PT88624A - Processo para a preparacao de uma glicoproteina xilanase de baixo peso molecular - Google Patents

Description

1 5 10 15 20 25 30 60.254 Ref:ISURF 959 SET. 1988

Descrição do objecto do invento que IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC,, norte-americana, industrial, com sede em 315 Beardshear AMES, IOWA 50011, Esta dos Unidos da América, pretende obter em Portugal para: "PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE UMA GL1C0PR0 TEINA XILANASE DE BAIXO PESO MOLI CULAR" O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de enzimas xilanase que actuam spbre xi-lano de plantas, por exemplo xilanases produzida por microrganismos. Endo-xilanases (1,4-β-D-xilano xilanohidro-lase) que hidrolizam ligações principalmente interiores (1 _»4)—β—D—xilosilo na hemicelulose xilano da planta, foram isoladas a partir de fungos, bactérias, plantas e invertebrados. Mas houve relativamente pouca investigação de éndo-xila-nasee provenientes de actinomicetes, apesar da grande importância científica e comercial desta família bacteriana. Na primeira referência conhecida, Iizuka e Kawaminami (1965) descreveram uma endo-xilanase proveniente de Streptomyces xilophagus. Produziu inicialmente xilobiose e xilo-oligossaearídeos maiores a partir de xilano, mas produziu finalmente xilobiose e D-xilose. Mais tarde, os 35 60.25¾ Refí ISURF 959 29. SET. 1988 c:

dois relatórios, Kusakabe et al. (1977) mediram a actividade e a estabilidade óptimas de uma enzima análoga proveniente de Streptomyces. Esta endo-xilanase tem um peso molecular de aproximadamente ^0.500. Produziu D-xilose e xilobiose a partir de xilano depois de inicialmente formar xilo-oligos_ sacarídeos com comprimento intermédio, e, evidentemente, teve alguma actividade xilositransferase, porque produziu xil£ biose mas não D-xilose a partir de xilotriose, ^ Kusakabe, Kawaguchi et al. (l977)» e Kusakabe, Yasui et al. (1977) »,7 Nakajima et al, (198¾) descreveu também uma endo-xilanase Streptomyces análoga com peso molecular de aproximadamente ^3*000 daltons.

Investigadores do Laboratório Nacional de Química de Pune, índia, descreveram o isolamento de estirpe produtora de enzima de uma estirpe actinomicete do género Chainia, /“Srinivasan et al. (1983)·/ A esta estirpe foi atribuída a identificação de código "NCL 82-5-1" © o seu estudo foi efectuado no Laboratório Nacional de Química (daqui em diante LNQ). /""Srinivasan et al. (198¾) ·_7 A estirpe Chainia LNQ-82-5-1 não pode ser obtida fora do LNQ, e tem sido mantida pelo LNQ numa base não pública.

Este pedido de patente baseia-se na descoberta de uma nova endo-xilanase qiiie pode ser obtida por fermentação de estirpe LNQ-82-5-1 sobre um meio que contém uma fonte de xilano, separação do líquido de fermentação dos sólidos, e a sujeição do líquido a uma série de separaçães cr£ matográficas para isolar e purificar a endo-xilanase de acor do com o presente invento, que, na presente descrição, é denominada Xilanase XX. Esta enzima é uma glicoproteína com um peso molecular pequeno. Tanto quanto se sabe, a Xilanase II tem o menor peso molecular de qualquer xilanase descr^L ta até agora. A Xilanase II foi obtida em forma essencialmen te pura. 0 seu peso molecular absoluto expresso em daltons é inferior a 9.000 e superior a 5.000. Com base nos dados - 2 - 10 15 20 25 30 60.25** Refí ISURF 959

