PT88208B

PT88208B - Processo para a preparacao de enzimas estabilizados

Info

Publication number: PT88208B
Application number: PT88208A
Authority: PT
Inventors: Amihay Freeman; Ruth Tor
Original assignee: Ramot University Aut For Appl
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1988-08-05
Publication date: 1995-03-01
Also published as: PT88208A; EP0302284A2; AU1916588A; ZA885190B; EP0302284B1; DK438088D0; IL83451A0; CA1306965C; DK170730B1; DK438088A; ES2034046T3; DE3875017T2; AU614295B2; IL83451A; ATE81152T1; DE3875017D1; US4904592A; JPS6467188A; EP0302284A3

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um dos problemas intrínsecos que frequentemente impede mai. or desenvolvimento de aplicações analíticas e sintéticas dos enzimas é a instabilidade inerente a muitos enzimas. Esta limitação ê crucial especialmente no caso de aplicações que envolvem a expo. sição prolongada dos enzimas a elevadas temperaturas ou à presen ça de solventes orgânicos (referências 1, 2 e 5)·

A perda das actividades enzimáticas pode resultar de dife rentes factores que impõe o seu efeito através de mecanismos dife. rentes, sendo o desenvolvimento estrutural do enzima o mais frequen te (referências 2 e 4).

A estabilização enzimática por meio de restrições impostas ao enzima, que limitam as suas grandes alterações de configuração foi tentada no passado através de uma das duas vias principais: ri. gidez da estrutura de proteína por ligação a pontos múltiplos, a suportes poliméricos insolúveis em água (referências 1, 2, 4 e 5), ou por meio de adição de diversas soluções (referências 6, 7, 8 e 9).

Diversas informações na literatura descrevem a ligação de polímeros solúveis em água a enzimas, visando a estabilização dos /

enzimas na forma solúvel ( para revisão consultar a referência 1). Assim, conjugados de polímero-enzima solúvel na ãgua, preparados por meio de ligação dos enzimas a polissacãridos (referências 1, 10, 11 e 12), álcool polivinílico (referência 13), polivinilpirro. lidona (referência 14) e ácido polimetacrílico (referência 4) têm sido descritos.

A estabilização eficaz de enzimas solúveis através desta via depende acentuadamente da obtenção de uma inter-acção intensa enzima-polímero multipontos, numa via complementar (referência 1 e 4). A eficácia destes conjugados enzima-polímero também depende, rá da natureza química do radical polimérico que cria um microambiente bidrofílico ou carregado na vizinhança do enzima. 0 conjugado mais eficaz deste tipo parece ser o conjugado de quimiotripsi. na—ácido polimetacrílico, preparado por copolimerização do ácido metacrílico e de enzima tratado com cloreto de acriloílo (referên cia 4). 0 derivado de enzima poli-aniónico resultante exibiu uma estabilidade comparável à estabilidade do enzima análogo envolvido por gel, preparado por copolimerização de metacrilamida ou acrila mida, com bisacrilamida e enzima tratado com cloreto de acriloílo.

Resumo da Presente Invenção

De acordo com esta invenção, proporciona-se um produto enzimático solúvel na água, biologicamente activo estabilizado, carac. terizado pelo facto de as moléculas enzimáticas possuírem uma estru. tura protectora de duas camadas que compreende um revestimento de base de poli-aldeído ligado a grupos amino livres do enzima e sobre esta uma camada polimêrica exterior reticulada, sendo os polímeros dessa referida camada exterior de uma espécie que no estado não li

gado abrange grupos amino livres e/ou grupos acil hidrazida.

A presente invenção também proporciona um método para a preparação de um produto enzimático activo biologicamente, estabi. lizado do tipo especificado, caracterizado pelo facto de, numa pri meira fase, o produto de enzima natural reagir em solução aquosa com um excesso de um poli-aldeído solúvel em água para produzir um produto enzimático intermédio em que as moléculas do enzima estão revestidas com a referida camada de base de poli-aldeído e por numa segunda fase o referido produto enzimático intermédio reagir em solução aquosa com um reagente polimêrico comportando grupos ami_ no livres e/ou grupos acil hidrazina livres.

