleases e os extremos foram subsequentemente desfosforilados em 100 pl de tampao 10 mM Tris pH 8,0 com 100 unidades de fosfatase alcalina baç_ teriana. Fez-se uma ligaçao usando 50 ng do DNA vector tratado e 12 ng do fragmento de DNA contendo o gene aFGF em 10 pl de 25 núí Tris pli 7,8, 10 mil MgC^, 1 mH DTT, 0,4 mi-í ATP coei 2 unidades de DNA ligase de T4 durante 16 horas a 4°C. A mistura de reacçao foi diluida a 1:5 em E^O e usou-se 1 pl de diluição para transformar 20 fil de células competentes E.coli DH5 (BRL; conforme descrito pelo fornecedor. As células foram semeadas com células hospedeiras E.coli JI-I 105 (Pharmacia) em 0,03λ de X-gal e 0,3 mlí IPTG; após incubaçao a 37°C isolaram-se placas incolores. Seleccionou-se um clone fágico contendo gene para aFGF bovino, M13mpl9-aFGF.

Projectaram-se e sintetizaram-se oito oligonucleotideos para especificar a sequência humana, ver Tabela VI.

oligomero 8 contem uma mutaçao adicional em que timina no sitio 386 no gene bovino foi subs tituida por citoxina no gene humano. Esta mutaçao permite a incorporação de um sitio de restrição sem alteraçao da sequên. cia de aminoácidos do aFGF humano.

i

η Ο oo

Os oligomeros humanos 1,2,3,4,6, e foram fosforilados e 15 pmoles de cada um foram emparelhados individualmente com 0,5 pmoles de DNA fágico de cadeia simples de M13mpl9-aFGF em 10 jil de 20 ml-í Tris pK 7,5, 10 mM

do de 10 minutos a 23°C As moléculas de cadeia dupla circu-

DNA polimerase I, fragmento Klenow, por incubaçao a 15°C durante 17 horas. As preparações foram usadas individualmente para transformar células competentes JIÍ105 e as placas transformantes resultantes foram seleccionadas por hibridaçao com o oligomero adequado que foi marcado radioactivamen32 te usando P-ATP e polinucleotideo cinase. As condiçoes ue hibridaçao foram optimizadas para cada sonda para evitar a formaçao de híbridos contendo alterações isoladas de bases. Isolou-se DNA de cadeia simples a partir do clone fágico con tendo as mutações do oligomero 4 humano e repetiu-se o processo acima usando o oligomero 5 humano para gerar um clone contendo as mutações do oligomero 4 e do 5.

Nos processos que se seguem as mu tações da sequência bovina para humana nestes clones baseados em M13 foram combinadas cuni clone baseado em pBR322. DNAs RF foram preparados a partir de clones contendo as alterações de bases especificadas pelos oligomeros humanos 1, 2,6 e 8. 0 DNA do clone mutante 1 humano foi clivado con EcoRI, os extremos foram desfosforilados com fosfatase alcalina bacteriana e o DNA foi clivado com HindIII. 0 DNA mutan. te 2 humano foi clivado cora HindIII, tratado com fosfatase e depois clivado com BamHi. 0 DNA mutante 6 humano foi clivado com BamHi, tratado com fosfatase e subsequentemente cli vado com Apal. De modo semelhante, o DNA mutante 8 humano foi clivado com Apal os extremos foram desfosforilados e o DMA foi clivado com Sall. Estas quatro preparações de DNA foram submetidas a electroforese num gel de 2% de agarose e os fragmentos de 45 pb, 190 pb, 135 pb e 70 pb dos DNAs mutantes contendo as mutações 1,2,5 e 8 humanas, respectivameri te, foram eluidos do gel. Aproximadamente 60 fmoles de cada fragmento foram colectivamente ligados a cerca de 60 fmoles de um fragmento EcoRI-SalI de 3,7 kb purificado em gel de pBR322 em 5 |il de 25 mM Tris pE 7,8, 10 mM MgCl^, 1 mi-í DTT, 0,4 mM ATP, com 1,5 unidades de DNA ligase de T4 durante 15 horas a 12°C. A mistura de reacçao foi diluida a 1:5 era H_n0 í.

