PT87972B - Processo para a preparacao de4'-deoxi-13(s)-dihidro-4'-iododoxorubicina com actividade anti-tumor mediante reducao estereo-selectiva microbiana de 4'-deoxi-4'-iododoxorubicina - Google Patents

Description

A presente invenção diz respeito a um derivado da dodox£ rubicina, a sua preparação e a composições farmacêuticas que o contem.

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De acordo com a presente invenção, proporciona-se o com posto 4¹ -deoxi-13(S)-di-hidro-4¹ -iododoxorubicina, com a fórmula de es trutu ra (11)

e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Um microrganismo pertencente ao gênero streptomyces ê utilizado para a redução estereo-selectiva do grupo funcional cetona ligado ao carbono 13 da 4'-deoxi-4¹-iodo-doxorubicina de

-2Cs fórmula de estrutura (I).

para fornecer a 4'-deoxi-13-(S)-di-hidro-4'-1ododoxorubicina es peeificamente, um dos dois possíveis estereoisómeros do carbono 13 de 4'-deoxi-13-di-hidro-4'-iododoxorubicinas. 0 novo compos^ to de formula (II), designado daqui em diante como FCE 24883, é útil como agente anti-tumoral e exibe nos tumores experimentais uma actividade comparável ã de 4'-deoxi-4¹-iododoxorubicina (de fórmula de estrutura I). 0 substracto para a redução estereo selectiva microbiana Ó um análogo semi-sintético da doxorubicina descrito na nossa patente de invenção norte americana A-4438105 de 20 de Março de 1984.

Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um processo bio-sintetico mediante o qual um mutante da espécie de

Streptomyces pencetius, designada por estirpe M87 F. I. e dep£

-3sitada na Deutsche Sammlung von Mi kroorgani sm e que foi regis_ tada com o níimsro de deposito DSM 2444 , e que é caracte ri zada pela sua capacidade para reduzir estereo-selectivamente o grupo funcioual cetona-13 da 4 '-deoxi-4¹-iododoxorubicina (I). 0 composto FCE 24883 (II) resultante acumula-se nos caldos de fermeji tação. 0 FCE 24883 (II) pode ser recolhido dos caldos de fermentação e as soluções brutas do seu concentrado purificadas.

A presente invenção também proporciona o processo para a preparação de 4¹-deoxi-13(S)-di-cidro-4¹ -iododoxirubicina de fÕ£ mula de estrutra (II) ou de os seus sais aceitáveis em farmácia, o qual co-siste na cultura da estirpe M 87 F. I. Streptomyces peuceti us (DSM 2444) na presença de 4¹-deoxi-4 '-iododoxorubicina e recuperação da 4 ¹ - deoxi-1 3 (S )-di-hi dro-4'-i ododoxorubi ci_ na resultante ou sob a forma de um seu sal aceitável em farmácia.

A presente invenção abrange no seu âmbito o novo agente anti-tumoral antraciclina FCE 24883(11) sob a forma pura de cl£ ri drato.

A presente invenção também proporciona composições farm£ ceuticas que incorporam o composto de formula (II) ou um seu sal aceitável em farmácia, conjuntamente com uma mistura de um diluente ou veiculo aceitável em farmácia.

Descrição Detalhada da Presente Invenção

Faz-se a mutação do microrganismo Streptomyces peucetius subespécie aureus ATCC 31428 uti1izando-se nitrosoguanidina , pa_ ra proporcionar um microrganismo laboratorial designado por Streptomyces peucetius estirpe M 87 F. I. que selectivamente transforma o composto (I) no composto (II). A estirpe M 87 F. I.

-4de _S. peuceti us foi atribuída o numero de depósito DSM 2444 pela Deutsche Sammlung von Mikroorganism, Alemanha Ocidental, que foi depositado na sua colecção permanente.

A morfologia da estirpe mutante M 87 F. I. é indistinguí vel da estirpe mãe S_. peuceti us ATCC 31 428, apesar das culturas de ambas serem nitidamente distinguíveis nas suas característi cas culturais e bioquímicas.

