PT87597B

PT87597B - Processo para a incorporacao de genes com sensibilidade a farmacos

Info

Publication number: PT87597B
Application number: PT87597A
Authority: PT
Inventors: Stephen Barnard Howell; Inder Verma
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1992-09-30
Also published as: AU618749B2; GB8712528D0; PT87597A; IL86532A0; EP0386002A1; WO1988009383A1; AU2125388A; EP0293193A2; JPH02503512A; ZA883804B; EP0293193A3; FI894851A0; DK34489A; EP0386002A4; NZ224802A; FI894851A7; DK34489D0

Description

CLAYTON FOUNDATION FOR RESEARCH

PROCESSO PARA A INCORPORAÇÃO DE GENES COM SENSIBILIDADE A FÁRMACOS

Campo da invenção

A presente invenção descreve de um modo geral a inserçSo de genes de sensibilidade aos fármacos em tecidos de tumores de mamíferos que perderam a sua sensibilidade a fármacps anti-neoplásicos, Mais particularmente a presente in vençSo refere-se à inserção de enzimas anabólicos cuja função foi perdida na população de células tumorais. A inserção é ob tida utilizando-se vectores retrovirais.

Antecedentes da invenção desenvolvimento da resistência aos fármacos é um problema comum do tratamento das doenças malignas. Infelizmente, as células que inicialmente sâo sensíveis aos fármacos anti-cancro frequentemente adquirem resistência a ejs tes. Este facto limita de um modo grave o sucesso da quimiot£ rapia. Nalguns tipos de células a resistência pode ser atribuída à perda de uma enzima necessário para a activação do fármaco anti-neoplásico. Genes que codificam para enzimas ana bélicos críticos, são, na realidade, genes sensíveis aos fármacos. A perda mutacional da função destes genes potencialmen te pode ser corrigida por transferência de genes. Por inserção do gene substituinte na população de células tumorais, po.

f .** de ser possível restaurar a sensibilidade aos fármacos anti-neoplásicos.

Vectores retrovirais de replicaçâo incompleta têm sido utilizados na tentativa para introduzir novo material genético nas células de mamíferos, especificamente, esta via tem sido utilizada para transferir o gene da hipoxantina-guanina fosforibossiltransferase humana (HGPRT) para células de medula óssea humana e murina e para linfocitos. Este trabalho tem sido dirigido para terapêutica de genes de células somáticas relativarnente a doenças hereditárias.

Existe uma série de vantagens na utilização de vectores retrovirais para a transferência de informação ge nética para células humanas. Uma vez que o processo de transferência genética é muito eficaz, teoricamente, quase todas as células resistentes ao fármaco podem ser transformadas para um estado dè sensibilidade a este e o gene estranho pode ser inserido com uma estrutura definida. Finalmente, os genes inseridos podem ser suficientemente estáveis após inserção na célula, permitindo matar as células tumorais por subsequente administração de agentes quimioterapêuticos adequados.

A 6-tiogúanina é um fármaco frequentemente utilizado no tratamento de leucemia humana. Antes da 6-tiogua nina exercer o seu efeito citotóxico esta deve converter-se por HGPRT em 6-tioguanosina monofosfato. Aproximadamente 7% das leucemias humanas resistentes a tiopurinas apresentam uma deficiência grave em lupoxantina-guanina fosforibosiltransferase humana. Além disso, 14% de todos os casos resistentes exi. hem uma perda parcial da actividade da hipoxantina guanina _ 3 _ /

C.-z' ί * fosforibosiltransferase humana (HGPRT) . Em tumores experimentais a perda acentuada da actividade de HGPRT tem-se evidenciado como a causa mais comum da insensibilidade à tiopurina.

Aproximadamente 50$ das crianças com leucemia linfoblastia aguda apresenta recidiva a seguir à quimioterapia com antimetabolitos de purina e os doentes com leucemia aguda não-linfocítica apresentam uma taxa de recidiva ainda mais elevada. Uma das causas da resistência a 6-tioguanina clínica nos doentes é uma diminuição da actividade da HGPRT.

A extensão em que esta perda de actividade de HGPRT é a causa principal da resistência aos fármacos nestes doentes ainda não foi bem definida.

A presente invenção proporciona o modelo para superar a resistência aos fármacos no tratamento de doenças malignas humanas proporcionando um método para a inserção de genes de sensibilidade aos fármacos em células tumorais. A terapia do gene de HGPRT pode ser vista como um meio potencial para superar a resistência à 6-tioguanina clínica mediada pela perda de actividade de HGPRT nas células de doentes de leucemia.

Resumo da invenção

Um objectivo da presente invenção consiste num método para sensibilizar células tumorais.

