PT89611B

PT89611B - Metodo para o isolamento purificacao, caracterizacao, clonagem e sequenciacao de n alfa-acetiltransferase

Info

Publication number: PT89611B
Application number: PT89611A
Authority: PT
Inventors: John A Smith; Fang-Jen S Lee
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1994-05-31
Also published as: DE68910713T2; DK186390A; EP0334004A1; IE890386L; DE68910713D1; EP0334004B1; AU616492B2; ES2061745T3; AU3196989A; US4966848A; JPH03502403A; DK186390D0; PT89611A; WO1989007138A1

Description

MÉTODO PARA O ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO, CLONAGEM E SEQUENOIAÇÃO DE NO-ACETILTRANSFERASE

-7.moleculares de cerca de 95 000 cada, possuindo actividade enzimática superior a 100 em que uma unidade de actividade é defini da como 1 pmole de resíduos acetilo incorporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) nas condições de ensaio padrão.

O método para a purificação de Nfc-acetiltransferase consiste em se recuperar N ^-acetiltransfera se bruta a partir de uma amostra que a contem, se submeter a re; ferida N^-acetiltransferase bruta a cromatografia de permuta ió nica, se submeter as fraeções adequadas a cromatografia de absor ção com hidroxiapatite, e se purificar a N °Y-acetiltransferase parcialmente purificada por cromatografia de afinidade, seguida de eluição do produto desejado.

-3Titulo do Invento

Isolamento, purificação, caracterização clonagem e sequenciação de N^acetiltransferase

Referência a pedidos de patente relacionados:

Este pedido é uma continuação em parte de um pedido da Patente dos Estados Unidos NQ. 153.361, entregue em 8 de Fevereiro, 1988, 0 conteúdo da qual é aqui totalmente incluido como referência.

Campo do Invento

O invento é dirigido ao isolamento, purificação, caracte rização, clonagem e sequenciação de NOV-acetiltransferase e à própria enzima.

Fundamento do Invento

Em 1958 (Warita, Κ. , Biochim Biophy Acta 28:184-191 (1958)) foi descoberto um grupo acetilo como grupo amino-terminal bloqueador de proteína de cápside vi_ ral e do peptídeo hormonal em 1959 (Harris J.I., Biochem.J. 71: 451-459 (1959). Desde então observou-se que um grande número de proteínas em vários organismos possui resíduos amino-terminais acetilados. Por exemplo, as células L de murganho e as células Ehrlich de ascites têm cerca de 80% das suas proteínas solúveis intracelulares N&_acetiladas (Brown. J.I. e Roberts, W.K., J. Biol Chem 251: 1009 (1976) e Brown, J.L. J.Biol Chem 254: 1447 (1979). Nos organismos eucariotas inferiores cerca de 50% das proteínas solúveis são acetiladas (Brown. J.L. Int'1 Congr. Biochem. Abstr. (Internation Union Biochemistry, Canada) Vol.

11:90 (1979)). Estes resultados demonstram que N^acetilo é um grupo bloqueador importante. Foi sugerido que a função biológi_ ca deste grupo bloqueador pode ser proteger o catabolismo prematuro das proteínas (Jornvall, H. J. Theor. Biol. 55:1-22 (1975)) e a degradação proteolitica das proteínas (Rubenstein, P. e Beuchler, J. Biol.Chem 254: 11142 (1979)). No entanto, nas células L de murganho tal N^-acetilação não tem aparentemente esta função biológica (Brown, J, L., J. Biol. Chem. 254:1447 (1979)).

Apesar de não ter sido estabelec_i da com certeza uma função geral clãra para a N-acetilação, têm sido observados alguns efeitos específicos para um pequeno número de proteínas. A glutamato-desidrogenase específica de NADP não acetilada num mutante de Neurospora crassa é instável ao calor, ao contrário da forma acetilada (Siddig et al.,J.Mol. Biol. 13 7:125 (1980 ) ) . Um mutante de Escherichia coli, em que a proteína ribossonal S5 não é acetilada apresenta termosensibilidadq (jumberlidge, A.G. e Isono, K., J.Mol.Biol 131:169 (1979)). A ΝΛ-acetilação de dois dos produtos a partir da pr£ teína precursora proopiomelanocortina tem um efeito regulador profundo na activação biológica destes polipeptideos; a activi_ dade opióide da B-endorfina é completamente suprimida, enquanto que o efeito melanotrópico de -MSH é aumentado se fór ΝΛ_ -acetilado (Smyth et al. , Nature 279: 252 (1970); Smyth, D. G. e Zakarian, S., Nature 288:613 (1980); e Ramachandram,J. e Li. L.H., Ado. Enzymol 29:391 (1967)). Tanto a activa citoplasmática acetilada como a não acetilada de célula de Drosophila em cultura participam na montagem dos microfilamentos, no entanto a última com menos eficácia (Berger et al., Biochem. Geneti 19 321 (1981)). Mais recentemente, a velocidade de reciclagem de proteínas mediada pelo sistema de degradação dependente da ubi. quítina observou-se depender da presença de um grupo L-NH₂ livre no extremo N de uma proteína (Hershko et al., Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. 81:9021-9025 (1984) e Bachmair et al.,

-5Science 234: 179-186 (1986), sugerindo que a N^-acetilação pode ter um papel no impedimento da reciclagem da proteína.

Dada a importância da N-acetilação para a função e capacidade destas proteínas N-acetiladas pa. ra modular o metabolismo celular, será interessante examinar a localização subcelular, especificidade do substrato e regulação da proteína acetiltransferase. No sentido de classificar as implicações biológicas da N-acetilação e elucidar o tnecanis mo enzimático da reacção, como primeiro passo, deve ser isolada uma enzima capaz de catalisar a acetilação amino-terminal para se investigar a sua especificidade de substrato. A existência de tal acetiltransferase tem sido demonstrada e estudada em E.coli para a proteína ribossomal L12 (Brot et al. ,Arch. Biochem Biophys. 155:475 (1973)) em fígado de rato (Pastana, A. e Pitot, H.C.Biochemistry 14:1404 (1975); Green et al., Lan. J. Biochem. 56: 1075 (1978)); e Pestana, A. e Pitot, H.C. Biochemistry 14:1397 (1975)), cristalino de vitela (Granger et al., Proc. .Nqtl Acad. Sei. U.S.A.73:3031 (1976)),pituitária de rato (Woodford, T.A. e Dixon J.E., J. Biol.Chem. 254:4993 (1979); Pease, K.A. e Dixon J.E., Arch. Biochem. Biophys. 212:177 (1981) ; e Glembotski, 1.1. ,J.Biol.Chem 257:10 501 (1982 )) , pitui tária de boi (Massy D.E. e Smyth, D.G. Biochem Soc'y Trans.:8 751-753 (1980), oviducto de galinha (Tsunasawa et al., J.Biochem. 87:645 (1980 )) e gérmen de trigo (Kido et al. ^rch Biochen Biophys. 20 8:95 (1981)). No entanto, não foi conseguido o isolamento desta enzima, e apenas a enzima do oviducto da galinha foi parcialmente purificada cerca de 40 vezes (Tsunasawa et al. J. Biochem. 87:645 (1980 ). A incapacidade para isolar e pirifi_ car estas enzimas é divido à sua baixa concentração e extrema instabilidade após purificação.

Sumário do invento

De acordo com este invento, uma

N^aceti1transferase que transfere um grupo acetilo do acetilcoenzima A para o grupo amina N-terminal de polipeptídeos foi isolada e purificada 4 600 vezes até à homogeneidade. O invento relaciona-se ainda portanto com a purificação até à homogeneida. de de N -acetiltransferase e à N^-acetiltransferase purificada.