J£P 29. SET. 1988 disponíveis, o peso molecular estimado em daltons é 6000 + 1000. Determinaram-se outros critérios de identificação. 0 conteúdo de amino ácido aproximado e o número de amino ácidos são conhecidos, e fez-se a sequência da maior parte da espinha dorsol amino ácida da proteína glicosilada. De facto, confirmou-se uma sequência exacta por meio de análise repetida da maior parte da proteína. A Xilanase IX tem propriedades para utilização no tratamento de fibras de madeira. Tem actividade enzi-mática específica para xilano com actividade enzimática insignificante para celulose. 0 seu peso molecular pequeno permite a Xilanase II penetrar em fibras de madeira, de manei ra que pode efectuar uma degradação selectiva de xilano. A xilanase II transforma xilano em xilo-oligossacarídeos. A Xilanase II pode ser utilizada também para actuar sobre xilano noutros substratos, visto que não têm uma acção enzimática apreciável contra derivados de celulose ou outros oli-gossacarídeos como amido. Os desenhos anexos são gráficos de separações cromatográficas das xilanases. A Figura 1 representa a separação inicial da actividade endo-xilanase do meio de fermen tação, estando incluídas no pico representado ambas as xilanases com molécula grande. A Figura 2 representa uma outra resolução desta actividade endo-xilanase em duas fracções sendo o primeiro pico uma xilanase com molécula grande (Xilanase i), e o segundo pico a xilanase com molécula pequena (Xilanase II) do presente invento. 0 presente invento diz respeito a uma nova en do-xilanase que é uma glicoproteína substancialmente pura que tem um peso molecular superior a 5000 e inferior a 9000 (expresso em daltons). ^sta enzima, designada por Xilanase II, é caracterizada por actividade enzimática específica para xilano com actividade insignificante para celulose. Pelo mé todo desdrito adiante, a Xilanase II pode ser purificada até - 3 - 35 5

15 20

30

r^29. SET.1S8S 6ο.25**

Ref: ISURF 959 se obter homogeneidade essencial. A Xilanase II é tamláem ca-racterizada por uma sequência de 24amino ácidos, conforme é descrito adiante. 0 processo preferido para a preparação de Xilanase II compreende a utilização da estirpe CHAINIA LNQ--82-5-1, que estará permanente a disposição do público. A utilização da estirpe LNQ-82-5-1 para a produção de Xilanase II implica os procedimentos gerais seguintes, descritos de maneira pormenorizada pelos Exemplos Experimentais. LNQ-82-5-1 é um actinomicete formador de es-clerótias do género Chainia que segrega isomerase glucose extracelular, isomerases xilose e xilanases quando cultivado num meio apropriado. Por exemplo, pode empregar-se um meio extraeto de fermento de farelo de trigo para produzir as en-do-xilanases extracelulares, que incluem a Xilanase I de molécula grande, que tem um peso molecular relativo aparente da ordem de 25.000, e a Xilanase IX de molécula pequena do presente invento.

Os meios de fermentação que podem ser utilizados para a cultura de LNQ-85-5-1 são descritos por Srini-vasan et al. (19^3) e Srinivasan et al (1984). Para a pre-paraçâp de culturas de inoculação, a estirpe Chainia pode ser cultivada e/ou conservada sobre ágar dextrose de batata e ágar peptona glucose extraeto de malte. É desejável sub-cultura periódica para manter a viabilidade. Os meios de fer mentação aquosa para a produção de xilanase devem conter uma fonte de xilano. Podem empregar-se, por exemplo, farelo de trigo e fontes vegetais análogas que contenham xilano. Mais especificamente, pode preparar-se um meio apropriado a partir de farelo de trigo a 5$ e extraeto de fermento a 1$. 0 pH de partida pode ser aproximadamente 5*8* e a fer mentação pode ser efeetuada a temperaturas de cerca de 28°C. A fermentação prossegue até estarem libertas as xilanases extracelulares. São apropriados tempo de fermentação desde - h - 35 60.254

Ref*. ISURF 959 90 até 120 horas, mas adoptar-se tempos de menor ou maior duração. 0 progresso da fermentação pode ser acompanhado por meio da recolha de amostras e experiências para determinar a sua acitivade xilanase extracelular.

Quando se completa a fermentação, as células Chainia são separadas do meio de fermentação aquosa, quer dizer, por centrifigação, filtração ou outro procedimento. 0 meio isento de células que contêm xilanases é depois tratado para recuperar a endo-xilanase Xilanase II. Num processo preferido, adiciona-se etanol ao meio clarificado para precipitar as xilanases, incluindo a Xilanase I de molécula grande e a Xilanase II de molécula pequena pretendida. As xjL lanases precipitadas são redissolvidas e submetidas a uma série de separações cromatográficas. A Xilanase II é preparada por este meio numa forma muito purificada.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS 20

Materiais e Processos

Condições de cultura: O meio de cultura e fermentação inclui farelo de trigo (5,0 g) e o extracto de fermento (l,0 g em 100 ml de água destilada. 0 meio esteve em autoclave a 121°C durante 40 minutos. Utilizou-se cultura com sete dias, mantida em corte agar dextrose de batata a 2$ para inocular os balões de inoculação. Os balões foram seguidamente incubados durante 72 horas e foram utilizados como inoculo. Os balões experimentais foram inoculados com o inoculo acima e incubados a 30°C num sacudidor rotativo (200 rpm) durante 120 horas. Recolheu-se filtrado de cultura depois de centri fugação (700 x g) como sobrenadante lxmpido.

