JPH0648980B2 - Ａ型肝炎ウイルス粒子の新規なる精製方法 - Google Patents
Ａ型肝炎ウイルス粒子の新規なる精製方法Info
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- JPH0648980B2 JPH0648980B2 JP63194324A JP19432488A JPH0648980B2 JP H0648980 B2 JPH0648980 B2 JP H0648980B2 JP 63194324 A JP63194324 A JP 63194324A JP 19432488 A JP19432488 A JP 19432488A JP H0648980 B2 JPH0648980 B2 JP H0648980B2
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- C12N2770/00011—Details
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Description
【発明の詳細な説明】 Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の新規精製方法はホルマリ
ン不活化ＨＡＶ及び弱毒化ＨＡＶを含む特典的ＨＡＶワ
クチン製造としての商業上の大量精製に対する改良の余
地をもつものである。
ン不活化ＨＡＶ及び弱毒化ＨＡＶを含む特典的ＨＡＶワ
クチン製造としての商業上の大量精製に対する改良の余
地をもつものである。
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、形態学的、生化学的、
及び免疫学的にも、紛れもなくピコルナウイルスであ
り、ヒトにおける感染性肝炎の病原因子である。すべて
のピコルナウイルス同様、ＨＡＶは、一本鎖（＋）セン
スである感染性ＲＮＡゲノムより成る。４種の主要カプ
シドタンパクがすでに報告されており、ＶＰ１（３２−
３３キロダルトンあるいはＫＤａ）、ＶＰ２（２６−２
９ＫＤａ）、ＶＰ３（２２−２７ＫＤａ）、及びＶＰ４
（１０−１４ＫＤａ）。更にＨＡＶはクローン化され塩
基配列も決定されている（例えば、ナジャリアン．アー
ル．（Ｎａｊａｒｉａｎ．Ｒ．）等、プロク．ナトル．
アカド．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ）、第８２巻、第２６２７頁、１９８５）。最近のレ
ビューとして、例えばゲレティー．アール．ジェイ．
（Ｇｅｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）著、ヘパティティスＡアカ
デミック プレス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４；フェインストー
ン．エス．エム．（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ．Ｓ．Ｍ．）、
プログレス イン リバー ディジージズ．（Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第
８巻、第２９９頁、１９８６；及びミヤック．エー．エ
ム．（Ｍｉｊｃｈ．Ａ．Ｍ．）等、セミナーズ イン
リバーディジージズ．（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉ
ｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第６巻、第４２頁、１９
８６、などを参照。研究及び初期の特徴決定の為に種々
の方法が部分的ＨＡＶウイルス粒子の精製に用いられ
た。例えば、ホーンベック．シー．エル．（Ｈｏｒｎｂ
ｅｃｋ．Ｃ．Ｌ．）等、インターヴィロロジー（Ｉｎｔ
ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６巻、３０９頁−第３１４
頁、１９７５；ロカルニニィー．エス．エー．（Ｌｏｃ
ａｒｎｉｎｉ．Ｓ．Ａ．）等、インターヴィロロジー
（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第３００
頁−第３０８頁、１９７８；シーゲル．ジー．（Ｓｉｅ
ｇｅｌ．Ｇ．）等、ジェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ）、第２６巻、第４０頁−第４７頁、１９７８；シー
ゲル．ジー．（Ｓｉｅｇｅｌ．Ｇ．）等、ジェイ．ジェ
ン．ヴィロル．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ）第５７巻、
第３３１頁−第３４１頁、１９８１；シーゲル．ジー．
（Ｓｉｅｇｅｌ．Ｇ．）等、インターヴィロロジー（Ｉ
ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第２１８頁、
１９８４；フゲス．ジェイ．ヴィ．（Ｈｕｇｈｅｓ．
Ｊ．Ｖ．）等、ジェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ）、第５２巻、４６５頁、１９８４；及びウィーレ
ル．シー．エム．（Ｗｈｅｅｌｅｒ．Ｃ．Ｍ．）等、ジ
ェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第５８巻、第３
０７頁、１９８６、などを参照。そこにおける方法は一
段階あるいは多数のステップにより遂行されているが、
検査用あるいはＨＡＶに対する安全なワクチンとしての
販売に関する食品医薬品局の認可の妨げとなりそうなも
のである。例えば、界面活性剤及び／あるいは、外来性
酵素が、一般的に使用されているという事である。更に
これらの方法はすべて扱いにくく、実際的でない、過度
に高価なものとなるステップ、例えば、ショ糖勾配遠心
法あるいは塩化セシウム密度勾配遠心法を使用してい
る。
及び免疫学的にも、紛れもなくピコルナウイルスであ
り、ヒトにおける感染性肝炎の病原因子である。すべて
のピコルナウイルス同様、ＨＡＶは、一本鎖（＋）セン
スである感染性ＲＮＡゲノムより成る。４種の主要カプ
シドタンパクがすでに報告されており、ＶＰ１（３２−
３３キロダルトンあるいはＫＤａ）、ＶＰ２（２６−２
９ＫＤａ）、ＶＰ３（２２−２７ＫＤａ）、及びＶＰ４
（１０−１４ＫＤａ）。更にＨＡＶはクローン化され塩
基配列も決定されている（例えば、ナジャリアン．アー
ル．（Ｎａｊａｒｉａｎ．Ｒ．）等、プロク．ナトル．
アカド．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ）、第８２巻、第２６２７頁、１９８５）。最近のレ
ビューとして、例えばゲレティー．アール．ジェイ．
（Ｇｅｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）著、ヘパティティスＡアカ
デミック プレス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４；フェインストー
ン．エス．エム．（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ．Ｓ．Ｍ．）、
プログレス イン リバー ディジージズ．（Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第
８巻、第２９９頁、１９８６；及びミヤック．エー．エ
ム．（Ｍｉｊｃｈ．Ａ．Ｍ．）等、セミナーズ イン
リバーディジージズ．（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉ
ｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第６巻、第４２頁、１９
８６、などを参照。研究及び初期の特徴決定の為に種々
の方法が部分的ＨＡＶウイルス粒子の精製に用いられ
た。例えば、ホーンベック．シー．エル．（Ｈｏｒｎｂ
ｅｃｋ．Ｃ．Ｌ．）等、インターヴィロロジー（Ｉｎｔ
ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６巻、３０９頁−第３１４
頁、１９７５；ロカルニニィー．エス．エー．（Ｌｏｃ
ａｒｎｉｎｉ．Ｓ．Ａ．）等、インターヴィロロジー
（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第３００
頁−第３０８頁、１９７８；シーゲル．ジー．（Ｓｉｅ
ｇｅｌ．Ｇ．）等、ジェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ）、第２６巻、第４０頁−第４７頁、１９７８；シー
ゲル．ジー．（Ｓｉｅｇｅｌ．Ｇ．）等、ジェイ．ジェ
ン．ヴィロル．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ）第５７巻、
第３３１頁−第３４１頁、１９８１；シーゲル．ジー．
（Ｓｉｅｇｅｌ．Ｇ．）等、インターヴィロロジー（Ｉ
ｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第２１８頁、
１９８４；フゲス．ジェイ．ヴィ．（Ｈｕｇｈｅｓ．
Ｊ．Ｖ．）等、ジェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ）、第５２巻、４６５頁、１９８４；及びウィーレ
ル．シー．エム．（Ｗｈｅｅｌｅｒ．Ｃ．Ｍ．）等、ジ
ェイ．ヴィロル．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第５８巻、第３
０７頁、１９８６、などを参照。そこにおける方法は一
段階あるいは多数のステップにより遂行されているが、
検査用あるいはＨＡＶに対する安全なワクチンとしての
販売に関する食品医薬品局の認可の妨げとなりそうなも
のである。例えば、界面活性剤及び／あるいは、外来性
酵素が、一般的に使用されているという事である。更に
これらの方法はすべて扱いにくく、実際的でない、過度
に高価なものとなるステップ、例えば、ショ糖勾配遠心
法あるいは塩化セシウム密度勾配遠心法を使用してい
る。
出願者は界面活性剤あるいは外来性酵素の使用なしに非
常に純度の高いＨＡＶを得る方法を発明した。またそれ
以上に、本明細書中に記載されている方法は容易に商業
用製造の為の大量処理に使用可能である。更らに、出願
者はこれらの方法をＭＲＣ−５宿主細胞に対して適用さ
せ、人体用ワクチン製造として食品医薬品局による認定
を受けた。
常に純度の高いＨＡＶを得る方法を発明した。またそれ
以上に、本明細書中に記載されている方法は容易に商業
用製造の為の大量処理に使用可能である。更らに、出願
者はこれらの方法をＭＲＣ−５宿主細胞に対して適用さ
せ、人体用ワクチン製造として食品医薬品局による認定
を受けた。
十分にＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を精製する方法を、
以下のステップより成るものとして発表した； (a)ＨＡＶ感染細胞の培養とハーベスト； (b)超音波処理によるハーベスト細胞の溶解； (c)溶解物の抽出及び水層中への維持； (d)水可溶性合成ポリマー効果による水層の濃縮及びＨ
ＡＶの沈殿形成； (e)沈殿ＨＡＶの抽出及び水層中への維持； (f)水層をイオン交換クロマトグラフィーにかける； (g)ＨＡＶを含むフラクション部分をゲル濾過にかけ、
十分に精製されたＨＡＶを得る。
以下のステップより成るものとして発表した； (a)ＨＡＶ感染細胞の培養とハーベスト； (b)超音波処理によるハーベスト細胞の溶解； (c)溶解物の抽出及び水層中への維持； (d)水可溶性合成ポリマー効果による水層の濃縮及びＨ
ＡＶの沈殿形成； (e)沈殿ＨＡＶの抽出及び水層中への維持； (f)水層をイオン交換クロマトグラフィーにかける； (g)ＨＡＶを含むフラクション部分をゲル濾過にかけ、
十分に精製されたＨＡＶを得る。
これらの過程は商業用大量処理としての改良しうる余地
をもつものであり、ワクチン用として、ＨＡＶ、あるい
は弱毒化ＨＡＶを含む、ＦＡＤ認可された商業用製造に
対する有望な方法の候補としてあげられるものである。
をもつものであり、ワクチン用として、ＨＡＶ、あるい
は弱毒化ＨＡＶを含む、ＦＡＤ認可された商業用製造に
対する有望な方法の候補としてあげられるものである。
商業的にも適用しうる精製方法である本発明は、弱毒で
あろうとなかろうと、あらゆるＡ型肝炎ウイルスの、そ
の様なＡ型肝炎ウイルスに対して感受性であるいかなる
細胞系あるいは培養細胞における精製を達成するもので
ある。ＭＲＣ−５細胞中で増殖分離されたＣＲ−３２６
のＦ株は、弱毒された株であろうとも、単に本発明の説
明の為に使用されているに過ぎない。一般的技術によっ
て弱毒されたＨＡＶ株を含む、他の株及び／又は血清型
をもつ株も本発明により達成されている。また、Ｖｅｒ
ｏ．ＦＬ．ＷＩ−３８及びＦＲｈＫ６細胞などを含む他
の細胞系についても同様である。細胞培養におけるＨＡ
Ｖ増殖に対するこれら及び他のシステムについての報告
がなされている。ゲレティー．アール．ジェイ．（Ｇｅ
ｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）“アクティブ イムナイゼーショ
ン アゲインスト ヘパティティスＡ（Ａｃｔｉｖｅ
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ａ．”ゲレティー，アール．ジェイ．（Ｇ
ｅｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）著、ヘパティティスＡ（Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓＡ）アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４、第２６３頁−第２７６
頁；及びティセハルスト．ジェイ．アール．（Ｔｉｃｅ
ｈｕｒｓｔ．Ｊ．Ｒ．）、セミナーズ イン リバー
ディジーズ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、第６巻、第４６頁−第５５頁、１９８
６。原則としてヒト二倍体線維細胞系がＨＡＶ感染に対
して感受性を示す宿主細胞として使用される。好ましい
細胞系としてＭＲＣ−５があげられる。
あろうとなかろうと、あらゆるＡ型肝炎ウイルスの、そ
の様なＡ型肝炎ウイルスに対して感受性であるいかなる
細胞系あるいは培養細胞における精製を達成するもので
ある。ＭＲＣ−５細胞中で増殖分離されたＣＲ−３２６
のＦ株は、弱毒された株であろうとも、単に本発明の説
明の為に使用されているに過ぎない。一般的技術によっ
て弱毒されたＨＡＶ株を含む、他の株及び／又は血清型
をもつ株も本発明により達成されている。また、Ｖｅｒ
ｏ．ＦＬ．ＷＩ−３８及びＦＲｈＫ６細胞などを含む他
の細胞系についても同様である。細胞培養におけるＨＡ
Ｖ増殖に対するこれら及び他のシステムについての報告
がなされている。ゲレティー．アール．ジェイ．（Ｇｅ
ｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）“アクティブ イムナイゼーショ
ン アゲインスト ヘパティティスＡ（Ａｃｔｉｖｅ
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ａ．”ゲレティー，アール．ジェイ．（Ｇ
ｅｒｅｔｙ．Ｒ．Ｊ．）著、ヘパティティスＡ（Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓＡ）アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４、第２６３頁−第２７６
頁；及びティセハルスト．ジェイ．アール．（Ｔｉｃｅ
ｈｕｒｓｔ．Ｊ．Ｒ．）、セミナーズ イン リバー
ディジーズ（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、第６巻、第４６頁−第５５頁、１９８
６。原則としてヒト二倍体線維細胞系がＨＡＶ感染に対
して感受性を示す宿主細胞として使用される。好ましい
細胞系としてＭＲＣ−５があげられる。
