PT89384A - Processo para a preparacao de novos anticorpos quimericos - Google Patents

Description

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Campo do invento

Este invento está relacionado com anticorpos monoclonais quiméricos ratinho/humano com elevada especificidade e afinidade para o antigénio carcinoembrionário humano (CEA),seus derivados, processos para a preparação destes anticorpos e seus derivados, DNAs codificadores das cadeias pesada e leve destes anticorpos, processos para a preparação dos referidos DNAs, linhas celulares de mamíferos que produzam e secretam os anticorpos, processos para a preparação das referidas linhas celulares, o uso dos anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados no diagnóstico e terapia do cancro"kits" de testes contendo os anticorpos monoclonais quiméricos e preparações farmacêuticas contendo os referidos anticorpos.

Fundamento do invento

As imunoglobulinas desempenham um papel importante no sistema imune dos mamíferos. Elas são produzidas pelas células do plasma e consistem em duas cadeias po-lipeptidicas leves (L) idênticas e duas cadeias polipeptidi-cas pesadas (H) idênticas ligadas por pontes dissulfureto ou em polímeros desta unidade básica de quatro cadeias. As cadeias leves são do tipo K ou , as cadeias pesadas do tipo I1 - S * Y ou £, . Cada uma das cadeias consiste numa região variável (V) e numa região constante (C). As regiões variáveis V que apresentam diferenças consideráveis na sequência em anticorpos com diferentes especificidade, compreendem partes altamente variáveis, as chamadas r«p.ões determinantes da complementaridade ou hipervariáveis (CDRs), ddimitadas por partes relativamente conservadas, as chamadas regiões de armação (FRs) .

Os anticorpos são moléculas bifuncionais . Por um lado, os segmentos variáveis do extremo N dos polipep-tídeos das cadeias H e L associam-se de modo altamente especí- -4- %

fico e individual, gerando uma estrutura tridimensional com uma afinidade única para motivos químicos particulares (epí-topos) na superfície de um antigénio, i.e., uma molécula que é reconhecida como estranha pelo organismo e induz uma resposta imune. Tais epítopos podem ser moléculas de baixo peso molecular (haptenos) ou partes de estruturas químicas ma-cromoleculares tais como proteínas, açúcares e glicoproteí-nas , e.g. , antigénios da superfície celular.

As características únicas de combinação com antigénios da molécula de imunoglobulina (Ig) resulta da recombinação genética de genes da linha germinal das cadeias H e L muito cedo na diferenciação das células B, por exemplo durante a embriogénese: um de várias centenas de segmentos V liga-se a um de um pequeno número de segmentos de ligação (segmentos J) e no caso do locus da cadeia H, segmentos adicionais de divosidade (segmentos D), formando um segmento de gene rear-ranjado V-(D)-J contíguo e totalmente único codificador de uma molécula de Ig com características de combinação de antigénio específicas. Além da devèrsidade dos anticorpos provocada por simples recombinação de genes, a junção presica em que os segmentos V e J se combinam pode variar Igeiramente.

Uma vez que a reacção de ligação pode ocorrer entre diferentes pares de bases e outros nucleotídeos podem ser adicionados drante o processo de recombinação, vários aminoácidos diferentes não codificados na linha germinal, podem ser inseridos no local de cada potencial combinação V, J ou D-J. Ainda, a mutação somática de bases simples pode também contribuir para a diversidade de Ig. A outra característica estrutural chave das moléculas de Ig é a sua capacidade para activar diversas vias biológicas no sistema imune. Estas chamadas funções efectoras (ligação do complemento, estimulação da fagocitose,, travagem da libertação de grânulos pelos mastócitos) residem básicamente nos segmentos da região constante do extremo car-boxilo dos polipeptideos da cadeia H, dando origem a diferen- -5-

tes classes de Ig (IgA, IgE, IgG, etc.) que definem o papel do anticorpo numa resposta imune particular. 0 desenvolvimento da tecnologia de hi-bridomas tornou possível gerar linhas celulares contínuas, principalmente hibridomas murinos , produtores de anticorpos monoclonais com a especificidade pretendida os quais podem ser usados para identificar, isolar e caracterizar moléculas biologicamente importantes. No entanto, uma grande limitação no uso de anticorpos monoclonais derivados de murganhos como agentes de diagnóstico _in vivo e como agentes terapêuticos é a sua imunogenicidade como proteína estranhas , a sua larga persistência na circulação ea formação de complexos imunes prejudiciais. Por outro lado, o tratamento com anticorpos monoclonais humanos está limitado também uma vez que raramente existem disponíveis linhas celulares de hibridomas humanos, gerálmente instáveis e que não produzem anticorpos monoclonais de especificidade adequada em quantidades suficientes e a custos razoáveis.

Uma alternativa promissora é a modificação de genes de imunoglobulinas usando tecnologia de DNA recombinante. Uma abordagem para diminuir a imunogenicidade para evitar respostas imunes indesejáveis, por exemplo, é a produção de anticorpos quiméricos com as vantagens e a selec-tividade dos monoclonais de murganho, ainda que com as propriedades específicas da espécie de anticorpos humanos.

As estratégias globais aplicáveis na montagem de genes quiméricos e a produção de anticorpos quiméricos envolve processos convencionais de tecnologia de DNA recombinante (identificação e isolamento de genes Ig, inserção dos genes clonados em vectores, transfecção de linhas celulares imortalizadas, expressão de proteínas quiméricas). Dependendo da fonte dos genes a serem combinados e da natureza dos genes codificadores da região variável específica do antigénio, no entanto, surgem problemas particulares de modo que são ne- -6-

cessários novos passos para desenvolver soluções que funcionem. Vários grupos de investigação tentaram fazer por engenharia genética anticorpos quiméricos. Os seus objectivos de pesquisa diferem no entanto na abordagem conceptual e os resultados variam consideravelmente relativamente à natureza e característica das moléculas recombinantes. Têm sido produzidos anticorpos quiméricos de várias classes de imunoglobulina.

Neuberger e_t a^L. (Nature 314, 268, 1985 ) descreve um anticorpo quimérico IgE Al cuja cadeia pesada é composta por uma região constante £ humana fundida com uma região variável de ratinho especifico para o hapteno 4-hidro-xi-3-nitrofenacetilo (NP). A estratégia usada na produção do anticorpo quimérico é construir um gene quimérico codificador da cadeia pesada e introduzir este segmento de DNA quimérico na linha celular de ratinho J558L em que a cadeia pesada quimérica expressa é montada com a cadeia leve éndógena de ratinho para produzir moléculas de IgE completas.

Boulianne et al^ , (Nature 312, 643, 1984 ) conseguiram ligar as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um mieloma de ratinho anti-TNP a genes μ e k humanos , respectivamente. Os genes quiméricos foram transfectados para células de mieloma. A IgM secretada, não se mostrou no entanto, tão eficaz como a IgM original de ratinho e apresenta qualidades de ligação diferentes. A geração de imunoglobulina G quimérica por ligação de genes de região constante humana a genes variáveis de ratinho tem sido descrita por vários autores. O Pedido de Patente WO 87/02671 descreve um anticorpo quimérico que se liga a genes virais, especialmente o antigénio de superfície da hepatite B, criado a -7-

partir de uma região ^ 1 humana e de uma região variável do mieloma de ratinho CRL 8017. Os autores também constituíram um anticorpo quimérico ratinho/humano com base no anticorpo monoclonal (MAb) de ratinho L6 , tal como Lia et al. (Proc.

Natl. Acad. Sei. 84, 3439, 1987). O Mab L6 /~IgG2a(k)_7 liga--se a um antigénio tipo açúcar encontrado na superfície de células derivadas de uma variedade de carcinomas humanos. Os autores dão dados exactos para a linha celular de carcinoma do cólon humano C-3347. As regiões constantes íf 2 e K do MAb L6 foram substituídas por regiões constantes γΐ e K humanas por recombinação de módulos de cDNA codificadores de domínios da regiões constantes e vaiável.

Um outro anticorpo monoclonal quimérico dirigido contra os antigénios de superfície de carcinomas humanos foi construído por Sahagan et aJL (J. Immunol. 137, 1066 , 1986 ) que fundiram exões da região variável do anticorpo IgGl da linha celular de hibridoma de murganho B6.2 9 genes y 1/k humanos. As características de ligação da Ig quimérica foram determinadas com células humanas de carcinoma do pulmão A549.E1.

Sun et al. , (Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 214, 1987) combinaram fragmentos de DNA codificadores das regiões variáveis da cadeia H/cadeia L do anticorpo anti-carci-noma colo-rectal (ACRC), produzido pelo hibridoma de ratinho 1083-17-A com regiões humanas )f3/Ck.

Os MAbs quiméricos tratados no presente invento são dirigidos contra antigénio carcinoembrionário (CEA). CEA é uma glicoproteína imuno-reactiva complexa com um peso molecular de 180000 encontrado em adenocarcinomas de epitélios do sistema digestivo derivados da endoderme e cólon fetal. O papel dos imunoensaios de CEA para diagnóstico e controle de pacientes com cancro no que respeita a doença re-currente ou resposta a terapia tem sido largamente avaliada e documentado. Um dos principais inpedimentos ao uso de an- -8- -8-

Λ ticorpos anti-CEA para os referidos fins tem sido a reactivi-dade cruzada destes reagentes com alguns tecidos adultos aparentemente normais.

Estudos anteriores mostraram que os an-ti-soros hiperimunes mais convencionais contra CEA usando diferentes imunogénios reagem de modo cruzado com muitos tipos diferentes de carcinomas assim como com antigénios relacionados com CEA, e.g., antigénio da reacção cruzada não específica NCA , antigénio relacionado com CEA extraído de tumores TEX, vários antigénios fecais normais (NFAl, NFA2), glico-proteína I biliar e outros, encontrados na mucosa colónica normal, fígado, baço, pulmão, glândulas sudoríparas , leucócitos polimorfonucleares e monócitos de indivíduos aparentemente normais (para uma revisão cf. Herberman & Mclntire, "Immuno-diagnosis of.Câncer", Vol. 9, parte 1, N.Y., 1979). Isto significa que o anti-soro reconhece epítopos específicos de CEA sozinho assim como epítopos presentes em CEA e antigénios relacionados com CEA; sugere ainda que genes estreitamente relacionados entre CEA e antigénios relacionados com CEA assim como relações de precursor-produto entre alguns deles.

Sugeriu-se que anticorpos policlonais (coelho, carneiro) reconhecem 10-15 sítios antigénicos em CEA (Sundblad e_t al^. , Protides Biol. Fluids 7Λ_, 435 , 1976 ).

Os epítopos estão predominantemente localizados nas partes peptídicas de CEA e parecem ser fortemente dependentes da conformação. Usando anticorpos monoclonais foram detectados pelo menos 5 epítopos diferentes em CEA (Hedin et^ a_l. , Mol. Immunol. 23, 1053, 1986).

Anticorpos monoclonais anti-CEA já foram empregues na produção de anticorpos quiméricos. No pedido de patente EPO 125.023 foi usado um anticorpo Ig yl originário da linha celular de hibridoma CEA.66-E3. O anticorpo quimérico não foi caracterizado relativamente a especificidade do epítopo ou reactividade cruzada nem estão incluidos re-

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sultados de ligação ou inibição. Os inventores descrevem o uso de E. coli para a clonagem de fragmentos de DNA e a expressão dos genes quiméricos. Está bem estabelecido no entanto, que as células procarioticas não proporcionam os passos necessários para a biossintese de anticorpos tetraméricos funcionais, como seja enrolamento correcto da cadeia polipep-tídica nascente, glicosilação e montagem. Os inventores da EP 0.125.023 descrevem (Proc. Natl. Acad. Sei. _81, 3273, 1984) que não se encontra actividade de anticorpo detectável em E. coli que produz simultaneamente cadeias H e L de IgG do anticorpo de ratinho original quando preparado de acordo com a especificação da patente. A especificação dá uma lista de uma série de células hospedeiras possíveis, incluindo também células de mamífero, mas estas sugestões não são substanciadas pelos exemplos. A abordagem conceituai a produção de anticorpos quimeicos no pedido de patente atrás citado não possui portanto a base para a expressão das construções de genes recombinantes e deste modo a secreção de anticorpos mo-noclonais activos.

Objectivo do invento O objectivo do invento é a construção de novos anticorpos monoclonais quimédeos (MAbs) que .possuem determiantes da região valável de murganho e da região constante humana, .se ligam especificamente ao antigénio carcinoembrionário humano , .são produzidos num nível elevado em células de mamíferos imortalizadas, .podem ser usados para diagnóstico e fins terapêuticos.

Face á estrutura antigénica complexa da molécula de CEA, os MAbs quiméricos anti-CEA pretendidos devem ter as seguintes características: -10-

.elevada afinidade para CEA .elevada percentagem de ligação a células de carcinoma portadoras de CEA, tanto iii vitro como iri vivo, .baixa percentagem ou ausência de ligação a taidos e células normais.

Descrição do invento O invento diz respeito a anticorpos mo-noclonais quiméricos consistindo em regiões variáveis originárias de ratinho e regiões constantes humanas, que reconhecem o antigénio carcinoembrionário humano (CEA) e seus derivados . O invento relaciona-se especialmente com anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados que reconhecem epítopos de CEA não presentes no antigénio de reac-ção cruzada não específica NCA, como seja NCA^^ e NCA^ (Bu-chegger et al. , Int. J. Câncer 3_3, 643, 1984), na glicopro-teína biliar ou em granulocitos. São preferidos os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados com uma afinidade de pelo menos 2,1 x 10^ litros/mol para CEA humano.

Para a produção de um anticorpo monoclo-nal quimérico, uma cadeia leve quimérica e uma cadeia pesada quimérica, cada uma delas compreendendo uma região constante e uma região variável, são construídas separadamente e são portanto distinguidas nesta descrição com especial enfásis na região variável de cada uma das construções quiméricas. O anticorpo monoclonal quimérico preferido do invento e seus derivados são caracterizados por compreenderem regiões variáveis da cadeia leve da fórmula -11-

FRi-Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Ser-Leu-His-FR2-I- CDRlL —-1

Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser-FRj-Gln-Gln-Ser-His-Gly-Trp-Pro-Phe-Thr-FRi, I-- CDR2L -1 I- CDR3L -1 (I), em que FR-^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 23-28 ami-noácidos naturais , FR2 é um resíduo polipeptidico compreendendo 14-16 aminoácidos naturais, FR^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 30-34 aminoácidos naturais e FR4 é um resíduo polipeptidico compreendendo 9-11 aminoácidos naturais e em que o aminoácido Cis pode estar no estado oxidado formando pontes S-S. São especialmente preferidos um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I, em que os resíduos po-lipeptidicos das regiões de estruturas FR^, FR^, FR^ e FR^ são os que ocorrem preferêncialmente em mamíferos, especialmente anticorpos de ratinho. São ainda mais preferidos um anticorpo monoclonal quimérico e um derivado de acordo com o invento compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I, em que FR^ é um resíduo polipeptidico de fórmula A-Gly-Asp-Ile-Leu-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Leu-Ser-Val-Ser-Pro-

Gly-Glu-Arg-Val-Thr-Phe-Ser-Cys (IA), em que A é hidrogénio, acilo ou o resíduo Ala-Ser-Arg, Ser-Arg ou Arg, particularmente hidrogénio, FR^ é o resíduo polipeptidico

Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Thr-Asn-Gly-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Met-Lys (IB), -12-

FR3 e o resíduo polipeptídico 01y-n.-Pro-s.r-Arg-Phe-s.r-C1)-S.r-01y-S.c-My-Ihr-A,p-Ph.-Ihr-L.„.

Thr-Ile-Asn-Ser-Val-Glu-Ser-Glu-Asp-He-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys (IC), e FR^ é o resíduo polipeptidico

Phe-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys (ID), e em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. O invento também esta relacionado com um anticorpo monoclonal quimeico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da formula I em que FR2 / FR2 / FR3 e fr4 são resíduos polipeptídicos da fórmula IA, IB, IC e ID, respectivamente e em que um ou mais , e.g. , 1,2,3, ou 4 aminoácidos isolados são substituidos por outros aminoácidos fora das regiões CDRlL, CDR2L e CDR3L e em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. O anticorpo monoclonal quimérico do invento e seus derivados são caracterizados por compreenderem regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula FRs-Thr-Tyr-Ala-Met-Ala-Trp-Val-FRe-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Thr-Tyr-Tyr-Pro- I- CDR1H -1 I-----

Asp-Ser-Val-Lys-Gly-rR7-Gly-Phe-Tyr-Asp-Gly-Tyr-Leu-Tyr-Val-Val-FR8 - CDR2H -1 I--- CDR3H---1 (II),

em que FRg é um resíduo polipeptídico compreendendo 32-36 aminoácidos naturais, FRg é um resíduo polipeptídico compreendendo 14-16 aminoácidos naturais, FR^ e um resíduo poli-peptidico conpreendendo 32-34 aminoácidos naturais e FRg é um resíduo polipeptídico compreendendo 12-14 aminoácidos naturais e en que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. São especialmente preferidos um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis na cadeia pesada da fórmula II, em que os resíduos polipeptídicos das regiões de estruturas FRg, FR^, FRg e FR^ são as que ocorrem preferêncialmente em mamíferos, especialmente anticorpos de murganho. São mais preferidos um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados de acordo com o invento compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada da fórmula II, em que FRg é um resíduo polipeptídico da fórmula B-Gly-Val-Gln-Cys-Glu-Val-Lys-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Arg (HA), em que B é hidrogénio ou acilo, particularmente hidrogénio, FRg é o resíduo polipeptídico

Arg-Gln-Thr-Pro-Glu-Lys-Arg-Leu-Glu-Trp-Val-Thr-Ser-Ile (IIB), FR^ é o resíduo polipeptídico -14-

Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Arg-Asn-Ile-Leu-Tyr-

Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Ile-Tyr-Tyr-Cys-

Ala-Arg (IIC), e FRg é o resíduo polipeptidico

Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Ser-Leu-Thr-Val-Ser-Ser (IID), e em que o aminoácído Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. O invento também está relacionado com um anticorpo monoclonal quimérico e seusderivados compreendendo reqiões variáveis de cadeias pesadas de fórmula II, em que FR,. , FRg, FR η e FRg são resíduos polípeptídicos da fórmula IIA, IIB, IIC e IID, respectivamente e em que um ou mais aminoácidos isolados, e.g., 1,2,3, ou 4 são substituídos por outros aminoácidos fora das regiões CDR1H, CDR2H e CDR3H e em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S.

As regiões variáveis de cadeia leve da fórmula IA e as regiões variáveis de cadeia pesada da fórmula IIA podem compreender um resíduo acilo, por exemplo formilo ou alcanoilo, e.g., palmitoilo, miristoilo ou alcanoilo inferior como seja acetilo ou propionilo. A classe de uma molécula de Ig é definida por regiões constantes da cadeia H e L como foi dito atrás. Um anticorpo monoclonal quimérico do invento pode ser de qualquer classe de imunoglobulina, i.e. IgA, IgD, IgE,

IgG ou IgM. De acordo com o presente invento um anticorpo monoclonal quimérico preferido é uma imunoglobulina da cias- -15-

se G que compreende as regiões constantes de cadeia leve humana K ou , especialmente regiões constantes humanas K e regiões constantes humanas da cadeia pesada V"1, γ2, r 3 ou Γ 4, especialmente regiões constantes humanas Y4.

Preferêncialmente o invento diz respeito a um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados com regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I com o significado preferido, em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S, regiões constantes da cadeia leve humana K, regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula II com o significado preferido, em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S e regiões constantes da cadeia pesada humana ^ 4.

Derivados de anticorpos monoclonais quiméricos de acordo com o invento são, por exemplo, fragmentos que retêm a sua especificidade para os determinados antigé-nios da molécula de CEA, como sejam o fragmento univalente Fab e o fragmento divalente F(ab’)2, conjugados dos anticorpos monoclonais quiméricos com enzimas, marcadores fluorescentes, quelatos de metais, substâncias citostáticas ou cito-tóxicas avidina, biotina e similares e anticorpos marcados radioact ivamente.

Enzimas usadas para conjugação de anticorpos do invento são, por exemplo peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, ^3-D-galactosidase, glucose-oxi-dase, glucoamilase, amidase carbónica, acetilcolinestearase, lisozima, malato-desidrogenase ou glucose-6-fosfato-desidro-genase.

