PT88532B

PT88532B - Processo para a preparacao de analogos do factor de libertacao da hormona do crescimento (grf)

Info

Publication number: PT88532B
Application number: PT88532A
Authority: PT
Inventors: Arthur Martin Felix; Edgar Philip Heimer
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1992-11-30
Also published as: NZ226178A; JPH01129000A; AU609878B2; PH25715A; CN1032014A; ATE106895T1; DE3850015T2; IE64494B1; EP0307860A2; EP0307860B1; PT88532A; ZA886860B; JP2715472B2; DE3850015D1; EP0307860A3; DK519088D0; IE882835L; ES2054754T3; DK519088A; AU2234688A

Description

Considera-se que o crescimento dos animais é regulado por uma cascata de moléculas bio-reguladoras. O hipotálamo pro duz usa substância chamada factor de libertação da Hormona de Crescimento que por seu turno actua. na pituitária para originar ° libertação de hormona de crescimento. A pituitária mantém-se sob ccntrôlo de retorne negativo por somatostativa e factor de crescimento de insulina (IGF). Verificou-se que o GRF era ex tremamente activo, e susceptível de estimular a libertação de níveis de micrograma por mililitro de hormona de crescimento no sangue. C GRF pode utilizar-se terapeuticamente em muitas das éreas agora consideradas como candidatos à aplicação de hormona de crescimento, por exemplo no tratamento de nanismo pituitário e diabetes resultantes de produção anormal de hormona de crescimento, melhoria da cicatrização de feridas, tratamento de queimaduras, ou retardamento do processo de envelhecimento.

sucesso do isolamento de GRF deveu-se parcxaâmente à descoberta de que tumores pancreáticos associados com acromegá lia produziam ectopicamanie grandes quantidades de GRF . Isolaram-se tres formas do GRF com sequência de aminoâcido homologa mas com diferentes comprimentos (44, 4o, e 37 aminoácidos).

A forna amidada de GRF com 44 aminoácidos é considera do a molécula de origem. Produziu-se uma vasta variedade de análogos sintéticos. Os quais consistem em popipeptidos que

possuem uma sequência- de aminoácidos equivalente a uma do GRF isolado ou de fragmentos biologicamente activos ou seus análogos com várias substituições de aminoácidos□ Às variações foram especificamente planeadas para, muitas vezes, proporcionarem análogos sintáticos com propriedades biológicas superiores às da molécula de origem. Assim, deseja-se fabricar SRP ana logos que apresentem, por exemplo, actividade biológica máxima em termos de potência, eficácia, e estabilidade.

Até ã data, todos os análogos de GRF conhecidos são de configuração linear. Regra geral, os péptidos lineares são moléculas muito flexíveis e nâo têm uma conformação bem definida. Nun péptído linear cada aminoácido expõe-se ao meio circulante originando uma maior susceptibilidade à degradação enzima tica e química.

^rJm péptído cíclico (lactama) é un péptido em que o terminal da cadeia lateral carboxi de um aminoácido ácido (por exem plc Asp ou Glu) se liga ao terminal da cadeia lateral amino de um aminoácido básico (por exemplo Lis) por intermédio da geração de uma ligação amída.

As propriedades biológicas de péptidos cíclicos estão muitas vezes alteradas relativamente aos seus análogos lineares. Os péptidos cíclicos são muito mais rígidos, com formas bem definidas e com resíduos ds aminoácidos interiores que estão prote gidos do meio circundante. Estas variações reflectem-se nas pr© priedades biológicas do péptido. A duração da acção dos pépti dos cíclicos é maior uma vez que a estrutura compacta os torna menos susceptíveis à degradação química e enzimática. A bio-dis ponlbilidade dos péptidos cíclicos aumenta devido ã variação na distribuição do tecídc originada pelos resíduos de aminoácidos lute res protegidos* Além disso, a conformação bem definida do pág tido cíclico proporciona-lhe maior especificidade para o recej} tor alvo reduzindo assim a probabilidade de efeitos biológicos indesejáveis. No caso de péptidos lineares, por exemplo, há geralmente reactividade cruzada para um dado péptido linear com receptores centrais e periféricos e há ainda reactividade cruzada considerável de um dado péptido com receptores para outro pén tido.

A presente invenção refere-se a análogos lineares e cíclicos de GRF com a sequência de aminoácidos específicos aqui indicada, incluindo os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

A presente invenção refere-se também a um método para estimular a libertação de hormona de crescimento num indivíduo, por administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz dos com postos desta invenção*

Os símbolos e terminologia seguintes, quando utilizados nesta memória descritiva são definidos como segue:

1. Péptido cíclico - ou lactama significa um péptido^^otaminaLcte csdeiaHabetsl carboxi de um aminoacido ácido (por exemplo Asp ou Glu) se liga ao terminal da csdsia lateral amino de um aminoácido básico (por exemplo, Lis) por intermédio de uma ligação amida (lactama).

Β cu ciclo

8,12

Significa que o oitavo aminoácido A” na ca dela peptídica se liga ao décimo segundo aminoácido ”B na cadeia para proporcionar uma estrutura lactâmica cíclica.

3. GRF Significa factor de libertação de hormona de crescimento humana que é um polipeptídico a sequência de aminoácidos:

io

Tyr-Ala-asp-Ala-Ile-Phe- Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lysl5 20

-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-A la-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn25 30 35

-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asp-Gln40

- G lu-Arg- Gly-A la-Ar g-A la-Arg- Leu-NH₂

4. /' Leu²7.^7 GRF Significa ura polipéptido que possui uma sesequência de aminoácidos correspondente a GRF em que um resíduo metionina na posição 27 foi substi tuído por um resíduo leucina. Estes análogos de GRF geralmente indicam-se, colocando o aminoácido substituído dentro de parêntesis reetos ante de

GRF.