以下の記載において、各パラグラフの番号は以下のフロ
ーチャートにおける各ステップの番号に対応するもので
ある。
ーチャートにおける各ステップの番号に対応するもので
ある。
１．種々の一般的技術のどれか一つあるいはそれらのい
くつかの方法によるＨＡＶ感染細胞の培養とハーベス
ト。使用される細胞系が必要としている選択的培養液を
含む、培養条件。例えばＭＲＣ−５細胞なら培養器底面
への吸着が必要であり、またハーベスト時の細胞のはぎ
取りあるいはトリプシン消化が必要である。本発明の目
的に使用しうるその他の細胞型としては、懸濁培養しう
るものも含まれている。懸濁細胞培養においては普通、
遠心によって細胞を沈殿せしめるものである。
くつかの方法によるＨＡＶ感染細胞の培養とハーベス
ト。使用される細胞系が必要としている選択的培養液を
含む、培養条件。例えばＭＲＣ−５細胞なら培養器底面
への吸着が必要であり、またハーベスト時の細胞のはぎ
取りあるいはトリプシン消化が必要である。本発明の目
的に使用しうるその他の細胞型としては、懸濁培養しう
るものも含まれている。懸濁細胞培養においては普通、
遠心によって細胞を沈殿せしめるものである。
２．培養及びハーベスト後、ＨＡＶ感染細胞は種々の技
術によって溶解されるが、高張緩衝液に浸す、ボルテッ
クスにかける、凍結融解の繰り返し、及び超音波処理に
限定されるものではない。出願者はＨＡＶ感染ＭＲＣ−
５細胞の溶解には、超音波処理が必要であり、細胞より
ウイルス粒子を効果的に遊離させる事を発見した。（破
壊された宿主細胞からＨＡＶウイルス粒子を遊離させる
事を以後“リシス（Ｌｙｓｉｓ）”と呼ぶ。）超音波処
理はＨＡＶウイルス粒子を細胞中における亜細胞性偽結
晶化状態より効果的に遊離させるものと考えられる。超
音波処理に加えて、高張液溶解、ボルテックスあるいは
凍結融解の繰り返しなどの併用も、細胞の適切かつ有効
な溶解目的の為に使用可能である事はよく知られる所で
ある。出願者はＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞の溶解にはむ
しろ以下のステップを選ぶものである： (a)チューブ中にあらかじめ凍結しておいたハーベスト
した細胞を融解し、リシス緩衝液（１０ｍＭトリス・塩
酸pH７．５、１０mMＮａＣｌ、１．５mMＭｇＣ２）を加
える； (b)激げしくボルテックスにかける（１０−１５秒、セ
ット１０、ボルテックス−ジェニィー（Ｖｏｒｔｅｘ−
Ｇｅｎｉｅ））； (c)それぞれ、エタノールドライアイス中及び３７℃温
浴中での凍結融解を１回あるいは数回、連続的に行な
う；及び (d)循環氷水浴中で最高出力のカップホーンソニケータ
ーを用いて３０秒間、１回あるいは数回、超音波処理を
行ない（ブランソン ソニフィール セル ディスラプ
ター（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）１８５及びウルトラソニックス
カップ ホーン（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｃｕｐ ｈ
ｏｒｎ））、超音波処理済溶液を得る。
術によって溶解されるが、高張緩衝液に浸す、ボルテッ
クスにかける、凍結融解の繰り返し、及び超音波処理に
限定されるものではない。出願者はＨＡＶ感染ＭＲＣ−
５細胞の溶解には、超音波処理が必要であり、細胞より
ウイルス粒子を効果的に遊離させる事を発見した。（破
壊された宿主細胞からＨＡＶウイルス粒子を遊離させる
事を以後“リシス（Ｌｙｓｉｓ）”と呼ぶ。）超音波処
理はＨＡＶウイルス粒子を細胞中における亜細胞性偽結
晶化状態より効果的に遊離させるものと考えられる。超
音波処理に加えて、高張液溶解、ボルテックスあるいは
凍結融解の繰り返しなどの併用も、細胞の適切かつ有効
な溶解目的の為に使用可能である事はよく知られる所で
ある。出願者はＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞の溶解にはむ
しろ以下のステップを選ぶものである： (a)チューブ中にあらかじめ凍結しておいたハーベスト
した細胞を融解し、リシス緩衝液（１０ｍＭトリス・塩
酸pH７．５、１０mMＮａＣｌ、１．５mMＭｇＣ２）を加
える； (b)激げしくボルテックスにかける（１０−１５秒、セ
ット１０、ボルテックス−ジェニィー（Ｖｏｒｔｅｘ−
Ｇｅｎｉｅ））； (c)それぞれ、エタノールドライアイス中及び３７℃温
浴中での凍結融解を１回あるいは数回、連続的に行な
う；及び (d)循環氷水浴中で最高出力のカップホーンソニケータ
ーを用いて３０秒間、１回あるいは数回、超音波処理を
行ない（ブランソン ソニフィール セル ディスラプ
ター（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）１８５及びウルトラソニックス
カップ ホーン（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｃｕｐ ｈ
ｏｒｎ））、超音波処理済溶液を得る。
３．リシス後、ＨＡＶ感染細胞つまり溶解懸濁液あるい
は、超音波処理済溶液を緩衝液で希釈して、有機溶媒に
よる抽出を行なう。その様な抽出は、特に不純物とし
て、リピドやリピド様物質を除去するものである。よっ
て超音波処理済溶液は種々ある緩衝液のどれか一つで希
釈されるものである。例えば、リン酸緩衝生理食塩水、
トリス、炭酸、重炭酸あるいは酢酸などの緩衝液。ＨＡ
Ｖウイルス粒子は酸に対して安定性を持つようなので酸
性pH領域を示す緩衝液が適切であろう。出願者は、緩衝
液中におけるＭｇＣｌ２の存在が、ウイルス粒子の獲得
を十分に低下させるという事を発見した。最も好ましい
緩衝液はＴＮＥ（１０ｍＭトリス・塩酸pH７．５、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）である。
は、超音波処理済溶液を緩衝液で希釈して、有機溶媒に
よる抽出を行なう。その様な抽出は、特に不純物とし
て、リピドやリピド様物質を除去するものである。よっ
て超音波処理済溶液は種々ある緩衝液のどれか一つで希
釈されるものである。例えば、リン酸緩衝生理食塩水、
トリス、炭酸、重炭酸あるいは酢酸などの緩衝液。ＨＡ
Ｖウイルス粒子は酸に対して安定性を持つようなので酸
性pH領域を示す緩衝液が適切であろう。出願者は、緩衝
液中におけるＭｇＣｌ２の存在が、ウイルス粒子の獲得
を十分に低下させるという事を発見した。最も好ましい
緩衝液はＴＮＥ（１０ｍＭトリス・塩酸pH７．５、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）である。
緩衝液で希釈された超音波処理済溶液に、塩化メチレン
の様なハロゲン化低級アルカンと、イソアミルアルコー
ルの様な消泡剤の混合物を加えて抽出を行なった。ハロ
ゲン化低級アルカンと消泡剤との容量対容量の比率は約
１５：１から約５０：１で、好ましくは、約２０：１か
ら約３０：１である。出願者は、このステップにおいて
は、塩化メチレンが、クロロホルムよりすぐれていると
判断した。ＨＡＶウイルス粒子は、水層中及び中間層に
維持されている。
の様なハロゲン化低級アルカンと、イソアミルアルコー
ルの様な消泡剤の混合物を加えて抽出を行なった。ハロ
ゲン化低級アルカンと消泡剤との容量対容量の比率は約
１５：１から約５０：１で、好ましくは、約２０：１か
ら約３０：１である。出願者は、このステップにおいて
は、塩化メチレンが、クロロホルムよりすぐれていると
判断した。ＨＡＶウイルス粒子は、水層中及び中間層に
維持されている。
最も好ましい方法としては、超音波処理済溶液に塩化メ
チレン：イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ／Ｖ）溶
媒を等量加えて有機的に抽出する事であり、１分間ボル
テックスにかけ、ＩＥＣ遠心（〜３，０００ｇ）、２０
℃で１０分間、３，０００ｒｐｍの遠心にかけ分離層を
得るものとする事である。水層を保存し、有機溶媒層を
除去した後、中間層を最初のサンプル量の1/3容量に相
当する容量のＴＮＥ緩衝液で再抽出し、上述同様、ボル
テックス及び遠心を行なう。この２つの水層を集め、そ
