PT85725B - Processo para a preparacao de transformantes de penicillium e de produtos obtidos por expressao de genes integrados nestes transformantes - Google Patents
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Description
Memória descritiva referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em 1, Wateringeseweg, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Holanda, (in ventoresj Joan Francisco Martin, Emílio Alvarez, Jose Luis Barredo, Jesus Manuel Cantoral e Bruno Diez Garcia, residentes em Espanha), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO BE TRANSFORMANTES DE PENICILLIUM E__DE
PRODUTOS OBTIDOS POR EXPRESSÃO DE GENES INTEGRADOS NESTES TRANSFORMANTES» .
MEMÓRIA DESCRITIVA
DOMÍNIO DA INVENÇÃO
Descreve-se a obtenção de estirpes transforma das de Penicillium e processos para a preparação de produtos novos obtidos por expressão de genes integrados nestes transformantes. Os genes estruturais são introduzidos em Penicillium sob condições tais que o gene resulte de preferência integrado de forma estável no genoma do hospedeiro. Os genes es truturais são expressos dando origem a estirpes com proprieda des fenotípicas de interesse.
ESTADO DA TÉCNICA
N
A utilização de fungos para a preparação de compostos orgânicos com um alto grau de funcionalização tem sido muito corrente. Apresentam interesse especial um largo conjunto de compostos que podem ser utilizados como antibióti cos, Foram desenvolvidos processos para melhorar as estirpes dos fungos produtores e para obter por meio de fermentações rendimentos mais elevados dos produtos pretendidos. Sabe-se pouco acerca des mecanismos de regulação que influem na expres são dos genes durante a biossíntese dos antibióticos, como por exemplo na produção de Penicilina por meio de Penicillium chrysgenum (Demain, Antibiotics Containing the beta-lactam structure I (Demain and Solimons, eds.) pp. 189-228, Springer -Verlag, 1983? Martin and Liras, Biossyntesis of beta lactam antibiotics: design and construction of Over-producing strains (Trends in bioteohnology 3 (1985) 39-44) . A fim de investigar os mecanismos metabólicos, é necessário em muitos casos desen volver sistemas nos quais as vias metabólicas podem ser identificadas e manipuladas. Deste modo torna-se possível modificar os fungos filamentosos a fim de conseguir uma produção mais eficiente dos produtos naturais ou de produtos novos,
BREVE DESCRIÇÃO DA LITERATURA RELEVANTE
A transformação de Aspergillus nidulans já se encontra descrita por meio da utilização de plasmídeos conten do um fragmento de N. crassa com o gene Pyr4 (Buxton and Redford, Mol. Gen. Genet. 190 (1983) 403-405? Ballance and Turner, Gene 36 (1985) 321-331) e o gene homólogo trpC (Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1974) 1470-1474). Um mutante de A. niger foi transformado para prototrofia com o gene argB de A. nidulans (Burton et al., Gene 37 (1985) 207-214. A, nidulanss foi transformado mediante a utilização dum gene de acetamidase clonado (Tilburn et al., Gene 26 (1983) 205-221) ou do gene acuD (Ballance and Turner, Mol. Gen. Genet. 202 (1986) 27I-275) em pBR322. Mutantes ura3 de leveduras podem ser detectadas por resistência ao ácido 5-Huoroorótico • (Bocke et al., Mol. Gen. Genet. 197 (1984) 345-346.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O objecto da presente invenção diz respeito a métodos eficientes de transformação de Penicillium e aos trans formantes daí resultantes. De preferência o ADN externo é integrado de forma estável no hospedeiro com expressão estável do gene estrutura (ou dos genes estruturais) que é introduzido. Para selecção utiliza-se em particular complementação de auxotrofia.
DESCRIÇÃO DOS MODOS DE CONCRETIZAÇÃO ESPECÍFICOS
É proporcionado um processo eficiente de trans formação de Penicillium para produzir transformantes contendo um ou vários genes estruturais dotados de capacidade de expressão, especialmente integrados no genoma do hospedeiro (in tegrantes). Preparam-se construções de ADN que possibilitam a selecção das células hospedeiras transformadas. Utilizam-se condições para a transformação que resultam numa alta frequên cia de transformação de modo a assegurar a selecção e o isola mento de hospedeiros transformados que expressem o gene estru tural (ou os genes estruturais) de interese. Os transformantes resultantes proporcionam a manutenção estável e a expressão do ADN integrado.