De facto, a estirpe mutante M 87 F. I. não produz em meios agar o pigmento solúvel amarelo palha ate amarelo limão que cara£ teriza a estirpe mãe de Y peuceti us ATCC 31 428.

Alem disso, a estirpe mutante M. 87 F. I, pode selectiva^ mente transformar o composto de fórmula de estrutura (I) no composto de formula (II), enquanto que a estirpe mãe S. peuceti us ATCC 31428 não Ó selectiva relativamente a esta característica. Esta propriedade da mutante M 87 F. I. torna-o altamente útil., tal como aqui se descreve.

Processo de transformação

A biotransformação estereo selectiva da presente invenção pode ser realizada numa cultura de desenvolvimento de S_. peucetius estirpe M 87 F. I. mediante adição do composto de fórmula I como substracto, a cultura, durante o período de incubação.

composto de fórmula I sob a forma de cloridrato, pode ser adicionado apos dissolução em água destilada estéril. A cojn centração preferida, mas não limitativa, do composto de fórmula I na cultura, estã compreendida entre cerca de 50-200 microgramas por litro. A cultura desenvolve-se num meio nutriente contejn do fontes de carbono, p. ex., um hidrato de carbono assimilável a uma ponte de azoto, p. ex., um composto de azoto assimilável ou t

material proteico. As fontes de carbono preferidas sao a glicose, sacarose, glicerol, amido, amido de milho, dextrina, melaço e idênticos. As fontes de azoto preferidas são o licor da infusão de milho, extracto de levedura, levedura de cerveja seca, proteína de soja, proteína de sementes de algodão, proteína de milho, caseína, proteína de peixe, sólidos de destilação, pept£ na animal, extracto de carne, sais de amonio, etc. A associação destas fontes de carbono e de azoto pode ser utilizada de um nw do vantajoso. Necessariamente, ter-se-a de adicionar ao meio de fermentação os oligoalimentos, p. ex., zinco, magnésio, mangane sio, cobalto, ferro e outros que são adicionados com agua comum e sob a forma de ingredientes não purificados antes da esterilj_ zação do mei o .

processo de biotransformação pode decorrer entre cerca de 72 horas e 8 dias. A temperatura de incubação durante o processo de biotransformação pode variar entre cerca de 25°C e 37°C, sendo a temperatura de 29°C a mais adequada. 0 conteúdo dos recipientes de transformação ê arejado por agitação a cerca de 250 r.p.m. ou por agitação com ar esterilizado, para favorecer o desenvolvimento do microrganismo e reforçar a eficácia do processo de transformação.

Métodos analíticos processo da reacção de transformação microbiana é controlado pela recolha de amostras de fermentação em diversos intervalos de tempo e a extracção com uma mistura de diclorometano: metanol a 9:1 com um pH de 8,0. Quando uma amostra dos extractos orgânicos é submetida a uma cromatografia em camada fina, (TLC) utilizando-se como elemento uma mistura de clorofórmio, metanol ácido acético, água a 80:20:7:3 (em volume), verifica-se que o

-6/ ^ν—χ’ composto FCE 24883 de formula II aparece com um valor médio de ί Rf de 0,50, enquanto que a 4¹-deoxi-4¹-iododoxorubicina de formula I possui um Rf de 0,60. A avaliação quantitativa das duas antraciclinas pode ser realizada após a cromatografia em camada fina, utilizando-se o sistema de elementos referidos antes, por raspagem e eluição com metanol das zonas coradas de vermelho corres^ pondentes e finalmente por determinação com espectrofotometria a 496 nm.