Um outro objectivo da presente invenção é um método para tratar-se células malignas.

Ainda um outro objectivo da presente invenção

- 4 J

consiste no desenvolvimento de um vector de retrovírus para a inserção de um gene sensível aos fármacos em células de mamíferos. Ainda um objectivo da presente invenção consiste no tratamento de leucemia. Assim, para cumprir os objectivos referidos anteriormente, proporciona-se, de acordo com um aspe£ to da presente invenção um método de sensibilização de células tumorais que consiste numa fase de inserção de um gene sensível ao fármaco em células tumorais. Um aspecto da presen te invenção é a inserção do gene para a hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase em células tumorais. No aspecto preferido a fase de inserção é repetida pelo menos uma vez.

Outro aspecto da presente invenção consiste num método de tratamento de células malignas que compreende as fases de inserção de um gene sensível ao fármaco nas referidas células malignas mediante a exposição destas a um retrovírus que inclui o gene sensível ao fármaco e subsequente exposição da célula resultante a um fármaco anti-cancro. Num outro aspecto preferido uma célula de leucemia humana é tratada median te inserção do gene de hipoxan tina-guanina-fosforibosiltransfe. rase e tratamento com 6-tioguanina.

Um outro aspecto da presente invenção consi£ te num retrovírus que incorpora segmentos de DNA que incluem uma repetição do terminal longo 3’ e uma repetição do terminal longo 5' em que as repetições de terminais longos 3’ e 5’ contêm cada uma, pelo menos, um sítio de enzima de restrição e es tão ligadas às extremidades 3’ θ 5' respectivamente; um promotor/indutor e pelo menos um gene sensível ao fármaco em que os segmentos de DNA estão ligados conjuntamente e colocados espa- 5 /

Y .

um gene sensível cialmente de forma a exprimir, pelo menos ao fármaco após inserção na célula alvo.

Num aspecto preferido a composição inclui um promotor de metalotionina curto e o gene da hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase.

Outros objectivos dos aspectos da invenção tornar-se-ão aparentes após a descrição seguinte de aspectos preferidos da presente invenção.

Breve descrição dos desenhos

A Figura IA representa um mapa da estrutura geral de um retrovírus para a inserção de um gene sensível ao fármaco em células de mamíferos.

A figura 1B representa um mapa da LPHAL do provírus de HGPRT, A escala está em pares de quilobares.

A figura 2 representa a percentagem de células negativas de HGPRT sensibilizadas para a 6-tioguanina como uma função de o tempo de exposição ao provírus LPHAL.

A figura 3 representa o efeito da concentração virai na actividade de HGPRT aumentada a seguir à exposição com LPHAL.

A figura 4 representa o efeito do tempo entre a exposição virai e o início da selecção do fármaco na fracção de células negativas de HGPRT sensibilizadas para 6-tioguanina.

A figura 5 representa um histograma da actividade de HGPRT presente em 40 clones de células negativas de

HGPRT escolhidas em meio HAT após exposição a LPHAL

A figura 6A representa a alteração na fracção de células sensibilizadas com 6-tioguanina como uma função do tempo após exposição a LPHAL.

A figura 6B representa a actividade de HGPRT na população celular total como uma função do tempo após exp o, sição a LPHAL.

Descrição detalhada de aspectos preferidos

É facilmente evidente a um técnico nesta matéria que diversas substituições e modificações podem ser feitas na presente invenção aqui descrita sem afastamento do seu âmbito e espírito.

termo gene de sensibilidade é aqui utilizado como um gene para uma enzima ou proteína que quando inseridos numa célula tumoral tornam a célula sensível a agentes quimioterapêuticos. Ainda que o gene de sensibilidade possa ser um constituinte normal de células, é útil porque as células tumorais, nas quais é inserido, perderam habitualmente a função do gene presente normalmente.

Tal como aqui se utiliza o termo promotor refere-se ao sítio no DNA a que se liga a RNA polimerase antes da iniciação da transcrição de um operão. Um indutor é utilizado aqui para referir um gene modificador que actua para induzir a acção de um gene não alélico.

Como aqui se utiliza sítio de enzima de res, trição refere-se a uma sequência no DNA que é sensível à en- 7 .....S donuclease de restrição. Quando a endonuclease de restrição específica é adicionada ao DNA ela cinde o DNA num sítio específico. Existe uma serie de endonucleases que cindem sequências diferentes. Assim, o sítio de enzima de restrição pode ser ad_e quado para cada utilização específica.

Tal como aqui se utilizam as designações célu la tumural, doença maligna e cancro referem-se àqueles neoplasmas e massas anormais de células que resultam duma multiplicação celular excessiva, crescimento ou proliferação e que terminam habitualmente na morte se não forem tratadas.