Para transformação de Penecillium utilizam-se construções que incluem pelo menos um marcador para a selecção das células transformadas e, de preferência, para aumento da estabilidade do ADN integrado, uma sequência de aumento susceptível de transformação proveniente dum fungo filamentoso (Ballance e Turner, 1985)· É desejável que o marcador permita uma selecção eficiente do hospedeiro transformado, selec ção esta que pode ser o resultado de complementação dum hospe deiro auxotrofico, resistência a um biocida, p. ex. um antibiótico, ou semelhante. 0 gene estrutural que proporciona o marcador de selecção pode ser nativo do hospedeiro Penicillium • tipo selvagem ou um gene estrutural heterólogo que seja fun- 3 -
cional no hospedeiro. Por exemplo, genes estruturais que codi ficam para uma enzima numa via metabólica podem ser provenien tes de Penicillium ou de outro fungo filamentoso, como, por exemplo, de Aspergillus, Neurospora ou Podospora, ou de leveduras, desde que o gene estrutural seja funcional no Penicillium e complemente a auxotrofia para dar lugar a prototrofia para a aptidão genética.
gene estrutural de complementação pode ser derivado duma via metabólica, como seja da síntese de purinas ou de pirimidinas (nucleósidos) ou de ácidos aminados. São de particular interesse os genes estruturais que codificam para enzimas na via das pirimidinas, por exemplo, o gene que codifica para a enzima orotidina-5’-fosfato-decarboxilase (pyrGou pyr4). Outros genes de interesse são genes da biossíntese de ácidos aminados, por exemplo, ornitina-carbamoil-transfera se (argB) e arginino-succinato-liase (aR14).
Em vez de genes de complementação, podem utilizar-se genes de resistência a biocidas. Estes incluem genes que proporcionam resistência a antibióticos, tais como higromicina, canamicina, oligomicina e semelhantes.
Para aumentos de estabilidade, a construção pode também incluir sequências do tipo ans (que podem ser iden tificadas em fungos em virtude da respectiva capacidade de au mentar substancialmente a eficiência da transformação e que em certas condições se replicam autonomamente, como, por exem pio, ars em Sac charo my c e s; Stinchcomb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (198o) 4559-^563).
Além do marcador e da sequência ans opcional, a construção pode incluir um ou vários genes estruturais de interesse. Estes genes podem ser endógenos (homólogos) ou exó genos (heterólogos), especialmente genes que codificam para uma enzima relacionada com um metabolito de interesse, por • exemplo, penicilina ou cefalosporina, mais particularmente um
V
gene estrutural que codifica para uma enzima relacionada com uma fase limitante da velocidade da via biossintética, por exemplo, tripeptídeo-sintetase, isopenicilina-N-sintetase (ci clase), transacilase, epimerase, expandase e hidroxilase. Estes genes são usualmente gerados por microorganismos produtores de beta-lactanas, como Penicillium, Cephalosporium, Streptomices e semelhantes. Também podem ser de interesse genes que codificam para enzimas, proteínas estruturais, receptores e outros produtos. Em vez de genes endógenos também podem ser utilizados genes exógenos, particularmente provenientes de ou tros fungos filamentosos, os quais codificam para enzimas que possuem a mesma função ou uma função diferente duma enzima en dógena. Estes genes incluem os genes da glucoamilase, alfa-amilase, celulase, protease, lipase, linhinase e renina, etc..
Podem ser introduzidos genes exógenos ou hete rólogos a fim de proporcionar novas funções ao Penicillium hospedeiro. Estas funções podem envolver a transformação de um metabolito endógeno, a produção de um novo produto não pro teico ou a produção de um novo produto proteico. 0 Penicilliuw pode ser fermentado de modo eficiente de modo a produzir uma larga gama de produtos de interesse.
As proteínas de interesse incluem proteínas de mamíferos, por exemplo quimosina» e proteínas humanas,tais como linfoquinas, factores sanguíneos, como por exemplo factores de coagulação, interferões, factores de crescimento,hor monas, etc.. Sendo um eucarionte, o Penicillium oferece uma oportunidade de preparação de produtos proteicos que são processados de modo análogo ao processamento dos vertebrados.
Os genes estruturais estarão sob regulação de transcrição e de tradução das regiões de início e de terminação que são funcionais em Penicillium, regiões estas que podem ser endógenas ou exógenas, em especial de regiões de fungos filamentosos. 0 início da transcrição pode ser constituti vo ou regulado, sendo em geral uma região de início forte.
Quando o gene estrutural possui uma região de regulação de ocorrência natural que é funcional em Penicillium e tem a ordem de actividade apropriada, 4 possível empragar esta região com o gene estrutural. Em alternativa é possível juntar ao ge ne estrutural uma região de regulação que não seja a região natural. As regiões de regulação com interesse incluem as regiões de início de py r4, pyrG, acuD, npe. trpC e ArgB ou promotores fortes derivados da via glicolítica (p. ex. PGK, GAPDH ou TPl), ou as regiões de regulação de enzimas com expressão elevada* como sejam a glucoamilase e a celulase ou as regiões de regulação envolvidas na via de biossíntese, por exemplo a isopenicilina N sintetase (iPNS). Estes genes foram isolados ou podem ser isolados facilmente e as respectivas regiões de regulação podem ser definidas e juntas na ordem apropriada ao gene estrutural.
gene pyr4 é expresso de forma elevada em P. chrysogenum como resultado do elevado número de cópias e/ou da alta frequência de transcrição. A inserção pyr4 na constru ção resultante proporciona a oportunidade para expressão eficiente sob a regulação da região de início de transcrição de pyr4. 0 gene que interressa pode ser inserido por manipulação adequada do gene pyr4, empregado sítios de restrição disponíveis ou introduzindo sítios de restrição por mutagénese, por novo corte ou por técnicas semelhantes, podendo o gene de interesse ser ligado à região de regulação 5’ não codificante do gene pyr4 ou inserido no gene pyr4 em fase de leitura de forma a proporcionar uma sequência fundida de ácidos aminados em resultado da presença de um ou de vários codões na extremi dade terminal 5' da sequência de codificação.