A estrutura protectora de duas camadas preparada de acordo com esta invenção será ocasionalmente referida aqui por gaiola” (cage) e a soa produção por engaiolamento. Esta proporciona diver sas vantagens sobre a técnica anterior, tal como:

- o conceito de gaiola ê geral e permite também a estabili_ zação dos enzimas que suportam um pequeno número de resíduos lisi.

lo. Este facto é devido a que o polialdeído utilizado na primeira fase amplifica o número total de fontes de reticulação formadas e, consequentemente, como distinto da técnica anterior (referência 4) o grau de estabilização não dependerá apenas do conteúdo de grupos lisilo do enzima (referência 4).

- o método de engaiolamento é baseado na utilização de reagentes poliméricos solúveis em água e é portanto virtualmente isento de efeitos tóxicos e inibidores que ocorrem quando reagentes de peso molecular reduzido têm que ser utilizados tais como por exemplo, cloreto de acriloílo e acrilamida.

- 0 conceito de gaiola permite controlar o microambiente

- 6 do enzima engaiolado mediante modificação apropriada ou escolha da natureza química do reagente do polimêrico utilizado na forma ção da camada exterior. Por exemplo, pode introduzir-se hidrofobia ou hidrofilia no referido reagente polimêrico tal como requer a natureza da enzima ou o fim a que se destina.

- devido ao efeito associado de duas camadas de constitui, ção-da gaiola. A estabilização da enzima ê mais eficaz quando comparada com conjugados polímero-enzima com uma sê camada.

A natureza dos reagentes na primeira e segunda fases refe. ridas não ê crítica. Assim, na primeira fase pode utilizar-se qual, quer poli-aldeído solúvel em água susceptível de reagir com grupos amino livres formando parte de resíduos lisilo da enzima, sendo um exemplo típico o poliglutaraldeído. Do mesmo modo não ê crítica na escolha do reagente polimêrico solúvel em água a utilizar na segun. da fase desde que este comporte grupos amino e/ou acil hidrazida livres, uma vez que são estes grupos que fazem reticulação com gru. pos carbonilo do revestimento coro base de poli-aldeído.

Exemplos típicos de reagentes poliméricos utilizados na se. gunda fase são as poliacrilamidas, poliacrilamidas N-alquiladas, derivados de acil hidrazida ou de amina de poliacrilamidas, polivi nil-hidrazidas, polivinilaminas, polilisina, diversas proteínas e outros.

Se apropriado um produto enzimático estabilizado com as mo. lêculas da enzima engaioladas de acordo com a presente invenção pode ser depois estabilizada por meio de imobilização. Como a cama, da exterior da enzima estabilizada de acordo com a presente inven ção ê feita de poliacrilamida-amina ou derivados de acil hidrazida, a sua imobilização ê facilmente obtida quer por ligação química quer por reticulação. Este último método ê particuiarmente apropriado

- 7 - / uma vez que a solução de enzima estabilizada obtida no fim da se gunda fase contém um grande excesso de polímero não ligado que po. de ser utilizado para formar uma matriz mediante reticulação adequada.

A imobilização de enzimas por meio de matrizes de gel ê conhecida e foi utilizada com sucesso para a imobilização de enzi. mas em gel de poliacirlamida-hidrazida reticulada com glioxal (referência 21 e 25)·

Acredita-se que a estabilização de enzimas engaioladas” de acordo com a presente invenção resulta de uma associação de dois efeitos, por um lado ocorre a supressão física do processo de desen. volvimento pela gaiola polimérica reticulada construída em volta da enzima. Por outro lado ocorre uma supressão química das altera ções de configuração devido ao efeito de microambiente da fracção polimérica hidrofílica ligada.

Um período enzimático estabilizado de acordo com a presen te invenção pode ser armazenado em solução aquosa ou liofilizado sob a forma de um pé seco e guardado como tal. Descobriu-se surpre endentemente que, de acordo com esta invenção a liofilização do pro. duto enzimático engaiolado aumenta ainda mais a sua estabilidade. Além disso, a imobilização da enzima engaiolada liofilizada em glioxal reticulado com gel de poliacrilamida-hidrazi^a resulta numa ampliação máxima desta via de estabilização.

Os produtos enzimáticos estabilizados e eventualmente imo. bilizados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados numa variedade de processos químicos catalisados pelas enzimas rea lizados de uma sé vez ou continuamente.