Marcadores fluorescentes conjugados com anticorpos quiméricos podem ser fluoresceína, fluorocromo, rodamina e similares.

Em tais conjugados o anticorpo é ligado -16-

às enzimas ou marcas fluorescentes directamente ou através de um grupo espaçador ou adaptador. São exemplos de quelatores de metais ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotria-minopentacético (DPTA), 1,4,8,11-tetra-azatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetra-azatetradecano-l,4,8 ,11-tetra-acético , ácido l-oxa-4,7,12,15-tetra-aza-heptadecano-4 ,7,12,15-tetracético ou similares. Citostáticos , aplicáveis com os anticorpos quiméricos, são, inter alia , substâncias alquilantes, como sejam mecloretamina , trietilenofosforamida , ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfano, melfalano ou triaziquo-na, também compostos de nitrosureia, tais como carmustina, homustina ou semustina. Podem-se usar também antimetaboli-tos, tais como metotrexato, mercaptopurina, citarabina, fluo-rouracilo, fluxuridina ou ftorafur. Ainda outro grupo de citostáticos inclui vimblastina e vincristina, assim como certos antibióticos, tais como actinomicina D, daunorrubicina (daunomicina), doxorrubicina , nitroamicina , estreptomigrina , mitomicina e bleomicina. Ainda outros citostáticos adequados são, inter alia, procarbacina, hidroxiureia, L-asparagi-nase, dacarbazina, mitotano, estramustina ou podofilotoxina. Outros agentes citostáticos podem ser hormonas e antagonistas de hormonas, tais como corticosteróides, e.g. prednisara, progestinas, e.g. hidroxiprogesterona ou medroprogesterona, estrogénios, e.g. dietilestilbestrol, anti-estrogénios, e.g. tamoxifeno, androgénios, e.g. testosterona e inibidores de aromatase, e.g. amino glutetimida.

Os conjugados de anticorpos monoclonais quiméricos com substâncias citostáticas contêm a toxina in-tacta ou a cadeia A derivada dela. Toxinas adequadas ao acoplamento com anticorpos são, entre outros, vários lectinas, tais como ricino ou abrina ou toxina A da difteia e similares .

Anticorpos monoclonais quiméricos mar-

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cados (123ι radioactivamente contêm e.g. iodo radioactivo 125T 131T> ,90vl , .. ,99mm . . . I, I), ítrio ( X), tecnetxo ( Tc), ou simi lares .

Os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados de acordo com o invento são preparados por processos conhecidos per se caracterizados por células de mamífero conforme definidos mais abaixo produtoras de tais anticorpos monoclonais quiméricos serem multiplicados de acordo com métodos conhecidos iji vitro ou in^ vivo e, caso se pretenda , os anticorpos monoclonais resultantes são convertidos nos seus derivados. A multiplicação iii vitro é efectuada em meio de cultura adequado, que são os meios de cultura convencionais, por exemplo Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) ou meio RPMI 1640, facultativamente complementado com um soro de mamífero, e.g. soro fetal de vitela ou micronutrien te e suplementos que suportam o crescimento, e.g. células de suporte como sejam células normais do exudado peritoneal de ratinho, células do baço, macrófagos da medula óssea ou similares .

Uma vez que as células produtoras de anticorpos são portadoras de uma marca selectiva descrita de-talhadamente abaixo, o meio de cultura pode ser suplementado com meios selectivos, por exemplo meios contendo G-418 ou xantina, hipoxantina/timidina e ácido micofenólico, de modo a evitar que células normais cresçam mais do que as células produtoras. A produção in vitro permite aumentar de escala para se obter grandes quantidades dos anticorpos pretendidos. As técnicas para cultura de células de mamífero nas condições de cultura de tecidos são conhecidos e incluem culturas homogéneas em suspensão, e.g. num reactor pneumático ou num reactor de agitação contínua ou cultura de células imo- bilizadas, e.g. em fibras ocas, microcápsulas ou microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica.

Os sobrenadantes das culturas celulares são testados quanto aos anticorpos monoclonais pretendidos, preferêncialmente com um imunoensaio enzimático, e.g. um ensaio de pontos ("dot-assay" ) ou um radioimunoensaio.

Para o isolamento dos anticorpos monoclonais quiméricos, as imunoglobulinas nos sobrenadantes das culturas são primeiro concentradas, e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico como seja PEG, filtração através de membranas selectivas ou similares. Caso seja necessário e/ou pretendido, os anticorpos concentrados são purificados por métodos de cromatografia convencionais, por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em DEAE-celulose ou cromatogra-fia de (imuno) afinidade.

Grandes quantidades dos anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos também podem ser obtidos por multiplação das células in vivo Com este fim, clones de células de uma linha celular histocompatível e/ou tolerada produtora de Ig são injectadas em mamíferos singeneicos para provocar crescimento de tumores produtores de anticorpos. Facultativamente, os animais são sensibilizados com um hidrocarbo-neto, especialmente óleos minerais como seja pristano (tetra-metilpentadecano) antes da injecção. Após 1-3 semanas, os anticorpos são isolados do corpo daqueles mamíferos. Por exem pio, células de hibridoma derivadas de ratinhos Balb/c que pro duzem os anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos são injectados dos intraperitonealmente em ratinhos Balb/c que foram facultativamente pré-tratados com um hidrocarboneto como seja o pristano e após 8-10 dias, coelhe-se o líquido ascíti-co destes animais. Os anticorpos monoclonais quiméricos são isolados a partir dele por meios convencionais como descrito atrás. -19-

Fragmentos de anticorpos monoclonais quiméricos que retêm a sua especificidade contra CEA, humano, por exemplo fragmentos Fab ou F(ab')2 podem ser obtidos a partir de um anticorpo quimérico preparado como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e-g. por manipulação genética dos exões codificadores de Ig adequados, por digestão com enzimas tais como papaína ou pepsina e/ou clivagem de pontes dissulfureto por redução química.

Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos, e.g. por reacção de um anticorpo monoclonal preparado como descrito atrás com a enzima na presença de um agente de acopiamento, e.g. glutaraldeído periodato, N,N'-o-fenilenodimaleimida , N--(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-/_2'-piridilditio7--propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil )--carbodiimida ou similares. Os conjugados com avidina são preparados de modo semelhante. Os conjugados com biotina são preparados e.g. por reacção de anticorpos monoclonais com um éster activado de biotina como seja o éster biotina N-hidroxi--succinimida. Os conjugados com marcas fluorescentes são preparados na presença de um agente de acoplamento, e.g. os referidos atrás ou por reacção com um isotiocianato, de preferência isotiocianato de fluorescéina. Os conjugados dos anticorpos quiméricos do invento com substâncias citostáticas/ /citotoxicas e quelatores de metais são preparados de modo análogo.

Os anticorpos monoclonais quiméricos 125 131 marcados radioactivamente com iodo (1231, I, I) são obtidos a partir dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento por iodinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou potássio radioactivo e um agente oxidante químico, como seja hipoclorito de sódio, cloaramina T ou similares ou um agente oxidante enzimático como seja a lactoperoxidase, glucose-oxidase e glucose. Os anticorpos monoclonais quiméricos de acordo com o invento são acoplados a ítrio (90γ) por -20-

exemplo por quelatação com o ácido dietilenotriaminopentacé-tico (DTPA ). Os anticorpos quiméricos marcados com tecnétio--99m são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de pertecnato (TcC>4 ) com solução de ião estanhoso, quelatação do tecnétio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicação dos anticorpos a esta coluna, ou por técnicas de marcação directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente redutor como seja SnC^ , uma solução tampão como seja uma solução de ftalato de sódio-potássio e os anticorpos . O invento também diz respeito a DNAs recombinantes compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável da cadeia leve de murganho e/ou região variável da cadeia pesada de murganho de anticorpos monoclonais quiméricos específicos para CEA humano como aqui descrito atrás. Por definição tais DNAs compreendem DNAs codificadores de cadeia simples e de cadeia dupla consistindo nos referidos DNAs codificadores e em DNA, complementares deles ou os próprios DNAs complementares (cadeia simples).

Em particular o invento diz respeito a um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável da cadeia leve de murganho específica de CEA humana, originando em DNA genómico da linha celular CE25. A linha celular CE25 foi gerada pela fusão de linfóci-tos B do baço de ratinhos Balb/c e células do mieloma P3-NS2/ /lAg4 e produz um anticorpo anti-CEA de murganho com uma cadeia leve K e uma cadeia pesada 1. E preferido um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora do polipeptideo da fórmula I, facultativamente contendo intrões , especialmente uma inserção codificadora do polipeptideo da fórmula I em que FR^, FR^, FR2 e FR^ são resíduos polipeptídicos da fórmula IA, IB, IC e -21- \ ID, respectivamente facultativamente contendo intrões.

Um exemplo de tal DNA recombinante preferido é um DNA recombinante compreendendo uma inserção da fórmula TCTAGACTGCTGTGGTCTTTTAAGTAGCATGAAAAACATCTGCTAAAGAAGGAATTAGTT 1----r----+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 TGAACATGCTAGAAATACATCTGTGATACTCTCATCACTCTTGTTGGAAAGATATGCAAG 61 —-------+-----————+-----—---·)-----—μ 120 AAGCACTATTTGGCTATTATTTGGAAAGTGCTATAATGTATTTTGATATCTCAACCTCTG 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AAATTCTTCTGTATGTTGGCAGATTGTAAACCTTTACAAGGCTTTCATTCTCTTCTCTGG 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 AGAAAAATGTCTTTGTAGGCAATCCAGAATTTCTTATTTCTTGCTAATGAAATCTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200 GTGTGATATCACTTTAGTTTCATGTGTTGTTATGCTTCATGTAATGTTAAGAAAGTTAAA 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 GATGCTCCAATCCATATTGTAAGAAACATTCCAAGCCATGGAATAAGGCATGGATTTGAG 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 ATGCTCTTTATTTCAAACTACTGAATATATCTTAGAGATTTCTTTAGACTGTGTTAAATA 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 TGTAACCATTTAAGTAGGAGTCAAGTCTCCTTTAAATCTCAACAGCTCTTCAGGTAACCA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 ACAAAAGGATAAATATTCTAATAAGTCACTAGGAGCATGCTCTTCTGACCAGGTCTTTCT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TATAAGCAACATGAAGACAGTATGATTTGCATAAGTTTTTCTTTCTTCTAATGTCCCTGC 601---—————+------———+---------+—---————"t-----------f·---------—μ 660 CTCTTAGAGTATTATAAGAAGATCTTTCTAGGGATGTGTCATGGTCCACACAAAAATAGG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

MVSTPQFLVFLLFWIP

MetValSerThrProGlnPheLeuValPheLeuLeuPheTrpIlePro GAAAGTGTGAAGATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCA 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 GGTAATGACTGTTTGGGTGTGGCAAAAAAGTGGAGATGTTATTTAAATACAAAATTTTCT 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 TGCTTTATTTGGAAGCCAATGTCACATGGGAATTGACTTTCAGTTTAAAGAAATTGATAC 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 AATAAAAGTCATTTATTTTTCTAAGTTGTTTAGAAGTGACTTTCATATTCAGTGTTATGA 901---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 -22-

ASRGDILLTQS AlaSerArgGlyAspIleLeuLeuThrGlnSer TCGACTAATGTATCTTCCATTTTTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCT 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 PAILSVSPGERVTFSCRASQ ProAlalleLeuSerValSerProGlyGluArgValThrPheSerCysArgAlaSerGln CCAGCCAT CCT GTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCACTTTCTCCTGCAGGGCCAGT C AG 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 SIGTSLHWYQQRTNGSPRLL SerlleGlyThrSerLeuHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySerProArgLeuLeu AGCATTGGCACAAGCTTACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTC 1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 MKYASESI S G'IPSRFSGSGS MetLysTyrAlaSerGluSerlleSerGlylleProSerArgPheSerGlySerGlySer ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA 1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 GTDFTLTINSVESE DIADYY GlyThrAspPheThrLeuThrlleAsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyr GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAC 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 CQQSHGWPFTFGSGTKLEIK CysGlnGlnSerHisGlyTrpProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluIleLys TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320

CGTAAGTGGACTTTTGTTCATTTACTTGTGACGTTTTGGTTCTGTTTGGGTAGCTTGTGT 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380

GAATTTGTGATATTT 1381 ---------+----- 1395 ' (III).

Um DNA recombinante compreendendo uma inserção da fórmula III em que um ou mais , e.g., até 10, nu-cleotideos isolados são substituídos por outros nucleotídeos fora das sequências nucleotidicas da fórmula III desde a posição 1069-1102, 1147-1167 e 1263-1291, respectivamente, é também preferido. -23-

Em particular, o invento também diz respeito a um DMA recombinante compreendendo uma inserção codificadora de uma região variavel da cadeia pesada de murganho especifica para CEA humano, originando em DNA genómico da linha celular CE25. É preferido um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora do polipeptídeo da fórmula II, facultativamente contendo intrões , especialmente uma inserção codificadora do polipeptídeo da fórmula II em que FR^, FRg, FR? e FRg são resíduos polipeptidicos da fórmula IIA, IIB, IIC e IID, respectivamente, facultativamente contendo intrões.

Um exemplo de tal DNA recombinante preferido é um DNA recombinante compreendendo uma inserção da f órmula -24-

AAGCTTGTTCTGTTCACATGCAAGGAGGGAAACTAAACTGAGTATGGTGAATCCCTAACC } ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AAACGGAAAAAATGAAACTACAATATGTTTCAAATGCTGTAACTGAAATCTGGTTTTTTG 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

ATGCCTTATATCTGGTATCATCAGTGACTTCAGATTTAGTCCAACCCCAGAGCATGGTAT 121 ---------+---------4---------+---------+---------+---------+ 180 AGCAGGAAGACATGCAAATAAGTCTTCTCTCTGCCCATGAAAACACCTCGGCCCTGACCC 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGCAGCTCTGACAGAGGAGGCCAGTCCATGGATTTGAGTTCCTCACATTCAGTGATGAGC 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 MNFGFSLIFLVLV MetAsnPheGlyPheSerLeuIlePheLeuValLeuVal ACTGAACACAGACACCTCACCATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTT 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 L K G LeuLysGly TTAAAACGTAATTTATTGAGAAGAGATGACATCTATTTTACGCACATGAGACAGAAAAAA 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 V Q ValGl TGTGGTTTGTTTTGTTAGTGACAGTTTTCCAACCAGTTATTCTCTGTTTGTAGGTGTCCA 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 CEVKLVESGGGLVKPGGSLK nCysGluValLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLy GTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA 481 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 540 LSCAASGFTFRTYAMAWVRQ sLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheArgThrTyrAlaMetAlaTrpValArgGl ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACTTTCAGGACCTATGCCATGGCTTGGGTTCGCCA 541 ---------4---------4---------4---------4---------4---------4 600

TPEKRLEWVTSISSGGTTYY nThrProGluLysArgLeuGluTrpValThrSerlleSerSerGlyGlyThrlhrTyrTy GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCCATTAGTAGTGGTGGTACCACCTACTA 601 ----------1·----————4--- f----------í-----------f---------+ 660

PDSVKGRFTISRDNARNILY rProAspSerValLysGlyArgPheThrlleSerArgAspAsnAlaArgAsnlleLeuTy

TCCAGACAGTGTGAAGCGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTA 4---------4---------4---------4---------4---------4 720 661 -25-

LQVSSLRSEDTAIYYCARGF rLeuGlnValSerSerLeuArgSerGluAspThrAlalleTyrTyrCysAlaArgGlyPh CCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAGAGGTTT 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 YDGYLYVVDYWGQGTSLTVS eTyrAspGlyTyrLeuTyrValValAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerLeuThrValSe CTATGATGGTTACCTCTATGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCACCGTCTC 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

S rSer CTCAGGTAAGAATGGCC 341---------+-------857 (IV).

Um DNA recombinante compreendendo uma inserção de fórmula IV em que um ou mais, e.g. até 10, nucleo-tídeos isolados são substituídos por outros nucleotideos fora das sequências nucleotídicas da fórmula IV da posição 575-595, 629-680 e 776-805, respectivamente é também preferido.

Para a montagem de moléculas de imuno-globulina tetraméricas completas e expressão de anticorpos ac-tivos, as inserções de DNA recombinante codificadoras de regiões variáveis da caõbLa pesada e leve são fundidas com os correspondentes DNAs codificadores das regiões constantes das cadeias leve e pesada, depois incorporadas em vectores híbridos e transferidos para células hospedeiras adequadas com a ajuda destes vectores híbridos.

Portanto, o invento diz também respeito a DNAs recombinantes compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável de cadeia leve de murganho específica -26-

para CEA humano fundida com uma região constante humana K ou γ . É preferido um DNA recombinante codificador de uma região variável preferida de murganho conforme aqui descrito fundidos com uma região constante k humana.

Assim, o invento diz respeito a DNAs recombinantes compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável da cadeia pesada de murganho especifica para CEA humano fundida a uma região constante ^ humana, por exemplo ^1, tf 2 , f3 ou (Γ 4. Ê preferido um DNA recombinante codificador de uma região variável de murganho conforme aqui descrito atrás fundida com uma região constante ^ 4 humana. O invento diz ainda respeito a um DNA recombinante que é um vector híbrido compreendendo uma inserção codificadora de uma cadeia leve quimérica, murganho/humano conforme aqui descrito atrás e/ou uma inserção codificadora de uma cadeia pesada quimérica murganho/humano conforme aqui descrito atrás , um replicão completo e uma ou mais sequências de marcas dominantes, facultativamente ligadas a sequências de controle de expressão

As marcas permitem a selecção de células hospedeiras que possuam o vector. As marcas de selecção incluem genes que conferem resistência a metais pesados, e.g. cobre, antibiótico, e.g. G-418 (geneticina , um derivado da neomicina) ou higromicina ou genes que complementam uma lesão genética da célula hospedeira como seja a ausência de timidi-na cinase, hipoxantina fosforiltransferase , di-hidrofulato--reductase ou similares. Em adição, os vectores híbridos contêm facultativamente sequências sinal, um ou mais sítios de restrição disponíveis para inserção de um gene estrutural, potenciador e/ou sequências de controle da expressão. Pode--se usar uma grande variedade de sequências reguladoras da transcrição e tradução, dependendo da natureza do hospedeiro. Os vectores preferidos são adequados aos hospecfeLros mamíferos -27-

e são baseados em sistemas de replicação virai, como seja vírus símio 40 (SV40), vírus do sarcoma de Rous (RSV), adenoví-rus 2, vírus do papiloma bovino (BPV), mutante BK dos papova-vírus (BKV) ou citomegalovirus (CMV) de murganho ou humanos. Como alternativa, os vectores podem conter promotores de produtos de expressão de mamíferos, como seja actina, colagénio, miosina, etc., ou as sequências nativas do promotor e de controle que estão normalmente associadas com as sequências do gene da imunoglobulina. Os potenciadores são sequências de DNA estimuladoras de transcrição de origem virai, e.g. derivadas de vírus símios tais como SV40, vírus polioma, vírus de papiloma bovino ou vírus do sarcoma de Moloney, ou genómicos, especialmente derivadas de murganhos (potenciador da Ig de ratinho). Uma origem de replicação pode ser proporcionada pela construção de vector de modo a incluir uma origem exógena, como seja derivada de SV40 ou outra fonte virai ou pelo mecanismo de replicação cromossómica da célula hospedeira. São exemplos de vectores preferidos os derivados de vectores pSV em que uma marca selectiva é colocada sob o control do promotor precoce do SV40, em particular pSV2gpt portador do gene da xantina-guanina fosforribosil-transferase e pSV2neo, portador do gene da fosfotransferase.

As construções de genes quiméricos para a cadeia leve e para a cadeia pesada são sequênciada ou simultâneamente transferidos para as células hospedeiras com a ajuda de dois vectores. Como alternativa, as cadeias leve e pesada são clonadas no mesmo vector híbrido e incorporadas segundo um processo de um único passo e como uma única construção nas células hospedeiras.

Os DNAs recombinantes codificadores dos anticorpos monoclonais quiméricos pretendidos podem ser preparados, por exemplo, por cultura de um hospedeiro transformado .