Como vectores podem usar-se os plasmídeos pDJBl e pDJB2 ou é possível utilizá-los como um gene pyrU e a sequência ans. Estes plasmídeos podem ser obtidos após amplificação de um dia para o outro em E. coli num meio contendo 300 ^il/ml de espectinomicina seguida de ultracentrifugação em cloreto de césio-brometo de etídio usando métodos normais (Ma
- 6 niatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, ΝΥ).
Na preparação da centrifugação podem ser clonados vários fragmentos em E. coli num vector de clonagem apropriado, por exemplo pBR322, pACYC184, pUC, etc.. Os fragmentos podem ser ligados e/ou modificados utilizando sítios de restrição convenientes, ligantes, adaptadores, reparação de iniciadores, mutagénese in vitro, resserção ou técnicas se melhantes. Os fragmentos podem ser ligados, clonados, analisa dos por enzimas de restrição ou sequências e em seguida usados para serem combinados com outros fragmentos, repetindo-se o processo até que a construção esteja completa. Uma vez que não se exige manutenção extracromossomal estável, é possível empregar o vector de clonagem como parte do ADN de transforma ção tanto sob forma linearizada como circular. Em alternativa é possível retirar a construção do vector para a transformação. Enquanto que o ADN contendo a construção pode ser construído por mais do que uma fracção, desde que os genes estruturais e as regiões de regulação se mantenham intactos, habitualmente a construção é constituída por uma única fracção de ADN.
Para conseguir a transformação duma forma efi ciente devem ser usadas condições seieccionadas. 0 Penicillium pode ser de estirpes de tipo selvagem ou de laboratório, prototróficas ou aoxotróficas em uma ou em várias vias metabólicas ou pode ser de estirpes mutantes bloqueadas na biossíntese de penicilina. 0 Penicillium pode ser utilizado sob a forma de protoplastos substancialmente isentos de micélio intacto. 0 micélio intacto pode ser removido após degradação da pa rede celular. As condições para remoção da parede celular e para remoção do micélio intacto são condições habituais. As células podem ser lisadas em 2 a 6 horas em condições ambientes empregando cerca de 3,1 a 1 mg/ml de enzima numa gama de pH de cerca de 5 a 6 num meio isotónico, por exemplo KC1 0,7M. A quantidade de micélio presente é de cerca de 25 a 150 mg de peso seco/ml. Os protoplastos podem ser obtidos sob a forma
centração de cerca de 25 a 100 mM.
*7 A transformação é realizada com cerca de 10' a 10^ protoplastos/ml usando polietileno glicol como fusogénio com cerca de 1 a 10 pg de ADN em tampão de tris-EDTA (TE) contendo uma pequena concentração de iões cálcio e a um pH de cerca de 5»5 a 7,5» em especial 5j8· Depois dum período curto a baixas temperaturas, por exemplo de 0 a 5°C durante 15 a 4-5 min., a solução é diluida cerca de 5 a 20 vezes com um meio tamponizado diferente que contém cerca de 20 a 60% de preferência 50% de polietilenoglicol, CaCl^ numa concentração de 25 a 75 mM, de preferência 50 mM e MOPo (ácido N-morfolinopro panossulfónico) de 5 a 25 mM e em seguida é incubada durante 10 a 30 min à temperatura ambiente, por exemplo 20 a 30°G. 0 polietilenoglicol pode ser PEG 1000 a 8000, de preferência 8000.
Após incubação o meio é diluido novamente e os protoplastos são cultivados em placas com meio de regeneração, por exemplo, meio mínimo de Czapek-sacarose (J.F. Peberdy, Fungai protoplasts: isolation, reversion and fusion, Ann. Rev. Micr. 21 (1979) 21-39).
A regeneração torna possível a selecção de transformantes. As colónias resultantes podem ser suspensas num meio nutriente apropriado, reclonadas e analisadas no que diz respeito à expressão do produto pretendido.
Os transformantes resultantes podem ter origem em integração homóloga ou aleatória e podem ter uma ou mais construções integradas no genoma. Quando se pretende uma recombinação homóloga é possível utilizar ADN nativo como par te da construção, podendo o ADN nativo ter como resultado uma recombinação cruzada simples ou dupla. 0 ADN nativo pode ser escolhido para ter como resultado a inactivação dum gene de tipo selvagem, para substituir o ADN nativo sem inactivação de genes ou para se integrar numa região inóqua.