Experiência de xilanase; Mediu-se a actividade xilanase por estimativa dos açúcares redutores produzidos, como equiva- - 5 - 35 10 15 20 25 30 60.25** Ref: ISURF 959 2 9. SETJS88 lentes xilose, por meio de reagente acido 3,5-dinitro-sali-cílico (Miller, 1959) assim como pelo método de Somogyi e Nelson (Nelson, l&bU). Produção e Isolamento de Xilanase 11 Chainia sp. (LNQ-82-5-1) foi cultivada no meio acima, que continha farelo como fonte de carbono principal. Depois da cultura com a duração de 120 horas, conforme descrito, separaram-se as células e resíduos sólidos do caldo de cultura por meio de centrifugação a 700 x jg durante 20 minutos. Purificação de Enzima Efectuaram-se os seguintes passos a uma temperatura de 0 a **°C, salvo indicação em contrários Fase Is Precipitação em álcool 0 filtrado de cultura (350 ml, 3.100 U) foi concentrado por meio de precipitação da enzima com três volumes de etanol destilado arrefecido a **°C conforme descrito no parágrafo Materiais e Métodos. O precipitado foi recuperado por centrifugação e seco sob vácuo e armazenado a -10°C até utilização ulterior. A recuperação de actividade xilanase foi de 85-90 $ aproximadamente. Fase IIs 0 precipitado em álcool (l,58 g, 2.800 u) de enzima proveniente da Fase I foi dissolvido em 50 ml de 50mM, tampão fosfato de sódio, pH 7»1· As partículas sólidas não dissolvidas provenientes do precipitado foram separadas por centrifugação, e a solução de enzima límpida foi depois puri ficada sobre DEAB-celulose em tratamento descontínuo. DBAB-celulose (tratamento descontínuo): DEAE-celulose pré- activada com NaOH IN e HC1 IN foi equilibrada com 50 mM, tam pão fosfato de sódio, pH 7»1. 0 bolo de DEAE-celulose sólido obtido por filtração de 290 ml de pasta de DEAE-celulose - 6 - 35 60.25^

Ref: ISURF 959 (que contém 25 mg de peso seco por ml) foi posto em suspensão em 50 ml de solução de enzima (2.800 U). Este tratamento foi efectuado enquanto se mantinha agitação constante, durante 30 minutos, e a pasta foi filtrada através de papel de filtro Whatman No. 1. 0 filtrado foi recolhido e o bolo de DEAE-celulose foi novamente posto em suspensão duas vezes no mesmo tampão, empregando 25 ml de tampão de cada vez para recuperar a enzima (875 U). 10

Fase III: DEAB-Fractogel-TSK-650 S cromatografia permutadora de iões 15 20 A solução de enzima concentrada proveniente do tratamento com DEAE-celulose (Fase II) foi reeromatogra-fada sobre coluna DEAE-Fractogel-TSK-650 S (2,0 x 90,0 cm), previamente equilibrada com 50 mM, tampão fosfato de sódio, pH 7*1· A coluna foi lavada com o mesmo tampão e recolheram--se fracçães de *f ml de 10 em 10 minutos. 0 pigmento amarelo proveniente da amostra carregada foi adsorvido no cimo da co luna. Juntaram-se fracçães que continham a xilanase não ad-sorvia 58O ml) e concentraram-se por ultrafiltração até restarem 12 ml (765 U), A enzima purificada nesta fase deu um só pico para a actividade xilanase, conforme representado na Figura 1. 25 -2SfSET.1S88

