PT88178B

PT88178B - Metodo para a purificacao de virus da hepatite a

Info

Publication number: PT88178B
Application number: PT88178A
Authority: PT
Inventors: Emilio A Emini; John A Lewis; Marcy E Armstrong
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1995-03-01
Also published as: GR3007158T3; JPS6451080A; CY1773A; EP0302692A2; PT88178A; ZA885726B; DK173215B1; JPH0648980B2; IE61294B1; DE3877082D1; ES2042751T3; EP0302692B1; AU612168B2; IL87257A0; ATE84067T1; AU2051888A; DK437988A; DK437988D0; US5521082A; DE3877082T2

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 88 178

REQUERENTE: MERCK & CO.,INC., norte -americana,industrial, com sede em Rahway, New Jersey 07065-0906 Es tados Unidos da América do Norte.

EPÍGRAFE: MÉTODO PARA A PURIFICAÇÃO DE VIRUS DA HEPA

TITE A

INVENTORES: John A. Lewis, Emílio A.Emini, Marcy E.

Annstrong.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte, em 06 de Agosto de 1987, sob o n⁹ . 082,720.

INPI. MOQ 113 RF 10732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

	0 presente invento diz respeito a novos
métodos para	purificar o vírus da Hepatite A (HAV) que são
adaptáveis à	escala comercial e produção de vacinas HAV espe

cificas, incluindo HAV inactivado pela formalina e HAV atenuado .

MERCK & CO.,INC.

MÉTODO PARA A PURIFICAÇÃO DE VIRUS DA HEPATITE A

O processo para purificar o vírus da he patite A consiste, essencialmente, nos seguintes passos: crescimento e colheita das células infectadas com HAV; lise das células recolhidas por ultra-sons; extracção do lisado, e retenção da fase aquosa; concentração da fase aquo sa com um polímero sintético solúvel na água eficaz para precipitar HAV; extracção do precipitado de HAV e retenção da fase aquosa; sujeição da fase aquosa a cromatografia de permuta iónica; filtração por gel das fracções contendo HAV, proporcionando HAV substancialmente purificado.

FUNDAMENTOS DO INVENTO

O virus da Hepatite A (HAV) é um picornavirus morfologicamente, bioquimicamente e imunológicamente distinto que é o agente etiológico da hepatite infecciosa nos seres humanos.

Tal como outros picornavirus, o HAV con tém um genoma de RNA infeccioso, de sentido positivo de cadeia molecular simples. Foram descritas quatro proteínas capsides (membranas exteriores de um virus), VP1 (32-33 Kilodaltons ou KDa), VP2 (26-29 KDa), VP3 (22-27 KDa) e VP4 (10-14 KDa) . O HAV foi actualmente submetido a clonagem e sequenciado, por exemplo, Najarian, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sei 82 , 2627 (1985 ) .

Para revisões recentes, ver, por exemplo Gerety, R.J. (ed.) Hepatitis A Academic Press 1984; Feinstone, S.M. Progress in Liver Diseases, £, 299 (1986); e Mijch A.M. et al . Seminars in Liver Diseases è_, 42 (1986).

Foram organizados vários métodos para purificar parcialmente os virions HAV tendo como finalidade o estudo e caracterização inicial.

Ver por exemplo, Hornbeck, C.L. et al. , Intervirology 6_; 309-314 (1975); Locarnini, S.A. et al. , Intervirology 10 ; 300-308 (1978 ) ; Siegl , G. et al. , J. Virol. 26 , 40-47 (1978); Siegl, G. et al. , J. Gen. Virol 51_

331-341 (1981); Siegl, G. et al. , Interviology 22 , 218 (1984); Hughes, J.V. et al. , J. Virol. 52 , 465 (1984); e

Wheeler , C.M. et al. , J. Virol 58 , 307 (1986).