'-η.

. GRF (1-29) Significa um fragmento do péptido GRF que possuí os primeiros 29 aminoácidos da sequência completa. Regra geral, os números entre parêntesis a seguir a GRF correspondem às posições de amino-

ácidos da sequência original de GRF indicando a extremidade N e a extremidade C d© fragmento*

6.	1 des NH₀Tir Significa que o grupo terminal NH_O de amino removido do resíduo de Tirosina na posição 1.
7·	CcHeX	Significa ciclohexilo.
δ.	PISA	Significa di-ísopr©pi1- e t iíamina
8·	ΕΤΞ	Significa ditio-etano.

A figura 1 ilustra a eficácia dos compostos desta invenção na libertação de hormona de crescimento a partir de células de pituitária de ratos. Impregnaram-se duas glândulas de pituitária (pits”) (diluições 1;4) em cada filtro do filtro de ensaio, ensaio que mede a actividade biológica em geral.

Utilizaram-se as seguintes abreviaturas^especicass rGH significa hormona de crescimento recornbinante_s £Al5 ciB cio S-127URF-(l-29)-Nn_2? Significa cíclo^8?12Z Asp⁸sAla^_/-GRF(l-29)-NH₂, ’'ciclo(8“12)Z&iALeeAtó7SRF( l-29)-NH₂ significa

Cicio⁸>¹²/'D-Ala²,Asp⁸,Ala¹^7-GRF(l-29)“NH₂, Ciclo (8-12) /'DesNH2Tir l D-a2 nl?7( 1-29)“W significa Ciclo⁸’¹²7fssNH2Tir¹,D-Ala²,Asp⁸,Ala¹^7“GRF(l”295=NH2 e Ciclo (3«=12) 7 desRH2Tirinl^y(1-29) -NH₂ significa Ciclo^{8 512}7 desNH^Tir¹, Asp⁸ ,A!si¹^ 7~GRF( 1-29) -NHg.

A presente invenção inclui péptidos da fórmula:

R -R_o-Asu-Ala-Ile-Phe-Thr-A-=Ser-Tyr«*Arg-B-Val-Leu

- ‘ ' 1_L

-R~-Gln-Lsu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile em que

R_L representa Tir, desNH^-Tir, Áe-Tir, His, N-Metil-L-Tir

R₉ representa Ala, D-Àla, N-Metil-D-Ála

R^ representa Gly, Ala, Leu, Vai, Ile, Nle, NVal, β-Ala,

ÍZ -2iib

Rj* representa Met, Leu, Hle, II®

R^ representa Ser, Asn

R^ representa vaia sequência de aminoácidos seleccionada

J do grupo constituído por$ Arg-Gln-Gln-Gly-Glu.-S‘er-Asn-GLn-0 Árg-Glí-Ala-Arg-Ála-Àrg-Leu ou seus fragmentos em. que o fragmente é reduzido em número de 1 a 1$ aminoácidos do terminal carboxílo,

X representa o radical GH, NH₂, MR?) (R^) em que R? e

R_r. representam o átomo de hidrogénio ou um grupo alqui

O lc inferior;

A representa Asp, Glu, ácido ^-amino-adípico, ácido «sL-araino-pimélico;

representa Lis, Grn, ácido diamino-propiónico, ácids di araino-butírieo em que o terminal da cadeia lateral carboxi de A se liga por intermédio de uma ligação amida ao terminal de cadeia lateral amino de . Β , e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Cs péptidos preferenciais são os de fórmula 1 em que R^ representa Tir, desNE^-Tir, N-metil-L-Tir; E₂ representa Ala D-Ala; R^ representa Ala; e A representa

Avio preferido é um péptido de acordo com a fórmula gerei I como referida antes;em que A representa Asp; B representa Lis Ce 0 terminal da cadeia lateral carboxi de Asp liga-se por covaiência ao terminal da cadeia lateral amino de Lis por intermédio de uma ligação amida); R^ representa Met; R^ representa Ser s representa Arg₀

Parti cu lamente preferido é um péptido em que R^ representa Tir, R₉ representa Ala e R^ representa Ala com a fórmula Tyr-A la-A sp-A la-1 le-Phe-Thr-A sp- S er-Ty r-Arg-Ly s-V al-Let-A la- Gin

L_1

Leu- S er-Ã Is-Arg-Ly s-Leu- Leu- G in-A sp-1 le-M et- S er- Ar g-NH,,.

Também particularmente preferido é um péptido em que R_nrepresenta B’nla com a fórmula

Tyr-£~Ála-Àsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala

I_I

GIn- Leu-Ser-ula-Arg- Lys-Leu- Leu- GIn-Asp-Tle=M®t- Ser-Arg-HH .

Também são preferidos os péptidos de acordo com a Fórmula geral I em que R^ representa desNH^Tir·, particularmente preferido um péptido em que R^ repre senta Ais, tendo 0 referido péptido a fórmula desRE_o-Tyr-Als-Asp-Aia-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val ² I_J

Leu-Ala-Gin-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-SerArg-MH₂.

Também é psrticularmente preferido um péptido em que R₂ representa L-&la com a fórmula.