A N°^acetil transf erase foi purif_i cada por passos de purificação sucessivos usando permuta iónica hidroxilapatite e cromatografia de afinidade. A N^acetil transferase é composta por duas subunidades idênticas. O peso molecu lar (Mr) da enzima nativa foi calculado como sendo 180 000 +

000 daltons por cromatografia de filtração em gel e o Mr de cada subunidade foi calculado como sendo 95000 + 2000 daltons por SDS-PAGE. A enzima tem um pH óptimo perto de 9,0 e apresenta uma actividade máxima a temperatura entre 30° e 42°C. Por cromatofocagem em Mono-P o ponto isoeléctrico desta enzima foi determinado como sendo 4,3. De entre uma série de catiões divalen. tes, demonstrou-se gue Cu^⁺ e Ζη^⁺ são os inibidores mais potentes da enzima. Usando vários peptídeos sintéticos demonstrou -se gue a enzima tem uma especificidade de substrato definida dependente do resíduo amino-terminal e gue a enzima pode estar envolvida no processamento N-terminal de proteínas de levedura.

Ainda, a partir de cDNA seduziu-se toda a seguência de aminoácidos da N^-acetiltransferase de levedura. A enzima N^-acetiltransferase foi cionada a partir de uma biblioteca de cDNA de levedura em kgtll e seguenciado um cDNA completo codificador da N^-aceti 1transferase de levedu ra. As hibridações de transferências Sonthern de DNA genómico e cromossónico revelaram que a enzima é codificada por um único gene que está localizado no cromossona IV. Este gene é designado aqui como AAA 1 (^mino-terminal Alfa-amino Acetiltransferase 1). Este cDNA de levedura forma a base da elucida-7ção da função biológica e regulação da N^acetiltransf erase na síntese proteica eucariótica e degradação de proteínas. Ainda, usando mutagénese dirigida pode ser elucidado o mecanismo catai tico e regulação da NCV-acetiltransferase.

Breve descrição das figuras

Figura 1 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DEAE-Sepharose (O,2MKC1).

Figura 2 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DEAE Sepharose (0,05 a 0,5 MKC1).

Figura 3 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em hidroxilapatite.

Figura 4 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DE(2 celulose

Figura 5 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em gel Affi-Blue.

Figura 6 mostra o cálculo do peso molecular da acetiltransferase de levedura desnatada por SDS-PAGE.

Figura 7 mostra o cálculo do peso molecular da acetiltransferase nativa de levedura por filtração em gel.

Figura 8 mostra a cromatofocagem de acetiltransferase de levedura numa coluna Mono P.

Figura 9 mostra o efeito da temperatura em acetiltransferase de levedura.

Figura 10 mostra a actividade específica de acetiltransferase de levedura determinada em tam pões HEPES 50 mM, fosfato de potássio, CHES e CAPS de diferentes pH.

-8Figura 11 mostra a separação por

HPLC dos peptídeos tripticos de ΝΛ-acetiltransferase de levedu ra. Os números referem-se aos peptídeos tripticos, as sequências dos quais estão apresentadas na Figura 12C.

Figura 12 mostra a clonagem e s_e quenciação. (A) mostra as sondas oligonucleotidicas usadas para o despiste inicial da biblioteca em lgtll. As posições de nucleotídeos indicadas pelo asterisco diferem da sequência de DNA real apresentada em (C). A numeração dos peptídeos trípticos é como se segue: o primeiro número refere-se ao pico corres pondente nas Figuras 11, o segundo número refere-se ao pico na separação isocrática em HPLC (dados não apresentados) e o terceiro número refere-se ao pico na segunda separação isocrática em HPLC (dados não apresentados). (B) mostra o mapa de restrição e a estratégia de sequenciação de DNA dos clones de cDNA. As setas indicam a direcção e grau de determinação das sequências para cada fragmento após deleção com exonuclease III. (C) mostra o nucleotídeo e sequência de amicoácidos deduzida dos clones de'cDNA da N -acetiltransferase.

Figura 13 mostra um gráfico de hidrofobicidade da N°-_acetiltransferase de levedura.

Descrição detalhada do invento

N^acetiltransferase é uma enzima que transfere um grupo acetilo do acetil-coenzima A para o extremo amina de uma proteína ou polipeptídeo. A estrutura do acetil-coenzima A está descrita abaixo:

Acetil

Coenzima A (CoA)

I. Isolamento, purificação e sequenciação de N^acetiltransferase.

De acordo com este invento,

-acetiltransferase pode ser isolada a partir de uma amostra contendo á enzima. Qualquer amostra que contenha a enzima pode ser usada como material de partida de acordo com os métodos descritos neste invento. A N⁰*—acetil transf erase parece ser ubíqua, sendo encontrada em todos os eucariotas, incluindo plantas, animais e organismos muiticelulares. Pensa-se também gue a enzima esteja presente em procariotas. Assim, qualquer fonte de N^-acetiltransferase é considerada neste invento. Con forme aqui é usado, a amostra contendo a enzima será referida simplesmente como amostra que se destina a incluir amostra contendo N^-acetiltransf erase.

O isolamento e purificação de

N -acetiltransferase será daqui em diante descrito a partir de uma amostra de levedura, se bem que se deva entender que outras amostras poderão ser usadas como material de partida. O método preferido para a purificação da N^acetiltransferase do presente invento é o de Lee, F.J.S. et al. (J.Biol. Chem 263: 14948-14955 (1988), referência esta aqui incluida na sua totaI

lidade por referência).

As células de levedura foram transformadas em esferoplastos pela acção de liticase e homoge nizadas em tampão hipotónico com um homogeneizador Dounce. A acetiltransferase de levedura foi libertada do lisado celular para o tampão B contendo 0,2 M KC1 com agitação suave. Após cen trifugação o sobrenadante foi concentrado por ultrafiltração com membrana PM-30 e dialisado durante a noite contra tampão HDG (20 mM Hepes-K⁺, pH 7,4, 0,9mMDTT,10% (v/v) glicerol e 0,02% NaN^ ) contendo 0,2 M KC1. A acetiltransferase de levedura não é uma enzima estável e usou-se 10% de glicerol para prolongar a semi-vida da enzima.

O passo seguinte na purificação foi a remoção dos biomateriais celulares residuais no sobrenadante para evitar a agregação de proteína-biomateriais nos pas sos subsequentes. Neste processo pode-se usar a permuta iónica. Neste passo, a permuta iónica usada foi cromatografia em DEAE-Sephaio’sé'~êm~eluição numa concentração constante de sal (0,2 MKCl)gue se verificou ser o processo mais suave. Cerca de 80% dos biomateriais ou proteínas foi removido com uma recuperação de 107% da actividade de acetiltransferase de levedura. A figura 1 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DEAE-Spharose (0,2MKCl). Uma amostra dos sobrenadantes dos homogenatos de levedura foi cromatografado em DEAE-Spharose (0,2MKCl).O material eluido foi medido ^aA200 ^{e a act}i^ví^^a(^^e de acetiltransferase foi testada como descrito nos Exemplos. As fracções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas conforme indicado pela barra horizontal.

As fracções do pico da coluna de DAAE-Spharose (O,2MKC1) foram reunidas, concentradas, dialisadas contra tampão HDG contendo 0,05 MKC1 e aplicadas numa soluna de DEAE-Spharose e eluidas com um gradiente de sal contínuo (0,05 a O,5MKC1). A Figura 2 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DEAE-Spharose (0,05 a 0,5M KC1). O i!

conjunto de fracções de acetiltransferase derivado de DEAE-Sepharose (O,2MKC1) foi concentrado, dialisado e uma amostra foi cromatografada numa coluna de DEAE-Sepharose (0,05 a 0,5M KC1) e analisado por A₂80 ^conúuctividade e actividade de acetil transferase como descrito nos Exemplos. As fracções contendo actividade de acetiltransf erase foram reunidas conforme indica, das pela barra horizontal. Obteve-se um único pico de activida de simétrica centrado em 0,18M KC1. Neste passo conseguiu-se uma recuperação de 20 4% da actividade de acetiltransf erase (Ta. bela 1) segerindo que foi removido um inibidor.

As fracções do pico de DEAE-Sapharose (0,05 a 0 , 5M KC1) foram reunidas, concentradas, dialisa. das contra tampão fosfato de potássio 0,05M, pH 7,4, 0,5mMDTT 10% (v/v) glicerol, 0,02% NaN^ e aplicados numa coluna de adsor ção usando hidroxilapatite. Conforme é conhecido na especialidade, uma coluna de hidroxilapatite adsorverá selectivamente proteínas a iões cálcio presentes no hidroxifosfato de cálcio.