e usou-se 1 pl de diluição para transformar 20 pl de células competentes E.coli DE5 (BRL) conforme descrito pelo fornecedor. Um clone contendo as mutações especificadas pelos quatro oligómeros mutantes foi seleccionado por hibridação con sondas marcadas radioactivamente preparadas a partir de cada um dos oligómeros. 0 fragmento de DNA kpml-BamHI de 140 pb isolado a partir do DNA RF clivado do clone em M13 do mutante 3 humano foi ligado aos produtos clivados cora endonuclease deste DIIA mutante 1-2-6-0 humano e usado para transformar células competentes DH5 para gerar um clone humano cora mutações 1-2-3-6-8. Os fragmentos EamIII-PstI deste último clone foram ligados aos fragmentos de digestão BamlII-Pstl do DNA RF do clone 4-5 humano baseado em M13 e usou-se a mis. tura de ligaçao para transformar células competentes DK5. S_e leccionou-se um clone humano contendo as mutações 1-2-3-4-5-6-8 por hibridação de oligómeros e o fragmento de DNA EcoRI-Sall do gene aFGF deste plasmideo recombinante foi ligado a DNA RF clivado com EcoRI-SalI e tratado com fosfatase do KI3mpl£ (BRL). Transformaram-se células competentes DE5 com este DNA ligado e as células transformadas foram semeadas em células hospedeiras JM105 para gerar um clone i-113. 0 DIIA fágico de cadeia simples deste clone foi emparelhado com o oli.

gómero 7 humano e ura clone 1Í13 contendo todas as mutações pretendidas foi obtido seguindo o processo descrito atrás. Preparou-se DNA RF a partir deste clone e clivou-se com EcoRI e Sall. A banda de 440 pb resultante foi purificada vector de expressão contendo o promotor tac de pKK2.7. Este DNA foi usado para transformar células competentes DII5 dando assim origem ao clone de expressão pKK-aFGF humano usado para a produção da forma humana do aFGF.

r-aFGF humano foi purificado pelo mesmo processo usado para o r-aFGF bovino, ver Exemplo 4. 0 r-aFGF humano considerou-se estar pelo menos 99,75% puro com base na presença de uma única banda intensa num gel de electroforese com SDS corado com prata a que se aplicou 400 ng de r-aFGF humano purificado e tendo uma sensibilidade de cerca de 1 ng/banda. 0 protocolo está descrito no Exemplo 4.

aFGF humano recombinante puro foi testado quanto à actividade mitogénica usando a incorporação de ^Jíi-timidina em células subconfluentes BAL3/C 3T3 conforme descrito para a proteina bovina recombinante no Exem pio 5. Tal como se observou com o aFGF humano derivado de c£ rebro testado em células endoteliais vasculares, a proteina humana recombinante apresenta uma diferença maior na activaçao com heparina '50 pg/ml) do que o aFGF bovino derivado de cérebro ou recombinante, Gimenez-Gallego et al Brochem. Biophys. Res. Comm. 135;541-548 (1936); os resultados do aFGF humano recombinante em células Balb/c 3T3 estão apresentados na Tabela que se segue:

TABELA IX

Respostas mitogenicas de fibroblastos

BALB/c 3T3 a r-aFGF humano

Concentração de r-aFGF	CPM	+ heparina
(picogramas/ml)*	- heparina
0	3574		991
1	4156		1336
3,16	4216		1802
10,0	4092		2617
31,6	4155		4824
100	4274		10489
316	6060		14584
1000 (1 ng)	6811		10547
3160	7910		12357
10000	G597		9143
31600	9700		9057
100000	11166		9277
1000000 (1 fig)	15G64		12425

-1 2 * pico grama = 10 graraas

Na presença de heparina, a estimulação com um valor de metade do máximo ocorre a cerca de 42 pg/ml. Na ausência de heparina o pico nao foi atingido claramente na concentração mais alta mas deve ser superior a cerca de 30 ng/ml.

Claims

1-, - Processo para a produção do factor de crescimento para fibroblastos acidico bovino, caracterizado por compreender os passos que se seguem:

a. obtenção de um plasmideo compreendendo uma sequência de nucleotideos codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acidico bovino, em que a sequência de nucleotideos é capaz de ser expressa por um hospedeiro contendo o plasmideo; seguido de

b. incorporação do plasmideo no hospedeiro;e

c. manutenção do hospedeiro contendo o plasmideo em condiçoes adequadas à expressão da sequência de nucleotideos produtora do factor de crescimento para fibroblas_ tos acidico bovino.

