PT87923B - processo para a preparaçAo oe arndc e de composições farmacêuticas que o CONTÊMUTEIS PARA A MODULAÇÃO DE ESTADOS CELULARES RESISTENTES A UNFOQUINAS - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se a um processo para a preparação de um ARNdc (ARN de dupla cadeia) desem parelhado que compreende ligarem-se complexos oligómeros, complexos poliméricos ou ambos, de preferência oligonucle ótidos, que hibridam com ARN polimérico de cadeia simples complementar de modo a formar o ARNdc duplex.

Description

EPÍGRAFE: .. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ARNdc E DE

COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS QUE 0 CONTEM ÚTEIS PARA A MODULAÇÃO DE ESTADOS CELULARES RESISTENTES A LINFOQUINAS

INVENTORES: Dr.William A.Cárter.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

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Descrição referente à patente de invenção de HEM Research, Inc., norte-americana, industrial e co inercial, com domicílio em 12220 Wilkins Avenue, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América, (inventor; Dr. William A. Cárter, residente nos E.U.A.), para, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ARNdc E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE 0 CONTÊM ÚTEIS PARA A MODULAÇÃO DE ESTADOS CELULARES

RESISTENTES A LINFOQUINAS.

Descrição

Domínio da invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de ácido ribonucleico de du pia cadeia (em seguida designado por ARNdc) para uso iso ladamente ou em combinação com linfoquinas a fim de inibit a proliferação de células neonlásicas no corpo de um aniί mal, incluindo seres humanos, com o objectivo de corrigirj defeitos que ocorram em células tumorais ou cancerosas no; corpo de um animal, incluindo seres humanos, e de tratar afecções do sistema imune ligadas à predisposição de certos indivíduos de serem susceptíveis a condições tumorais ou cancerosas, seja esta predisposição de origem genética (hereditária) ou de causas ambientais. A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação de compo ¹ BAD ORIGINAL sições farmacêuticas que contêm ARNdc¹s em combinação com , , I outros agentes químicos e biologicos para o tratamento de condições tumorais ou cancerosas.

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ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [ !

I. Funções de IFN e ARNdc's como indutores de IFN

Os interferoes (em seguida designa dos por IFMs) constituem uma classe de proteínas com capacidade de inibição da replicação de vírus em células animais. Estas proteínas têm origem celular, podem ser produzidas in vitro ou in vivo, e são estimuladas por uma grande variedade de materiais (The Encyclopedia of Bioche mistry, editada por Roger Williams e Edwin Lansford, Rei. nhold Publishing Company, 1967). 0 IFN é conhecido por exercer efeitos antiproliferativos bem como efeitos antivi^ rais (Nature 262, 300, 1978), por reestabelecer inibição de contacto (J. Cell Eiol., 56 846, 1973) e por inibir o crescimento de células neoplásicas em agar semi-sólido (nature, 231, 20, 1971).

oor ri . _ η n de interferão, po na indução do rFN, enzimas induzidas por IFN,

Os ARNdc's são indutores de dife- I rentes formas moleculares de IFN humano incluindo os tipos alfa (leucócitos), beta (fibroblastos) e gama (imune) (J. Reticuloendothelial Society, 2 3, 299, 1978), podendo a produção de IFN ser estimulada por ARNdc's tanto naturais como sintéticos. É conhecida a utilização de ARNdc sintético sob a forma de complexos de ácidos polirriboinosínico e polirriboicitidilico (seguidamente designados rC ou poli IC) estritamente como um inoutor exemplo, ca Patente dos EUA ne. 3 666 646 em nome de Lampson et al.. Para além do seu papel o ARNdc é também um activador de duas uma quinase de proteína e uma sintetase de 2'-5'-oligoadenilato (Proc. Natl. Acad. Sei. 75 5893, 1978). As bases moleculares para os efeitos

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antiproliferativo e antineopásico do interferão e para a í sua relação com o ADNdc são, no entanto, desconhecidas e < antes da presente invenção eram também desconhecidos quais quer efeitos antiproliferativos do ADNdc para além do seu papel como um indutor do interferão.

II. Análogos desemparelhados sintéticos de ARNdc

Mais recentemente verificou-se que o IFN pode também ser induzido por análogos desemparelhados de rl_n . rC_n> conforme descrito nas Patentes dos E.U.A. N^e. 4 130 641 e 4 024 222 em nome de Ts¹ o e Cárter.

Estes análogos são formados modificando o ri . rC a fim η n de incorporar bases não correspondentes (uracilo e guanina) ao longo da cadeia de polirribocitiailato (rC ) ou de n modificar a coluna vertebral de ribosilo do ácido polirriboinosínico (rl^). Os análogos desemparelhados, particularmente os modificados na cadeia de rC , conservam a capa n — cidade de induzirem o interferão na condição de que sejam satisfeitos certos requisitos estruturais. Conforme as figuras ilustram não são necessárias longas regiões de : ARNdc com as bases perfeitamente emparelhadas para a indução do interferão. De facto, o pré-requisito estrutural para desencadear a síntese do interferão parece ser a conservação de 1/2 a 1 volta de hélice de ARNdc com bases perfeitamente emparelhadas.

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Verificou-se uma velocidade acele-;

rada de hidrólise quando se expuseram polímeros desemoarelhados a nucleases (J. Molec. Biol., 70, 567, 1972), se bem c.us estes ARNdc¹s fossem cuase tão activos como o ri n . rC em termos de indução do interferão. Foi prooosto que a conservação prolongada de uma estrutura em dupla hé-! lice intacta poderia ser responsável pelas outras numerosas respostas ao ARNdc comummente relacionadas com a respectiva toxicidade. Estudos efectuados sobre o análogo (Rj desemparelhado, ri . r(C.. ..) , Ampligen^, uma marca

BAD ORIGINAL registada nos S. U. A. por HEM researcn, Inc., Rockville,

Md., 10852, EUA, em vários sistemas animais mostraram que o ri . r(C.~ U) é menos tóxico do que o ri .rC ri x rL f η o n (ver Foly IC witn mismatched bases, prospects for câncer therapy, em Augmenting Agents in Câncer Therapy, editado por Ξ.Μ. Hersh et al, P.aven Press, New York, 177, 1981).

Em particular, a administração repetida de ri r (C

12,

U) a ratos tem como resultado uma toxicidade muito menor n a órgãos sensíveis críticos incluindo elementos da medulei / — óssea, células do fígado, timócitos e esplenócitos (J. Mole. Biol., 70 , 567, 1972), enquanto que se conserva a eficácia na protecção contra várias ameaças virais letais (Mole. Pharm., 12, 299, 1976).

Além disso, o ri . r(C_ni .. U) n 11-14, n apresenta uma pirogenicidade reduzida (redução de 100 vezes) em relação ao ri . rC em coelhos, uma mitogenicin n dade mais baixa (redução de 5 a 10 vezes) com células de rato e humanas in vitro e uma formação diminuída de formação de anticorpo de ARNdc (redução de 5 a 10 vezes) em coelhos e ratos. Contra este quadro de toxicidade celular reduzida, o ri .r(C.. . „ U) conserva a sua capacida de para induzir interferão, estimular a função das células destruidoras naturais (natural killer = NK) (J. Immuno, 124, 1852, 1980) e activar os mediadores intra celulares acima mencionados, sintetase de 2'-5¹-oligo-ade nilato e uma quinase de proteína específica. á claro, ¹ por conseguinte, que, numa variedade de sistemas de ensaio (coelhos, ratos e no homem) e sob diferentes esquemas de dosagem medindo várias toxicidades e efeitos terapêuticos, o análogo desemparelhado ri (Ampli- ¹ gene ) apresenta uma relação terapêutica melhorada. A preparação e a formulação deste indutor/activador desemparelhado foram já descritas (J. Molec. Bio. 70, 567,

1972).

A utilização de análogos de ri

BAl) ORIGINAL

. rC_n modificados para o fim específico de induzir a produção de interferao em células animais para o combate ao ataque de vírus é já conhecida, por exemplo das Patentes dos S.U.A. N^s. 4 13G 641 e 4 024 222 mencionadas. No entanto, no que se refere à respectiva utilização como agentes antiproliferativos, existe um impedimento à terapia de IFN (bem como de outras linfoquinas quando administradas isoladamente) devido a que estas linfoquinas apresentam apenas um efeito marginal em muitos indivíduos. Em conse quência são necessárias para a administração quantidades relativamente grandes de linfoquinas, dando como resultado níveis de linfoquinas no corpo anormalmente altos que não seriam gerados no decurso da resposta humana normal e uma infecção virai ordinária, a uma diferenciação celular imunológica ou de mecanismos naturais de imunovigilância, antivirais e de defesa de hospedeiro. A estes altos níveis o corpo pode tratar a linfoquina tal como o IFN como se fosse uma substância estranha e os indivíduos tratados têm a capacidade de gerar anticorpos contra várias linfoquinas incluindo o IFN. Estes anticorpos resultantes des troem geralmente quaisquer benefícios terapêuticos residu ais.

Para além disso, as células neoplá sicas em particular possuem a capacidade de adquirir resis tência às propriedades terapêuticas de várias linfoquinas incluindo o IFN e os diferentes membros da família das interleuquinas. Como se demonstra seguidamente, esta capacidade das linhas de células neoplásicas para desenvolve rem resistência conrra o IFN é adquirida sob a forma dum fenótipo não aleatório e por consequência constitui um in conveniente grave de qualquer método terapêutico destinado a inibir a proliferação baseado na utilização de linfoquias isoladamente. A presente invenção representa uma solução para esta deficiência da técnica anterior ao apresen tar novos agentes antiproliferativos e composições que param ou retardam drasticamente o crescimento das células

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cancerosas, quer as células tenham ou não desenvolvido resistência a linfoquinas. Para além disso, a presente invenção proporciona processos para a preparação de composições que contêm interferão de tal modo que os níveis corporais de interferão, embora inferiores por um factor de 20 ou de 50 aos níveis alcançados pela técnica anterior, têm como resultado mesmo assim, uma eficácia terapêutica ainda maior. Uma vez que as composições da presente invenção que contêm ARNdc actuam de modo sinergístico, os benefícios terapêuticos do ARNdc são do mesmo modo muito superiores aos descritos na técnica anterior e proporcio nam sem dúvida um ataque terapêutico a núcleos tumorais em santuários da matriz óssea, santuários tumorais estes que são notoriamente resistentes ao ataque de linfoquinas aplicadas de forma exógena quando estas são administradas como terapia de modalidade simples.