Processo de isolamento

Os caldos de fermentação totais em que o composto de for mula I foi submetido a conversão em FCE 24883 de fórmula II, são filtrados com o auxílio de terra de diatomasia. 0 bolo de micélio vermelho é extraído com um solvente orgânico miscível com a agua, tal como metanol ou outro álcool inferior, dioxano, aceto nitrilo, acetona, utilizando-se de preferência acetona. Os extractos de micélio são recolhidos, concentrados sob pressão red]j zida e adicionados aos líquidos de fermentação filtrados; o seu pH e ajustado para 8,0, sendo em seguida extraídos com um solveri te orgânico não miscível com a ãgua, tal como n-butanol , clorofórmio, diclorometano ou, de preferencia, uma mistura de dicloro metano: metanol a 9:1. Extractos orgânicos contêm o FCE 24883 de fórmula II, conjuntamente com o composto de fórmula I e alguns produtos de degradação menores.

Processo de purificação extracto orgânico Ó concentrado sob pressão reduzida até â secura e o resíduo é dissolvido em diclorometano e cromat£ grafado sobre uma coluna de gel de sílica, tamponada a pH 7, com um gradiente constituído por uma mistura de diclorometno , metanol, água. 0 composto de fórmula I é eluído primeiro com uma mistura a 95, 5, 0,25, seguida de FCE 24883 de formula II com uma mistura

-7a 90, 10, 0,5.

As fracções reunidas, apôs lavagem com agua, sao concentradas para um pequeno volume na presença de n-propanol, adicionadas com ácido cloridrico na proporção de um equivalente e um excesso de n-hexano, obtendo-se um precipitado de FCE 24883 de formula II sob a forma pura de cloridrato.

Propriedades fisicas e químicas

A FCE 24883 de fórmula II e uma base livre solúvel nos so/ ventes orgânicos polares e em álcoois aquosos, enquanto que o cio ridrato ê solúvel em ãgua e em álcoois inferiores, mas pouco solúvel em solventes orgânicos. 0 cloridrato de FCE 24883 tem as seguintes propriedades físico-químicas:

ponto de fusão: 200°C (com decomposição) rotação específica: θ³°+188° (c 0,05,CH₃0H) espectro de absorção de U.V. e esoectro de absorção de VIS H_o0 232, 254, 290 e 480 nm c m α X (E]^%Cm ^{= 492}> ³⁷⁰’ ¹²⁷’ ¹⁶³)·

Espectro I.R. (KBr): picos nas seguintes frequências.

3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 965, 940, 920, 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 e 415 cm’¹.

1H - Espectro NMR (DMSOd_g, 200 MHz, 22°C) : 14,03 (bs, 2H, OH-6, 0H-11), 7.6-7.9 (m, 3H, H-l, H-2, H-3), 5,26 (m, ΙΗ, Η -1 ¹),

4,96 (D, J = 5.2 Hz, ΙΗ, 0H-13), 4.92 (m, 1H, H-7), 4.55 (m, 1H,

H-4'), 4.51 (t, J = 6.7 Hz, ΙΗ, 0H-14) , 4.20 (s, ΙΗ, OH-9), 3.97 (s, 3H, 4-0CH₃), 3.76 (ddd, J=3.5, 6.7, 11.0 Hz, 1H, CH (H)-OH),

3.60 (dq, J = 1.0, 6.0 Hz, H-5' ) , 3.48 (ddd, J = 7.2, 6.7, 11.0 Hz,

1H, CH(H)-OH), 3.37 (ddd, J=5.2, 3.5, 7.2 Hz, 1H, H-13), 3.02

-8-.

(m, IH, H-3'), 2.81 (m, 2H, CH₂-10), 2.15 (dd, J=2.0, 15.3 Hz,

IH, H-8e ), 1.97 (dd, J=6.0, 15.3 Hz, IH, H-8ax) , 1.7-1.9 (m, 2H, CH₂-2') e 1 .1 4 (d, J=6.0 Hz, 3H , ÇH_₃-5* ) .

Fórmula molecular: Ο^Η^θΝΧ^θ.ΗΠ m/2 em FC equivalente a base livre: 656 MH 655 M ; e 416(M ) correspondente a aglicona.

A cromatografia líquida de alta pressão selectiva (HPLC) permite separar os dois álcoois estereoisomericos em C-13 (dois picos com tampão de retenção 18,8 e 19,3 minutos) presentes numa amostra de.4¹-deoxi-13-di-hidro-4¹-iododoxorubicina sintética preparada por redução com NaBH^ do composto de formula I.