Fase IV: Separação de duas xilanases por filtração em gel A solução de enzima concentrada proveniente da Fase III foi utilizada para nova purificação por coluna Sephadex G-50 (2,5 por 110 cm), 50 mM, tampão fosfato de sódio, pH 7*1 utilizado para carga e eluição da enzima. Os perfis da actividade xilanase e da eluição de proteína estão representados na Figura 2. Recolheram-se fracçães num débito igual ao mencionado na Fase III. As duas xilanases - 7 - 60.25¾

Ref: ISURF 959 designadas por Xilanase I e Xilanase II (peso molecular pequeno) foram resolvidas em 2 picos em 135-170 ml (66 ϋ) e 265-335 ml (265 U) respectivamente. A proporção destas duas enzimas protínas foi de 30:70 e a proporção das áuas activi-dades foi de 20:80. As actividades específicas da Xilanase I e da Xilanase II purificadas foram 20,0 e 31,5 U/mg de proteína, respectivamente.

Pureza de Xilanase I e II: A pureza de Xilanase I foi novamente avaliada por processo de concentração isoeléctrica LKB analítica. As amostras de proteína de xilanase II foram levadas juntamente com as proteínas padrão para a gama pi de 3,5 a 9,5· Carregaram-se amostras de 20 a 30 ug num gel de placa de piliacri^ lamida, efectuou-.se . eletroforese durante 8 horas. A preparação Xilanase II apresentou uma faixa de proteína única em eletroforese de gel de disco com pH ht3, o que indicou a sua homogeneidade. 0 Quadro A resume o processo de purificação, recuperação e actividade específica de Xilanase II em várias fases. - 8 - 29.SET.1988 6ο.25½

Refí ISURF 959 0 κβ σ> Φ Ο Ο C\! ι> \Ω h * ·* « * 9% φ Ο ία οθ •Cf· 00 Α >w Ο 00 Μ CM 3 0 φ « Η ο> Φ Ό Ο Φ ·ιΗ Ό «Η •Η Μ 6ί 10 25 30 > Ο ε οθ C\ ιΑ ία •Η Φ *> ·· «· +S Α & Ο Η νθ ο Η Ο η c\i CA «4 Φ Φ η φ φΤ) οι •X Φ ο Ο »Α ΐΑ kA > C Η 'Β ο Ο t'- νϋ VO Η •Η Φ Φ Η 00 00 t- Η •Ρ Η -Ρ 0 τ) Ο ca CM ω <4 X -Ρ ω < Φ •cf- Ρ 3 \ < Η Μ ΙΑ CA JÍ fc- 00 X Φ Η 15 b- r- CA CA Ο •Ρ Φ ε 00 j· Η Α S Ο -Ρ CA Η « η U ο •«4 Α -Ρ Ρ ο θ’ κ ο Φ <4 ε >»>> Ο Ο Ο Ο ΙΑ ϋ 3 Η ΙΑ ΙΑ Η 00 ί— Η Η ε CA Η Α 0 'w Η ί> Α Η 1 0 Η Ο Φ Ο Μ Η Ο 'Φ +» Ο 0 ε φ U φ U 3 Φ Α ο -Α 0 (0 1 »Α ε «4 ο Α 1 Ε0 •Η ί» Α *3 ω ο Φ Φ 3 Α ΙΟ 0 +5 Η Ο ο X Φ φη Ό •Η φ ΙΑ φ (0 Ο Φ Α ο Φ νο Ό Φ Φ U Η 1 3 1 Φ 3 β •Ρ υ Ã 3 À Λ Φ Α Η φ ◄ Η C0 Α Η •Η U Α 0 Φ •Η Α Α α ο « ω X Η Η Η > Η Η Η Η Ε0 Φ Φ Φ Φ Φ <0 0} 10 (0 <0 Φ Φ Φ Φ Φ Α Α Α Α Α - 9 35 60.25¾ Refs ISURF 959 2 9. SET. 1888

Verificação de Pureza Adicional A Xilanase II preparada conforme descrito fo submetida a cromatografia de permuta de catiões com uma coluna de CM-Trisacryl com diâmetro interior de 20 mm e 700 mm de comprimento, eluída com 0,8 ml/min de 0,025 M, tampãô a-cetato de sódio, pH 4,5» com um gradiente 0-0,2M de cloreto de sódio. Apenas um pico de proteína saiu da coluna; continha toda actividade Xilanase II (Figura z). Purificou-se este material por SDS-PAGE e IEF efectuadas com anfólitos pH 7 a pH 9·