Cada um destes métodos utiliza um ou mais passos os quais provavelmente vão impedir a aprovação pela Food and Drug Administration para as finalidades de ensaiar e de depois vender uma vacina segura contra HAV. Por exemplo são habitualmente utilizados detergentes e/ou enzimas exógenos.

Além disso, todos estes métodos utilizam passos não manejáveis, não práticos e excessivamente caros (dispendiosos), tais como centrifugação em gradiente da sucrose ou centrifugação em gradiente de densidade-CsCl.

Os requerentes descobriram métodos para obter HAV muito puro sem a utilização de detergentes e de enzimas enxógenos. Além disso, os métodos aqui apresentados podem ser rapidamente adaptados a produção proporcional do tipo comercial. Além disso, os requerentes conseguiram adap tar estes métodos às células MRC-5 do hospedeiro, que são certificados pela Food and Administration para a produção de vacina humana.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DO INVENTO

São apresentados métodos para uma subs tancial purificação do virus da Hepatite A (HAV), compreendendo os passos de:

(a) crescimento e colheita de células infectadas com HAV;

(b) lise das células colhidas por sonicação;

(c) extracção do lisado, e retenção da fase aquosa;

(d) concentração da fase aquosa com um polímero sintético solúvel na água eficaz para precipitar HAV;

(e) extracção do HAV precipitado e retenção da fase aquosa;

(f) submissão da fase aquosa a cromatografia por permuta iónica;

(g) filtração por gel das fracções contendo HAV, proporcionando HAV substancialmente purificado.

Estes processos são adaptáveis a produ ção proporcional à escala comercial e são provávelmente can didatos para a produção comercial de HAV inactivado, assim como de HAV atenuado aprovados pela FDA, com finalidades de vacinação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os processos de purificação adaptáveis comercialmente, do presente invento incluem a purificação de qualquer virus da Hepatite A, atenuado ou não, em qualquer linha celular ou cultura susceptivel a infecção pelo virus da Hepatite A.

A estirpe F do isolado CR-326 propagado em células MRC-5 foi usada neste invento com finalidades meramente ilustrativas, e acontece ser uma estirpe atenuada. São abrangidos por este invento outras estirpes e/ou estereo tipos, incluindo estirpes HAV que possam ser atenuadas por técnicas convencionais.

Outras linhagens celulares incluem células Vero, FL, WI-38 e FRhK6. Estes e outros sistemas para a propagação de HAV em culturas de células são discutidos em Gerety, R.J. (ed.) Hepatitis Academic Press 1984, pp. 263-276; e Ticehurst, J.R. Seminars in Liver Diseases £, 46-55 (1986). Em principio, qualquer linhagem celular tal como qualquer linhagem celular fibroblástica diploide pode servir como célula hospedeira contanto que seja susceptível à infec ção por HAV. A linhagem celular preferida é MRC-5.

Na descrição que se segue, o número de um parágrafo corresponde ao numero de medida da Figura 1.

1. As células infectadas por HAV são feitas cres cer e são recolhidas por qualquer uma ou mais de uma série de técnicas convencionais. As condições de crescimento, incluindo a selecção de meios, depende dos requerimentos da 1£ nhagem celular utilizada.

Para as células MRC-5, é necessária a ligação a um substracto, de modo a que a raspagem das células ou a tripsinização constituem um requerimento para a recolha. Outros tipos de células úteis para as finalidades deste invento incluem as capazes de crescimento em suspensão. As culturas de células em suspensão são normalmente centrifugadas até peletizar células.

2. Após o crecimento e a recolha, as células iri fectadas com HAV são submetidas a lise por qualquer uma ou mais de uma série de técnicas, incluindo mas não se limitando a exposição a um tampão hipotónico, vórtice (redemoinho), ciclo congelação-descongelação, e sonicação. Os requerentes, verificaram que a sonicação é necessária para a lise das cé lulas MRC-5 infectadas por HAV, resultando numa libertação eficiente de viriões a partir da célula, ção de viriões HAV a partir de uma célula da é aqui a seguir considerada lise).