A coluna de—+t-idroxi lapati te foi eluida com um gradiente salino linear e obteve-se um único pico de actividade em fosfato de potássio 0,36 M. Neste passo o pico principal da eluição total de proteína ocorreu em fosfato de potássio 0,5 a 2,0M. A Figura 3 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em hidroxilapatite. 0 conjunto de fracções de acetiltransferase da coluna de DEAE-Sepharose (0 ,05 a 0 ,5M KC1) foi concentrado, dialisado e uma amostra foi cromatograf ada numa coluna de hidro· xilapatite e analisado por ^a2qq, conductividade e actividade de acetiltransferase como descrito nos Exemplos. As fracções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas conforme indicado pelas barras horizontais.

As fracções do pico da coluna de hidroxilapatite foram reunidas, concentradas, dialisadas contra tampão HDG contendo 0,05M KC1 e aplicadas numa coluna de permuta iónica, DE52-celulose, com um gradiente de sal contínuo.

Obteve-se um único pico de actividade que se centrou em 0,14M KC1. A Figura 4 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura em DE52 celulose. 0 conjunto de fracções de acetiltransf erase da coluna de hidroxilapatite foi concentrado, dialisado e uma amostra foi submetida a cromatografia em coluna de DE52 celulose e analisado por Α₂₈θ ' ^con8uctividade e activ_i dade de acetiltransf erase como o descrito nos Exemplos. As frac ções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas conforme indicado pela barra horizontal.

As fracções do pico da coluna de DE52-celulose foram reunidas, concentradas, dialisadas contra tampão HDG contendo 0,05M KC1 e aplicadas numa coluna de afinidade, gel Affi-Blue, eluido com um gradiente contínuo de sal (0,0 5 a 1 ,0 M KC1). Obteve-se um único pico de actividade cerp trado em O,6MKC1. A Figura 5 mostra a cromatografia da acetiltransferase de levedura numa coluna de gel Affi-Blue e analis_a do por A_2go, conductividade e actividade ou acetiltransferase como -descrárto— acima em Materiais e métodos. As fracções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas conforme indicado pela barra horizontal.

Usando esta série de passos de cromatografia, a acetiltransferase de levedura foi purificada aproximadamente 4 600 vezes relativamente ao extracto celular como um - rendimento de 27% como se vê na Tabela 1.

-13TABELA 1

Purificação de bí^acetiltransferase de levedura

Passo	Actividade	Proteína Actividade	Purificação	Rendi-
	(unidade)	(mg)	específica (unidade/mg)	(vezes)	mento (%)
.Extrato bruto	30200	177)0	1,7	1,0	100
.DEAE-Sepharose ^a	3 2 200	3710	8,7	5,1	10 7⁰
.DEAE-Sepharose^C	61500	147)	41,8	24,5	20 4^b
.Hidroxilapatite	19300	53,6	360	210	64
.DEAE-celulose	127)0	8 ,58	1500	87)	42
.Affi-Blue Gel	8160	1.05	7800 4600	27

a) Os resultados para o passo 2 são os rendimentos combinados de duas cromatografias. A eluição foi com 0,2M KC1.

b) Removeu-se um inibidor neste passo.

c) A eluição foi de 0 ,0 5 a 0 ,2M KC1.

Tal como aqui é usado o termo substancialmente puro ou substancialmente purificado pretende descrever n^ace til transf erase que está substancialmente livre de qualquer composto normaimente associado à enzima no seu estado natural, i.e., sem proteina ou componentes tipo açú car. O termo pretende ainda descrever N^acetiltransferase que é homogénea por uma ou mais caracteristicas de pureza ou homogeneidade usadas pelos familiarizados com a matéria. Por exem pio, uma N ^acetiltransf erase substancialmente pura apresentai rá caracteristicas constantes e reprodutíveis dentro dos desvios experimentais convencionais para parâmetros tais como os

-14que se seguem: peso molecular, técnicas de cromatografia e outros parâmetros. 0 termo, no entanto, não pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas das enzimas com outros compostos O termo também não pretende excluir a presença de impurezas menores que não interferem com a actividade biológica da enzima e gue podem estar presentes, por exemplo, devido a purificação imcompleta.

II. Identificação, purificação e caracterização, de N^acetiltransferase

Peso molecular

Os géis de SDS-poliacrilamida da amostra purificada revelam uma única banda guando corados com azul Coomassie. A electroforese foi efectuada de acordo com o método de Laemmli, U.K., Nature 227:680-685 (1970) usando um gel de 8%. O gel foi corado com azul coomassie. Padrões proteicos de peso molecular 45,66,97, 116 e 205 migraram juntamente com o extracto bruto, fracções de DEAE-Sepharose, fracções de hidroxilapatite, fracções de DEAE-celulose e fracções de gel Affi-Blue. A electroforese em gel de SDS poliacrilamida mostra que a enzima purificada tem um peso molecular de 95000 + 2 000 deltas. A Figura 6 mostra o cálculo do peso molecular da acetiltransferase de levedura desnatada em SDS-PAGE. A enzima purificada foi aplicada em electroforese com SDS de acordo com o método de Laemmli, U.K. Nature 227:680-685 (1970) usando um gel de 9%. O peso molecular das acetiltransferase de levedura desnatada foi calculado usando padrões proteicos. A cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL-4B mostrou que o peso mole : cular nativo da acetiltransferase é de aproximadamente 180.000 daltons. A Figura 7 mostra o cálculo do peso molecular da acetiltransf erase nativa de levedura por filtração em gel. A enzi ma purificada foi aplicada numa coluna de Sepharose CL-4B (2,5 χ 96 cm). O peso molecular aparente da acetiltransferase

Λ

-15nativa de levedura foi calculado a partir do volume de eluição relativo de proteínas padrão como sendo 180 000 + 10 000 daltons O volume de eluição foi determinado por absorvância a 280 nm e actividade enzimática. Estes resultados sugerem gue a acetiltransferase de levedura é composta por duas subunidades idênti cas. A acetiltransferase de levedura purificada foi sujeita a análise de aminoácidos. Os resultados desta análise estão apre^ sentados na Tabela 2.

TABELA 2

Composição em aminoácidos de N-Acetiltransferase de levedura

Aminoácido	Resíduos Calculados
,Asx____	10 3
Thr	24
Ser	43
Glx	96
Pro	32
Gly	39
Ala	61
Vai	41
Met	3
lle	41
Leu	10 6
Tyr	32
Phe	45
Lys	73
His	12
Arg	37

a) A acetiltransferase purificada foi obtida por eluição do gel após SDS-PAGE

b) Os resíduos por subunidade de enzima foram calculados com base num peso molecular de 95000. Não foi feita gualguer correcção para as guantidades de aminoácidos ser e tre gue são destruídas a hidrólise lis e trp não foram determinadas por este método.

Propriedade bioguímicas da N^-acetiltransferase

Usou-se cromatofocagem em Mono

P para determinar pl da acetiltransferase. Observou-se um pico de actividade a pH 4,3. A Figura 8 mostra a cromatofocagem de acetiltransferase de levedura numa coluna Mono Ρ. A enzima parcialmente purificada obtida de coluna de DE52, foi aplicada na coluna Mono P eguilibrada com tampão Tris-Bis 25 mM (pH6) e eluida por Polybuffer 74 (pH 3,6) num caudal de 1 ml/min a 4°C. A eluição foi_controlada por absorvância a 280 mm e colheram-se fracções de 0,5 ml para medir o pH e actividade enzimática.

A Figura 9 mostra o efeito da temperatura numa acetiltransferase de levedura. A Figura 10 mostra a actividade específica da acetiltransferase de levedu_ ra determinada nos tampões HEPES, fosfato de potássio, CHES e CAPS 50mM de diferentes pH's. A temperatura óptima para a ace tiltransferase de levedura foi determinada em condições conven cionais. Os ensaios foram efectuados de 5° a 55° conforme indi. cado na Figura 9. A acetiltransferase de levedura apresenta um máximo de actividade a temperatura de 30° a 42°C. A desnaturação irreversível ocorreu após 1 minuto a 65°C. A dependencia do pH da acetiltransferase de levedura foi medida testando nos valores de pH de 5 a 11 e na presença dos tampões HEPES, fosfa. to de potássio, CHES e CAPS 50 mM conforme indicado na Figura

10. A actividade enzimática máxima ocorreu a pH 9,0. A actividade enzimática foi inferior a 25% abaixo de pH 6,5 e acima de

-17ρΗ 11. Α adição de Kcl ou Nacl atè à concentração 0,45 M não afectou a reacção enzimática. Observou-se uma redução de 50% na actividade enzimática quando ó ensaio foi efectuado a 0,6 Kcl ou

0,6M Nacl.