Propriedades e Estudos Cinéticos

Peso molecular: Determinou-se o peso molecular de Xilanase II por quatro métodosí (l) A partir dos amino ácidos deter minados por hidrólise e CLGP, adicionando um resíduo tripto-fano encontrado por sequenciação, o peso molecular é superior a 4087 daltons; (2) Utilizando os amino ácidos encon trados por sequenciação, o peso molecular ó superior a 4214 daltons; (3) Por ensaio de SDS-PAGE, com marcadores de peso molecular de proteína LKB desde 2.512 até 16,969 dan-tons, o peso molecular de Xilanase II não derivada é de 6000 dantons. Depois de piridiletilação, o peso molecular é de 8000 daltons. Por meio de cromatografia de coluna com Sepha-dex G-50-50, utilizando os mesmos padrões de peso molecular, o peso molecular é de 5000 dantons, (4) Por meio de cromatografia de coluna com Fractogel HW-405, o peso molecular foi de 9000 daltons.

Natureza glicoproteína

Usaram-se dois métodos diferentes para determinar a natureza glicoproteína de Xilanase II. (a) Método Timos:etanoltH„S0^; Depois de electroforese de gel poliacrilamida, os geles foram mergulhados numa solução fixadora que continha isopropanol:ácido 10 29.SET.1S88 60.254

Rei1! ISURF 959 acético: água (25:10:65) para fixar as caixas de proteína e separar substâncias com peso molecular pequeno, por exemplo sacarose, glicerol e outras impurezas. Os geles foram mergulhados de novo durante 1 hora em timos a 0,2 $ preparado na solução de fixação acima. Os geles,depois de nova lavagem com a solução de fixação, foram transferidos para uma solução de HgSO^ concentradoíetanol (80:20 v/v) e mantidos durante 3 horas a 35°G. A glicoproteína de Xilanase II apresentou uma Êixa vermelha sobre fundo amarelo. (b) Cromatografia de afinidade sobre Concanavalin A Sepharose 4B: A Concavalin A Sepharose 4b tem afinidade para com glicoproteínas que contêm especificamente resíduos o<-D-manopiranosilo e/ou -D-glucopiranosilo ou resíduos 2-Q-D-manopiranosilo interno. Quando se cromatografou Xilanase II sobre coluna de Concanavalin A Sepharose 4B (0,6 x x 8,0 cm), não foi absorvida, visto que a actividade foi detectada nas primeiraq fracções eluídas. Isto sugeriu que a Xilanase II pode conter porções açúcar que não resíduos cxf-D-manopiranosilo ou -D-glucopiranosilo.

Composição amino ácida:

Determinou-se a composição amino ácida de Xilanase II utilizando o analisador de amino ácido automático Beckman. Os resultados obtidos estão indicados no Quadro B. Supõe-se que metionina, isoleucina, leucina, fenil-alanina e lisina, todos com concentrações molares muito similares, são representados por um resíduo amino ácido cada uma e que as concentrações molares de histidina e cisteína são anormalmente pequenas, mas também representam um resíduo. 0 número total de resíduo é 42, mais um resíduo tripto-fano não medido mas inferido a partir de sequenciação amino ácida. - 11

60.25^

Rei*: ISURF 959

Sequenciaçâo aniino acida:

Determinou-se a sequência amino ácida de Xila nase II (10 ug) num sequenciador de fase gasosa automático. Antes da sequenciaçâo, era essencial saber se o amino á-cido N-terminal de Xilanase II estava bloqueado ou livre. De terminou-se isto de acordo com Chang (1983)» utilizando reagente isotiocianato de dimetilaminobenzeno. Verificou-se que o amino ácido N-terminal estava livre de qualquer bloqueio · A sequência amino ácida parcial de Xilanase II está indicada no Diagrama A, e no Quadro B indica-se a composição amino ácida a partir dos dados da sequenciaçâo. Os dados da sequenciaçâo mostraram que o N-terminal da enzima era alanina, enquanto que havia prolina na extremidade carboxilo. 0 total de resíduos amino ácidos detectados por sequenciador foi de ^0.