Um aspecto da presente invenção consiste num método de sensibilização de uma célula tumoral de mamífero que abrange a fase de inserção de um gene de sensibilidade ao fármaco, na referida célula tumoral. Por exemplo, um retrovírus que contenha o gene de hipoxantina-guanina-fosforibosiltransfe. rase humana (HGPRT) pode ser inserido erii células de leucemia.

Um retrovirus que contém o HGPRT humano e um gene de adenosina deaminase humana não expresso foi desenvolvido iniciando-se com a construção de pLPMKL contendo o gene de hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferase humana ligado ao promotor de meta lotionina curto de murganho seguido por o gene de timidina qui nase murino. A repetição de terminal longo 5’ θ derivada do vírus do sarcoma de Maloney e a repetição do terminal longo 3’ é derivada do vírus de leucemia de Maloney. 0 promotor de meta lotionina murino longo ligado ao gene de adenosina desaminase humana foi cortado do plásmídio MAMD em que o gene da adenosina foi inicialmente clonado e inserido no pLPMKL num sítio Eco RI para formar o plásmídio pLPíIAL,

Esta construção contém um sítio único Saci em

-ίc * ciada repetição de terminal longo. Na construção deste plasmídeo executaram-se duas delecções, uma no promotor de metalotionina e outra na região imediatamente a montante da repetição terminal longa 3'. Este último tornou o promotor de metalotionina não funcional e impediu a expressão do gene ABA na construção virai final, 0 diagrama desta construção está representado na figura IA, Foi obtido um vírus auxiliar isento de vírus deficiente na replicação anfotrópica a partir de pLPHAL. Isto envolve a transfecçâo de pLPHAL em células PA12 e recolha do vírus expresso transitoriamente em 48 horas aprc> ximadamente. Este foi utilizado para infectar fibroblastos 3T3 de murganho negativos de HGRPT B77. Estas células foram em seguida escolhidas em meio HAT e diversos clones foram co-transfectados com o vector que incluía deficiência de replicação pPAM e o plasmídeo FR4OO que contém di-hidrofolato redutase. As células co-transfectadas foram escolhidas com 0,2 pm de metorexato e os clones obtidos produziram vírus que foram ensaiados para determinação da concentração do vírus que produziram em células deficientes de HGPRT de ratos 208F em meio HAT, Os sobrenadantes contendo vírus foram titulados e utilizai dos para infecção. Estes foram preparados por repartição num frasco confluente a Ií5, permitindo que se desenvolvam durante cerca de 24 horas, mudando então o meio e recolhendo a fracção sobrenadante 24 horas mais tarde. A fracção sobrenadante foi centrifugada com 1000 x g durante 10 minutos para aglomerar as células não ligadas. Todas as infecções foram realizadas na presença de 4 pg/ml de polibreno.

A figura IB representa um esquema geral de uma construção retroviral que pode ser utilizada para a inserção

-9-/ ί * de genes em células tumorais de mamífero. Neste modelo uma re petição terminal longa encontra-se em ambas as extremidades 5' e 3’. A repetição terminal longa no aspecto preferido contém um sítio de restrição. Além de conter repetições de terminal longo, o retrovirus também contém elementos do promotor/ /indutor. Nesta localização um gene promotor e/ou um gene indutor pode ser inserido para facilitar a expressão dos genes desejados nas células de mamífero. Os genes desejados na presente invenção incluem pelo menos um gene de sensibilidade ao fármaeo. No vector retroviral pode ser inserida uma série de combinações de genes promotores para a expressão de genes de sensibilidade múltipla nas células. Os segmentos de DNA das repetições de terminal longo e genes promotor/indutor e genes de sensibilidade aos fármacos podem ser orientados de modo apropriado. Os fragmentos de DNA, quando ligados, podem ser colocados espacialmente quando o retrovirus é inserido na célula de mamífero. Quando os elementos estão colocados correctamente, o gene de sensibilidade ao fármaeo é expresso.

No aspecto preferido, o promotor é o promotor de metalotionina curto de murganho e o gene de sensibilidade ao fármaeo é o gene de HGPRT e o sítio de restrição é um sítio Saci. A célula alvo é qualquer tumor, cancro ou célula maligna que tenha perdido a sensibilidade à quimioterapia. A inserção do gene repõe a sensibilidade e as células são mortas por agentes quimioterapêuticos.

