PT88524B - Processo de preparacao de uma vacina para proteccao de aves contra infeccoes por mycoplasma e de preparacao de uma cultura pura do mesmo - Google Patents
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Description
presente invento refere-se ao processo de preparação de uma vacina para o combate da infecção provocada pelo Mycoplasma em aves de capoeira, caracterizado por compreender:
a) cultivar, durante um período de tempo adequado, células da estirpe Mycoplasma gallisepticum, possuindo as propriedades imunológieas da estirpe Intervet 6/85 num meio adequado, e
b) recolher as células.
A vacina não é virulenta para as galinhas e não é patogénica para os perús.
invento refere-se ainda ao processo de preparação de uma cultura microbiologicamente pura de Mycoplasma gallisepticum.
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-2MEMQRIA descritiva presente invento refere-se a um processo de preparação de uma vacina contra o micoplasma e a um processo para a protecção das aves de capoeira contra as infecções provocadas pelo Mycoplas. ma, pela administração dessa mesma vacina.
Mycoplasma e mais particularmente M. gallisepticum, é uma bactéria que ê infecciosa, em particular para as aves de cap£ eira. A infecçâo de aves comercialmente importantes com esta ba£ téria causa prejuízos económicos apreciáveis.
síndroma que o M. gallisepticum provoca ê usualmente denominado, no caso das galinhas doença respiratória crónica e no caso dos perús sinusite infecciosa. A infecçâo por _M· gallisepticum é também frequentemente acompanhada pela infecçâo devida a vírus respiratórios e devida a Escherichia coli.
As infecções por gallisepticum podem ser combatidas com certos antibióticos como eritromicina, estreptomicina, clorotetra ciclina, tilosina e magnamicina, os quais são geralmente misturados com a comida, mas as bactérias têm vindo a desenvolver resistências cada vez maiores a essas substâncias e consequentemente o seu combate esta-se a tornar cada vez mais difícil.
Desenvolveram-se vacinas para a protecção imunológica das aves de capoeira contra as infecções por M. gallisepticum.
Foram utilizadas bacterinas inactivadas de M. gallisepticum com resultados variáveis. Apesar de originarem uma boa resposta serológica, especialmente quando administradas em combinação com um adjuvante do tipo emulsão oleosa, estas vacinas parecem não proteger contra as infecções.
Num número limitado de estados dos EUA, especialmente nas denominadas multiple-age egg-laying farms (quintas de produção de ovos por galinhas poedeiras de diversas idades), a vacinação foi efectuada com M. gallisepticum vivo enfraquecido, da estirpe F. Esta estirpe ê administrada pelo método de aspersão (spray) e proporciona uma protecção razoável contra as inflamações dos sacos aéreos e reduz a quebra na produção de ovos para um nível aceitável.
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As desvantagens das vacinas inactivadas conhecidas são inu merâveis. Cada animal tem que ser injectado individualmente. A vacina é muito dispendiosa. Os animais não ficam protegidos contra a infecção, isto é, após a infecção podem permanecer portadores do Mycoplasma (virulento).
Mesmo as vacinas vivas existentes não estão isentas de pro blemas. Apesar de a estirpe F ser apenas ligeiramente virulenta para as galinhas, é extremamente patogênica para os perús. Adicionalmente, após a vacinação, as galinhas permanecem portadoras da estirpe da vacina a qual pode portanto continuar também a alas, trar-se durante um período prolongado.
Foi agora encontrada uma vacina contra o M. gallisepticum que não apresenta as desvantagens acima referidas.
A vacina contra o Mycoplasma de acordo com o presente invento caracteriza-se por ser derivada duma estirpe de M. gallisepticum qus possui as propriedades da estirpe Intervet 6/85.
A estirpe Intervet 6/85 é uma estirpe nova de M· gallisepticum - um mutante que foi obtido por uma série de passagens in vitro” da estirpe S6 conhecida (ATCC NS. 15302).
Esta nova estirpe, que foi depositada no Collection Nationale de Cultures de Microorganismes do Instituto Pasteur de Paris em 7 de Julho de 1987 sob o número 1-673, faz também parte do pre sente invento. As estirpes que possuem as mesmas propriedades imunológicas oaracterísticas da referida estirpe Intervet 6/85 constituem também parte do invento. Mais particularmente, as estirpes que, mantendo as propriedades imunológicas particularmente favoráveis, são derivadas da estirpe Intervet 6/85 fazem também parte do invento.