の体積を測定し、有機的に抽出された細胞溶液物中にＡ
型肝炎ウイルスを獲得する。
チレン：イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ／Ｖ）溶
媒を等量加えて有機的に抽出する事であり、１分間ボル
テックスにかけ、ＩＥＣ遠心（〜３，０００ｇ）、２０
℃で１０分間、３，０００ｒｐｍの遠心にかけ分離層を
得るものとする事である。水層を保存し、有機溶媒層を
除去した後、中間層を最初のサンプル量の1/3容量に相
当する容量のＴＮＥ緩衝液で再抽出し、上述同様、ボル
テックス及び遠心を行なう。この２つの水層を集め、そ
の体積を測定し、有機的に抽出された細胞溶液物中にＡ
型肝炎ウイルスを獲得する。
４．次のステップは水可溶性合成ポリマー効果による濃
縮及びタンパクの沈殿。出願者は有機的に抽出された細
胞溶解物の濃縮に、分子量約２０００ダルトンから約１
２０００ダルトンを持つポリエチレングリコール(PEG)
を選んだ。一般的にその溶解物に対して加えられるＮａ
Ｃｌの最終濃度は約１５０mMから約５００mMであり、か
つＰＥＧは最終濃度が約２％（ｗ／ｖ）から約１０％
（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、その有機的抽出細
胞溶解に対して、ＮａＣｌ、５００mMであり、ＰＥＧ
（分子量〜８０００ダルトン）、約４％（ｗ／ｖ）であ
る。沈殿形成が見られたら、この４％ＰＥＧ溶解物を遠
心にかけ、上清を除去し、ＰＥＧ沈殿物を更に次なる過
程の為に再浮遊させる。この再浮遊ＰＥＧ沈殿物はその
２回目の有機的抽出の前に、超音波処理される事が好ま
しく、以下に記載するものである。ステップ４における
産生物は、再浮遊された超音波処理済ＰＥＧ沈殿物であ
る。
縮及びタンパクの沈殿。出願者は有機的に抽出された細
胞溶解物の濃縮に、分子量約２０００ダルトンから約１
２０００ダルトンを持つポリエチレングリコール(PEG)
を選んだ。一般的にその溶解物に対して加えられるＮａ
Ｃｌの最終濃度は約１５０mMから約５００mMであり、か
つＰＥＧは最終濃度が約２％（ｗ／ｖ）から約１０％
（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、その有機的抽出細
胞溶解に対して、ＮａＣｌ、５００mMであり、ＰＥＧ
（分子量〜８０００ダルトン）、約４％（ｗ／ｖ）であ
る。沈殿形成が見られたら、この４％ＰＥＧ溶解物を遠
心にかけ、上清を除去し、ＰＥＧ沈殿物を更に次なる過
程の為に再浮遊させる。この再浮遊ＰＥＧ沈殿物はその
２回目の有機的抽出の前に、超音波処理される事が好ま
しく、以下に記載するものである。ステップ４における
産生物は、再浮遊された超音波処理済ＰＥＧ沈殿物であ
る。
５．再浮遊された超音波処理済ＰＥＧ沈殿物にクロロホ
ルムの様なハロゲン化低級アルカンとイソアミルアルコ
ールの様な消泡剤の混合物を加えて抽出を行なった。ハ
ロゲン化低級アルカンと消泡剤との容量対容量の比率は
約１５：１から約５０：１で好ましくは、約２０：１か
ら約３０：１である。この２回目の有機的抽出がその最
終ＨＡＶ産生物の純度を十分に増大させるとは出願者に
とっても予期せぬ発見であった。更に１回目の有機的抽
出（ステップ３に対応するパラグラフ参照）とは対照的
に、出願者はこの２回目の有機的抽出においては、クロ
ロホルムの方が塩化メチレンよりもすぐれている事に気
がついた。
ルムの様なハロゲン化低級アルカンとイソアミルアルコ
ールの様な消泡剤の混合物を加えて抽出を行なった。ハ
ロゲン化低級アルカンと消泡剤との容量対容量の比率は
約１５：１から約５０：１で好ましくは、約２０：１か
ら約３０：１である。この２回目の有機的抽出がその最
終ＨＡＶ産生物の純度を十分に増大させるとは出願者に
とっても予期せぬ発見であった。更に１回目の有機的抽
出（ステップ３に対応するパラグラフ参照）とは対照的
に、出願者はこの２回目の有機的抽出においては、クロ
ロホルムの方が塩化メチレンよりもすぐれている事に気
がついた。
最も好ましい方法として、以下に示す様に、その２回目
の抽出ステップを行なった： 超音波処理済、再浮遊された沈殿物を１時間、４℃で２
００ｒｐｍの旋回振盪機により回転させる。再浮遊ＰＥ
Ｇ８０００沈殿物に等量のクロロホルム：イソアミルア
ルコール（２４：１、ｖ／ｖ）溶媒を加え、激げしくボ
ルテックスし、２０℃、１０分、４０００ｇの遠心にか
けて浄化するという有機的抽出を行なった。水層を保存
しておき、中間層及び有機溶媒層を最初のサンプル量の
1/3容量に相当するＴＮＥ緩衝液で再抽出し、両方の水
層を集め、抽出ＰＥＧ沈殿物を得る。
の抽出ステップを行なった： 超音波処理済、再浮遊された沈殿物を１時間、４℃で２
００ｒｐｍの旋回振盪機により回転させる。再浮遊ＰＥ
Ｇ８０００沈殿物に等量のクロロホルム：イソアミルア
ルコール（２４：１、ｖ／ｖ）溶媒を加え、激げしくボ
ルテックスし、２０℃、１０分、４０００ｇの遠心にか
けて浄化するという有機的抽出を行なった。水層を保存
しておき、中間層及び有機溶媒層を最初のサンプル量の
1/3容量に相当するＴＮＥ緩衝液で再抽出し、両方の水
層を集め、抽出ＰＥＧ沈殿物を得る。
６．ほとんどの場合、少なくとも１回は、その２回目の
有機的抽出操作後に陰イオン交換クロマトグラフィーに
かけられる事が望ましい。ＰＥＧ抽出沈殿物あるいはポ
リマー抽出沈殿物は陽電荷をもつ樹脂、ゲル、マトリッ
クスなどによるイオン交換クロマトグラフィーにかけら
れる。代表的な陰イオン交換マトリックスとして、以下
の物があるが、それに限定されるものではない。つま
り、ＤＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥアガロース、ＤＥＡ
Ｅバイオゲル、ＤＥＡＥデキストラン、ＤＥＡＥセファ
デックス、ＤＥＡＥセファロース、アミノヘキシルセフ
ァロース、エクテオラセルロース、ＴＥＡＥセルロー
ス、ＱＡＥセルロース、モノ−Ｑ、あるいはベンゾイル
化ジエチルアミノエチルセルロース。陰イオン交換とし
て好ましいものは、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア）である。イオン交換クロマトグラフィ
ーの一般的かつ基礎的な説明が例えばイー．エー．ピー
ターソン．（Ｅ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、“セルロジ
ック イオン イクスチェンジャーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｉｃ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ）”、ウォー
ク．ティー．エス．（Ｗｏｒｋ．Ｔ．Ｓ．）等、ラボラ
トリー テクニクス イン バイオケミストリー アン
ド モレキュラー バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）、第２巻、パートII、第２２３頁以下参照、ノース
ー オランダ（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ）、１９７
０にみられる。
有機的抽出操作後に陰イオン交換クロマトグラフィーに
かけられる事が望ましい。ＰＥＧ抽出沈殿物あるいはポ
リマー抽出沈殿物は陽電荷をもつ樹脂、ゲル、マトリッ
クスなどによるイオン交換クロマトグラフィーにかけら
れる。代表的な陰イオン交換マトリックスとして、以下
の物があるが、それに限定されるものではない。つま
り、ＤＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥアガロース、ＤＥＡ
Ｅバイオゲル、ＤＥＡＥデキストラン、ＤＥＡＥセファ
デックス、ＤＥＡＥセファロース、アミノヘキシルセフ
ァロース、エクテオラセルロース、ＴＥＡＥセルロー
ス、ＱＡＥセルロース、モノ−Ｑ、あるいはベンゾイル
化ジエチルアミノエチルセルロース。陰イオン交換とし
て好ましいものは、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア）である。イオン交換クロマトグラフィ