Os transformantes podem ser de várias estirpes de Penicillium; sendo preferida a estirpe Penicillium chrysogenum.
As estirpes transformadas podem ser usadas em fermentadores em processos de fermentação para a produção de produtos que podem ficar retidos no citoplasma ou ser segrega dos no meio. A secreção depende do reconhecimento pelo hospedeiro duma sequência de sinal apropriada.
As condições para a fermentação de Penicillium são bem conhecidas. Ver, por exemplo, G.J.M. Hersbach, C.P.v.d. Beek e P.W.M. van Dijck, The Penicillins: Properties Biosynte sis and Fermentation in Biotechnology of Industrial Antibiotics, E. van Dammie (ed.), Mareei Dekker 1084.
Os exemplos que se seguem tem por objectivo ilustrar a presente invenção sem limitar de qualquer modo o respectivo âmbito.
Exemplo 1
Transformação dum Penicillium chrysogenum pyrG auxotrófico usando o gene pyr4 de Neurospora crassa
Usaram-se auxotrofos pyrG de P» chrysogenum
R
Wis 5^-1255 (pyrG, Aza ) e de mutantes derivados deste (pyrG, R
Aza , npe) bloqueados para a produção de penicilina como estirpes receptoras. Os auxotrofos pyrG foram facilmente isolados de entre os mutantes resistentes ao ácido 5-fluoro-orótico (Bocke et al., Mol. Gen. Genet. 197 (1984) 345-346). Inocularam-se conídios de diferentes estirpes em meio mínimo (100 ml) suplementado com 0,2% de extracto de levedura (Anne e Peberdy, Induced fusion of fungai protoplasts following treatment with polyethylene glycol., J. Gen. Microbiol, 92, (1976), 413-417). Incubaram-se os balões num agitador orbital (250 rpm) a 28°C durante 20 a 48 h (respectivamente para o tipo
selvagem e para os auxotrofos). Recolheu-se o micélio por fil tração através dum filtro de nylon (Nytal, poro de 30 pm), la vou-se com NaCl (9 g/1) e secou-se pressionando entre dois pa péis de filtro, A fim de obter protoplastos, o micélio foi no vamente suspenso (100 mg de peso seco /ml) em tampão lisogéni co (tampão de fosfato de 50 mM a pH 5*8 contendo KC1 0,7 M) . Adicionou-se um volume idêntico de Novozym 234 (Novo Industri Ltd, Copenhaga, Dinamarca)(1 mg/ml em tampão lisogénico).
Incubou-se a mistura a lisar com agitação sua ve durante 3 h a 25°C seguindo microscopicamente a libertação dos protoplastos. 0 micélio residual foi removido por filtração dos protoplastos através dum filtro de nylon estéril de 30 jim de poro. Os protoplastos foram lavados 3 vezes com KCl 0,7 M e separados por centrifugação (400 g, 3 min) e ressuspensos em 100 ml de solução KCM (KCl 0,7 M, CaClg 50 mM e MOPS 10 mM a pH 5,8).
Contaram-se os protoplastos ao microscópio com uma câmara de contagem e ajustou-se a concentração com so ~ lução KCM a uma concentração final de 10 protoplastos/ml. No procedimento normal de transformação, misturaram-se 50 yul da suspensão de protoplastos com 1 a 10 pg de ADN em tampão TE e com 12 pl de PCM (polietilenoglicol 8000 a 50%, CaClg 50 mM e MOPS 10 mM a pH 5,8). Cada reacção foi bem misturada e conser vada a 4°C durante 3θ min. Mais tarde adicionaram-se 500 pl de PCM e incubou-se a 25°C durante 20 min. Por fim, adicionou -se 1 ml da solução e, após diluições adicionais conforme necessário, cultivaram-se os protoplastos em placas com camadas sobrepostas de meio mínimo de sacarose de Czapek (KCl 0,7 M). Em algumas experiências usou-se uma técnica modificada na qual se utilizaram 250 (ou 500) p.1 da suspensão de protoplastos e as quantidades correspondentes dos outros componentes.
Levaram-se a cabo por técnicas normais as ope rações de transferência de ADN para nitrocelulose, translac. ção de encaixe, digestão por enzimas de restrição e ligação
(Maniatis et al., 1982).
A estirpe Penicillium chrysogenum Vis 54-1255 R (pyrG, Aza ) foi depositada em 16 de Setembro de 1986 ao Commoirwealth Mycologucal Institute de Kew, Reino Unido, tendo-lhe sido atribuído o número de depósito CMI 309 919·
Os resultados das diferentes experiências de transformação, nas quais se estudaram os efeitos de diversas variáveis, são apresentados nos Quadros 1 e 2.