A construção de retrovirus envolve a ligação de segmentos de DNA clonado em conjunto extracelularmente, com a transfecção da construção de DNA numa célula eucariotica, re- l jjf colha do vírus produzido e utilização deste vírus para infectar as células malignas alvo. A preparação do vírus pode envolver várias fases de transfecção e infecçâo para fornecer o vírus final com as características desejadas para ser susceptível de infectar eficientemente células humanas malignas e exprimir o gene(s) desejado com níveis elevados sem ser susceptível de se replicar extensivamente.

Uma série de genes pode ser transferida ou potencialmente transferida, mediante a aplicação desta técnica para sensibilizar células, incluindo genes que codificam para a sensibilidade a fármacos anti-cancro, genes que suprimem o fenotipo maligno de tumores humanos, genes bacterianos que codificam para a conversão de um antibiótico numa forma tóxica susceptível de rnatar células malignas, genes que codificam para a produção de toxinas bacterianas ou toxinas fúngicas, genes que alteram o fenotipo metastásico de células alvo e genes que induzem a sensibilidade a radiação.

No método de sensibilização de células tumorais de mamífero, preferencialmente o gene de sensibilidade ao fármaco, é HGPRT. Além disso, num aspecto preferido verifica-se que a realização da fase inserção, mais do que uma vez, aumenta o número de células que incorporam o gene e assim aumenta a eficácia do tratamento.

Num outro aspecto da presente invenção, inclui-se um método de tratamento de células malignas de mamífero que consiste em fases de inserção do gene de sensibilidade ao fármaco nas referidas células malignas por exposição destas ao retrovírus que inclui o gene de sensibilidade ao f ’ farmaco e exposição das células resultantes com o farmaco anti-cancro, É importante que quando o gene de sensibilidade ao farmaco é inserido, o farmaco adequado que reage com aquele gene seja o farmaco utilizado. No aspecto preferido, a repetição da inserção e/ou das fases de exposição mais do que uma vez resulta numa morte muito mais eficaz das células cancerosas e portanto num tratamento mais eficiente.

Materiais e métodos

Células e cultura. Células HL-60 negativas de HGPRT e precursoras desenvolveram-se ern meio RMPI 1640 suplementado com soro bovino fetal inactivado por aquecimento a 20$, 1$ de L-glutamina e 1$ de uma mistura antibiótica contendo penicilina, estreptomicina e anfoteracina. 0 vírus LPHAL produzido pelas células B77 desenvolvem-se no mesmo meio suplementado com apenas 10$ de soro fetal de vitela. As contagens celulares foram realizadas com um hemocitometro na presença de azul de triptano.

Ensaios clonogénicos. Determinaram-se as células HL-60 sobreviventes após exposição do vírus pela formação das colónias em agarose de baixo ponto de fusão a 0,3$ na presença ou não de 20 pm de 6-tioguanina. Colocaram-se em placas oito mil células num volume final de 1 ml em placas de cultura de tecidos de 35 mm, a seguir incubadas com humidade elevada à temperatura de 37° C e 5$ CO^ durante 7 a 10 dias. Os agrupamentos que continham mais de 60 células foram sondados como colónias.

Determinação da actividade de HGPRT por absorção de hipoxantina. As células a serem investigadas para /

- 13* c.

/ absorção de 3H-hipoxantina foram centrifugadas e postas de novo em suspensão em meio RPMI l64o e soro bovino fetal ina.c tivado por aquecimento dializado. Removeu-se uma alíquota das células para se determinar o número de células. Adicionou-se 3H-hipoxantina (l Ci/mmole, 217 pM) às restantes célu las e incubaram-se durante 3θ minutos à temperatura de 37° C, com 5% de anidrido carbónico. Interrompeu-se a absorção pela adição de 5 volumes de solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato arrefecido em gelo. As células foram centrifugadas (lOOO x g) , lavadas duas vezes e digeridas durante a noi. te com 0,4 ml de hidróxido de sódio a Ο,ΙΝ. A absorção de hipoxantina foi determinada por contagem dos digestos célula res numa mistura de cintilação beta.

Actividade de HGPRT nos lisados de células.

A actividade de HGPRT de células HL-60 foi avaliada mediante modificação ligeira de métodos padrão. As células foram preparadas por lavagem três vezes com cloreto de sódio tamponado com fosfato, lisadas em quatro ciclos de congelamento-des^ congelamento. A mistura reaccional para cada lisado foi colo, cada em tubos de microcentrifugadora em gelo, com 100 mM tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl^, 2,0 mg/ml de 5-fosforibosil-1-pirofosfato de magnésio (PRPP) e 45 pl de ^C-hipoxantina (13,5 mCi/mmole) num volume final de 100 pl. Os lisados celulares de 5θ pl foram adicionados a cada mistura reaccional e incubados à temperatura de 37° θ, durante 15 minutos. Colocaram-se tubos de microcentrifugadora em gelo e 50 pl de cada mistura reaccional foi colocada em discos de filtro de

2,3 cm de DE-81. Os filtros foram lavados uma vez com 1 mM

NH^HCO^ e cinco vezes com água duplamente destilada e a se-

guir secos com metanol num dispositivo múltiplo. A conversão l4 14 de C-hipoxantina para monofosfato de C-inosina foi deter minada pela contagem de cintilação em filtros secos.