ーの一般的かつ基礎的な説明が例えばイー．エー．ピー
ターソン．（Ｅ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、“セルロジ
ック イオン イクスチェンジャーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｉｃ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ）”、ウォー
ク．ティー．エス．（Ｗｏｒｋ．Ｔ．Ｓ．）等、ラボラ
トリー テクニクス イン バイオケミストリー アン
ド モレキュラー バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）、第２巻、パートII、第２２３頁以下参照、ノース
ー オランダ（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ）、１９７
０にみられる。
ＰＥＧ抽出沈殿における陰イオン交換の主要な効果の１
つとして、ＤＮＡの除去があげられる。原則的に、それ
故、陰イオン交換は付加的に代用されＤＮＡｓｅの除去
にも使用される。あるいは精製過程のこのステップにお
いて選択的処理としてＤＮＡ除去に使用される。
つとして、ＤＮＡの除去があげられる。原則的に、それ
故、陰イオン交換は付加的に代用されＤＮＡｓｅの除去
にも使用される。あるいは精製過程のこのステップにお
いて選択的処理としてＤＮＡ除去に使用される。
７．最終ステップとして陰イオン交換の次にゲル濾過ク
ロマトグラフィーが行なわれる。代表的にセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）が使用されるが、その他多
くのタイプのゲル濾過マトリックスも使用されるところ
である。例えば、フィッシャー．エル．（Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ．Ｌ．）“ゲル フィルトレーション クロマトグラ
フィー（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ）”ウォーク．ティー．エス．（Ｗｏ
ｒｋ．Ｔ．Ｓ）等、ラボラトリーテクニクス イン バ
イオケミストリー アンド モレキュラー バイオロジ
ー エルセバー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）１９８０、参照。
ロマトグラフィーが行なわれる。代表的にセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）が使用されるが、その他多
くのタイプのゲル濾過マトリックスも使用されるところ
である。例えば、フィッシャー．エル．（Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ．Ｌ．）“ゲル フィルトレーション クロマトグラ
フィー（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ）”ウォーク．ティー．エス．（Ｗｏ
ｒｋ．Ｔ．Ｓ）等、ラボラトリーテクニクス イン バ
イオケミストリー アンド モレキュラー バイオロジ
ー エルセバー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）１９８０、参照。
本発明においては、クロマトグラフィーステップの使用
順位が詳細に１つの代表的プロトコールとして、陰イオ
ン交換、次にゲル濾過として記載されているが、それら
の使用順位が変化しうるものであることは、理解されて
いるところである。例えばゲル濾過をイオン交換の前に
行なうという様に。
順位が詳細に１つの代表的プロトコールとして、陰イオ
ン交換、次にゲル濾過として記載されているが、それら
の使用順位が変化しうるものであることは、理解されて
いるところである。例えばゲル濾過をイオン交換の前に
行なうという様に。
付加的ステップ ウイルスタンパクあるいはウイルス粒子の精製にもっぱ
ら使用されたり、知られているその他の常法がこのＨＡ
Ｖ精製過程においても、追加使用されるものである。こ
れらステップは以下の事より成るが、それに限定される
ものではない： (a)固相上における選択的吸着あるいは分離、例えば、
シリカゲル、リン酸カルシウム炭素粉、あるいはセライ
トアルミナ； (b)疎水性クロマトグラフィー、例えば、ブチルアガロ
ース；及び (c)その他の溶媒あるいは試薬による選択的抽出。
ら使用されたり、知られているその他の常法がこのＨＡ
Ｖ精製過程においても、追加使用されるものである。こ
れらステップは以下の事より成るが、それに限定される
ものではない： (a)固相上における選択的吸着あるいは分離、例えば、
シリカゲル、リン酸カルシウム炭素粉、あるいはセライ
トアルミナ； (b)疎水性クロマトグラフィー、例えば、ブチルアガロ
ース；及び (c)その他の溶媒あるいは試薬による選択的抽出。
(d)ＨＡＶ単離に効果的な、その他のステップとしての
追加的沈殿形成法。
追加的沈殿形成法。
その他の方法として (e)標準的ないくつかの方法によるクロマトグラフィ
ー、例えば、薄層、ゲル、分子ふるい、分子排除、イオ
ン交換、リガンドアフィニティー、イムノアフィニティ
ー、あるいは電気泳動など； (f)２層抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧとデキスト
ラン； (g)透析、ウルトラフィルトレーション、あるいはダイ
アフィルトレーション； (h)密度勾配遠心法； (i)等電点焦点法； (j)凍結乾燥；あるいは (k)結晶化； (l)プロテアーゼ インヒビタ及び／あるいはキレート
剤の緩衝液への添加；あるいは (m)一つの緩衝液を別の緩衝液に置き換える。上記リス
トがすべてであるわけでは決してない。
ー、例えば、薄層、ゲル、分子ふるい、分子排除、イオ
ン交換、リガンドアフィニティー、イムノアフィニティ
ー、あるいは電気泳動など； (f)２層抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧとデキスト
ラン； (g)透析、ウルトラフィルトレーション、あるいはダイ
アフィルトレーション； (h)密度勾配遠心法； (i)等電点焦点法； (j)凍結乾燥；あるいは (k)結晶化； (l)プロテアーゼ インヒビタ及び／あるいはキレート
剤の緩衝液への添加；あるいは (m)一つの緩衝液を別の緩衝液に置き換える。上記リス
トがすべてであるわけでは決してない。
このリストの順番は精製における好ましい順位を示すも
のではない。ＨＡＶの精製をうまく行なうには、ステッ
プ(a)〜(m)のうちのどれか、あるいは数種、あるいはす
べての使用が含まれている事はよく知られている所であ
る。
のではない。ＨＡＶの精製をうまく行なうには、ステッ
プ(a)〜(m)のうちのどれか、あるいは数種、あるいはす
べての使用が含まれている事はよく知られている所であ
る。
一般的あるいは公知の特性をもつステップの付加的方法
がワクチンとしての精製ＨＡＶを調製するものであり、
また、必要とされているのである。例えば、ホルマリン
処理、滅菌濾過及び担体あるいはアジュバンドへの吸着
などもホルマリン不活化ワクチンの製造においては代表
的かつ基本的ステップである。例えば、プロボスト．ピ
ー．ジェイ．（Ｐｒｏｖｏｓｔ．Ｐ．Ｊ．）等、プロ
ク．ソク．イクス．バイオル．メド．（Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、第１６０巻、第２
１３頁、１９７９；プロボスト．ピー．ジェイ．等、ジ
ェイ．メド．ヴィロル．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、第１９巻、第２３頁、１９８６、参照。ＨＡＶ
の不活化は、熱処理、pH変化、有機溶媒処理、紫外線照
射、あるいはホルマリン処理によって行なわれる。本発
明の目的は、ＨＡＶのＣ３２６Ｆ株に加えて、弱毒化の
あるなしにかかわらず、その他あらゆるＨＡＶ株につい
ても達成される事はよく知られている所である。弱毒株
は細胞中あるいは動物中における連続的継代によって、
