PT87105B - Processo para a preparacao de uma resina sintetica a base de um poli-estireno - Google Patents

Description

Resumo

O presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma resina sintética à base de um poli-estireno utilizável como suporte para a sintese peptídica em fase sólida, reticulado com 0 a 5% (molar)de divinilbenzeno, e que está substituído, nos aneis benzénicos

CIBA-GEIGY AG.,

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA RESINA SINTÉTICA A BASE

DE UM POLI-ESTIRENO da sua estrutura de base, pelos grupos de fórmula

em que

X representa -0- ou -NH- e R representa Cj-C^-alquilo.

A referida resina, utilizada como suporte, possibilita a sintese em fase solida de péptidos e peptidamidas, eventualmente protegidos nos seus grupos aminoâcidos terminais-N e/ou nos restantes grupos funcionais. A referida resina pode ser preparada mediante a reacção de uma resina de poli-estireno clorometilada normal com um sal de um metal alcalino da correspondente 4-hidroxí-benzofenona e por redução subsequente do grupo carbonilo e aminação eventual.

presente intento refere-se a uma nova resina sintética, destinada à aplicação como suporte para a síntese de péptidos e peptidamidas, em fase sólida, segundo o conhecido principio geral da síntese de Merrifield.

A resina sintética do presente invento compreende a estrutura de base de um poli-estireno utilizável para a referida síntese de í-1errifield, e que, eventualmente, está dotada de muitas ligações transversais (reticulação), obtidas por copol imerização com 0 - 5% (molar), de preferência 1 - 2% (molar), de divinilbenzeno, e que se caracteriza por estar substituída, nos aneis benzénicos da sua estrutura de base, pelos grupos correspondentes à fórmula · —·

-CH₂-O—( · = · ^R0\_.

ÇH—OR (I), em que X representa -0- ou -NH- e R representa Cj-C^-alquilo. Na resina de acordo com o invento, X representa preferentemente -0-, R representa preferentemente Cj-C₄-a 1qui1 o, em primeiro lugar metilo.

presente invento diz ainda respeito a um processo para a preparação da resina definida atrás, bem como à sua utilização na preparação de péptidos e amidas peptídicas, em especial daqueles que estão protegidos no grupo amino terminal-N e/ou nos restantes grupos funcionais presentes.

Além disso, o presente invento refere-se a resinas correspondentes, em que o radical -XH, que significa -NH^, estâ presente sob a forma protegida, e se refere também a resinas com radicais amino-ácidos, peptídicos e peptidamídicos 'ancorados' (firmemente ligados), eventualmente protegidos, bem como se refere aos péptidos e peptidami das livres, preparados através do processo atrás referido, em especial aos compostos obtidos nos exemplos práticos.

E do conhecimento geral o principio básico da síntese de Merrifield (publicado em 1962) de compostos com ligações peptidicas. De acordo com esta síntese, liga-se (fixa-se) um amino-ácido protegido num dos grupos terminais (geralmente o radical terminal-N) a um polímero de base apropriado, dotado de grupos funcionais (geralmente, a um poli-estireno clorometilado). Por um lado, a ligação assim estabelecida deverá ser suficientemente forte para se manter intacta nas diversas condições reaccionais da síntese de péptidos (especialmente, nas condições da separação do grupo protector de amino terminal-N), mas por outro lado, ela deverá assegurar a separação do pêptido final do suporte polímero, em condições tais que não prejudiquem o produto final. A síntese própriamente dita efectua-se então no amino-ácido fixado ao suporte, neste caso, cliva-se geralmente o grupo protector do radical terminal-N,. acila-se o grupo amino assim libertado mediante um derivado de amino-ácido apropriado., protegido no radical amino terminal-N (ou seja, se forma uma nova ligação peptídica) e repete-se esta separação do grupo protector do radical terminal e a acilação com um outro radical amino-ácido as vezes necessárias para se obter uma sequência de amino-ácidos com um comprimento deseja^ do.

A referida sequência de aminoácidos é seguidamente separada, por meio de um reagente adequado, do suporte polímero, sob a forma do pêptido final. No entanto, aquando da execução na prática deste decurso 'ideal' da reac-5-

ção, surgem uma série de problemas e desvantagens e a literatura cimtifica da síntese peptídica tem vindo a insistir nestes problemas durante os últimos 25 anos. Um dos problemas mais graves reside no facto de a sequência formada no suporte polúmero não poder ser separada de produtos secundários, pelo que, em cada etapa de síntese ulterior, continua a reagir também uma estrutura deficiente resultante (por ex., um produto secundário que apresenta uma sequência encurtada), sendo 'arrastada' para as restantes etapas da síntese, de modo que, no final da reacção, frequentemente se obtém o produto desejado apenas numa quantidade diminuta, que coexiste ao lado de uma quantidade excessiva de compostos secundários e terá de ser separado dos referidos produtos secundários indesej ados.

A situação é especialmente gravosa se os amino-ácidos utilizados contiverem nas suas cadeias laterais grupos funcionais adicionais, cuja protecção é práticamente sempre necessária (devido às condições relativamente enérgicas da operação de acilação). Por seu lado, os grupos protectores utilizados deverão ser suficientemente estáveis, a fim de ficarem intactos aquando da separação/1ibertação do grupo amino terminal-N.

Outro problema consiste na natureza das peptidamidas, dado que a sua ligação ao suporte (em contraste com a ligação éster dos pêptidos normais) é uma ligação peptídica da mesma forma que a ligação existente entre os amino-ácidos de toda a sequência de amino-acidos.Torna-se dificil separar de modo selectivo uma peptidamida do seu suporte, com conservação das restantes ligações peptídicas. Por esta razão e ainda por outros motivos vários, a síntese em fase sólida (síntese de Merrifield) só é adoptada, como método que apresenta certas vantagens, no caso da formação de pêptidos contendo um número máximo de 30 amino-ácidos.

Afim de alargar o seu campo de aplicação sugeriu-se E. Atherton et al., Proceedings of the 7th American Peptide Symposium, Seiten 163-195, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, U.S.A.(1981), fixar a um suporte como componentes de base, inteiras sequências parciais de amino-ácidos com grupos funcionais protegidos (inclusivê o grupo amino terminal-N) e ligar a outros fragmentos peptidicos protegidos como elementos constitutivos. Desta maneira seria possível obter estes elementos constitutivos necessários (fragmentos de péptidos) no suporte através da síntese em fase sólida. No entanto, esta síntese constitui uma tarefa totalmente inédita. Necessita-se, portanto, de uma resina que permita separar o fragmento peptidico sintetizado, e que se compõe de vários radicais amino-âcidos protegidos, em condições tão suaves e/ou selectivas, da sua 'ancoragem¹ n resina, que não fiquem prejudicados o grupo protector do radical amino-N-terminal, nem os grupos protectores de outros grupos funcionais (que, forçosamente,hão-de ser diferentes do primeiro). Uma discussão pormenorizada de várias propostas e soluções parciais encontram-se na publicação de Atherton et a 1., atrás mencionada. Estes autores propuseram, considerando-a como a sua solução mais bem conseguida, a utilização de uma resina à base de poli-amidas, e que por via de norvalina, está ligada ao ácido 2- ou 3-metoxi-4-hidroximetil-fenoxi-acético. Neste caso, o radical terminal-C do primeiro amino-ácido (protegido) encontra-se fixado ao grupo hidroximetilo através de uma ligação éster, a clivagem desta ligação (separação da resina) no final do processo de síntese realiza-se com ácido trif1uoroacético, a 1%, em cloreto de meti leno.Contudo, também este método que, provávelmente, poderá ser considerado como um dos melhores no actual nível da técnica, não se pode aplicar de maneira universal. Com efeito, e de acordo com as próprias afirmações dos referidos autores, verifica-se que, nas condições da separação no final da síntese, pelo menos 2 grupos protectores muito importantes das cadeias laterais, ou seja, o grupo protector terc.-butoxicarboní lo do grupo £-amino da lisina, bem como o grupo protector terc.-butilo do grupo hidroxilo da tirosina, são separados tão prontamente a pôr em causa a sua utilização como grupos de protecção. Além disso, a resina referida não estâ indicada para uma síntese directa, em fase sólida, de peptidamidas. Todos os inconvenientes terão impedido a aplicação mais generalizada deste método, não obstante as suas indiscutíveis vantagens.

Descobriu-se agora, surpreendentemente, de que a resina sintética do presente invento não apresenta as desvantagens conhecidas das soluções anteriormente propostas, permitindo, assim, a aplicação em larga escala da síntese em fase sólida, de péptidos e peptidamidas, protegidos e não-protegidos.Utiliza-se como estrutura polímera preferentemente o polímero de suporte mais usual, ou seja, poli-estireno.

Práticamente todas as resinas sintéticas contendo grupos de fenilo na sua estru.tura podem ser utilizadas como polímeros de base. Preferem-se os polímeros de estireno, tal como desde hâ 20 anos estão sendo utilizados como suporte para a síntese, em fase sólida, de péptidos, sob as mais variadas formas de preparados comerciais apropriados para este fim.

Para aumentar a estabilidade e para garantir que não se dissolvam em dissolventes orgânicos, preferem-se resinas de pol i-estirenos com ligações transversais (reticulação) obtidas por copolimerização com 5 moles (%), no máximo, de preferencia 1 a 2 moles (%), de divini lbenzeno. Estes polímeros de base são substituídos por clorometilação ou bromometilação nos seus grupos fenílicos (aneis de benzeno), após o que se insere os grupos de fixação (' ancoragem¹) própriamente ditos por substituição de cloro ou bromo, no grupo meti leno.Também as resinas de poli-estirenos halo-metiladas, em especial clorometiladas,

são produtos comerciais habituais que, sob a designação de 'resinas de Merrifield¹, encontram larga aplicação na síntese de péptidos em fase sólida.

processo de acordo com o presente invento para a preparação das novas resinas sintéticas, atrás definidas, caracteriza-se em que se faz reagir um poli-estireno apropriado, por ex., o poli-estireno atrás descrito, reticulado com 0-5% de divinilbenzeno e substituído nos aneis de benzeno da estrutura de base por clorometilo ou bromometilo, sucessivamente, com

a) um composto de fórmula ^E0\_.