Quadro 1
Efeito de DMSO, do número de protoplastos e da concentração de ADN na transformação da estirpe P» chrysogenum Vis 54-1255 (pyrG, Aza&)
| Ensaio | Proto- | DMSO | ADN do | Mistura | Diluição | Transfor- |
| d e t rans- | plastos | (^1) | plasmídeo | de PCM | do PCM | mant es/ |
| formação | (ps) | pDLB2 | (/*1) | (ml) | zug de ADN | |
| 1 | 500 | 5 | 8 | 50 | 2 | 1,2 x 103 |
| 2 | 500 | 0 | 8 | 50 | 2 | 1,3 x 103 |
| 3 | 500 | 5 | 12 | 50 | 2 | 2,8 x 103 |
| 4 | 500 | 5 | 20 | 50 | 2 | 2,2 x 103 |
| 5 | 250 | 2 | 28 | 25 | 1 | 3,0 x 103 |
| 6 | 250 | 2 | 14 | 25 | 1 | 3,0 x 103 |
| 7 testemu- | 500 | 5 | nenhum | 50 | 2 | 0 |
nho
Quadro 2
Efeito da concentração de polietilenoglicol e das concentrações crescentes de transformação da estirpe P. chrysogenum Vis 54-1255
R (pyrG, Aza )
| Ensaio de transformação | Proto- ADN do | Mistura de Diluição | Solu Transfor- | |||
| plastos (ug) | plasmíd eo (ug) | PCM (ul) | do PCM (ml) | Ção de KCM (ml) | mantes/ug de ADN | |
| 1 | 50 | 0,4 | 12(50% Peg) | 0,5(50%PEG) | 1 | 0,3 x 103 |
| 2 | 50 | 2,0 | 12 | 0,5 | 1 | 1,9 x 103 |
| 3 | 50 | 4,0 | 12 | 0,5 | 1 | 0,9 x 103 |
| 4 | 50 | 0,4 | 12(25%PEG) | 0,5(25%PEG) | 1 | 0,11 x 103 |
| 5 | 50 | 2,0 | 12 | 0,5 | 1 | 0,45 x 103 |
| 6 | 50 | 4,0 | 12 | 0,5 | 1 | 0,15 x 103 |
| 7 teste- | 50 nenhum | 12 | 0,5 '· | 1 | 0 | |
| munho |
A frequência de reversão dos diferentes auxotrofos de uracilo (pyrG) utilizados para estirpes hospedeiras era em todos os casos inferior a 2x10 , isto é, não foram ob8 tidos revertantes numa placa inoculada com 2x10 protoplastos.
A máxima eficiência de transformação foi conseguida usando uma concentração de ADN de plasmídeo da ordem 7 de 12 a 28 ^ug de ADN e cerca de 2,5 x 10 protoolastos por reacção de transformação. A adição de DMSO não afectou a eficiência de transformação.
A frequência de transformação que foi obtida é relativamente alta em comparação com as frequências obtidas com outros fungos (Johnstone, Transformation of Aspergillus nidulans Microbiol. Sei. 2, (1985) 307-311)· Em vários fungos as frequências de transformação são da ordem de 10 a 20 trans formantes/pg de ADN (Ballance et al., 19&3í Tilburn et al., 1984; Wernars et al., Gene amplification in Aspergillus nidulans by transformation with vectors containing amdS gene. Cur rent Genetics 9, 9 (1985) 316-368). A eficiência da transformação nos exemplos referidos é similar à elevada frequência relatada recentemente por Ballance e Turner (1985) em A. nidu
lans .
A localização do ADN plasmídico depois da transformação foi estudada por hibridação usando como sonda o plasmídeo pBR322 marcado com ^2p, uma vez que este plasmídeo forma parte dos plasmídeos pDJBl e pDJB2. 0 plasmídeo pBR322 foi usado como sonda uma vez que este plasmídeo não contem se quências de ADN de fungos que possam ser homólogos do ADN cro mossomal do P. ch rysogenum. Não se conseguiu hibridação com o ADN integral de P. chrysogenum não transformado. No entanto foram obtidas bandas de hibridação nítidas com o ADN integral de várias estirpes transformantes digerido opcionalmente com PvuII, EcoRi ou Bcll. Os fragmentos de ADN que dão hibridação positiva não foram idênticos à dimensão do plasmídeo pDJB2 in tegrado no cromossoma. Urra prova,de ausência, adicional, de pDJB2 sob a forma de plasmídeos livres nos transformantes está no facto de não se detectar hibridação do plasmídeo livre em ADN integral não digerido das estirpes transformadas.
Em S, cerevisiae, Hinnen et al. (Transformation of yeast, Proc. Natt. Acad . Sei. USA 75 (1978) 1929-1933) descreveram três tipos de integração: os tipos I e III envolvendo recombinação homóloga (por cruzamento simples e duplo, respectivamente) entre o ADN de transformação e o gene equiva lente do hospedeiro; a integração do tipo II ocorre em outros locais do genoma. Em Aspergillus, em alguns casos, ocorre pre dominantemente integração no sítio da homologia, por exemplo Tilburn et al. (1984) sugeriram que os plasmídeos contendo o gene estrutural amdS mais parte da repetição de ADN ribossomal do Aspergillus se integram no ADN ribossomal.