Salecção HAT, células HL-60 positivas de HGPRT foram escolhidas por desenvolvimento num meio que continha 30 pM de hipoxantina, 0,1 pM de aminopeterina e 20 pM de timidina. Todos os outros tipos de células foram escolhidos em meio HAT contendo 1 pM de aminopeterina.

Determinação da proteína. 0 conteúdo em pro teína dos lisados celulares foi determinado de acordo com mé. todos tradicionais.

Manchas de Southern. DNA foi submetida a digestão com Saci. 10 pg do digesto de DNA de cada linha celular foram separados por electroforese em agarose a 1% e trans feridos para nitrocelulose por aplicação de métodos convencionais, como os descritos em Southern 98 Mol. Biol. 503-517, (1975). Os filtros foram sondados com um fragmento de 0,6 kb de corte transplantado de HGPRT humano cortado de pLPL com PstI e Hind III. A hibridazação foi realizada em 6 x SSC (0,15 M NaCl mais 0,015 M de citrato de sódio, pH 7) â temperatura de 42° C, durante 72 horas. Os filtros foram lavados duas vezes em 2 x SSC, 0,1% de dodecil sulfato de sódio durante 10 minutos cada, à temperatura de 42° C, seguida por duas lavagens em 0,2 x SSC, 0,1% de dodecil sulfato de sódio à temperatura de 68° C, durante 15 minutos.

Exemplo 1

Utilizaram-se vectores retrovirais isentos

- l4 / /

¹_________ de células auxiliares deficientes de replicação anfotrópica que continham HGPRT humana designada por LPHAI-. A concentração dos sobrenadantes virais, recolhidos das células produtoras de LPHAL, 18 horas após mudança do meio compreendido entre 1,2 e 6,2 xlO^ partículas virais infecciosas por mililitro quando testado em células de rato 208 F negativas de HGPRT. A eficiência da infecção foi determinada por suspensão de 106 células HL-ÓO negativas de HGPRT em 1 ml de sobrenadan te virai durante 3 horas (vírus; células na proporção de 6,2:l), em seguida desenvolveram-se durante 48 horas para per mitir a integração e expressão antes de serem cultivadas num ensaio de formação de colónias com 20 pm de 6-tioguanina. Tornou-se sensível uma média de 7θ- 18% (SD) de células clonogénicas ao farmaco, A figura 2 mostra que a fracção de células sensibilizadas à 6-tioguanina aumentou com o prolongamento do tempo de exposição ao sobrenadante virai, alcançando 74% em 5 horas. Quando as células HL-60 foram co-cultivadas com células produtoras de vírus durante 48 horas, foi tornada sensível uma média de 89 - 3% (Sh) de células à 6-txoguanina, sugerindo que uma exposição contínua ao vírus não foi acentuadamente mais eficaz do que uma exposição de 5 horas.

A figura 3 representa o efeito do aumento do vírus para a proporção celular durante uma infecção de 3 horas por diluição do sobrenadante virai. Neste caso, o ponto final foi a actividade de HGPRT das células infectadas medida pela absorção de 3H-hipoxantina. As células negativas de HGPRT não tratadas continham 0,18% da actividade presente nas células do tipo selvagem. A actividade de HGPRT das células

- 15 infectadas aumentou com o aumento da proporção vírus/célula; na proporção de 1,2:1 as células infectadas continham 60$ mais de actividade HGPRT do que as células não infectadas, quando ensaiadas dois dias depois da exposição ao vírus. 0 efeito do aumento de tempo permitido para a integração pro-viral e expressão, quando avaliado pela sobrevivência celular no ensaio clonogénico, está descrito na figura 4. As células foram infectadas durante 3 horas e em seguida cultivadas num meio isento de fármaco durante diversos períodos de tempo antes de serem ensaiadas para a sobrevivência clonogénica na presença de 20 pM de 6-tioguanina, A percentagem de células clonogénicas sensibilizadas era uma média de 43,2$ quando ensaiada um dia apos a exposição ao vírus. Esta percentagem aumentou para uma média de 62,3$ quando testada cinco dias após exposição virai, mas o aumento na percentagem sensibilizada com o tempo para além de um dia não foi es. tatisticamente significativa.