M-O—CO—OR ·ζ=· ·=χ· (II), em que M representa um metal (fe um metal alcalino e R tem o significado atrás referido.

b) um agente redutor e, caso X represente -NH-,

c) um reagente capaz de introduzir o grupo amino.

A reacção segundo a etapa a) do processo realiza-se na presença de um dissolvente altamente polar que, de preferencia, consiga dissolver sais de maneira fácil, por ex., na presença de um dissolvente aprótico dipolar, tal como sulfóxido de dimetilo, acetonitrilo, triamida de ácido hexametiIfosfórico, N,N'-propileno-ureia ou na presença de uma amida alifática, em especial formamida de dimetilo, e ainda de mistikras desses dissolventes entre si,e de preferencia, ao abrigo da humidade.Trabalha-se, sobretudo, com uma solução do sal do metal alcalino de fórmula Ilj para este fim serve muito bem um sal de césio (M representa césio). A reacção pode realizar-se a temperaturas entre 0 e 50°, de preferencia,à volta da temperatura ambiente, e os periodos de reacção poderão variar em função da temperatura adoptada, por ex., entre 8 e 72 horas. De preferencia, a mistura reaccional serâ submetida a uma agitação ou vibração mecânicas. As 2,4-dialcoxi-4'-hidroxi-benzofenonas utilizadas como compostos de partida podem obter-se, de maneira usual, conhecida, por ex., pela C-acilação de um correspondente di-éter de resorcinol com cloreto de p-hidroxibenzoilo, catalisada por cloreto de alumínio, ou por uma modificação desta acilação; obtém-se o sal desejado mediante reacção habitual com o correspondente hidróxido de metal alcalino, tal como hidróxido de césio.

Realiza-se a etapa b) do processo, de maneira habitual, pela reacção com um agente redutor, por ex., um redutor que se emprega normalmente para a redução de grupos oxo a grupos hidroxi. Redutores apropriados são, por ex., diborano ou hidretos complexos, em especial borohidretos de metais alcalinos (por ex., borohidreto de sódio, borohidreto de litio ou borohidreto de potássio), e bem assim, aluminato-hidretos de metais alcalinos (por ex., aluminato-hidreto de soâio ou aluminato-hidreto de litio), que se empregam em solventes orgânicos, inertes, apropriados, em especial éteres de cadeia aberta ou cíclicos (por ex., éter diisopropi 1 ico ou 1,2-dimetoxi- ou dietoxi-etano, dioxano ou tetrahidrofurano), a temperaturas entre 0 e cerca de 100°C, de acordo com o reagente utilizado. Os periodos reaccionais dependem dos correspondentes reagentes e condições reaccionais e, de uma maneira geral, oscilam entre 1 e 48 horas; as operações de agitação ou remeximento facilitam o contacto entre os componentes sólidos e líquidos. Caso seja necessário, pode repetir-se a redução empregando nova quantidade do redutor; o reagente em excesso será eliminado, com vantagem,no

final da reacção, por ex., pela adição de uma cetona, tal como a acetona.

A etapa c) do processo, que eventualmente se realiza, e que serve para a conversão da 'resina de hidroxi¹ obtida segundo a etapa b), na 'resina de amino', poderá decorrer com amónia. Para este fim, introduz-se, por ex., amoníaco gasoso numa suspensão agitada da 'resina de hidroxi', num dissolvente polar, por ex., num dissolvente referido na etapa a) ou b) do processo, a temperaturas entre 0°C e a temperatura ambiente; a reacção poderá realizar-se também sob pressão aumentada e a temperaturas até 50°C, sob agitação.

Reagentes especialmente apropriados para a inserção do grupo amino, no âmbito da etapa c) do processo, são carbamatos, cujo função alcoólica pode ser separada por tratamento com uma base, mas que sejam estáveis em condições reaccionais acídicas. Exemplos destes carbamatos são carbamatos de etilo substituídos, que, na posição B, contêm substituintes activantes, em especial substituintes capazes de atrair electrões. São compostos apropriados, por ex., ^-(alcano inferior ou arilsulfoni1)-eti1-carbamatos , por ex., β-(metanossulfoni1)-etilcarbamato ou β-(benzenossulfoni1 )-etilcarbamato, P-(nitro-, ciano- ou halo-feni1)-etilcarbamatos, por ex., JB-(p-nitrcfeni 1)-eti 1 carbamato, p-di-(p-nitrofeni 1)-eti lcarbamato ou β-fpentafluorofeni1)-etilcarbamato, ou, em especial, 9-fluorenilmetilcarbamato.No caso da reacção com os referidos carbamatos, agita-se uma suspensão da 'resina de hidroxilo', num dissolvente orgânico inerte, por ex., num hidrocarboneto halogenado, tal como cloreto de metileno, clorofórmio ou 1,2-dicloroetano, ou num éter, tal como éter diisopropi1ico., éter diisobuti 1 ico, dimetoxietano, dietoxietano, tetrahidrofurano ou dioxano, a temperaturas entre 20° e 80°C, de preferencia a 50°C, do carbamato e de um ácido forte, por ex., um ácido sulfónico orgânico, de preferencia um ácido alcano inferior- ou arilo-sulfónico, por ex., ácido

metanossulfónico, ácido benzenossulfónico ou ácido p-toluenossulfónico, durante algumas horas, por ex., 2 a 48 horas.

Forma-se, desta maneira, uma resina sintética com a estrutura definida atrás, que, em lugar do grupo -X-H, apresenta um grupo -NH-W, em que W representa um grupo amino-protector separável mediante tratamento com uma base, em especial um grupo etoxicarbonilo substituído, Em seguida, para a libertação da 'resina de amino' separa-se o grupo protector com uma base, por ex., com uma solução de uma amina terciária ou, de preferência, secundária, de cadeia aberta ou cíclica, por ex., trietilamina, tributilamina, dietilamina, piperidina, pirrolidina ou morfolina, num dissolvente orgânico inerte, de preferência num dos referidos éteres ou numa amida de dialquilo inferior, por ex., dimetilformamida ou dimetilacetamida, a temperaturas entre 0^o e 50°C, de preferencia, à volta da temperatura ambiente; os tempos de reacção variam entre poucos minutos, por ex., 1 minuto, e algumas horas, por ex., 6 horas. Em vez de uma amina é também possível utilizar um hidróxido de um metal alcalino, por ex., hidróxido de sódio, ou um hidróxido de amónio, por ex., hidróxido de benzi 1-trimetilamónio; neste caso, a separação já estará concluída dentro de períodos reaccionais mais curtos, por ex., dentro de pouco mais de 1 minuto, mesmo quando se adoptarem temperaturas reaccionais mais baixas.

Como já se indicou atrás, o presente invento refere-se igualmente à utilização da resina sintética de acordo com o invento como suporte para a síntese de péptidos e peptidamidas, em fase sólida, em especial para a preparação de péptidos e peptidamidas que estejam protegidos no grupo amino terminal-N e/ou nos grupos funcionais das cadeias laterais.

12De acordo com o presente invento, os referidos compostos peptídicos são preparados, com utilização da referida resina sintética, atrás definida, fazendo reagir

a) a resina sintética com um composto de fórmula W^-AM^-Y-H, em que Y representa -0- ou -NH-, W¹ representa um grupo protector de amino terminal-N e AM¹ representa o radical acilo de uma sequência de amino-ácidos constituída por 1 a 25 radicais de amino-ácidos, eventualmente protegidos nos grupos funcionais, ou com um dos seus derivados funcionais, reacti-

1 vos, para fixação ('soldagem') do radical W -AM - ao grupo -X- da resina,

b) separando o grupo protector de amino terminal-N(grupo W¹),

c) acilando o grupo amino terminal-N livre mediante reacção

2 2 2 com um ácido de fórmula W -AM -OH, em que W e AM têm um significado análogo ao dos radicais W¹ e AM¹, atrás definidos, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos,

d) repetindo a operação da separação alternada segundo b) e da acilação segundo c), as vezes necessárias, até se obter uma sequência de amino-ácidos desejada, e

e) separando da resina, mediante acidólise, o péptido ou peptidamida assim formado, eventualmente após separação prévia ou separação simultânea de grupos protectores.

Aquando da fixação do amino-âcido, protegido no grupo terminal-C ou da sequência de amino-âcidos protegida, à resina de acordo com o presente invento, as respectivas condições reaccionais serão sempre escolhidas atendendo â natureza dos grupos funcionais, reactivos. De preferencia, utiliza-se como resina de suporte a 'resina de hidroxilo' de fórmula I, em que X representa -0-; caso se pretenda obter o produto final sob a forma de amida, esta

resina poderá ser levada a reagir com uma amida de amino-ácido protegida ou com uma sequência de amino-ácidos protegida, presente sob a forma de amida, por ex., com um composto de fórmula W^-AM^-NHp, em que U e AmJ têm os significados atrás mencionados; neste caso, substituem-se os grupos hidroxi -XH da resina pelo grupo amino terminal-C, com ligação amídica. Geralmente, a reacção para a fixação do amino-ácido realiza-se com catálise acídica, por ex., mediante um ácido sulfónico orgânico, de preferencia, um ácido alcano inferior- ou arilo-sulfônico, por ex., ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico ou ácido p-toluenossulfónico, em presença de dissolventes orgânicos, inertes, tais como alcanos clorados (por ex., cloreto de metileno, clorofórmio ou 1,2-dicloroetano) e/ou éteres de cadeia aberta ou cíclicos (por ex., éter dietilico, éter diisopropi1ico ou éter dibutílico, ou 1,2-dimetoxi- ou 1,2-dietoxi-etano,ou dioxano ou tetrahidrofurano), durante várias horas, por ex., durante 2 a 48 horas, a temperaturas compreendidas entre 20 e 80°C, de preferencia a cerca de 50°C. Caso seja necessário, pode-se repetir a reacção de fixação ou 'ancoragem¹. Em seguida, a resina com amida terminal-C 'ancorada¹, ou seja, uma resina, cujos aneis benzénicos estão substituídos pelos radicais de fórmula

(III) em que R, Vp e AM^ têm os significados atrás referidos, será então submetida âs etapas b) -d) do processo para a formação da desejada sequência de amino-ácidos. A separação da peptidamida final (etapa e) do processo) poderá realizar-se com ácido fluoridrico, de'preferencia, com agentes acídicos

mais suaves, tal como ácido trifluoroacético e, de preferencia, num diluente orgânico, inerte, tal como um alcano halogenado, ou também em água. Assim, por ex., realiza-se a separação com uma mistura de ácido trifluoroacético e cloreto de metileno ou 1,2-dicloroetano, por ex., numa razão volumétrica de 1 : 1. No entanto, nestas condições nem todos os grupos protectores, normalmente utilizados e separáveis por acidólise, são estáveis. Assim, consoante as respectivas condições reaccionais, separam-se - simultaneamente com a separação da resina - também os respectivos grupos protectores, resultando uma peptidamida com grupos funcionais livres.