III. Células destruidoras naturais (NK) como mecanisr mo de imunovigilância contra células tumorais

Foram publicados numerosos trabalhos que suportam um papel central para as populações de células NK nos mecanismos de imunovigilância contra as células neoplásicas. Demonstrou-se que ratos com actiI vidade de células NK elevada eram mais resistentes ao cres cimento de células tumorais sensíveis a NK do que os ratos com baixa actividade de células NK (Immunol. Rev., 44, lò5j, 1979). Foi também relatado que ratos pardos O573L/6, quej têm uma deficiência selectiva de células NK, são mais sus-¹ ceptíveis ao crescimento tumoral do que ratos singénicos com actividade normal das células NK (Nature (Londres),

84, 622, 1980; Nature, 2 34, 624, 1980) . .Existe uma condição semelhante em pacientes humanos com a síndrome de Chediak-Higashi e foi sugerido que a deficiência nas células NK nesta doença pode estar relacionada causalmente ao desenvolvimento subsequente de linfomas nestes pacientes (J. Exp. Iled., 151, 1039, 1980; J. Exp. Fie d.,

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151, 1049, 1980); Nature (Londres), 284, 553, 1980).

á sabido que pacientes com leucemia linfocítica crónica (LLC) apresentam uma alta incidência de doenças malignas secundárias. Ziegler e Zarling (Int. J. Câncer, 27, 321, 1981) avaliaram a actividade de células NK em lin fócitos de pacientes de leucemia crónica depois da elimi. nação das células leucémicas. De modo significativo, a maioria dos pacientes com LLC possuem uma actividade das células NK mínima ou não detectável, apesar da presença de linfócitos que se ligam a alvos sensíveis a NK. Além disso, receptores de transplantes renais, que são tratados com altas doses de produtos imunossupressores, apresentam um risco de desenvolvimento de doenças malignas aproximadamente 100 vezes superior e têm actividades das células NK extremamente reduzidas ou abolidas (Transplantation, 29, 214, 1980). Em contraste, a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (CODA) não é tão reduzida nesses receptores. Este facto sugere que a deficiência na actividade das células imunitárias é específica, e, quando presente, vem associada a uma propensão profunda para o desenvolvimento ou a recorrência das doenças malignas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção baseia-se em múltiplas descobertas incluindo a observação de que mesmo que as células de um tumor sejam resistentes ao IFN, a utilização de lincocuinas específicas em combinação com ARNdc deseraparelhado tem como resultado um efeito sinergístico ou potenciado no que diz respeito à respectiva ac ção antiproliferativa. Este facto significa que a utilização do AxNdc isoladamente ou em combinação com linfoquip nas em indivíduos que apresentam uma resposta marginal à j terapia de modalidade simples tem como resultado um efeitc antiproliferativo/imunomodular do ARNdc aumentado em comparação com o que resulta da terapia baseada na utilização

- 7 BAD ORIGINAL de ARNdc isolado

Para além disso, para muitos indivíduos a terapia com linfoquinas, incluindo o IFN, constitui um método viável de tratamento, isto é, estes indivíduos não necessitam de níveis de dosagem anormalmente altos de IFN e, em consequência, correm um risco muito menor’ de desenvolver anticorpos contra linfoquinas ou de apreser tar outros efeitos secundários da linfoquina administrada, uma vez que estes efeitos secundários estão directamente relacionados com a dosagem de linfoquina. Nestes indivíduos, os ARNdc's potenciam a acção das linfoquinas e deste modo tornam a terapia por IFN um método terapêutico ain da mais eficaz. Por conseguinte, os métodos terapêuticos e as composições descritos na presente invenção melhoram os métodos de tratamento existentes baseados em linfoquinas isoladas e, simultaneamente, proporcionam o acesso a estes métodos de tratamento àqueles indivíduos que estariam excluídos de outro modo dé tratamento eficaz por uma ou várias das rezões apontadas.

Uma forma de concretização preferida da presente invenção refere-se a um ARNdc que é um análogo desemparelhado de ri . rC_n . Tal como previamen te mencionado, estes análogos desemparelhados resultam da interrupção de qualquer das cadeias com bases não correspondentes (isto é, que não formam pares de bases de Watson -Crick) tais como uracilo e guanina. Estes análogos de-! semparelhados representam formas de concretização preferi-i das devido ao facto de conservarem os efeitos anti-prolivativos do ri rC nao modificacío enquanto apress η n tam uma tendência consioeravelmente reduzida para desencadear efeitos laterais inuesejáveis, corno sejam reore, morte celular não-específica (isto é, a morte de células normais do corpo) e antigeniciciade

Para além disso, constatei também

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L

que o análogo desemparelhado específico rl^ . ^r(^cqq_q4'

U) apresenta efeitos drásticos mesmo superiores aos observados anteriormente em ligação com as capacidades antiproliferativas de um ARNdc típico, como seja ri . ^rCn* Especificamente possibilita a capacidade em alguns casos de corrigir deficiências em células tumorais de tal modo que estas células são reprogramadas e convertem-se funcionalmente em células normais. De facto, isolei células cancerosas de pacientes e observei repetitivamente este fenómeno. Além disso, verifiquei que o Ampligen po de realmente funcionar como um agente de normalização de células cancerosas em situações nas quais as linfoquinas põem realmente um obstáculo completo ao referido tratamen to. Certas substâncias químicas e biológicas são conhecidas por possuir alguma capacidade para normalizar células cancerosas de forma independente. Os ARNdc¹s desemparelhados, notavelmente o . r(C^-_L_^₄, U) , é capaz de amplificar este tipo de actividade de normalização de células tumorais, enquanto certas linfoquinas, especialmente linfoquinas, frequentemente têm o efeito oposto, isto é, reduzem ou anulam este processo de normalização.

Além disso, a presente invenção permite ainda a correcção de afecçÕes imunológicas em indivjL duos predispostos para o desenvolvimento de cancro em vir rude de antecedentes familiares (ou seja, por razões here ditarias) ou de defeitos no sistema imune. Esta capacidade é aparentemente um efeito alheio ao IFN e às linfoquinas e evidencia o facto de que os ARNdc¹s podem afectar as células cancerosas de modo qualitativo, o que as linfoquinas isoladas não são capazes.

As composições terapêuticas e os métodos terapêuticos permitem o tratamento do cancro, de tumores e de células neoplásicas. Neste contexto, tratamento é um termo genérico abrangendo a prevenção de cancro, a paragem de tumores (seja parcial ou completa),

BAD ORIGINAL inibição do reaparecimento de tumores em pacientes previamente tratados por terapia estabelecida, a conversão de células tumorais em células normais, a correcção de deficiências imunológicas relacionadas com o cancro e a melhoria das defesas do hospedeiro necessária para possibilitar uma protecção contra infecçSes virais bem como contra vários estados autoimunes e inflamatórios. É crucial a com preensão de que a presente invenção é aplicável não apenas ao tratamento do cancro ou de tumores uma vez que estes já se manifestaram clinicamente mas também à prevenção ou à abolição destes estados malignos enquanto são incipientes ou sub-clínicos. Isto significa que as condições cancero sas podem ser sub-clínicas durante décadas antes de se tor narem abertamente evidentes, tornando-se então objecto de tratamento com os métodos terapêuticos existentes. A presente invenção, por outro lado, permite advertir um estado canceroso antes mesmo de este alcançar o estado clin_i camente evidente, por exemplo em indivíduos que possuam antecedentes que indiquem uma alta predisposição para o cancro. Visto de uma perspectiva diferente, o cancro é í

simplesmente parte de um conrínuo biológico (possivelmente com a duração de décadas) em queos estados precoces do contínuo podem ser simplesmente uma predisposição. A prel sente invenção possibilita não apenas a correcção de cancro abertamente evidente mas permite também a prevenção do cam cro se este é tratado durante os estágios precoces deste I contínuo, possivelmente décadas antes do seu aparecimento í real. ί

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á por conseguinte um objectivo da presente invenção proporcionar processos para a preparação de composições úteis para o tratamento de cancro em animaiç incluindo o homem, sendo o termo tratamento (quando usaq do em conjunção com cancro, tumor, etc.) um termo genérij co abrangendo a prevenção do cancro, a paragem de um tumor (quer seja parcial ou completa), a inibição do reaparecimer; to de tumores em pacientes previamente tratados por tera- 10 BAD ORIGINAL

pia estabelecida, a conversão de células tumorais em célu las normais ou a correcção de deficiências imunes relacio nadas com cancro e a melhoria das defesas do hospedeiro necessárias para conferir protecção contra iníecções virais bem como contra vários estados autoimunes/inf1amatór ios.

As composições preparadas de acordo com o processo da presente invenção são úteis para a utilização em métodos terapêuticos para a inibição de pro liferação de células neoplásicas em animais, incluindo seres humanos, que contêm ARNdc desemparelhado sob uma forma apropriada para a administração ao animal que tenha necessidade deste tratamento terapêutico.

Adicionalmente, as composições pre paradas de acordo com o processo da presente invenção são úteis para o emprego em métodos terapêuticos melhorados para a inibição da proliferação de células neoplásicas resistentes ao IFN sob uma forma apropriada para a administração ao animal que tenha necessidade deste trata mento terapêutico.

Ê ainda um objecto da presente invenção proporcionar um processo para a preparação de composições farmacêuticas úteis para a potenciação de efeitos antiproliferativos do ARNdc sobre células neoplásicas no corpo de um animal, incluindo um ser humano, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um ARNdc desemparelhado em combinação com uma linfoquina.

á ainda um outro objecto da presen te invenção proporcionar um processo para a preparação de composições farmacêuticas úteis para o tratamento de turno res, incluindo os tumores resistentes ao IFN isolado, no corpo ce um animal, incluindo um ser humano, caracterí zado por se incorporar como ingrediente activo um ARNdc

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isolado ou em comoinaçao com uma linfoquiAs composições farmacêuticas obticom o processo da presente invenção são ain — converter funcionalmente células cancerosas corpo de um animal, incluindo um ser humanormais.

á ainda um outro objectivo da preproporcionar um processo para a preparação farmacêuticas úteis para a conversão funcio cancerosas ou tumorais no corpo de um aninormais caracterizado por se incorporar coactivo um ARNdc desemparelhado em combinasubstância química ou biolóqica que possui desemparelhado na.

das de acordo da úteis para ou tumores no no, em células sente invenção de composições nal de células mal em células mo ingrediente ção com outra independentemente alguma capacidade para a normalização de células neoplásicas.