A estirpe Intervet 6/85 apresenta diversas vantagens impo£ tantes sobre as estirpes conhecidas de M. gallisepticum que a to_r nam extremamente adequada para aplicação em vacinas e que também a distinguem das estirpes de M. gallisepticum conhecidas:
a. não ê virulenta para as galinhas: não provoca quaisquer sintomas clínicos; não ocorrem virtualmente inflamações dos sacos aéreos;
b. não é virulenta para os perús;
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-4c. 4 semanas após a administração é ainda encontrada apenas num número desprezável de animais, enquanto a estirpe F continua a ser segregada durante um longo periodo de tempo por quase 100$ dos animais;
d. um modelo de endonuclease de restrição como apresentado na Figura 1.
A vacina de acordo com o invento é preferivelmente adminis, trada às aves de capoeira na forma de uma vacina viva, se bem que no entanto, possa ser administrada na forma de vacina inactivada.
A vacina contra o Mycoplasma pode ser administrada da maneira usual para as vacinas semelhantes, mas a presente vacina presta-se, em particular, para a administração na forma de aerosol. Os aerosóis muito finamente divididos da vacina podem ser preparados, por exemplo, por meio de um equipamento de produção de aerosóis Uineland.
A vacina contra o Mycoplasma de acordo com o invento pode ser comercializada, por exemplo, na forma liofilizada. A partir desta forma, pode preparar-se uma suspensão por adição de um liquido aquoso, por exemplo água da torneira. A vacina pode, claro, ser comercializada na forma de suspensão. Se desejado, em adição ao material Mycoplasma, podem encontrar-se presentes na v,a cina um ou mais estabilizantes (como leite desnatado ou hidrolis£ do de caseína) e/ou um ou mais antibióticos (tal como ampicilina ou polimixina).
A presente vacina ê adequada para combater as infecçães por Mycoplasma em aves de capoeira. Em particular ê adequada para combater as infecçães por Mycoplasma em galinhas e perús. A vacina deverá ser administrada no periodo da criação, preferivelmente a uma idade de 8-15 semanas como protecção contra uma queda na produção durante o periodo da postura. A vacinação deverá ser efectuada preferivelmente no periodo da criação porque:
a. uma leve reacção de inoculação que possa resultar da vacinação não tem efeito sobre a produção de ovos neste estágio;
b. a protecção deve ser adequada no instante em que os animais iniciam a postura;
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-5c. os animais deverão ser protegidos quando são transferidos da quinta de criação para a quinta de postura onde a infecção tem usualmente lugar.
Uma das características favoráveis da vacina de acordo com o invento é a sua muito baixa virulência para as galinhas.
Isto foi demonstrado em linhagens Leghorn branca, em que se compararam os efeitos da estirpe Interver 6/85, da estirpe R e da estirpe Γ. A estirpe R ê encarada como uma estirpe de M. gallisepticum muito virulenta. A estirpe F ê utilizada nos EUA como uma estirpe de vacina. Ambas as estirpes foram postas à disposição por S. Kleven da Universidade da Georgia. As estirpes R e F foram cultivadas no meio descrito por Frey e col. (M.C. Frey, R.P. Hanson e D.P. Anderson (1968) Amer. 0. Uet. Res. 29, 2164-71), er> quanto que a estirpe Intervet 6/85 foi cultivada num meio Adler modificado (H.E. Adler, R. Yamamoto e S. Bankoiuski, (1954) Amer.
3. Vet. Res. JL5, 463-5). As modificações do meio Adler consistiram na substituição do caldo Bacto PPLO por peptona protease e de soro de cavalo por soro de porco.
As galinhas utilizadas nestas experiências comparativas ti nham sido previamente avaliadas como seronegativas, tanto em rela ção a M. gallisepticum como a M. synoviae.
Aproximadamente uma semana antes das experiências colocaram -se 10 galinhas numa câmara de isolamento de pressão reduzida. Administrou-se micoplasma a estas galinhas pelo método de aerosol. Atomizaram-se 100 ml da cultura de Mycoplasma respectiva durante 10 minutos na câmara de isolamento, cuja exaustão de ar tinha sido cortada. A suspensão de Intervet 6/85 administrada continha ΐΟ^θ organismos viáveis por ml, enquanto que as suspensões das es.
tirpes F e R continham apenas 10 organismos viáveis por ml.