Efeito dos catiões divalentes na reacção enzimética

O efeito dos vários catiões divalentes na actividade enzimática foi determinado como se mostra

2 na Tabela 3. Numa concentração de lmM, Ca^Z+ e Mg ⁺ não tiveram qualquer efeito enquanto gue na presença de Mn^⁺, Fe^⁺, Co^⁺,

Zn^⁺ e Cd^⁺ observou-se inibição quase total. Cu^⁺ e Zn^ ⁺ foram os inibidores mais potentes. Verificou-se que os efeitos obser_ 2 vados dos iões metálicos não eram devidos ao anião SO.^- .

Tabela 3 .^ Efei-Los- de catiões divalentes na actividade enzimática

Adição	Actividade (%)
Concentração (mM)
	1	0;l	0 ,01
Nada	100	_ _ _	_ __ _
Ca C i q	100	—	—
MgCl^	99	120	—
MgSO	120	120	—
MnCl₂	28	43	84
CoClp	20	60	86
CdCl₂	12	42	90
FeSO	12	53	78
CuSCK 4	0	0	58
ZnSO . 4	0	0	40

a. A acetiltransferase de levedura foi incubada na presença de vários catioes divalentes à temperatura ambiente durante 5 minutos. A actividade enzimática foi determinada pela adição de substracto directamente à mistura de incubação seguido do processo de ensaio convencional.

Efeito das modificações químicas na reacção enzimática

Para avaliar o possível papel catalítico dos resíduos de aminoácídos na reacção de acetilação des_ ta enzima, efectuaram-se várias modificações químicas (Tabela 4) A acetiltransferase de levedura foi incubada com cada um dos reagentes a 30°C durante quinze minutos, dialisada contra tampão HEPES 50 mM pH 7,4, 150 mM DTT a 4°C durante 3-4 horas. A actividade enzimática foi determinada como descrito atrás. A reacção de acetiltransferase com dietil-pirocarbonato 1 ou 5 mM um reagente de modificação da histidina, provocou uma ' inactivação completa da enzima. Os reagentes usados na Tabela 4 são: reagèntes que modificam resíduos de císteina e cistina (NEM, N-etil-maleimida; IAA, ácido iodoacético; IAM , iodoacetamida; pCMB, p-cloromercuribenzoato; DTT, ditiotreitol); reagentes que modificam resíduos HIS TYR ou LYS (DEPC, dietilpirocarbonato); reagentes que modificam resíduos HIS, TYR ou TRP (NBS, NQBromo succinimida); reagentes que modificam HIS ou carboxilo (Woodwar 's 3'sulfonato de N-etil-5-fenilisoxazólio); reagentes que modificam lisina ou resíduos de aminoácídos primários (anidrido succinico; TNBS, ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico); reagentes gue modificam resíduos TYR (N-acetilimidazole); reagentes que modificam resíduos TRP (HNBS (CH^^-Br; brometo de dimetil-(2-hidroxi-5-nitrobenzil)sulfónico; reagentes que modi. ficam resíduos SER (PMSF); e reagentes que quelatam iõés metálicos (DEAE).

-19Tabela 4

Efeito de reagentes modificadores de proteina na actividade enzimática de N-alfa-acetiltransferase de S.cerevisial

Reagente adicionado	Concentração (mM)	Actividade enzimática (%)
Nenhum		100
NEM	1,0	92
	10 ,0	13
IAA	1,0	100
	5,0	73
IAM	1,0	98
	10 ,0	63
pCMB	1,0	10 0
	10 ,0	55
pCMB+DTT	1 ,0 +10 ,0	10 0
	10 ,0 + 60 ,0	16 0
DTT * ' ’ ''	1,0	10 0
	10 ,0	11 0
	50 ,0	12 0
DEPC	o ,5	52
	1,0	1,6
	5 ,0	0
DEPC+Hidrolxilamina	1 ,0 + 250 ,0	0
	1,0 + 500 ,0	0
NBS	0 ,5	30
	5,0	0 ,5
Woodward's K	1,0	79
	10 ,0	0
Anidrido succinico	1,0	94
	10 ,0	71
TNBS	1,0	94
	10 ,0	76
N-acetilimidazole	1,0	100
	10 ,0	63
HNBS(CH~)_-Br	1,0	82
o Z	10 ,0	70

PMSF	1,0	140
	10 ,0	134
DEAE	2,5	120
	25 ,0	135
2-Mercaptoctanol	10 ,0	110

Especificidade do substracto

Fez-se uma determinação parcial da especificidade de substracto da acetiltransferase de levedura usando um substracto contendo os 24 primeiros resíduos de aminoácidos da hormona adrenocorticotrópica (ATCH). As sequências de aminoàcidos dos quatro substractos de ACTH são como descritas por Lee, F.-J.S. , et al, (J. Biol Chem 263:14948-14955 (1988 referência essa que aqui foi incluída por referência na sua totalidade.)

A Tabela 5 mostra que a eficácia 2 de acetilação do análogo /~PheJ7não foi significativamente diferente da ACTH (aminoàcidos 1-24). Quatro formas truncadas de ACTH (aminoàcidos 4-10), (aminoàcidos 11-24), (aminoàcidos'7-38) e aminoàcidos 18-39), sem resíduos N-terminais diferentes de ACTH, não foram acetilados. B-endorfina pode ser acetilada no resíduo Tyr N-terminal pela acetiltransferase de pituitária de rato mas não pela acetiltransferase de levedura (Tabela 6). A especificidade de substracto usando substratos naturais na leve dura foi também investigada. A álcool-desidrogenase (ADM) de levedura é naturalmente acetilada no seu resíduo Ser N-terminal A superóxido dismutase (SOD) humana é naturalmente acetilada no seu resíduo Ala N-terminal e também quando expressa como proteí. na recombinante em levedura. No entanto, SOD endógena de leve dura, que é 48% idêntica à SOD humana, não é acetilada. Não é claro se as diferenças nas sequências N-terminais entre estas

-21proteínas são ou não responsáveis pelas diferenças de acetilação. Como se mostra na Tabela 6, ADH sintética de levedura (aminoácidos'1-24) e SOD sintética humana (aminoácidos 1-24) podem ser acetilados por esta enzima. No entanto, ADH de levedu ra já naturalmente acetilada no resíduo Ser do extremo N ou SOD sintática de levedura (aminoácidos 1-24) não podem ser acetiladas. Em adição, a enolase de levedura contendo um resíduo Ala com um grupo L-NH2 livre sabe-se gue não é acetilada em N in-vi vo e de facto não pode ser acetilada por esta enzima. Ainda, as histonas de timo de vitela ricas em lisina ou argina não são acetiladas pela acetiltransferase de levedura.