A sobrevivência de células HL-60, tipo selvagem clonogénicas, expostas ao sobrenadante virai, numa pr<o porção de vírus/cólula de 1,2:1 e em seguida tratada com con centrações crescentes de 6-tioguanina não foi diferente da que se obteve com células HL-60 repletas de HGPRT que não se expuseram aos vírus. A relação da ΙΟ^θ das células HL-60 pre cursoras com a de células HL-60 tratadas com LPHAL foi de 0,6 +_ 0,3 (SD). Este facto sugere que as células HL-60 de tipo selvagem, tinham um excesso de HGPRT relativamente ao que é necessário para as sensibilizar para 6-tioguanina e que um aumento posterior, proveniente da contribuição de um gene de

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HGPRT inserido no vírus, não resulta em posterior sensibilização para a 6-tioguanina. Assim, no tratamento de células tumorais humanas, qualquer inserção nas células normais não provocará a morte de células normais. A inserção de genes de sensibilidade aumentará apenas a sensibilidade daquelas células que sofreram uma insersão prévia, devido a uma ausência da enzima necessária para responder ao agente anti-cancro.

Exemplo II

DNA proveniente de células murinas produtoras de vírus, células HL-60 deficiente em HGPRT e clones des tas últimas, escolhidos para a expressão de HGPRT em meio HAT, seguido de exposição virai, foram digeridas com Saci que corta uma vez em cada repetição do terminal longo pro-viral. Uma Southern blot foi sondada com um fragmento de 0,6 kb desde o terminal 3' do cDNA de HGPRT humano. As células murinas produtoras de LPHAL continham uma banda de 5,3 kb que reflectia a presença de pro-vírus contendo HGPRT. As células HL-60 negativas a HGPRT não continham inserção, mas cada sete clones que exprimiam HGPRT continham a mesma inserção de 5,3 kb. Portanto, as células tornadas positivas de HGPRT por exposição aos vírus que continham individualmente os pro-vírus integrados não tinham ainda sofrido os rearranjos suficientes para serem detectados pela análise de Southern.

Exemplo III

Clones de células negativas HL-60 expostas

- ι_Ζ ⁽·<

ao vírus e escolhidas em meio HAT foram ensaiadas para deter minação do seu grau de actividade HGPRT, mediante avaliação da absorção de 3H-hipoxantina. A figura 5 demonstra que a a£ tividade de HGPRT em 40 desses clones estava compreendido en tre 1 e 9^% da actividade nas células repletas de HGPRT HL-60 de tipo selvagem. A actividade de HGPRT da maior parte dos clones, estava abaixo de 20,0% da actividade demonstrada pelas células de tipo selvagem, mas obtiveram-se clones ocasionais com níveis de actividade perto do normal. A figura 5 também demonstra que mesmo os clones com uma actividade tão pequena como 5$ da actividade normal, foram susceptíveis de sobreviver em meio HAT.

Exemplo IV

Para controlar a alteração induzida no fenjo tipo da infecção de população negativa de HGPRT total, células negativas de HGPRT foram ensaiadas para a sua sensibilidade 6-tioguanina e actividade de HGPRT seguindo uma exposição única de 3 horas ao vírus. Como se demonstra na figura 6a, 56% de células resistentes tornaram-se sensíveis à 6-ti<5 guanina quando ensaiadas 48 horas após exposição virai. Veri_ ficou-se uma lenta diminuição na fracção de células que permaneceram sensíveis durante o desenvolvimento subsequente sob condições não selectivas que alcançou 12% aos 54 dias.

A figura 6B representa a alteração na actividade de HGPRT avaliada pela taxa de acumulação de hipoxantina no conjunto das células, como uma função do tempo após exposição ao vírus. A taxa de absorção de hipoxantina nas células negativas de HGPRT, não expostas ao vírus, foi consistentemente menor

- 18, i /

z.....

/ * do que 0,2% que as células positivas de HGPRT de tipo selva gem. Cinco dias após uma exposição virai de 3 horas as célu las acumularam hipoxantina com uma taxa de 1,64% da do tipo selvagem. Esta diminuiu durante 30 dias de desenvolvimento sob condições não selectivas. A média da taxa de desenvolvimento de clones que continham o gene HGPRT inserido, foi a mesma que a obtida com células positivas de HGPRT tipo sei.

vagem.

Exemplo V

I

Determinaram-se taxas de mutação de genes inseridos utilizando-se análise de flutuação de Luria-Delbruck para a perda de actividade de HGPRT na população de có_ lulas deficientes de HGPRT que se tinham tornado positivas de HGPRT por contacto com LPHAL. A taxa de mutação anterior no sítio de HGPRT nas células de tipo selvagem era de 6,9 x x 10 por divisão celular, A actividade de HGPRT codificada pelo gene inserido viralmente, perdeu-se com uma taxa de rnu_ c tação de 1,7 x 10 por divisão celular; a taxa 24l vezes su perior à das células de tipo selvagem.