Efectuou-se um exame post-mortem 10 e 24 dias após a admi nistração de Mycoplasma - em ambos os casos com 5 galinhas. As galinhas foram examinadas em relação aos danos provocados nos sacos aéreos, à degeneração dos ovários e ao número de animais dos quais pode ser isolado o M. gallisepticum. 0s resultados foram reproduzidos como descrito no Exemplo 2 sob a, b e c respectivamente.
068
0Α/1352-428 y--;
-60g resultados encontram-se reproduzidos nas Tabelas abaixo:
Infecção de galinhas de 27 semanas de idade
| T ipo administrado | Dias após a adminis tração | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isola- mento ($) |
| Estirpe R | 10 | 3,0 | 3,0 | 100 |
| Intervet 6/85 | 10 | 0,6 | 0,2 | 40 |
| - | 0,0 | 0,0 | 0 | |
| Estirpe R | 24 | 1,0 | 0,6 | 100 |
| Intervet 6/85 | 24 | 0,0 | 0,2 | 40 |
| - | 0,0 | 0,0 | 0 |
Infecção de galinhas de 32 semanas de idade
| Tipo administrado | Dias após a adminis tração | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isola- mento (%) |
| Estirpe R | 10 | 3,2* | 2,5 | 100 |
| Intervet 6/85 | 10 | 0,3 | 0,8 | 17 |
| - | 0,0 | 0,0 | 0 |
k média de 6 galinhas
068
ΟΑ/1352-428 /η
-ΊInfecção de galinhas de 35 semanas de idade
| T ipo administrado | Dias apôs a adminis tração | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isola- mento w |
| Estirpe R | 10 | 2,8 | 2,6 | 100 |
| Intervet 6/85 | 10 | 0,2 | 1,4 | 20 |
| Estirpe F | 10 | 2,0 | 1,6 | 100 |
| - | 0,0 | 0,1 | 0 | |
| Estirpe R | 24 | 0,6 | 0,8 | 100 |
| Intervet 6/85 | 24 | 0,0 | 0,0 | 0 |
| Estirpe F | 24 | 0,6 0,0 | 0,4 0,0 | 80 0 |
Infecção de galinhas de 39 semanas de idade
| Tipo administrado | Dias após a adminis. tração | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isola- mento |
| Estirpe R | 10 | 2,2 | 2,4 | 100 |
| Intervet 6/85 | 10 | 0,0 | 0,8 | 0 |
| Estirpe F | 10 | 2,0 | 1,4 | 20 |
| (40 semanas de idade) | 0,0 | 0,4 | 0 |
Dos resultados acima torna-se evidente que a estirpe Intervet 6/85 provoca danos apreciavelmente menores nos sacos aéreos e nos ovários, que qualquer uma das estirpes R e F.
Adicionalmente, torna-se também evidente que a estirpe Intervet 6/85 já não se encontra presente, de forma detectável, nas galinhas infectadas após aproximadamente 4 semanas, enquanto que as estirpes R e F podem ds facto ser ainda detectáveis nessa altju ra.
Efectuaram-se experiências semelhantes com perús brancos de
068
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-./
-84 semanas de idade. Os resultados encontram-se reproduzidos na tabela abaixo.
| Tipo administrado | Dias após a administra- ção | Danos nos sacos aéreos | Re-isolameji to (/o) |
| Estirpe R | 10 | 3,2 | 100 |
| Intervet 6/85 | 10 | 0,2 | 100 |
| Estirpe F | 10 | 2,6 | 100 |
| *· | (5 1/2 semanas de idade) | 0,4 | 0 |
| Estirpe R | 28 | 3,75 | 100 |
| Intervet 6/85 | 28 | 0,5 | 0 |
| Estirpe F | 28 | 2,6 | 100 |
| — | (8 semanas de idade) | 0,2 | 0 |
E sabido que os perús são particularmente susceptíveis ao M. gallisepticum, mesmo a estirpes relativamente pouco virulentas como a estirpe F, a qual ê utilizada como estirpe de vacina no ca so das galinhas.
Os resultados acima demonstram, no entanto, que a nova estirpe Intervet 6/85 ê também muito pouco virulenta para os perús e não produz virtualmente nenhum prejuízo.