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Descrição dos Desenhos

Para maior compreensão da presente invenção esta será ago. ra descrita através da referência aos desenhos anexados,em que:

- a figura 1, representa um diagrama de estabilização da estearase de fígado de porco mediante engaiolamento de acordo com a presente invenção expresso pela resistência a temperatura associada - efeitos de desnaturação de co-solvente por três solventes diferentes, em comparação com o comportamento da carboxilestearase natural sob condições semelhantes;

- a figura 2, representa um diagrama da estabilidade térmi. ca de estearase de fígado de porco engaiolada liofilizada envolvida num gel de poliacrilamida-hidrazida, de acordo com a presente invenção, em comparação com o comportamento da estearase de fígado de porco natural sob condições idênticas; e

- a figura 3, é uma representação esquemática da formação de uma gaiola protectora de duas camadas de acordo com a presente invenção.

Descrição da Invenção

Foi estudada a estabilização de enzimas engaioladas de acordo com esta invenção em solução aquosa e na presença de solven tes orgânicos miscíveis com a água. A estabilização para evitar a desnaturação por co-solventes orgânicos ê de grande vaZor prático porque estes co-solventes podem ser utilizados para o reforço do substrato e solubilidades do produto e a inversão das vias de reac_ ção naturais (referência 3 e 21). O efeito de estabilização foi avaliado através da determinação da constante da taxa de inactiva. ção (FIFA) para as enzimas naturais e engaioladas (liofilizadas)

-3-f ϊ / incubadas à temperatura de 55°C na presença de um co-solvente. Co-solventes que representam o grupo que exibe apenas uma interferência moderada com a retenção da estabilidade da enzima na sua presença (por exemplo, etileno glicol, dimetil sulfóxido, referên cia 21), assim como co-solventes que exibem o efeito de desnatura, ção forte (por exemplo, etanol) foram utilizados e a estabilização de acordo com a presente invenção verificou-se ser eficaz com sol_ ventes de ambos os grupos.

Na figura 1, os círculos não a cheio representam, uma car. boxilestearase engaiolada estabilizada de acordo com esta inven ção e os círculos negros a cheio representam a enzima natural, sen do claro que a taxa de inactivação da primeira é muito menor que a taxa de inactivação da última. Esta estabilidade reforçada contra a desnaturação pelo etileno glicol, dimetil sulfóxido e etanol, permite um aumento significativo do conteúdo do co-solvente presen te, sem prejudicar a actividade enzimática. Prrodutos enzimáticos estabilizados de acordo com esta invenção podem portanto ser utili_ zados com vantagem como catalisadores na realização das reacções em que são necessários dos co-solventes provenientes do exterior ou que se formam no decurso da reacção.

A figura dois indica que um produto enzimático imobilizado e engaiolado liofilizado de acordo com a presente invenção (círculos não a cheio) reteve a sua actividade para além de dezasseis dias, virtualmente sem qualquer alteração, enquanto que a da enzima natural (círculos a negro) decaiu bruscamente, no primeiro dia e a partir daí, essa actividade aproximou-se assimptoticamente do valor zero.

Nestes testes as enzimas forma incubadas à temperatura de 55°C em tampão 0,05 M Tris, pH 8, e as actividades verificadas periodicamente.

A figura 3, representa esquematicamente a formação de um engaiolamento de duas camadas de acordo com a presente invenção, Como se mostra, na primeira fase uma molécula de enzima reage com um polialdeído para proporcionar uma enzima com um revestimento ba se. Este produto em seguida reage com um polímero 2” solúvel na água e transportando grupos amino e/ou acil hidrazida, para formar uma enzima numa gaiola de duas camadas de acordo com a presente in venção.

A presente invenção será agora mais detalhada através da descrição dos exemplos seguintes que não sãò limitativos. Todas as indicações de temperatura são em graus centígrados.

EXEMPLO 1

Estabilização de glicose oxidase (E.C. 1.1.5-4) por engaio lamento de duas camadas.