2^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, Passo a, caracterizado por a sequência de nucleotideos ter a seguinte sequência de bases:

43.

1 20 40 60 80

AATTCATGTTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACGGTGGTTACTTTCTCCGC

GTACAAGTTAGACGGTGACCCATTAATGTTTTTCGGTTTCGAAGAAATGACGAGATTGCCACCAATGAAAGAGGCG

100 120 140160

ATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTAT

TAGGACGGTCTACCATGGCACCTGCCGTGGTTTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACACGCGGCTTAGATA

180 200 220240

CGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA

GCCACTTCAAATGTAGTTTAGATGGCTTTGACCAGTTAAGGAACGGTACCTGTGACTACCGGACGACATGCCTAGGGTCT

260 280 300320

CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAAAAGCATGCTGAG

GGGGTTTGCTCCTCACGGAAAAGGACCTCGCGGACCTCCTTTTGGTAATGTTGTGGATGTAGAGATTTTTCGTACGACTC

340 360 380400

AAACATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGCCCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCT TTTGTAACCAAGCATCCGGAATTCTTTTTACCGGCGAGATTTGACCCGGGAGCATGAGTGAAACCAGTTTTTCGATAGGA

420440

GTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGACTAATAGATATCG

CAAGGACGGTGACGGTCACTCGAGACTGATTATCTATAGCAGCT.

3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, Passo b. caracterizado por o hospedeiro ser E. coli.

4^a

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir o factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante tendo uma sequência de aminoácidos de:

1 10 20

PheAsnLeuProProGlyAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyHi sPheLeuArglleLeu

30 4050

ProAspGlyThrVal AspGlyThrArgAspArgSerAspGl nHi s II eGl nLeuGl nLeuSerAl aGl uSerValGl yGl u

60 7080

Vai TyrlleLysSerThrGluThrGlyGlnTyrLeuAl aMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsn

90100

G1 uGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGl uGluAsnHi sTyrAsnThrTyrlleSerLysLysHi sAlaGluLysAsnT rp

110 120130

PheVal GlyLeuLysLysAsnGlySerCysLysArgGlyProArgThrHi sTyrGlyGl nLysAl all eLeuPheLeuPro

140

LeuProValSerSerAsp .

.

5^S. - Processo para a produção do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma metionina se encontrar ligada à fenilalanina na primeira posição.

6- . - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir formas micro-heterogénias do factor de crescimento para fibroblastos aci^ dico bovino recombinante.

7- . - Processo para a construção de uma sequência de nucleotídeos codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino, caracterizado por compreender a determinação da sequência de aminoácidos seguida do arranjo dos nucleotídeos de tal maneira que a expressão do referido arranjo possa resultar na produção do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino bioljá gicamente activo.

8^â. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se construir uma sequência de nucleotídeos codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante da reivindicação 4.

9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se construir uma sequência de nucleotídeos codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acidico bovino recombinante da reivindicação 5.

10^a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência de nucleotídeos ter uma sequência de bases que é qualquer uma das que se seguem:

TTQ AAQ CTN CCN CTN GGN AAQ TAQ AAP AAP CCN AAP CTN CTN TAQ TGQ TCN AAQ GGN GGN 60 TTP TTP TTP TTP AGQ TAQ TTQ CTN CGN ATQ CTN CCN GAQ GGN ACN GTN GAQ GGN ACN AAP GAQ CGN TCN GAQ CAP 120 TTP AGP ATA TTP AGP AGQ CAQ ATQ CAP CTN CAP CTN TGQ GCN GAP TCN ATQ GGN GAP GTN TAQ ATQ AAP TCN ACN GAP 180 ATA TTP TTP AGQ ATA ATA AGQ ACN GGN CAP TTQ CTN GCN ATG GAQ ACN GAQ GGN CTN CTN TAQ GGN TCN CAP ACN CCN AAQ 240 TTP TTP TTP AGQ GAP GAP TGQ CTN TTQ CTN GAP CGN CTN GAP GAP AAQ CAQ TAQ AAQ ACN TAQ ATQ TCN AAP 300 TTP TTP AGP TTP ATA AGQ AAP CAQ GCN GAP AAP CAQ TGG TTQ GTN GGN CTN AAP AAP AAQ GGN CGN TCN AAP CTN GGN 360 TTP AGP AGQ TTP CCN CGN ACN CAQ TTQ GGN CAP AAP GCN ATQ CTN TTQ CTN CCN CTN CCN GTN TCN TCN GAQ; 420 AGP ATA TTP TTP TTP AGQ AGQ

onde Q e C ou T, PeAouGeNé, A, T, CouG.