Exemplo VI

Uma vez que uma única exposição a LPHAL seri sibilizou apenas uma fracção de células negativas de HGPRT, o sucesso da utilização da terapêutica genética para eliminar a resistência à 6-tioguanina num aspecto preferido reque rerá que as células não tornadas sensíveis ao fármaco com o primeiro contacto, sejam sensibilizadas por um segundo ou

subsequente exposição. As células HL-60 negativas de HGPRT foram expostas a LPHAL durante 3 horas e escolheram-se 9 clones que ainda eram resistentes a 20 μΜ de 6-tioguanina. Quando DNA digerido por Saci foi sondado com o cDNA de HGPRT humano, nenhum destes clones continha a banda de 5,3 kb esperada que correspondia à HGPRT proviral, sugerindo que a razão das células não terem sido sensibilizadas se de_ via à falta de infecção ou integração mais do que à falta de expressão do gene proviral integrado. Para demonstrar que estas células eram ainda injectáveis, células HL-60 negativas de HGPRT permanecendo resistentes à 6-tioguanina após uma exposição única de 3 horas com o vírus, foram tratadas de novo com vírus durante 3 horas e tornadas sensíveis à 6-tioguanina 56 +_ 4% (SD).

Estes resultados demonstraram a aplicabili^ dade da utilização do vector retroviral para inserir um gene de sensibilidade a um fármaco numa célula tumoral humana. Por exemplo, numa célula de tumor leucémico promielocítico, uma única exposição de 3 horas de células negativas de HGPRT HL-60 ao retrovírus LPHAL foi suficiente para sensibilizar aproximadamente 7θ% das células clorogénicas. A eficiência da sensibilização aumenta em função do tempo de exposição virai e com o título virai. A maior percentagem de células foi sensibilizada para 6-tioguanina por exposição ao sobrenadante virai não diluído. A utilização de concentra ções de vírus ainda mais elevadas pode aumentar a fracção de células sensibilizadas ainda mais. Portanto, uma exposição virai de 5 horas produziu 88% da sensibilização conseguida por uma exposição contínua de 48 horas a células produtoras de vírus conseguidas através de co-cultivação. Um problema potencial de terapêutica genética como um meio de repor a sensibilidade ao fármaco em células resistentes consiste no facto de, se o vírus infecta as células normais do hospedeiro, ele pode aumentar a sensibilidade destas células assim como ás células malignas resistentes limitando o índice terapêutico da administração subsequente do fármaco. Contudo, os resultados apresentados aqui sugerem que isto não constitui um problema. Por exemplo, nas células HL-ÓO precursoras, células repletas de HGPRT parece conter excesso de actividade de HGPRT acima do requerido para uma activação máxima de

6-tioguanina, sob estas condições qualquer actividade de HGPRT adicional, acrescentada pelo gene inserido viralmente, não se esperará aumentar a sensibilidade destas células para a 6-tioguanina e no facto das células HL-60 tipo selvagem, não serem mais sensibilizadas pela exposição virai.

Clones que continham suficiente actividade de HGPRT para selecção de sobrevivência em meio HAT, continham, pelo menos, uma cópia do genoma de IIGPRT proviral.

De um modo idêntico, clones escolhidos pela persistência de ausência de actividade de HGPRT a seguir à exposição â LPHAL continham HGPRT inserido viralmente. Portanto, a falta de sensibilização a seguir à exposição virai é devida mais provavelmente a uma falta de infecção do que ã falta de expressão ou integração do provírus. Isto é de importância particular relativamente à utilização potencial de tera^ pêutica genética para inverter a resistência clínica ao fár

maco porque se as células foram infectadas com sucesso, mas não exprime o gene de sensibilidade ao fármaco terá que se admitir que elas serão resistentes a uma sequente infecção pelo meemo retrovírus. De facto, quando células que foram reinfectadas permanaceram negativas de HGPRT após exposição virai, verificou-se que a eficiência da sensibilização não foi significativamente diferente da obtida com células HL-60 negativas de HGPRT virgens. Assim, a repetição dos ciclos de infecção virai seguida de terapêutica com 6-tioguanina pode ser eficaz para eliminar todas as células resistentes de um doente.