As composições farmacêuticas obtidas de acordo com o processo da presente invenção são úainda para melhorar ou suDrimir deficiências imunoló-,' ί

ou virais crónicas, j i

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ;

A presente invenção é ilustrada ;

desenhos anexos nos quais: i ί

A FIGURA lA é um gráfico que apre-i a medição indirecta da indução de níveis de cAMP por medida da actividade catalisada por adenilato em células i

de glioma humano tratadas com ARNdc desemparelhado (duas concentrações) durante 30 minutos;

A FIGURA 1B é um gráfico sernelhan-! te ao da Figura lA que apresenta resultados semelhantes

- 12 BAD ORIGINAL tei s gic as pelos senta ι

durante um período de 24 horas;

A FIGURA 2a é um gráfico que apresenta uma medição directa da indução de níveis de cAMP por medida de RIA em células de glioma humano tratadas com ARNdc desemparelhado (duas concentrações) durante 30 minu tos;

A FIGURA 23 é um gráfico semelhante ao da Figura 2a que apresenta resultados semelhantes durante um período de 24 horas;

A FIGURA 3 é um gráfico de barras que apresenta a síntese de proteínas em células de glioma humano (não tratadas, tratadas com IFN, tratadas com ARNdc e tratadas com IFN e ARNdc simultaneamente) às 24, e 72 horas com diferenciação progressiva e perda do fe nótipo celular maligno, uma propriedade que não é das lin foauinas, para as células tratadas com ARNdc;

A FIGURA 4 é um gráfico dos resul- !

I tados de uma experência de 31 dias com medição da dimensão! dos tumores (comprimento vezes largura) de tumores enxer- j tados em ratos atímicos entre ratos não tratados (compara j ção) e tratados com IFN e ARNdc; i

A FIGURA 5 é um gráfico dos resultados da análise colonogénica em células de melonorna para quantidades crescentes de IFN-alfa, IFN-beta e ARNdc;

I

A FIGURA ò é um gráfico dos resultados de uma análise cologénica em células de carcinoma renal humano para IFN-alfa isolado e duas combinações de IFN-alfa a zero e 100, 30C e 1GC0 unidades com 50 e 100 pg/ml do ARNdc demonstrando efeitos sinergísticos antipro ;

liferativos para as combinações; I i

- ¹³ - BAD ORIGINAL

J

A FIGURA 7 apresenta a resposta de j um paciente com um meianoma maligno em termos cs volume de tumor e de actividade de sintetase de 2¹,5'-ademilato antes e depois de mais de 75 dias de terapia com ARNdc;

A FIGURA 8 é uma série de quatro gráficos de HPLC que medem a presença de vários oligóme- i ros, especialmente de p^A^z antes e depois do início da terapia com ARNdc no paciente da Figura 7;

A FIGURA 9 é uma ilustração da acti vidade de LAK elevada num cancro carcinóide estabilizado em seguida a mais de 30 meses de terapia com ARNdc em com paração com a actividade de LAK em pacientes com tumores sólidos que nao recebiam terapia de ARNdc e de pacientes normais para comparação, e é usada para verificar as quan tidades de terapia de manutenção de ARNdc necessárias para manter um efeito clínico favorável durante um período de tempo prolongado; e í

A FIGURA 10 apresenta a resposta ! de um paciente com um adenocarcinoma no pulmão em termos de actividade das células NK e da dimensão mediastinal do tumor antes e quase 400 dias depois da terapia com ARNdc desemparelhado.

!

I

SUMÁRIO DA IN72NÇÃ0 ;

Descrevem-se processos para a prepa ração de composições terapêuticas úreis para a modulação do crescimento de células tumorais em direcção à normalização celular e para a perda do fenótipo celular maligno contendo ARNdc desemparelhado exógeno mediante a adminis-! tração destas composições a um paciente aumentando deste modo o nível de ARNdc intracelular do paciente. As célu las tumorais que não respondiam ou que apenas respondiam fracamente à linfoquina tornaram-se deste modo capazes de

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dar resposta. As composições terapêuticas podem conter i

uma linfoquina para administração conjunta com o ARNdc. Conseguem-se respostas particularmente drásticas tornando células tumorais indolentes capazes de dar resposta aos efeitos antiproliferativos dos interíerões.

DESCRIÇÃO DOS MODOS PREFERIDOS DE CONCRETIZAÇÃO

Conforme já afirmado, muitos indivíduos podem nao responder satisfatoriamente à terapia anti-cancerosa baseada na utilização de IFN isolado. Em consequência são necessários altos níveis de dosagem o que pc de ter como resultado que estes indivíduos podem vir a gerar resistência ao seu IFN natural. Para além disso, o facto de se poder desenvolver também uma resistência de outro tipo por células neoplásicas num fenótipo adquirido ! de modo não aleatório constitui uma consideração de extra ordinária importância na compreensão da melhoria drástica que as composições farmacêuticas da presente invenção proporcionam em relação a qualquer método que procure inibir

I a proliferação por meio da utilização de IFN isolado.

A administração de IFN e de qualquer ARNdc, isto é, de ARNdc perfeitamente emparelhado ou desem parelhado, “em combinação inclui formas de concretização nas quais os dois agentes são administrados em conjunto ' sob a forma duma mistura terapêutica e também quando os dois agentes são administrados separados mas simultaneamen te, por exemplo, por meio de injecções intravenosas separadas no mesmo indivíduo. A administração em combinação inclui ainda a administração separada dos dois produtos de tal modo que um dos produtos é dado em primeiro lugar seguido pouco tempo depois do segundo. Todas estas formas de administração possuem vantagens inerentes. a administração separada mas simultânea, por exemplo, permite uma regulação independente de cada agente e por conseguinte possibilita uma optimização terapêutica numa base indivi- 15 BAD ORIGINAL '

dual. A administração separada mas simultânea, por exem pio, permite uma regulação independente de cada agente e í por conseguinte possibilita uma optimização terapêutica numa base individual. A administração separada permite j que o IFN dado isoladamente estabeleça um efeito nas célu las, embora marginal, efeito este que é então amplificado por meio do uso de ARNdc. A preparação de IFN e do ARN-ί dc sob a forma duma mistura permite, como é evidente, umί acesso instântaneo a esta composição terapêutica nos casos em que os níveis óptimos foram previamente estabeleci^ âos. Os comentários precedentes aplicam-se a todos os casos apresentados na presente especificação, incluindo ! as reivindicações, quando um agente terapêutico é admini£ trado em combinação com outro.

i

Do mesmo modo os agentes terapêuti cos e as composições da presente invenção podem ser administradas por qualquer das vias corporais correntemente utilizadas como é do conhecimento da ciência médica. Foi ί

mencionada a administração intravenosa mas podem ser utilizadas outras vias, incluindo a intramuscular, a intratecal, a intracranial e intraperitoneal.

As linfoquinas incluem os interferões (alfa, beta e gama), de preferência o interferão alfa as interleuquinas, especificamente as interieucuinas 1, 2 ou 3 e a interleuquina 2 recombinante (rlL-2), e o factor de necrose tumoral (tumor necrosis factor = TNF). Também se consideram incluídas as células destruidoras ac tivadas por linfoquina (lymphokine activated Killer cells - LAK) formadas em animais em resposta à exposição a uma linfoquina.

Quando a linfoquina usada é o inter ferão (alfa), a quantidade administrada deve ser tal que proporcione O,Cl a 10C 000 IRU por mililitro do fluido ; corporal do paciente. Quando a linfoquina é a IL-2, de I

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preferência a rlL-2, a quantidade administrada situa-se 2 numa gama desde cerca de 10 unidades de iL-2 por Kg do peso corporal do paciente até um valor que se aproxima dos níveis inaceitáveis de toxicidade nesse paciente, o que pode ser tão elevado como 10θ unidades de IL-2. No entanto, é preferida uma dosagem na gama desde cerca de 3,7 até cerca de 10 unidades de IL-2 por Kg de peso cor poral.

Quando se administram os dois agentes, o ARNdc e a linfoquina, tal como anteriormente descrito, estes podem ser administrados sob a forma de uma mistura, ou administrados separadamente mas simultaneamen te ou ainda de modo sequencial.

Quando se administram em combinação a linfoquina e qualquer ARNdc, este pode ser administrado numa quantidade tal que tenha como resultado um nível de 1 a 1 000 ^ug de ARNdc/ml de fluido corporal, isto é, 3 solução de soro, sais, vitaminas, etc., que circula no in terior do organismo e banha os tecidos. Por exemplo, a administração de uma composição contendo 10 mg de ARNdc a j z z ' um indivíduo que pese 160 lb (72,5 Kg) tera como resultaί do um nível de ARNdc de aproximadamente 1 yug/ml. De mo :

do semelhante, a quantidade de IFN presente quando se a- / dministra uma combinação de ARNdc-IFN é a quantidade que ί dará corno resultado um nível de 1 a 100 000 IRU/ml no aluí, do corporal. O modo de administração da comoinação pode' ser tal como anteriormente descrito, isto é, sou a forma de uma mistura, por administração separada mas simultânea ou de modo sequencial. O que importa neste caso é que a administração seja funcionalmente sinergístice, qualquer que seja a forma física de concretização.

Por APXdc desemparelhedo (?) entende-se aquele ARNdc em que as ligações de hidrogénio (empilhamento das bases) entre as cadeias correspondentes

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estão relativamente intactas, isto é, estão interrompidas em média em menos de um par de bases em cada 29 resíduos í consecutivos de bases. 0 termo ASKdc desemparelhado deve ser entendido em concordância. 0 ARNdc pode ser um complexo de um poliinosinato com um policitidilato conten do uma proporção de bases de uracilo ou de guanidina, por exemplo, desde 1 em 5 até 1 em 30 destas bases (poli I . poli (C. - C_o ^x ou G). Em alternativa, podem ser complexados oligonucleótidos apropriados (pequenos fragmen tos de nucleótidos) com os polinucleótidos complementares apropriados ou com oligonucleótidos em certas circunstâncias.

ARNdc pode ser poli I . poli C,U, sendo neste caso a proporção de C para U de cerca de 13 para 1 e sendo os coeficientes de sedimentação do poli I e do poli C,U ambos menores do que 9 e a uma distância de 2 unidades um do outro, sendo ambos de preferência 6,5 a 7,5.