11^a. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sequencia de nucleotideos apresentar o codao da fenilalanina procedido por um codao para a metionina.

12-, - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a sequência de nucleoti deos ter a sequência de bases seguinte:

1 20 40 6080 aattcatgttcaatctgccactgggtaattacaaaaagccaaagcttctttactgctctaacggtggttactttctccgc gtacaagttagacggtgacccattaatgtttttcggtttcgaagaaatgacgagattgccaccaatgaaagaggcg

100 120 140160 atcctgccagatggtaccgtggacggcaccaaagatcgttctgatcaacatattcaactgcagctgtgcgccgaatctat taggacggtctaccatggcacctgccgtggtttctagcaagactagttgtataagttgacgtcgacacgcggcttagata

180 200 220240 cggtgaagtttacatcaaatctaccgaaactggtcaattccttgccatggacactgatggcctgctgtacggatcccaga gccacttcaaatgtagtttagatggctttgaccagttaaggaacggtacctgtgactaccggacgacatgcctagggtct

260 280 300320 ccccaaacgaggagtgccttttcctggagcgcctggaggaaaaccattacaacacctacatctctaaaaagcatgctgag ggggtttgctcctcacggaaaaggacctcgcggacctccttttggtaatgttgtggatgtagagatttttcgtacgactc

340 360 380400 aaacattggttcgtaggccttaagaaaaatggccgctctaaactgggccctcgtactcactttggtcaaaaagctatcct tttgtaaccaagcatccggaattctttttaccggcgagatttgacccgggagcatgagtgaaaccagtttttcgatagga

420440 gttcctgccactgccagtgagctctgactaatagatatcg caaggacggtgacggtcactcgagactgattatctatagcagct.

13³. - Plasmideo de expressão, caracterizado por compreender a sequência de nucleotideos da reivindicação 12, inserida nele.

14^a. - Plasmideo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a sua estrutura ser a que está apresentada na figura 1.

FIG-1

15³. - Plasmideo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser o plasmideo pBR322.

16³. - Hospedeiro caracterizado por ser compatível com o plasmideo da reivindicação 13 e o conter.

17^a. - Hospedeiro de acordo com a

reivindicação 16, caracterizado por ser Ξ. coli. 18^a. - • Hospedeiro de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por ser E.coli JH105 ou E.- coli. DH5. 19^a. - • Plasmideo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser capaz de expressar

a sequência de aminoácidos do factor de crescimento para fibroblastos acidico bovino.

20^a. - Processo para a produção de uma proteína, caracterizado por a referida proteína ser produzida pelo hospedeiro da reivindicação 16, sendo a refcs rida proteína capaz de estimular a síntese de DNA em células respondentes.

21^a. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para curar feridas, caracte- rizado por se incluir na referida composição uni veículo far-

maceutico e uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acidico bovino recombinante obtido de acordo com a reivindicação 1.

22-. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para curar feridas, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo farmacêutico e uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante obtido de acordo com a reivindicação 4.

23^a. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para curar feridas, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo farmacêutico e uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante obtido de acordo com a reivindicação 5.

24^a. - Método para curar feridas caracterizado por se administrar a um paciente, necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico bovino recombinante obtido de acordo com a reivindicação 4, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 0,1 a 100 pg/cm ,

25^a. - Método para curar feridas caracterizado por se administrar a um paciente, necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblasto acídico bovino recombinante obtido de acordo com a reivindicação 5, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 0,1 a 100 / 2 pg/cm .