â d osNH_n-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-1le-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysI_1

Ngi-Leu-Àla-Gln-Ieu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Mefc-SerArg-NIí₂.

A presente invenção inclui também análogos lineares dos péptidos cíclicos especificamente referidos antes.

Os péptidos podem sintetizar-se por métodos adequados tais como síntese de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, síntese de condensação de fragmentos ou síntese de solução clássica. Podem também utilizar-se técnicas de recombi nação de DNA para análogos contendo apenas resíduos de aminoácidos naturais. Os péptidos desta invenção preparam-se de preferência por síntese peptídica. de fase sólida como descrito por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 21^9 ¢1963)0 A síntese executa-se com aminoáoidos protegidos no terminal Alfa-aminíco. Os aminoácidos trifuncionais com cadeias laterais instáveis são também protegidos com grupos adequados que evitam que ocorra uma reacção química naquele sítio durante a união do péptido.

grupo de protecção alfa-amínico é selectivaments removido para evitar que reacções de ligação subsequentes ocorram na extremidade amina. As condições para a remoção do grupo de protec ção alfa-amínieo não originam a desprotecção dos grupos de protecção da cadeia lateral.

Gs grupos de protecção alfa-amina são os conhecidos na especialidade de síntese d® fases de péptidos, incluindo grupos semelhantes a grupos de protecção tipo acilo (por exemplo, formilo, trifluoro-acetilo, acetilo), grupos de protecção tipo ure tano aromático (por exemplo, bensíloxi-carbonilo (cbz) e benzi loxi- carbonilo substituído), grupos de protecção uretano ali2

fátíco (por exemplo, t-butiloxi-carbonilo (Boc), isopropiloxk-c*rfconilo, ciclobexiloxí-carbonilo) e grupos de protecção tipo alquilo (por exemplo benzilo, trifenil-metilo)« 0 grupo de protecção preferido é o grupo Boc. Os grupos de protecção da cadeia lateral para Tir incluem tetrabidropiranilo, terc.-butilo, tritilo, benzilo, cbz, 4-Br-cbz e 2,6-diclorobenzilo. 0 grupo de protecção preferido da cadeia lateral para Tir á 2,6-diclorobenzilo. Os grupos de protecção da cadeia lateral para Asp incluem benzilo, 2,6-díclorobenzilo, metilo, etilo e ciclobexilo.

C grupo de protecção de cadeia lateral preferido para Asp é o gruoo ciclobexilo. Os grupos de protecção da cadeia lateral pa ra Tr e Ser incluem acetilo, benzoilo, tritilo, tetrabidropiranilo, benzilo, 2,6-díclorobenzilo e cbz. 0 grupo de protecção preferencial para tr e Ser é o grupo benzilo. Os grupos de protecção de cadeia lateral para Arg incluem nitro, tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxi-carbonilo ou Boc» 0 grupo de protecção preferencial para Arg é Tos. 0 grupo da cadeia lateral ami no de Lis pode ser protegido com Cbz, 2-Cl-Gbz, Tos ou Boc. 0 2-Cl-Cbz é o grupo de protecção preferido para Lis. A selecção dos grupos de protecção da cadeia lateral baseia-se no seguinte: C grupo de protecção da cadeia lateral permanece intacto durante a ligação e não se divide durante a desprotecçao do grupo de protecção terminal de amino ou durante as condições de ligação. 0 grupo de protecção da cadeia lateral deve ser removível, depois ds se completar a síntese do péptido final, por con dições de reacção que não alterem o referido péptido.

x síntese de fase sólida executa-se, normalmente, a partir da extremidade carbonilo do péptido a sintetizar por ligação do aminoácido alfa-amino protegida (cadeia lateral prote gida) a um suporte sólido adequado. Forma-se uma ligação éster quando a ligação se faz a uma resina clorometilada ou a hidroximetilada s o péptido alvo resultante tem um grupo carboxilo livre no C-terminal. Àlternatlvamente, utiliza-se uma resina de benzidrilamina ou de p-metil-benzidrilamina quando se forma uma ligação amida e o péptido alvo resultante tem um grupo carboxamida no C-terminal. Estas resinas estão comercializa das e a sua preparação é descrita por Stevart et al., Soli Phase Peptid Synthesis (2^â Edição, Pierre Chemical Co., Rockford, IL., 198¼).

No caso do aminoácídô de G-termínal ser Arg (protegido na cadeia lateral com Tos e na função alfa-amina com Boc) o referido aminoácido pode ligar-se ã resina de benzidrilamina utilizando vários agentes de activação incluindo dlciclohexilcarbodiímida (PCC), Ν,Ν’-diisopropil-carbodiimida ou carbonildiimi dazol. A seguir h ligação ao suporte de resina o grupo de protecção alfa-amina é removido utilizando-se ácido trifluoroacético (IFA) ou HC1 eia dioxano a uma temperatura entre 0° e 25°. Adiciona-se dimetilsulfito ao TFA depois da introdução de meticnina (Met) para suprimir uma possível alquilação-S. Depois da remoção do grupo de protecção alfa-amina os aminoáeidos protegi dos remanescentes ligam-se passo a passo na ordem necessária pa ra obter a sequSncia peptídica desejada» Podem utilizar-se vários agentes de activação para as reacções de ligação incluindo DCC , Ν,Ν’-diisopropilcarbodiiiaida, hexafluorofosfato de benzctríazol-l-il-oxi)-/ tris( dimetilamino)_7 fosfónio (BOP) e PCC-hidroxíbenzotriazol (HOBt). Cada aminoácido protegido é utilizado em excesso ( > 2,5 equivalentes) e as ligações executam-se, normalmente, em dimetilformamida (DMF) CH^Cl^ ou suas misturas, k extensão da reacção de ligação é controlada em cada fase pela reacção de ninidrina como descrito por Kaiser et al., Anal Biochem., A9 _? 595 (19?C)» Nos casos de ligação incompleta repete-se ?. referida reacção de ligação. As reacções da ligação podem efectuar-se automaticamente, por exemplo em sintetizadores como o Vega 250, síntetísadores de Bio-sistemas Aplicados ou outros instrumentos já comercializados.

protocolo para um ciclo de síntese típico na síntese dos páptidos desta invenção apresenta-se na Tabela 1.