A estirpe Intervet 6/85 foi também investigada em relação à reversão à virulência. Para este fim, a estirpe foi passada 5 vezes através de galinhas, administrando-se de cada vez às novas galinhas o Mycoplasma re-isolado por meio de raspagem da traqueia Os resultados encontram-se reproduzidos na tabela abaixo. Não se verificou aumento na virulência após as cinco passagens.
068
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| Tipo | Passa | Dias após | Idade | Danos nos | Degenera | Re-isola |
| administrado | gem | a adminis | (sema | sacos aé- | ção dos | mento |
| Na. | tração | nas) | reos | ovários | (%) | |
| Intervet 6/85 | 2 | 10 | 29 | 0,75 | 1,2 | 66 |
| - | 29 | 0,25 | 0,0 | 0 | ||
| Intervet 6/85 | 3 | 10 | 35 | 0,0 | 1,0 | 20 |
| Intervet 6/85 | 0 | 10 | 35 | 0,2 | 1,4 | 20 |
| Estirpe R | 0 | 10 | 35 | 2,8 | 2,6 | 100 |
| 35 | 0,0 | 0,1 | 0 | |||
| Intervet 6/85 | 4 | 10 | 39 | 0,4 | 1,4 | 20 |
| Intervet 6/85 | 0 | 10 | 39 | 0,0 | 0,8 | 0 |
| Estirpe R | 0 | 10 | 39 | 2,2 | 2,4 | 100 |
| - | 39 | 0,0 | 0,4 | 0 | ||
| Intervet 6/85 | 5 | 10 | 41 | 0,4 | 1,4 | 20 |
| Estirpe R | 0 | 10 | 41 | 2,2 | 2,2 | 100 |
| - | 41 | 0,0 | 0,4 | 0 |
Exemplo 1
Preparação de uma vacina viva
Reconstituiu-se uma quantidade de aproximadamente 1 ml do germe da estirpe Intervet 6/85 de Mycoplasma gallisepticum em 10 ml de meio Adler modificado e realizou-se a incubação a 379C.
Quando já tinha ocorrido crescimento suficiente, o que foi estabelecido com base na mudança de cor de um indicador que tinha sido adicionado (vermelho de fenol), a suspensão foi inoculada num meio Adler recentemente modificado, numa proporção volumétrica de 1:20 e novamente incubada da forma descrita acima.
Este procedimento é repetida atê se obter um inóculo com tamanho suficiente para inocular o fermentador a ser utilizado (são necessários cerca de 5 1 de inóculo para um fermentador de 100 1).
Depois da inoculação do fermentador, a incubação é levada
06Β
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a cabo durante 24-30 horas a um pH de 7,5, a uma temperatura de 37SC com uma velocidade de agitação e arejamento constantes.
Em seguida as células são recolhidas por centrifugação e tomadas em leite desnatado (lO/Q ao qual se adicionou previamente ampicilina.
Depois de se guardar em frascos de vidro apropriados, a va cina é liofilizada e os frascos são então selados.
Exemplo 2
Experiência de vacinação com galinhas
Vacinaram-se dois grupos de 10 galinhas pelo método de aerosol com, respectivamente, a estirpe F e a estirpe Intervet 6/85 e colocaram-se em câmaras isoladas de pressão reduzida.
Duas semanas mais tarde, os dois grupos, e também um grupo de controlo não vacinado, foram infectados com a estirpe virulenta R e mortos 10 dias depois. Os danos nos sacos aéreos, a degeneração dos ovários e a quantidade relativa de M. gallisepticum presentes nos animais mortos foram determinados da maneira descri ta abaixo:
a) as graduações dos danos nos sacos aéreos foram classificadas como se segue:
= sacos aéreos limpos sem danos linfofoliculares;
= ligeira turbidez num ou em dois sacos aéreos ou danos lin fofoliculares num ou em dois sacos aéreos;
= como 1, mas neste caso em ambos os sacos aéreos ou turbidez intensa num ou em dois sacos aéreos ou secreção semelhante a queijo num ou dois sacos aéreos ou aparência espessa e esponjosa de um ou dois sacos aéreos;
= ambos os sacos aéreos intensamente turvos ou secreção semelhante a queijo ou com aparência espessa e esponjosa;
= uma combinação dos sintomas de 3.
b) 0 grau de degeneração dos ovários foi classificado como se se. gue:
= ovários activos sem degeneração;
068
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'.f, t>
C:
= degeneração de alguns follculos do ovário;
= degeneração de todos os follculos do ovário apresentando alguns hemorragias;
= degeneração de todos os follculos com hemorragias.
c) Efectuou-ss uma determinação do número de galinhas nas quais o Mycoplasma gallisepticum podia ser re-isolado. 0 resultado foi expresso numa percentagem do número total de galinhas nos grupos respectivos.