Em particular, tais DNAs podem ser pre- -28-

parados por a) isolamento de DNAs de murganho a partir de uma linha celular de hibrídoma, selecçâo dos DNAs pretendidos codificadores das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais dirigidos contra CEA humano usando sondas de DNA, b) isolamento de DNAs humanos a partir de uma biblioteca ge-nómica, selecçâo dos DNAs pretendidos codificadores das regiões constantes dos anticorpos monoclonais usando sondas de DNA, c) construção de genes quiméricos ratinho/humano por incorporação do DNA do passo a) e b) nos vectores híbridos adequados , d) transferência dos vectores híbridos obtidos para uma célula hospedeira recipiente e e) selecçâo e cultura do hospedeiro transformado. 0 DNA de acordo com o passo a) do processo descrito atrás pode ser obtido por isolamento de DNA genómico ou por preparação de cDNA a partir de mRNA isolado. CJma vez que construções de DNA genómico facilitam a expressão dos genes prefere-se a preparação e uso de DNA genómico. 0 DNA genómico derivado de células de hibridoma é isolado por métodos conhecidos que incluem passes para a disrupção das células, e.g., por lise na presença de detergentes tais como o Triton , extraeção do DNA, e.g. por tratamento com fenol e CHCl^/álcool isoamílico e precipitação do DNA. O DNA é fragmentado, convenientemente por uma ou mais enzimas de restrição, e.g. Xbal, BgLL, EcoRI, HindIII, BamHI, os fragmentos resultantes são replicados num veículo adequado, e.g. membranas de nitrocelulose e despistados com uma sonda de DNA como descrito mais detalhadamente abaixo quanto á presença de sequências de DNA codificadoras da sequência polipeptídica com interesse, em particular quanto a presença dos loci dos genes das cadeias H eL de Ig. Por este processo encontram-se fragmentos de DNA que contêm inserções com regiões V, D e J da cadeia pesada e região V e J da cadeia leve, respectivamente, juntamente com uma sequência condutora e intrões. -29- -29-

\ DNA genómico humano de acordo com o passo b) doprocesso descrito atrás é isolado a partir de tecido humano adequado, de preferência a partir de placenta humana ou de células de fígado fetal humano, de acordo com métodos conhecidos. Constrói-se uma biblioteca de DNA genómico a partir dele por digestão limitada com endonucleases de restrição adequadas, e.g. HaelII e Alui e incorporação no fago X Charon , e.g. Charon 4a, seguindo processos estabelecidos. A biblioteca de DNA genómico é replicada, e.g. em membranas de nitrocelulose e despistado com uma sonda de DNA como descrito abaixo para as sequências de DNA com interesse. A sonda de DNA para as regiões variáveis de ratinho ou das regiões constantes humanas pode ser um DNA shtético, um cDNA derivado de mRNA codificador da imu-noglobulina pretendida ou um DNA genómico ou fragmento de DNA de sequência nucleotídica conhecida. De preferência usa-se uma sonda de DNA genómico ou fragmento de DNA. Como sondas para a detecção de loci rearranjados do gene de IgG das regiões variáveis das cadeias L/H, seleccionam-se fragmentos de DNA de sequências nucleotidicas das regiões adjuvantes conservadas variáveis ou constantes que constituem o loci Ig da cadeia L/H no mamífero do qual deriva o DNA, e.g. ratinhos Balbk. A utilização de sondas de DNA de murganho para a detecção de sequências de DNA humano baseia-se nas homologias de sequências entre DNAs de murganho e humano. A sonda de DNA é isolada a partir de tecido adequado de um mamífero apropriado, e.g. fígado de ratinho Balb/c, purificada por clona-gem molecular em bacteriófago >Λ- e subclonagem dos fragmentos de DNA adequados em vectores plasmideos adequados, tais como pUC12 ou pUC13 e recuperação/purificação das inserções da DNAs clonados usando processos convencionais. 0 DNA sonda purificado é marcado, e.g. marcado radioactivamente pela conhecida técnica de "nick-translation" , depois hibridado com a biblioteca de DNA humano em soluções de tampão e de sais contendo aditivos, e.g., quelatores de cálcio, compostos reguladores da viscosidade, proteínas DNA não específicas e simila- -30-

res, a temperaturas que favoreçam a hibridação selectiva.

Uma vez identificado um fragmento que contem a sequência de DNA pretendida, este fragmento pode ser ainda manipulado para remover DNA não essencial, modificado num ou em ambos os extremos e tratado para remover todas ou uma porção das sequências intervenientes, ou similares. A ligação dos vários fragmentos de DNA de modo a produzir genes quiméricos é efectuada de acordo com técnicas convencionais , por exemplo por ligação de extremos cegos, digestão com enzimas de restrição para dar os extremos coesivos adequados, preenchimento dos extremos coesivos se fôr adequado, tratamento co m fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas. A transferência dos DNAs recombinantes, e.g. a transferência de vectores híbridos e a selecção de células transformadas está descrita abaixo.

Ainda, o invento está relacionado com células hospedeiras transformadas com os DNAs recombinantes descritos atrás , nomeadamente células hospedeiras que são trans formadas com um DNA codificador da cadeia leve e/ou um DNA codificador da cadeia pesada do anticorpo quimérico pretendido .

As células hospedeiras do presente invento têm de ser cultiváveis _in vitro e têm de ser derivadas de eucariotas superiores para proporcionar um ambiente adequado à produção de anticorpos activos, uma vez que a biossínte-se de moléculas de anticorpos tetraméricas funcionais requere enrolamento correcto das cadeias polipeptídicas nascentes, gli-cosilação e montagem. São exemplos de células hospedeiras adequadas de acordo com o invento as células de mamífero, e.g. células COS-7, células de melanoma de Bowes, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de pulmão embrionário -31-

L-132 e em partículas células de mamífero de origem linfóide, como sejam células de mieloma ou de linfoma, por exemplo células Sp2/0. Sp2/0 (ATCC CRL 1581) é uma linha celular de ratinho não secretora de Ig bem caracterizada, derivada da fusão de células de baço de ratinho com o mieloma X63-Ag8. Estas células hospedeiras são transfectadas com a construção de genes quiméricos da cadeia H sozinha, com a construção do gene da cadeia L sozinha ou com ambas , transferidas com a ajuda de dois vectores separados ou usando um vector de dupla construção (cadeia L/cadeia H) conforme aqui indicado ante-riormente. São particularmente preferidas as células hospedeiras transfectadas com ambas as construções de genes , as quais são transferidas com a ajuda de dois vectores separados, que secretam anticorpos monoclonais quiméricos com uma afinidade para CEA como aqui descrito atras, por exemplo células da linha celular EFVIII/ Y4Na 75-75/CKGa 5-6 (referidas como CE75-5-6). São também particularmente preferidas as células hospedeiras transfectadas com ambas as construções de genes , as quais são simultaneamente transferidas com a ajuda de um vector de dupla-construção, que secretam anticorpos monoclonais quiméricos do invento, por exemplo células de linha celular EFIX-pCEA-Ig-( γ 4; CK) (referidas como CE 4-8-13). Outros exemplos das células hospedeiras do invento são as células transfectadas com plasmideos recombinan-tes semelhantes que contêm orientações alternativas das construções de genes das cadeias H e L, tendo incorporados outros elementos de DNA para facilitar níveis elevados de expressão dos anticorpos monoclonais quiméricos.

As células hospedeiras do inento são genéticamente estáveis, secretam anticorpos monoclonais quiméricos do invento de especificidade constante e podem ser activados a partir de células congeladas por descongelação e reclonagem. O invento também esta relacionado com processos para a preparação de células hospedeiras secretoras -32-

de anticorpos monoclonais quiméricos com especificidade para CEA conforme descrito atrás, caracterizado por uma célula adequada ser transformada com um ou dois vectores, e.g. por elec-troeluição, tratamento com cálcio, microinjecção ou fusão de protoplastos.

Os vectores são introduzidos em células de mamífero por transfecção na presença de compostos auxiliares, e.g, dietilaminoetildextrano, dimetilsulfóxido, glicerol , polietilenoglicol ou similares ou como coprecipitados de DNA vector e fosfato de cálcio. Outros métodos adequados incluem microinjecção directa de DNA vector no núcleo celular, fusão de protoplastos e electroporação, i.e. introdução de DNA através de um curto pulso electrico que transitoriamente aumenta a permeabilidade das membranas celulares. A selecção subsequente das células transfectadas pode ser feita usando uma marca selectiva que é covalentemente integrada no vector de expressão ou adicionada como entidade separada. As marcas selectivas incluem genes que conferem resistência a antibióticos, e.g. G-418 (geneticina, um derivado da neomicina) ou higromicina ou genes que complementam uma lesão genética da célula hospedeira como seja a ausência de timidina cinase, hipoxantina fosforribosil-transferase di-hidrofolato-reducta-se ou similares.

Os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados de acordo com o invento são usados numa série de aplicações, especialmente para o diagnóstico e terapia do cancro.

Um exemplo do uso em diagnóstico é a determinação qualitativa e quantitativa do antigénio carcino-embrionário humano, especialmente em fluidos biológicos. Os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios conhecidos per se que utilizam as interacções de ligação entre antigénio e anticorpo monoclonal, como sejam radioimunoensaios (RIA), imunoensaios -33-

com enzimas, testes de imunofluorescência, aglutinação de látex ou hemaglutinação.

Pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas do RIA por exemplo RIA em fase homogénea, RIA em fase sólida ou RIA heterogéneo, RIA simples ou RIA duplo (sanduíche) com determinação directa ou indirecta (competitiva) de CEA. É preferido uma RIA tipo sanduíche em que um veículo adequado por exemplo a superfície de plástico de uma placa de microtitulação ou de um tubo de ensaio, por exemplo polistireno, polipropileno ou cloreto de polivinilo , esferas de vidro ou de plástico, papel de filtro ou dextrano, acetato de celulose ou folhas de nitrocelulose ou similares é revestida com um anticorpo contra CEA por simples adsorção ou facultativamente após activação do veículo, por exemplo com glutaraldeido ou brometo de cianogénio e incubada com a solução a testar e uma solução de um anticorpo marcado radio- 125 actxvamente com I, o anticorpo dissolvido reconheosrtdo um outro epitopo de CEA que não o do anticorpo ligado ao veículo e a quantidade de CEA é determinada medindo a radioactivida-de ligada ao veículo. Um dos dois anticorpos usados na RIA em sanduíche é um anticorpo monoclonal quimérico do invento, o outro pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal conhecido anti-CEA ou também umanticorpo químáico de acordo com o invento.

Os anticorpos monoclonais quiméricos de acordo com o invento podem ser usados tal ou na forma de derivados conjugados com enzimas num imunoensaio com enzimas. Tais imunoensaios incluem processos de testes em que são usados os derivados do anticorpo monoclonal quimérico marcado com enzima de acordo com o invento ou anticorpo marcados com enzima conhecidas per se que reconhecem e ligam um epitopo dos anticorpos de acordo com o invento. A quantidade de antigénio é determinada num complexo cascada de antigénio-anticorpo com a ajuda de um teste enzimático. -34-

É preferido uma ELISA (ensaio imunosor-vente ligado a enzimas) em que um veículo como descrito acima para uma RIA é revestido com um anticorpo anti-CEA e incubado com uma solução a testar contendo CEA. Apos ligação de CEA, adiciona-se um segundo anticorpo dirigido contra CEA o qual se liga ao complexo anticorpo-antigénio. Os anticorpos ligados são reveladas por um terceiro anticorpo marcado com enzima especifica para a região constante do segundo anticorpo. A quantidade de CEA é determinada por uma reacção enzima-subs-tracto. Um dos anticorpos usados no teste é um anticorpo mo-noclonal quimérico do invento, o outro pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal conhecido anti-CEA ou também um anticorpo quimérico de acordo com o invento. 0 anticorpo marcado é por exemplo um anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com fosfatase alcalina. Ê também preferido uma ELISA em que um veículo revestido com um anticorpo é incubado com uma solução a testar contendo CEA e com uma solução de um anticorpo que está conjugado com uma enzima, o anticorpo dissolvido reconhecendo um epítopo de CEA diferente do reconhecido pelo anticorpo ligado ao veículo. Um dos anticorpos usados no teste é um anticorpo monoclonal quimérico do invento, o outro é um anticorpo monoclonal ou policlonal conhecido anti-CEA. O invento está também relacionado com "kits" de testes para a determinação de CEA humano contendo anticorpos monoclonais quiméricos contra CEA humano e/ou seus derivados e, facultativamente aditivos. s "kits" de testes de acordo com o invento para um radioimunoensaio contêm por exemplo, um veículo adequado, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um ou mais anticorpos monoclonais , soluções de um anticorpo monoclonal marcado radioactivamente ou de CEA humano marcado radioactivamente, soluções padrão de CEA humano, soluções tampão e facultativamente detergentes para a prevenção agregados , pipetas , similares. Um ou de teste são anticor- de adsorção não especifica e formação de vasos de reacção, curvas de calibração e mais dos anticorpos monoclonais do "kit" pos monoclonais quiméricos do invento.

Os "kits" de teste de acordo com o invento para um imunoensaio com enzima contêm, por exemplo, um veículo adequado, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um ou mais anticorpos monoclonais, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um anticorpo monoclonal marcado com enzima, de CEA humano marcado com enzima, de um soro policlonal anti-CEA humano e/ou de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com enzimas que reconhecem e ligam o anticorpo anti-CEA humano, substractos de enzimas na forma sólida ou dissolvida, soluções padrão de CEA humano, soluções tampão, detergentes, pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, tabelas com escalas de cõr e similares. Um ou mais dos anticorpos monoclonais do "kit" de teste são anticorpos monoclonais quiméricos do invento.

Em adição, baseado na sua imunogenici-dadereduzida, os anticorpos monoclonais quiméricos e seus derivados são úteis em terapia, para imunização passiva sem reacções imunológicas negativas como seja espessamento do soro ou choque anafilático, para localização e visualização in vivo de tumores, para tratamento específico de células doentes, e.g. libertação, dirigida de citotoxinas, imunomodu-ladores ou outras moléculas farmacêuticamente activas sempre que a concentração local do agente activo seja um factor importante, ou similares. Para a visualização iri vivo, o anticorpo quimérico é marcado radioactivamente ou conjugado com um quelato de metal complexado com um radionuclido, e.g. iodo, xtrio, tecnétio ou similares e técnicas de "radio-sconning" podem ser usadas para detectar tumores primários e metásticos. Com esta finalidade, oanticorpo radioactivo é injectado, e.g. intravenosamente e o paciente varrido com um visualizador gama em intervalos regulares. Os tumores que expressam CEA tomarão -36-

mais anticorpos radioactivos do que os outros tecidos e serão claramente reconhecidos pela câmara de visualização gama. De preferência são usados anticorpos monoclonais marcados com 131I para "radio-sconning" em quantidades de 3 a 8 jiq representados 15 a 30 jiCi por kg de peso de corpo. Para activida-de biocida no tratamento do cancro, os anticorpos quiméricos são usados como derivados conjugados com substâncias citostá-ticas ou citotóxicas conforme aqui descrito atrás, e.g. rícino A, como derivados marcados radioactivamente ou ainda incluídos em lipossomas contendo reagentes biocidas. A dose terapêutica para mamíferos é então aproximadamente 1 mg e 5 mg por kg de peso de corpo para os próprios anticorpos monoclonais e entre 0,1 mg e 5 mg por kg de peso de corpo para conjugados com drogas citotóxicas, dependendo do estado do paciente e do modo de aplicação. Como alternativa, os anticorpos quiméricos podem ser usados em combinação com componentes do sistema imune do hospedeiro, e.g. complemento, devido â presença da região constante nativa. Iii vitro os presentes anticorpos quiméricos podem ser usados em conjunto com o complemento para ignover células apresentadoras de CEA particulares de entre uma mistura de células. O invento também está relacionado com preparações farmacêuticas contendo um anticorpo monoclonal quimérico ou seus derivados com especificidade elevada para CEA conforme aqui discutido atrás. As preparações farmacêuticas contêm por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos ou seus derivados numa quantidade eficaz juntamente ou misturando com veículos farmacêuticamente aceitáveis sólidos, inorgânicos ou orgânicos. São preferidas as preparações farmacêuticas para aplicação parentérica. Aspreparações para aplicação intramuscular, subcutânea ou intravenosa são e.g. soluções isotónicas ou suspensões, facultativamente preparadas pouco antes de usar a partir de preparações liofilizadas ou concentradas. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas -37-

e conter adjuvantes, e.g. para conservação, estabilização, humidificação emulsionação ou solubilização dos ingredientes, sis para a regulação da pressão osmótica, tampão e/ou compostos para regulação da viscosidade e.g. carboxicelulose sódica, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina. Elas são preparadas por métodos conhecidos, e.g. por mistura, dissolução ou liofilização convencionais e contêm entre aproximadamente 0,01% e 50% dos ingredientes activos. As preparações para injecção são processadas, distribuídas por ampolas ou frascos e fechadas em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos .

Os exemplos que se seguem ilustram o invento mas não o limitam em qualquer grau.

Legendas das Figuras Símbolos para sítios de restrição: A-AluI, B-BamHI, Bg-BglII, E-EcoRI, H-HindIII, Hh-Hhal, P-PstI Sa-Sall, Sp-Sphl, X-Xbal, Xm-Xmml. V: segmento da região variável do gene de Ig J: segmento de união D: segmento da diversidade L: sequência condutora

As caixas indicam a posição da região V rearranjada e o seu segmento codificador do peptideo condutor (caixas pretas) e~a posição dos segmentos J (caixas abertas).

Figura 1: (A) G: configuração germinal do locus do gene da cadeia leve do Ig de ratinho mostrando a posição dos segmentos J e a origem da sonda da região J. L2 e L2.5: mapas de restrição dos genes -38- -38-

rearranjados da cadeia L de Ig específicos do hibridoma CE 25 deduzidos a partir de análise de transferência Southern (Exemplo 3 ). plasmideo pCEA-L2a: segmento clonado do gene L2. (B) G: configuração germinal do locus do gene rearranjado da cadeia H de Ig de ratinho mostrando a posição dos segmentos J e a origem da sonda da região J. H» e HQ: mapas de restrição dos genes

£. O rearranjados da cadeia H de Ig específicos do hibridoma CE 25 deduzidos a partir da análise de transferências Suthern (Exemplo 3 ) . O plasmideo pH801 não é apresentado, mas está construído de modo análogo ao pCEA-L2a e contem o segmento Xbal/Xbal do gene H8. /~E 7 : sítios EcoRI no gene H8 clonado que não podem ser detectados por análise de transferências Southern de DNA do hibridoma CE 25.

Figura 2:

Detecçao de mRNA especifica de L2 e Hg em células do hibridoma CE 25 por análise de transferência Northern (Exemplo 6).

Transferência de RNA de 25 e 50 jig de RNA celular P3-NS2/lAg4 (NS) e de RNA celular do hibridoma CE 25 (CE 25). a) usando um segmento do gene da cadeia L b) usando um segmento do gene da cadeia Η H8 -39-

Figura 3:

Esquema para a construção do gene quimérico da cadeia L ratinho/humano pCEA-CkGa (Exemplos 8.1 e 8.2 ) Símbolos ver atrás.

Figura 4:

Esquema para a construção do gene quimérico da cadeia H ratinho/humano pCEA- \ 4Na (Exempbs 8.3 e 8.4 ) Símbolos ver atrás.

Figura 5:

Esquema para a construção de pMlHuCk-la (exemplos 10.1 e 10.2) Símbolos: ver atrás; sitios de restrição colocados entre parêntesis são eliminados durante os vários processos de clonagem.

Figura 6:

Esquema para construção da dupla construção quimérica pCEA(H+L)2neo portadoras de genes das cadeias H e L de Ig anti-CEA ratinho/humano ( V 4; K) Símbolos: ver atrás; sítios de restrição colocados entre parêntesis são eliminados durante os vários processos de clonagem.