‘Ta12

Tabela 1

Protocolo para um Ciclo de Síntese Típico

0'·' ' ;·	Reagente	Tempo
1	1 DWCH₂G1₂	1 x l min
2	5o $ TFA/CH₂C1₂ * 1 % BMS (v/v)	l x l min
J	1 % IWOH₂O1₂	1 x l min
t	50 $ TFA/CH_OC1_O * DMS (v/v)	1 x 20 mio
5	ch₂oi₂	3 >< 1 min^b
6	10 % DIEá/CH₂G1₂	1x5 min
7	ch₂ci₂	2xi min
8	Repetir Passos 6_S 7
G y	MeOH	2X1 min
10	ch_sci₂	3 x 1 min
11a	2,5 eq. Boc-AA-C00H/GH₂Cl₂	5 min^c
b	2,5 eq. BCC/CH₂Cl₂	6q min
c	i,5 biea/gh₂gi₀	15 min
12	Repetir Passos 10, ll
13	^CII2^C12	2xi min
lU	MeOH	ixi min
i5	CH₂C1₂	ixi min^b

a Os solventes para todas as lavagens e ligações mediram-se os volumes ds 15-20 ml/g de resina b Ensaio nínidrina Kaiser c rWCE_?Cl_o para Boc-Àrg(Tos)-0H.

Depois de se sintetizar o conjunto completo do peptido, o péptido-resins reage primeiro com TFA-ditioetano e depois com um reagente tal como HF líquido durante 1 a 2 horas a 0° o que separa c péptido da resina e remove todos os grupos de protecção da cadeia lateral.

A ciclização, cadeia lateral a cadela lateral, no supor te sólido necessita da utilização de um esquema de protecção or togonal susceptível de separação selectiva das funções de cadeia lateral do aminoácidos acídicos (por exemplo Àsp) e dos amlnoáçi dos básicos (por exemplo Lis). G grupo de protecção 9-fluoronil metilo (CFra) para a cadeia lateral de Âsp e o grupo de protecção 9-fluoronilmetoxi-carbonilo (Fmoc) podem utilizar-se para este objectivo. lestes casos, os grupos ds protecçãode cadela lateral (oFm e Fmoc) do péptido-rssina Boc-protegido são selectlvamente removidos com piperidina em DMF» Consegue-se a ciclização num suporte sólido utilizando vários agentes de activação incluindo ?0C, DCG/HGBt ou BCP. A reacção HF executa-se no péptido-resina ciclizado como descrito antes»

A purificação dos popipéptidos desta invenção pode efeç t.uar-ss utilizando-se procedimentos bem conhecidos na química dos péptidos. Gs popipétidos da presente Invenção podem purifi car-ee utilizando-se (HPLC) preparativa^ contudo, podem também utilizar-se outros procedimentos cromatográficos tais como cromatografia de impregnação de gel, de permuta iónica e de partilha ou de distribuição em contra-corrente»

A presente invenção incluí também um método de etimulação da libertação de hormona de crescimento num indivíduo por administração ao referido indivíduo de uraa quantidade eficaz de réptidos de acordo cos a fórmula geral I.

Os popipéptidos desta invenção têm actividade de liberta ção de hormona de crescimento. As composições farmacêuticas de de *cerdo com esta invenção incluem análogos com cerca de 29 a 4·+ aminoácidos em comprimento, ou ura sal não tóxico de qualquer destes, disperso num veículo sólido ou líquido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou veterinário. Tais composições farmacêuticas podem utilizar-se para fins terapêuticos ou de diagnósticos en medicina humana e veterinária. São adequadas, por exemplo, no tratamento de distúribos relacionados com o ores cimento tais como nanísmo pituitário e diabetes,resultantes de produção anormal de hormona de crescimento. Além disso, podem também utilisar-so para estimular o crescimento ou aumento da eficiência de alimentação de animais criados para produção de carne, para aumentar a produção de leite e estimular a produção evo 0.

às dosagens apropriadas dos polipeptidos desta invenção a administrar dependem do indivíduo e mais especiflcamente do grau de insuficiência de produção de hormona de crescimento' e da condição do tratamento. Um especialista é capaz de determinar as dosagens adequadas com base nos níveis conhecidos de circulação de hormona de crescimento associados com o crescimento normal e com a actividade de libertação da hormona d® crescimento dos po lipeptides desta invenção. Mais especiflcamente, pode utilizar -se uma dosagem que varia de 0,c4 jbg/kg/dia a cerca de 20,õ^bg/ /kg/dia com base no pêso do corpo do indivíduo, para estimular a libertação de hormona de crescimento. Âs dosagens utilizadas para estimular a actividade decrescimento nos animais são signi fícativamente mais elevadas (por kg de péso de indivíduo) do que as dosagens utilizadas para restabelecer o crescimento nor15

mal no caso de deficiências da hormona de crescimento tais como nanismo pituitário nos seres humanos. Nos animais, regra geral, pode utilizar-se subcutâneamente uma dosagem que varia entre 0,4 yug/kg/dla e cerca de 100 j&g/kg/dia, para estimular a libertação da pituitária da hormona de crescimento.