Ds resultados das experiências descritas acima, após a vacinação de galinhas de várias idades, são descritos abaixo.
I» Vacinação de galinhas de 27 semanas de idade
| Grupo | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isolamen to* W |
| Vacinação com Intervet 6/85 mais infecção com estirpe R | 1,0 | 0,5 | 80 |
| Ausência de va cinação mas iri fecção com estirpe R | 3,0 | 2,8 | 100 |
| Vacinação com Intervet 6/85 sem infecção com estirpe R | 0,0 | 0,2 | 40 |
| Ausência de va cinação e de infecção com estirpe R | 0,0 | 0,0 | 0 |
* Não se faz distinção entre as estirpes R e Intervet 6/85
068
ΟΑ/1358-428
-/7
77^:
-12II. Vacinação de galinhas de 35 semanas de idade
| Grupo | Danos nos sacos aéreos | Degeneração dos ovários | Re-isolameji to * |
| Vacinação com Intervet 6/85 mais infecção com estirpe R | 1,2 | 2,0 | 100 |
| Vacinação com estirpe F e infecção com estirpe R | 1,0 | 1,0 | 100 |
| Ausência de vacinação mas infecção com estirpe R | 2,4 | 2,6 | 100 |
| Vacinação com Intervet 6/85 sem infecção | 0,0 | 0,0 | 0 |
| Vacinação com estirpe F sem infecção | 0,6 | 0,4 | 80 |
| Ausência de vacinação e de infecção | 0,0 | 0,0 | 0 |
x Não é feita distinção entre as estirpes R, F e Intervet 6/85
068
0Α/1352-428 λ
-13III. Vacinação de galinhas de 39 semanas de idade
| Grupo | Danos nos sacos aê- Γ SOS | Degeneração dos ovários | Re-isolamen to * ($) |
| Vacinação com Internet 6/85 mais infecção com estirpe R | 0,0 | 1,0 | 100 |
| Vacinação com estirpe F e infecção com estirpe R | 1,4 | 1,4 | 80 |
| Ausência de vacinação e infecção com estirpe R | 2,2 | 2,2 | 100 |
| Ausência de vacinação e de infecção | 0,0 | 0,4 | 0 |
x Não se faz distinção entre as estirpes R, F e Intervet 6/85.
Destas experiências pode concluir-se que a estirpe Internet 6/85 proporciona uma protecção contra danos nos sacos aéreos e contra a degeneração dos ovários como consequência de uma infecção grave, protecção essa que ê comparável com a obtida com a estirpe F.
Claims (10)
- REIVINDICAÇ0ES1 - Processo de preparação de uma vacina para o combate da infecção provocada pelo micoplasma em aves de capoeira, caracteri. zado por compreender:a) cultivar, durante um período de tempo adequado, células da estirpe Mycoplasma gallisepticum, possuindo as propriedades imunolégicas da estirpe Intervet 6/85 num meio adequado, eb) recolher as células.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se adicionar, subsequentemente um ou mais estabilizantes, tais como leite evaporado ou hidrolisado de caseína.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte rizado por também se adicionar um ou mais antibióticos.
- 4 - Processo de acordo com as reivindicaçSes 1-3, caracterizado por o material resultante ser liofilizado.
- 5 - Processo de acordo com as reivindicaçSes 1-4, caracterizado por o Mycoplasma gallisepticum vivo cultivado possuir as propriedades imunolégicas da estirpe Intervet 6/85.
- 6 - Processo de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizado por se cultivar a estirpe Intervet 6/85.
- 7 - Estirpe de Mycoplasma gallisepticum, caracterizado por possuir as propriedades imunolégicas da estirpe Intervet 6/85.
- 8 - Estirpe Intervet 6/85 de Mycoplasma gallisepticum.
- 9 - Processo de preparação de uma cultura microbiologicamente pura de Mycoplasma gallisepticum, caracterizado por se cultivar uma estirpe de Mycoplasma gallisepticum a qual tem as propriedades imunolégicas da estirpe Intervet 6/85.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizai do por a estirpe cultivada ser a estirpe Intervet 6/85.
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Effective date: 19920505 |
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