Utilizando-se o mesmo método de (HPLC) apresenta-se a FCE 24883 de fórmula II sob a forma de um unico pico com um tempo de retenção de 19,3 minutos que corresponde ao constituinte de menor mobilidade do 13-di-hidro derivado sintético.

Processo de HPLC

Coluna: duas colunas de RP Spherisorb S30DS2(C18 S^j, Phase Separation U. K.) de 150 x 4,5 mm ligadas em série.

Temperatura: 45°C.

Fase móvel A: KH₂P0^ aquoso 0,05M, com pH 3,0 com H₃P0₄lM/CH₃0H=80/20, em volume

Fase movei B: CH₃0H

Eluição: isocrãtica durante 30 minutos (42% A+58% B) Débito: 0,6 ml/minuto Detecção: 254 nm.

ί Elucidação da Estrutura

A hidrólise acida do composto de fórmula II (HC1 aquoso 0,2 N, 80°C, 30 minutos) forneceu um precipitado vermelho da aglTcona correspondente de formula III, enquanto que o constituir^ te açúcar, designadamente a 3-amino-2,3,4,6-tetradioxi-4-iodo-L-1ixo-hexo-hexose de formula IV, presente na fase aquosa, foi identificada pós comparação com uma amostra autêntica obtida apõs hidrólise acida do composto de fórmula I.

III: 13-‘5)- IV

A configuração (S) absoluta no Carbono 13 do composto de formula III foi determinada por comparação directa (ressonância magnetica-nuclear protõnica e o espectro de massa e cromatografia em camada fina) do seu derivado 9,13-0-isopropilideno-14-0-t-butiJ difeni1sí1ico como derivado correspondente de uma amostra autêntica de 13-S-di-hidroadriamicinona, obtida de acordo com o meto-10/ /

do descrito por S. Penco et al. em Gazzetta Chimica Italiana , 115, 195, 1985.

Actividade biológica

A actividade citotõxica de FCE 24883 de fórmula II foi av<q liada em ensaios in vitro sobre formação de colónias de células Hela e células 388 em comparação com os compostos de formula I e com doxorubicina. Como se refere no Quadro I, o composto de fÕ£ mula II resultou tão presente quanto 4¹-deoxi-4¹-iododoxorubicina de formula I e a doxorubicina.

A actividade anti-tumoral in vivo, de FCE 24883 de fórmula II foi testada contra leucemia total disseminada. Injectaram-se murganhos C3H por via endovenosa com 2,10θ células/murganho tratados com os compostos em estudo 24 horas apos injecção de tumor.

No Quadro II mostram-se resultados das duas experiências.

Na dose óptima , verificou-se que FCE 24883 II era mais potente do que doxorubicina e tão potente quanto 4 ¹-deoxi-4 ¹-i ododoxorubi ci_ na (I), mas com uma toxicidade menor exibida nas doses activas .

A actividade anti-tumoral do composto de fórmula II avaliada como tempo médio de sobrevivência de murganhos de controlo sob tr£ tamento pôde ser comparada com a dos compostos de fórmula I e do xorubi ci na.

Actividade In vitro de 1 3-/s7’di h i d ro-4 ¹ - i ododoxorub i c i na (II, FCE 24883) em comparação com 4'-deoxi-4'- iododoxorubicina (I, FCE 21954) e doxorubicina (Dx).

c) Células P388 de leucemia /

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Os exemplos que seguem não limitativos são fornecidos com vista a descrever detalhadamente os processos e os produtos objecto to da presente invenção.