Assim, proporciona-se de acordo com esta invenção um mé todc de tratamento de distúrbios relacionados com o crescimento, caracterizados pela produção insuficiente de hormona de crescimento, que consiste na administração de uma quantidade dos análogos desta invenção suficiente para estimular a produção de hor mcna de crescimento a níveis associados com o crescimento normal.

Os níveis normais de hormona de crescimento variam consi deravslmente entre os indivíduos e, para um dado indivíduo, os níveis da circulação da hormona de crescimento variam considera velmente durante o dia. Nos seres humanos adultos, os níveis normais nc soro da hormona de crescimento têm sido referidos co mo variando de cerca d® 0 a 10 nanogramas/ml. Nas crianças, tem sido referido que os níveis normais no soro da hormona de crescimento variam de cerca de 0 a 20 nanogramas/ml.

Para que o tratamento do nanismo hipopituitário com os análogos descritos seja eficaz, faz-se o tratamento durante o pe ríodo de crescimento normal. Nas fêmeas, este período geralmente não se estende para além do início do fluxo menstrual. Assim, o tratamento das fêmeas deve efectuar-se aproximadamente na idade de 12 a l6 anos, dependendo do índivíuo. Nos machos, a estimulação do crescimento pode ser possível durante um período consideravelmente mais longo, para além da puberdade. Assim, o tra tamento eficaz dos machos é normalmente possível até cerca dos

a 19 anos de idade e, em alguns casos individuais, até cerca dos 25 anos.

Proporciona-se também um método de aumento da velocidade de crescimento de animais por administração de uma quantidade de análogo suficiente para estimular a produção da hormona de crescimento até um nível superior ao associado com o crescimento nor mal.

Cs poliuéptidos desta invenção podem administrar-se sob

o. forma de composições farmacêuticas para seres humanos ou veterinários que se podem preparar pelas técnicas convencionais de formulação farmacêutica. Podem utilizar-se composições adequadas para administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou intradérmicao Uma forma de dosagem adequada para utilização farmacêutica contém de cerca de C,Gl a cerca de 0,5 mg do composto desta invenção, o qi,.al se pode liofilizar para reconstituição com água estéril ou solução de cloreto de sédio. A composição deve manter-se a um pH inferior a cerca de 5?0 a fim de assegurar a estabilidade do análogo. A albumina do soro das espécies a tratar (por exemplo albumina do soro humano no caso dos seres humanos, a albumina do soro de bovino no caso de vacas e outros) pode também estar presente em conjunto com outros adjuvantes farmacêuticos conhecidos.

A presente invenção é descrita em ligação com os exemrlos seguintes que são apresentados apenas com objectivos de ilus tração.

Exemplo 1 fíntese de Ciclo^{3 j12}/' Asp³, Ala¹^ 7-GRF( 1-29)-NH

21'

Preparação de Boc-Krg(Tos)-BenzidriXamina~resina

Lavou-se bensidrílamina-resina (óOg, 0,7 meq/g, b2 meq) com 900 nl de cada um de Cí^Glg, MeOH, CH₂Cl_2S 25 % de St^N 0Η_?0ΐ_ο (3 vezes ), GHgClg, MeOH e CIi₂Cl₂. Adícionou^se Boc-Arg (Tos)-OH (35,95 g, 8^ mmoles, 2 eq) em BMP (80 ml)~CH₂Cl₂ (600 ml), agitou-se durante 5 min © adicionou-se DCC (17,3 g₉ 8^ mmoles, eq.) e fez-se reagir durante 2½ horas. Lavou-se a Boc-Arg(Tos)-3HA-resina resultante com W, CH^Cl^, MeOH e OHgC^. A análise de aminoácidos de uma alíquota revelou uma substituição de 0,38 mmole /g. Acetilou-se a resina com 300 ml de 50 % de ACgO-píridino durante 2 horas a 25° e lavou-se com CH₂Cl₂, MeOH, CH₂C1₂ e secou-se sob vácuo para proporcionar 70 g de Boc-Arg(Tos)=BHA-re sina (substituição: 0,6 meq/g).

Preparação de / Asp^b(0Fm) , Lis¹²(Fmoc), Ála¹^ 7-GRF( 1-29)-benzidrilamína-resina.

Desprotegeu-se a Boe-Arg(Tos)-BHA-resina (70 g, 0,6 meq/ /g, 42 neq) 3 neutralizou-se de acordo com 0 protocolo apresentado na Tabela 1. Protegeram-se os aminoácidos tri-funcionais como se segues Boc-Arg(Tos), Boc-Asp(OcHex), Boc-Glu-(03zl) ,Bbc-Iôs (2Ο1-Ζ), Ba>íja^z3),Bcc-(SÍ0eiÔ,Boc-Tir-5,6-QL2Bzl), Boc-Asp^(.OBn)..e Boc-Bis^(Fmoc As excepções ao protolo foram para a. ligação de Boc-Gln-0H (posições 2¼ e 16) e para a ligação imediatamente a seguir Gin (po síções 23 © l5) ©m que se utilizaram 3 equivalentes do anidrido simétrico em DMF (ligação dupla). Nos caos especiais em que era necessário ume terceira ligação preparou-se 0 éster HOBt utilizando 2,5 equivalente, de cada um, de Boc-aminoácido, 1-hidroxi -benzotriazol 9 DCC pré-activado em. BMC (120 ml), filtrou-se

(remoção de dieiclc-hexilureia) e diluiu-se com tolueno a 1,21.