No entanto, a integração também pode dar-se em sítios não homólogos. No caso do hene pyr4 de N, crassa não existe homologia significativa com o local pyrG- de Aspergillus e a integração dá-se noutra localização (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112 (1983). Yelton et al., (1984) e Ballance e Tumer (1985) também se referiram à integração de tipo II em A. nidulans usando um marcador trpC. 0
gene pyr4 de N. crassa, que codifica para a orotidina-5'-fosfato-descarboxilase é capaz de transformar um mutante pyrG de A. nidulans por integração cromossomal, apesar do baixo grau de homologia entra o ADN de transformação e o genoma destinatário (Ballance e Turner, 1985, ref. acima). A situação é pro vàvelmente similar com o P. chrysogenum, embora não seja reco nhecido o grau exacto de homologia entre os genes pyr4 de Neu rospora e de Penicillium. Uma vez que se usou uma sequência ans heterologa do ADN de A. nidulans, existe uma possibilidade de integração num sítio não homólogo com a condição de a realização da integração não destruir qualquer gene essencial para a viabilidade no meio selectivo de regeneração.
foram encontradas duas espécies de colónias transformantes. 0 primeiro tipo é constituído por colónias grandes que crescem normalmente em meio não selectivo. Existem também colónias pequenas que aparentemente estão sujeitas a expressão transiente do gene pyr4 mas que normalmente não tem a capacidade de se desenvolver em transplantes maduros e de se replicar após subcultura em meio selectivo. Foram relatados resultados semelhantes em transformantes de A. nidulans com o gene da acetamidase (Tilburn et al., 1983; Wermars et al · , Current Genetics _£ (1985) 361-368).
Existe um efeito nítido da sequência ansl (pre sente no plasmídeo pDLB2) sobre a transformação de P. chrysogenum usando o gene pyr4 de N.__crassa. 0 número de transformantes estáveis usando o plasmídeo pDJB2 foi 15 vezes mais elevado do que o número obtido usando pDJBl ao qual falta a sequência ansl mas de resto idêntico a pDJB2. 0 baixo número de transformantes absortivos com o vector contendo ans é sugestivo duma integração precoce de forma estável. Foram relatados resultados semelhantes por Ballance e Turner, 1985· Estes autores sugerem que o plasmídeo pDJB2 (sendo diferente de pDJBl) poderia sofrer diversos estádios de replicação quando da entrada nos protoplastos antes da integração. Esta hipótese explicaria também o aumento da transformação e a redução
do número de transformantes abortivos observados em P, chryso genum usando pDJB2.
A expressão do gene nyr4 em transformantes de P, chrysogenum foi estudada através da determinação da activi dade de 5’-monofosfato de orotidina (MFO) por meio da medida do 5’-monofosfato de uracilo (MFU). Encontrou-se uma activida de baixa de MFO-descarboxilase em culturas de tipo selvagem e quase que não se detectou activicade num mutante pyrG de P, chrysogenum. Os resultados estão em concordância com um alto nível de expressão do gene pyr4 em Penicillium (Ver Quadro 3).
Quad ro 3
Actividade de MFO-descarboxilase do tipo selvagem e duma estirpe transformante de P, chrysogenum usando o gene pyr4
| MFO-descarbo xilase | /o do | |
| (actividad e | ||
| Estirpe | específica) | tipo |
| mU/mg de proteína | Selvagem |
| P. chrvsogenum Wis 54-1255 | 62 | 100 |
| (tipo selvagem) | ||
| P. chrysogenum Wis 54-1255 pyrG | 0 | 0 |
| P. chrysogenum Wis 54-1255 (pDJB2) | 292 | 471 |
Uma unidade de enzima (u) é a actividade que forma 1 jimole de MFU em 1 h a 30°C em tampão de Tris 5θ mM a pH 8,0.
A actividade de MFO descarboxilase foi determinada por meio duma análise radiométrica a fim de medir a con versão de /6 C/-MFU. Ambos os nucleotidos foram separados por CCF usando placas de PEI-celulose reveladas em cloreto de
Litio 0,3 Μ.
Exemplo 2
Transfor ma çSo dum auxotrofo pyrG de P. chrysogenum usando o _ gene pyrG homólogo de P. chrysogenum
A fim de isolar o gene pyrG de P. chrysogenum, esyabeleceu-se um banco fenómico do ADN de P, chrysogenum de tipo selvagem no sítio SalT do vector do bacteriófago lambda pEMBL 3 (Frischauf et al., J. Mol. Biol. 120, 827-842 (1983) por métodos normais (Maniatis et al. (1982)).