Se no final da síntese se pretender obter o péptido na forma de um ácido livre (eventualmente com um grupo protector de radical terminal-N e/ou com outro grupo protector qualquer), utilizar-se-á como resina de suporte também a 'resina de hidroxi¹ de fórmula I, em que X representa -0-.

Esta resina faz-se reagir com um amino-ácido protegido ou com uma sequência de amino-ácidos protegida na forma do ácido livre ou na forma de um derivado funcional, reactivo do ácido, por ex., com um composto de fórmula W^-AI^-OH, em que W¹ e AM¹ têm os significados atrás definidos, pelo que se verifica a esterificação do grupo hidroxi na resina. A reacção de 'ancoragem' (fixação) realiza-se nas condições da acilação, habituais na síntese de pêptidos. Como derivado funcional reactivo emprega-se, por ex., um anidrido do ácido a fixar, em especial um anidrido simétrico, de preferencia, na presença de bases orgâricas terciárias, tais como aquelas a seguir enumeradas. Um derivado funcional apropriado é também um éster activado do ácido que se pretende fixar, que também se faz reagir na presença das bases orgânicas terciárias, adiante mencionadas. Esteres activados apropriados são sobretudos os ésteres de fenóis, que contêm substituíntes que atraem electrões, bem como és-15-

teres de N-hidroxi-imidas. Contudo, em prega-se o composto que se pretende acoplar sob a forma do ácido livre e acila-se mediante carbodiimidas, por ex., diisopropilcarbodiimida, ou, em especial, diciclohexilcarbodiimida, como agentes de condensação. A reacção realiza-se na presença de bases orgânicas, em especial na presença de bases terciárias(tal como piridina, quinolina, 4-dimetilaminopiridina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, N,N'-dimetilpiperazina, ou trietilamina ou diisopropiletilamina) e em dissolventes orgânicos inertes, tais como alcanos clonados (por ex., cloreto de metileno ou clorofórmio) e/ou éteres de cadeia aberta ou cíclicos (por ex., éter dietilico, éter diisopropi1ico ou éter dibutílico, ou ainda 1,2-dimetoxi- ou 1,2-dietoxi-etano, ou dioxano ou tetrahidrofurano).

Adiciona-se, de preferencia, um composto de N-hidroxi activado, por ex., 1-hidroxibenzotriazole. Geralmente, a reacção demora várias horas, por ex., 2 a 48 horas, a temperaturas compreendidas entre 0^o e 40°C; caso se desejar, a operação de acilação pode ser repetida. Para evitar a ocorrência de reacções secundárias conducentes à formação de produtos indesejados, hâ vantagem em tratar a resina obtida com cloreto de benzoilo (ou com um derivado acídico simples semelhante), na presença de uma base, tal como das bases atrás referidas, pelo que se bloqueia os grupos de hidroxi da resina, eventualmente livres ainda.

Em seguida, a resina com éster terminal-C acoplado ('ancorado'), isto é, uma resina cujo anel benzénico está substituído pelos radicais de fórmula ^R0\ ·-—· .·

-CHz-O-/ )—OR ·=· ·=·

O—AM¹—W¹ (IV),

em que R, e AM¹ têm os sigiificados atrás referidos, será submetida às etapas b) e d) do processo para formação da desejada sequência de amino-ácidos. Caso se deseje obter um produto final sem grupos protectores, em especial, sem grupos protectores atacáveis pelos ácidos, a separação do ácido peptidico final (etapa e) do processo) pode realizar-se com ácido fluorídríco, de preferencia, com agentes acídicos mais suaves, tal como ácido trifluoroacético, que se dilui preferentemente com um dissolvente orgânico inerte, tal como um alcano halogenado. Se se pretender obter um pêptido (Sequência de amino-ácidos) em que o grupo amino terminal-N e/ou os restantes grupos funcionais se mantêm na forma protegida, tal como se deseja, geralmente, no caso de fragmentos peptídicos utilizados nas sínteses ulteriores, então a separação do produto final da resina realiza-se em condições acidolíticas especialmente moderadas, por ex., com um ácido orgânico, em especial um ácido carboxilico de um alcano inferior, de preferencia, ácido fórmico ou ácido propiónico e, sobretudo, ácido acético, que poderá ser diluído com dissolventes orgânicos neutros, por ex., alcanos clorados ou éteres alifático ou cíclicos. E especialmente vantajoso empregar uma mistura de ácido acético e cloreto de metileno ou clorofórmio, numa razão volumétrica de cerca de 1 : 1 até cerca de 1 : 19, em especial, 1 : 9.

São também apropriados o ácido trifluoroacético, fortemente diluido, por ex., sob a forma de uma solução a 0,1 a 2%, em cloreto de metileno ou clorofórmio, ou um sal de piridinio, por ex., cloridrato de piridinio, num dissolvente polar, capaz de dissolver sais e péptidos, por ex., em dimetilacetamida ou dimetiIformamida. Geralmente, a separação realiza-se numa gama de temperaturas entre 0^o e 50°C, de preferencia, â volta de temperatura ambiente, e o período reaccional poderá oscilar entre uns poucos minutos e várias horas (por ex., 2 a 8 horas).

Obtêm-se também peptidamidas fazendo reagir, como resina de suporte, a resina de 'amino' de fórmula I, em que X representa -NH-, com um amino-âcido protegido ou com uma sequência de vários amino-ácidos protegida sob a forma do ácido livre ou sob a forma de um derivado funcional reactivo do ácido, por ex., com um composto de fórmula W^-AM^-OH, em que W¹ e AM¹ têm os significados atrás referidos. Forma-se neste caso uma resina com amida terminal-C, 'ancorada', isto é, uma resina cujos aneis beníénicos estão substituídos pelos radicais de fórmula III. A reacção realiza-se, de preferencia, nas condições reaccionais referidas atrás em relação à esterificação da 'resina de hidroxi' com um ácido livre ou um dos seus derivados funcionais,reactivos. Em seguida, a constituição da desejada sequência de amino-ácidos segundo as etapas b) a d) do processo, bem como a separação da peptidamida final segundo a etapa e) do processo realizam-se exactamente da maneira descrita.

A relativamente fácil separação da sequência de amino-ácidos da resina exige uma selecçao criteriosa dos grupos protectores de radicais amino terminais-N, os quais deverão permitir a sua separação estritamente selectiva, com manutenção do acoplamento ('ancoragem¹) da sequência na resina (e também com manutenção dos restantes grupos protectores), mas, mesmo assim, deverão permitir uma separação em termos quantitativos.

Este grupo protector de radicais amino 1 2 terminais- N, W ou W , é preferentemente um grupo separável mediante bases, em especial um grupo do tipo de oxicarbonilo. Grupos protectores de radicais amino terminais-N preferidos

2 (W ou W ) são grupos etoxicarbonilo substituídos, que, na posição B, apresentem substituintes activantes, nomeadamente substituintes que atraem electrões, tal como vêm referidos atrás no caso dos correspondentes carbamatos. São especialmente apropriados o grupo ^-(metanossulfonilo)-etoxicarbonilo,

o grupo β-(p-nitrofenilo)-etoxicarbonilo e o grupo p-di(£-n£ trofenilo)-etoxicarbonilo, e, mais especialmente, o grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). A separação destes grupos protectores pode realizar-se mediante bases inorgânicas ou orgânicas, em especial mediante aminas terciárias ou secundárias, tais como aquelas mencionadas aquando da preparação da 'resina de amino'. As condições da separação do grupo protector de amino terminal -N, segundo a etapa b) do processo, em especial a separação do grupo Fmoc,descrevem-se na preparação da 'resina de amino', sendo sobejamente conhec/ das.

A acilação do grupo amino terminal-N libertado, segundo a etapa c) do processo, realiza-se nas condições usuais da síntese em fase sólida, em especial, com utilização da resina de suporte segundo Merrifield. De entre as inúmeras variantes conhecidas convém destacar aquela segundo a qual se procede â acilação com um amino-âcido protegido por Fmoc no grupo terminal-N ou por um grupo protector equivalente separável com o auxilio de uma base, ou se procede à acilação com uma correspondente sequência de amino-âcidos, em que todos os grupos funcionais da cadeia leteral estão presentes sob a forma protegida, ou com um dos derivados funcionais, reactivos, deste ácido, por ex., com o anidrido simétrico ou um éster activado.

Utilizando o ácido livre, então empregar-se-á como agente de condensação diciclohexilcarbodiimida (ou um reagente análogo) de preferencia, em associação com 1-hidroxibenzotriazole e em presença de bases orgânicas terciárias, por ex., aminas alifâticas ou cíclicas, terciárias, ou bases hetero-aromâticas, tal como trietilamina, diisopropiletilamina, Ν,Ν-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-etilpiperidina, N-metilmorfolina, N,N'-dimetilpiperazina ou piridina e seus homólogos, quinolina ou 4-dimetilaminopiridina. Também a acilação mediante o anidrido simétri-

co ou o éster activado realiza-se na presença das referidas bases terciárias e, de preferencia, também na presença de 1-hidroxibenzotriazole. Como ésteres activados podem empregar-se ésteres com fenóis, contendo substituintes que atraem electrões, por ex., com p-nitrofenol, pentafluorofenol ou 2,4,5-triclorofenol, ou com N-hidroxi-imidas, por ex., com N-hidroxi-succinimida ou imida de ácido N-hidroxi-norbornano- ou 5-norbornen-2,3-dicarboxílico.