A ligação prosseguiu durante 2 horas e adicionou-se di-isopro?» plletilanira a 1,5 $ e fez-se reagir durante mais 15 min.

Removeu-se uma porção do composto intermédio £Ala^XJ X -ΟΗΓ( 1.3-29)-3HA-resina (1,88 g, 0,71½ amole) e continuou-se a sír.tese passo-a-passo em fase sólida como descrito antes« Depois da incorporação de Lis (Fmoc), substituiu-se o Passo 6 com LIEA/CH^Clg a 0,6 $. A ligação com Boc-Asn-GE (6 equivalentes) executou-se por pré-actívação com 1-hídroxl-bsnzotriazol (6,6 eqviv.) e PCG (6 equív.).

Preparação de Ciclo⁸ ’ ¹²f Asp⁸, Ala¹^ J-GRF( 1-29)-^.

A seguir a união de Boc-/ Asp⁸( OFm) , Lis¹²(Fmoc), Ala¹^ -GRF(1-29resina (2,72 g, 0,71½ amole ) desprotegeu-se a resina com piperidina/DMF a 20 $ durante 20 min para proporcionar Bc-c-/Asp° , Ala¹^ /-GBF( 1-29)-BHA-resina» Giclizou-se uma porção Ί,^!τΟ g, 0,40 mmole ) por reacção com reagente BOP (^3 mg, 1,0 mmole , 2,5 eq.5 em DMG (Ml ml) contendo Et^E (l57^1_s l_s12 mmole , 2,8 eq.) durante ½ horas. Depois de lavagem, repetiu-se a ciclização mais duas vezes durante 11 horas e 3 horas (ensaio de ninidrina Kaiser negativo) e lavou-se o péptido-resina, secou-se e fracturou-se com HF (~20 ml) contendo DTE (l ml/g de resina.) a 0° durante 2 horas. A evaporação de HF foi seguida de lavagem com EtCAc, extracção com TFA (6><5 ml), evaporação- θ trituração eom éter»

Purificarão e caracterização de Ciclo^{0 512}/ Asp⁸, Ala¹^/-GSF( 1-29 ) -NE₉

Fez-se a suspensão do produto bruto (708 mg) em 20 ml de

H₀C (TFA a 0,025 /), agitou-se, centrifugou-se, filtrou-se e aplicou-se numa coluna Syncrc-pak E.P-P (2,0 x 50 cm) /Condições

/minjf\ Recolheram-se fracções a intervalos de 1 min. Reuniu-se as fracções 82-89 e liofiIIzaram-se para proporcionarem 8^mg de produto semi-puro» Das fracções 90-93 obtiveram-se bandas laterais (33 mg)· Purificou-se de novo, o material seml-puro (8*+ ng) numa coluna Ni«eleosíl 0_Ίθ (1,C x 50 cmj /condições de eluição; eluente (A) HgO (TFA a 0,1 /) (B) ACE (TFA a ^rsl /); gradiente linear 20-90 % (B) em 120 min; débito 3 ml/min/

Recdlberemree ³³ fracções a Intervalo a.l min. * As fracções 1^-lã, fexanreurddse elio ligadasparaproflveifmran um produto homogéneo (9 mg) e as fracções 122-138 proporcionaram b-2 mg de um produto que era mais que 97 $

Exemplo 2

-CRF( 13-29resina (5,1 g, 1,63 mmole ) e continuou-se a sfn tese passo-a-passo em fase sólida de acordo com o protocolo apre sentado na Tabela 1. Depois de incorporação de Lis (Fmoc),

substituiu-se o passo 6 com DIEA/CIi^Ci^ a 0,6 Continuou-se o 10 a síntese pare, proporcionar 6,4 g de Boc-/'Asp°(0Fm, Lis (Fmóc), ***

Ala'^1-'’ J7-GRF( 3-29)-BHA-resina. Submeteu-se uma porção de 1,0 g (0,255 mmole ) a um ciclo de síntese de fase sólida com Boc-D-Ala-OH para proporcionar (Boc-^D-Ala ²,Asp® (OFm), Lis¹²(Fmoc),

-(

Ala'_/-GFíF(2-29)-BíIA-resina. Submeteu-se uma porção de 0,5 g a um ciclo final com DesNE^Tír-OE para proporcionar f desNH^Tir¹, D-Ala”, Asp® (Ofm), Lis¹²(Fmoc), Ala¹^ _/-0RF( 1-29)-BHA-resina que se desprotegeu com piperidina/DMF a 20 f₀ durante 20 minutos e se ciclisou com reagente BOP (170 mg, 0,384 oirnole , 3 eq) em DMF (20 ml) contendo DISa (0,3 ml, 2,2 mmole ) durante 2 horas. Repetiu-se a ciclização com reagente BOP recente (ensaio de ninidrina Kaiser negativo) e lavou-se o péptido, secou-se e separou-se (corno anteriormente) com HF (''IO ml) a 0° durante 2 horas. À evaporação de HF seguiu-se a lavagem com EtOAc, extracção eom TFA, evaporação e trituração com éter para proporcionar 229 mg de pro duto bruto. A purificação executou-se por HPLC preparativa como descrito antes para ciclo®⁵¹²/Asp®,AlaJ7-GRF(1-29)-NH^®