(Qualquer libertahospedeiro rebenta

Pensa-se que a sonicação liberta eficientemente os viriões HAV a partir do seu estado pseudocristalino subcelular no interior da célula. Deva ter-se em cora sideração o facto de que, para além da sonicação, podem ser utilizadas muitas combinações com lise hipotónica, vórtice ou ciclo congelação-descongelação com a finalidade de conseguir uma lise apropriada e eficaz das células. Os requerentes têm maior preferência pelos passos que se seguem para a lise das células MRC-5 infectadas com HAV:

(a) descongelando células armazenadas, previamente congeladas em tubos pela adição do tampão para lise (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl₂ 1,5 mM);

(b) vórtice vigoroso (10-15 segundos no número 10 num Vortex-Genie):

(c) congelando-descongelando uma ou mais vezes por exposição sucessiva de cada vez a um banho de gelo seco em etanol e a um banho de água a 37°C; e (d) sonicação uma ou mais vezes durante 30 seguia dos com o máximo de saída (output) de potên cia em watts de um sonicador com trompa de taça com um banho de água gelada em circula ção (Branson Sonifier Cell Disrupter 185 and Ultrasonics cup horn), proporcionando um sonicado (produto de sonicação).

3. Após a lise, as células infectadas por HAV, constituindo agora uma suspensão que sofreu lise, ou sonicado, são diluídas com tampão sendo então submetidas a extracção orgânica. Essa extracção remove, entre outros contaminar^ tes, lípidos e substâncias afins dos lípidos.

Consequentemente, o sonicado é diluido com qualquer um de uma série de tampões, incluindo solução salina tamponada com fosfato, Tris, carbonato, bicarbonato ou tampões acetato. Como os virions HAV são provavelmente estjá veis em relação ao ácido, os tampões com uma taxa de pH ácida constituem também substitutos possíveis. Os requerentes des cobriram que a presença de MgCl₂ no tampão faz descer substancialmente os rendimentos dos virions. 0 tampão mais preferível é TNE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM , EDTA lmM).

Os sonicados diluídos com tampão são então extraídos pela adição de uma mistura de um alcano inf£ rior halogenado, tal como cloreto de metileno, e um agente anti-formação de espuma, tal como o álcool isoamílico.

A relação volume-para-volume entre o alcano inferior halogenado e o agente anti-formação de espuma varia entre cerca de 15:1 e cerca de 50:1, de preferência entre cerca de 20:1 e 30:1. Os requerentes verificaram que o cloreto de metileno é superior ao clorofórmio neste estádio Os virions HAV permanecem na fase aquosa e interface.

Com a maior preferência, o sonicado é extraido organicamente pela adição de um volume igual de cl£ reto de metileno: álcool isoamílico v/v, 24:1) com vórtice durante 1 minuto e é centrifugado a 3.000 rpm durante 10 minutos a 20°C numa centrífuga IEC (rv3.000 g) para se conseguir a separação de fase.

A fase aquosa é guardada, a fase orgânica é eliminada e a interface é re-extraida, com um volume de tampão TNE igual a um terço do volume da amostra original, por vórtice e centrifugação tal como anteriormente. As duas fases aquosas são armazenadas e o volume'é medido, proporcio^ nando vírus da Hepatite A em lisados de células extraídas organicamente.

4. O passo que se segue envolve a concentração com um polímero sintético solúvel na água eficaz para a precipitação de proteínas. Os requerentes preferem concentrar os lisados celulares extraídos organicamente com polietileno glicol (PEG) tendo um peso molecular de entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 12.000 daltons.

Tipicamente, adiciona-se NaCl ao lisado até uma concentração final de entre cerca de 150 mM e cerca de 500 mM, sendo então adicionado o PEG até uma concentração final de entre cerca de 2% (p/v) e cerca de 10% (p/v). E mais preferível ajustar organicamente os lisados das células extraídas até cerca de NaCl 500 mM, levando então o lisado até cerca de 4% (p/v) em PEG (MWoj 8.000 daltons).