DIAGRAMA A

Sequência Amino Ácida

Parcial

para Xilanase II 1 7 10

Ala-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly 11 20

Tyr-Asp-Gly-Met-Tyr-Tyr-Ser-Phe-Trp-Thr- 30

Asp-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Ser-Met-Thr-Leu- 31 37 ko

Asn-Gly-Gly-Gly-Thr-Tyr-Ser-Thr-Arg-Pro- , >> (Glu) 12 60.25¾

Ref: ISURF 959 DIAGRAMA A (Cont.) 5 (a) A sequência indicada prolonga-se desde o amino ácido N-terminal (Ala) até ao amino ácido 40 (Pro), mas não é completa até C-terminal. (b) O amino ácido 37 é provavelmente serina, mas pode ser ácido glutâmico. 10

SLE9JETJ98B (c) Empregam-se símbolos de 3 letras normalizados* Ala-alanina, Asn-Asparagina, Asp-ácido aspártico, Gln--glicina, Ile-isoleucina, Leu-leucina, Met-metionina, Phe-fenilalanina, Pro-prolina, Ser-serina, ^hr-threo nina, Trp-triptofano, Tyr-tirosina e Val-valina. A s equência amino ácida do diagrama A foi confirmada por análise da sequência de 24 amino ácidos desde o amino ácido (Asn) até ao amino ácido 30 (Leu), As por-ç8es restantes da molécula estão de modo geral correctas, segundo se crê, mas pode haver alguma variação amino ácida devido à indeterminação própria dos analisadores de amino ácidos. No entanto, o ^iagrama a deve proporcionar deve proporcionar identificação do tipo impressão digital para Xila-nase II. 25 30 - 13 - 35 15 10 15 20 25 30 60.25^Ref: ISURF 959 cd « •ri 0 o 3 fi Ό cd ft to 0 Φ cd «d fi •ri o ϋ cd Φ fi •ri Ό <Φ O G fi O σ* rs <0 fi φ Ο G Φ co tf ε I Φ '3 cd Η ω & fi v—' .29. SET. 1988

mo s < θ’ H H Φ (0 cd fi cd H •ri

Φ TS <0 O V •ri O O G •ri o 0) Φ Λ ΰ 0 (d νφ 0 Ρ H β 3 β to 0 0 Kd G β XS •ri 0 (0 u /-—V Φ •ri 0 U Φ ε -P •ri Φ β Μ X5 •ri Ό fi 0 0 ft fi u Φ Φ co ε ε •ri •>3 '3 β & β ε CA t— C\i C\! H rri CD 0) {O o· •H Cfl O ftεoo (0 •ri

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H-3-HOOHOH 0 cd 'Φ 0 P H (d 3 "-τ' β (0 o O Ml 3 fi XJ '•rl O to 3 Φ ·Η O H ρ· H H H CM H o 3 d) s -P -rl d) β M τι ·Η '0 3 oo a • A 3 δ 3 d οι d) m 3 P S S *rl •rl o '3-3 td «I iz; β ε 3 d) 3 3 d) A (0 (0 •rl 3 H '0 (0 CM 3 (D (?\ o O t~ O cn m Ό H H OO (Λ OO CM 00 O •rl O •k •v •w * w ♦* a cm σ\ CM CM O ΙΛ o O O * •rl 0 -P X) 3 3 '3 3 A •rl to • ε « 3 tf 3 -P 3 d) 3 O •rl P O (0 tti XJ ε d) o O 3 •rl 3 X) XJ •H O O P ffl •rl 3 3 3 '3 3 0 O cd 3 3 3 3 3 H 23 '3 (d β •H 3 3 <3 CM P ã o 3 •H 3 3 Tí •rl NH O S 0 •rl to H 3 •rl 3 0) P Ω 3 O O •rl •rl -P •rl -P A -< •rl 3 3 3 (0 to δΰ (0 •rl s P ε o •rl d) •rl •rl 3 •rl 3 3 P O cy P (í P 13 < O £-t '—^ '—- - 15 - 35

R 60.254 ef: ISURF 959 29 SET. 1988

Propriedades enzimáticas;

Xilanase II purificada era estável a pH 6,0 quando armazenada a -15°C. Não se observou perda significativa de actividade durante um período de um ano. A enzima não mostrou nenhuma acção sobre car-boximetil celulose, papel de filtro, £-nitrofenil-^-xilo-sido e celobiose. 10 pH óptimo: Examinou-se o efeito do pH sobre Xilanase II uti^ lizando 50 mM, tampáo citrato (pH 3,5 a 6,θ) e 50 mM, tampão fosfato de sódio (pll 6,5 a 8,0). Verificou-se que o pH óptimo para a actividade de Xilanase II é 6,0 a 50°C. 15