ARNdc pode ser da fórmula geral ri . r(C_ni U) e esoecificamente ri . r(C_nn, U) .

n 11-14 n ‘ n 12 n

Em seguida são discutidos outros exemplos de ARNdc adequa-| dos.

Os ARNdc's desemparelhados preferidos na presente invenção são baseados em copolinucleótidos seleccionados de entre poli(C , U) e poli (C , G) em que η n n é um número inteiro com um valor desde 4 até 29 e são i

análogos desemparelhados de complexos de poliribocitidilam to ír C ), oor exemplo por inclusão de resíduos de 2' n - C-metil-ribosilo. Estes análogos desemparelhados de j rl . rC , dos aueis os preferidos têm a fórmula geral I η η [

Π . r(C^2' ^u)_n > foram descritos por Cárter e Ts'o nas >

Patentes US 4 130 641 e 4 024 222. Os ARNdc's descritos nestas patentes são em geral adequados para utilização de acordo com a presente invenção.

- IS BAD ΟΓ-C!P -

semparelhados em:

para	ut iliz ação	na presente invenção
poli	(I) . poli	(c4,u)
poli	(I) . poli	(C.7,U)
poli	(I) . poli	(C13'U)
poli	(I) . poli	(c22,u)
poli	(I) . poli	(C2o,G)
poli	(I) . poli	(C2g,G) e
poli	(I) . poli	(C ) 23 G > P D

A quantidade de ARNdc desemparelha. do administrada é de preferência suficiente para provocar um pico de concentração no sangue desde 0,01 microgratnas por mililitro de ARNdc até 1000 microgramas por mililitro de ARNdc na circulação de sangue sistémica imediatamente a seguir à administração distai em relação ao ponto de per fusão.

Tal como descrito anteriormente, uma forma preferida da presente invenção é constituída pelo processo de preparação de ARNdc desemparelhado de fórmula ri . rC (C_n. U) e de composições farmacêuticas η n 11-14' n que o contêm úteis para inibir a proliferação de células neoplásicas. Verificamos que os ARNdc*s desemparelhados | causam efeitos farmacológicos mais suaves em relação aos i ARNdc¹s que apresentam um emperelhamento de bases perfeit o.

As actividades de outros tipos de IFN para além do IFN de fibrobla^tos humanos foram também examinados, incluindo as variedades naturais de IFN de leuj cócitos humanos e os IFNs produzidos em bactérias por meioí da utilização de tecnologia de ADN recomoinante (rIFN). ;

Fm todos os casos os IFNs apresentaram um efeito menor sobre o crescimento das células tumorais quando injectados isoladamente do que quando injectados em conjunto com ou

- 19 BAD ORIGINAL '

seguidos por ARNdc, quer fosse ARNdc emparelhado (ri rC ) quer desemparelhado ri ^r(Cll-14' ^U)n'

A reauçao máxima do crescimento das células tumorais conseguida por todos os IFNs administrados isoladamente foi de aproximaaamente 33 % em toda uma larga gama de concentrações de IFN injectado (10$ _até 3 x 10^ IRU por dia).

Em contras te, animais tratados com quantidades tão pequenas como 5

IRU por dia de IFN em combinação com um ARNdc apresentaram uma redução no crescimento de células tumorais humanas de 65 % ou superior,

Deste modo, o ARNdc usado em conjunção com qualquer forma de IFN tem como resultado um efeito quantitativamente superior. Para além disso, os tumores humanos geralmente necessitam de um regime de tratamento individualizado a fim de gerar o efeito terapêutico óptimo. Os esforços adicionais para individuali zar o programa de tratamento deverão ter como resultado uma eficácia terapêutica 10 vezes superior ou mais sempre que se usa um ARNdc desemparelhado em conjunção com o IFN.

Os dados demonstram claramente que o ARNdc amplifica a eficácia terapêutica de todas as formas de IFN, incluindo as formas naturais, sintéticas e hí bridas, como as derivadas em parte de IFNs alfa e em parte de IFNs beta ou gama, sendo todas estas formas sbrengi das no âmbito da presente invenção. Deste modo, a comei nação de ARNdc desemparelhado, em particular da fórmula ri . r(C_n. U), constitui uma formulação ootente con n 11 -14 ' — tra o cancro, ultrapassando em muito a capacidade do IFN isolado. Para além disso, sabe-se que o material tumoral humano estudado contém vários tipos de informação genética virai que contribui afirinativamente para o processo ma ligno e/ou para o processo patológico em tecidos humanos, causando a doença nos tecidos e a respectiva destruição.

Os dados por conseguinte demonstram o facto importante de que uma combinação ARNdc - IFN não é apenas eficaz como agente anti-canceroso mas também como agente anti-canceroso mas também como agente contra os componentes e doen- 20 BAD ORIGINAL

ças virais. De facto, as composições terapêuticas da pr sente invenção actuam contra qualquer doença na qual o tratamento com IFN possa ser indicado, incluindo doenças virais manifestadas por fases agudas, subagudas, latentes ou crónicas e incluindo também as doenças humanas disimunes nas quais a actividade virai serve para iniciar a pato loyia mas pode também desaparecer à medida que a doença autoimune humana se torna auto-pèrpetuante.

Deverá ser salientado que o papel de qualquer ARNdc em reforço sinergístico de qualquer tratamento combinado de ARNdc-IFN não é o de indutor do IFN, pois neste caso não se observaria qualquer sinergismo.

Pelo contrário, o ARNdc é um agente singular que contribui para suplementar e complementar a acção do IFN, proporcio nando deste modo um grau de flexibilidade e de eficácia que não poderiam ser conseguidos quer pelo ARNdc quer pelo IFN quando isolados no tratamento das doenças virais huma nas e do cancro.

Observei baixos níveis de actividades das células NK em alguns membros de um grupo de estudo incluindo pacientes com cancro no pulmão e indivíduos com uma história familiar de alta incidência de cancro. Estas observações são pormenorizadas seguidamente. Investiguei se a baixa actividade de células NK nos pacientes com uma história familiar de alta incidência de cancro poderia ser restabelecida para níveis normais através da adição de vários tipos de interferão e/ou com ARNdc desemparelhedo. Relatos recentes demonstram a ocorrência de diferença na eficiência do aumento das células NK (células derivadas de indivíduos normais) tanto entre os tipos naturais (Brit. J. Kaem., 50, 85, 1982) e os subtipos clonados (Can, Res, 42 , 1312, 1982) co interferão. Observei que o ARNdc desemparelhado apresenta a capacidade mais pronunciada de restabelecer níveis normais de aumento de células NK em indivíduos em risco de desenvolver cancro.

- 21 BAD ORIGÍMAL

A presente invenção é explicada mais em pormenor através dos exemplos que se seguem nos quais todas as partes e percentagens estão expressas em peso. O ARNdc (desemparelhado) usado nos exemplos que se seguem era da fórmula ri . r(C_in U) , por vezes n 11-14 n representado por ri . r(C.„, U) .

n 12 n

A. Novo mecanismo do ARNdc na modulação do crescimento novo mecanismo de modulação do crescimento apresentado pelos ARNdc's desemparelhados não é compartilhado pelas linfoquinas protótipo. Este demons tra a ampla base de utilidade dos ARNdc¹s na modulação de crescimento de células humanas aberrantes por um mecanismo diferente da indução de IFN. Especificamente, constatou-se a ocorrência de indução por ARNdc de um monofosfato cíclico de adenosina (cyclic adenosine monophosphate = cAMP) em células que se sabia serem insensíveis ao interferão alfa. Estes estudos foram conduzidos com dois inibidores de quinase de cAMP designados por fi-7 e HA 1004 (inibidores metabólicos conhecidos da quinase C de proteína e da quinase de CAMP) a fim de auxiliarem na avaliação^ da nova actividade de modulação anti-crescimento do ARNdc desemparelhado em face da resistência à terapia de linfoquina de modalidade simples usando interferão alfa para linfoquina protótipo.

A fim de demonstrar que o ARNdc desemparelhado não funciona por indução de prooução de iní terferão nas células insensíveis ao IFN, trataram-se célu-i las de glioraa humana (tumor cerebral) (A 1235) com o ARNdcí durante vários períoeos de tempo desde 0 até 8 horas. Ξliminou-se o ARNdc e adicionou-se meio fresco durante 24 horas, determinando-se os títulos de interferão (IRU/ml) em seguida por meio da análise de efeito citopático (Finter, N.G., J. Gen Virol. 5: 419-427, 1969). Os resultados são apresentados no quadro seguinte no qual o limite

- 22 BAD CiNOvJ

interior de detecção era de 5 IRU/ml.

QUADRO 1

Indução de Interferão em células de Glioma Humano tratadas com ARNdc

Célula indicadora

HFF

WI3H

Duração do tratamento (n) 0 2 4 6 8

5 5 5 5

5 5 5 5

A partir destes resultados concluiu-se que o ARNdc não induz o interferão nestas células insensíveis a IFN.

Em seguida submeteram-se células idênticas a um ensaio de confirmação a fim de determinar se os interferões desempenham qualquer papel nos efeitos antipro1iferativos causados pelo ARNdc nas células em questão. Este ensaio foi feito por meio do uso de anticorpos de interferão que, se presente, se ligará ao anticorpo e reduzirá o efeito antiproliferativo inuuzieo pelo ARNdc. Usaram-se três anticorpos de interferões diferen tes (alfa, beta e gama) a 240 unidades de neutralização/' /ml e um branco ou amostra de comparação. Os ensaios de inibição de crescimento celular foram levados a efeitos conforme descrito por iiubbell et al, Câncer Res. 44: 3252-3257 (1984). A percentagem de crescimento de comparação para o anticorpo foi calculada como se segue:

células tratadas (24 h) - células de comparação (0 n) células de comparação (24 h) - células de comparação (0 h)

BAD ORIGINAL

J

Os

I •Η t—( ο

Μ a

•Η

-μ d

Φ

π) ε

φ

	Já •Η C •Η
CM	0 {φ
Ο a	d φ
Q	3
*4	a
Ρ	Η
31	φ 0 Ρ φ

ο fi μ

Ο ο

Η

-Ρ

C

Φ resultados são

I o

Ή r—l cn φ

Ρ φ (0 Γ—1 ο

t—d 'φ ο

Ε φ

υ ρ

<

ο ο

a φ

ρ •Η

Ν

Ρ d

•Η Ο d ο φ ίΦ ε σ 3 φ η μ φ φ η ε ο

a μ

ο ο

•Η

-μ d

<

>-=>

a

H

I

H

P d

(0 «ο_ a

Η ι

Ή

-μ

C

Φ tf a

κ

I

Ή

-μ d

φ ο

d ο

ο

apresentados no quadro seguinte

ι—4	ο			3	r-1
•	•			•	«
ΓΟ	Γ\1			m
+ 1	+ 1			+ 1	+Ί
C0	η			σ	1“4
•	«			♦	«
Γ*	π	Q	Q	Ρ	σ\
C0	LO	3	3	ο	σ>
				ί—Ί	ι—4