Este banco foi submetido a uma selecção por hidridação em placa em formamida a 45% usando como sonda o ge ne pyr4 heterólogo de N. crassa. Foram obtidos sete fagos recombinantes dando um sinal positivo de hibridação. Estes fagos tinham uma dimensão média de inserção de 17 kilobases.Por digestão com a enzima de restrição SalT verificou-se que todos os fagos tinham fragmentos de inserção de 3»07 e de 2,66 kb em comum. A enzima BamHl gerou três fragmentos comuns em todos os fagos com dimensões de 3,6, 1,1 e 0,75 kb, respectivament e.
Os fragmentos contendo o gene pyrG foram identificados por hibridação de Southern usando como sonda a mistura de oligonucleátidos sintéticos 5'd (TTC GAG CAPy CGPy AAG TTC)3', correspondente a uma região conservada nos genes pyr4 de N. crassa e URA3 de Saccharomyces cerevjsiae (Nervbury et al., Gene 43 (1986) 51-58). 0 fragmento BamHl de 33,6 kb e o fragmento SalT de 3,07 kb, que é interno em relação ao primeiro, deram um sinal positivo.
Seleccionou-se um dos sete recombinantes posi tivos, pEMBL3/5 (= pEMBL3/£5, ver mapa físico apresentado na Fig. 1), para transformação de destinatários auxotróficos * pyrG P. chrysogenum Wis-54-1255 como descrito no exemplo 1.
• Foram obtidos transformantes trototráficos com uma frequência
de 5θ a 100 por micrograma de ADN de pEMBL3/5 adicionado.
fago pEMBL3/5 foi depositado no Central Bureau voor Schimmel cultures, Baam, Paises Baixos, sob o nume ro CBS 399.87.
Um fragmento Sau 3A de 4 kb contendo a inserção do plasmídeo pEMBL3/5 foi subclonado no sítio BamHI do plasmídeo pUC13. A construção resultante (nUC13:;pyrG) foi usada com bons resultados para transformar a estirpe destinatária Penecillium chrysogenum pyrG com uma frequência elevada. A estirpe E. coli DHl contendo este plasmídeo foi depositada no CBS em 14 de Setembro de 1987 sob o número de acesso 426.87·
Exemplo 3
Transformação de auxotrofos de arginina de P. chrysogenum usggi do o gene ARG4 de Saccharomyces cerevisiae plasmídeo dador, pGB83, que foi usado neste exemplo foi construido a partir de fracções do vector cosmídeo pJB8 (isli-Horowicz e Burke, Nucl. Ac. Res. (1981) 2989-2998), do plasmídeo híbrido pCL4 de E, coli/ S.cerevisiae (Hsiao e Carbon, Gene 15. (1981) 157-166), que contém o gene de levedura ARG4 (argininossuccinato-liase) e 2 kilobases da repetição do ADN ribossomal de P. chrysogenum, de modo a promover a recombinação entre o plasmídeo dador e o genoma hospe deiro. 0 cosmídeo pJB8rB contendo o ADN ribossomal foi identi ficado num banco genómico de Penicillium usando como sonda de 32 hibridação ARN ribossomal de Penicillium marcado com p. Na Figura 2 salientam-se pormenores da construção, usando as abre viaturas B, C, H, S e X para indicar os sítios de restrição para as enzimas BamHI, Çla.I, HindIII. Sall e Xbal, respectiva mente.
Como estirpe destinatária foram usadas sete auxótrofos diferentes de P. chrysogenum dependentes de argini na. A transformação foi levada a cabo essencialmente de acor- 17 -
do com a descrição do exemplo 2. Com dois mutantes, HDM2 e HDM15» foram obtidos transformantes. A frequência de transfor mação situou-se normalmente na ordem de 1 tranaformante por micrograma de ADN adicionado, embora em algumas experiências, usando HDM15 como destinatário, se tivesse conseguido obter até 100 transformantes por micrograma.
carácter transformante dos clones foi verificado por hibridação de ADN total isolado de transformantes com o plasmídeo vector pJB8,
Exemplo 4
Transformação dum auxotrofo argB de P. chrysogenum usando o gene argB de Penicillium chrysogenum
A fim de isolar o gene argB de P, chrysogenum (omitina-carbanoiltransf erase) , estabeleceu-se por métodos normais um banco genómico de P.chrysogenum de tipo selvagem (ver exemplo 2) no vector cosmídeo pPS07 (ver exemplo 3). Este vector é um derivado do cosmídeo pJB8 que contém o gene de S. cerevisiae e 2 kilobases de ADN ribossomal de P. chrysogenum (ver também exemplo 3 e o mapa físico na Figura l).
A dimensão das inserções de ADN de P, chrysogenum no banco variava entre 10 e 30 kilobases. 0 banco foi dividido em 32 conjuntos cada um contendo 12 clones. Os ADNs dos cosmídeos foram isolados a partir dos clones dos conjuntos digeridos com EcoRI e transferidos para filtros de nitrocelulose usando técnicas normais (Maniatis et al., 1982). As transferências foram seleccionadas por hibridação à temperatu ra ambiente em formamida a 50% usando o gene heterólogo argB de Aspergillus nidulans (Berse et al. Gene 25 (1983) 109-117) como sonda.