Temperatura óptima; Observou-se o efeito da temperatura sobre Xilanase II na gama de 4 a 80°C. Verificou-se que a temperatura óptima para a actividade de Xilanase II sobre xilano solúvel é 60°C com pH 6,0). 20

Depósito de Estirpe 25 30

Em 20 de Dezembro de 1982, a estirpe Chainia LNQ-82-5-1 foi colocada em depósito restrito, não público, na Colecção Nacional de Microrganismos Industriais, Laboratório Nacional de Química, Pune, índia, com o No. de Matrí cola 2980, Outro depósito de estirpe Chainia LNQ-82-5-1 foi feito na ColeciçãÕ Americana de Culturas Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, E.U.A., com o No. de Matriculo ATCC 53812. - 16 - 35

Claims (3)

1. 60.25½ Ref: ISURF 959 1 10 15 REFERÊNCIAS Iizuka and Kawaminami (1965), Agr. Biol. Chem.. 29:520-52½. Kusakabe, Kawaguchi et al. (1977), Nippon Nogeilcagaku Kaishi. 51ϊ½29-½37. Kusakabe, Yasui et al. (1977), Nippon Nogeikagaku Kaishi, 51^39-½½¾. Mil ler (l959)i Anal, Chem.. 31^26. Nelson, J. Biol. ^hem. (19½½), 153:375-380. Nakajima et al. (198½), J. Ferm. Technol., 62:269-276. Nelson (19½½). J. Biol, Chem.. 153:375. Srinivasan et al·, (1983), Biotechnol. Lett» 5:^11-61½. Srinivasan et al. (198½). Bio^feecbnol^^^Lejtt^ 6:715—718. Vartak et al. (198½). Biotchnol. Lett, 6^93^9½. 0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 27 de Julho de 1988 sob o NS 22½.590. ’ -REIVINDICAÇOES-
2. 15 - Processo para a preparação de novas endoxilanases (xilanase II) caracterizado por se realizar 30 , a fermentação da estirpe NCL-82-5-1 num meio que contem uma estirpe de xilan, a separação do líquido de fermentação dos sólidos e se submeter o líquido a uma série de separa- çães cromatográficas para isolar e purificar a endo-xilanase 35 2i - Processo de acordo com a reivindica- - 17 60 ·254 ' .,;í;23..SET.J388 Refs ISURF 959 ção 1, caracterizado por se preparar uma endo-xilanase que compreende uma glicoproteína substancialmente pura possuindo as caracterxsticas seguintes: (a) um peso molecular superior a 5«000 e inferior a 9.000; e (b) actividade enzimática específica para xilano sem actividade enzimática apreciável para celulose.
3. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a purificação se realizar até homogenejL dade essencial. k* - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado ainda por se preparar uma endo-xilana-se que compreende a sequência de amino ácidos 2k seguintes: -Asn-Gln-Thr-Gly-Tyr-Asp-Gly-Met-Tyr-Tyr-Ser-Phe- Trp-Thr-Asp-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Ser-Net-Thr-Leu-em que Asn, Asp, Gin, Gly, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr e Vai, são, respectivamente, asparagina, ácido as-pártico, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilala-nina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. 5- - Processo de acordo com as reivindica-çães anteriores caracterizado por compreender uma preparação homogénea de glicoprotexna possuindo as caracterxsticas seguintes: (a) um peso molecular de 6000 +_ 1000; (b) actividade específica para conversão de xilano em xilo-oligossacaridos; e (c) contendo a sequência amino ácido representada por: -Asn-Gln-Thr-Gly-Tyr-Asp-Gly-Met-Tyr-Tyr-Ser-Phe- Trp-Thr-Asp-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Ser-Met-Thr-Leu- - 18 - 60.25^ 29 SET.W Ref: ISURF 959 em que Asn, Asp, Gin, Gly, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, e Vai, são respectivamenteç asparagina, ácido aspárti-co, glutamina, glicina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Lisboa, 29 SET. 1388 Por IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FUNDATION, INC.

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