Tabela 5

Actividade relativa da acetiltransferase de N-acetilação de fragmentos de ACTH	levedura para a
Substrato	Actividade (%)
ACTH (1-24)	100 + 5
/Phe²/ACTH (1-24)	90+9
ACTH (4-10 )	'0
ACTH (11-24)	0
ACTH (7-38)	0
ACTH (18-39)	0

Dados apresentados como actividade média DP (N=3-5) ~λ

-22Tabela 6

Actividade relativa da acetiltransferase de levedura para a N-acetilação de vários peptídeos sintéticos e proteínas nativas

Substrato

Actividade (%)

ACTH (1-24) (Humano)

B-endorf ina(humana)

Âlcool-desidrogenase (1-24) (levedura) Âlcool-desidrogenase (levedura) Superóxido-dismútase (1-24) (levedura) Superóxido-dismutase (1-24) (humano) Enolase (1-24) (levedura)

Histona (rica em lisina) (timo de vitela) Histona (rica em arginina) (timo de vitela

100 + 5 2 + 2 92 + 8 4 + 2 + 6 4 + 2 0 0

Dados~'ap'ré^:3^rftados com actividade média + DP(N=3-5)

Sequências de aminoácidos de N -acetiltransferase

A N^-acetiltransferase foi cliva^ da com tripsina e os fragmentos foram separados numa coluna de HPLC de fase reversa. Os fragmentos peptídicos (indicados com linhas a tracejado de dois dos fragmentos peptídicos sequencia dos, Fragmento 15-3-1 e Fragmento 29-1 são como se segue:

Fragmento 15-3-1 gli-val-pro-ala-tre-fen-ser-asn-val-lis-pro-leu-tir-gln-arg Fragmento 29-1:

fen-ile-pro-leu-tre-fen-leu-gln-asp-lis-glu-glu-leu-ser-lis r*

-23Conforme detalhado abaixo, a informação da sequência destes dois fragmentos peptidicos podem ser usada para sintetizar sondas oligonucleotídicas conforme descrito abaixo no Exemplo 2.

III. Engenharia genética da N^acetiltransferase

Sequênciação da N^acetiltrasferase

Os inventores completaram a clona. gem molecular e determinaram toda a sequência de DNA de um gene eucariótico de N-^-acetil transf erase . A proteína N Kaceti 1 transferase de levedura é codificada por uma grelha de leitura aber ta de 2562 bases e consiste em 854 aminoácidos. 0 seu peso mole cular calculado a partir da sua composição em aminoácidos é de 98 575 daltons e o seu peso molecular está de acordo com a M da s/ubusiçLade, calculado como sendo 95 000 £ 2 000. Conforme descrita atrás, a análise da sequência proteica da proteína nativa revelou o seu bloqueio N-terminal, sendo provável que após a clivagem do resíduo N-terminal Met que o penúltimo resíduoe serilo seja acilado (possívelmente acetilado). Apesar da enzima não ser conhecida como uma glicoproteina, ela possui 6 sítios pestativos de N-glicosilação (i.e., sequências, Asn-XSer (ou Tre)) nos resíduos 122-122, 161-163, 643-645, 702-704, 761-763, 792-793. A região hidrofílica entre os resíduos 508 e 720 é uma característica estrutural invulgar da molécula, se bem que não seja claro se esta região desempenha um papel funcional na regulação ou localização da enzima. Uma comparação das sequências proteicas da N ^-acetiltransferase com outros acetiltransferase não revela uma percentagem apreciável de semelhanças entre elas, se bem que determinadas pequenas sequer, cias tenham uma semelhança superior a 50%. Provavelmente estar são regiões onde as mutações específicas de sítio deverão ser introduzidas nas tentativas preliminares para identificar re-24síduos envolvidos na catálise.

Considerados em conjunto, as trans ferências Northern e Sonthern indicam haver um gene codificador desta N acetiltransf erase. No entanto, não é claro se a levedjj ra contêm ou não ainda outras acetiltransferases capazes de codi ficar o grupo C*c-NA₂ de proteínas. Ainda, estudos anteriores sobre a especificidade do substracto da N -acetiltransferase ds levedura demonstraram claramente gue esta enzima não é capaz de fazer acetilação de grupos E-NH₂ em substratos peptídicos ou em histonas, se bem que tenha sido demonstrada uma acetiltransfe rase específica de histonas na levedura (Travis, G.H., J, Biol Chem 259: 14406-14412 (1984).

O gene AAA 1 está situado no cro mossona 4 e eâtá colocado imediatamente adjacente à sequência delimitante 5 do gene STR₂. Uma vez gue SIR₂ e três outros genes de 8IR que não estão em linkage afectam a repressão trans da transcrição dos genes HMR e HML, os quais estão envolvidos na determinação do tipo de conjugação das leveduras haplóides, não existe uma relação clara entre a função destes genes e AAA1

O gene AAA1 de levedura permitará obter detalhes moleculares do papel da N ^acetilação no processamento e degradação de proteínas eucarióticas.

Clonagem de N^t4-acetiltransferase

Este invento compreende ainda as sequências de aminoácidos da N K-acetiltransferase, as sequências genéticas codificadoras da enzima, veículos contendo a sequência genética, hospedeiros transformados com eles, produção de enzima por expressão do hospedeiro transformado e utilização da enzima na acetilação de peptídicos ou proteínas.

-25A sequência de DNA codificadora de N K-aceti 1 transf erase pode ser derivados de uma variedade de fontes. Por exemplo, mRNA codificado pela N<X-acetiltransferase pode ser isolado a partir dos tecidos de quaisquer espéc_i es que produzam a enzima, usando o método de transferência Nor thern (Alwine, et al., Method Enzymol. 68: 220-242 (1979)) e sondas oligonucleotídicas marcadas. O mRNA pode ser então convertido em cDNA por técnicas conhecidas pelos familiarizados com a matéria. As sondas podem ser sintetizadas com base na se; quência de aminoácidos conhecida da N ^-acetiltransferase como descrita atrás.

Como alternativa, podem ser usadas sondas de DNA degenerativas para fazer o despiste de uma biblioteca de DNA de uma espécie que produza N*-acetiltransferase, isolado assim, um clone que contem a sequência de DNA co dificadora da enzima. A biblioteca de DNA é criada pela fragmer tação usando uma ou mais endonucleases de restrição do DNA genómico, seguido de incorporação em vectores e sua utilização parâ~ t'r'an'sfdrmar células hospedeiras, as quais são então senea das e despistadas.

A sonda de DNA pode ser marcada com um grupo detectável. Tal grupo detectável pode ser qualquer material tendo uma propriedade física ou química detectável. Tais materiais têm sido bem desenvolvidos no campo dos imunoensaios e de um modo geral qualquer marca utilizada em tais métodos pode ser aplicada no presente invento. São particularmente úteis grupos enzimáticamente activos, tais como enzimas (ver Clin. Chem. 22: 1243 (1976), substratos de enzimas (ver Especificação de Pat. Britânica 1548 741), coenzimas (ver 230797 e 4238565) e inibidores de enzimas (ver 134 792); substâncias fluorescentes (ver. Clin.

Pat.	U.S .	N°s
Pat.	U.S .	N° .
Chem	25 í	353

25í 353 (1979)); cromóforos; substâncias lumirescentes como sejam guimioluminescentes e bioluminescentes (ver Clin Chem. 25: 512 (1979)); ligandos de ligação específica; pares de intereacção proxinal; a rediaisolopos tais como ^JH

35, *—\

-263 5 14

Ρ, I e C. Tais marcas e pares de marcação são detectados com base nas suas próprias propriedades físicas (e.g., corn postos fluorescentes, cromóforos e radioisótopos) ou nas suas propriedades de reactividade ou ligação (e.g., enzimas, substra tos , coenzimas e inibidores). Por exemplo, uma sonda marcada com um cofactor pode ser detectada pela adição da enzima para a gual a marca é um cofactor e um substrato da enzima. Por exemplo , pode-se usar uma enzima gue actue sobre um substrato para gerar um produto com uma propriedade física mensurável. Exemplo deste último incluem mas não estão limitadas a beta-galactosidja de, fosfatase alcalina e peroxidase.

Uma seguência de DNA codificadora da N K-acetiltransferase pode ser recombinada com DNA vector de acordo com técnicas convencionais , incluindo extremos agos ou coesivos para ligação, digestão com enzimas de restrição, para dar extremos apropriados, preenchimento de extremos coesi vos conforme adeguados , tratamento com fosfatase alcalina para evi taj? .Ligaç-ãc , indesejável e ligação com ligases adequadas.

Para expressar N Cb-acetiltransferase são necessários sinais de transcrição e tradução reconhecidos por um elemento hospedeiro adequado. Os hospedeiros eucarióticos podem ser células de mamífero que possam ser cultivadas in vitro, particularmente leucócitos, mais particularmente células de mielona ou outros linfócitos transformados ou oncogénicos, e.g. células transformadas por EBV. Como alternativa, podem ser empregues células que não sejam de mamíferos, tais como bactérias, fungos, e.g. leveduras, fungos filamentosos ou similares.