Num dos conjuntos estava presente um fragmento de hibridação de EcoRI com a mesma mobilidade electroforé18
tica (1,7 kb) que o sinal de hibridação observado em ADN cromossomal de P. chrysogenum digerido com EcoRI. 0 clone indivi dual que deu o sinal positivo foi isolado do conjunto e denominado pRV13O. 0 fragmento EcoRI de 1,7 kb foi isolado a partir da inserção de pVR13O e foi subclonado no vector plasmídeo pUC19 (Yanisch-perron et al., Gene 33 (1985) 103-119) dan do origem ao plasmídeo pRVOl. Ambos os plasmideos foram usados com bons resultados para experiências de transformação a ser descritas em seguida.
Foram usados como estirpes destinatárias auxo trofos argB de P. chrysogenum. Estas estirpes podem ser fácil mente identificadas de entre os auxótrofos de arginina em vir tude da respectiva capacidade para crescer em meio mínimo suplementado com citrulina mas não em meio suplementado com ornitina.
A transformação foi levada a efeito segundo o método descrito nos exemplos anteriores. Numa experiência típica foram usados 10 microgramas de ADN do dador; a frequência de transformação foi de aproximadamente 1 transformante por micrograma.
A ocorrência de transformação foi adicionalmen te confirmada por hibridação dos transformantes com o plasmídeo vector, por exemplo, pJB8.
A presente invenção proporciona um processo efectivo para a transformação de Penecillium e de manutenção estável do gene ou dos genes introduzidos de interesse para a preparação de estirpes possuindo propriedades que se pretendam. Descrevem-se as condições que resultam numa alta frequência de transformação de tal modo a que se possam obter clones que conduzam a resultados óptimos.
Embora a presente invenção tenha sido descrita com um certo grau de pormenorização por meio de indicação de modos de concretização e de exemplos com o fim de melhor compreensão e clareza, é óbvio que poderão ser praticadas certas alterações e modificações no âmbito das reivindicações anexas.
Claims (2)
- R Ε I V IND I C A C 8 £ S- 18 Processo para transformar uma célula de Penecillium hospedeira caracterizado por:combinar protoplastos das ditas células hospedeiras, em que as ditas células hospedeiras são auxotróficas, com uma construção de ADN compreendendo um gene estrutural, capaz de fornecer prototrofia no que diz respeito a pelo menos uma via me tabólica sob condições de transformação para fornecer protoplastos transformados; e cultivar os referidos protoplastos transformados sob condições de regeneração da parede celular e de prototrofia selectiva para fornecer transformantes de Penecillium.
- - 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a construção de ADN compreender para além dis so o gene ans.^rocesso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a referida construção de ADN integrada pelo menos em parte no genoma da dita célula hospedeira.- /qa 20Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3» caracterizado por a referida auxotrofia estar na via biosintética de uma purina ou pirimidina ou um aminoácido .Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o referido gene estrutural ser orotidina-5*-fosfato dicarboxilase, arginina succinato liase ou ornitina carbamoil transferase.Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a estirpe de Penecillium transformada ser da espécie chrysogenum.» y â- —Processo de acordo com qualquer das reivindicações la 5 caracterizado por a referida construção incluir um gene de interesse capaz de expressão no dito Penecillium.- 8a Processo de acordo com a reivindicação 7« caracterizado por o referido gene de interesse estar sob a regu lação de iniciação de transcrição da região de início de tians crição do gene pyr4, pyrG, argB, arg4.Processo para a produção de um produto em Penicillium que compreende cultivar uma estirpe de Penicillium produzida de acordo com qualquer dos processos das reivindica çoes 1 a 8, caracterizado por o referido gene ser expresso pa ra produzir o referido produto de interese.A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América* em 16 de Setembro de 1986, sob o número de série 9θ7»732.«
RESUMO PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE TRANSFORMANTES DE PENICI- LLIUM E DE PRODUTOS OBTIDOS POR EXPRESSÃO DE GENES INTEGRADOS NESTES TRANSFORMANTESA invenção refere-se a um processo para trans formar uma célula de Penicillium hospedeira que compreende: combinar protoplastos das ditas células hospedeiras, em que as ditas células hospedeiras são auxotróficas, com uma construcção de ADN compreendendo um gene estrutural, capaz de fornecer prototrofia no que diz respeito a pelo menos uma via meta bélica sob condição de transformação para fornecer protoplastos transformados; e cultivar os referidos protoplastos transformados sob condições de regeneração da parede celular e de prototrofia selectiva para fornecer transformantes de Penicillium.FIGURA 1IleSX)ACCM0) mapa físico de pEMBL3^5IHiueg __ II®S IIBS = IHiuea «II® s o ϋ coI -J ca 2 LUO o> o u.adn de Penicillium chrysogenum ( — 17kb)FIGURA 2 rADN de P chrysogenum |--------------------------------------1--------------------------------------1
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