Descrição de aspectos preferidos

Exemplo 1

Uma cultura _de Sjtreptomyces peuceti us, estirpe M 87 F.I. (DSM 2444) foi submetida a crescimento durante 14 dias ã tempera, tura de 28° em placas de agar seguido de manutenção em meio (meio SA), constituído do seguinte modo: glicose 3%; levedura de cerve ja seca 1,2%; Cloreto de Sódio 0,1%; KH₂P0₄ 0,05%; CaCOg, 0,1% ; MgSo₄, 0,005%; FeS0₄7K₂0, 0,0005%; ZnS0₄· 7H₂0, 0,0005%; CuSO . .5H₂0, 0,0005%; agar 2%; ãgua comum 1000 ml; pH 6,7; a esterilização foi realizada por aquecimento em autoclave a 115°C durante 20 minutos.

Os esporos, obtidos desta cultura, foram recolhidos e fej_ ta a sua suspensão em 3 ml de ãgua estéril destilada; esta suspensão foi inoculada em frascos de 300 ml Erlenmeyer, contendo 60 ml do seguinte meio líquido; levedura seca de cerveja, 0,3 %; peptona 0,5%; Ca (NOg) ₂.4H₂ 0, 0,05%; ãgua comum 100 ml. Esterilj, zação por aquecimento em autoclave a 120°C durante 20 minutos. 0 pH deste meio, apÓs esterilização, estava compreendido entre 6,8 e 7,0. Os frascos inoculados foram agitados, durante dois dias, ã temperatura de 28°C num agitador rotativo com 250 r.p.m. e des_ crevendo um círculo de 7 cm de diâmetro. Inocularam-se 1,5 ml da cultura de desenvolvimento, descrita antes, em frascos de 300 ml Erlenmeyer que continham 50 ml de um meio de biotransformação se guinte: extracto de levedura 1,5«; KH_{2 0>25%}. _{glicose 1>5%;}

-14agua comum ate 100 ml pH 6,9; fez-se a esterilização por aquecimento em autoclave a 115°C durante 20 minutos. A solução de g 1 _i cose foi esterilizada separadamente e adicionada a cada frasco esterilizado com a concentração

Em seguida, os frascos, 28°C sob as condições descritas te 24 horas. Nesta altura, adi uma solução contendo o composto tilada, com uma concentração de ram incubados durante mais dois de 70% do composto de fórmula I adequada.

foram incubados ã temperatura de para a fase de sementeira, duraji ionou-se a cada frasco 1 ml de de fórmula I em ãgua estéril des^ 5 mg/ml. Os frascos agitados f£ dias, obtendo-se uma conversão para o composto de fórmula II.

Exemplo 2

Uma cultura de (3. peuce ti us da estirpe M 87 F.I. desenvo^ veu-se em meio solido como descrito no Exemplo I. Retiraram-se os esporos de três planos e colocaram-se em 10 ml de agua destilada estéril; a suspensão obtida por este modo foi inoculada num frasco de fundo redondo arejado, contendo 500 ml de um meio de sementeira descrito no Exemplo 1. 0 frasco foi incubado durante horas num agitador rotativo a 120 r.p.m., descrevendo um circulo de 7 cm de diâmetro, a uma temperatura de 28°C. A sementei_ ra total foi inoculada num fermentador de aço inoxidável de 10 1. contendo 7 litros e meio do meio de biotransformação descrito no exemplo 1 e esterilizado por vapor a 120°C, durante 30 minutos, tendo esterilizado separadamente a solução de glicose e adiciona^ da na concentração adequada ao fermentador esterilizado. A cultura ficou no desenvolvimento â temperatura de 28°C com agitação de 230 r.p.m. e o arejamento com um débito de ar de 0,7 litros

de meio/mi nu to. Após 48 horas o composto de substracto foi adicionado com uma concentração como descrita no exemplo 1, e a cul_ tura foi incubada por mais 3 dias, obtendo-se 60% da conversão do composto 1 no composto de formula II.