As condições da acilação nas referidas variantes são de conhecimento geral; a operação de acilação poderá ser repetida e/ou, para evitar a formação de sequências incorrectas, se poderá acilar de maneira usual o composto de partida remanescente, não-acilado, com um derivado simples de um ácido carboxilico, tal como anidrido de ácido acético ou cloreto de ácido acético, pelo que se impede quaisquer acilações ulteriores, indesejadas, deste composto, provocadas por radicais de amino-ácidos nas etapas de síntese mais tardias.

Radicais amino-ácidos para a síntese do presante invento podem ser sobretudo aqueles amino-ácidos que derivam dos X-amino-ácidos (como elementos constitutivos de péptidos) que ocorrem na Natureza, da série L, e dos seus homólogos afins, em especial dos enantiómeros da série D, 'não-natural'., \-Amino-ácidos preferidos são, por ex., glicina, alanina, valina, leucina, iso-leucina, fenilalanina, ácido aspártioo , ácido glutâmico, arginina, histidina e lisina, e ainda ácido íK-amino-butirico, norvalina, isovalina, norleucina, ornitina e citrulina, bem como asparagina, glutamina, tirosina, triptofano, metionina, treonina, serina, mas também prolina e hidroxiprolina (nos quais o grupo X-amino forma um anel com o radical alquilo), e ainda cisteína e cistina (sendo que esta última está presente sob a forma de um par de 2 radicais cisteína condensados, e que podem também ocorrer em duas posições separadas na sequência de amino-âcidos).

Além disso, são ainda apropriados os radicais de outros amino-¹ ácidos, que derivam de ácidos carboxilicos de Cj-Cy-alcanos, em especial, de ácidos carboxilicos lineares deste gênero, e que contêm o grupo amino numa qualquer das posições na cadeia, por ex., no átomo de carbono terminal (tal como no caso da β-alanina, ácido gama-amínobutirico ou ácido delta-aminovalêrico); além disso, eles podem ainda conter grupos amino primários adicionais (tal como no caso do ácido«* ,gama-diaminobutirico) ou podem estar substituídos por outros grupos funcionais, tais como grupos hidroxi, mercapto, dissulfureto, guanidino, carboxí ou carboxamido, ou podem estar substituídos por radicais hidrocarbilo ou hetero-ciclilo cíclicos, tais como fenilo, p-hidroxifenilo, indolilo ou imidazolilo.

Quando contiverem átomos de carbono assimétricos, estes amino-ácidos podem ser utilizados sob a forma racémica ou, de preferência, na forma, ôpticamente activa.

Exige o carácter especifico da síntese em fase sólida de que nos radicais amino-ácidos utilizados estejam presentes na forma protegida, geralmente, os grupos funcionais que não participem na reacção (e também aqueles que poderão existir na forma livre durante a síntese em fase 1 iquida).

A escolha dos grupos protectores regular-se-á pelas condições reaccionais e pela utilização do composto final que está a ser sintetizado. Em presença de vários grupos funcionais a proteger será conveniente escolher uma determinada combinação adequada destes grupos protectores. Em especial, deve ter-se o cuidado de assegurar de que os grupos protectores de grupos funcionais das cadeias

laterais dos amino-ãcidos sejam estáveis aquando da separação do grupo protector de radicais terminais-N, tal como no caso do grupo Fmoc, e, caso se desejar obter como composto final um fragmento peptidico protegido para uma síntese ulterior, que sejam também estáveis sob as condições acidicas, suaves, durante a separação da resina no final da síntese.

Para proteger quaisquer outros grupos amino presentes, tal como o grupo L-amino presente no radical lisina, pode empregar-se qualquer grupo protector de amino usualmente utilizado na Química dos péptidos, contanto que seja estável, em condições fracamente básicas.

Os grupos apropriados vêm descritos em manuais conhecidos, por ex., em Houben-Weyl; Methoden der organischen Chemie, 4.Auflage, Band 15/1, E. Wiinsch (Herausgeber), Synthese von Peptiden (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974), de maneira sucinta.

Assim, podem empregar-se grupos protectores de amino separáveis em condições redutoras ou em condições básicas, enérgicas, por ex., sobretudo o grupo benz_i loxicarbonilo e grupos benziloxicarbonilo que, na parte aromática, estejam substituidos por átomos de halogénios, grupos nitro, grupos alcoxi inferior e/ou radicais alquilo inferior, tais como os grupos p-cloro- ou p-bromo-benziloxicarbonilo, ja-nitrobenzi loxicarboni lo, p-metoxibenzi loxicarboni lo ou p-toliloxicarbonilo, e ainda o grupo isonicotiniloxicarbonilo, e também grupos sulfonilo, tais como grupos p-toluenossulfonilo, benzenossulfonilo, o-nitrobenzenosulfonilo e ainda outros grupos benzenossulfonilo substituidos ou também grupos acilo, como formilo, trifluoroacetilo ou ftaloílo.

Um grupo amino-protector apropriado é um grupo etoxicarbonilo que, na posição β, apresenta um grupo sililo substituído por 3 radicais hidrocarbonetos, tal como o grupo trifenilsi1ilo, dimeti1-terc.-butílsi1ilo, ou, sobretudo, trimeti1si1i1 o.

Um grupo p-(trihidrocarbilsi1i1)-etoxicarbonilo deste tipo, tal como um grupo β-(tri-a 1qui1 o inferior-si 1i 1)-etoxicarbonilo, por ex., e em especial o grupo p-(trimeti1si1i1)-etoxicarbonilo, é estável nas condições da hidrólise acídica e da hidrogenólise, embora possa ser clivado por iões fluoreto em condições muito especificas, extremamente moderadas. Neste caso, proceder-se-á análogamente ao caso do grupo protector de carboxi, ou seja, o grupo de éster β-si1iletí1ico, adiante descrito.

São especialmente preferidos os grupos separáveis por acidólise, em primeiro lugar, o grupo terc.-butoxicarbonilo e grupos análogos, por ex., os grupos terc.-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarboni lo, aliloxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, ciclohexi loxicarboni lo, d^-isoborni loxicarboni lo e adamantiloxicarbonilo, e bem assim grupos do tipo de aralquilo, tal como benzidrilo e trifenilmetilo (tritilo), e ainda grupos aralcoxicarbonilo do tipo de 2-arilo-2-propiloxicarbonilo, por ex., o grupo 2-fenilo- ou 2-p-bifeni1i1-2-propiloxicarboni lo.

Como grupo protector da função guanidino, tal como existe, por ex., no amino-ácido arginina que ocorre na Natureza, poderá empregar-se um dos referidos grupos amino-protectores.

São especialmente apropriados os grupos sulfonilo, em especial grupos alcano inferior-, por ex., metano-, etano- ou isopropano-sulfonilo, ou grupos

arilo-, por ex., benzeno substituido-sulfonilo, em que os substituintes poderão ser alquilo inferior, por ex., metilo, alcoxi inferior, por ex., metoxi, alcoxi inferior cíclico (anelado), por ex., 1-oxa-l,4-butileno, nitro ou halogénio, por ex., cloro, ou bromo.

Prefere-se sobretudo o grupo 2,3,5-trimeti1-4-metoxi-benzenosulfonilo e o grupo 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo.

Como grupo protector de hidroxi podem usar-se todos os grupos habitualmente empregados na Química dos Péptidos para esta finalidade; cf o artigo sinóptico publicado no manual de Houben-Weyl, atrás citado. São preferidos os grupso que se podem separar por acidólise, tal como 2-tetrahidropiranilo e, muito especialmente, terc-butilo e ainda terc.-butoxicarbonilo.

Podem empregar-se também grupos hidroxi-protectores cliváveis por redução ou reacções básicas, por ex., grupos benzilo-carbonilo ou benziloxicarbonilo, que, na parte aromática, podem estar substituídos por halogénios, nitro e/ou alcoxi inferior, e também radicais alcanoilo inferior, tal como acetilo, ou radicais aroilo, tal como benzoilo.

Como grupo carboxi-protector pode empregar-se qualquer grupo habitualmente utilizado para este fim (cf. o artigo sinóptico no manual de Houben-Weyl, atrás citado). Assim, a protecção de grupos carboxilo faz-se, por ex., mediante esterificação ou por formação de hidrazidas. Para a esterificação servem, por ex., alcanois inferiores, eventualmente substituídos, tais como metanol, etanol, álcool cianometi1ico, 2,2,2-tricloroetanol, álcool benzoilmetilico ou, em especial, álcool terc.-buti1ico, mas também um álcool benzilico, eventualmente substituído. Uma classe

especialmente útil dos alcanois substituídos são álcoois etílicos, que, na posição β, apresentem um grupo sililo tri-substituido, tal como um grupo trifenilsi1ilo, dimeti1-terc.-butilsililo ou, sobretudo, um grupo trimetilsi 1 ilo. A razão da sua especial ioneidade de grupo protector de carboxilo destes álcoois reside na circunstância de os correspondentes ésteres p-sililetilicos, por ex., o éster β-(trimeti1si1i1)-etílico, possuírem de facto, a esta bilidade dos ésteres de alquilo normais, mas serem susceptiveis de clivagem selectiva por iões fluoreto, sem afectar os restantes grupos protectores presentes.

Todos os grupos protectores de mercapto, habitualmente empregados na Qumica dos Péptidos, podem ser utilizados para este fim. Em especial, os grupos mercapto são protegidos por meio de acilação ou alquilação apropriadas. Para a acilação presta-se, por ex., o radical acetilo ou benzoilo, um grupo alquilo inferior-(por ex., etil-) -carbamoilo, ou um grupo benziloxicarbonilo, eventualmente substituído da maneira atrás indicada. Para a alquilação servem, por ex., o radical terc.-butilo, isobutiloximetilo, benziltiometilo ou tetrahidropíranilo, ou radicais arilmetilo, eventualmente substituídos por halogénios, alcoxi inferior ou nitro, tal como benzi lo, p-metoxibenzilo, difenilmetilo, dimetoxibenzidrilo ou, muito especialmente, tritilo, e bem assim feniIciclohexilo, £-metoxifenilciclohexilo, ou 2-tienilciclohexilo.

Reveste-se de vantagem especial também um radical acilaminometilo, em que acilo representa, por ex., acetilo ou também benzoilo. 0 grupo acetilaminometilo é especialmente preferido.