Figura 7:

Ligação do anticorpo monoclonal quimérico secretado por CE 4-8-13 contra CEA OD: densidade óptica -40- Abreviaturas

pb CDR ddNTP dNTP DMEM DTT EDTA FCS HEPES HAT HT Ig Kb MOPS NZ-amina

PBS

PBS-CM RIA SDS 20 x SET SSC tampao TE Tris pares de bases região determinante da complementaridade trifosfato de didesoxirribonucleotideo (N = adenina, citosina, guanina ou timina) trifosfato de desoxirribonucleotideo (N=adenina, citosina, guanina ou timina) meio mínimo essêncial de Dulbecco (Dulbecco & Vogt , J. Exp. Med. 9_9, 167, 1954 ) ditiotreitol ácido etilenodiaminatetracético soro fetal de vitela ácido Ν-2-hidroxietil piperazina-N1-2'-etano--sulfón ico hipoxantina/aminopterina/timidina hipoxantina/timidina imunoglobulina kilobase (pares) ácido ^ -morfolino propanossulfónico NZ-amina (10 g/1); NaCl (5 g/1); extracto de levedura (5g/l, Difco); casaminoácido (lg/1, Difco) MgS0^.7H20 (2g/l), pH 7,5 com NaOH tampão fosfato salino (Dulbecco & Vogt, J. Exp. Med. 9_9, 167, 1954) PBS sem MgC^ e CaC^ radioimunoensaio dodecilsulfato de sódio 3M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4M Tris-HCl, pH 7,8 0,15M NaCl, 0,015M citrato de sódio 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 Tris (hidroximetil)aminometano

Exemplo 1: Preparação da linha celular de hibridoma CE 25 1.1 Purificação do antiqénio carcinoembrionário (CEA)

Extraíram-se com soro fisiológico me-tastases do fígado de carcinoma do colón obtidos a partir de autópsia (dentro de 6 h após a morte) 1 vol. de tecido é primeiro homogenizado em 3 vol. de tampão fosfato 0,02M pH 7,4 a 4°C durante 10 min. num Omnimixer Sorvall a 8000 rpm. O homogenato bruto é então centdfugado a 8000 g durante 15 min. a 4°C. O sobrenadante clarificado e aplicado num imunoadsor-vente consistindo num conjunto de anticorpos monoclonais anti--CEA conhecidos Mab 35 e Mab 115 (Haskell e_t a_l. , Câncer Res. 4 3 , 3857, 1987; Buchegger et. a_l. , J. Exp. Med. 158 , 413, 1983 ) e Mab 73 (Buchegger e_t a_l. , Immunol. Letters _5, 85, 1982) acoplado a Sepharose activada com CNBr. CEA é eluido com tiocianato de amónia 2M. 1.2 Imunização de ratinhos Balb/c

Ratinhos Balb/c de dois meses de idade são imunizados com CEA por injecção intraperitoneal de 15 jiq de CEA purificado extraído com soro fisiológico com adjuvante completo de Freund. Após 4 meses, uma série de injecções de memória compreendendo 15, 50 e 150 pg da mesma preparação de CEA em soro fisiológico sem adjuvante de Freund foram administrados intraperitonealmente 5,4 e 3 dias antes da fusão, res-pectivamente. 1.3 Fusão celular A fusão celular é conseguida usando 8 7 1,5 x 10 células do baço de ratinho imunizados e 1,5 x 10 células de mieloma de ratinho P3-NS2/lAg4 de acordo com métodos convencionais anteriormente descritos (Koehler & Milstein, Nature 256, 494, 1975). Após lavagem as células são ressus-pensas em 48 ml de meio mínimo essêncial de Dulbecco conven- -42-

cional (Gibco NQ 0422501). Como células de suporte adicionaram-se 3 x 10^ células de exudado peritoneal de ratinho normal. As células são distribuídas por poços Costar 96 x 0,5 ml e alimentadas 3 vezes por semana com meio de selecção HAT convencional durante 3-6 semanas. Quando o crescimento das células de hibridoma se torna visivel, os sobrenadantes são despistados como descrito no Exemplo 1.4. Os hibridomas positivos, por exemplo a linha celular CE 25 descrita no Exemplo 1.5, são relacionados e guardados. 1.4. Detecção de anticorpos em sobrenadantes de hibridomas

Os sobrenadantes das culturas de hibridomas em crescimento são testados quanto a presença de anticorpo anti-CEA por uma modificação do ensaio de Farr (J. In-fect. Dis. 103, 239, 1958) como anteriormente descrito (Acco-11a et a_l. , Proc. Natl. Acad. Sei. 7_7, 563, 1980). Diluições 1:10 (v/v) dos sobrenadantes das culturas celulares são incu- 125 bados em duplicado com CEA marcado com I em tampão Tris-HCl 0,02M, pH 7,4. O CEA ligado aos anticorpos é precipitado a 4°C pela adição de uma solução saturada de sulfato de amónio na presença de soro humano normal. 1.5. Armazenamento e processamento de hibridomas O hibridoma CE 25 que secreta o anticorpo anti CEA Mab CE 25 pode ser cultivado em cultura, congelado a -80°C ou em azoto líquido e recultivado. As células são clonadas pelo método de diluição limite e expandidas por formação de ascites em ratinhos Balb/c sensibilizados com pris-tano. A linha celular CE 25 foi depositada na "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" do Institut Pasteur, Paris, em 15 de Dezembro de 1987 com o numero 1-719. -43-

Exemplo 2: Isolamento de DNA das linhas celulares de hibri-doma CE 25, P3-NS2/lAq4 e de células de rim de murganho Balb/c n

As células de hibridoma CE 25 (5 x 10 ) são cultivadas em suspensão a 37°C em DMEM (Seromed) + 10% FCS (Seromed), piruvato de sódio 1 mM (Seromed), glutamina 2 mM (Seromed), 2-mercaptoetanol 50 yuM e 100 jiq/ml de genta-micina (Seromed) numa atmosfera humidificada de ar e 7,5% de 3 CC>2, em frascos de cultura de tecidos de 175 cm (Falcon 3028). As células são colhidas por centrifugação, congeladas em azoto líquido e mantidas congeladas como um sedimento a -80°C num tubo de plástico transparente esterilizado e tapado.

As células congeladas são ressuspensas em 10 ml de PBS a que se adiciona 90 ml de sucrose 0,3M, 5 mM MgC^, 0,1% (p/v) de Triton-X100, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 4°C numa proveta de plástico estéril de 100 ml. As células são lisadas e os núcleos colhidos por centrifugação (10 min. , 10.000 rpm, 4°C , centrífuga Sorvall RC-5 , rotor SS-34). O sobrenadante é removido e o sedimento de núcleos ressuspenso em 4,5 ml de 75 mM NaCl, 24 mM EDTA, pH 8,0. Adiciona-se água destilada (100 yul) , SDS (250 ^il de uma solução a 10% (p/v) em água destilada) e 100 yjl de solução de proteínase k (Boe-hringer; solução a 10 mg/ml em água destilada) e mistura-se suavemente. A mistura é incubada a 37°C durante a noite. A solução é extraída misturando com igual volume de fenol redistilado saturado com 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, a 0°C. A fase aquosa é recuperada após centrifugação (10.000 rpm), temperatura ambiente, centrífuga Sorvall RC-5, rotor SS-34) e extraída duas vezes com igual volume de CHCl^/ /álcool isoamílico (24:1, v/v). O DNA é precipitado pela adição de um décimo do volume de 3M NaOAc, pH 5,0, seguido de dois volumes de etanol absoluto à temperatura ambiente. O DNA precipitado é removido da solução de etanol, colocado em 1 ml de tampão TE e dissolvido durante a noite a 4oC. O rendimen- -44-

to de DNA é aproximadamente 0,5 mg. O DNA da linha celular P3-NS2/lAg4 é obtido de modo idêntico.

Para as preparações de DNA de tecido de rim de murganho Balb/c, rim fresco de murganho é congelado em azoto líquido, triturado até se obter um pó fino num almofariz, limpo e esterilizado, na presença de azoto liquido e o DNA extraído a partir de uma quantidade de tecido equivalente a 5 x 10 células, seguindo o processo descrito atrás.

Exemplo 3: Análise dos loci rearranjados dos genes das cadeias H e L de Ig em células CE 25 O hibridoma CE 25 contem os loci dos genes das cadeias H e L de Ig derivados da célula P3-NS2/lAg4 usado na formação do hibridoma. A linha celular P3-NS2/lAg4 deriva do mieoloma MOPC-21 (Strrb et al. , Nucleic Acids Res. 8^, 4681, 1980). Estes loci endógenos rearranjados distinguem--se dos genes rearranjados específicos de CE-25 pelos seguintes processos.

3.1 Fonte e preparação dos fragmentos sonda de DNA O segmento de DNA sonda usado para a de-tecção do segmento de DNA da região J da cadeia H germinal de murganho Balb/c é um segmento BglII/Xbal aproximadamente 1750 pb de DNA de fígado de murganho Balb/c, correspondendo as posições de nucleotideos 1130-2881 do locus da cadeia H germinal de Ig, publicado (Newell aJL. , Science 209, 1128, 1980; dado de bases EMBL entrada MUSIGCD07).

O segmento de DNA sonda usado na detec-ção do segmento da região J da cadeia L germinal de murganho Balb/c é um segmento HindIII/Xbal de aperoxi 2240 pb de DNA -45-

do fígado de murganho Balb/c, correspondendo as posições de nucleotídeos 659-2900 do locus da cadeia L germinal de Ig publicado (Max et al., Proc. Natl. Acad. Sei, 7j6, 3450, 3454, 1979; sequência da base de dados EMBL entrada MUSIGKJC2 ) .

As sondas de DNA são purificadas por clonagem molecular de DNA de fígado de murganho Balb/c em bacteriófago JL , subclonagem dos fragmentos de DNA adequados nos vectores plasmídeos pUC12 ou pUCl3 e recuperação/purifi-cação das inserções de DNA clonados usando processos convencionais (Maniatis eHt _al. , "Molecular Cloning: A Laboratory manual", Cold Spr. Harbour, N.Y., 1982).

As sondas de DNA são preparadas a partir de 300 ng de fragmentos de DNA purificados por "nick-transla- 32 tion" na presença de - P-dCTP, DNA-Polimerase-I de E. co- li e DNAsel, usando o processo convencional publicado (Rigby et al. , J. Mol. Biol. 113, 237, 1977). O DNA sonda marcado é separado da marca não incorporada usando cromatografia em Sephadex G50 (Pharmacia) com uma coluna de separação de 10 x 0 ,5 cm e um tampão de eluição contendo 150 mM NaCl , 10 mM EDTA, 0,1% (p/v) de SDS, 50 mM Tris-HCl , pH 7,5.

3.2 Electroforese em gel do DNA

Amostras de DNA (5 ^ng) de (a) o mielo-ma P3-NS2/l-Ag4 usado na fusão parental quando da produção do hibridoma CE 25, (b) o hibridoma CE 25 e (c) células de rim de murganho Balb/c, preparado como descrito no Exemplo 2, são totalmente digeridas usando as enzimas de restrição Xbal, BglII, EcoRI+HindIII, BamHI, EcoRI ou HindIII (Boehringer) nas condições recomendadas pelo fabricante. Os fragmentos de DNA são separados por electroforese em gel de agarose horizontal usando géis de 0,5% (p/v) agarose 10 x 20 x 0,5 cm (Biored, baixa M convencional) e tampão de electroforese contendo 25 mM EDTA di-sódico, 90 mM Tris-base, 90 mM ácido bórico, pH 8,3. Os fragmentos do bacteriófago digeridos com -46-

HindlII ou com EcoRI são reunidos e marcados radioactivamente usando DNA-polimerase I fragmento Klenow (Boehringer) na pre-sença de dNTPs e C>( zP-dNTPs usando um processo publicado (Manniatis et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spr. Harbour, N.Y., 1982). Estes são incluídos em calhas separadas do gel de agarose para propocionar uma gama de fragmentos marcadores de DNA marcados de tamanho conhecido.

Após separação dos fragmentos de DNA por electroforese eles são transferidos por transferência, à temperatura ambiente, para membrana de nitrocelulose usando o processo publicado de Southern (Southern, J. Mol. Biol. _98, 503, 1975) como algumas peguenas modificações como se segue. Após electroforese o excesso de agarose é retirado dos lados do gel, após o que este ê incubado ã temperatura ambiente em 500 ml de solução 0,25M HC1 durante 30 min., seguido de 500 ml de 1,5M NaCl, 0,5M NaOH durante 50 minutos para desnaturar o DNA. O gel é passado rapidamente com água destilada e depois incubado durante 60 min. em solução neutralizante (3M NaCl, 0,3M Tris-HCl, pH 7,5). Os fragmentos de DNA são então transferidos durante a noite para uma membrana de nitrocelulose (SchUeicher & Schuel] , tamanho de poro 0,45 um) pelo processo publicado referido atrás usando uma solução contendo 3M NaCl, citrato de sódio 0,3M, pH 6,8. A membrana de nitrocelulose contendo os fragmentos de DNA transferidos é seca ao ar e incubadaa 80°C durante 2h sob vácuo. Após incubação, o excesso de sais são removidos incubando a membrana em 0,75M NaCl, citrato de sódio 0,075M, pH 6,8, antes da hibridação com sondas de DNA marcadas radioactivamente.

3.3 Hibridação de DNA

Filtros de nitrocelulose preparados como descrito no Exemplo 3.2 são pré-hibridados em sacos de plástico, fechados por acção do calor, durante 4h a 65°C em 20 ml de solução de pré-hibridação contendo 0,2 ml de SDS a 10% (p/v), 0,4 ml de pirofosfato de sódio a 5% (p/v), 0,4 ml de DNA de esperma de arenque (5 mg/ml em água destilada) partindo -47-

por passagem através de uma agulha hipodérmica 18 gouge, 5 ml de solução de Denhardt (Denhardt, BBRC 2_3, 641, 1966; 0,2% (p/v) de albumina do soro bovina, (0,02% (p/v) de polivinil-pirrolidona, 0,02% (p/v) de Ficoll-400 em tampão SET 20x (3M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4M Tris-HCl, pH 7,8) e 14 ml de água destilada . A mistura de hibridação de DNA contem 7 10 cpm da sonda de DNA marcada radioactivamente, 10 ml de solução de pré-hibridação, preparada como descrito atrás e 10% (p/v) de dextran-sulfato (Sigma). A mistura é aquecida a 100°C durante 20 min. para desnaturar o DNA. Para hibridação a mistura de pré-hibridação é removida do saco de plástico e substituído pda mistura de hibridação. Após exclusão das bolhas de ar o ar é novamente fechado e incubado durante a noite a 65°C. Para remover da membrana o DNA ligado ines-pecificamente, a mistura de hibridação e a membrana são removidos do saco de plástico. A membrana ê colocada num banho contendo 500 ml de SSC 5x, 0,1% (p/v) de pirofosfato de sódio e lavada durante 15 min. a 65°C. A membrana é então lavada sequêncialmente a 65°C durante 30 min. em 500 ml de solução contendo SSC 4x, SSC 3x, SSC 2x e finalmente SSC lx, todas contendo 0,1% (p/v) de pirofosfato de sódio. A membrana é seca ao ar, fechada num saco de politeno fino e autor-radiografada a -70°C usando filme de raio X Kodak (X-omet TM AR) e écrans intensificadores de imagens até durante três dias.

Os resultados estão resumidos na Tabe la 1 abaixo e ilustrados na Figura 1: -48-

Tabela 1:

Tamanho das fragmentos de DNA genómico específicos do hibri-doma CE 25 gue apresentam homologia com sondas de DNA da região J da cadeia H e da cadeia L de Ig sonda de DNA enzima de restrição usada/tamanho dos fragmentos em kb Xbal BglII EcoRI/ BamHI EcoRI HindIII HindIII 8,0* 21,0 5,6 10,8 7,5 6,3 cadeia H 2,1 20,0 2,1 8 ,3 2,5 2,9 2,5 1,8 2,1 6,4 20,0 9,5 cadeia L 2,0* 1,2 1,9 4,5 18,0 1,9 ^fragmentos codificadores dos segmentos funcionais H8 e L2

da região V das cadeias H e L

Por comparação com a linha celular pa-renteral da fusão P3-NS2/lAg4, o hibridoma CE 25 contem dois loci rearranjados de genes da cadeia H de Ig adicionais, e dois loci adicionais rearranjados de genes cadeia L de Ig. Estes são referidos como H2 e H8 (Fig. 1B) e L2 e L2,5 (Fig. IA), respectivamente,®m base nos tamanhos dos fragmentos de DNA genómico de ratinho detectados em produtos de digestão com Xbal por transferência Souther usando sondas de DNA específicas de Ig. -49-

Exemplo 4: Clonagem molecular de genes das cadeias H e L de Ig funcionalmente rearranjados do hibridoma CE 25 4.1 Preparação de fracções de DNA relacionadas por tamanho contendo loci rearranjado das cadeias H e L de Ig especificas do hibridoma CE 25 0 DNA do hibridoma CE 25 (50 yug) é digerido totalmente com Xbal, extraído com igual volume de CHCl^/ /fenol redistalado (1:1, v/v, saturado com 20 mM Tris-HCl, pH 8,0), seguido de extracção com um volume igual de CHCl^ para remover vestígios de fenol. O DNA é precipitado pela adição de 0,1 vol de 3M NaOAc, pH 5,0 e 2,5 vol de etanol absoluto a -20°C. O sedimento de DNA é recuperado, dissolvido em 150 ^al de tampão TE e aplicado num gradiente de 12ml de 5-24% (p/v) de NaCl em tampão TE um tubo de polialómero para o rotor Beckman SW41. Os gradientes são centrifugados durante 4,5 h a 37.000 rpm a 25°C e fraccionando a partir do fundo. As fracções de DNA (300 ^il) correspondendo a (a) fragmentos de DNA de 1,5-2,5 kb de comprimento e (b) fragmentos de DNA de 6,0-9,0 kb de comprimento são colhidos, reunidas e precipitadas usando 2,5 volumes de etanol absoluto a -20°C. O DNA das fracções reunidas (a) e (b) é recuperado por centrifugação, seco sob vácuo e dissolvido em tampão TE para concentrações de 50 ng/jil e 200 nq/jil, respectivamente. 4.2 Ligação de DNA e empacotamento em partículas bacteriofá-gicas

Amostras de DNA (1 jil) das fracções (a) e (b) como descrito atrás são ligadas durante a noite a 4°C com 0,8 ^jg de braços de DNA de bacteriõfago J^· -OngC/digeri-do com Xbal (Stratagene Inc. , San Diego, USA) em 5 pl de uma solução contendo 10 mM DTT, 1 mM ATP, 10 mM MgC^, 20 mM Tris--HC1, pH 7,6 na presença de 5 unidades de DNA-ligase de T4 (Boehringer). As misturas de ligação são empacotadas usando Gigapack "PLUS" (Stratagene Inc., San Diego, USA) e semeadas -SO-

em E. coli K12/VCS257 (preparada por crescimento em NZ-amin/ /0,4% (p/v) de maltose usando meio de crescimento NZ-amin, de acordo com as instruções do fabricante, a uma densidade de 2 aproximadamente 250 pfu/cm usando processos de microbiologia convencionais. As placas são incubadas durante a noite a 3 7°C.

Os loci dos genes da cadeia L rearran-jados L2 e L2,5 são detectados na biblioteca (a) pelo despiste de hibridação de Benton & Davis (Science 196, 180, 1977) usando a sonda de DNA da cadeia L de Ig de murganho marcada 32 com P descrita no Exemplo 3.1. As placas com hibridação positiva são purificadas, repicadas usando a ponta de uma pipeta de Pasteur estéril e o fago ressuspenso em 1 ml de tampão para fagos (100 mM NaCl, 8 mM MgSO^^t^O, 0,01% (p/v) de gelatina, 5 mM Tris-HCl, pH 7,5). Os lisados de fago (10 ml) são preparados por adsorção de 20 ul da suspensão de fagos a um volume de 100 ^ul de células retiradas de uma cultura de E. coli K12/VCS257 que cresceu durante a noite em meio NZ-ami-na suplementado com 0,4% (p/v) de maltose. A mistura é diluída para 10 ml com meio NZ-amina fresco em tubos Falcon de 50 ml estéreis e cultivada durante a noite a 37°C com agitação forte. Adiciona-se CHCl^ (20 ^j1 ) e a agitação contínua a 37°C durante 30 min. O DNA da bacteriofagos recombinantes é preparado a partir dos lisados usando um processo publicado da autoria de Blattner et al (Science 202, 1279, 1978). O DNA obtido após o passo final de precipitação com etanol é dissolvido em 100 jjil de tampão TE. A produção de DNA fágico é de aproximadamente 100 ug.