	Γ~
•	«		•
	ι-1		ro
+ 1	+ 1		+ 1
C0	Ρ		σ
•	•		•
ο	ο	Q	Ίΐ·
σ	ρ	3	00

σ	ι—1	ο
•	•	•
Ρ	CN	ro
+ 1	+ 1	+ 1
ω		Ρ
•	•	•
ι—1	ιΓ)	Γ—1	Q	Ω	Ω
σ\	ι_Ω	σ\	3

'3	3	rO	ω
«	•	•	•
		CN	ΓΟ
+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
σ		σ	(Ν
•	•	•	•
σ>	ι—1	ο	ο
m		e	Γ-

r_j ε σ	<Η ε \ Ρ r-S Ηi	γ-4 ε \ Ρ Γν* Η	ί—I Ρ \ Ρ a ι
ο	Ο	Ο	Ρ
ο	ο	ο	CN
CN	>—1	ι—1

d φ

0 Ρ		«.Ti •Η	Κ	<41		pi
d		<“Η	I	I		1
φ		α	S	3		3
£		C	Ω	a		a
Φ	ΓΟ	Ο <	Η	H		O H
Ρ	cxl
φ	1-1				-tf
μ					Η
Η					a

BAD ORIGINAL 1

- - —d

Os resultados apresentados são em!

ι percentagem do crescimento da amostra de comparação em 24 horas. ND = Não disponível. Estes dados confirmam novamente que o ARNdc não induz o IFN nas células estudadas.

Verificou-se que o ARNdc induz o AI4P cíclico em células de glioma humano o que era directamente atribuível ao ARNdc e não por indução de IFN nestas células. Três inibidores metabólicos conhecidos, H-7, KA 1004 e toxina da coqueluche, inibem ou antagonizar o efeito antitumoral do ARNdc, conforme se apresenta nos quadros seguintes. O crescimento celular em percentagem foi novamente determinado, tal como no Quadro 2 acima, sen do o objectivo obter uma baixa percentagem de crescimento em relação à amostra de comparação. 0 ARNdc desemparelhado isolado provoca uma redução do crescimento em percen tagem da amostra de comparação; no entanto a presença de um inibidor metabólico aumenta o crescimento celular.

No Quadro 3, abaixo, apresenta-se o antagonismo do efeito anti-tumoral do ARNdc pelos inibidores metabólicos H-7 e AN 1004 em células de glioma humano, sendo novamente os valores apresentados como percentagem do crescimento da amostra de comparação para ARNdc em concentrações de 0 (branco ou amostra de comparação), 25 e 200 jug/ml.

BAD ORIGINAL

LUADRO 3

ARNdc ( ^ug/ml)

	0	25	2 00 1
H-7 ( ^àM) 0		66,7-12,6	! 48,2-5,4
5	103,3-13,6	108,3-15,5	75,2±4,5
25	87,5- 6,7	89,7-11,0	72,8-7,9
HA1004 ( yUE)
5	112,7-16,2	113,4— 3,2	94,1-13,4
25	113,2-14,3	117,2-16,7	1O1,7Í 6,8

De modo semelhante, um pré-tratamento das mesmas células de glioma humano com toxina da

I coqueluche inibiu a antiproliferação induzida por ARNdc, I conforme se apresenta abaixo. No Quadro 4 a percentagem 1 do crescimento da amostra de comparação é referida às 24 horas em células pré-tratadas durante 4 noras com toxina da coqueluche antes da adição de ARNdc. Verifica-se que !

os inibidores metabólicos conhecioos H-7 e HA 1C04 têm um !

i efeito mínimo sobre a inibição do crescimento em células í tratadas oor interferão alfa, enquanto que a toxina da co-i , , ί queluche parece ter um ereito oizasico - - nao provoca quí alquer alteração na inibição do crescimento induzida por : interferão alfa e altas doses e aumenta o efeito antiproli_ ferativo em doses baixas.

I

I

- 26 - '1

BAD ORIGINAL I

QUADRO 4

ARNdc ( yug/ml)

Tratamento	0	25	200
0		88,4-2,Ia	71,7±5,7
3 ^jg/ml	98,7-7,1	102,5-7,3	99,9-6,3
1 ^ug/ml	94,0-5,2	93,8-7,1	+ 1 93,2-5,1
C, 3 ^ug/ml	99,4-7,2	95,6-4,1	102,7-5,7
	Por	outro lado, o	IFN-alfa não au

menta os níveis de cAMP intracelular nas mesmas células durante um período de 24 horas, conforme se verifica no quadro seguinte. Neste procedimento, as células de giio ma humano (A 1235) foram expostas a zero (amostra de comparação), 25o e 1000 IRU/ml de IFN-alfa durante períodos desde o início da experiência até 24 horas.

QUADRO 5

Duração do _(IRU/ml)_ tratamento O 250 1000 <0,02

1	min	< 0.02	<0.02
5	min	<0.02	< 0.02
10	min	<0.02	<0.02
30	min	<0.02	< 0.02
1	h	<0.02	<0.02
2	h	<0.02	<0.02
4	h	< 0.02	<0.02
O	h	<0.02	<0.02
24	h	<0.02	< 0.02

- 27 RAD ORIGINAL^

Neste quadro, os valores são apre sentados em picamoles de cAMP/ jjg de proteína; o limite de detecção era de 0,02 pmol de cAMP/ pg de proteína.

Os níveis de cAMP intracelular foram em seguida medidos por via indirecta em células de gli orna humano tratados com ARNdc (A 1235) por medida da actividade de catálise de adenilato (pmol de cAMP produzidas em 15 minutos) imediatamente a seguir a doses antiproliferativas do ARNdc (25 e 200 ^ug/ml) em 30 minutos, conforme se apresenta na Figura lA, e depois de 24 horas na Figura 1B. Neste procedimento, as células foram tratadas com ARNdc desemparelhado, 25 (triângulo a cheio) ou 200 (quadrados a cheio) jug/ml de ARNdc desemparelhado. Nos instantes apropriados (Fig. lA; 0,5 a 30 min e Fig. 1B:

0,5 a 25 h) o meio foi retirado e as células foram congela das rapidamente em gelo seco. A actividade de ciclase de adenilato em células tratadas por ultra-sons foi medida pelo método de Young et al., Kolec. Endocrinol. 1: 884-988, 1987. Foram realizadas contagens de células às 24 noras a fim de verificar a actividade antiproliferativa.

l£_.

Mediu-se a indução de cAKP em cél las de glioma humano (A 1235) tratadas com ARNdc directamente em picamoles de CAMP por micrograma de proteína e os resultados são apresentados na Figura 2a para 30 minutos e na Figura 23 para 24 horas. Neste procedimento as células A 1235 foram tratadas com 25 (triângulos) ou 20C (quadrados a cheio) jug/ml do ARNdc desemparelhado. Nos

I instantes apropriados, o meio foi eliminado e o CAI.P intraj celular foi solubilizado em HCl 0,1 N. Os níveis de cAKPi foram determinados usando um método de RIA, conforme descrito por Reisíne et al., J. Cell. Biol. 102: 1630-1637, 1986. Os níveis de cAKP em células de comparação e em ί 1 jug/ml de ARNdc estavam abaixo do Foram realizadas contagens de células às 24 h a fim de verificar a actividade antiprolifera- 28 células tratadas com limite de deteccão.

BAD ORIGINAL ___.tió

t iva

Nestes quatro gráficos nota-se um aumento drástico no cAMP depois de apenas 30 segundos de exposição ao ARNdc (Figs. 1a e 2a) e uma manutenção do ní vel depois de 30 minutos. A medida às 24 horas, como nas Figs. 1B e 2B, mostra o efeito do ARNdc com o tempo.

i

Estes estudos confirmam que o aumeri to dos níveis de cAMP é directamente atribuível ao ARBdc uma vez que o ARNdc não induz o IFN nas células usadas. Doses antiproliferativas do ARNdc induzem a actividade de ciclase de adenilato dentro de 30 segundos após o inicio do tratamento. De modo semelhante, os níveis de cAMP intracelular aumentaram de um modo dependente da dose antiprolif erativa em 30 segundos. O pré-tratamento das células com toxina da coqueluche, também um inibidor do cAMP intracelular, seguido de tratamento com ARNdc inibe a inibição do crescimento induzida pelo ARNdc. Pelo con trário, as doses antiproliferativas de IFN-alfa humano natural não aumentam os níveis de cAMP intracelular durante um período de tratamento de 24 horas. Além disso, os I inibidores metabólicos conhecidos H-7 e HA 1004 têm um efeito mínimo sobre a inibição do crescimento em células tratadas com IFN-alfa, enquanto que se verifica que a toxi na da coqueluche tem um efeito bifásico, conforme se fez notar acima.

Em estudos do sistema de cAl-P em antiproliferação induzida por IFN (Panniers et al., J.

Cell Eci., 48: 259, 1981; Banerjee et al. , Virology 129:

230, 1983; Ebsworth et al., J. Cell Physiol. 120: 14o,

1934), estes autores verificaram que o cAitP não estava associado com o grau do estado de antiproliteração. Tanto quanto é do meu conhecimento, não havia qualquer estudo, antes dos aqui relatados, sobre os ARNdc¹s no mesmo sistema. Estes estudos apoiam as conclusões de que (a) os

BAD ORIGINAL

ARNdc's e as linfocuinas, das quais o xFN é um protótipo, têm diferentes mecanismos de acçao e (b) a antipro1ifera- ;

i ção induzida por ARNdc está associada com o sistema do cAMP (enquanto as linfoquinas não o estão).

Uma vez que o caAP tem uma natureI za de imbiquidade, isto é, a maioria das células, se não todas, possuem a informação genética necessária para sinte tizar um cAMP sob o estímulo apropriado, estas experiências indicam a ocorrência de uma ampla base de utilidade do ARNdc desemparelhado na modulação do crescimento, de célu las humanas aberrantes, sendo estas células relativa ou completamente resistentes ao IFN ou a outras linfoquinas quando administradas isoladamente. Estes resultados suge rem ainda que o ARNdc actua por meio de dois mecanismos se quenciais -- o primeiro mediado por quinase de caí-IP, seguido pela modulação da quinase C de proteína.