De preferencia, os grupos protectores das cadeias laterais serão escolhidos de forma a que todos eles sejam separáveis em condições similares. São especialmente preferidos os jâ destacados grupos separáveis por acidólise, sobretudo os grupos que se derivam de terc.-butilo. Com vantagem, a separação de todos esses grupos protectores realiza-se numa única operação.

A separação dos grupos protectores efectua-se da maneira geralmente conhecida. Realiza-se a acidólise ou hidrólise acídica, por ex., mediante ácido trifluoroacético, ácido clorídrico ou ácido fluoridrico e, no caso de grupos protectores prontamente separáveis, também mediante um ácido carboxilico de alcano inferior, tal como ácido fôrmico e/ou ácido acético, na presença de um hidrocarboneto halogenado, por ex., cloreto de metileno, ou na presença de água e, eventualmente, de um alcanol inferior poli-halogenado ou alcanona inferior poli-halogenada, tal como 1,1,1,3,3,3-hexafIuoropropan-2-ol ou hexafluoro-acetona.

Os grupos protectores separáveis por redução, em especial aqueles contendo radicais benzilo, serão preferentemente separados por hidrogenólise, por ex., mediante hidrogenação, com paládio catalisante. De preferência, o grupo isonicotiniloxicarbonilo será separado por redução com zinco. A separação do grupo p-si1iletiloxicarbonilo realiza-se mediante iões fluoreto.

presente invento refere-se também aos compostos intermédios e compostos finais obtidos durante o processo de síntese, com utilização da resina do invento. Em especial, o presente invento diz respeito a uma resina sintética da estrutura referida inicialmente que, em vez do grupo -X-H, apresenta o grupo -NH-W, -X-AM-W ou -X-AM-H, em que -X- representa -0- ou -NH-, W representa um grupo protector de amino terminal-N, e AM representa o radi-26-

cal acilo de uma sequência de amino-ácidos, eventualmente protegida nos grupos funcionais, e constituída por 1 a 180 radicais amino-ácidos, em especial, se refere a um composto indicado nos exemplos práticos seguintes.

De igual modo, o invento refere-se a pêptidos e peptidamidas de fórmula W-AM°-XH, em que -X- representa -0- ou -NH-, W representa um grupo protector de amino terminal-N, e AM° representa o radical acilo de uma sequência de amino-ácidos, eventualmente protegida nos grupos funcionais, e cmstituida por 2 a 180 radicais amino-ácidos, bem como se refere a compostos análogos com gripo amino terminal-N, livre de fórmula H-AM°-NH, contanto que possam ser obtidos através do processo de síntese do presente invento, em especial os pêptidos e peptidamidas descritos nos exemplos práticos seguintes.

As abreviaturas empregadas, por ex., para designar amino-ácidos, pêptidos, grupos protectores, etc., adoptam- os símbolos habituais, por ex., aqueles enumerados no referido artigo sinóptico no manual de Houben-Weyl. Na falta de menção em contrário, os nomes e abreviaturas dos radicais amino-ácidos referem-se aos radicais dosá -amino-ácidos da série L, que ocorrem na Natureza. 0 termo 'inferior', onde quer que apareça em relação a um radical orgânico ou composto, designa um radical ou um composto contendo um número máximo de 7 átomos de carbono, de preferencia, um número máximo de 4 átomos de carbono.

Os seguintes exemplos práticos irão explicitar melhor o presente invento, sem, no entanto, limitar-lhe o alcance inventivo. As abreviaturas adoptadas têm os seguintes significados:

Boc	- terc.-butoxicarbonilo
But	- terc.-butilo (no éter)
DC	- cromatografia em camada fina
DCCI	- diciclohexilcarbodiimida
DMA	- dimetilacetamida
DMF	- dimetilformamida
DMSO	- dimetilsulfôxido
EDC	- 1,2-etano-dicloreto
FAB-MS	- espectro de massas por bombardeamento acelerado de átomos
Fmoc	- 9-fluoreniImetoxicarbonilo
HOBt	- 1-hidroxibenzotriazole
HPLC	- cromatografia líquida de alta pressão
IGF-2	- Factor de crescimento-2, semelhante à insulina
MI F	- Factor de inibição de migração de macrôfagos
Mtr	- 2,3,5-trimeti1-4-metoxi-benzenossulfonilo
OBut	- terc.-butilo (no éster)
TFA	- ácido trifluoroacético
THF	- tetrahidrofurano
Trt	- tritilo.

28Exemplo 1: 2,4-dimetoxi-4^l-hidroxi-benzofenona (I)

Em analogia ao processo divulgado por Darstellung, para a preparação de 2,4'-dihidroxi-4-metoxi-benzofenona, /Ray, S., Grover, P.K. e Anand Nitya: Indian Journal of Chemistry 9,619-623(1971)7, obtém-se o composto em epígrafe a partir de éter dimetilico de resorcinol e de ácido 4-hidroxi-benzoico. A estrutura do composto (1) vem confirmada pela análise elementar, RMN-^H e espectro do infra-vermelho.

Espectro 2: Sal de césio de 2,4-dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona (IA)

Prepara-se uma suspensão de 5,00 g (1) (19,3 mmoles) em 40 ml de etanol e 16 ml de água e adiciona-se uma solução de 3,25 g (19 mmoles) de monohidrato de hidróxido de césio, em 4,5 ml de água. A solução é concentrada, num vácuo, dissolve-se o resíduo obtido em 40 ml de água/álcool terc.-buti1ico (1: 1) e 1iofi1iza-se. 0 liofilizado fracamente amarelado, que cristaliza em 20 ml de terc.-butanol, dá origem ao sal (IA) sob a forma de pó branco.

Exemplo 3: 4-(2,4-dimetoxibenzoi1)-fenoximeti1-poli-estireno (reticulação com 1% de DVB/divinilbenzenoj (2))

20,0 g de clorometi1-poli-estireno, com 1% de DVB (divinilbenzeno) (=Merrifield Polymer Fluka, Suíça. 0,67 mmole de Cl/g (13,4 mmoles) são secos durante 1 hora, a 50°C, num alto vácuo. 26,1 g (IA) (67 mmoles) são suspensos (3 vezes em cerca de 500 ml de piridina, de cada vez, e são concentrados, por evaporação, num alto vácuo. 0 resíduo é dissolvido em cerca de 700 ml de DMF anidro e é concentrada para um volume de cerca de 400 ml, num alto vácuo. Adiciona-se a resina e agita-se a mistura reaccional, ao

abrigo da humidade, durante 20 horas, à temperatura ambiente. Filtra-se a resina e lava-se com porções de 100 ml dos seguintes dissolventes: álcool isopropilico (3vezes), DMF (3 x), água (3 x), DMF (3 x), água (5 x), álcool isopropilico (4 x). Seca-se a resina, num alto vácuo, a 40-45°C, até o peso permanecer constante. 0 espectro do IV apresenta a banda de C=0 esperada.

Exemplo 4:

4-(2,4-dimetoxifeni1-hidroxi-meti1)-fenoximetil-poli-estireno/poli-estireno de dimetoxiben- zidriloximetilo, 'resina de hidroxi'7 (3)

Faz-se reagir uma suspensão de 7,07 g (2) (cerca de 4,8 mmoles em termos de função cetónica), em 50 ml de THF seco, com 14,5 ml de borohidreto de lítio 1M, em THF, e aquece-se a mistura reaccional, ao refluxo, durante 1 hora, ao abrigo da humidade.

DEpois do arrefecimento até cerca de 0-5°C, adiciona-se a mistura, a 24 ml de metanol e, gota a gota, e sob misturação enérgica, a cerca de 6 ml de acetona. A resina filtrada é lavada com porções de 30 ml do dissolvente, da seguinte forma: metanol (3 x), água (1 x), ácido clorídrico aquoso (1 x, pH = cerca de 3,0), água (2 x), metanol (4 x). Seca-se a resina, num alto vácuo, a 40-45°C, até o peso permanecer constante.Análise elementar:

3,67 % de 0 = 2,31 mmoles de 0/g; espectro de IV: ausência de banda de C=0.

Exemplo 5: N-ZFmoc-ProZ-4-(2,4-dimetoxifenilaminometi1)fenoximeti1-poli-estireno/resina de Fmoc-Pro-aminoZ (4)

Uma mistura de 0,46 g (3) (cerca de

0,26 mmole), 0,31 g de Fmoc-Pro-Nl·^ (0,92 mmole), 76,5 ju 1 de solução 1M de ácido benzenossulfónico, em diclorometano (76,5 /imoles) e 10 ml de dioxano, é agitada durante 3 horas e, após adição de mais 76,5 /ul da solução 1M de ácido benzenossulfónico, ainda durante 20 horas, a 50°C.Filtra-se a resina e purifica-se da seguinte forma, com utilização de respectivamente porções de 5 ml dos dissolventes: metanol (5 x), diclorometano (12 x), metanol (3 x), diclorometano (3 x).Seca-se a resina no alto vácuo, a 40-45°C, até o peso ficar constante.

Numa amostra rigorosamente pesada, de cerca de 20 mg, separa-se o grupo Fmoc mediante tratamento (4 x, durante 2 minutos,) com 300 μ 1 de piperidina, a 20%, e lavagem (6 x) com dimetilacetamida (DMA). A determinação por meio de fotoespectrometria (a 300 nm) revela uma carga (concentração) de 0,23 mmole de Fmoc por g/resina.

Exemplo 6: N-ZBoc-Pro-Glu(0But)-Ile-Pro7-resina de amino(5)

Mediante um dispositivo automático para a síntese de péptidos, 0,42 g (4) (97 mmoles) são submetidos ao seguinte processo caracterizado pela separação alternada, sucessiva, do grupo Fmoc e condensação (acoplamento) de Fmoc-Ue, Fmoc-Glu(OBut) e Boc-Pro, sob bloqueio correspondente dos grupos amino que não reagiram, mediante acetilação, dando origem à formação do composto em epígrafe (5).