Amostras de DNA (1 ^jg) de cada um dos bacteriofagos recombinantes que dão hibridação positiva são digeridos totalmente usando a endonuiease de restrição Xbal. Um segmento de genes L2 é identificado como um fragmento de restrição Xbal de 2kb quando as amostras de DNA recombinante digeridas são analisadas por electroforese em gel de 1% (p/v) de agarose. O segmento de gene L2 de aproximadamente 2,0 kb -51- -51-

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é cortado do gel, purificado por extracção com fenol/CHCl^ e recuperado por precipitação com etanol. 0 fragmento de DNA purificado é então subclonado em ambas as orientações no vector de clonagem plasmídeo pUC12, linearizado por digestão com Xbal. Todos os processos são métodos convencionais (Ma-niatis ert ad . , "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spr. Harbour, N.Y., 1982). O mapeamento de restrição dos subclones de plasmídeo usando as endonucleases de restrição Xbal, BglII, PstI, HindIII e BamHI confirma que a estrutura do segmento clonado de genes L2 corresponde ao segmento de genes L2 genómico original, deduzido a partir de transferência Southern de DNA do hibridoma CE 25 como descrito no Exemplo 3. Os plasmídeos contendo o segmento clonado de genes L2 em ambas as orientações são designados pCEA-12a e pCEA--L2b. Na Figura IA está apresentado um mapa de restrição de pCEA-C2 9. A biblioteca (b) é usada como fonte do segmento H8 de genes rearranjados da cadeia H de Ig usando o mesmo processo. O despiste do fago recombinantes para o lo-ci de genes da cadeia H é conseguido por hibridação com uma sonda de DNA marcada radioactivamente e específica para a cadeia H descrita no Exemplo 3.1. Os fagos recombinantes que dão hibridação positiva são purificados, o DNA isolado e digerido usando Xbal como descrito atrás. Uma sequência de genes H8 é identificada como um fragmento de restrição de aproximadamente 8 kb quando separado do DNA do vector de clonagem por digestão com Xbal seguido de electroforese em gel de 1% (p/v) de agarose. 0 gene H8 é subclonado em ambas as orientações no vector plasmídeo pUC12 , linearizado por digestão usando Xbal. 0 mapa de restrição dos subclones de DNA usando as enzimas Xbal, PstI, HindIII e BamHI confirma que a estrutura do segmento de genes H8 subclonado corresponde ao locus rearranjado genómico H8 da cadeia H de Ig, deduzido a partir da transferência Southern do DNA do hibridoma CE 25 usando uma sonda de DNA marcada radioactivamente e especifica para a cadeia H como descrito no Exemplo 3. Estes subclones -52-

de DNA de H8 são designados pH8al e pH8bl. Na Fig. 1B está apresentado um mapa de restrição do fragmento de DNA inserido Xbal do DNA de H8. 4.3 Análise da sequência de nucleotídeos dos segmentos de genes L2 e H8 A sequênciação de nucleotídeos dos loci dos genes L2 e H8 em pCEA-L2 (a ou b) e pH8 (al ou bl) é efec-tuada usando o método de terminação de cadeias didesoxi publicado por Sanger (Sanger et a^., Proc. Natl. Acad. Sei., 74, 5463, 1977). Os DNAs de piasmídeos recombinantes são cortados usando as endonucleases de restrição adequadas e os fragmentos de DNA a serem sequênciados são recuperados por electroforese em gel de 1% (p/v) de agarose. Os fragmentos de DNA são então clonados e sequênciados em vectores bacte-riofagos M13 com o Amersham M13 Cloning System, usando as instruções fornecidas (Amersham International PLC, UK). O segmento de genes L2 é sequênciado a partir do sítio de restrição Xbal 5' até ao nudeotídeo 1395, situado 3' relativamente á região V-J4 da cadeia L rearranja-da. A sequência de nucleotídeos é a apresentada na fórmula III.

Estes dados confirmam o mapa de restrição do gene L2 clonado nesta região (Fig. IA) e define a sequência do primeiro exão codificador dos resíduos N-terminais do peptideo condutor da cadeia L (começando com metionina na posição 733 na sequência), uma sequência interveniente (nucleotídeos 781-987) e a sequência codificadora do restante peptideo condutor e a região V de L2 rearranjada num resíduo prolina situado na região V-J4 (nucleotídeos 988-1284). Os nucleotídeos 1285-1395 correspondem á sequência germinal conhecida da cadeia k de Ig de murganho (entre 1725-1836 do banco de dados EMBL entrada MUSIGKJC2). Os nucleotídeos 680-1284 correspondem a uma região V germinal da cadeia L de murganho -53-

conhecida (L7, Pech et al., Nsture 2 91, 668, 1981) exceptuando as 7 alterações na sequência codificadora da região V, que podem surgir por mutação somática. Estes dados definem a sequência codificadora de aminoácidos do gene rearranjado L2 da cadeia L incluindo o peptídeo condutor, as três regiões de armação e as regiões que determinam complementaridade CDRLs 1-3 (resíduos de nucleotideos 1069-1102, 1147, 1167, 1263-1291) incluindo a junção V-J4 na mesma grelha de leitura. O segmento de genes H8 da cadeia H está sequênciado a partir do sítio de restrição HindIII interno até ao nucleotideo 857 situado 3' relativamente á região V-D-J da cadeia H rearranjada. A sequência de nucleotideos é a apresentada na fórmula IV.

Estes dados confirmam o mapa de restrição desta região do gene H8 (Fig. 1B) e define a sequência do primeiro exão codificador dos 16 resíduos de aminoácidos N-terminais do peptídeo condutor (começando com metionina na posição 322 na sequência), uma sequência interveniente (nucleotideos 368-473) e a sequência codificadora do restante peptídeo condutor e a região V de H8 até ao resíduo serina (nucleotideos 474-844). Os resíduos de nucleotideos 797-857 correspondem á sequência germinal da cadeia H de Ig de murganho (entre 2291-2352 do banco de dados EMBL entrada MUSIGCD007) exceptuando as três alterações de nucleotideos que afectam a sequência codificadora prevista da região J do polipeptideo da cadeia H. Os 769 primeiros resíduos de nucleotideos da sequência são homólogos mas não são idênticos á região V da cadeia H de murganho conhecida, conforme deduzido de uma pesquisa nos dados de sequênciação disponíveis nas bibliotecas Genbank, NBRF ou EMBL. Estes dados de sequênciação definem a sequência codificadora de aminoácidos que abrange o peptídeo condutor, as três regiões de armação e CDRHs 1-3 (nucleotideos 575-595, 629-680, 776-805), a origem do segmento de diversidade (D) da cadeia H (que deriva de DSP2.3 , DSP2.4 ou DSP2.6 do locus germinal da cadeia H de Ig de murganho) e a -54-

junção V-D-J4 na mesma grelha de leitura do gene rearranjado da cadeia H de H8 do hibridoma CE 25.

Exemplo 5: Comparação entre as sequências de nucleotídeos dos mRNAs expressos das cadeias H e L de Ig e as sequências de nucleotideos dos genes rearran-jados das cadeias H e L do hibridoma CE 25 de murganho 5.1 Extracção de RNA celular total RNA total é extraído usando o método de LiCl/ureia descrito por Anffray & Rougeon (Eur. J. Bio-chem. 107, 303, 1980) conforme modificado por Le Meur et al. (Cell 23_, 561, 1981). As células de hibridoma CE 25 (5 χ 107) são cultivadas e preparadas como descrito no Exemplo 2. Os sedimentos celulares são descongelados directamente no tubo na presença de 5 ml de LiCl/ureia (3M LiCl , 6M ureia, 200 pq/ /ml de heparina , 0,1¾ de SDS, 10 mM NaOAc , pH 5,0). Os passos subsequentes estão descritos nos processos publicados. O método dá aproximadamente 50 jiq de RNA celular total. O material final purificado é guardado em etanol a 70% (v/v) a-80°C numa concentração conhecida. 5.2 Sequênciação de nucleotideos dos mRNAs expressos das cadeias H e L de Iq A sequênciação de nucleotideos do mRNA derivado do hibridoma CE 25 é conseguida directamente em preparações de RNA celular total utilizando iniciadores oligo-nucleotideos específicos marcados radioactivamente. Estes oligonucleotideos iniciadores são sintetizados quimicamente usando um processo publicado (Rink et al., Nuc. Acids Res. 12 , 6369, 1984). (a) Sequênciações de mRNA contendo Ck -55-

de murganho é conseguida usando um iniciador oligonucleotídi-co especifico de composição HO-5'-dGGGAGATGGATACAGTTGG-31-OH. Esta sequência é complementar dos codões 3-12 da sequência codificadora de Ck de murganho publicada (Altenburger et al. , Nuc. Acids. Res. j), 971, 1981). (b) Sequênciação de mRNA especifico de IgGl de murganho é conseguida usando um iniciador oligonucleo-tidico especifico com a composição HO-5'-dGGCCAGTGGATAGAC-3' -OH. Esta sequência é complementar dos codões 7-11 do domínio CHI (primeiro exão da região constante) da sequência codificadora da cadeia H de Ig yl de murganho (Honjo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 1J3, 559, 1979).

Ambos os oligonucleotideos são marca- 32 dos radioactivamente no extremo 5' na presença de Y- P-ATP (Amersham) usando polinucleotideo-cinase de T4 (Pharmacia), para uma actividade especifica de 2x10^ dpm/pmole. A marcação e separação de oligonucleotideos marcados radioactivamen-32 te do γ- P-ATP nao incorporado usando cromatografia Sephadex G-50 (Pharmacia) é efectuado usando um processo publicado (Qu et al., Nuc. Acids Res. Ll, 5903, 1983).

Para sequênciação, amostras (25 pg) de RNA guardado em etanol são recuperados por centrifugação a 4°C durante 30 minutos usando uma centrífuga Eppendorf e res- g suspensas em tampão TE contendo 10 dpm de iniciador marcado no extremo 5'. Esta mistura é dividida em pequenas porções por tubos Eppendorf de 5x1 ml contendo 1 pl de tampão de em-parelhamento, 5 unidades de transcriptase reversa (Genofit SA, Geneva), 1 pl da mistura de dNTP e 1 pl de solução de ddATP (200 jjM), ddGTP (100 uM) , ddCTP (80 ^iM) ou ddTPP (200 ^jM) em água destilada num volume final de 5 ^ul (todos da Amersham International, UK). O quinto tubo de reacção não contem ddNTPs e é usado para controlar a integridade do mRNA.

As misturas de reacção são incubadas a 37°C durante 30 min. para o iniciador (a) ou a 42°C durante 30 min. para o iniciador -56-

(b). Os tampões e misturas são como se segue: tampão de era-parelhamento para o iniciador (b): 60 mM MgCl2 , 0,6M NaCl, 0,5M Tris-HCl, pH 8,3; mistura de dNTPs: concentração 2 mM de cada um dos dNTPs em água destilada, excepto para o dNTP usado na reacção de sequênciação particular, o qual é usado numa concentração de 0,5 mM.

As reacções de sequênciação são paradas pela adição de 20 jj 1 de água destilada e 30 pl de 0,6M NaOH a cada tubo. O RNA é hidrolisado por incubação durante a noite a 37°C. As misturas de reacção são neutralizadas pela adição de 8,4 pl de ácido acético 3M e o DNA precipitado pela adição de 2,5 vols de etanol absoluto na presença de 0,3M NaOAc , pH 5,0. Os sedimentos de DNA são secos ao ar a 60°C e ressuspensos em 2 pl de mistura de sequênciação corada e sujeitos a electroforese em géis de sequênciação de DNA 6% de poliacrilamida/ureia usando materiais e processos convencionais (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463, 1977). A sequênciação de mRNA da cadeia L es-pecificamente expresso no hibridoma CE 25 de murganho é mRNA: mRNA: mRNA: mRNA: 1160 1180 1200 ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA 3’-GACCCTAGGGAAGGTCCAAATCACCGTCACCTAGT 1220 1240 1260 GGGACAGATTTTACTCTTAÇCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAÇ CCCTGTCTAAAATGAGAATGGTAGTTATCÀCACCTCAGACTTCTATAACGTCTAATAATG 1280 1300 1320 TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA ACAGTTGTTTCAGTACCGACCGGTAAGTGCAAGCCGAGCCCCTGTTTCAACCTTTATTTT CG, GCccgactacgacgtggttgacataggtagaaggg-5' I- primer 1 -57-

A sequência vai de 3' para 5' e é complementar da porção do gene 2 da cadeia L de Ig clonado e se-quênciado, isolado a partir de DNA do hibridoma CE 25 desde o nucleotideo 1166-1322 (c.f. Exemplo 4.3). A sequência do mRNA da cadeia H especi-ficamente expressa no hibridoma CE 25 de murganho é 614 634 654 TCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCÇATTAGTAGTGGTGGTACCAÇ mRNA: 3'-ACCTCACCCAGTGTAGGTAATCATCACCACCATGGTÔ 674 694 714 CTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCÇAGAGATAATGCCAGGAACAT mRNA: GATGATAGGTCTGTCACACTTCCCGGCTAAgTGGTAGAGGTCTCTATTACGGTCCTTGTÀ 734 754 774

CCTGTACCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTÇTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAG mRNA: GGACATGGACGTTCACTCGTCAGACTCCAGACTCCTGTGCCGGTAAATAÀTGACACGTTC 794 814 834

AGGTTTCTATGATGGTTACÇTCTATGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCAÇ mRNA: TCCAAAGAtÁcTACCAATGGAGATACAACACCTGATGACCCCAGTTCCTTGGAGTGAGTG 854 CGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCC mRNA: GCAGA-5' A sequência vai de 3' para 5' e é complementar da porção do gene H8 da cadeia H de Ig clonado e sequênciado, isolado a partir de DNA do hibridoma CE 25 desde o nucleotideo 618-839 (cf. Exemplo 4.3). Ela não inclui a sequência complementar do sítio de ligação do iniciador. -58-

Exemplo 6: Transcrição especifica de mRNA especifico para L2 e H8 em células do hibridoma CE 25 por análise de transferência Northern 0 RNA celular total das células do hibridoma CE 25 ou das células P3-NS2/lAg4 é preparado como descrito no Exemplo 5. Amostras de RNA (25 e 50 ^jg) são recuperadas por centrifugação a partir do etanol usado para armazenamento, apos o que elas são ressuspensas em 20 ^il de solução contendo 2,2M formaldeido, 50% (v/v) de formamida, 1 mM EDTA, 40% (p/v) de sucrose , ácido γ-morfolino-propano-sulfónico (MOPS) 50 mM pH 7,0 e 0,5% (p/v) de xilenocianol e 0,5% (p/v) de verde de bromocresol, usados como corantes marcadores para controlar o andamento da electroforese. Após mistura, as amostras são aplicadas em géis de 1% (p/v) de agarose usando um tampão de electrof orese ccntendo 1 mM EDTA, formaldeido 2,2M 50 mM MOPS, pH 7,0. Os géis são pré-corridos durante 30 minutos antes de serem usados.

Após electroforese, retira-se o excesso de agarose dos lados do gel, o qual é então incubado em tampão SSC 20x durante 5 min. 0 RNA é transferido para membrana de nitrocelulose pelo processo convencional de transferência Northern (Maniatis et_ al_. , "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold. Spr; Harbour, N.Y., 1982). Após transferência durante a noite, a membrana é seca ao ar e incubada durante 2h a 80°C sob vácuo. Antes da hibridação, a membrana é pré-hibridada em 20 ml de uma solução contendo 50% (v/v) de formamida, tampão SSC 5x, solução de Denhardt 5x (descrita no Exemplo 3.3), 10 mM EDTA, 0,1% (p/v) de SDS, 50 mM fosfato de sódio, pH 6,8 e 2 ml de DNA de esperma de arenque fragmentado (5 mg/ml em água destilada, Exemplo 3.3). A incubação decorre num saco de plástico, fechado pelo calor, a 42°C durante 8h. Para hibridação, a mistura de pré-hibrida-ção é removida do saco de plástico e substituída por uma solução de hibridação semelhante ã solução de pré-hibridação mas contendo solução de Denhardt 2x em vez de solução de Den- -59-

7 hardt 5x e 2x10 cpm de DNA da sonda de hibridação marcado 32 com P por "nick-translation" e desnaturado: A sonda de DNA marcada radioactivamente especifica para o segmento do gene L2 da cadeia L de Ig é o plasmideo pCEA-L2a (Fig. IA & Fig. 3). 0 DNA marcado radioactivamente especifico para o segmento do gene H8 rearranjado da cadeia H é o plasmideo pH 8 a 1 (Fig. 1B). A preparação de DNA da sonda marcada por "nick-translation" está descrito no Exemplo 3.1. Após hibridação durante 16h a 42°C, a membrana é removida do saco de plástico e lavada duas vezes durante lh a 42°C na mistura de hibridação sem sonda de DNA, depois uma vez em SSC 2x, 0,1¾ (p/v) de SDS tampão a 42°C, seguido de duas lavagens em SSC 0,lx, 0,1% (p/v) de SDS, ambos á temperatura ambiente. A membrana é então seca ao ar, colocada num saco de plástico fino e exposta a filme de diagnóstico Kodak X-omat TM AR a -70°C usando um écran intensificador de imagem.

Os resultados da análise de transferência Northern estão apresentados Na Fig. 2.

Exemplo 7: Clonagem molecular dos segmentos da região constante do loci de genes de Ig humana 7.1 Biblioteca de DNA humano

Uma biblioteca de DNA humano é construída no vector do bacteriófago X- Charon 4a, por digestão limitada de DNA de figado fetal humano com as endonucleases de restrição HaelII e Alui usando processos publicados (Lawn et al., Cell Γ5, 1157, 1978). Aproximadamente 1x10^ fagos recombinantes independentes são semeados em E. coli K12/803 e despistados por hibridação de ácidos nucleicos quanto á presença de sequências da cadeia L CK humana e de sequências da cadeia H de Ig Y 4 humana, como descrito abaixo. -60-

7.2 Isolamento do segmento DNA contendo Ck humana

Uma sonda de DNA da cadeia L de Ig de 32 murganho marcada com P por "níck-translation" é preparada como descrito no Exemplo 3.1 e usada para fazer o despiste de fagos recombinantes usando o processo descrito no Exemplo 4.2. O DNA é isolado e purificado a partir de placas que deram hibridação positiva usando um processo convencional publicado (Blattner et al., Science 202, 1279, 1978). Um fragmento de DNA EcoRI de 2,5 kb incluindo o segmento codifica dor de CK humana (Hieter et al., J. Biol. Chem. 257, 1516, 1982) é isolado deste modo e subclonado em ambas as orientações no vector plasmideo pBR322, linearizado usando EcoRI. Estes plasmideos são referidos como pDA13b e pDA14a respecti-vamente. Construiu-se um mapa de restrição que está apresentado na Fig. 3. 7.3 Isolamento do segmento de DNA contendo a cadeia H de 4 humano

Uma sonda de DNA da cadeia H de Ig de 32 murganho marcada com P por "nick-translation" , correspondendo ao fragmento Xbal/Hhal do locus do gene Y 2b de murganho é usada para fazer o despiste de fagos recombinantes como descrito atrás (Takahashi ejt ad. , Cell , 671, 1982).

Um clone de DNA (ήt 188) contem o locus do gene 4 humano conforme determinado por mapeamento de restrição e por análise da sequência de nucleotideos usando o processo de Gil-bert-Maxam (Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 560, 1977). A porção do clone 9^ 188 que é sequênciada corresponde exactamente á publicada para o gene V 4 humano entre os nucleotideos 27--98 (base de dados EMBL entrada HUMIGCD2). Um fragmento de restrição HindIII/EcoRI de aproximadamente 3 kb, incluindo os 4 exões do locus do gene γ 4, é subclonado no vector plasmideo pUCI2 clivado usando HindIII/EcoRI. O plasmideo é designado p V 4/1. O sítio HindIII em p Y 4/1 é encontrado no locus do gene Y 4 do DNA de murganho Balb/c (posição de -61- \

nucleotideo 1 da base de dados EMBL entrada HUMIGDCD2; Ellison et al . , DNA 1_, 11, 1981). O sítio EcoRI deriva do sítio de clonagem EcoRI no vector de clonagem do bacteriófago lambda Charon 4a no extremo do clone ££ 188. Na Fig. 4 está apresentado um mapa de restrição de p ^4/1.