あるいは、その他の方法によって分離されてくるもので
ある。例えば、プロボスト．ビー．ジェイ．等、プロ
ク．ソク．イクス．バイオル．メド．第１７０巻、第８
頁、１９８２；及びプロボスト．ピー．ジェイ．等、ジ
ェイ．メド．ヴィロル．第２０巻、第１６５頁、１９８
６、の弱毒化についての詳細報告参照。本発明の精製方
法は迅速かつ容易に弱毒あるいは非弱毒化株に対して適
用しうるものである。
がワクチンとしての精製ＨＡＶを調製するものであり、
また、必要とされているのである。例えば、ホルマリン
処理、滅菌濾過及び担体あるいはアジュバンドへの吸着
などもホルマリン不活化ワクチンの製造においては代表
的かつ基本的ステップである。例えば、プロボスト．ピ
ー．ジェイ．（Ｐｒｏｖｏｓｔ．Ｐ．Ｊ．）等、プロ
ク．ソク．イクス．バイオル．メド．（Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、第１６０巻、第２
１３頁、１９７９；プロボスト．ピー．ジェイ．等、ジ
ェイ．メド．ヴィロル．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、第１９巻、第２３頁、１９８６、参照。ＨＡＶ
の不活化は、熱処理、pH変化、有機溶媒処理、紫外線照
射、あるいはホルマリン処理によって行なわれる。本発
明の目的は、ＨＡＶのＣ３２６Ｆ株に加えて、弱毒化の
あるなしにかかわらず、その他あらゆるＨＡＶ株につい
ても達成される事はよく知られている所である。弱毒株
は細胞中あるいは動物中における連続的継代によって、
あるいは、その他の方法によって分離されてくるもので
ある。例えば、プロボスト．ビー．ジェイ．等、プロ
ク．ソク．イクス．バイオル．メド．第１７０巻、第８
頁、１９８２；及びプロボスト．ピー．ジェイ．等、ジ
ェイ．メド．ヴィロル．第２０巻、第１６５頁、１９８
６、の弱毒化についての詳細報告参照。本発明の精製方
法は迅速かつ容易に弱毒あるいは非弱毒化株に対して適
用しうるものである。
本発明において、低級アルカンとは１から６個の炭素原
子を含むものである。
子を含むものである。
以下記載の実施例は本発明の実行を説明するものであ
り、本発明の目的及び内容を限定するものではない。
り、本発明の目的及び内容を限定するものではない。
実施例 ＭＲＣ−５細胞由来のＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の精
製方法 Ａ．細胞破壊 ４本のローラーボトルにおける弱毒ＨＡＶ（ＣＲ−３２
６Ｆ株）感染細胞をはぎとり、ハーベストした後、１本
のチューブに入れ−７０℃で凍結。この様なチューブ２
本に、１本当たり３mlのリシス緩衝液（１０ｍＭトリス
塩酸、pH７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２）を加えて融解させる。そして、激げしくボルテ
ックスにかけ（１０−１５秒、セット１０、ボルテック
ス−ジェニィー）、氷水中に１５分、放置。溶解物をエ
タノールドライアイス中及び３７℃温浴中での凍結融解
に２回かける。そして、各チューブを循環氷水浴中で、
最高出力のカップホーンソニケーターを用いて３０秒
間、３回（ブランソン ソニフィール セル ディスラ
プター １８５及びウルトラ ソニックス カップホー
ン）の超音波処理にかける。超音波処理済溶液を集め、
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとした、ブ
ラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）プティンアッセイ
（バイオラッド）により、タンパク濃度を測定し、１ml
当たり、３ｍｇタンパク量になる様にＴＮＥ緩衝液（１
０ｍＭトリス・塩酸、pH７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で調整する。この超音波処理済
溶液に等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール（２
４：１、ｖ／ｖ）溶媒を加えて、１分間ボルテックスを
行ない抽出をする。そしてＩＥＣ遠心（〜３０００
ｇ）、２０℃で１０分間、３０００ｒｐｍの遠心にかけ
分離層を得る。水層を保存し、有機溶媒層は除去、中間
層を最初のサンプル量の1/3容量に相当する容量のＴＮ
Ｅ緩衝液で再度、抽出する。同様に遠心前にはボルテッ
クスにかける。この２つの水層を集め、その体積を測定
して、有機的に抽出された細胞溶解物中にＡ型肝炎ウイ
ルスを獲得する。
製方法 Ａ．細胞破壊 ４本のローラーボトルにおける弱毒ＨＡＶ（ＣＲ−３２
６Ｆ株）感染細胞をはぎとり、ハーベストした後、１本
のチューブに入れ−７０℃で凍結。この様なチューブ２
本に、１本当たり３mlのリシス緩衝液（１０ｍＭトリス
塩酸、pH７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２）を加えて融解させる。そして、激げしくボルテ
ックスにかけ（１０−１５秒、セット１０、ボルテック
ス−ジェニィー）、氷水中に１５分、放置。溶解物をエ
タノールドライアイス中及び３７℃温浴中での凍結融解
に２回かける。そして、各チューブを循環氷水浴中で、
最高出力のカップホーンソニケーターを用いて３０秒
間、３回（ブランソン ソニフィール セル ディスラ
プター １８５及びウルトラ ソニックス カップホー
ン）の超音波処理にかける。超音波処理済溶液を集め、
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとした、ブ
ラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）プティンアッセイ
（バイオラッド）により、タンパク濃度を測定し、１ml
当たり、３ｍｇタンパク量になる様にＴＮＥ緩衝液（１
０ｍＭトリス・塩酸、pH７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で調整する。この超音波処理済
溶液に等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール（２
４：１、ｖ／ｖ）溶媒を加えて、１分間ボルテックスを
行ない抽出をする。そしてＩＥＣ遠心（〜３０００
ｇ）、２０℃で１０分間、３０００ｒｐｍの遠心にかけ
分離層を得る。水層を保存し、有機溶媒層は除去、中間
層を最初のサンプル量の1/3容量に相当する容量のＴＮ
Ｅ緩衝液で再度、抽出する。同様に遠心前にはボルテッ
クスにかける。この２つの水層を集め、その体積を測定
して、有機的に抽出された細胞溶解物中にＡ型肝炎ウイ
ルスを獲得する。
Ｂ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿形成 有機的に抽出された細胞溶解物中のＡ型肝炎ウイルス
を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿形成法によ
り濃縮する。溶解物中に、５００ｍＭ ＮａＣｌになる
様に、かつＰＥＧ８０００が４％（ｗ／ｖ）になるよう
に、４０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ（１０ｍＭトリス・塩
酸、pH７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）をそれぞれ加え、激げしくボルテックスにかける。
この４％ＰＥＧ溶解物を４℃、１時間、静置し、ベック
マンＨＢ−４ローター、４℃、１０分間、１５００ｇの
遠心にかける。上清を除去して、ＰＥＧ沈殿物を１０ml
の１０ｍＭトリス・塩酸pH７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに再浮遊させ、激しくボルテッ
クスにかける。そして、上述同様、循環氷水浴中で最高
出力のカップホーンソニケーターを用いて３０秒間、３
回の超音波処理を行なう。この超音波処理された、再浮
遊沈殿物を１時間、４℃で２００ｒｐｍの旋回振盪機に
より回転させる。この再浮遊ＰＥＧ８０００沈殿物に等