Tendo ocorrido a centrifugação, os re sultantes lisados a 4% com PEG são centrifugados, o produto flutuante é eliminado e a pílula (bolinha) de PEG é ressuspensa para posterior processamento. A pilula de PEG é de pre ferência sonicada antes da segunda extracção orgânica, descri_ ta como se segue. 0 produto do passo 4 é re-suspenso, a pílula de PEG é sonicada.

5. A pílula de PEG sonicada, re-suspensa é extraída pela adição de uma mistura de um alcano inferior hal£ genado, tal como o clorofórmio, e com um agente anti-formação de espuma, tal como álcool isoamílico.

A relação volume-para-volume entre o alcano inferior halogenado e o agente anti-formação de espu ma varia entre cerca de 15:1 e cerca de 50:1, de preferência entre cerca de 20:1 e 30:1. Osrequerentes descobriram ines peradamente que esta segunda extracção orgânica aumenta a pureza do. produto HAV final. Além disso, em contraste com a primeira extracção orgânica (ver parágrafos correspondendo ao passo 3), os requerentes verificaram na segunda extracção orgânica que o clorofórmio é superior ao cloreto de metileno.

Com a maior preferência, os passos da segunda extracção são realizados como se segue:

O precipitado re-suspenso, sonicado, é submetido a rotação a 200 rpm num agitador de plataforma orbital durante 1 hora a 4°C. A pilula de PEG 8.000 re-suspensa é extraída organicamente pela adição de um volume igual de clorofórmio; álcool isoamílico (v/v, 24:1) com vórtice vi_ goroso e em seguida clarificação por centrifugação a 4.000 g durante 10 minutos a 20°C.

A fase aquosa é guardada, a interface e a fase orgânica são re-extraidas com um volume de tampão TNE igual a um terço de volume da amostra original e ambas as fases aquosas são combinadas, proporcionando a extracção de uma pilula de PEG.

zar pelo aniónica extraída tografia com carga

6. Na maior parte dos casos, é desejável reali^ menos um passo de uma cromatografia por permuta após a segunda extracção orgânica. A pilula PEG ou pilula de polímero extraída é submetida a cromapor permuta iónica sobre uma resina, gel ou matriz positiva.

As matrizes típicas de permuta anióni. ca incluem, mas não são limitadas por,

Celulose DEAE

Agarose DEAE

Biogel DEAE

Dextran DEAE

Sephadex DEAE

Sepharose DEAE

Sepharose Aminohexilo

Celulose Ecteola

Celulose TEAE

Celulose QAE mono-Q , ou

Celulose dietilaminoetilica benzoilada.

A matriz permutadora aniónica preferida é Sepharose DEAE CL-6B (Pharmacia). A informação fundamental geral sobre cromatografia por permuta iónica pode ser encontrada, por exemplo, em E.A. Peterson, Cellulosic Ion Exchangers em Work, T.S. et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Volume 2, Parte II, pags 223 e segs. North-Holland 1970.

Um efeito predominante da permuta iónica sobre a pilula de PEG extraída consiste na remoção de DNA. Assim, em principio, a permuta aniónica pode ser substituída pela adição e remoção da ADNase , ou por meio de tratamentos alternativos tendo como finalidade remover o DNA neste estádio da purificação do processo.

7. Um passo final da cromatografia por fil tração por gel segue a permuta aniónica.

Tipicamente, é utilizada Sepharose Cl-4B (Pharmacia) mas podem ser substituidos por vários outros tipos de matrizes gel para filtração. Ver, por exemplo, Fischer, L., Gel Filtration Chromatography, in Work, T.S. et al. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Elsevier 1980.