Exemplo 8: Construção de genes quiméricos murganho/humano ( Y 4; K) das cadeias H e L de Ig anti-CEA e inserção destes genes em vectores separados

Construção quiméricas portadores de genes quiméricos murganho/humano das cadeias H e L anti-CEA, respec-tivamente, são construídas e são sequênciadamente transferidas para células hospedeiras com a ajuda de dois vectores de expressão como descrito a seguir (exemplos 8 a 9). A menos que de outro modo seja referido, os processos expaimentais são os descritos em Maniatis et al ("Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spr. Harbour, N.Y., 1982 ) . 8.1 Clonagem molecular de um segmento de DNA de murganho contendo o elemento potenciador da cadeia L de Ig

Um fragmento de restrição Alui de apro-ximadamente 475 pb contendo o potenciador da transcrição de mRNA da cadeia L de Ig de murganho (Picard & Schaffner, Na-ture 309, 80, 1984; nucleotideos 3691-4164 do locus da cadeia L de Ig de murganho Balb/c, sequência da base de dados EMBL entrada MUSIGKJC2) é clonado por ligação de extremos cegos no vector plasmídeo pUC12 linearizado usando a endonuclease de restrição Smal. O DNA ligado é usado para transformar E. coli K12/803 competente e os clones são seleccionados após crescimento durante a noite em placas de agar nutritivo (Oxoid) contendo 50 yug/ml de ampicilina. Das duas orientações possíveis para o DNA inserido selecciona-se um clone contendo o plasmí- -62-

deo pEL22, o mapa de restrição do qual está apresentado na Fig. 3. pEL22 contém o fragmento de DNA Alui de 475 pb de murganho na mesma orientação do genoma de murganho, com o seu extremo 3' adjuvante ao sítio EcoRI no vector pUCR. A sua orientação é determinada pela sequênciação de nucleotideos com o protocolo de sequênciação de Sanger descrito no Exemplo 4.3, usando as modificações para sequênciação directa de moléculas de DNA de plasmídeo (Chem & Seeburg, DNA, 4_, 165, 1985). 0 iniciador de sequênciação usado é o iniciador de sequênciação reversa da Amersham (Cloning and Sequencing Hand, Amersham International PLC, UK). 8.2 0 gene da cadeia L quimérica (pCEA-CkGa) 0 esquema para a construção de pCEA-CkGa está apresentado na Fig. 3. 0 plasmideo pDA14a (Exemplo 7.2) e o plasmideo pEL22 (Exemplo 8.1) são digeridos totalmente com a endonuclease pDA14a é separada das sequências do vector por electroforeseem gel de 1% (p/v) de agarose e recuperada por precipitação com etanol após extracção com fenol/ /CHCl^ (Exemplo 3.2). Quantidades equimolares da inserção de DNA de 2,5 de pEL22 e pDAl4a cortadas com EcoRI são ligadas uma à outra durante a noite a 4°C usando a DNA-ligase de T4 (Boehringer) e usadas para transformar j:. coli K12/803 competente. As colónias resistentes à ampicilina são selec-cionadas por sementeira em placas de agar contendo 50 pg/ml de ampicilina e incubação durante a noite a 37°C. Seleccio-nam-se colónias isoladas e o DNA de plasmídeo é preparado a partir de mini-culturas de 5 ml de acordo com o processo descrito por Ish-Horowicz & Burne (Nucleic Acids Res. 9_, 2989, 1981). A digestão de plasmídeos recombinantes usando a endonuclease de restrição Xbal é usada para determinar a orientação do fragmento EcoRI de 2,5 kb em relação ao elemento contendo o pctênciador da transcrição de pEL22. Um clone contendo estes fragmentos na orientação pretendida é seleccionado e o DNA de plasmídeo isolado. O plasmídeo recombinante correspondente é referido como pKYl4a. O DNA de pKYl4a é parcial- -63-

mente digerido usando a endonuclease de restrição Xbal, extraído com fenol/CHCl^ e recuperado por precipitação com eta-nol. Após recuperação, o DNA é tratado com DNA-polimerase-I fragmento Klenow (Boehringer) na presença de dNTPs para efec-tuar uma reacção de preenchimento nos extremos de DNA clivado com Xbal. Os fragmentos de DNA com extremos cegos são ligados na presença de DNA-ligase de T4 (Boehringer), usados para transformar E.coli K12/803 competente e feitas mini-preparações de DNA de plasmideo a partir de clones individuais resistentes à ampicilina, como descrito acima. O mapeamento de restrição dos plssnídeos recombinantes por digestão terminal usando HindIII+Xbal é usado para identificar um plasmí-deo recombinante (pXba 5.5) contendo um sítio de restrição Xbal eliminado na posição indicada entre parêntesis na Fig. 3. A inserção de DNA completa (aproximada-mente 3 kb) de pXba 5.5 é isolado por digestão parcial do plasmideo com EcoRI seguido de digestão completa com Sall, separação das sequências de DNA vector por electroforese em gel de 1% de agarose, seguido de extracção com fenol/CHCl^ e precipitação com etanol como descrito acima. O fragmento de DNA da inserção com aproximadamente 2 kb do pCEA-L29 é recuperado de modo semelhante após digestão terminal com EcoRI/ /Sall. Os fragnentos de DNA recuperados são quantificados. 0 vector eucariótico plasmideo pSV2ght (Mulliger & Berg, Science 20 9, 1422, 1980) é digerido totalmente usando EcoRI e oDNA extraído de modo semelhante com fenol/CHCl^, recuperado após precipitação com etanol e quantificado. Quantidades equimolares de pSV2ght cortado com EcoRI, o fragmento de DNA de murganho EcoRI/SalI de 2 Kb de pCEA-L2a e o fragmento de DNA de murganho SalI/EcoRI de 3 kb de pXba5.5 são ligados uns aos outros numa reacção de ligação por três vias na presença de DNA-ligase de T4 (Boehringer). Os plasmideos recombinantes são novamente seleccionados como descrito acima e os que possuem os fragmentos de DNA com a orientação correcta caracterizados por mapeamento de restrição. Um reconhecimento designado pCEA-CKGa contem os fragmentos de DNA na orienta- -64-

ção mostrada na Fig. 3. 0 gene da marca selectiva (ght) de rivado de pSV2ght e o gene quimálco resultante murganho/huma-no da cadeia L de Ig tem a mesma polaridade de transcrição. 8.3 Clonagem molecular de um segmento de DNA de murganho contendo o elemento potenciador da cadeia H de Ig

Um segnento de DNA HindIII/EcoRI de 1,6 kb do genoma de murganho Balb/c (posições de nucleotideos 1963-3559, sequência do banco de dados EMBL entrada MUSIGCD07) é tratado com o fragmento Klenow da DNA-polimerase I (Boehrin-ger) na presença de dNTPs de modo a gerar uma molécula de DNA de cadeia dupla com extremos cerses. 0 DNA é extraído com fenol/CHCl^ e recuperado após precipitação com etanol. Os adaptadores de DNA HindIII de cadeia dupla são adicionados por ligação na presença de DNA-ligase de T4 (Boehringer) e repetido o processo de extracção/precipitação. O fragmento de DNA é então tratado com endonucleases de restrição HindIII+ +XbaI e o mais pequeno dos dois fragmentos Xbal/HindIII gerados (aproximadamente 670 pb) é isolado após separação do outro por electroforese em gel de 1% (p/v) de agarose. Este fragmento é clonado num vector plasmídeo pUCl3 clivado com Xbal/HindIII usando processos descritos no Exemplo 8.2. O plasmídeo resultante, referido como pDA4 (Fig. 4) contem o potenciador de transcrição da cadeia H de Ig de murganho. 8.4 O gene quimérico da cadeia H (pCEA- fr"4Na) O fragmento contendo o potenciador de Ig de murganho de pDA4 é recuperado após clivagem com EcoRI+HindIII por electroforese em gel de agarose/extracção com fenol-CHCl3/ /precipitação com etanol. A insação de DNA EcoRI/HindIII de 3 kb do p ^ 4/1 é isolado de modo semelhante. Os dois fragmentos são ligados um ao outro com o DNA do vector de plasmídeo pBR322 linearizado por digestão com EcoRI. Após transformação de E. coli K12/803, os recombinantes são selecciona-dos e feitas as mii-preparações de plasmídeo. O mapeamento -65-

de restrição usado EcoRI, HindIII e PstI conduz à identificação de clones recombinantes contendo os fragmentos de DNA pretendidos. Um destes clones é designado pDA16a (Fig. 4). 0 fragmento de DNA inserção de aproximadamente 3,7 kb do pDAl6a é recuperado após digestão terminal usando as endonu-cleass de restrição Xbal e EcoRI, seguido de electroforese em gel de agarose/extracção com fenol-CHCl^/precipitação com etanol. 0 fragmento EcoRI/Xbal de aproximadamente 1,7 kb do pH 8al, contendo o segmento da cadeia H rearranjado V-D-J4 do gene H8 é purificado de modo semelhante. Os dois fragmentos são quantificados e ligados um ao outro em quantidades equimolares numa reacção de ligação de três vias com pSV2neo (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1_, 327, 1982 ) linearizado usando a endonuclease de restrição EcoRI na presença de DNA-ligase de T4 (Boehringer). Após transformação de E. coli K12/803, os recombinantes são seleccionados como descrito atrás e caracterizados por mapeamento de restrição usando as endonucleases de restrição EcoRI, HindIII, PstI e Xbal. Um recombinante com a orientação pretendida dos fragmentos de DNA é designado pCEA- X 4Na. Neste plasmideo o gene da marca selectiva (neo) derivado do vector pSV2neo tem a mesma polaridade de transcrição do gene quimáico murganho/humano da cadeia H de Ig.

Exemplo 9: Transfecção e expressão de genes quiméricos murganho/humano de Ig pCEA-CKGa e pCEA- y4Na em células linfócitas de murganho

Sp2/0 (ATCC CRL 1581) é uma linha celular de murganho, bem caracterizada, de origem linfóide. É uma variante não secretora de Ig de uma linha celular obtida a partir da fusão de uma célula de baço de murganho com o miè-loma X63-Ag8, uma sublinha do mieloma MOPC-21 (Kochler & Mils-tein, Eur. J. Immunol 6^, 511, 1976; Shulmam et al. , Nature 276, 270, 1978). As células Sp2/0 cultivadas em DMEM suplementado como descrito no Exemplo 2 são colhidas por centrifu- -66-

gação suave (130 g, 4°C) em tubos estéreis de 50 ml (Falcon 2070) e lavados e ressuspensos em PBS-CM (Seromed) numa concentração de aproximadamente 1x10 8 células) ml a 4°C. As células são mantidas em gelo durante até 30 min. 9.1 Transfecção de Sp2/0 com o gene quimérico da cadeia H de Ig pCEA- ^r~4Na A transfecção da construção do gene quimérico da cadeia H (pCEA- £f4Na) é conseguidapela adição de 20 ug de DNA de pCEA-^f 4Na super-enrolado em 50 ul de tampão 7 '

TE a 1x10 células Sp2/0 em 200 yal de PBS-CM num tubo de plástico estéril, em gelo. As células são vertidas para o vaso de um emparelhamento de electrotransfecção TA750 (Kruss GmbH, Hamburge, W. Germany)+sujeitas a um pulso eléctrico de 3500V/ /cm durante 10 yus, usando a câmara de electroporação cílindri-ca proporcionada pelo fabricante pré-arrefecida deitando PBS-CH estéril, arrefecido em gelo, no vaso do sistema antes de usar. As células são expelidas suavemente para um criotubo estéril (Nunc) e mantidas em gelo durante 10 minutos, após o qua são incubadas à temperatura ambiente durante mais 20 min. após diluição (1:3; v/v) com meio de crescimento (ver atrás). As células são então distribuídas por 96 poços em duas placas de cultura de tecidos de 48 poços cada (Costar) numa densidade celular de aproximadamente 1x10 células por poço em 1 ml de meio de crescimento DMEM contendo 15% de FCS, 1 mM piruva-to de sódio, 10 mM Hepes , 1 mM glutamina, 100 ^jM gentamicina (Gibco), 5 ng/ml de insulina+5 ng/ml de transferrina+5 pg/ml de selénio (CR-ITS premix, Collaborative Res. Inc. ) , 56 yug/ml de ácido fólico (Seromed), 36 ^ng/ml de L-asparagina (Calbio-chem), 116 ^g/ml de L-arginina HC1 (Calbiochem). Após incubação durante 48 h a 37°C numa atmosfera húmida contendo 7,5% de CC>2 incubadora Heraeus Cytoperm) , as células transfectadas são seleccionadas pela adição de 1 mg/ml de g418-sulfato (Ge-neticin, Gibco 066-1811). O meio e a droga são mudados de 2 em 2 dias. As células são testadas quanto à expressão de IgG -67-

humano após 14 dias usando o ensaio "dot" descrito no Exemplo 9.2. 9.2 Selecção de transfectantes contendo o polipeptideo da cadeia H de Iq humana intracelular Não se espera encontrar proteina correspondente à cadeia H de Ig no meio de células Sp2/0 transfec-tadas com a construção quimérica do gene da cadeia H, porque as cadeias H são secretadas apenas após associadas às cadeias L e as células Sp2/0 não contêm o polipeptideo funcional da cadeia L. A confirmação da expressão de polipeptideos da cadeia H intracelulares em células transfectadas com o gene quimérico da cadeia H de Ig pCEA- ^4Na é efectuada como se segue. Células transfectadas (ΙχΙΟ^) são colhidas a partir do meio de cultura por centrifugação suave, lavadas com PBS e ressuspensas em 10 pl de f^O. ^s células são rebentadas por três ciclos de congelação em neve carbónica e descongelação a 37°C. Os detritos celulares são removidos por centrifugação a 5000 g (Eppendorf Microcentrifuga) à temperatura ambiente. A expressão da cadeia pesada intracelular é analisada porum processo descrito por Towbin & Gordon (J.

Immun. Meth. 72, 313, 1984) por transferência das amostras (1 pl) do sobrenadante para membrana de acetato de celulose (Millipore HAWAG, 0,45 um de tamanho de poro). Após bloquea-mento da ligação inespecifica por incubação das membranas em tampão RIA (1% BSA (Fluka Fraction V, 05480), 0,2% NaN^ (Merck), 0,1% de vermelho de fenol (Seromed) em PBS) a 37°C durante 20 min, elas foram lavadas em PBS e depois incubadas durante 2h a 37°C em soro revelador contendo IgG de cabra anti--humano (marcado com fosfatose alcalina, Tago) numa diluição de 1:1000 em tampão RIA. As membranas são lavadas 6x em PBS seguido de 6x em F^O, aP°s o que elas são incubadas à temperatura ambiente durante 15 min em tampão substracto consistindo numa mistura a 1:1 das duas soluções que se seguem preparadas imediatamente antes de usar: (a) 1 mg/ml de sal Fast Blue B (Fluka, 44660 ) em F^O; (b) 1 mg/ml de 2-naftilfosfato, -68-

sal mono-sódico (Fluka, 71100) em tampão borato 60 mM, pH 9,7. A reacção é parada por incubação das membranas em metanol: ácido acéticorágua (5:1:5, v/v). As células viáveis, correspondendo àquelas que dão uma côr forte significando activida-de de fosfatase alcalina (expressando assim níveis elevados da cadeia pesada de IgG humana intracelular), são cLonadas .

De entre várias dessas linhas celulares clonadas, uma (EFVIII/ /Y4Na 75-75) é escolhida para um segmento ciclo de transfec-ção com o plasmídeo pCEA-CKGA contendo a construção quimérica do gene da cadeia L. 9.3 Transfecção de EFVIII/ V 4Na 75-75 com o gene quimérico da cadeia L de Ig pCEA-CKGa

As células de FFVIII/γ4Na 75-75 ou qualquer outra linha celular preparada de acordo com o Exemplo 9.2 são expandidas por crescimento no meio descrito no Exem- 7 pio 2. Aproximadamente 1x10 células são colhidas por centrifugação suave e lavadas/ressuspensas em 200 ^il de PBS-CM em gelo. As células são então transfectadas usando 10 jiq de DMA pCEA-CKGa super-enrolado e os transfectantes semeados em placas de cultura de tecidos usando o processo descrito no Exemplo 9.2. Após crescimento durante 60 h as células tras-fectadas são seleccionadas usando meio de crescimento contendo 0,125 pg de ácido micofenólico (Calbiochem, 475913, da Boehring Diagnostics), 250 pg/ml de xantina e uma diluição de 1:45 de hipoxantina/timidina (HT, 50xconc. , Boehringer, 623091). A concentração de ácido micofenólico é aumentada para 0,5 ^ug/ml dentro do período de crescimento de 14 dias, mantendo a quantidade de HT e xantina constante. Após este período, o meio de cultura celular dos poços das placas de cultura de tecidos é testado quanto a IgG secretada, como descrito no Exemplo 9.4. -69-

9.4 Ensaio de detecção de anticorpos e determinação do nível de IgG humana secretada em células transfectadas

Placas de micro-ELISA de fundo plano (Immulon, Dynatech, M129A) são revestidas com 1 μς/poço de anticorpo de cabra anti-K humana (Tago 060401) ou com 500 ng/ /poço do antigénio careinoembrionário humano purificado (Tu241 um presente do Prof. J.P. Mach, Department of Biochemistry, University of Leusanne), por incubação durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS, a ligação inespecifica é bloqueada por incubação com tampão RIA (Exemplo 9.2) durante 20 min. a 37°C numa câmara humidificada, seguida de lavagem com PBS. Adicionam-se sobrenadantes celulares (50 μΐ ) e incuba-se durante 2h a 37°C. Após lavagem com PBS, o anticorpo quimérico ligado é revelado usando anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com fosfatase alcalina (Tago, 902002) na diluição recomendada (1:1000) em tampão RIA. As placas são incubadas durante 2h a 37°C. Lavam-se as placas várias vezes com PBS antes da adição de 150 ^jl de tampão substracto que consiste em 2 comprimidos de substrato de fosfatase (p-nitrofenilfosfato , Sigma, 104R) em 10 ml de tampão substrato (800 ml de H^O, 97 ml de dietanolamina, 130 ml de HC1 1M, 200 mg de NaN^ , 200 mg de MgC^.ô^O, pH ajustado a 9,7. Após incubação durante 15 minutos a 37°C a reacção corada é parada pela adição de 50 jal de 1M NaOH £405-495 ® medido usando um Titer-tek , Multiscan MC. As células viáveis de poços paralelos tendo níveis elevados de IgG humana secretado são clonadas.

Um de vários desses clones designado EFVIII/f4Na 75-75/CKGa 5-6 (referido como (E 75-5-6 ) foi depositado na "Collection National de Cultures de Microorganismes" do Institut Pasteur, Paris, em 15 Dez. de 1987, com o número de acesso 1-720.

Para a quantificação da quantidade de anticorpo quimérico ( p4; K) secretado por CE 75-5-6 usam-se várias proteínas padrão do mieloma IgG4K humano (do Dr. F. Skvaril, Institute of Câncer Research, Berne). Com base neste teste o transfectoma CE75-5-6 secreta 1 ug/ml de anticorpo -70-

quimérico para o meio de cultura após 6 dias de crescimento.