1. Preparação de reagentes poliméricos :

a) glutardialdeído polimêrico solúvel em água:

Num frasco de fundo redondo de 100 ml, à temperatura cons_ tante de 50°C, adicionaram-se 20 ml de K^CO^ 1 M, pH 10, e em se. guida 20 ml de glutardialdeído a 25% (p/^v) (Merck, Cat M2 4259)· A reacção de polimerização ficou a processar-se durante duas horas à temperatura de 50° C. A mistura reaccional foi em seguida arrefecida para a temperatura ambiente e o pH corrigido para 7, median te a adição de ácido clorídrico concentrado e os precipitados reti /

rados por centrifugação a 7000 rotações por minuto durante 10 mi nutos. A solução restante foi em seguida adicionada com dez vezes o -seu volume de acetona para eliminar o carbonato de potássio e os sais por precipitação. A solução foi em seguida separada, a aceto na evaporada e a restante solução liofilizada e conservada à tem peratura de -20°C (rendimento: 3,3 g correspondente a 66%).

glutaraldeído polimêrico solúvel na água obtido deste mo do continha 0,35 milimoles de grupos aldeídicos por grama em peso seco, determinado de acordo com J.S. Tompson e G.D. Shockman, 1968 Analytical Biochemistry 22, 260 - 268 e os seus pesos moleculares avaliados, por filtração de gel (Biogel P-6) contra a padrões de proteína, em 1000.

b) Preparação de poliacrilamidas:

b-1) Poliacrilamida de peso molecular 8000:

Num frasco de fundo redondo de um litro, equipado com um agitador magnético, adicionaram-se 680 ml de água. A temperatura foi mantida a 4°C por meio de um banho de gelo e adicionaram-se 4 g (0,056 moles) de acrilamida monomêrica sob atmosfera de azoto. A seguir à total dissolução do monómero, adicionaram-se 4,6 ml (0,0y4 mole) de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametiletilenodiamina e em seguida imediatamen te 20 ml de persulfato de amónio 0,8777M (4g em 20 ml). A reacção de polimerização ficou a processar-se durante uma hora sob gelo e atmosfera de azoto.

A solução de polímero foi em seguida adicionada gota a gota a 3,5 litros de metanol arrefecido em gelo, 0 precipitado separado por filtração, conservado durante a noite à temperatura de

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4°C sob metanol, separado e seco num evaporador rotativo durante 30 minutos à temperatura de 40°C. 0 polímero foi finalmente seco sobre vácuo em θ polímero seco foi conservado num vaso fechado cuidadosamente à temperatura ambiente (rendimento 3,2 g cor respondente a 80%).

b-2) Derivado de alquilamina:

Num frasco de fundo redondo de 250 ml equipado com um agi tador magnético colocaram-se 100 ml de etileno glicol e ajustou-se a temperatura para 50°C em banho de óleo. Adicionou-se 1 g de poli, acrilamida e a dissolução ficou a processar-se a essa temperatura durante a noite. Em seguida subiu-se a temperatura para 100°C e adi. cionaram-se 13 ml (0,13 mole) de 1,4 diaminobutano. A reacção de aminélise processou-se à temperatura de 100°C durante três horas.

Em seguida a solução foi arrefecida com gelo e misturada com 100 ml de ácido clorídrico 2N arrefecido com gelo. 0 pH desta solução foi corrigido para 6,3 θ a solução foi dialisada quatro vezes con tra cinco litros de fosfato 0,02 M, pH 6,3\ fosfato 0,02 M, pH 6,3j fosfato 0,02 M pH 6,3 θ finalmente água.

polímero foi finalmente recolhido por liofilização (ren. dimento essencialmente quantitativo, conteúdo de amina 2 mil equivalentes por grama de polímero seco, conversão de 12,5 % determinada tiWímetricamente de acordo com J.F. Inman e H.M. Dintzis (1969) Biochemistry 8, 4074 - 4082) e conservado à temperatura de -20°C.

2. Engaiolamento de duas camadas de glicose oxidase

2-a) Num balão de 20 ml equipado com um agitador magnético e conservado à temperatura de 4°C, adicionaram-se 9,8 ml de uma solu.

/ ção de 10 mg/ml de guataraldeído polimêrico em fosfato 0,2 M, pH 8,2, e em seguida 0,2 ml de uma solução de glicose oxidase a 50 mg/ml em fosfato 0,2 M pH 6,0. A reacção de ligação ficou a pro cessar-se durante 3 horas à temperatura de 4°C. 0 polímero não ligado foi retirado por diálise (3 vezes contra tampão de fosfato 0,2 M, pH 8).