26^a. - Processo para a produção de aFGF humano caracterizado por compreender os passos que se seguem:

a. obtenção de um plasmídeo compreendendo uma sequêii cia de nucleotídeos codificadora de aFGF humano, em que a sequência de nucleotídeos é capaz de ser expressa por um ho£ pedeiro contendo o plasmídeo; seguido de

b. incorporação do plasmídeo no hospedeiro; e

c. manutenção do hospedeiro contendo o plasmídeo em condiçoes adequadas ã expressão da sequência de nucleotídeos produtora de aFGF humano.

27^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 26, Passo a, caracterizado por a sequência de nucleotídeos ter a seguinte sequência de bases:

1 20 40 6080

AATTCATGTTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACGGTGGTTACTTTCTCCGC GTACAAGTTAGACGGTGACCCATTAATGTTTTTCGGTTTCGAAGAAATGACGAGATTGCCACCAATGAAAGAGGCG

100 120 140160

ATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAàTCTAT

180 ZOO 220240 cggtgaagtttacatcaaatctaccgaaactggtcaattccttgccatggacactgatggcctgctgtacggatcccaga

260 280 300320

CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGYAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAAAAGCATGCTGAG

340 360 380400

AAACATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGCCCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCT tttgtaaccaagcatccggaattctttttaccggcgagatttgacccgggagcatgagtgaaaccagtttitcgatagga

28^a. - Processo de acordo com a reivindicação 26, Passo b, caracterizado por o hospedeiro ser E.coli.

29^a

Processo de acordo com a

-5.4.

reivindicação 26, caracterizado por se produzir o factor de crescimento para fibroblastos acidico humano recombinante tendo uma sequência de aminoácidos de:

PheAsnLeuProLeuGlyAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyTyrPheLeuArglleLeu

ProAspGl yThrVal AspGl yThrLysAspArgSerAspGl nHi sll eGl nLeuGI nLeuCysAl aGl uSerll eGl yGl u

ValTyrlleLysSerThrGluThrGlyGlnPheLeuAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsn

100

G1uGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHi sTy rAsnThrTyrlleSerLysLysHi sAlaGluLysHi sTrp

110

120

130

PheValG1yLeuLysLysAsnGIyArgSerLysLeuGlyProArgThrHi sPheGlyGlnLysAlalleLeuPheLeuPro

140

LeuProValSerSerAsp .

•

30^a. - Processo para a produção do factor de crescimento para fibroblastos acidico humano recombinante de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por uma metionina se encontrar ligada ã fenilalanina na primeira posição.

31^a. - Processo para a produção do factor de crescimento para fibroblastos acidico humano recombinante da reivindicação 29, caracterizado por a fenilalanina na primeira posição ter sido removida e por o aminoácido na segunda posição ser asparagina ou ácido aspartico.

32^a. - Processo de acordo cora a reivindicação 26, caracterizado por se produzir formas micr -heterogéneas do factor de crescimento para fibroblastos ac dico humano recombinante.

o| v_H|

33^a. - Processo para a construção de uma sequência de nucleotideos codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acidico humano recombinante, caracterizado por compreender a determinação da sequência de aminoácidos, seguida do arranjo dos nucleotideos de tal maneira que a expressão do referido arranjo possa resultar na produção do factor de crescimento para fibroblastos acidico humano biologicamente activo.

34^a. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por se construir uma sequência codificadora do factor de crescimento para fibroblastos acidico humano recombinante da reivindicação 30.

35^a. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a sequência de nucleotídeos ter uma sequência de bases que é:

1 20 40 6080

100 120 140160

ATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTAT TAGGACGGTCTACCATGGCACCTGCCGTGGTTTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACACGCGGCTTAGATA

180 200 220240

CGGTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA GCCACTTCAAATGTAGTTTAGATGGCTTTGACCAGTTAAGGAACGGTACCTGTGACTACCGGACGACATGCCTAGGGTCT

260 280 300320

CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAAAAGCATGCTGAG GGGGTTTGCTCCTCACGGAAAAGGACCTCGCGGACCTCCTTTTGGTAATGTTGTGGATGTÁGAGATTTTTCGTACGACTC

340 360 380400

420440

GTTCCTGCCACTGCCAGTGAGCTCTGACTAATAGATATCG CAAGGACGGTGACGGTCACTCGAGACTGATTATCTATAGCAGCT.