Exemplo 3 caldo completo, 5 1., proveniente de uma fermentação ob tida de acordo com a descrição no exemplo 2, foi filtrado uti 1 i_ zando-se como filtro terra de diatomáceas a 2%. 0 filtro húmido

-foi extraído com 3 litros de acetona. Após filtração fizeram-se mais duas extracções com acetona para se assegurar a completa recolha dos pigmentos vermelhos. Os extractos de acetona reunidos foram concentrados sob pressão reduzida ate ao volume de um litro, reunidos com o caldo filtrado e exaustivamente extraídos a um pH 8 com diclorometano-metanol em mistura 9:1. 0 extracto orgânico, contendo os compostos de formula 1 e 2 , com alguns pr£ dutos de degradação, foi concentrado sob pressão reduzida até ã secura. 0 resíduo dissolvido em diclorometano foi cromatogoraf£ do numa coluna de gel de sílica, tamponado para pH 7 (tampão de fosfato M/15) com um gradiente constituído por uma mistura de di_ clorometano, metanol, ãgua. .Em seguida eluiram alguns produtos de degradação do composto de fórmula 1 com uma mistura a 95:5:0,25 e, depois, eluíu o composto FCE 24883 da fórmula II com uma mistura a 90:10:0,5.

A partir das fracções reunidas, apos lavagem com ãgua, concentração para um pequeno volume na presença de n-propanol , adição do ãcido clorídrico na proporção de um equivalente com um excesso de n-hexano, obteve-se o composto FCE 24883 de fórmula

-16II, sob a forma pura (0,30 g, rendimento 60%), sob a forma de cloridrato com um ponto de fusão de 200°C, com decomposição. Em seguida, a este procespo o composto de fórmula I, não transformado (0,13 g, 26% de rendimento) também foi recolhido sob a forma de cloridrato.

Exemplo 4

Uma amostra de FCE 2483 de 200 mg (I) foi dissolvida em acido clorídrico aquoso 0,2 N (50 ml) e aquecida durante 30 mi njj tos ã temperatura de 100°C. Por filtração recolheu-se um p re ci pitado meio cristalino (0,12 g) de aglícona de formula III que se lavou com água e secou.

Espectro de massa: m/e 416 M⁺. A aglícona de fórmula III foi identificada como 13-(S)-di-hidroadriamicinona por comparação com uma amostra autentica.

Claims (5)

1. Reivindicações

   1.- Processo para a preparação de 4'-deoxi-13(S)-dihidro-4'-iododoxorubicina de fórmula e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe mutante, designada por estirpe M 87 F.I. (DSM 2444), da espécie Streptomyces peucetius, sob condições aeróbias em um meio de cultura aquoso _ Ί η

   J_O contendo uma fonte de carbono assimilável, uma fonte de azoto assimilável e sais minerais, na presença de 4’-deoxi-4'-iododoxoru bicina de fórmula /

   f sob a forma do seu cloridrato, e de se isolar a 4'-deoxi-13(S)-dihidro-4’-iododoxorubicina de fórmula II resultante sob a forma do seu cloridrato.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter o composto de fórmula geral II sob a forma do seu cloridrato.
3. 3, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a uma temperatura compreendida encre 25°C e 37°C, de preferência a 29°C, durante um período desde 72 horas até oito dias.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterí-19-

   Ζ zado pelo facto de se extrair o glicosido antraciclínico de. fórmula II da massa de micélio com acetona e dos líquidos de fermentação filtrados com uma mistura de diclorometano/metanol a 9:1 v/v a um pH igual a 8, de se reunirem os extractos e de se evaporarem os extractos reunidos até ã secura sob pressão reduzida.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se dissolver o produto bruto obtido em diclorometano, de se submeter o referido produto a uma purificação por cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica tamponada a pH7, de se eliminar o composto inicial de fórmula I que não reagiu por meio de um sistema eluente constituído primeiro por uma mistura de diclorometano: metanol: água a 95:5:0,25 v/v e em sequida, por uma mistura de diclorometano: metanol: água a 90:10:0,5 v/v de se concentrarem as fracções eluídas até um pequeno volume na presença de n-propar.ol, e de se isolar a 4 '-deoxi-13(S)-dihidro-4'-iododoxorubicina de fórmula II sob a forma pura de cloridrato mediante adição de um equivalente de ácido clorídrico e um excesso de n-hexano,

   Lisboa, 12 de Julho de 1988

   O Àqente Oticiai da Propriedade