2-d) Num balão de 20 ml equipado com um agitador megnético e à temperatura de 4°C, adicionaram-se 16 ml de um derivado aminobutí lico de uma solução de poliacrilamida (0,25 mg/ml em fosfato 0,2 M, pH 8,0) e em seguida 4 ml de uma solução de glicose oxidada re vestida com poliglutaraldeído (obtido como descrito anteriormente). A reacção foi deixada a processar-se durante 3 horas à temperatura de 4°C e o pH corrigido para 6,0 mediante diálise contra fosfato 0,2 M,pH 6,0.

A enzima estabilizada foi conservada sob a forma de solução à temperatura de 4°C ou sob a forma de pê liofilizado.

3. Estabilização de glicose oxidase para inactivação térmica:

A estabilização de glicose oxidase para a desnaturação tér. mica foi demonstrada mediante a avaliação da velocidade de inactivação da enzima natural ou da enzima estabilizada a uma temperatura elevada fixada em 50°C. A constante de velocidade definida como:

NINA em que: E(T) = actividade enzimática determinada no tempo ”T

-,

Ε(0) = actividade enzimática determinada no tempo ”0 (para a de_s crição deste método ver a referência 24).

Os dados estão representados no Quadro 1.

Quadro 1: Efeito de engaiolamento de duas camadas na estabilidade térmica de glicose oxidase

Enzima ΚΙΝΑ. ΚΙΝΑ. rela. Actividade residual apés (h^_1,55°C) tiva (%) 5h a 55°C (%) nativa

(controlo)	0,19	100	43
tratado com po.
1 iglu tar ald eido	0,066	35	60
gaiola de
duas camadas	0,032	17	80

4. Estabilização de glicose oxidase para a inactivação re sultante na presença de co-solventes orgânicos.

A estabilização da glicose oxidase contra o efeito de des. naturação de solventes orgânicos miscíveis com a água foi demonstra da mediante a avaliação de velocidade de'inactivação (ΚΙΝΑ.) para a enzima natural e a enzima estabilizada a uma temperatura fixada em 50°C na presença de co-solvente 3,5 M (20 %). Os dados estão repre. sentados no Quadro 2·

Quadro 2ς Efeito de engaiolamento de duas camadas na tolerância da glicose oxidase para os solventes orgânicos.

	ΚΙΜΑ	(h¹, 55°C)
Co-solvente (todos a 3,5 M)	Enzima natural (a)	Enzima engaiolada (b)	Relativa (b/a,%)
nenhum	0,19	0,055	29
etilenoglicol	0,16	0,074	46
DMSO	0,019	0,075	40
DMF	0,40	0,22	55
etanol	1,020	0,40	39
formamida	1,74	0,50	29

EXEMPLO 2.

Estabilização de estearase de fígado de porco (E.C. 3,1,1,1) por engaiolamento de duas camadas.

1. Preparação dos reagentes poliméricos:

Prepararam-se poliglutaraldeído polimérico e poliacrilami.

da como se descreveu no Exemplo número 1.

Um derivado de acil hidrazida de poliacrilamida foi prepa.

rado do seguinte modo: num frasco de fundo redondo de 100 ml equipado com um agitador magnético foi mantido à temperatura de 50°C, verteram-se 38 ml de água e 1,5 g de poliacrilamida. Após a disso, lução completa adicionaram-se 12 ml (0,23 mole) de hidrato de hidrazina e a reacção de hidrazinálise processou-se durante 4 horas.

derivado de acil hidrazida obtido sete modo foi separado por pre.

cipitação induzida pela adição gota a gota da solução reaccional aquosa a 250 ml de metanol, recolheu-se por centrifugação, dissol. veu-se e. precipitou-se de novo como referido antes, conservou-se durante a noite à temperatura de 4°C sob metanol, separou-se e se cou-se num evaporador rotativo, 50 minutos à temperatura de 40°C, e finalmente secou-se sob o vácuo com pentóxido de fósforo. 0 polímero seco (conteúdo em acil hidrazida: 1,5 milimole/g determina, do de acordo com a referência 19, rendimento essencialmente quantitativo) foi conservado à temperatura de -20°C.