B. Síntese de proteína j

I í

I

As alterações proteicas intracelu-j lares em células tratadas com ARNdc reflectem a diferencia.ção e a perda do fenótipo celular maligno, uma propriedade que não é própria das linfoquinas. A normalização celular depois do tratamento com ARNdc foi estudada de acordo

I com o método de Soslau et al. , Biochemical and Biophysi- ;

i cal Research Communications, 119 : 941,943, 1984. Neste procedimento, células de tumor cerebral humano (A 1235) tratadas com doses antiproliferativas de ARNdc desempareIhado (200 yum/ml) ou de IFN alfa humano natural (100 pm/, /ml) apresentaram padrões significativamente diferentes de síntese proteica durante um período de 72 horas. A síntese proteica é um parâmetro importante uma vez que indica que as células anormais tratadas estão em vias de norI malização e indica a extensão ou a duração do efeito tera- I pêutico. Os resultados deste estudo estão representados no gráfico de barras da Figura 3. A síntese proteica foi

- 30 BAD ORIGINAL ______J

avaliada por meio da determinação das contagens por minuto de células a 1235 marcadas por isótopos radioactivog para um número de células pré-estabelecido. Estas célu-j las eram células não tratadas (amostra de comparação, bab ras em branco), células tratadas apenas com IFN-alfa a uma concentração de ICO jim/ml (tracejado inclinado baixando da direita para a esquerda), com A.RNdc (tracejado vertical) a 200 yum/ml e conjuntamente com IFN-alfa nas quantidades indicadas (tracejado inclinado subindo da direita para a esquerda). Efectuarara-se medições às 24, e 72 horas. A. linha por cima de cada barra representa uma unidade de desvio padrão.

Embora se tenham verificado alterações nominais às 24 horas com ambos os agentes em compara ção com as amostras de comparação, às 48 horas tanto o ARNdc como o IFN apresentavam aumentos significativos na síntese proteica, sendo a síntese proteica estimulada pelo ARNdc significativamente mais elevada doque a das célu las tratadas por IFN. Surpreendentemente verificou-se um aumento de 3 vezes na síntese proteica nas células tra tadas com ARNdc em comparação com as amostras de comparação e com as células tratadas com IFN, nas quais a sínte se proteica baixou para os níveis das amostras de comparai ção. 0 aumento contínuo na síntese proteica nas células?

I tratadas com ARNdc reflecte aparentemente alterações si- [ j

gnificativas nos tipos de proteínas específicas produzidas como resultado de alterações celulares induzidas pelo: ARNdc para um fenótipo celular mais diferenciado ou norma lizado. ;

Estudos de fcsforilação de prot eí- ; nas em células de carcinoma da bexiga tratadas com inter-ferão-béta mostraram a ocorrência de alterações signifi-i cativas na fosforilação de várias proteínas em comparação com células não tratadas (Soslau et al., Biochem. Biophy. Ac ta , Vol. 119, 1934, p. 941). Em contraste os meus

- 31 - -j

BAD ORIGINAL

estuaos sctuais (geis de poliacrilamida não apresentados) com ri . r(C,, .., U) demonstram alterações inteiramente diferentes nos padrões de fosforilação em comparação com as células tratadas com interferão. Estes dados reforçam ainda mais as diferenças moleculares entre os ARNdc ' s e as linfoouinas em termos de mecanismos da modulação das células tumorais, de retorno para fenótipos celulares mais normais e de diferenças fundamentais nas vias utilizadas na modulação de imunodiferenciação e de imuno-competência.

Para um especialista nas técnicas oncológicas e imunológicas, na prática da invenção básica aqui descrita de vários modos, seleccionar-se-à uma carac terística proteica específica do processo maligno para uma célula de interesse ou uma característica da recupera ção da célula maligna de interesse e acompanhar-se-ão as alterações na proteína ou no grupo de proteínas seleccionadas à luz da invenção aqui descrita. Factores que variam de indivíduo para indivíduo podem afectar a necessidade líquida de ARNdc desemparelhado durante um período de tempo, não diminuindo contudo a utilidade da presente j invenção. Nota - a presença de níveis extraordinariamen te elevaaos de nucleases ou de fosfodiesterases pode alterar ou fazer com que o médico modifique a concentração da terapia com ARNdc necessário em oposição aos apresentados nos exemplos e experiências aqui referidos. É de esperar variações de paciente para paciente, como em muitos aspectos da medicina clínica.

Os estudos de síntese proteica permitem seguir do princípio ao fim os mecanismos subjacentes;

I determinar a cinética do desencadeamento da acção do pro-i duto; a grandeza da acção do produto permite assim avaliar o número de células em normalização e a duração da acç;ão j do produto e portanto a duração do efeito terapêutico, de í modo não antecipado ainda pelos numerosos resultados de I

- 32 bMú ORIGINAL j

investigação relatados neste campo pelo requerente. | i

C. Necessidade intrínseca de ARNdc em células tumorais para actividade anti-crescimento do IFN

Determinei que a actividade anti-crescimento do interferão em células tumorais ocorre ape nas raramente e principalmente quando as células de tumor sensíveis ao IFN têm ARNdc intrínseco pré-existente numa quantidade suficiente residente nas células. a activida de anti-crescimento em células que não possuam ARNdc intrínseco ou que o possuam apenas em quantidade insuficiente pode ser provocada por aplicação de ARNdc (por adminis. tração) para cirar condições de suficiência de ARNdc.

Sabe-se que os interferões induzem a enzima dependente de ARN de dupla cadeia sintetase de 2’,5'-oligo-A, a qual está implicada na inibição do crescimento celular. Os resultados das minhas investigações indicam que os ARNs de dupla cadeia funcionam essencialmente como cofactores para a activação da enzima, umaί fase distinta da indução por interferão desta enzima. ΐ

Historicamente, estas duas acçÕes têm sido erroneamente j agrupadas tendo como resultado uma diminuição drástica no potencial dos benefícios terapêuticos dos dois agentes, quer isoladamente quer em combinação. Demonstro agora que os ARMdc¹s ocorrem naturalmente nas células mononucle! ares do sangue periférico (Ci-iSPs) de alguns indivíduos, ' nomeadamente em pacientes com leucemia das células filamentosas, embora não ocorram nas CNSPs de inoivíduos nor-ί mais. Sem dúvida, a presença dos ARMdc's em pacientes i _r !

com leucemia das células filamentosas explica agora aparentemente pela primeira vez a conhecida eficácia do in- ; terferão nos casos em que o interferão é dado isoladamente e proporciona uma dicotomia crítica adicional entre o IFN e o ARNdc, a qual pode ser explorada terapeuticamente.

BAD ORIGINAL

Nomeadamente, a eficácia clínica do interferão é devida a i indução de uma enzima (a sintetase de 2¹,5'-oligo-a) na j !

presença de ARNdc natural intracelular pré-existente, enquanto que o ARNdc exógeno actua principalmente por activação de enzimas pré-existentes nesta via particular de regulação do crescimento.

A fim de verificar a validade desta minha hipótese original, isolei ARNs nucleares de indivíduos normais para comparação e rIFN-c<A de células de leucemia (HeLa) de células filamentosas, fraccionei este material em gradientes de sacarose e investiguei a respectiva capacidade de activação de sintetase de 2',5'-A de alto peso molecular purificada. Nenhuma das fracções dos ARNs das células HeLa não tratadas mostrou capacidade de activação da sintetase. No entanto, a fracção do ARN nuclear heterogéneo (ARNnH) das células tratadas com IFN activou a sintetase de um modo dependente da dose. Por aná lise de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) dos produtos enzimáticos verificou-se que se formaram trímeros e tetrâmeros activos de 2',5'-A. Também fraccionei ARN nuclear de células mononucleares de pacientes com leucemia de células filamentosas, os quais são extremamente sensíveis à terapia por IFN, e demonstrei a ocorrência de altos níveis de ARNdc¹s activanóo a sintetase de 2',5'-A na fracção de ARNnH. Por análise de HPLC verificou-se a oco rrência da formação de trímero, tetrâmero, pentâmero e he-| xâmero biologicamente activos de 2',5¹-A (proporções aproj ximadas 53:15:4:1). Cs ARNs nucleares de células mononuj cieares normais não provocaram activação. Estes resultados indicam que existem ARNs nucleares naturais que, quan-¹ do presentes em células relevantes, neoplásicas ou outras, podem participar na regulação do crescimento pelo IFN. De facto, existe uma necessicaae crítica de uma resposta do \ interferão até agora não detectada. Estes factos permi tiram-me deduzir que deficiências nestes ARNdc's podem con duzir a uma ineficácia do IFN, a qual pode, no entanto, — 34 —

BAD ORIG^tMAL!

ser ultrapassada por ARNdc exógeno, um ponto que eu pude investigar e confirmar por meio de ensaios clínicos conforme descrevi em outro local na presente memória descri t iva.

A fim de ser eficaz, a actividade de IFN necessita da presença de ARNdc na célula em que se pretende a actividade de anticrescimento, o que é raro Aparentemente esta presença é necessária a fim de que a célula tumoral seja receptiva/sensível à terapia por IFN. Alguns investigadores agrupam erradamente os IFNs e os ARNdc's em conjunto. A partir destas investigações e de outros relacionadas parece que os ARNdc¹s são cofactores que activam a enzima sintetase de 2',5'-oligo-A. As células tumorais insensíveis aos IFNs, quando lhes é fornecido ARNdc exógeno, tornam-se susceptíveis à terapia com ARNdc com êxito. Em células que respondém ao tratamento por IFN, pensa-se que o ARNdc ou os ARNdc's intrace lulares possuem uma estrutura tridimensional muito semelhante aos ARNdc¹s desemparelhados, principalmente aos rl^ . r(C^^ U) da presente invenção, com base nas respectivas propriedades biológicas e catalíticas e de falta de toxicidade, na função imune intensificada quando em comparação com a função citotóxica bem como em outros dados, como seja nos parâmetros de cAKP e de células turno rais.

As células que não responaem às linfoquinas em geral e aos IFNs em particular tornam-se capazes de responaer se lhes for primeiramente fornecida uma quantidade eficaz de ARNdc exógeno a fim de induzir a síntese do ARNdc intracelular pretendiao que participa na regulação do crescimento celular em associação com um interferao, e terapêutico, cer o ARN d c , fornecendo em seguida o IFN, agora tornado enquanto opcionalmente se continua a fornese necessário.