Exemplo 10: Construção de genes quiméricos murganho/humano ( (Γ 4 ; K) da cadeia H e L anti CEA e inserção destes genes num vector de dupla-construção

Construções quiméricas contendo genes quiméricos, murganho/humanos das cadeias H e L anti-CEA, res-pectivamente, são construídas e transferidas para células hospedeiras com a ajuda de um vector único compreendendo genes quiméricos das cadeias H e L como descrito nos Exemplos 10 e 11 que se seguem. A menos que de outro modo seja referido os processos experimentais são os descritos em Maniatis et al ("Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spr. Harbour, N.Y. , 1982 ) . 10.1 Clonagem molecular de um segmento de DNA de murganho contendo o elemento potenciador da cadeia L de Ig (pre-cursor da cadeia L-ACK) O gene CK de murganho é desprovido das sequências germinais através do isolamento de um fragmento PstI/Xmnl de 2 kb e de um fragmento XmnI/BamHI de 1,1 kb do pLCEA/14A. (Walfield et_ al_. , Nucl . Acids Res. £, 4689, 1980 ). Este plasmídeo contem o gene da cadeia leve CK NS2 de murganho, rearranjado no segmento de união J2 num fragmento de restrição BamHI/BamHI de 7,0 kb. Este fragmento é equivalente ao fragmento BamHI/BamHI de 7,0 kb derivado de MOPC21/NS-ln como descrito por Walfield e_t al_ (ver acima). A sequência exacta do fragmento PstI/BamHI de 3,9 kb está apresentada na base de dados EMBL entrada MUSIGKJC2, posições de nucleotí-deos 2368-6258. A clonagem destes dois fragmentos no vec- -71-

tor pLJCl2, cortado com as enzimas de restrição PstI e BamHI, cria um plasmídeo recombinante designado pMlACK. o fragmento clonado resultante contem sequências germinais do locus da cadeia leve de imunoglobulina de murganho começando no sitio PstI, 268 pb a jusante do segmento de união J5, através do sítio BamHI, 3884 pb a jusante do sitio PstI. As posições de nucleotideos abaixo são indicadas em relação à primeira base desta sequência de reconhecimento PstI. 0 fragmento inclui as sequências potenciadoras de CK de Ig de murganho em 1542-1666 na sua configuração germinal original. Da região codificadora de CK de murganho retiraram-se os nucleotideos entre as posições 2021 e 2754 usando sítios Xmnl existentes nestas posições recreando um sítio Xmnl na junção do gene CK com delecção. O fragmento total PstI/BamHI mede 3152 pb e tem agora um sítio único Xmnl no sitio do gene CK de murganho com delecção na posição 2017-2026, para fins de clo-nagem. Na Fig. 5 está apresentado um mapa de restrição pMlAcK. 10 .2 O gene quimérico da cadeia L (pMceacic-la)

As sequências codificadoras de Ck humanas são isoladas a partir do plasmideo pDAl4a, um pBR322 recombinante, contendo um fragmento EcoRI/EcoRI de 2,5 kb dentro do qual está situada a região codificadora de CK humano com Ca. 320 pb. Este plasmideo foi descrito no Exemplo 7.2 e nas figuras 3 e 5 está apresentado um mapa de restrição. Um fragmento Sph/Hhal de 724 pb foi purificado e os extremos protuberantes 3' preenchidos com DNA-polimerase do bacterió-fago T4. O fragmento começa 106 pb 5' e prolonga-se até 296 pb 3' da região codificadora de CK humana. Inclui também o sítio de poliadenilação que se situa 177 pb 3' da sequência codificadora de CK. pMlCK contem dois sitios Xmnl, um na junção das sequências CK de murganho com delecção e um na sequência codificadora da Γ^-lactamase derivada de pUCR, que -72-

confere resistência à ampicilina. pMl&C é parcialmente restringido à ampicilina. pMl a foi cortado parcialmente com Xmnl e a forma linear purificada em gel. 50% deste material foi cortado no sítio Xmnl na sequência codificadora da p>--lactamase, 50% está cortado na zona de murganho. A inserção do fragmento CK humano no primeiro sítio Xmnl resulta num plasmídeo recombinante sem um gene da -lactamase funcional portanto apenas se encontram recombinantes que contenham o fragmento CK humano na posição da primeira região CK de murganho. São possíveis duas orientações. O plasmídeo recombinante contendo o fragmento CK humano na orientação correcta, o extremo N mais perto da região potenciadora de murganho, é identificado por análise de restrição dos plasmídeos recombinantes com a endonuclease de restrição Avall. Este plasmídeo é designado pMlHuCK-la.

As sequências da cadeia leve de CEA de murganho são isoladas a partir do plasmídeo recombinante pCEA-L2a. Este plasmídeo contem um fragmento Xbal/Xbal de 1,9 kb codificador da parte variável funcional da cadeia leve anti-CEA de murganho e foi descrito anteriormente (Exemplo 4.2). Nas Figs. IA, 3 e 6 está apresentado um mapa de restrição .

Por digestão parcial com Xbal seguido de digestão total com EcoRI, isola-se o segmento variável da cadeia leve anti-CEA de murganho num fragmento EcoRI/Xbal. Este fragmento tem 24 pb extra derivados do poliadaptador pUCl2, incluído sítios de restrição para BamHI, Smal e Saci. Estes sítios ficam 5' relativamente à região codificadora da zona variável anti-CEA de murganho. Na construção genómica final eles estão situados na junção do fragmento recombinante e do vector de expressão. O fragmento EcoRI/Xbal de 1,9 kb é ligado ao fragmento PstI/BamHI de 3,8 kb do pMlHuCK-la descrito -73-

V

atrás contendo o potenciador de CK de Ig de murganho e a região codificadora de CK humana. Para fins de clonagem isola--se um fragmento Xbal/EcoRI usando o sítio Xbal 18 pb a jusante do sítio PstI e o sítio EcoRI no poliadaptador pUCl2, que adiciona 18 pb a jusante do sítio BamHI incluindo os sítios de restrição Smal e Seal. Estas sequências poliadapta-doras estão situadas na segunda junção do fragmento recombi-nante e vector de expressão.

Os dois fragmentos são ligados e clonados no vector de expressão pSV2gpt, cortado com EcoRI, numa ligação de três vias. Duas orientações do fragmento relativamente ao gene gpt, são isoladas, com gpt e região variável de murganho anti-CEA-CK humano na mesma orientação de transcrição (orientação a) ou na orientação oposta de transcrição (orientação b). Ambas as orientações são identificadas por dupla digestão com as endonucleases de restrição Hindlll e Pst. Elas foram designadas pMcea C^-la e pMceaC^-lb. A sua inserção de DNA contem toda a região codificadora da região variável de murganho anti-CEA-região constante CK da cadeia leve de imunoglobulina humana na configuração genómica de murganho original. 0 fragmento é recuperado como um fragmento único EcoRI/EcoRI de ca. 5,7 kb. 10.3 O gene quimérico da cadeia H(cpCEA- y4Na) O gene quimérico da cadeia H pCEA-^MNa foi construído conforme descrito nos exemplos 83 e 84. 10 .4 A dupla construção quimérica portadora dos genes das cadeias H e L anti-CEA murganho/humano (Y4; K)

As cadeias leve e pesada quiméricas anti--CEA de murganho-constante humana estão contidas num único fragmento EcoRI/EcoRI, a cadeia leve num fragmento de 5,7 kb em pMcea cft -la, a cadeia pesada num fragmento EcoRI/EcoRI de 5.3 kb em pCEA-^4Na. -74-

Através da ligação dos fragmentos EcoRI/ /EcoRI das cadeias leve e pesada e destruição do sítio EcoRI na junção, criou-se uma construção de genes duplos onde todas as sequências codificadoras e reguladoras dos genes das cadeias H e L anti-CEA murganho/humano ( ^4; K) estão situadas num fragmento EcoRI/EcoRI de 11,0 kb. pMcea cft-la e pCEA- ^4Na são digeridas parcialmente com EcoRI seguido de preenchimento do extremo protuberante 5' com o fragmento grande da DNA-polimerasel de E. coli (fragmento Klenow). A forma linear de cada um dos plasmideos foi purificada em gel seguido de dupla digestão com as endonucleases de restrição EcoRI e Hpal. Isto liberta o fragmento quimérico do vector pSV2 gpt ou pSV2neo, respec-tivamente, uma vez que apenas os sítios de restrição para Hpal estão nos dois vectores. Apenas um dos extremos EcoRI 5' de cada um dos fragmentos é um extremo cego. 0 outro extremo mantém um extremo coesivo EcoRI 5'. Os dois fragmentos são ligados um ao outro numa proporção de 1:1 com a liga-se do bacteriófago T4 para formar moléculas concateméricas.

Um certo número de fragmentos da cadeia leve são ligados a um extremo cego de um fragmento de cadeia pesada. A digestão total com EcoRI produz um certo número de fragmentos EcoRI/ /EcoRI de 11,0 kb dos quais um terço é uma cadeia leve, ligada a um fragmento quimérico murganho/humano ( f4; K) da cadeia pesada anti-CEA. Os restantes dois terços consistem em dimeros de cadeias pesada-pesada e leve-leve que não são presumivelmente clonáveis . A purificação em gel dos fragmentos EccRE/ /EcoRI com Ca. de 11 kb seguido de clonagem no vector de expressão pSV2gpt, digestão com EcoRI e transformação de ceíulas E. coli K12/803 resulta numa série de plasmideos recombinan-tes. Estes são testados por hibridação de colónias com o fragmento Xbal/Xbal de 1,9 kb codificador das sequências da região variável da cadeia leve de murganho anti-CEA, isolado a partir do plasmideo pCEA-L2a (Exemplo 4.2). O DNA é preparado a par- -75- \ tir de colónias positivas e os plasmideos recombinantes preparado a partir de colónias positivas e os plasmideos recombinantes tendo os fragmentos de DNA quiméricos murganho/huma-no (γ 4; K) das cadeias pesada e leve anti-CEA são identificados por análise com enzimas de restrição com as endonuclea-ses de restrição EcoRI, Xmnl e PstI. Um plasmideo recombi-nante obtido desta forma foi designado pCEA(H+L)2neo. Os fragmentos quiméricos das cadeias leve e pesada anti-CEA estão arranjados na orientação de transcrição oposta. 0 fragmento da cadeia pesada anti-CEA está na mesma orientação de transcrição do gene neo em pSV2neo. 0 sítio EcoRI na junção dos fragmentos quiméricos das cadeias leve a pesada anti-CEA é destruído mas o sítio Xmnl esperado, que é criado pela união dos dois sítios EcoRI cegos, não está presente. A partir desta dupla construção de genes quiméricos isolaram-se as sequências codificadoras e reguladoras murganho/humano ( Y4; K) das cadeias leve e pesada anti-CEA na forma de um único fragmento EcoRI/EcoRI de 11,0 kb. Na Figura 6 está apresentado um mapa de restrição de pCEA(H+L)2neo.

Exemplo 11: Transfecção e repressão da construção dupla de genes quiméricos murganho/humano ( Y4;K) das cadeias H e L de Ig anti-CEA pCEA(H+L)2 neo em células linfóides de murganho A transfecção da construção dupla de genes quiméricos murganho/humano (γ 4;K) de Ig anti-CEA pCEA(H+L)2neo foi conseguida através de isolamento das regiões codificadoras murganho/humano ( γ 4 ; K) das cadeias H e L anti--CEA num único fragmento de DNA EcoRI/EcoRI ca. 11,0 kb a partir do pCEA(H+L)2neo. 15 pg deste fragmento foram mistura dos com 1,5 ^g de pSV2neo, linearizado com EcoRI, em 50 ^ul de tampão TE e subsequentemente usados para transfectar células linfóides de murganho Sp2/0 , exactamente como descrito no Exemplo 9 para as construções simples de genes quiméricos murganho/humano (^4; K) de iG anti-CEA. -76-

A selecçao relativamente à resistência à neomicina, detecção de anticorpos e determinação do nível de IgG secretada em células transfectadas são efectuadas exac-tamente como descrito no Exemplo 9.2 e 9.3, respectivamente.

Uma linha de células clonais isoladas deste modo e seleccio-nada relativamente a níveis de expressão elevados do anticorpo monoclonal quimérico foi designada EFIX-pCEA-Ig-( γ4; CK) 4-8-13 (referida como CE 4-8-13) e depositada na "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes 4 do Institut Pasteur , Paris, em 22 de Nov. de 1988 com o número 1-818. 0 transfectoma CE 4-8-13 secreta 10 ug/ml de anticorpo quimérico para o meio de cultura após 6 dias de crescimento, conforme determinado pelos processos descritos no exemplo 9.4.

Exemplo 12: Caracterização do anticorpo monoclonal quimérico A ligação do anticorpo monoclonal quimérico (T 4; K) a CEA é determinado pelo teste de ELISA descrito no Exemplo 9.4 para a selecção de anticorpos quiméricos.

Com os Mab quiméricos anti-CEA secretados pela linha celular CE 4-8-13, é necessário menos de 8 ng/ml do Mab para resultar numa densidade óptica de 0,1 no teste (ver Figura 7).

Para os testes de competição usam-se o antigénio CEA purificado e uma fracção de Ig purificada derivada do liquido as-cítico de murganhos gerado a partir do hibridoma CE 25. Os métodos usados são baseados em processos publicados (Voller et al. , "MantaL of Climical Immunology" , 1976, 506 ). A ligação do anticorpo quimérico a CEA purificado no teste de ELISA é inibida por CEA solúvel ou com o anticorpo purificado CE 25. Cerca de 99% do anticorpo monoclonal quimérico secretado pode ser adsorvido ao antigénio CEA imobilizado. Enquanto o hibridoma CE 25 parental produz um anticorpo murino (γ 1; K) quando revelado com soro de cabra anti IgGl de murganho (fosfata-se alcalina marcada), CE 75-5-6 e CE 4-8-13 não.

Os testes imunológicos acima demonstram que os anticorpos secretados pelas linhas celulares CE 75-5-6 e CE 4-8-13: (a) ligam-se ao antigénio CEA; (b) possuem determinantes da região constante humana ( ^4; K) e não possuem os correspondentes determinantes de murganho; (c) são inibidos pelo correspondente anticorpo de murganho produzido pelo hibridoma CE 25; (d) ligam-se especificamente ao antigénio CEA, uma vez que a sua ligação é inibida por CEA solúvel; (e) são produzidos em níveis elevados em transfectomas contendo os genes quiméricos das cadeias H e L de Ig como descrito acima (1 jjg/ml pelo CE 75-5-6; 10 jjg/ml pelo CE 4-8-13).

Exemplo 13: Isolamento e purificação de anticorpos monoclonais quiméricos para fins de diagnóstico/terapêutica 13.1 Síntese in vitro

Uma linha celular como descrito atrás que sintetiza os anticorpos monoclonais quiméricos é cultivada em esferas de vidro de uma coluna. A pré-cultura para esta coluna é preparada como se segue: As células de 4 frascos 2 de cultura de tecidos de 175 cm confluentes são usadas para inocular um "stapler" Nunc. As células aderentes são destacadas do frasco levando a camada de células confluentes com uma solução de tripsina (Verseno feita com iguais volumes de solução de tripsina (Gibco, 0,5 g/1) e Verseno (Gibco, 1:5000) 4x10° células são ressuspensas em 400 ml de meio DMEM modificado (DMEMme^ = DMEM contendo em adição 1 mM Na-piruvato, 2mM glutamina, 50 uM 2-mercaptoetanol, 10 mM Hepes e caso não seja de outro modo indicado, 10^ FCS). O volume da suspensão é levado a 500 ml pela adição de DMEMmed fresco. 500 ml da -78-

suspensão de células são transferidos para um Nunc e incubado a 37°C numa atmosfera de ar contendo 10% CC^. Quatro, sete e dez dias após inoculação adiciona-se mais meio (3x500 ml). Quatorze dias após inoculação colhem-se as células e usam-se para inocular o reactor com esferas. O meio condicionado é primeiro removido do "stapler" . Adiciona-se 500 ml da solução de tripsina/Verseno ao "stapler" e toda a camada de células é passada por esta solução. A solução de tripsina/ /Verseno livre é rejeitada e a camada de células é deixada em contacto com a tripsina/Verseno residual durante 5 min. Adiciona-se outra vez 500 ml de meio condicionado às células. As células são destacadas por agitação forte do "stapler". Adiciona-se mais 1,5 1 do meio condicionado ao "stapler" e toda a suspensão é então transferida para o reactor. O reactor consiste num vaso de vidro cilíndrico de 10 1 com esferas de vidro de boro-silicato de 2 mm de diâmetro. O meio é circulado através do reactor por meio de uma bomba externa a uma velocidade de 45 1/h. A concentração de oxigénio dissolvido e o pH do meio circulante é medido e controlado contia-nuamente. Usa-se oxigénio puro para manter o nivel minimo de oxigénio dissolvido acima de 10% da saturação e CC^ e 1,0M NaOH são usados para controlar o pH entre 7,0 e 7,3. O volume de liquido no reactor e o circuito externo é de 5 1. O sistema é mantido num banho-maria a 37°C. Após inoculação as células ficam a crescer num meio DMEM , contendo 10% soro. Logo que o nível de glucose do meio desça abaixo de 1 g/1 inicia-se a troca contínua de meio a uma velocidade de 2 1/dia. Quando o nivel de oxigénio dissolvido decresce para 20% a concentração de soro no meio é baixada para 1,25. Dois dias mais tarde a velocidade de troca é aumentada para 1 1/dia.

Nos dias seguintes a velocidade de troca é ainda aumentada até se atingir um valor máximo de 5 1/dia. A partir desta altura o meio que sai é colhido para isolamento e purificação do anticorpo quimérico. -79-

13.2 Isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais quiméricos O meio de cultura é filtrado usando um sistema de ultrafiltração Minitan (Millipore Corp., Bedford, Mass.), através de um filtro cassete de 0,1 pm (tipo VVLP0MP04 Millipore). O filtrado é concentrado 10 vezes usando o sistema de ultrafiltração Minitan a que se adaptou cassetes de filtração com um peso molecular de exclusão de 30.000 (tipo PTTK0MP04, Millipore). O retentato concentrado é então preparado para cromatografia em proteina A-Sepharose pela adição de glicina e NaCl para uma concentração final de 1,5 M glici-na e 3M NaCl e o pH ajustado a 8,6 com 5M NaOH. Após passagem do meio de cultura concentrado através de uma coluna contendo proteina A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Suécia) o material não ligado é levado da coluna com tampão de ligação (1,5M glicina, 3M NaCl, pH 8,9 com NaOH) e a coluna elui-da com um gradiente de passos discretos de pH decrescente consistindo em ácido cítrico 100 mM ajustado a pH 3,0, 4,0, 5,0 e 6,0 com 5M NaOH como descrito na nota de aplicação da Pharmacia (Separation News Vol. 13, N9 5). A concentração mais elevada de anticorpo quimérico é determinada por um teste de ELISA eluindo a pH 4,0.

Exemplo 14: Determinação de CEA com um ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) 14.1 Marcação de anticorpos monoclonais quiméricos com fosfatase alcalina 1,4 mg de um anticorpo monoclonal quimérico em 1,4 ml de PBS é acoplado durante 2h com uma solução contendo 5 mg de fosfatase alcalina (Sigma P6774, tipo VII-T) de acordo com o método convencional de Voller et al, (Buli. World Health Organ. 5_3, 55, 1976 ) usando glutaraldeido (0,2% (v/v). 0 conjugado é transferido para 5 ml de tampão Tris -80-

0 ,0 5Μ, ρΗ 8,0, contendo 1 mM MgCl2, 1% BSA e 0,0 2% NaN3. A solução é mantida no escuro a 4°C. 14.2 Processo do ensaio

Placas de microtitulação em polipropileno (Dynatech) são revestidas durante um período de 2h a 37°C e durante a noite a 4°C com 150 1 de uma solução do anticorpo monoclonal quimérico secretado pela linha celular CE 75-5-6 ou CE 4-8-13 (10 pg/ml) num tampão pH 8,6 (soro fisiológico tramponado com carbonato contendo 0,02% de azida de sódio).

As placas são lavadas cincovezes com PBS e os sítios reacti-vos com proteína ainda presentes são saturados por incubação durante lh a 37°C com 250 jul de um tampão pH 7,4 (0,2% de gelatina e 0,2% de NaN^ e m PBS). As placas assim revestidas podem ser mantidas a 4°C neste tampão durante alguns dias. 50 yul de uma sériede diluições de uma solução a testar ou de uma solução padrão contendo CEA humano purificado, 50 jjI de tampão 7,4 e 50 pl de uma solução de anticorpo monoclonal anti-CEA marcado com fosfatase Mab 35 (Haskell et al., Câncer Res. £3, 3857, 1983) que reconhece um epítopo de CEA diferente do reconhecido pelo anticorpo quimérico (Exemplo 14.1) diluido a 1:100 com tampão pH 7,4 são misturados e incubados poços das placas de microtitulação durante 2h a 37°C e durante 30 minutos a 4°C. As placas são lavadas cinco vezes com PBS, depois incubadas durante 30 min a 37°C com 150 jj 1 de uma solução de p-nitrofenil-fos-fato (1 mg/ml em tampão de 10% de dietanolamina, 0,5 mM MgCl^, pH 9,8). Medindo a densidade óptica a 405 nm, determina-se a quantidade, p-nitrofenol libertado, a qual é proporcional à quantidade de enzima fosfatase ligada e portanto proporcional à quantidade de CEA humano na solução a testar. O teste pode também ser efectuado usando o anticorpo monoclonal marcado com enzima e secretado pela linha celular CE 75-5-6 ou CE 4-8-13 e revestindo as placas -81-

de microtitulação com o anticorpo monoclonal anti-CEA Mab 35 que reconhece um epitopo de CEA diferente do reconhecido pelo anticorpo quimérico.