Embora a sequência particular de passos de cromatografia de permuta aniónica seguida por filtração por gel constituam os protocolos típicos para a purificação do HAV neste invento, deve ter-se em consideração que a sequência pode ser variada. Por exemplo, a filtração por gel pode preceder a permuta aniónica.

PASSOS ADICIONAIS

Podem ser utilizados para o processo HAV outros passos convencionais ou conheusados na purificação das proteínas dos v_i Estes passos incluem, mas não são limitados da purificação do eidos normalmente rus ou viriões. por :

(a) adsorção selectiva ou divisão numa fase sólida, por exemplo gel de sílica, carvão fos fato de cálcio ou alumina celite;

(b) cromatograf ia hidrofóbica com, por exemplo, agarose de butilo; e (c) extracção selectiva com outros solventes ou reagentes.

(d) Uma precipitação adicional constitui um outro passo útil para o isolamento do HAV.

Outros métodos incluem (e) cromatografia por qualquer método padrão, in eluindo de placa delgada, gel, crivo molecular, permuta iónica, afinidade de ligandos, imunoafinidade, por electroforese;

(f) fraccionamento do solvente por extraeções em duas fases, por exemplo com PEG e dextrano;

(g) diálise, ultrafiltração, ou diafiltração ;

(h) centrifugação com gradiente de densidades;

(i) electroconcentração ;

(j) secagem por congelação, liofilização; ou (k) cristalização, (l) adição de inibidores da protease e/ou de agentes quelantes para tampão; ou (m) substituição de um tampão por um outro.

Esta lista não é, de modo algum, exaus tiva. A sua ordem não constitui uma indicação da ordem pre. ferida da purificação. Deverá ser considerado que uma pur£ ficação do HAV com êxito pode incluir qualquer um, alguns, ou todos os passos (a)-(m).

São ou podem ser necessários para preparar HAV purificado para uma vacina, passos adicionais de processamento de caracter convencional e bem conhecido. Por exemplo, o tratamento com formalina, filtração estéril e adsorção para veículos ou adjuvantes constituem os passos básicos tipicos para a preparação de uma vacina inactivada pe_ la formalina. Ver, por exemplo, Provost, P.J. et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 213 (1979); Provost, P.J. et al. J. Med Virol. 19,23 (1986 ) .

O HAV pode ser inactivado pelo calor, alterações do pH, tratamento com solventes orgânicos, irradija ção ultravioleta, ou exposição à formalina. Deverá ter-se em consideração o facto do âmbito do presente invento incluir para além da estirpe F de C326 de HAV, qualquer outra estir. pe HAV, quer esteja ou não atenuada.

As estirpes atenuadas podem ser isoladas por meio de passagem seriada através de células , animais , ou por outros métodos. Ver, por exemplo, Provost, P.

J. et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 170,8 (1982 ); e Provost, P . J.et al. J. Med. Virol. 20 , 165 (1986), para detalhes sobre a atenuação. Os métodos de purificação do presente invento são rápidamente e fácilmente adaptáveis a estirpes at£ nuadas ou não atenuadas.

Neste invento, o alcano inferior contem átomos de carbono 1-6.

O Exemplo que se segue ilustra a prática deste invento, mas não pretende limitar o âmbito e con teudo do invento.

-15Processo para a Purificação de Virus da Hepatite A (HAV) a partir de Células MRC-5

EXEMPLO

A. Rebentamento das células

Células MRC-5 infectadas com HAV ate nuados (estirpe F de CR-326) foram recolhidas por raspagem e congelação a -70°C em quatro equivalentes de recipientes ci lindricos por tubo. Foram descongelados dois tubos pela adi_ ção de 3 mis de tampão para lise por tubo (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 10 mM, MgClg 1,5 mM) e por vórtice vigoroso (10— -15 segundos no número 10 num Vortex-Genie ) sendo então mari tidos em gelo húmido durante 15 minutos.