A utilidade terapêutica desta via, para eliminar a resistência ao fármaco, depende do gene inserido permanecer activo o tempo suficientemente longo para permitir a administração de 6-tioguanina. Os estudos descritos aqui demonstraram claramente que a actividade de HGPRT atri. buível ao gene inserido permanece na população de células tu morais durante vários dias, a seguir ao contacto virai. A ta, xa de mutação do gene inserido é contudo 24l vezes superior à do gene endógeno, que pode contribuir para uma perda gradual da actividade de HGPRD na população total durante um período de semanas.

Nestes estudos examinou-se a capacidade de LPHAL para transferir o gene de HGPRT, de preferência para a população de células clonogénicas do que para todas as cé lulas. A razão disto é que, ainda que apenas uma pequena fracção de células da população maligna sejam células clonogénicas, são estas células semelhantes a hastes que são cru- 22 / /’ ciais para o maior desenvolvimento do tumor θ são portanto os alvos mais importantes para a quimioterapia. Neste siste ma a formação de colónias é a marca mais disponível para o potencial proliferativo não limitado. Os resultados apresen tados indicam que uma grande fracção de células clonogénicas pode ser sensibilizada para a 6-tioguanina mediante a inserção do gene de HGPRT. Contudo, os resultados também su gerem que a transferência do gene para células clonogénicas, pode ser mais eficaz do que a transferência para células não clonogénicas, uma vez que a actividade de HGPRT na população total, após contacto com células negativas de HGPRT com LPHAL permanece bastante abaixo da actividade de HGPRT presente nas células de tipo selvagem.

Nestes estudos utilizou-se o gene de HGPRT como um exemplo de um modelo dum gene de sensibilidade ao fármaco para avaliar a eficácia do vector retroviral. Enquanto que é evidente que a eficiência da infecçâo é suficien. temente baixa, então ciclos repetidos de infecçâo e quimioterapêutica serão requeridos para tornar suficientemente elevada a eficácia desta via para a inserção de outros genes de sensibilidade a fármaco susceptíveis de activarem fármacos quimioterapêuticos. Um técnico facilmente se apercebe que a presente invenção poderá ser adaptada convenientemente para realizar os objectivos e obter os fins e vantagens refe. ridos, assim como os que lhe são inerentes. Os métodos, processos e técnicas anui descritas, são presenteniente represeri tativos de aspectos preferidos e serão considerados como exemplos e não como limitações do âmbito da presente invenção.

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Alterações e outras utilizações ocorrerão aos técnicos nes ta matéria que estão abrangidas pelo espírito da presente invenção ou definidas pelo âmbito das reivindicações apensas .

Claims

1. - Processo para sensibilizar células tumorais de mamíferos, caracterizado pelo facto de incluir uma fase de inserção de um gene de sensibilidade a um fármaco nas referidas células tumorais.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o referido gene de sensibilidade planeada no grupo constituído por genes que codificam para a sensibilidade aos fármacos anti-cancro, genes que reprimem o fenotipo maligno, genes bacterianos que codificam para a transformação de um antibiótico para uma forma tóxica, genes que codificam para toxinas bacterianas ou fúngicas, genes que modificam o fenotipo metastásico das células alvo e genes que reforçam a sensibilidade à radiação.

-253. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido gene codificar para hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se repetir a fase de inserção pelo menos uma vez.

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5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a fase de inserção incluir a exposição das referidas células tumorais a um retrovírus que contém o referido gene de sensibilidade aos fãrmacos.

6. - Processo para o tratamento de células malignas de mamíferos, caracterizado pelo facto:

de se inserir um gene de sensibilidade aos fãrmacos nas referidas células malignas mediante exposição destas ultimas a um retrovírus que incorpora o gene de sensibilidade ao farmaco; e de se expor as células resultantes a um farmaco anti-cancro.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as referidas células malignas com o retrovírus mais do que uma vez.

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-268. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de as referidas células malignas serem células de leucémia humana; de o gene sensível ao fármaeo ser o gene da hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase; e de o referido fãrmaco anti-cancro ser a 6-tioguanina.

9. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica que contém um retrovirus que incorpora fragmentos de DNA que incluem:

uma repetição de terminal longo 3¹ e uma repetição de terminal longo 5', cada um dos quais contém pelo menos um sítio de enzimas de restrição, e que estão ligados às extremidades 3' e 5', respectivamente;

um promotor/indutor; e pelo menos um gene de sensibilidade a fármacos;

caracterizado pelo facto de se ligarem os segmentos de DNA um ao outro e de se posicionarem no espaço para expressar, pelo menos, um gene de sensibilidade a fármacos, após inserção numa célula alvo.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o promotor/indutor ser o promotor de metalotionina curto de murganho, e de o gene de sensibilidade pelo menos a um fãrmaco ser o gene que codifica para a hipoxantina-guanina-fosf oribosil-transferase,