Exemplo 3

Síntese de Ciclo®⁹¹²/TdesHHpTjr¹, Asp®, Ala^^Z-GRF-(l-29)-HH_o ___—-__j*

Submeteu-se uma porção de 1,0 g (0,255 mmole ) de BocAsp°( OFm), Lis^-íFmoc), Ala¹-? _7“GRF( 3-29)-BHA-resina a 2 ci cios de síntese de fase sólida com Boc-L-Ala-0H seguida de desHH^Tir-CH para proporcionar £ desHHgTir¹, Àsp®(CFm), Lis¹²

-j Cy (Fuicc), Ala y- GRF(l-29)-BHA-resina que se desprotegeu com pi21

peridina/DMF a 20 / durante 20 min e se ciclizou com reagente BCP (l/O mg, 0,38*+ mmole 3 eq.) em DMF (20 ml) contendo DISA . (0,3 ml, 2,2mmoles) durante 2 horas. Repetiu-se a cicliaaçp.o com reagente BOP recente (ensaio de ninídrina Kaiser negativo) e lavou-se o péptido, secou-se e separou-se (como anteriormente) com HF (*** 10 ml) a 0° durante 2 horas. A evaporação de HF seguiu-se a lavagem com EtOAc, extracçao com TFA, evaporação e tri turação con éter para proporcionar k5c mg de produto bruto.

A purificação executou-se por HPLC preparativa como descrito antes para ciclo⁸’¹²Z Asp⁸, Ala¹^ 7-GRF( 1-,29)-ΝΗ_Ό·

Exemplo

Síntese de Ciclo^{8 s12}/D-Ala², Asp⁸, ÀlAy-GRF( 1-29)-¾

Submeteu-se uma porção de 0,5 g de Boc-/h-Ala², Asp⁸(Fmoc), Aley-GRF( 2-29)“BHA-resins do Exemplo 2 a um ciclo final con Boc-Tír/7 2,6-Cl₀Bzly-0H Para proporcionar Boe-/~D-Âla²,Asp⁸(CFn), Lis^(Fmoc), Àla^^-GRF( 1-29)-BHA-resina que se desprote geu com piperídina/DMF a 20 / durante 20 min e se ciclizou com reagente BOP (Γ/C irig, 0,38*+ mmole , 3 eq) em DMF (20 ml) contendo DIEA (0,3 al» 2,2 mmoles) durante 2 horas. Repetiu-se a ciclização cem reagente BOP recente (ensaio de ninídrina Kaiser ne gativo) e lavou-se o péptido, secou-se e separou-se (como anteriormente) com HF (^ 10 ml) a 0° durante 2 horas. A evaporação de HF seguiu-se a lavagem com EtOAc,. extracçao com TFA, evaporação e trituração com éter para proporcionar 198 mg de produto bru_ to. K purificação executou-se por HPLC preparativa como descrito antes para Ciclo⁸’¹²Z“ Asp⁸ , Àla^y-GRFC 1-29-¾

Exemplo 5

GR?(1-29)-1¾

ciclo final com Boc<=H-Metil-L-Tir-(2,6-Gl₂Bzl)-0H para propor-

com, piperidina/DMF a 20 $ durante 20 min e se ciclizou com reagente 30P (1/0 mg, 33^ mrnole, 3 ®Q) ©m DMF (5 ml) contendo PIEA (0,103 Ril 5 C , 765 mmole 6 eq) durante duas horas. Repetiu-se a ciclização mais 2 vezes com reagente BOP recente (ensaio de ninidrina negativo), lavou-se o páptido, secou-se e separou-se (cora o anteriormente) com HF í'*' 10 ml) a 0° durante 2 horas. A evaporação de HF seguiu-se a lavagem cem EtOAc, extracção com TFA, evaporação e trituração com éter para proporcionar 219 mg de produto bruto. A purificação executou-se por HPLC preparati va como descrito antes para Οΐοίοθ^/Άδρθ, Ala^__7-GRF( 1-29)nh₂.

Embora a invenção tenha sido descrita em relação com aspectos preferidos, considera-s® que não se limita o âmbito des ta invenção,aos aspectos particulares apresentados, mas, pelo contrário, considera-se que abrange alternativas, modificações, e equivalentes que podem ser incluídos no espírito e âmbito da presente invenção como definido pelas reivindicações apensas.

Claims

Reivindicações representa

R^ representa Rg representa

1.- Processo para a preparação de um péptido da formula geral R^-R„-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-^-Val-Leu-R₃-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R^-R^-Rg-X na qual 'Tyr ,desNH₂“Tyr, Ac-Tyr ,His,

N-Metil-L-Tyr

Ala, D-Ala, N-Metil-D-Ala

Sly, Ala, Leu, Vai, Ile, Nle, NVal, fc-Ala, -Aib ’

Met, Leu, Nle,Ile

Ser, Asn uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-GluArg-C-ly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu ,ou os seus fragmentos em que o

R^ representa Ri- representa R_ representa

-24fragmento ê constituído por 1 a 15 aminoãcidos a partir da extremidade carboxilo,

X representa um grupo OH ou NH₂ ou um grupo de fórmula geral N(R^)(Rg) na qual R^ e Rg representam, cada um, um ãtomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior,