Operações individuais:

Lavagem e separação(desbloqueamento) de

Fmoc, â temperatura ambiente com cerca de 10 ml, em cada caso, dos seguintes compostos: álcool isopropilico (1 x), (4 minutos), DMA desgaseifiçada (4 x, 0,5 minutos), álcool iscpropilico (1 χ, 1 minuto), DMA desgaseifiçada (3 x, 0,5 minuto), piperidina, a 20% (4 x, 2 minutos, em DMA), água-dioxano (2 χ, 1 : 1, 1 minuto), DMA desgaseifiçada (5 x, 0,5 minuto), DMA desgaseifiçada (3 x, 0,5 minuto).

Acoplamento:

0,39 mmole de amino-âcido N-protegido, 0,68 ml de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) 0,57 M, em DMA (0,39 mmole) e 0,18 ml de diciclohexiIcarbodiimida (DCCI) 2,4M, em DMA, com adição de 0,20 ml de DMA (20 minutos, â temperatura ambiente, 2 horas, a 40°C).

Lavagem e acetiIação dos restantes grupos amino livres, com: acetanidrido-piridina-DMA (1 x, 5 minutos; 1:1: 8, em volume), DMA desgaseificada (3 x), álcool isopropilico (1 χ, 1 minuto), DMA desgaseificada (3 x, 0,5 minuto).

Lava-se a resina com álcool isopropilico (3 x, 5 ml) e seca-se, num alto vácuo, à temperatura am biente.

Exemplo 7: H-Pro-Glu-Ile-Pro-NH₂

0,46 g (5) (cerca de 90 umoles) são agitados numa mistura de ácido trifluoroacético/diclorometano (1:1, em volume), durante 15 minutos, à temperatura ambiente; separa-se a resina por filtração e lava-se (3 x) com cerca de 10 ml de diclorometano, de cada vez. Num vácuo, o filtrado é concentrado para cerca de 2 ml, e, sob agitação, é gotejado para 10 ml de êter.Separa-se o precipitado, por filtração, e seca-se num vácuo. 0 pó incolor, assim obtido, é idêntico a uma tetrapeptidamida autêntica, preparada em solução,de acordo com os resultados da cromatografia em camada fina e HPLC.

Exemplo 8: O-fFmoc-GliJ-resina de hidroxi(6)

2,0 g (3)(cerca de 1 mmole), 1,19 g de Fmoc-Gli-0H (4 mmoles) e 0,87 g de DCCI (4,2 mmoles) são agitados, em 20 ml de 1,2-etano-dicloreto (EDC), durante 5 minutos, a 0-5°C; em seguida, faz-se reagir a mistura com 24 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,2 mmoles) e, passados mais 20 minutos, a cerca de 5°C, com 110 pl de N-metiImorfolina (1 mmole).Agita-se a mistura resultante, durante 4 horas, à temperatura ambiente. A resina separada por filtração, num dispositivo para a preparação de péptidos 'sintéticos' (peptidesinthesizer), é lavada com 20 ml, respectivamente,dos seguintes dissolventes: metanol (3 x), EDC(3 x), DMA(3 x) (em cada caso, durante 0,5 minuto).Para bloquear(proteger)os grupos hidroxi ainda presentes na resina, agita-se a resina,durante 2 horas, à temperatura ambiente,com 1,23 g de anidrido de ácido benzoico(5,4 mmoles),em 1,2 ml de piridina e 6 ml de DMA, em seguida, lava-se da seguinte maneira: com 20 ml (em cada caso) de álcool isopropilico (2 x).DMA desgaseificada (3 x), álcool isopropilico (2 x), EDC (6 x), álcool isopropilico (2 x), DMA desgaseifiçada (3 x), álcool isopro

pilico (3 x), (em cada caso, durante 0,5 minuto).0 composto em epígrafe, seco num alto vácuo, a 45°C,(composto 6) apresein ta um título (teor) de Fmoc de 0,26 mmole/g.

Exemplo 9: 0-/(Fmoc-p-Ala7-resina de hidroxi(7)

Prepara-se o composto em epígrafe (7) analogamente ao processo para a síntese do composto (6). 0 composto (7) apresenta um teor em Fmoc de 0,33 mmole/g.

Exemplo 10: Resina de hidroxi de 0-7Fmoc-Leu-Pro-Glu(0But)-Gli-Ser(But)-Pro-Val-Tre(But)-Leu-Asp(OBut)-Leu-Arg(Mtr)-Tir(But)-Asn-Arg(Mtr)-Val-Arg (Mtr)-Val-)3-Ala.7(Fragmento de egl ina,protegido _ — nas cadeias laterais, Z^-AIa J-eglina 0(37-55)nonadecapêptido, ligado â resina de hidroxi(8)

Num dispositivo automático para a síntese peptidica, fazem-se reagir, 1,10 g (7) (0,36 mmoles),obtido no exemplo 9,procedendo-se às operações de lavagem e de separação de Fmoc,em analogia com os processos do exemplo.Procede-se ao acoplamento dos amino-ácidos 10 a 18 (isto é, os amino-ácidos 46-54 da eglina C),sob a forma do éster 2,4,5-triclorofenil ico (1,08 mmoles),em 1,8 ml de DMA, com adição de 1,89 ml de HOBt, 0,57M,(l,08 mmoles),e 0,285M de diisopropiletilamina (0,54 mmoles),em DMA, durante 2 horas,à temperatura ambiente. Repete-se este procedimento com os amino-ácidos 11, 12,16 e 18(isto é, os amino-ácidos 47,48, 52 e 54 da eglina

C). Para fins do seu acoplamento, os aminoácidos 1 a 9b(isto é, 37 a 45 da eglina C) são utilizados sob a forma de anidridos simétricos (1,08 mmoles): 2,16 mmoles de Fmoc-amino-ácido são dissolvidos em 10 ml de diclorometano (no caso de Fmoc-Gli-0H, com adição de 1 ml de DMA), faz-se reagir, à temperatura ambiente, com 245 mg de DCCI (1,12 mmoles), sob agitação, mantém-se a mistura reaccional à tempera-34-

tura ambiente, durante 15 minutos, separa-se, por filtração, a diciclohexilureia precipitada, adiciona-se ao filtrado

2,5 ml de DMA(dest.) e remove-se o diclorometano num vácuo. Esta mistura é adicionada â resina de síntese e, apôs adição de 58 μ 1 de di isopropi Ieti lamina (0,36 mmoles), mantém-se a mistura resultante à temperatura ambiente, durante 1 hora. Terminada a síntese e após remoção do grupo Fmoc terminal (segundo o processo do exemplo 5), lava-se a resina (3 x) com 5 ml de álcool isopropi1ico, de cada vez, e seca-se, num alto vácuo, à temperatura ambiente.

Exemplo 11: /^-Ala^^J-eglina C(37-55)-nonadecapéptido,com protecção de cadeias laterais

1,55 g (8) (cerca de 83 umoles) (exemplo 10) são agitados com 20 ml de diclorometano-âcido acético (9: 1, em volume), durante 1,5 horas, à temperatura ambiente; separa-se a resina, por filtração, e lava-se com 10 ml dos seguintes dissolventes, da seguinte maneira:diclorometano (3 x), metanol (4 x), diclorometano (4 x). 0 filtrado original é reunido com as águas de lavagem e é concentrado, num vácuo; faz-se reagir o resíduo resultante com cerca de 5 ml de ácido acético e 1iofi1iza-se, até â secagem.Obtém-se o composto em epígrafe sob a forma de um pô incolor remanescente.

HPLC, nuam coluna de Nucleosil ^{5 C}18’ 25 x 4,6 mm, gradiente: 100% de A/0 % de B~>0% de A/100% de B, durante 60 minutos, com A = água, 0,1% TFA, B = acetonitrilo, a 0,1% TFA, tempo de retenção: 52 minutos.

HPLC preparativa: 10 mg do produto são dissolvidos em 500 pl de trifluoroetano/acetonitrilo( 1:1), são separados com o gradiente indicado, na referida coluna; colhem-se as fracções principais e concentram-se, por evapo-35-

ração. Obtêm-se, desta forma, 6,8 mg de produto que, de acordo com a HPLC, contém mais de 90% do composto em epígrafe.

Exemplo 12: 0-£rmoc-Asp(OBut)-Arg(Mtr)-Gli-Fe-Tir(But)-FeSer(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ala-Ser(But)-Arg(Mtr)-Val-Ser(But)-Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-Ser(But)-Arg(Mtr)-Gli7-resina de hidroxi (IGF-2 (23-41)-nonadecapéptido protegido nas cadeias laterais, ligado â resina de hidroxi), (9)

Num dispositivo para a preparação automatizada de péptidos, fazem-se reagir 1,20 g (6) (0,31 mmoles) do exemplo 8, através das operações de lavagem e separação de Fmoc, analogamente ao processo do exemplo 6. Todos os amino-âcidos são utilizados, para fins de acoplamento (1 hora), sob a forma de anidridos simétricos (3 equivalentes, preparação tal como se indica no exemplo 10).Repete-se o processo de acoplamento com os amino-âcidos 14, 17 e 18(isto ê, amino-âcidos 36,39 e 40 de IGF-2) (1 hora). Terminada a síntese, a resina é lavada (3 x) com 5 ml de álcool ísopropilico, de cada vez, e é seca num alto vácuo.

Exemplo 13: Fmoc-Asp(OBut)-Arg(Mtr)-G1i-Fe-Tir(But)-Fe-Ser (But)-Arg(Mtr)-Pro-Ala-Ser(But)-Arg(Mtr)-Val-Ser(But)-Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-Ser(But)-Arg(Mtr)-Glí-OH (IGF-2(23-41)-nonadecapêptido protegido com Fmoc) exemplo 12 do exemplo (9 : 1, em lor. Para

1,65 g (9) (cerca de 154 ^umoles) do são lavados e separados (análogamente ao processo 11) com 33 ml ώ diclorometano-âcido acético volume). Apôs a liofilização obtêm-se um pó incoa purificação, este produto é distribuído, num dis-36-

positivo automático de distribuição em contra-corrente, (5 ml/fase) com uma mistura de metanol/água/clorofórmio/tetracloreto de carbono (2700 : 675 : 900 : 1575), em 1050 andares. As fracções 46 - 75 contêm o composto puro (segundo DC, HPLC) e são concentradas, por evaporação; o resíduo ê triturado com éter e separado, por filtração. Segundo DC (4 sistemas, em silicagel) e HPLC (sistema tal como no exemplo 11; tempo de retenção : 57 minutos), o pó incolor obtido apresenta estrutura uniforme. FAB-MS (espectro de massas por bombardeamento acelarado de átomos):pico de massas correcto (2480).