Constituem possíveis hospedeiros para a produção de N^-acetiltransferase, células de mamífero, cultivadas in vitro em cultura de tecidos ou in vivo em animais. As células de mamífero podem proporcionar modificações pós-tradução das moléculas de NK-acetiltransferaseincluindo enrolamento ou glicosilação correcta dos sítios correctos. As

-27células de mamíferos que podem ser úteis como hospedeiros incluem células de origem fibroblástica tais como Vero ou CHO-K1 ou Células de origem linfoíde, tais como o hibridoma SP2/0-AG14 ou o mieloma P3 χ 635gh e seus derivados. Geralmente a construção de N -acetiltranferase será parte de um vector tendo um sijs tema de replicação reconhecida pela célula hospedeira.

Numa execução, uma célula procaric ta é transformada por um plasmideo portador do gene codificador da N -acetiltransferase. Hospedeiros bacterianos de particular interesse incluem _E. coli K12 estirpe 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537) , E, coli W3110 (F~, lambda, fototrófica (ATCC 27325)) e outras enterobactérias tais como Salmonella Typhrimurium ou Serratia marcescens, e várias espécies de Pseu domonas. Em tais condições a ΝΛ-acetiltransferase não será glicosilada. 0 hospedeiro procariótico deve ser compatível com o replição e sequências de controle no plasmideo de expressão.

Em geral, tais vectores contendo replição e sequências de controle que são derivadas de espécies compativies com uma célula hospedeira são usados em ligação com o hospedeiro. 0 vector normalmente possui um sítio de replição, assim como genes especif icos que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. A expressão do DNA codificador de N -acetiltransferase pode também ser coloca da sob controle de outras sequências reguladoras que podem ser homólogas para o organismo no seu estado não transformado. Por exemplo, DNA cromossónico de E. coli dependente de lactose com preende um operão lactose ou lac que medeia a utilização de lactose através da elaboração da enzima B-galactosidade. Os ele mentos de controle lac podem ser obtidos a partir do bacteriofago lambda plac5, que é infeccioso para E. coli. 0 sistema promotor-operador lac pode ser induzido por IPTG.

-28Também podem ser empregues outros sistemas promotor/operador ou porções deles. Por exemplo podem ser usados colicinas El , galactose, fosfatase alcalina, triptofano, xilose tax e similares.

Para um hospedeiro mamífero vários sistemas vector possíveis estão disponíveis para expressão. Uma classe de vectores utiliza elementos de DNA que proporcionam plasmídeos extra-cromossónicos de replicação autónoma, derivados de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus ou vírus 5 B40 . Uma segunda classe de vecto res baseia-se na integração das sequências genes pretendidas no cromossoma hospedeiro . As células que têm estávelmente integra, do o DNA introduzido nos seus cromossomas podem ser seleccionadas através da introdução de uma ou mais ?arcas que permitem se lecção de células hospedeiras que contenham o vector de expressão. A marca pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxo trófico , resistência a biocidas , e.g. antibióticos ou metais pe. sados , tais como cobre ou similares. O gene da marca seleccioná. vel pode ser ligado directamente às sequências de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Podem também ser necessários elementos adicionais para a síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de shlicing, assim como promotores de potenciadores e sinais de terminação da transcrição. Os vectores de expressão de cDNA que incluem tais elementos abrangem os descritos por Okayama, H., Mol. Cel. Biol. .3: 280 (198 3) e outros.

Podem ser empregues uma grande variedade de sequências reguladores da transcrição e tradução dependendo da natureza do hospedeiro. Os sinais de transcrição e tradução podem derivar de fontes virais tais como adenovírus vírus, do papiloma bovino, vírus sínio ou similares, onde os sinais reguladores estejam associados com um gene particular que um elevado nível de expressão. Como alternativa podem ser empregues promotores de produtos de expressão de mamíferos tais como activo, colagénio, miosina, etc. Podem igualmente ser se-

-29leccionados sinais de iniciação da transcrição que permitem a repressão ou activação de modo a que a expressão dos genes pos sa ser modulada. São particularmente interessantes os sinais reguladores sensíveis à temperatura de modo a que variando a temperatura, a expressão possa ser reprimida ou iniciada, ou que estejam sujeitos a regulação química , e.g. metabolitos.

Uma vez preparado para expressão o vector ou sequência de DNA contendo as construções, as construções de DNA podem ser introduzidas num hospedeiro adequado. Podem ser empregues várias técnicas tais como fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais. Após fusão, as células são cultivadas em meio e despistadas quanto às actividades adequadas. A expressão do (s) gene(s) resulta na produção de N®L-acetiltransferase.

As células hospedeiras para produção de N^-acetiltransferase podem ser células imortalizadas prin<?ipá 1 mente células de mieloma ou linfoma. Estas células po dem ser cultivadas num meio nutritivo adequado em frascos de cultura ou injectadas num hospédeiro sinergéstico, e.g., murga nho ou rato ou hospedeiro imunodeficiente ou local do hospedei^ ro imunodeficiente, e.g. murganho labro ou bolsa de hamster.

A N^acetil transf erase do invente pode ser isolada e purificada de acordo com condições convencia nais, tais como extracção precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, electroforese ou similares.

IV Utilizações da N<K-acetiltransferase.

N ^-acetiltransf erase uma vez prea duzida e purificada pode ser usada, po exemplo, num ambiente de fabrico farmacêutico para N-acetilar um peptideo ou proteíra A N-acetilação é útil na redução da degradação de proteínas a serem usadas terapêuticamente. Ver a descussão de A. Klibinov,

-30Unconventional Catalytic Properties of Covencional Enzymes em Basic Biology of New Developments in Biotechnology pág 497-518 (A. Hollaender, ed., 1973) sobre o uso de enzimas.

Expressão da N^-acetiltransferase em plantas

Ainda, a N K-acetiltransferase pode ser introduzida numa planta por técnicas de engenharia genética para aumentar a velocidade de acetilação. Sabe-se que certos herbicidas são inactivados por acetilação. Portanto, é possível produzir uma planta gue seja mais tolerante aos herbicidas. Ain. da numa outra realização deste invento, o gene da N⁰'—acetil trans ferase é usado para transformar uma planta para aumentar a tole. rância da planta a herbicidas.

A região codificadora do gene da N -acetiltransferase que pode ser usado neste invento pode ser homólogo ou heterólogo para a célula vegetal ou planta a ser transíor-m^cLa-^-É necessário no entanto, que a sequência genética codificadora da N ^-acetiltransferase se ja expressa e produzida como uma proteína funcional ou polipeptídeo na célula vegetal resultante. Assim, o invento compreende plantas contendo genes homólogos da N X-acetiltransferase ou genes heterólogos da N*<-acetiltransferase que expressam a enzima.

Numa realização deste invento , a N -acetiltransf erase compreende uma N ^-acetiltransf erase vegjs tal que é homóloga da planta a ser transformada. Numa outra rea lização deste invento, a NOt-acetiltransferase compreende uma enzima que é heteróloga da planta a ser transformada. Ainda, o DNA do DNA genómico ou cDNA codificador do gene da NíX-acetiltransferase pode ser usado neste invento. Ainda, um gene N-acetiltransferase pode ser construído'parcialmente com um cio ne de cDNA e parcialmente com um clone genómico. Em adição, o DNA codificador do gene da N «-acetiltransferase pode compreender porções de várias espécies.

Existe uma variedade de realização

abrngidas	pelo
1i zações,	este
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Π31 -H |

N acetil transf erase que quando da expressão do gene numa deter minada célula vegetal é funcional para N^acetiltransferase;

(b) uma ou mais sequências genéticas adicionais operacio nalmente, ligadas em ambos os lados da região codificadora da N «^-acetiltransf erase. Estas sequências genéticas adicionais contêm sequências para promotor(es) ou terminador(es).As sequências reguladoras vegetais podem ser heterólogas ou homólogas para a célula hospedeira.