Os lisados foram congelados duas vezes e descongelados num banho de gelo seco pelo etanol e num banho de água a 37°C, e cada tubo foi sonificado três vezes du rante 30 segundos com o (máximo de saida) fornecimento máximo de potência em Watts de um sonificador com trompa de ta ça com um banho de água gelada em circulação (Branson Sonifier Cell Disrupter 185 and Ultrasonics cup horn).

Os sonificados foram reunidos e ensaia dos quanto à proteina usando um ensaio de proteína de Bradford (BioRad) com BSA (Albumina do Soro Bovina) como um padrão sendo então ajustados para 3 mg de proteina por ml em tampão TNE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM).

O sonificado foi extraído organicamente pela adição de um vo lume igual de cloreto de metileno:álcool isoamilico (v/v, 24:1) com vortex durante 1 minuto e foi centrifugado a 3.000· rpm durante 10 minutos a 20°C numa centrífuga IEC (..3.000 g) para se atingir a fase de separação.

A fase aquosa foi guardada, a fase orgânica foi eliminada e a interfase foi re-extraida, com um volume de tampão TNE igual a um terço do volume da amostra original, por vórtice e centrifugação como anteriormente.

As duas fases aquosas foram reunidas e o volume foi medido proporcionando virus da Hepatite A em lisados celulares extraídos organicamente.

B. Precipitação do polietileno glicol (PEG)

O virus da Hepatite A nos lisados de células extraídos organicamente foi concentrado por precipitação do polietileno glicol (PEG). Os lisados foram ajusta_ dos para NaCl 500 mM e levados a 4% (p/v) em PEG 8.000 pela adição, com vórtice vigoroso, de 40% (p/v) de PEG 8.000 (preparado em Tris-HCl 10 mM pH 7,5 NaCl 500 mM, EDTA 1 mM).

Os lisados de PEG a 4% foram mantidos a 4°C durante 1 hora sendo então centrifugados a 1.500 g du rante 10 minutos a 4°C num rotor Beckman HB-4. O produto flutuante foi removido e a pilula (bolinha) de PEG foi re-suspensa por vórtice vigoroso em 10 mis de Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM e por sonicação 3 vezes du rante 30 segundos com um máximo de saida (fornecimento máxi_ mo) de potência em watts num sonicador com trompa de taça com um banho de água gelada em circulação tal como foi atrás descrito.

O precipitado re-suspenso, sonicado foi então submetido a rotação a 200 rpm num agitador de plataforma orbital durante 1 hora a 4°C. A pilula (bolinha) de PEG 8.000 re-suspensa foi extraída organicamente pela adição de um volume igual de clorofórmio: álcool isoamilico (v/v, 24:1) com vórtice vigoroso sendo então clarificada por centri

-17fugação a 4.000 g durante 10 minutos a 20°C. A fase aquosa foi guardada, a interface e a fase orgânica foram extraídas com um volume de TNE igual a um terço do volume da pílula de PEG re-suspensa e ambas as fases aquosas foram combinadas, proporcionando uma pilula de PEG re-suspensa.

C. Cromatografia por permuta iónica e por filtração por gel

A pilula de PEG re-suspensa foi ajus_ tada para NaCl 350 mM e cromatografada com uma velocidade de bombeamento de 3 mls/minuto sobre uma coluna de 2 ml de DEAE-Sepharose CL-CB (Pharmacia), preparada em coluna Kontes Flex (1,0 x 5,0 cm) e equilibrada em Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 350 mM, EDTA 1 mM.

Os primeiros 15 mis de eluido foram recolhidos e cromatografados através de uma coluna de Sepharose CL-4B (Pharmacia) (2,6 χ 95 cm), equilibrados em tam pão TNE operado a uma velocidade de bombeamento de 20 ml/ /hora. Foram recolhidas fracçoes de cinco mis, proporcionara do HAV atenuado, substancialmente purificado.