Exemplo 14: Fmoc-resina de amino(lO) e resina de amino£4-(2,4dimetoxifeni 1 -amino-meti 1) - fenoximeti 1-pol iest irgitf

Suspendem-se 4,1 g da resina de hidroxi (3) (cerca de 1,89 mmoles) em 80 ml de dioxano. Adicionam-se 1,35 g de carbamato de 9-fluorenilmetilo (5,65 mmoles) (preparado segundo Carpino, L.A. et al., J. Org. Chem. 48, 661 (1983)) e 0,47 ml de ácido benzenossulfónico 1M, em 1,2-etano-dicloreto (EDC) (0,47 mmoles), e mantém-se a mistura a 50°C, durante 3 horas. Apôs adição de mais 0,47 ml de ácido benzenossulfônico 1M, a mistura continua a reagir durante mais 17 horas, a 50°C. Filtra-se a resina e lava-se com porções de 30 ml dos seguintes dissolventes: álcool isopropilico (3 x), EDC (3 x), dimetilacetamida (DMA, 1 x), álcool isopropilico (6 x), DMA (3 x). Em seguida, para bloquear os grupos hidroxi ainda livres, a resina é misturada com 5,0 g de anidrido benzoico, em 25 ml de DMA e 5 ml de piridina, durante 2 horas, à temperatura ambiente; lava-se da maneira atrás mencionada. A última lavagem realiza-se com álcool isopropilico (6 x). Em seguida, a resina de amino protegida com Fmoc, assim obtida, (10), é seca, num alto vácuo, até o peso se manter constante. 0 doseamento de Fmoc por espectrofotometria, após a clivagem de uma amostra, em analogia com o exemplo 5, revela uma carga especifica de cerca de 0,35 mmoles de Fmoc/g

de resina.

Para a preparação da resina de amino livre, 2,0 g de resina de amino-Fmoc (10) são agitados em 30 ml de piperidina, a 20% em dimetilacetamida (DMA), durante 1 hora, à temperatura ambiente; em seguida, filtra-se, trata-se mais uma vez com 30 ml de piperidina a 20%, em DMA, durante 1 hora, e lava-se com porções de 30 ml dos seguintes dissolventes: DMA (3 x), álcool isopropilico (3 x), DMA (3 x), álcool isopropilico (6 x). Seca-se a resina num alto vácuo, até o peso se manter constante.

Exemplo 15:

N-/Met-Hi s(Trt)-Glu(OBut)-G1i-Asp(OBut)-Glu(OBut)Gli-Pro-Gli7-resina de amino, (11)

Fazem-se reagir, num dispositivo para a síntese automática de péptidos, 0,50 g de resina de amino-Fmoc (10) (cerca de 175 umoles) do exemplo 14, mediante o seguinte processo, por separação do grupo Fmoc e condensação de Fmoc-Gli, Fmoc-Pro, Fmoc-Gli, Fmoc-Glu(OBut), Fmoc-Asp(OBut), Fmoc-Gli, Fmoc-Glu(OBut), Fmoc-His(Trt) e Fmoc-Met, num esquema sucessivo e alternado, com bloqueio dos agrupos amino ainda livres, mediante acetilação:

Lavagem e separação (desb1oqueamento) de Fmoc, à temperatura ambiente, com cerca de 10 ml de: álcool isopropilico (1 χ), (1 minuto), DMA desgaseifiçada (4 x) (0,5 minuto), piperidina a 20%, em DMA (6 x, 2 minutos), DMA desgaseifiçada (2 x, 0,5 minuto), álcool isopropilico (1 χ, 1 minuto), DMA desgaseifiçada (4 x, 0,5 minuto), DMA destilada (3 x, 0,5 minuto).

Acop1amento: 0,52 mmoles de éster de

2,4,5-triclorofenilo de amino-âcido protegido e 0,92 ml de 1-hidroxibenzotriazole 0,57 M (H0Bt)/0,75M diisopropiletilamina, em DMA(0,52 mmoles), sob adição de 0,88 ml de DMA (30 minutos, â temperatura ambiente).

Lavagem e acetilação dos restantes grupos amino livres com: acetanidrido-piridina-DMA (Ix, 1 :1 : 8, em volume) (5 minutos), DMA desgaseifiçada (3 x, 0,5 minuto), álcool isopropilico (1 x, 1 minuto), DMA desgaseifiçada (3 x, 0,5 minuto).

A separação do grupo terminal Fmoc realiza-se tal como atrás se indica. A resina é lavada com álcool isopropilico e é seca num alto vácuo, à temperatura ambiente.

Exemplo 16:

Met-His-Glu-Gli-Asp-Glu-Gli-Pro-Gli-NHg ( ¹ MIF-re·lated protein 14 (94-102-amida)

0,65 g (11) (cerca de 150 mmoles) do exemplo 15 são lavados numa coluna, durante 60 minutos, com cerca de 30 ml de ácido trifluoroacêtico a 2% (TFA), em diclorometano; o eluato é concentrado, num vácuo, para cerca de 0,3 ml, junta-se 1 ml de TFA-água (95 : 5, em volume) e, para separação total dos grupos protectores, deixa-se em repouso durante 15 minutos, à temperatura ambiente. A peptidamida ê precipitada pela adição de 5 ml de éter diisopropi1ico. 0 precipitado é separado, por filtração, e é seco num vácuo. 0 produto obtido é dissolvido em 5 ml de água, elimina-se os materiais turvos por centrifigação e liofiliza-se o material que sobrenada. Obtém-se um pó incolor que, de acordo com HPLC, contém mais de 90% do composto em qoígrafe.

HPLC: terpo de retenção: 6,8 minutos,

coluna Nucleosil 70|θ, 120 x 4,6 mm, gradiente: 100 % de A/0% de B-710% de A/90% de B, em 30 minutos, com A = TFA a 0,1%/ /água, B = TFA a ^θ,1%/acetonitrilo, 1,5 ml/min. detecçao a 215 nm.

FAB-MS: Pico de massas: 927 (M+H⁺).

Exemplo 17: 0-ÓFmoc-Ala-Tir(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ser(But)-Glu (OBut)-Tre(But)-Leu-Cis(Trt)-Gli-Gli-Glu(QBut)-Leu-Val-Asp(OBut)-Tre(But)-Leu-Gln-Fe-Val-Cis (SBut)-Gl i-Z-resina de hidroxi (IGF-2 (1-22)-docosa-pêptido, ligado â resina de hidroxí),(12

Num dispositivo para a síntese automática de péptidos, 1,00 g de 0-Z.Fmoc-Gl iZ-res ina de hidroxi (6) (cerca de 0,36 mmoles) é tratado análogamente ao processo do exemplo 15 e submetido ³âs operações de lavagem e separação de Fmoc.

Acop1amento: Procede-se ao acoplamento de Vai, Gin, Gli, Leu e Arg soba forma do éster 2,4,5-triclorofeni1ico de amino-ácidos-Fmoc (0,72 mmoles), em 1,20 ml de DMA, juntamente com 1,44 ml de 0,5M H0Bt/0,5M diisopropiletilamina, em DMA, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Os restantes derivados de amino-âcidos são acoplados sob a forma de anidridos simétricos (1,08 mmoles) (preparação segundo o processo do exemplo 10), durante 1 hora, à temperatura ambiente. Repete-se esta operação (acoplamento posterior) com os amino-ácidos 3,8, 10, 11, 18, 20 e 21.

Após a síntese, lava-se a resina com álcool isopropilico (5 x), ccnservando o grupo Fmoc terminal, e seca-se num alto vácuo.

Exemplo 18: Fmoc-Ala-Tir(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ser(But)-Glu (OBut)Tre(But)-Leu-Cis(Trt)-Gli-Gli-Glu(OBut)-Leu-Val-Asp(OBut)-Tre(But)-Leu-Gln-Fe-Val-Cis(SBut)-Gli-OH- IGF-2 (l-22)-docosapéptido protegido nas cadeias laterais)

Fazem-se reagir 1,80 g (12) (cerca de 0,19 mmoles) do exemplo 17 com 35 ml de diclorometano/ácido acético (9 : 1, em volume), durante 1,5 horas, à temperatura ambiente. Separa-se a resina, por filtração, e extrai-se o fragmento pouco solúvel, a 60°C, da seguinte maneira: dimetilsulfóxido (DMSO, 3 x, 50 ml), trifluoroetanol/diclorometano (3 x, 1:1, em volume), N-meti1-pirrolidona-DMSO (1 x, 8 : 2, em volume). Os filtrados reunidos são concentrados, por evaporação, num alto vácuo, e o residuo é agitado com 5 ml de água-metanol (5 : 95, em volume), a 50°C, durante 1 hora. Separa-se, por filtração, o material que não dissolveu e seca-se, num alto vácuo, à temperatura ambiente. 0 fragmento muito dificilmente solúvel não pode ser caracterizado por meio de análise de HPLC. DC (2 sistemas): 0 produto final apresenta uma pureza superior a 90% (dissolvido em DMSO-N-meti1-pirrolidona (2 : 8)).

FAB-MS: Pico de massas 3539(M+Na⁺)

Exemplo 19:

0-£Fmoc-Ala-Tir(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ser(But)-Glu (0But)-Tre(But)-Leu-Cis(Trt)-GIiJ-resina de hidroxi (IGF-2 (l-10)-undecapéptido, protegido nas cadeias laterais, e ligado à resina de hidroxi), (13)

Faz-se reagir 1,00 g de 0-Z'FmocGliJ-resina de hidroxi (6) (cerca de 0,36 mmoles), nim

' peptid-synthesizer¹ através das operações de lavagem e de separação de Fmoc, em analogia com o exemplo 15.

Acoplamento: Os derivados de amino-ácidos são acoplados durante 1 hora, à temperatura ambiente sob a forma de anidridos simétricos (1,08 mmoles) (preparação análoga à do exemplo 10). Repete-se o processo de acoplamento com 2 equivalentes de éster 2,4,5-triclorofenilico, no caso dos amino-ácidos 3, 8 e 9. Apôs a conclusão da síntese, a resina é lavada com álcool isopropilico (5 x), sob manutenção do grupo Fmoc terminal, e é seca num alto vácuo.