Numa realização preferida, o promo tor do gene da N°^aceti 1transferase é usado para expressar a sequência genética quimérica. Outros promotores que podem ser usados na sequência genética incluem promotores nos, ocs e CaMVrOm járomotor vegetal eficaz gue pode ser usado é um promo tor vegetal de superprodução. Este promotor em ligação opera, cional com a sequência genética da Να-acetiltransferase deverá ser capaz de promover a expressão da referida Nacetiltransferase de modo a gue a planta transformada tenha uma maior tolerância a um herbicida. Os promotores vegetais superprodutores que podem ser usados neste invento incluem o promotor da subunidade de pequena(as) da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase de soja (Berry Lowe et al., J. Molecular and App. Gen.1: 483-498 (1982)) e o promotor da proteína de ligação à clorofila a/b. Sabe-se que estes dois promotores são induzidos pelas luz em células vegetais eucarióticas (ver, por exemplo, Genetic Engineering of Plants an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York 1983, páginas 29-38; Corruzi , G, et al. ,

J. Biol Chem., 258: 1399 (1983); e Dunsmuir, P. et al., J.Mol. and Applied Genet. , _2: 285 (1983)).

Ainda, numa outra realização pre-

-32ferida, a expressão da sequência genética quimérica compreender^ do o gene da N (X—acetiltransf erase é operacionalmente ligado na grelha de leitura correcta com um promotor vegetal e com uma sequêncià sinal de um gene de secreção.

A sequência genética quimérica com preende o gene da N^-acetiltransferase operacionalmente ligado a um promotor vegetal, e na realização preferida com as sequêti cias sinal da secreção, pode ser ligada num vector de clonagem adequado. Em geral, são usados vectores plasmídeos ou virais (bacteriofago) contendo sequências de replicação e de controle derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira. 0 vector de clonagem possuirá tipicamente uma origem de replicação, assim como genes específicos que são capazes de proporcionar marcas de selecção fenotípica em células hospedeiras transformadas , tipicamente resistência a antibióticos. Os vectores de transformação podem ser seleccionados por estas marcas feno tipicas após transformação de uma célula hospedeira.

*· ' As células hospedeiras que podem ser usadas neste invento incluem procariotas, incluindo hospjí deiros bacterianos tais como E. coli , j5, Typhimurium e Serratia marcescens. Neste invento podem também ser usados hospedeiros eucarióticos tais como leveduras ou fungos filamentosos.

O vector de clonagem e célula hos pedeira transformada com o vector são usados neste invento tip_i camente para aumentar o número de cópias do vector. Com um aumento do número de cópias, os vectores contendo o gene da N -acetiltransferase pode ser isolado e, por exemplo, usado para introduzir ao sequências genéticas quiméricas nas células vege tais. 0 material genético contido no vector pode ser microinjectado directamente nas células vegetais através da utilização de micropipetas para a transferência mecânica do DNA recombinari te. O material genético pode também ser transferido para a célu la vegetal usando polietilenoglicol que forma um complexo de precipitação com o material genético o qual é internalizado p.e

-33la célula. (Paszkowski et al. , EMBO J. _3: 2717-22 (1984 )).

Numa execução alternativa deste vento, o gene da N ^-acetiltransferase pode ser introduzido nas células vegetais por electroporação. (Fromm et al., Expression of Genes transferred into Monocot and Dicot Plant Cells by Eleg troporation, Proc. Nat'1 Acad. Sei U.S.A. 82: 5824 (1985)). Nesta técnica os protoplastos vegetais são electroporados na presença de plasmideos contendo a construção genética da N ^ac_e tiltransferase. Os implusos eléctricos de alta voltagem permeabilizam reversivelmente biomembranas permitindo a introdução dos: plasmideos. Os protoplastos vegetais electroporados refazem a parede celular, dividem-se e formam calos vegetais. A selecção das células vegetais transformadas com a N ^-acetiltransferase expressa pode ser conseguida usando as marcas fenótipicas como descrito atrás.

Um outro método para a introdução do que da N ^acetiltransferase em células vegetais é infectar uma qélula—v-egetal com Agrobacterium tumefaciens transformada com o gene da N £<-acetil transf erase . Em condições adequadas conte cidas na especialidade , as células vegetais transformadas são cultivadas para formar rebentos, raízes e desenvolverem-se em plantas. As sequências genéticas da ΝΛ-acetiltransferase podem ser introduzidas nas células vegetais adequadas, por exemplo, por meio do plasmideo Ti de Agrobacterium tumef aciens. 0 plas^ mídeo Ti é tarnsmitido às células vegetais quando da infecção por Agrobacterium tumef aciens e é estávelmente integrado no genoma vegetal. (Horsch et al., Inheritance of Functional For eign genes in Plants, Science 233: 496-498 (1984); Fraley et al Proc. Nat ' 1 Acad. Sei USA 80 : 480 3 ( 1983)).

Os plasmideos Ti contêm regiões essenciais à produção de células transformadas. Uma destas, designada DNA de transferência (TDNA) induz a formação de tumores A outra, designada região virulenta é essencial à formação mas não à manutenção de tumores. A região do DNA de transferência, que transfere para o genoma vegetal, pode ser aumentada através

-34da inserção da sequência genética da enzima sem que a sua capa cidade de transferência seja afectada. Pela remoção dos genes causadores de tumores de modo a que eles não mais interfiram, o plasmídeo Ti modificado pode então ser usado como um vector para a transferência das construções genéticas do invento para uma célula vegetal adequada.

Todas as células vegetais que poder ser transformadas por Agrobacterium e plastas completas regeneradas a partir das células transformadas podem também ser trans formadas de acordo com o invento de modo a produzir plantas corn pletas transformadas que contêm o gene da N -acetiltransferase transferido.

Existem presentemente duas maneiras diferentes de transformar células vegetais com Agrobacteriun (1) co-cultura de Agrobacterium com protòplastos isolados em cultura ou (2) transformação de células ou tecidos com AgrobacteÍUm.

O Método (1) requere um sistema de cultura estabelecido que permita a cultura de protoplastos e a regeneração de plantas a partir dos protoplastos cultivado.

Método (2) requere (a) que as células ou tecidos vegetais possam ser transformados por Agrobacterium e (b) que as células ou tecidos vegetais transforma dos possam ser induzidos para regenerar plantas completas. No sistema binário, para se ter infecção são necessários dois pias mídeos um plasmídeo contendo T-DNA e um plasmídeo vir.

Após transformação da célula vegetal ou planta, as células vegetais ou plantas transformadas pelo plasmídeo Ti de modo a que a enzima seja expressa, podem ser seleccionados através de um marcador fenótipico adequado. Estas marcas fenotípicas incluem mas nãõ estão limitadas a resistência a antibióticos. São conhecidas outras marcas fenotipicas que podem ser usadas neste invento.

-35Todas as plantas a partir das quais podem ser isolados e cultivados protoplastos para darem plantas completas regeneradas podem ser transformadas pelo pre sente invento de modo a que sejam recuperadas plantas completas que contêm o gene da N^-acetiltransferasetransferido. Algumas plantas adequadas incluem, por exemplo, espécies dos géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum , Geranium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus , Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotina , Solanum, Petunia, Digitalis , Majo

Agrobacterium nocotiledóneas rana, Cichorium, Helianthus , Lactuca, Bromus, Asparaqus , Antirrhinum , Hemerocallis , Nemesia, Pelargonium, Panicum , Pennisetum , Ranunculus, Senecio , Salpiglossis, Cucumis , Browallia Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, e Datura.

Existe um número crescente de dados que sugerem que práticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos em cultura incluindo mas nao' esTãndo limitado a todas as espécies principais de cereais, cana de açúcar, beterraba sacarina, algodoeiro, árvores de fruto e outros , legumes e vegetais. Neste momento desconhe ce-se se todas estas plantas podem ser transformadas por Agrobacterium. As espécies que são hospedeiros naturais de podem ser transformadas in vitro. As plantas mo e em particular, cereais e forragens, não são hospedeiros naturais de Agrobacterium. Até recentemente as ten tativas para as transformar com Agrobacterium têm sido infrutí feras. (Hooykas-van Slogteren et al., Nature 311: 763-764 (1984) Existe evidencia crescente que certas monocotiledóneas podem ser transformadas por Agrobacterium.Usando novas abordagens experimentais agora disponíveis, os cereais e espécies de ferragens podem ser transformados.