A representa Asp, Glu, ácido G<-aminopimêlico, ácido

-aminoadípico,

B representa Lys, Orn, ácido diaminopropiónico, ácido diaminobutírico, em que a terminação carboxi da cadeia lateral de A se liga, por meio de uma ligação amida, â terminação amino da cadeia lateral de B, e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico,caracterizado pelo facto de se fazer reagir um polipeptido convenientemente ligado a uma resina protegida de cadeia lateral de sequência de aminoãcidos correspondente, que foi sintetizado mediante síntese de peptidos de fase sólida, com HF líquido e, se necessário, de se converter um tal péptido em um sal aceitável em farmácia.
2,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de R^ representar Tyr, desNH₂~Tyr, N-Metil-L-Tyr; R₂representar Ala, D-Ala; R^ representar Ala; e X representar um grupo NH_2> * t g :
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de A representar Asp; B representar Lys (e de a terminação carboxi da cadeia lateral de Asp ser covalentemente ligada à terminação amino de cadeia lateral de Lys como uma ligação amida); R₄ representar Met; Rg representar Ser; e R_g representar Arg.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caraterizado pelo facto de R₁ representar Tyr.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de R^ representar Ala e de o referido composto ter a fórmula geral:

Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-AlaX............... i

Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂· >
6. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de R₂ representar D-Ala e de o referido composto ter a fórmula geral:

Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Alai—-—-1

Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de R^ representar desNH₂~Tyr.
8,- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de R₂ representar Ala e de o referido composto ter a fórmula geral desNH -Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val2 ι-----i

Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-SerArg-NH .
9, - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de R₂ representar JD-Ala e de o referido composto ter a fórmula geral desNH₂-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-MetSer-Arg-NH₂,
10, - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de R^ representar N-metil-L-Tyr,
11, - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de R₂ representar Ala e de o referido composto ter a fórmula geral

N-Metil-L-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-MetSer-Arg-NH₂«
12, - Processo de acordo com a reivindicação 10, câracterizado pelo facto de R₂ representar D-Ala e de o referido composto ter a fórmula:

N-Metil-L-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-Ile-MetSer-Arg-Ní^.
13.- Processo para a preparação de um peptido de fórmula geral

Rl-I^-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R^Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R^-Rg-Rg-X na qual representa

R2 representa

Rg representa

R4 representa

Rg representa

Rg representa nados a partir do grupo que

Tyr, desNí^-Tyr, Ac-Tyr, His, N-Metil-L-Tyr

Ala, D-Ala, N-Metil-D-Ala

Gly, Ala, Leu, Vai, Ile, Nle, NVal, |}-Ala, Ç^-Aib

Met, Leu, Nle, Ile

Ser, Asn uma sequência de aminoácidos seleccio consiste em

Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-GluArg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu ou os seus fragmentos em que o fragmento é constituído por 1 a 15 aminoácidos a partir da extre midade carboxilo,

X representa um grupo OH ou ^{ou 13111} çruno de fórmula geral N(R.p (Rg)na qual Ry e Rg representam,cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior,

-28A representa Asp, Glu, ãcido <X. -aminopimêlico, ãcido

A -aminoadípico.

E representa Lys, Orn, ãcido diaminopropiónico, ãcido diaminobutírico, e dos seus sais aceitáveis, sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um polipeptido convenien temente ligado a uma resina protegida de cadeia lateral de uma sequência de aminoãcidos correspondente, que foi sintetizado mediante síntese de pêptidos de fase sólida com HF líquido e, se necessário, de se converter um tal pêptido em um sal aceitável em farmácia.
14,- Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^ representar Tyr, representar Ala? A representar Asp; B representar Lys; R^ representar Ala; representar Met; R^ representar Ser; Rg representar Arg; e X representar um grupo NH^ e de o referido peptido ter a fórmula geral

Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-AlaGln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂ ·,
15.- Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^ representar Tyr, R₂ representar D-Ala, A re presentar Asp; B representar Lys; R^ representar Ala,R₄ representar Met, Rj- representar Ser, Rg representar Arg e X um grupo NH₂e de o referido composto ter a fórmula geral

Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH₂.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^ representar desNI^Tyr; R₂ representar Ala; A representar Asp; B representar Lys; R^ representar Ala; R₄ representar Met; R^ representar Ser; Rg representar Arg e X representar um grupo NH₂ e de o referido composto ter a fórmula geral desNH₂-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-SerArg-NH₂.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R representar desNH₂ Tyr; R₂ representar D-Ala; A representar Asp; B representar Lys; R^ representar Ala; R^ representar Met; representar Ser; Rg representar Arg e X representar um grupo NH₂ e de o referido composto ter a fórmula geral:

desNH₂-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-MetSer-Arg-NH₂.
18.- Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^ representar N-metil-L-Tyr; R₂ representar Ala; A representar Asp; B representar Lys; R^ representar Ala;

representar Met; R^ representar Ser; Rg representar Arg e X representar um grupo NH₂ e de o referido composto ter a fórmula geral

N-Metil-L-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-MetSer-Arg-NH₂.
19.- Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de R^ representar N-metil-L-Tyr; R₂ representar D-Ala; A representar Asp; B representar Lys; representar Ala;

representar Met; Rg representar Ser; Rg representar Arg e X representar um grupo NH₂ e de o referido composto ter a fórmula geral

N-Metil-L-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-MetSer-Arg-NH₂.
20.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19 e, eventualmente, outra ou mais substâncias terapeuticamente activas, com um material veicular terapeuticamente inerte e de se converter a mistura em uma forma de administração galónica,