BAD ORIGINAL

D. Respostas de enxerto de tumor de rim humano

As respostas de enxertos de rim humano a IFN e a ARNdc são fundamentalmente diferentes em termos de sobrevivência a longo prazo e de grandeza do efeito, conforme explicado na investigação que se segue.

Utilizei vários sistemas animais originais utilizando enxertos de tumores humanos em ratos atímicos a fim de mostrar uma resposta inesperada e diferencial aos interferões e a ARNdc. Por exemplo, o carci noma das células renais humanas demonstrou um crescimento tumoral progressivo e não se verificou aumento da sobrevivência durante o tratamento com interferão alfa, enquanto que observei diminuições significativas na dimensão dos tumores e aumentos drásticos na sobrevivência com o tratamento por ARNdc. De facto, após morte com idades de 2 a 4 anos por causas naturais, 95 % dos ratos tratados com ARNdc não mostraram a presença histológica de tumores na autopsia. Este resultado é completamente inesperado, uma vez que as remissões de cancro causadas por linfoquinas (por exemplo, por IFN) são notoriamente de curta duração e existem poucos ou nenhuns exemplos de animais sem tumor depois de vários meses. Deste modo, a observação duma taxa de cura de 95 % por critérios histológicos e de dados de sobrevivência é completamente inesperada. Para além disso, a actividade das células destruieoras naturais (na¹ tural killer = NK) esplénicas foi aumentada nos animais tratados por ARNdc enquanto que não se notaram aumentos de actividade das células NK em ratos tratados com interferão.

Notaram-se diferenças semelhantes na inibição do crescimento entre o interferão gama e o ARNdc em dois modelos diferentes de enxertos e também observei diferenças pronunciadas no carcinoma humano RI'4 da bexiga e no glioma A 1235 cerebral, humano, conforme rela

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tado acima. Sm toccs os casos, verificou-se uma inibiçãd significativa estatisticamente de crescimento tumoral nos animais tratados com ARNdc enquanto que se verificou uma inibição mínima de crescimento com interferão gama isolado. Também se observaram diferenças significativas na actividade de células NK esplénicas com aumento da actividade NX pelo ARNdc mas não se notou qualquer aumento na actividade NK pelo interferão gama.

Foram observados efeitos semelhantes em termos de aumento de actividade imune; no Quadro 6 apresentado em seguida reunem-se os resultados com tumores cerebrais. As dosagens foram de 20 000 IRU de interferão por dia e de 2 a 3 doses semanais (200 a 500 yjg por dose) de ri . r(C.. , ,, , U) · Um estudo cuidadoso de an 11—14 n mostras de sangue (obtidas em série a intervalos regulares da veia caudal) mostrou que o ARNdc da ciasse química descrita noutro local da presente memória descritiva poderia ser administrado indefinidamente sem qualquer efeito renal, sobre a medula óssea ou sobre a função imune inconveniente', sendo de notar que estes órgãos têm sido histericamente j considerados como expressando toxicidade.

No Quadro õ, que se apresenta em seguida, mostra-se a activicade celular imune em células do baço de ratos tratados com INN-gama e/ou com ARNdc.

C estudo reúne células efectcras (células imunes ootióas por cirurgia a partir de baços de animais com enxertos de tumores humanos) a células visadas (neste caso, tumores ou células cereorais humanos) na proporção incicaca. A célu la efectora é uma célula imune ou do sistema imune e a célula visada é uma célula do cancro específico de interesse. Os resultados são apresentados sob a forma de percentagem ! de citotoxicicede (morte celular) como resultado do trata-i mento (IFN, ARNdc ou ambos). Uma percentagem de toxicidade superior à amostra de comparação indica uma melhoria na erradicaçao das células tumorais.

- 37 BAD ORIGINAL quadro

Tratamento por células efectoras

Comparaçao

200 : 1

100 : 1 : 1

IFN gama

200 : 1

100 : 1 : 1

ARNdc

00 : 1

100 : 1 : 1

IFN gama + ARNdc

200 ; 1

100 : 1 : 1

Comparação

16,3

14,2

7,5

6,4

2,9

2,8

2,3

22,8

13.2

28.7

22.8

17.2

Curiosamente, neste ensaio o ipq-gama matou menos células qo que no grupo de comparação (sem qualquer tratamento), enquanto que o ARNdc isolado deu os melhores resultados com o tratamento combinado logo a seguir,

- 3 3 - BAD ORIGINAL ' ι

A eficácia do ARNdc, especificamente do ri . r(C,, U) , contra tumores cerebrais hu π jl i “ JL - n manos enxertados em ratos atímicos em comparação com o IFN-gama é ilustrada na Figura 4 dos desenhos. Esta figura é um gráfico que compara a dimensão bi-dimensional do tumor, calculado em comprimento vezes largura, em n;^z.

A linha que une as circunferências refere-se ao grupo de comparação (sem qualquer terapia); a linha que une os tri ângulos a branco refere-se ao IFN-gama isolado (p >0,5); a linha que une os quadrados a cheio refere-se ao ARNdc rl^ . ^r(^cj_2_q4' ^u)_n (p>0,50). Os tumores são medidos do IO⁹ aos 31⁹ dias a seguir ao início da experiência.

ARNdc foi eficaz na redução da dimensão do tumor quan do em comparação com o IFN-gama que apenas era ligeiramen te mais eficaz do que a amostra de comparação.

E. Exemplos clínicos de tumores resistentes a linfoguinas que respondem a ARNdc

Desenvolveu-se uma metodologia al. ternativa a partir de um modelo animal a fim de avaliar os tumores susceptíveis ou resistentes a terapia por IFN e de identificar os casos em que é provável uma sinergia clínica potencial para a terapia da combinação de IFN e de ARNdc. Uma técnica como referido é a técnica de análise cologénica de tumores humanos desenvolvida por Hamburger e Salmon (primary Bioassay of Numan Tumor Stem Cells, Science, 197 : 461-463, 1977), que permite prever de modo seguro a resposta clínica ou a resistência aos produtos anticancerosos em. pacientes individuais com um grau de precisão de 90 a 95 p ao nível celular com um grau de confiança para prooutos inactivos e d« para os produtos activos.

7' 5 a óc

A análise colonogénica é levada a efeito de acordo com. os procedimenros de Hamburger e Salmon como se segue. As células tumorais ou as células

- 39 BAD ORIGINAL

leucémicas frescas são obtidas do paciente e preparadas sob a forma de uma suspensão unicelular. Aplica-se a um$ placa de agar ou de metilcelulose ou às células depois co cultivo urna concentração pré-determinada do candidato a agente terapêutico, calculada a partir da literatura e de outras normas de dosagem. as células são lavadas e inoculadas em agar ou em metilcelulose e incubadas em placas de Petri a 37°C para permitir o crescimento de colónias de células. A seguir a um período prê-determinado de crescimento celular, as colónias são inspeccionadas visualmente com um microscópio e o número de colónias em cada placa de Petri é contado. Estudam-se então a biologia e a composição celular das colónias em mais pormenor, incluindo a morfologia, a cariologia, a auto-renovação e a imunologia celular e os efeitos das células em ratos atí. micos (pelados). As células são analisadas usando anticorpos monoclonais e sondas de ácidos nucleicos. as aná lises colonogénicas representam uma abordagem fidedigna para o ensaio da quimiosensibilidade de células tumorais in vitro.

i j

Levaram-se a efeito ensaios de aná j lise colonogénica em vários especimens de tumores no labo ratório do inventor. ao contrário da ausência de activi. dade antitumoral esperada, conforme descrito em vários sim pósios sobre o tratamento do cancro (Compilation of Phase II Results with Single Antineoplastic Agents, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Volume 4, 19S5) que relatam que cerca de 1G0 indivíduos receberam poli I.poli C sem · qualquer resposta completa ou parcial, o inventor observou) uma taxa de resposta prevista de 42 usando um AxHdc de- ^! semparelhado numa ampla variedade de tumores sólicos huma-j nos histologicamente insensíveis à terapia por polinucleó-i tidos. ' !

ί l

Com finalidade de avaliação clínica

- 40 BAD ORIf ? ' &ξξ§$& #ft*C£aayv?. -v^- _

preliminar, os tumores considerados sensíveis apresentaram uma diminuição celular superior a 60 % no número de clones de células tumorais.

Na grande maioria dos exemplos levaram-se a efeito ensaios concorrentes com indivíduos tan to no laboratório como na clínica a fim de determinar a sua sensibilidade tumoral a várias classes genéricas de IFN e/ou a várias tipos de interleuqqinas. Especificamente, os indivíduos que participaram nos estudos com ARN dc tinham anteriormente sido submetidos a vários tratamen tos clínicos sem êxito com os interferoes ou com as inter leuquinas em doses julgadas eficazes com base em dados médicos publicados. Em todos os casos a metodologia com a linfoquina específica não teve êxito na prevenção da con tinuação do crescimento dos tumores e numa maioria de casos os perfis das células imunes mantiveram-se sem modofi cação ou em muitos casos chegaram a diminuir (piorar) em relação aos valores verificados antes da perfusão da linfoquina específica isolada.

laboratório clínico em que se ree lizaram as investigações da presente invenção estabeleceu pelo menos três resultados inesperados: !

. o ARNdc desemparelhado preferido dá bons resultados enquanto que o poli I . poli C não;

. o ARNdc desemparelhado preferido é eficaz enI quanto que o IFN isolado é ineficaz;

j

I . existe sinergismo quando se empregam em comoinação o ARNdc desemparelhado preferido e uma. linfoquina.

Estudou-se a sensibilidade relativa de vários tipos histológicos de tumores humanos ao ARNdc desemparelhado (ver Quadro Ί abaixo). A experiência inbadorigijy .L '

dica que mais de 42 % de uma grande variedade de tumores diferentes, especialmente de tumores sólidos, se bem que resistentes à exposição a linfoquinas quando isoladas, são extremamente sensíveis aos efeitos antiproliferativos da configuração molecular específica dos ARNdc's.