量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１、
ｖ／ｖ）溶媒を加え激しくボルテックスし、２０℃、１
０分間、４０００ｇの遠心にかけて浄化する。水層を保
存しておき、中間層及び有機溶媒層を再浮遊ＰＥＧ沈殿
物量の1/3容量に相当するＴＮＥ緩衝液で再抽出し、両
方の水層を集め、再抽出ＰＥＧ沈殿物を得る。
を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿形成法によ
り濃縮する。溶解物中に、５００ｍＭ ＮａＣｌになる
様に、かつＰＥＧ８０００が４％（ｗ／ｖ）になるよう
に、４０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ（１０ｍＭトリス・塩
酸、pH７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）をそれぞれ加え、激げしくボルテックスにかける。
この４％ＰＥＧ溶解物を４℃、１時間、静置し、ベック
マンＨＢ−４ローター、４℃、１０分間、１５００ｇの
遠心にかける。上清を除去して、ＰＥＧ沈殿物を１０ml
の１０ｍＭトリス・塩酸pH７．５、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに再浮遊させ、激しくボルテッ
クスにかける。そして、上述同様、循環氷水浴中で最高
出力のカップホーンソニケーターを用いて３０秒間、３
回の超音波処理を行なう。この超音波処理された、再浮
遊沈殿物を１時間、４℃で２００ｒｐｍの旋回振盪機に
より回転させる。この再浮遊ＰＥＧ８０００沈殿物に等
量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１、
ｖ／ｖ）溶媒を加え激しくボルテックスし、２０℃、１
０分間、４０００ｇの遠心にかけて浄化する。水層を保
存しておき、中間層及び有機溶媒層を再浮遊ＰＥＧ沈殿
物量の1/3容量に相当するＴＮＥ緩衝液で再抽出し、両
方の水層を集め、再抽出ＰＥＧ沈殿物を得る。
Ｃ．イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー 再抽出ＰＥＧ沈殿物を３５０ｍＭ ＮａＣｌになる様に
調整し、流速３ml／分で２mlのＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラ
フィーを行なう。コンテス フレックス（Ｋｏｎｔｅｓ
Ｆｌｅｘ）カラム（１．０×５．０cm）使用、１０ｍ
Ｍトリス・塩酸pH７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡで平衡化。最初の溶出液１５mlを集めて、
セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）カラム（２．
６×９５cm）でクロマトグラフィーを行なう。ＴＮＥ緩
衝液で平衡、流速は２０ml／時とする。５mlのフラクシ
ョン部分を集め、十分に精製された、弱毒ＨＡＶを得
る。
調整し、流速３ml／分で２mlのＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラ
フィーを行なう。コンテス フレックス（Ｋｏｎｔｅｓ
Ｆｌｅｘ）カラム（１．０×５．０cm）使用、１０ｍ
Ｍトリス・塩酸pH７．５、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡで平衡化。最初の溶出液１５mlを集めて、
セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）カラム（２．
６×９５cm）でクロマトグラフィーを行なう。ＴＮＥ緩
衝液で平衡、流速は２０ml／時とする。５mlのフラクシ
ョン部分を集め、十分に精製された、弱毒ＨＡＶを得
る。
ＨＡＶを含むフラクション部分をハバグ リア（ＨＡＶ
ＡＧ ＲＩＡ）（アボット ラボラトリーズ（Ａｂｂｏ
ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で固定し、一つに集
めた後、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶ−０．２２μ
フィルター（ミリポア）で滅菌濾過を行ない４℃に保存
する。集めたＨＡＶの濃度を定量的ハバグ リア（ＨＡ
ＶＡＧ ＲＩＡ）で測定し、（もし必要があれば）、Ｙ
Ｍ１００メンブランを持つ、アミコンウルトラフィルト
レーションセルにより、このサンプルを濃縮する。
ＡＧ ＲＩＡ）（アボット ラボラトリーズ（Ａｂｂｏ
ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で固定し、一つに集
めた後、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶ−０．２２μ
フィルター（ミリポア）で滅菌濾過を行ない４℃に保存
する。集めたＨＡＶの濃度を定量的ハバグ リア（ＨＡ
ＶＡＧ ＲＩＡ）で測定し、（もし必要があれば）、Ｙ
Ｍ１００メンブランを持つ、アミコンウルトラフィルト
レーションセルにより、このサンプルを濃縮する。
５μｇの精製ＨＡＶサンプルに関して、銀染色及びウェ
スタンブロッティングを用いた、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動からは、いかなる不純物も確認出
来なかった。
スタンブロッティングを用いた、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動からは、いかなる不純物も確認出
来なかった。
前述の明細記載内容は、説明の為の実施例をもって本発
明の原理を示したものであるが、特許請求の範囲におけ
る目的にみられる様に、本明細書中に述べられている過
程、及びプロトコールにおいて、いかなる変法、応用、
改良、省略あるいは追加があったとしても、本発明は遂
行されるものであるということは、よく理解されている
ところである。
明の原理を示したものであるが、特許請求の範囲におけ
る目的にみられる様に、本明細書中に述べられている過
程、及びプロトコールにおいて、いかなる変法、応用、
改良、省略あるいは追加があったとしても、本発明は遂
行されるものであるということは、よく理解されている
ところである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーシー イー．アームストロング アメリカ合衆国，19473 ペンシルヴアニ ア，シユウエンクス ヴイル，バーンブリ ツジ ドライヴ 1080
Claims (11)
- 【請求項１】ＨＡＶを十分に精製する方法において、 (a)ＨＡＶ感染細胞の培養とハーベスト； (b)超音波処理によるハーベスト細胞の溶解； (c)溶解物の抽出及び水層中への維持； (d)水可溶性合成ポリマー効果による水層の濃縮及びＨ
ＡＶの沈殿形成； (e)沈殿ＨＡＶの抽出及び水層中への維持； (f)水層をイオン交換クロマトグラフィーにかける； (g)ＨＡＶを含むフラクション部分をゲル濾過にかけ、
十分に精製されたＨＡＶを得ることよりなる方法。 - 【請求項２】ＨＡＶ感染細胞がＭＲＣ−５細胞である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】ＨＡＶがＣＲ−３２６のＦ株である請求項
２記載の方法。 - 【請求項４】ステップ(a)の培養とハーベストに先立
ち、ＨＡＶが弱毒されている請求項１記載の方法。 - 【請求項５】ステップ(c)の抽出がイソアミルアルコー
ルとハロゲン化低級アルカンの混合物の添加により行な
われ、当該混合物が約１容量のイソアミルアルコールと
約２０から約３０容量の当該ハロゲン化低級アルカンよ
り成る請求項１記載の方法。 - 【請求項６】ハロゲン化低級アルカンが塩化メチレンで
ある請求項５記載の方法。 - 【請求項７】ステップ(d)の水可溶性合成ポリマーが約
２０００ダルトンから約１２０００ダルトンの分子量を
もつポリエチレングリコールであり当該ポリエチレング
リコールの水層中での最終濃度は約２％(w/v)から約１