As fracçoes contendo HAV foram identi^ ficadas por HAVAG RIA (Abbot Laboratories), combinadas, tor nadas estéreis por filtração através de um filtro Millex GV-0,22 (millipore) e armazenadas a 4°C. A concentração de HAV reunido foi determinado por HAVAG RIA a amostra foi concentrada (se necessário) numa célula de ultrafiltração Ami con equipada com uma membrana YM100.

Com uma amostra de 5 g de HAV purificado, não foi possivel por electroforese com gel SDS-poliacrilamida, detectar quaisquer impurezas após coloração com prata e mancha Western.

Embora a especificação (descrição detalhada) indique os princípios do presente invento, propor cionando exemplos ilustrativos, deve ter-se em ccnsideraçã que a prática do invento abrange todas as usuais variações adaptações, modificações, eliminações ou adições dos proce sos e protocolos aqui descritos, no âmbito das reivindicações que se seguem.

-19-:

Claims

REIVINDICAÇÕES lê. - Método para purificar substancial mente vírus da hepatite A (HAV) caracterizado por compreender os passos de:

(a) crescimento e colheita das células infectadas com HAV;

(b) lise das células recolhidas por ultra-sons;

(c) extracção do lisado, e retenção da fase aquosa;

(d) concentração da fase aquosa com um polímero sintético solúvel na água eficaz para precipitar HAV;

(e) extracção do precipitado de HAV e retenção da fase aguo sa ;

(f) sujeição da fase aquosa e cromatografia de permuta iónica;

(g) filtração por gel das fracções contendo HAV, proporcionando HAV substancialmente purificado.
2â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as células infectadas com HAV serem células MRC-5.
3â. - Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o HAV ser a estirpe F de CR-326.
4â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por HAV ser atenuado antes do crescimento e colheita do passo (a).
5â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o passo de extracção (c) ser real_i zado pela adição de uma mistura de álcool isoamílico e de um alcano inferior halogenado, compreendendo a referida mistura cerca de um volume de álcool isoamílico e entre cerca de 20 a cerca de 30 volumes do referido alcano inferior halogenado.
6§. - Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o alcano inferior halogenado ser cloreto de metileno.
7ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polímero sintético solúvel na água do passo (d) ser polietileno glicol (PEG) com um peso molecular de entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 12.000 daltons , tendo o referido polietileno glicol uma concentração final na fase aquosa de entre cerca de 2% (p/v) e cerca de 10% (p/v).
8â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polímero sintético solúvel na água do passo (d) ser polietileno glicol com um peso molecular de cerca de 8.000 daltons, tendo o referido polietileno glicol uma concentração final na fase aquosa de cerca de 4% (p/v).
9ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o passo de extracção (e) ser realizado pela adição de uma mistura de álcool isoamílico e de alcano inferior halogenado, compreendendo a referida mistura um volume de álcool isoamílico e entre cerca de 20 a cer ca de 30 volumes do referido alcano inferior halogenado.

lOã. - Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o alcano inferior halogenado ser clorofórmio.

119. - Método para purificar substancialmente HAV atenuado para fins de vacinação, caracterizado por compreender os passos de;

(a) crescimento e colheita de células MRC-5 infectadas com HAV atenuado;

(b) lise das células MRC-5 colhidas por ultra-sons;

(c) extracção do lisado com uma mistura de álcool isomilico e de cloreto de metileno, e retenção de fase aquosa;

(d) concentração da fase aquosa em 4% (p/v) de PEG 8.000 e re-suspensão da pilula de PEG a 4%;

(e) extracção da pilula de PEG a 4% re-suspensa com uma mistura de álcool isomilico e clorofórmio, e retenção de fase aquosa;

-22(f) sujeição da fase aquosa a cromatografia por permuta iónica ; e (g) filtração por gel das fracções contendo HAV, proporcionan do HAV atenuado substancialmente purificado para fins de vacinação.

Lisboa, 3 de Agosto de 1988