Exemplo 20: Fmoc-Ala-Tir(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ser(But)-Glu (OBut)Tre(but)-Leu-Cis(Trt)-Gli- (IGF-2 (1-10)-undecapéptido, protegido nas cadeias laterais)

Faz-se reagir 1,50 g (13) (cerca de 0,19 mmoles) do exemplo 19, com 30 ml de diclorometano/ácido acético (9 : 1, em volume) durante 1,5 horas, à temperatura ambiente. Separa-se a resina por filtração, concentra-se o filtrado num vácuo e liofiliza-se num alto vácuo. 0 pó incolor, assim obtido, é distribuído, para a sua purificação, com a mesma mistura que a utilizada no exemplo 13, em 1330 andares, num dispositivo de distribuição em contra-corrente automático (5 ml/fase). As fracções 65 - 111 contêm o composto final puro (DC, HPLC) e são concentradas, por evaporação. 0 residuo é triturado com éter e separado, por filtração. De acordo com a DC (5 sistemas, em silica-gel) e HPLC, o pó incolor é uniforme.

Tempo de retenção = 24,1 minutos.., coluna = Necleosil 5C_1Q,

4,6 x 250 mm, gradiente = 50 % de A/50 % de B fO⁰/ de A/100% de B, em 30 minutos, com A = TFA a 0,1%/água, B = TFA a 0,1%/acetonitrilo, 1,0 ml/min., detecção a 215 nm.

Exemplo 21:

0-/7Asn-Fe-Fe-D-Trp-Lis(Boc)-Tre-(But)-Fe-Gaba/-resina de hidroxi (somatostatin-D-Trp(8)áéido 4-amino-butirico(12-(5-12)-octapéptido, protegido nas cadeias laterais, ligado ã resina de hidroxi), (14).

Faz-se reagir 1,00 g de 0-Z.Fmoc-GabaJ-resina de hidroxi(preparada analogamente ao processo do exem pio 8, com ácido 4-amino-butirico em vez de glicina) (cerca de 0,31 mmoles), num ¹peptid-synthesizer, através das operações de lavagem e de separação de Fmoc, em analogia com o processo do exemplo 15.

Acoplamento: Os derivados de amino-ácidos são acoplados sob a forma de anidridos simétricos (0,93 mmoles) (preparação em analogia com o exemplo 10) durante 1 hora, à temperatura ambiente. Os amino-ácidos Fe e Asn são acoplados sob a forma do éster 2,4,5-triclorofenilico (2 equivalentes). Com o amino-ácido 1 (Asn) procede-se a uma acoplamento posterior. DEpois da conclusão da síntese e apôs separação do grupo Fmoc terminal, lava-se a resina com álcool isopropilico (5 x) e seca-se num alto vácuo.

Exemplo 22:

H-Asn-Fe-Fe-D-TRp-Lis(Boc)-Tre(But)-Fe-Gaba-OH (somatostatin-D-Trep(8)-ácido 4-amino-butirico(12)-(5-12)-octapéptido, protegido nas cadeias laterais).

Faz-se reagir 1,38 g (14) (cerca de 0,26 mmoles) do exemplo 21 com 5 ml de cloridrato de piridinio, a 5%, em DMA, durante 1 hora, a 50°C. Separa-se a resina por filtração e lava-se com DMSO, concentra-se o filtrado num alto vácuo e liofiliza-se (1 x) a partir de DMSO e

(2 x) a partir de terc.-butanol. 0 pó incolor, assim obtido, é um produto puro segundo as indicações da HPLC (pureza = superior a 95%) e, de acordo com HPLC e DC, ê idêntico a uma amostra autêntica, que tinha sido preparada mediante síntese em fase liquida.

HPLC: tempo de retenção = 20,6 minutos, coluna = Nucleosil 5Cjg, 4,6 x 250 mm, gradiente = = 100% de A/0 % de B -^10% de A/90% de B, em 30 minutos: A = =TFA a 0,1%/água, B = TFA a 0,1%/acetonitri lo, 1,0 ml/minuto, detecção a 215 nm.

-44R Ε I VINDICAÇOES l^â. - Processo para a prepara ção de uma resina sintética à base de um poli-estireno utilizável como suporte para a síntese peptídica, em fase solida, reticulado com 0-5%, em percentagem molar, de divinilbenzeno, e que nos aneis benzenicos da sua estrutura de base está substituído pelos grupos de formula

OR (I), em que

X representa -0- ou -NH- e R representa C^-C^-alquilo, caracterizado por se fazer reagir, sucessivamente, um poliestireno utilizável como suporte para a sintese peptídica, em fase solida, reticulado com 0-5% de divinilbenzeno, e substituído, nos aneis benzenicos da estrutura de base, por bromometilo ou clorometilo, com

a) um composto de formula

RO, (II),

em que

M representa um metal alcalino e R tem o significado atrás defenido,

b) um agente redutor, e caso X represente -NH-,

c) um reagente capaz de introduzir o grupo amino.

Claims (2)

2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar poli-estireno reticulado com 1 a 2% de diviniIbenzeno. 3â. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se realizar a reacção com um composto de formula II, em que M representa césio. 43. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se reduzir na etapa b), por meio de um hidreto complexo ou diborano. 5â.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se realizar a reacção com um composto de formula II, em que R representa metilo. 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar uma resina sintética, em que, na formula I, X representa -0- e R representa metilo. 73. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar uma resina sintética em que na formula I, X representa -NH- e R representa meti lo. 83. - Processo para a preparação de péptidos e amidas peptidicas, caracterizado por se utilizar uma resina sintética, definida na reivindicação 1, como suporte para a síntese em fase solida. 93.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se preparar péptidos ou amidas peptidicas, protegidos no radical aminoácido terminal-N e/ou em outros grupos funcionais eventualmente presentes. 103. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 ou 9, caracterizado por a) se fazer reagir a resina sintética com um composto de fórmula W^-AM^-Y-H, em que Y representa -0- ou -NH-, representa um grupo protector de amino terminal-N e AM^ represer^ ta o radical acilo de uma sequência de amino-ácidos, eventualmente protegida nos grupos funcionais, constituída por 1 a 25 radicais aminoécidos, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos, com o fim de fixar o radical W^AM1- ao grupo -Xda referida resina, b) se separar W1 como grupo protector de amino terminal-N, c) se acilar o grupo amino terminal-N livre por reacção 2 2 2 2 com um acido de formula W -AM -OH, em que W. e AM têm significados analogos aos dos radicais Wx e AM , atras definidos, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos, d) se repetir a operação de separação alternada segundo b) e da acilação seguido c), as vezes necessárias para se obter uma sequencia de amino-ácidos desejada e, e) se separar o péptido ou amida peptídica da resina, eventualmente após prévia separação ou separação simultânea de grupos protectores, mediante acidólise. llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se utilizar um grupo protec1 2 tor de amino W ou W , separavel em condições básicas, para a protecção do grupo amino terminal-N, e se realizar a separa_ ção de acordo com a etapa b), mediante uma base. 12?. _ Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se utilizar como grupo ami1 2 no-protector Wou W , separável em condições básicas, o grupo 9-fluoronilmetaoxicarbonilo (Fmoc). 133. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizado por se fazer reagir, no âmbito da etapa a), uma resina sintética, em que X representa -0-, com um ácido de formula >;P-AM^-0H, em que e AM^ têm os significados referidos na reivindicação 11, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos, e se separar o produto final sob a forma de acido. 14â. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizado por se fazer reagir, no âmbito da etapa a) uma resina sintética, emque X representa -0-, coffi uma amida de formula l^-AM^-NH2, em que e AM^· têm os significados mencionados na reivindicação 11, e se separar o produto final sob a forma de uma amida peptídica (peptidamida). 15â. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizado por se fazer reagir, no âmbito da etapa a), uma resina sintética, 1 1 em que X representa -NH- com um acido de formula W -AM -0H, em que W1 e AM' têm os significados indicados na reivindica* ção 11, ou com um dos seus derivados funcionais, e se separar o produto final sob a forma de uma peptidamida. 16â. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 ou 9, caracterizado por os peptidos ou peptidamidas conterem 2 a 180 radicais de amino-ácidos. 17â. - Processo para a preparação de uma resina sintética cpe apresenta a estrutura definida na reivindicação 1, e que, em vez do grupo -X-H, contem o grupo -X-AM-W ou -X-AM-H, em que -X-representa -0- ou -NH-, W representa um grupo protector de amino-terminal-N e Am representa um radical acilo de uma sequência de amino-ácidos constituída de 1 a 180 radicais de amino-ácidos, e cujos grupos funcionais estão eventualmente protegidos, caracterizado por a) se fazer reagir uma resina sintética definida na reivin-

1 1 dicação 1, com um composto de formula W -AM -Y-H, em que Y representa -0- ou -NH-, W¹ significa um grupo protector de amino terminal-H e AM¹ representa o radical acilo de uma sequencia de amino-ácidos constituída por 1. a 25 radicais amino-ácidos, cujos grupos funcionais, estão eventualmente protegidos, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos, com o fim de fixar o radical W^AM¹ ao grupo -X- da referida resina, e, eventualmente,

b) se separar o grupo protector de amino termina 1-N,W¹ e, eventualmente,

c) se acilar o grupo amino terminal-N livre, mediante reac-

2 2 2 2 ção com um acido de formula W -AM -OH, em que W e AM têm significados análogos aos indicados em relação aos radicais W¹ e AM¹, atrás definidos, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos, e

-49d) se repetir a operação da separação alternada de acordo com a etapa b) e da acilação de acordo com a etapa c), as vezes necessárias para se obter a desejada sequência de aminoácidos.

18^â. - Processo para a preparação de uma resina sintética com a estrutura descrita na reivindicação 1, que, em vez do grupo -X-H, contem o grupo -NH-W, em que W representa um grupo protector de amino terminal-N, caracterizado por se fazer reagir uma resina sintética defini da na reivindicação 1, com um composto de formula W-NH₂, em que W tem o significado atrás mencionado, ou com um dos seus derivados funcionais, reactivos com o fim de fixar o radical W-NH- ao grupo -X- da referida resina.