2. Engaiolamento de duas camadas de estearase de fígado de por co.

2-a) Num frasco de 50 ml equipado com um agitador magnético e mantido à temperatura de 4°C, adicionaram-se 19,7 ml de uma solução de poliglutaraldeído a 4 mg/ml em fosfato 0,05 M, pH 8,0 e em segui da 0,5 ml de uma solução de enzima a 11 mg/ml (Sigma Cat. IN E-5128). A reacção de ligação ficou a processar-se à temperatura de 4°C durante 5 horas e o excesso de poliglutaraldeído foi retirado por meio de diálise (três vezes contra fosfato 0,05 pH 8,0).

2-h) Num frasco de 100 ml equipado com agitador magnético e man tido à temperatura de 4°C, adicionaram-se 41 ml de derivado de acil hidrazida de poliacrilamida em fosfato 0,05^ pH 8 a 5 mg/ml e em seguida 19 ml de uma solução de encima de poliglutaraldeído (obtida como descrito antes). A reacção ficou a processar-se durante 5 horas à temperatura de 4°C e finalmente foi dializada contra tampão 0,05M Tris pH 8. A enzima estabilizada foi conservada sob a for. ma de solução à temperatura de 4°C ou sob a forca de pó liofilizado.

/ / Estabilização de estearase de fígado de porco para inactivação térmica.

- 17 A estabilização de estearase de fígado de porco para desna turação pelo calor foi demonstrada pela determinação de ΚΙΝΑ (h*”¹, 55°θ) como descrito no Exemplo 1. Os dados estão apresentados no Quadro 5.

Quadro 5· Efeito de engaiolamento de duas camadas na es.

tabilidade térmica da estearase de fígado de por co.

Enzima ΚΙΝΑ ΚΙΝΑ rela. Actividade residual apés (h^_1,55°C) tiva (%) 5 b a 55°C (%) natural 0,140 (controlo) tratada com po. liglutaraldeído 0,047 engaiolamento de duas camadas 0,052

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4. Estabilização de estearase de fígado de porco para a presença de solventes miscíveis com a água.

A estabilização para o efeito de desnaturação de co-solven tes miscíveis com a água presentes numa concentração de 5,5 M (aproximadamente 20 %) foi demonstrada de acordo com a descrição do exemplo 1. Os dados estão representados no Quadro 4 e são rela, tivos a preparações enzimáticas engaioladas e liofilizadas.

Quadro 4: Efeito de engaiolamento” de duas camadas na to. lerância da estearase de fígado de porco aos solventes orgânicos.

ΚΙΝΑ (h^-1, 55°C)

Co-dissolvente --------------------------

(todos a 3,5 M)	Enzima natural	Enzima-engaiolada (liofilizada)
nenhum	0,14	0,00
etilenoglicol	0,24	0,00
LMSO	0,24	0,01
propilenoglicol	0,50	0,00
etanol	2,95	0,093

EXEMPLO 3.

Estabilização de ^-Lactamase (E.C. 3,5,2,6) por engaiola, mento de duas camadas.

1. Preparação de reagentes poliméricos: o poliglutaraldeído foi preparado como descrito no Exemplo 1. A poliacrilamida com grupos acil hidrazida como substituintes parciais foi preparada coco des. crita no Exemplo 2.

2. As duas fases do processo foram realizadas essencialmente co mo descrito no Exemplo 2 para a estearase do fígado de porco.

3. A estabilização de β-Lactamase à desnaturação pelo calor me. diante engaiolamento de duas camadas de acordo com a presente in venção foi demonstrada pela avaliação de ΚΙΝΑ (h~ , 55°0) como de^. crito no Exemplo 1. Os dados estão representados no Quadro 5·

Quadro 5^: Efeito de engaiolamento” de duas camadas na estabilidade térmica de P?-Lactamase

-19 r /

ί

Enzima ΚΙΝΑ. ΚΙΝΑ, re- Actividade residual apés (h^_1, 55°C) lativa (%) 5 h a 55°C (%) nativa (controlo) 0,52 tratada com po. liglutaraldeído 0,10 bi-fase engaiolada 0,03

100

ENEMFLO 4

Estabilização de enzimas engaioladas por liofilização

A liofilização das enzimas engaioladas resultou numa melhoria bastante significativa da estabilidade da enzima. Este efei. to está em contraste com o efeito corrente de liofilização nos en zimas naturais; em muitos casos a sua estabilidade diminui, e em outros permanece inalterável.

efeito de liofilização na estabilidade de enzimas engaja oladas está representado no Quadro 8 para a estearase de fígado de porco e para Ô-Lactamase.