Tipo histo lógico

QUADRO 7

Quantidade Quantidade de de sensíveis resistentes

Carcinoma endometrial 2

Glioblastoma 4

Carcinoma do pulmão 3

Carcinoma das células renais 33

Carcinóide 3

Carcinoma protático 1

Carcinoma de mama 4

Kelanoma 5

Carcinoma colo-rectal 5

Sarcoma 1

Carcinoma do esófago O

Kesotelioma 0

Carcinoma pancriético O

Carcinoma gástrico 0

Meduloblastorna 0

7

2

Percenta gem de sensíveis

100 80 60 52 50 50 36 36 3 õ 13 ⁰ i 0 O

TOTAL 61 85 42% 1

Esta observação é inesperada pelo , manos por duas razões -- a biomérica história dos ARNdc's , ~ 1 em geral e a ausência de utilidade clinica nas 1inroquinas.

Os efeitos do IFN-alfa, do IFN-beta e do ARNdc desemparelhado preferido na análise colonogéni ca descrita acima são apresentados graficamente em células

-Tí-J

BAD ORIG/N

de melanoma na Figura 5. A percentagem de colónias em j relação à amostra de comparação é representada em função da dose de ri . r(C_ln .., U) em microgramas oor ml e em IRU/ml para os interferões; a linha de base corresponde a 100 % das colónias da amostra de comparação. Notar que ambos os IFNs estão acima da linha de base (sem regu- j lação) excepto quando em quantidades citotóxicas. j í

!

I

Na Figura 6 apresenta-se o efeito antiproliferativo sinergístico de IFN-alfa e rl^ .r(C₁₂,U) no carcinoma celular renal humano, também em percentagem do número de colónias da amostra de comparação. Usa ram-se duas quantidades de ri . r(C_n_, U) a 50 e a 100 n 12 n microgramas por ml em cada combinação. a concentração de IFN-alfa foi de 0 a 3000 IRU/ml, o que é bem acima das con contrações terapêuticas normais do IFN-alfa.

Ha uma interrupção na linha a seguir às leituras iniciais (indicando a ausência de efeito sobre às colónias de comparação para o IFN, cerca de 62 / para ; 50 e cerca de 50 % Dara ICO ri . r(C\„, U) e em seguidai uma leitura para 100 IRU/ml de IFN-alfa. Conforme estes ! dados mostram, o IFN-alfa isolado não era eficaz na gama de dosagens clinicamente aceitáveis; apenas se verificou eficácia para o IFN-alfa acima destas dosagens mas a níveis cititóxicos, níveis demasiaaamente elevados para utilização clínica. Os resultados desta análise inoicam que para umã terapia eficaz a quantidade de IFN deve ser reduzida para i um nível clinicamente aceitável e, de preferência, deve ^! ser suplementado com outro agente anriproliferativo.

Verificaram-se casos específicos de efeitos sinergísticos em 63 % dos melanomas, 50 % dos cancros da mama, 80 % dos carcinomas do ovário e 65 / dos c&r cinomas renais para a terapia combinada de IFN-alfa + rl^/

I . r(C.„, U) . Deste modo pode ser determinado a partir n

destes exemplos que (a) a aplicação de ARNdc's desemparelha

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dos específicos em estados resistentes a linfoquinas apre senta utilidade clínica; (b) nos casos de resistência ao ARNdc isolado, uma combinação judiciosa com linfoquinas deverá ter como resultado um benefício terapêutico significativo na maioria dos casos.

F. Apresentam-se em seguida três exemplos clínicos que confirmam a eficácia da presente invenção

Paciente n2 1 - melanoma malicno

--- - ----- - — - - — - - 0 paciente η® 1, do sexo masculino e de meia idade, tinha um melanoma maligno que não respon dia clinicamente nem a IFN nem a IL-2. A administração de ARNdc (300 mg duas vezes por semana) teve como resultado a eliminação completa do tumor (de acordo com a determinação da massa do tumor) ao fim de 80 dias de terapiai; ver Figura 7. Esta resposta favorável continua eproxima□amente após 2,5 anos a partir do tratamento inicial. A dose actual de manutenção situa-se entre 50 e 100 mg duas í vezes por semana. A dosagem é determinada por consioera j ção da resposta clínica à luz de parâmetros de laboratório!, i

incluindo o nível relativo da enzima sintetase 2',5'-a e a capacidade de detectar intermediários bioquímicos activos no efeito induzido pelo ARNdc, tais como os níveis de ARP cíclico descritos acima ou a presença de classes específicas de moléculas de 2',5'-A que possam prejudicar a situação de paragem do tumor bem como um perfil melhora do das células imunes. Estas circunstâncias são icUslmeij te apresentadas na Figura 7, na qual o inventor determinou aumentos aproximadamente contemporâneos de sintetase de 2',5^{* 1}-a, de cAKP e de oligómeros de 2¹,5'-a bioactivos, ! nenhum dos quais estava presente enquanto o paciente rece beu terapia de linfócitos ou no seu período de Nash-out sem tratamento. A activicade de sintetase de 2',5(-ademilato (pmol de ATP/ jag de proteína) está indicada pelos

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pontos representados por círculos a cheio em relação ao volume da massa do tumor (indicada pelos pontos representados por triângulos a cheio) para vários dias antes do início da terapia, com o início da terapia com ARNdc desemparelhado e no fim da terapia cuando se observou uma resposta completa (virtualmente anulação do volume do tumor) .

Veja-se também a Figura 8 para o mesmo paciente, na qual se apresentam os oligómeros designados por P3A3 e superiores (determinados por cromatografia líquida de alta pressão), verificando-se que estes oligómeros não aparecem senão após administração do ARNdc desemparelhado, e note-se a correlação entre a presença destes oligómeros e a resposta clínica. Os vários oligó meros foram medidos a intervalos de 25 dias antes da tera pia com o ARNdc desemparelhado e 1, 23 e 55 dias após o início da terapia. Verificou-se, tanto no laboratório do inventor como noutro local, que os oligómeros de baixo peso molecular (dímeros) são especialmente bioinertes em relação às propriedades de anticrescimento (antiproliíera ção), antivirais e de intensificação imune.

Fenómenos bioquímicos semelhantes prejudicam a elevação prolongada na actividade das célula destruidoras activadas por linfoquinas (lymphokine-acti. vated killer = LAK) e a regressão estável da doença e/ou drástica do tumor resultante, tal como representado na Figura 9, r.a qual se apresenta a medida da elevação ce ac tivicade das células LAK (em % de libertação específica de Cr) num paciente com um estado de doença estabiliza do (cancro carcinóide) a seguir a mais de 30 meses de terapia com o ARNdc (coluna da esquerda) em comparação com pacientes ccrn tumores sólidos que não receberam terapia com ARNdc (centro) e pacientes normais ou indivíduos para comparação (coluna da direita). Fstes dados sgo us dos para verificar a quantidade relativa de agente terapê

- 45 BAD ORIGINAL tico necessária para manter um efeito clínico favorável durante longos períodos de tempo, como em terapia de manutenção a seguir ao domínio inicial do tumor, mesmo em presença de resistência às linfoquinas.

Paciente ns 2

Tem um significado particular o reconhecimento efectuado pelo inventor de que a disseminação do cancro para os ossos pode ser reduzida drasticamente pela combinação de ARNdc com IFN. Por exemplo, o paciente n? 2, com cancro das células renais e com abundantes metásteses ósseas, apresentou uma resposta rápida e prolongada após receber uma dose diária de apenas 1,5 m unidades de IFN-alfa e 300 mg de ARNdc administrada duas vezes por semana. Num caso de leucemia crónica, um regime semelhante induziu remissões prolongadas numa alta percentagem de indivíduos, enquanto que os pacientes que rece beram IFN-alfa isolado não apresentaram qualquer resposta clínica significativa.

Paciente ns 3 paciente rd 3, do sexo masculino de meia idade com um tumor no rim resistente a IFN, apresentou um início rápida da redução do tumor contemporaneamente com uma alteração no perfil dos olicómeros de 2',5’-A, um início rápido da modificação da via do cANP e um aumento drástico na actividade de imunovigilância. Estas verificações clínicas e laboratoriais significativas per- ί sistiram durante 3õ meses consecutivos e não foram acompanhadas por quaisquer efeitos secundários relacionados com a terapia.

I

Foram obtidas observações clínicas semelhantes com êxito clínico na maioria dos tumores resis tentes a linfoquinas, incluindo as formas mais letais e

- 46 BAD ORIGIN/.

indolentes do cancro do pulmão, apresentando-se suntariamente na Figura 10 os respectivos dados. a comparação da actividade das células NK (medida em unidades líticas e em dimensão mediastinal da dimensão do tumor (em 2 mm )) foi medida por um escrutinizador de CT. São apresentados os resultados relativos ao início e ao fim de cerca de 400 dias de terapia com ARNdc desemparelhado.

paciente apresentou uma resposta clínica completa à terapia na base de medições da dimensão do tumor.

Claims (1)

1. Processo para a preparação de um ARNdc (ARN de dupla cadeia) desemparelhado caracterizado por se ligarem complexos oligómeros, complexos poliméricos ou ambos, de preferência oligonucleótidos, que hibridam com ARN polimérico de cadeia simples complementar de modo a formar o ARNdc duplex.

   - 23 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ARNdc conter regiões de quebra de ligação e apresentar as propriedades de proporção terapêutica favoráveis de ri ,r(C_ni ,„,U) .

   n 11-14 n

   - 3ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o ARNdc ter uma estrutura tridimensional idêntica à do ARNdc no qual as células tumorais que se pretendem tratar são deficientes.

   - 4 - i

   J ΐ

   J

   Processo para a preparação de i uma composição farmacêutica útil para a modulação do cres cimento de células tumorais e para a perda do fenótipo de células malignas caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um ARNdc quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3.

   - 5ã de acordo com a reivindi

   BAD ORIGINAL

   Processo 48 cação 4, caracterizado por a composição farmacêutica con ter também uma linfoquina numa quantidade eficaz para a inibição do crescimento tumoral.

   - 6a Processo de acordo com a reivindi cação 5, caracterizado por a linfoquina ser uma interleuquina ou um interferão.

   Lisboa, 6 de Julho de 1988.

   BAD ORIGINAL

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DS ARNdc 5 DE

   COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM ÚTEIS PARA A MODULAÇÃO DE ESTADOS CELULARES

   RESISTENTES A LINFOQUINAS

   A invenção refere-se a um processo para a preparação de um ARNdc (ARN de dupla cadeia) desem parelhado que compreende ligarem-se complexos oligómeros, complexos poliméricos ou ambos, de preferência oligonucle ótidos, que hibridam com ARN polimérico de cadeia simples complementar de modo a formar o ARNdc duplex.