36^a. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por se construir a sequência de nucleotídeos da reivindicação 12 em que a sequência de bases está substituída por mutações pontuais para dar a sequência de bases da reivindicação 35.

31-. - Plasmídeo de expressão caracterizado por compreender a sequência de nucleotídeos da reivindicação 35, inserido nele.

38^a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a sua estrutura ser a que está apresentada na figura 1.

FIG-Í rrnB

Posição'

6840

BamHI (Narl/Ndel)

Fusão de pBR322 '

Posição

413 a 2298

39^a. - Plasmideo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por ser o plasmideo pBR322.

40^a. - Hospedeiro caracterizado por ser compatível com o plasmideo da reivindicação 37 e o conter.

41^a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser E.coli • 42^a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por ser E.coli JM105 ou E. coli DH5. 43^a. · - Plasmideo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser capaz de expressar

o gene do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano.

44^a. - Plasmideo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser capaz de expressar a sequência de nucleotideos sintética para o factor de cres cimento para fibroblastos acídico humano.

45^a. - Processo para a produção de uma proteína, caracterizado por a referida proteina ser produzida pelo hospedeiro da reivindicação 40, sendo a referida proteina capaz de estimular a sintese de DNA em células respondentes

46^â. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para curar feridas, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo farmacêutico e uma quantidade eficaz para a cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recom binante obtido de acordo com a reivindicação 26.

47^a. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para feridas, caracterizado por se incluir na referida composição um veículo farmacêutico e uma quantidade eficaz para a cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante obtido de acordo com a reivindicação 29.

48^a. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para a cura de feridas, carac terizado por se incluir na referida composição um veículo farmacêutico e uma quantidade eficaz na cura de feridas de factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recom binante obtido de acordo com a reivindicação 30.

49^ã. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica para a cura de feridas, carac terizado por se incluir na referida composição um veiculo farmacêutico e uma quantidade eficaz para curar feridas das formas micro-heterogéneas do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante, obtidas de acordo com a reivindicação 32.

50^a. - Método para promover a cura de feridas caracterizado por se administrar a um paciente necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante, obtido de acordo com a reivindicação 26, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 01 a 100 pg/cm^.

51^a. - Método para promover a cura de feridas caracterizado por se administrar a um paciente, necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor de crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante obtido de acordo com a reivindicação 29, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 0,1 a 100 pg/crn^.

52^a. - Método para promover a cura de feridas, caracterizado por se administrar a um paciente necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na cura de feridas do factor do crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante obtido de acordo com a reivindicação 30.

53^a. - Método para promover a cura de feridas, caracterizado por se administrar a um paciente, necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz na promoção do crescimento das formas micro-heterogéneas do fa£ tor de crescimento para fibroblastos acídico humano recombinante obtidos de acordo com a reivindicação 32 sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 0,1 a 100 pg/cm^_f

54^a. - Método para a purificação de factor de crescimento para fibroblastos acídico (aFGF) recombinante na forma pura, caracterizado por compreender os passos que se seguem:

a. Purificação parcial de aFGF recombinante por uma matriz de cromatografia de afinidade e um eluente aceitável; seguido de

b. Purificação de aFGF recombinante parcialmente purificado por cromatografia liquida de alta resolução em fase reversa usando um alquilsilano como substracto e um eluente aceitável.

55^a. - Método de acordo com a reivindicação 54, Passo a, caracterizado por a matriz de afinidade ser heporina-Sepharose.

56^a. - Método de acordo com a reivindicação 54, Passo b, caracterizado por o substracto alquíL silano conter entre 3 e 18 átomos de carbono.

57^a. - Método de acordo com a reivindicação 54, Passo b, caracterizado por o substracto alquil silano conter 4 átomos de carbono.

58^a. - Método de acordo com a reivindicação 54, Passo a, caracterizado por o aFGF ser eluido com cloreto de sódio.

59-. - Método de acordo com a reivindicação 54, Passo b, caracterizado por aFGF ser purificado por um gradiente de eluição consistindo num ácido e num solvente orgânico.

60^a. - Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por o ácido ser ácido trifluoroacético, ácido fosfórico ou ácido acético.

61^a. - Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por o solvente orgânico ser acc tonitrilo ou etanol.