14.3 "Kit" de testes para ELISA

Um "kit" de testes para o ensaio descrito no Exemplo 14.2 contem: placas de microtitulação em polipropileno, 20 ml do anticorpo monoclonal quimérico anti-CEA secretado pela linha celular CE 75-5-6 ou CE 4-8-13 (10 jiq/ml ) em soro fisiológico tamponado com carbonatos (0,9% NaCl, 0,42% NaHC03 , 0,00 72% Na2C03 , 0,02% NaN3 ) , 1 ml do anticorpo monoclonal anti-CEA, Mab 35, acoplado a fosfatase alcalina que reconhece um epitopo de CEA diferente do reconhecido pelo anticorpo quimérico (0,3 mg de anticorpo por ml) em tampão lis (0,05M, 1 mM MgCl2, 1% BSA, 0,0 2% NaN3 , pH 8,0), 2 ml de solução padrão contendo 5 ug de CEA humano purifi cado 300 ml de PBS , 300 ml de tampão pH 7,4 (0,2% de gelatina e 0,2% NaN3 em PBS) 50 ml de p-nitrofenil-fosfato (1 mg/ml) em tampão dietanola-mina (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, ajustada a pH 8,9 com HC1), curva de calibração, escala de intensidades de côr manual de instruções.

Claims (2)

1. reivindicações li. _ Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal quimérico consistindo em regiões variáveis originários de ratinho e regiões constantes humanas, os quais reconhecem o antigénio carcinoembrionário humano (CEA) e seus derivados caracterizado por as células de mamífero produtoras de tais anticorpos monoclonais quiméricos serem multiplicados in_ vivo ou in_ vitro e, caso se pretenda, os anticorpos monoclonais quiméricos resultantes serem convertidos nos seus derivados. 2 â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados que reconhecem epitopos de CEA não presentes em antigénio NCA^^ e NCA^ não específicos que dão reacção cruzada, em glicoproteinas biliar ou em gra-nulócitos . 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados com uma afinidade de pelo menos 2,1 x IO1 litros/mole para CEA humano. 4 §. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula FRi-Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Ser-Leu-His-FRz I___ CDR1L --1 Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser I- CDR2L - -Ile-Ser-FRj-Gln-Gln-Ser-His-Gly-Trp-Pro-Phe-Thr-FRi, CDR3L (I), -84-

   em que FR^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 28 amino-ácidos naturais, FR2 é um resíduo polipeptidico compreendendo 14-16 aminoácidos naturais, FR^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 30-34 aminoácidos naturais, e FR^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 9-11 aminoácidos naturais e em que o aminoácido Cis pode estar no estado oxidado formado pontes S-S. 5ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I, em que os resíduos polipeptidicos das regiões FR^, FR^, FR^ e FR^ são os que preferêncialmente ocorrem em anticorpos de murganho. 6 â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I, em que FR^ é um resíduo polipeptidico da fórmula A-Gly-Asp-Ile-Leu-Léu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Leu-Ser-Val-Ser-Pro- Gly-Glu-Arg-Val-Thr-Phe-Ser-Cys (IA), em que A é hidrogénio, acilo ou o resíduo Ala-Ser-Arg, Ser--Arg ou Arg FR2 é o resíduo polipeptidico Trp-Tyr-Gln-Gln-Arg-Thr-Asn-Gly-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Met-Lys (IB), -85-

   FR^ é o resíduo polipeptidico Gly-Ile-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Phe-Thr-Leu-Thr-Ile-Asn-Ser-Val-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys (IC), e FR^ é o resíduo polipeptidico Phe-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys (ID), e em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. 7â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclo-nal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I, em que FR^, FR£, FR^ e FR^ são resíduos polipeptidicos da fórmula IA, IB, IC e ID, res-pectàamente em que um ou mais aminoácidos individuais são substituídos por outros aminoácidos fora das regiões CDR1L, CDR2L e CDR3L e em gue o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S. 8§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico'e seus deivados compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula -86- κ FRs-Thr-Tyr-Ala-Met-Ala-Trp-Val-FRt-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Thr-Tyr-Tyr-Pro-I- CDR1H -1 I----- Asp-Ser-Val-Lys-Gly-FR7-Gly-Phe-Tyr-Asp-Gly-Tyr-Leu-Tyr-Val-Val-FRe - CDR2H -1 I- CDR3H--Ί (II), em que FRg é um resíduo polipeptidico compreendendo 32-36 aminoácidos naturais, FRg é um resíduo polipeptidico compreendendo 14-16 aminoácidos naturais, FR^ é um resíduo polipeptidico compreendendo 32-34 aminoácidos naturais e FRg é um resíduo polipeptidico compreendendo 12-14 aminoácidos naturais e em que o aminoácido Cis pode estar no estadç oxidado formando pontes S-S. 9i. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula II, em que os resíduos polipeptidicos das regiões FRg, FRg e FRg são os que ocorrem preferêncialmente em anticorpos de murganho. 10i. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula II, em que FRg é um resíduo polipeptidico da fórmula B-Gly-Val-Gln-Cys-Glu-Val-Lys-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu- Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe Thr-Phe-Arg (IIA), -87-

   em que B é hidrogénio ou acilo, FRg é o resíduo polipeptidico Arg-Gln-Thr-Pro-Glu-Lys-Arg-Leu-Glu-Trp-Val-Thr-Ser-Ile (IIB), FR? é o resíduo polipeptidico Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Arg-Asn-Ile-Leu-Tyr-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Ile-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Arg (IIC), e FRg é o resíduo polipeptidico Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Ser-Leu-Thr-Val Ser Ser (IID), e em que o aminoácido Cis pode estar no estado oxidado formando pontes S-S. llã. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclo-nal quimérico e seus derivados compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada da fórmula II em que FRg , FRg , FR^ e FR8 são resíduos polipeptidicos da fórmula IIA, IIB, IIC e -88-

   IID, respectivamente em que um ou mais aminoácidos individuais são substituídos por outros aminoácidos fora das regiões CDR1H, CDR2H e CDR3H e em que o aminoacido Cis pode estar na forma oxidada formando pontesS-S. 12â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações a-11, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compren-dendo regiões constantes da caieia leve humana K ou yí- . 13â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões constantes da cadeia pesada humana \"1, p2 , p ou γ4 . 14â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados compreendendo regiões constantes da cadeia leve humana K e regiões constantes da cadeia pesada humana ^4. 15§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14 , caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal quimérico e seus derivados com regiões variáveis da cadeia leve da fórmula I em que FR^, FR£, FR^ e FR^ são resíduos polipeptidicos da fórmula IA, IB, IC, e ID, respectivamente e em que o aminoácido Cis pode estar na forma oxidada formando pontes S-S, uma região constante da cadeia leve humana K, uma região variável da cadeia pesada da fórmula II em que FR^ , FR^ , FR^ e FRQ são resíduos polipeptidicos da fórmula IIA, IIB, IIC e IID, respectivamente e em que o aminoácido Cis pode estar no estado oxidado formando -89-

   pontes S-S e uma região constante da cadeia pesada humana γ4. 16â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal quimérico, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser clivado enzimáticamente ou quimicamente num fragmento. 17^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal quimérico, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser conjugado com uma enzima, um marcador fluorescente, um quelato de metais, uma substância citostática ou citotóxica, avidina, biotina ou similares. 18§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal quimérico, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser marcado radioactivamen- te. 19§. - Processo para a preparação, de um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável de cadeia leve de murganho e/ou de uma região variável de cadeia de murganho de anticorpos monoclo-nais quiméricos preparados por um processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido processo compreender a cultura de um hospedeiro transformado. 20 a. - Processo de acordo com a reivindicação 19, para a preparação de um DNA recombinante, caracterizado por o referido processo compreender os passos de: -90-

   a) isolamento de DNAs de murganho a partir de uma linha celular de hibridoma adequada, selecção dos DNAs pretendidos codificadores das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais dirigidos contra CEA humano sondas de DNA, b) isolamento de DNAs humanos a partir de uma biblioteca ge-nómica, selecção dos DNAs pretendidos codificadores das regiões constantes de anticorpos monoclonais usando sondas de DNA , c) construção de genes quiméricos murganho/humano através da incorporação dos passos a) e b) em vectores híbridos adequados , d) transferência dos vectores híbridos obtidos para um hospedeiro recipiente e e) selecção e cultura do hospedeiro transformado. 21â. - Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20 , caracterizado por se preparar um DNA re- combinante compreendendo uma inserção codificando uma região variável de cadeia leve de murganho especifica de CEA humano originária de DNA genómico da linha celular CE 25. 22â. - Processo de acordo ®m a reivindicação 19, 20 ou 21, caracterizado por se preparar um DNA re-combinante compreendendo uma inserção codificadora do poli-peptideo da fórmula I, facultativamente contendo intrões. 23^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-22, caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificando o polipeptideo da fórmula I em que FR^, FR2, FR^, e FR^ são polipeptideos da fórmula IA, IB, IC e ID, respectivamente, facultativamente contendo intrões . 24ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23 caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção da fórmula TCTAGACTGCTGTGGTCTTTTAAGTAGCATGAAAAACATCTGCTAAAGAAGGAATTAGTT 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 TGAACAT GCTAGAAATACATCT GT GATACTCT CAT CACTCTTGTT GGAAAGATAT GCAAG 61----------i-----------f----------f----------+---—----"f---120 AAGCACTATTTGGCTATTATTTGGAAAGTGCTATAATGTATTTTGATATCTCAACCTCTG 121---------+---------+---------+---------+'---------+---------+ 180 AAATTCTTCTGTATGTTGGCAGATTGTAAACCTTTACAAGGCTTTCATTCTCTTCTCTGG 181 ----------h----------h-----——+—--------240 AGAAAAATGTCTTTGTAGGCAATCCAGAATTTCTTATTTCTTGCTAATGAAATCTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 200 GTGTGATATCACTTTAGTTTCATGTGTTGTTATGCTTCATGTAATGTTAAGAAAGTTAAA 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 GATGCTCCAATCCATATTGTAAGAAACATTCCAAGCCATGGAATAAGGCATGGATTTGAG 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 ATGCTCTTTATTTCAAACTACTGAATATATCTTAGAGATTTCTTTAGACTGTGTTAAATA 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 TGT AACCATTTAAGT AGGAGTCAAGTCTCCTTTAAATCTCAACAGCTCTT CAGGT AACCA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 ACAAAAGGATAAATATTCTAATAAGTCACTAGGAGCATGCTCTTCTGACCAGGTCTTTCT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TATAAGCAACATGAAGACAGTATGATTTGCATAAGTTTTTCTTTCTTCTAATGTCCCTGC 601 ----————f·—————————+——— ——+------——h—660 CTCTTAGAGTATTATAAGAAGATCTTTCTAGGGATGTGTCATGGTCCACACAAAAATAGG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 MVSTPQFLVFLLFWIP MetValSerThrProGlnPheLeuValPheLeuLeuPheTrpIlePro GAAAGTGTGAAGATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCA 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 GGTAATGACTGTTTGGGTGTGGCAAAAAAGTGGAGATCTTATTTAAATACAAAATTTTCT 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 TGCTTTATTTGGAAGCCAATGTCACATGGGAATTGACTTTCAGTTTAAAGAAATTGATAC 841---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 AATAAAAGTCATTTATTTTTCTAAGTTGTTTAGAAGTGACTTTCATATTCAGTGTTATGA 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 -92-

   961 1021 1081 11 AI 1201 1261 1321 ASRGDILLTQS AlaSerArgGlyAspIleLeuLeuThrGlnSer TCGACTAATGTATCTTCCATTTTTCCAGCCTCCAGAGGTGACATCTTGCTGACTCAGTCT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 PAILSVSPGERVTFSCRASQ ProAlalleLeuSerValSerProGlyGluArgValThrPheSerCysArgAlaSerGIn CCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCACTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 SIGTSLHWYQQRTNGSPRLL SerlleGlyThrSerLeuHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySerProArgLeuLeu AGCATTGGCACAAGCTTACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 11 AO MKYASESI SG'IPSRFSGSGS MetLysTyrAlaSerGluSerlleSerGlylleProSerArgPheSerGlySerGlySer ATGAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 GTDFTLTINSVESE DIADYY GlyThrAspPheThrLeuThrIleAsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyr GGGACAGATTTTACTCTTACCATCAATAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTAC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 CQQSHGWPFTFGSGTKLEIK CysGlnGlnSerHisGlyTrpProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluIleLys TGTCAACAAAGTCATGGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 CGTAAGTGGACTTTTGTTCATTTACTTGTGACGTTTTGGTTCTGTTTGGGTAGCTTGTGT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 GAATTTGTGATATTT 1395 (III). 1381 + -93- 25â. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção da fórmula III em que um ou mais nucleotídeos individuais são substituídos por outros nucleo-tideos fora das sequências nucleotidicas da fórmula III da posição 1060-1102, 1147-1167 e 1263-1291, respectivamente. 26â. - Processo de acordo com a reivindicação 19 , caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificando uma região variável da cadeia pesada de murganho especifica de CEA humano originária de DNA genómico da linha celular CE 25. 271. _ Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 26, caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificando o polipepti-deo da fórmula II, facultativamente contendo intrões. 28i. - Processo de acordo com a reivindicação L9 , 26 ou 27, caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção codificadora do po-lipeptideo da fórmula II em que FR,-, FR^, FR^ e FRg são resíduos polipeptidicos da fórmula IIA, IIB, Ilc e IID, res-pectivamente, facultativamente contendo intrões. 29ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 26-28, caracterizado por se preparar um DNA recombinante compreendendo uma inserção da fórmula -94-

   AAGCTTGTTCTGTTCACATGCAAGGAGGGAAACTAAACTGAGTATGGTGAATCCCTAACC 1 ---------+---------+---------+---------+'---------+---------+ 60 AAAGGGAAAAAATGAAACTACAATATGTTTCAAATGCTGTAACTGAAATCTGGTTTTTTG 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 ATGCCTTATATCTGGTATCATCAGTGACTTCAGATTTAGTCCAACCCCAGAGCATGGTAT 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AGCAGGAAGACATGCAAATAAGTCTTCTCTCTGCCCATGAAAACACCTCGGCCCTGACCC 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGCAGCTCTGACAGAGGAGGCCAGTCCATGGATTTGAGTTCCTCACATTCAGTGATGAGC 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 MNFGFSLIFLVLV MetAsnPheGlyPheSerLeuIlePheLeuValLeuVal ACTGAACACAGACACCTCACCATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTT 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 L K G LeuLysGly TTAAAAGGTAATTTATTGAGAAGAGATGACATCTATTTTACGCACATGAGACAGAAAAAA 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 V Q ValGl TGTGGTTTGTTTTCTTAGTGACAGTTTTCCAACCAGTTATTCTCTGTTTGTAGGTGTCCA 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 CEVKLVESGGGLVKPGGSLK nCysGluValLysLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLy GTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 L S CAAS GFTFRTYAMAWVRQ sLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheArgThrTyrAlaMetAlaTrpValArgGl ACTCTCCTGTCCACCCTCTGGGTTCACTTTCAGGACCTATGCCATGGCTTGGGTTCGCCA 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 TPEKRLEWVTSI SSGGTTYY nThrProGluLysArgLeuGluTrpValThrSerlleSerSerGlyGlyThrThrTyrTy GACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATCCATTAGTAGTGGTGGTACCACCTACTA 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 PDSVKGRFTISRDNARNILY rProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgAsnlleLeuTy TCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTA +---------+---------+---------+---------+---------+ 720 661 -95- -95-

   \ LQVSSLRSEDTAIYYCARGF rLeuGlnValSerSerLeuArgSerGluAspThrAlalleTyrTyrCysAlaArgGlyPh CCTGCAAGTGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAAGAGGTTT 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 YDGYLYVVDYWGQGTSLTVS eTyrAspGlyTyrLeuTyrValValAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerLeuThrValSe CTATGATGGTTACCTCTATGTTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCACTCACCGTCTC 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 8A0 S rSer CTCAGGTAAGAATGGCC 841 ---------+------- 857 (IV).
2. 30- Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se preparar um DNA recombinan-te compreendendo uma inserção da fórmula IV em que um ou mais nucleotideos individuais são substituídos por outros nucleo-tideos fora das sequências de nucleotideos da fórmula IV da posição 575-595, 629-680 e 776-805, respectivamente. 31â. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar um DNA recombinan-te compreendendo uma inserção codificante uma região variável de cadeia leve de murganho fundida com uma região constante humana K ou ·^ . 32â. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por se preparar um DNA recombinan-te compreendendo uma inserção da fórmula III fundida com uma região constante K humana. 33â. -' Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar um DNA recombinante -96-

   compreendendo uma inserção codificadora de uma região variável de cadeia pesada de murganho fundida com uma região constante humana Y 1, \2, y3 ou Jf 4 . 34§. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por se preparar um DNA recombinan-te compreendendo uma inserção da fórmula IV fundida com uma região constante humana ^ 4. 35§. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar um DNA recombinan-te que é um vector hibrido compreendendo uma inserção codificando uma cadeia leve quimérica murganho/humano preparada por um processo de acordo com a reivindicação 32 e/ou uma cadeia pesada quimérica murganho/humano preparada por um processo de acordo com a reivindicação 34 um replicão completo e uma ou mais sequências de marcas dominantes operacionalmente ligadas a sequências de controlo da expressão. 36§. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar um DNA recombinante que é um vector hibrido compreendendo uma inserção codificadora de uma cadeia leve quimérica murganho/humano preparada por um processo de acordo com a reivindicação 33 e/ou uma cadeia pesada quimérica murganho/humano preparada por um processo de acordo com a reivindicação 35, um replicão completo e uma ou mais sequências de marcas dominantes , operacionalmente ligadas a sequências de controlo da expressão. 37â. - Processo de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado por se preparar um DNA recombinante que é um vector hibrido adequado a hospedeiros mamíferos. -97-

   38â. - Processo de acordo com a reivindicação 35, 36 ou 37, caracterizado por se preparar um DNAre-combinante que é um vector hibrido em que o vector é derivado do plasmideo pSV. 39§. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por se preparar um DNA recombinante que é um vector hibrido em queo vector é derivado do plasmí-deo pSV2ght ou do plasmideo pSV2neo. 40§. - Célula hospedeira caracterizada por ser transformada com DNAs recombinantes preparados por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-39. 41â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser uma célula de mamífero de origem linfóide. 42â. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser uma célula derivada de uma linha celular de hibridoma de murganho não secretora de Ig Sp2/0 (ATCC CRL 1581). 43i. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40 ou 42, caracterizado por ser transformada com um ou dois vectores preparados por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 36-39. 44§. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por ser uma célula da linha -98-

   celular EFVIII/{ 4Na75-75/CkGa 5-6 (CE 75-5-6). 45â. - célula hospedeira de acordo com a reivindicação 43 , caracterizada por ser uma célula da linha celular EFIX-pCEA-Ig-( y4 ; Ck) (CE 4-8-13). 46§. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40 caracterizada por secretar anticorpos mo-noclonais quiméricos preparados por um processo de acordo com a reivindicação 1. 4 7â. - Processo para a preparação de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 40 ou 46, caracterizado por uma célula hospedeira ser transformada com um ou dois vectores por electroporação, tratamento com cálcio, microinjecção ou fusão de protoplastos. 48§. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal quimérico ou seus derivados preparados por um processo de acordo com a rãvindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser misturado com um veículo farmacêutico. -99- 49â. - Método para a terapia de cancro em mamíferos, caracterizado por um anticorpo monoclonal quimérico e/ou seus derivados preparados por um processo de acordo com a reivindicação 1 serem administrados ao referido mamífero numa dosagem de 0,1 a 5 mg por kg de peso corporal. Lisboa, 3 de Janeiro de 1989

   1200 LISBOA'