０％(w/v)である請求項１記載の方法。 - 【請求項８】ステップ(d)の水可溶性合成ポリマーが約
８０００ダルトンの分子量をもつポリエチレングリコー
ルであり当該ポリエチレングリコールの水層中での最終
濃度は約４％(w/v)である請求項１記載の方法。 - 【請求項９】ステップ(e)の抽出がイソアミルアルコー
ルとハロゲン化アルカンの混合物の添加により行なわれ
当該混合物が約１容量のイソアミルアルコールと約２０
から約３０容量の当該ハロゲン化低級アルカンより成る
請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】ハロゲン化低級アルカンがクロロホルム
である請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】ワクチン用弱毒ＨＡＶを十分に精製する
方法において、 (a)弱毒ＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞の培養とハーベス
ト； (b)超音波処理によるハーベストＭＲＣ−５細胞の溶
解； (c)イソアミルアルコールと塩化メチレンの混合物によ
る、溶解物の抽出及び水層中への維持； (d)４％(w/v)ＰＥＧ８０００による水層の濃縮及び４％
ＰＥＧ沈殿物の再懸濁； (e)イソアミルアルコールとクロロホルムの混合物によ
る、４％ＰＥＧ沈殿物再懸濁の抽出及び水層中への維
持； (f)水層をイオン交換クロマトグラフィーにかける；そ
して (g)ＨＡＶを含むフラクション部分をゲル濾過にかける
ことよりなるワクチン用の十分に精製された弱毒ＨＡＶ
を得る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8272087A | 1987-08-06 | 1987-08-06 | |
| US082,720 | 1998-05-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6451080A JPS6451080A (en) | 1989-02-27 |
| JPH0648980B2 true JPH0648980B2 (ja) | 1994-06-29 |
Family
ID=22173006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63194324A Expired - Lifetime JPH0648980B2 (ja) | 1987-08-06 | 1988-08-03 | Ａ型肝炎ウイルス粒子の新規なる精製方法 |
Country Status (16)
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| JP (1) | JPH0648980B2 (ja) |
| KR (1) | KR970001711B1 (ja) |
| AT (1) | ATE84067T1 (ja) |
| AU (1) | AU612168B2 (ja) |
| CY (1) | CY1773A (ja) |
| DE (1) | DE3877082T2 (ja) |
| DK (1) | DK173215B1 (ja) |
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| GR (1) | GR3007158T3 (ja) |
| IE (1) | IE61294B1 (ja) |
| IL (1) | IL87257A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ225583A (ja) |
| PT (1) | PT88178B (ja) |
| ZA (1) | ZA885726B (ja) |
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| CA2047041A1 (en) * | 1990-07-18 | 1992-01-19 | John A. Lewis | Process for purification of hepatitis-a virus capsids |
| JPH0834362B2 (ja) * | 1991-03-08 | 1996-03-29 | ローム株式会社 | 電気部品取り外し機 |
| GB9111230D0 (en) * | 1991-05-24 | 1991-07-17 | Wellcome Found | Virus production |
| US5506129A (en) * | 1991-05-24 | 1996-04-09 | Evans Medical Limited | Virus production |
| IT1248075B (it) * | 1991-06-18 | 1995-01-05 | Sclavo Spa | Processo per la purificazione del virus dell'epatite a (hav), virus cosi` purificato e composizioni vaccinali che lo contengono. |
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| DZ1706A1 (fr) | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| FR2696748B1 (fr) | 1992-10-14 | 1994-12-30 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV). |
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| DE69515028T2 (de) * | 1994-03-22 | 2000-06-29 | The Immune Response Corp., Carlsbad | Die hocheffiziente herstellung und isolierung von viruspartikeln |
| WO1997008298A1 (en) | 1995-08-30 | 1997-03-06 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adenovirus and aav |
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| DE602004021260D1 (de) * | 2003-07-11 | 2009-07-09 | Alphavax Inc | Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren |
| US8460913B2 (en) | 2007-06-21 | 2013-06-11 | Alpha Vax, Inc. | Promoterless cassettes for expression of alpha virus structural proteins |
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-
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- 1988-08-04 KR KR1019880009926A patent/KR970001711B1/ko not_active Expired - Lifetime
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- 1988-08-05 IE IE240788A patent/IE61294B1/en not_active IP Right Cessation
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1995
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