Quadro 6: Efeito de liofilização na estabilidade térmica de enzimas naturais e enzimas engaioladas

ΚΙΝΑ (h^-1, 55°C)

Enzima	antes da liofilização	apés liofi. lização
Estearase de fígado de porco natural	0,12	0,14
Estearase de fígado de porco engaiolada	0,032	0,00
/3-lactamase - nativa	0,52	2,59
β-lactamase - engaiolada	0,03	0,00

EXEMPLO 5

Imobilização e estabilização de enzima engaiolada liofilizada. Processo de imobilização.

Numa solução de 1,5 g de poliacril-hidrazida (peso molecular de 100 000) em 8,5 ml de água destilada adicionou-se com uma agitação cuidadosa 0,5 ml de tampão de fosfato 1 M, pH 8. A solu. ção tamponada de uma estearase de fígado de porco engaiolada liofilizada, preparada como no Exemplo 2 (150 mg em 1 ml de fosfa, to 0,05 M, pH 8, 30 UE) foi adicionada em seguida, agitada cuidado, samente mediante um agitador magnético e a solução obtida deste no. do injectada (injector exterior 2 ml) numa solução de glioxal a 1% arrefecida em gelo. As porções gelificadas obtidas deste modo foram deixadas a endurecer durante uma hora e em seguida divididas em fragmentos de 2 ml por meio da passagem através de uma seringa sob pressão (diâmetro exterior 2 mm). 0 gel foi em seguida incubado à

f' temperatura de A°C durante 20 horas e novamente fragmentado em partículas de cerca de 0,25 mm por meio de um homogeneizador de lâmina (Sorvai Omnimixer, 7000 rotações por minuto, 1 minuto).

As partículas de gel foram lavadas com 1 litro de tampão 0,05 M de Tris arrefecido com gelo (pH 8), fez-se de novo a sua suspensão em 50 ml do mesmo tampão e conservadas à temperatura de 4°C até à sua utilização.

A estabilidade térmica a 55°C desta preparação está repre sentada na figura 2.

Claims

Reivindicações

1.- Processo para a preparação de produtos enzimáticos biologicamente activos, estabilizados e solúveis na água em que as moléculas do enzima possuem uma estrutura protectora com duas camadas que comportam um revestimento de base polialdeídica liaada aos grupos amino livres do enzima e, reticulado com esta, um revestimento polimérico exterior, sendo os polímeros que constituem o citado revestimento exterior de um tipo que, no estado não-licaco compreendem grupos amino e/ou aci1-hidrazida livres, caracterizado pelo facto de se fazer reaqir, em uma primeira fase, um produto de enzima natural em solução aquosa com um excesso de um polialdeído solúvel na água para se obter um produto de enzima intermédio em aue as moléculas do enzima são revestidas com o referido revestimento de base polialdeídica e de, em uma segunda fase, se fazer, reagir o produto de enzima intermédio em solução acmosa com /

um reagente polimérico que comporta grupos amino e/ou acil-hidrazida livres.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se liofilizar o produto obtido na segunda fase referida .
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se imobilizar o produto de enzima por meio de uma matriz.
4. - Processo para a preparação de produtos de enzima imobili zados de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se submeter a uma reacção de reticulação a solução aquosa obtida no final da segunda fase referida na reivindicação 1, que contém o polímero que não reagiu.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se preparar o produto de enzima sob a forma de uma solução aquosa.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do se obter o produto dc enzina sob ura forne liofilizaca anidra.

Ί .!

V.

Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1, 3, 5 ou 6, caracterizado pelo facto de o referido revestimento de base ser constituído por poliglutaraldeído.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo facto de se obter o referido revestimento exterior a partir de um polímero escolhido no orupo constituído por poliacrilamidas, poliacrilamidas N-alquiladas e derivados de acil-hidrazida de poliacrilamidas.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 3, 5, 6, 7 e 8, caracterizado pelo facto de o enzima ser glicose-oxidase.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 3, 5, 6, 7, e 8, caracterizado pelo facto de o enzima ser estearase de fígado de porco.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 3, 5, 6, 7 e 8, caracterizado pelo facto de o enzima ser y?-lactamase,