Outros géneros de plantas que podem ser transformados por Agrobacterium incluem Ipomoea Passiflora, Allium, Lilium, Narcissus , Ananas, Arachis,

-36Phaseolus, e Pisum.

A regeneração de plantas a partir de protoplastos em cultura está descrito por Evans et al. , Protoplast Isolion and Culture em Handbook of Plant Cell Culture _1: 124-176 (MacMillan Publishing Co. , New York, 1983 );

M.R. Davey, Recent Developmento in the Culture-and Regeneration of Plant Protoplasto Protoplastos, 1983- Lecture Proceedings pág. 19-29 (Birkhauser, Basel, 1983 ); P.J. Dale, Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereais and Other Recalcitrait Recalcitrant Crops em Protoplasts 1983 -Lecture Proceedings, pág 31-41 (Birkhauser, Basel, 1983); e H. Binding, Regeneration of Plants em Plant Protoplasto, pág. 21-37 (CRC Press, Boca Raton, 1985).

A regeneração varia de espécie para espécie de plantas, mas geralmente uma suspensão de proto plastos transformados contendo múltiplas cópias do gene da N c*—acetiltransferase é obtida em primeiro lugar. A formação de embriões pTTde então ser induzida a partir das suspensões de pro toplastos para a fase de ripening e germinação como embriões n_a turais. O meio de cultura conterá geralmente vários aminoácidos e hormonas, tais como auxina e ritocininas. É também vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para espécies tais como milho e alfafa. Os rebentos e raízes nor malmente desenvolvem-se simultaneamente. A regeneração eficaz dependerá do meio do genótipo e da história da cultura. Se estas três variáveis forem controladas a regeneração será então totalmente reprodutível e repetível .

As plantas maduras, cultivadas a partir de células vegetais transformadas, são auto-cruzadas para produzirem plantas consanguíneas. As plantas consanguínas produzem sementes contendo o gene para a NP^-acetiltransferase. Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que tenham uma maior velocidade de acetilação.

-37Estas plantas consaguíneas de acordo com este invento podem ser usadas para desenvolver híbridos tolerantes a herbicidas. Neste método, uma linha consanguínea tolerante a herbicidas é cruzada com uma outra linha consanguínea para produzir o híbrido.

Partes obtidas a partir da planta regenerada, tais como flores, sementes, folhas, ramos, frutos e similares são cobertos pelo invento desde que estas partes compreendam células tolerantes a herbicidas. A progénie e variantes é mutantes das plantas regeneradas também estão incluindas no âmbito deste invento.

Em plantas diplóides, tipicamente um progenitor pode ser transformado pela sequência genética da N ^-acetiltransferasee o outro progenitor é tipo selvagem. Após cruzamento dos progenitores os híbridos da primeira gera ção (Fl) mostrarão uma distribuição de 1/2 Nt^-acetiltransferase/tipo selvagem: 1/2 N^-acetiltransferase/tipo selvagem . Esta-prime-í-ra- geração de híbridas (Fl) são auto-cruzados para produzir uma segunda geração de híbridas (F2). A distribuição genética dos híbridos F2 são 1/4 N X-acetiltransferase/ N K-ace tiltransferase: 1/2 N X-aceti 1transferase/tipo seivagem: 1/4 tipo seivagem/tipo selvagem. Os híbridas F2 coma com a composição genética NK-acetiltransferase /Ntx.-acetiltransf erase são escolhidos como as plantas tolerantes a herbicidas.

Tal como aqui é usado, variante descreve alterações fenotípicas que são estáveis e hereditárias incluindo variação hereditária que é sexualmente transmitida à progénie das plantas, desde que a variante ainda seja uma planta tolerante a herbicidas através de uma maior taxa de ace tilação. Também , como aqui é usado, mutante descreve variação como resultado das condições ambientais, como seja radiação, ou como resultado da variação genética em que uma característica é transmitida meioticamente de acordo com leis da hereditariedade bem estabelecidas. A planta mutante, no entanto, de-38ve ainda apresentar uma tolerância a herbicidas através de uma maior taxa de acetilação de acordo com o invento.

Tendo já descrito de um modo genérico o invento, o mesmo será melhor compreendido por referência a exemplos específicos, os quais são aqui incluídos apenas com fins ilustrativos e não pretendem ser limitantes a menos que de outro modo seja especificado.

EXEMPLO 1

Isolamento e purificação de N^-acetiltransferase

Materiais e métodos

Ensaios enzimáticos ·, Amostras de enzimas de 1-10 pl foram adicionadas a tubos Eppendorf de 1,5 ml contendo uma mis tura de reacção de 50 mM Hepes-K⁺, pH 7,4, 150 mM KC1, lmM DTT, 25 pM / ^H/acetil-Coenzima A (0 ,5 pCi , /^H/acetil-coenzima A da Amersham, acetil-coenzima A não marcado da P-L Biochemicals ) e 50 pM ACTH (1-24) com um volume final de 100 pl. A mistura do ensaio foi incubada a 30°C durante 30 minutos. A reacção foi parada pela adição de 17 pl de ácido acético 0 ,5 M e arrefecida num banho de gelo. As amostras de reacção foram filtradas através de uma membrana SP de 2,5 cm de diômetro (Cuno Inc.) que tinha sido pré-inchada numa lavagem com 0 ,5 M ácido acético.

As membranas foram lavadas três vezes em 1 ml de ácido acético 3

0,5M para remover o L. HV acetil-coenzima A que nao reagiu. As membranas parcialmente secas foram contadas num contador de ciri tilação Beckman L5 3801. A radioactividade na testemunha repre sentou acetilação de compostos endogenos foi subtraída da deter; minação de cada amostra. Uma unidade de actividade foi definida

-39como 1 pmole de resíduos acetilo incorporada em ACTH (1-24) em condições de ensaio convencionais.

Purificação de N^-acetiltransferase de levedura

Crescimento celular e armazenamento

Células de levedura estirpe TD 71 -8 foram cultivadas aeróbicamente a 30°C em meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose) colhidas na fase log tardia e guardadas a 20°C com 10% (v/v) de glicerol até 4 meses sem perda de actividade.

Extracto Celular

As células foram descongeladas colhidas por centrifugação a 4000 rpm durante 10 minutos (Bech£ man , -rotor—J-S--4 ,0 ) . As células (800 g, peso molhado) foram ressuspensas em 1 litro de tampão A (sorbitol 1M, três-HCl 50mM, pH7,0, MgCl₂ 10mM, DTT 3mM) contendo 80 mg liticase (Sigma) e a suspensão celular foi agitada muito suavemente), a 30°C durante 45 minutos. Todos os passos subsequentes foram efectuados a 4°C. Os esferoplastos foram colhidos por centrifugação a 4000 rpm durante 10 minutos, lavados por ressuspensão suave em 500 ml de tampão A, colhidos por centrifugação e ressuspensos suavemente em 400 ml de Tampão B /10mM Hepes-K⁺, pH7,4, l,5mM

MgCl , lOmM KC1 e 0,5 mM DTT). Os esferoplastos foram rebentaâ dos neste tampão hipotánico fazendo trinta choques com um homo geneizador de vidro Dcunce e adicionou-se 2,0 M KC1 frio para dar uma concentração de KC1 final de 0,2M. O homogenato foi suavemente agitado durante 30 minutos e os detritos celulares removidos por centrifugação a 14000 rpm durante 45 minutos (Beckamn, rotor JA 14). A solução do sobrenadante foi concentre da por ultrafiltração com membrana PM-30 (Anicon, Lexington, Mfl) e dialisada durante a noite contra 8 litros de tampão HDG (20 mM HEPES-K⁺, pH 7,4, 0,5 mM DTT, 10% (v/v) glicerol e 0,0 2%

NaN^) contendo 0,2M KC1.

-40 Cromatografia em DEAE-Sepharose CL-6B

DEAE Sepharose CL.-6B (Pharmacia, P-L Biochemicals) foi preparada, desgaseada e usada para encher uma coluna (55x2,5cm) seguindo as intruções do fabricante. A co luna foi lavada com quatro volumes de coluna de tampão HDG con tendo 0 ,2 KC1 (para cromatografia com 0,2M KC1) ou 50mM KC1 (para cromatografia com gradiente linear de KC1). O sobrenadante dialisado foi aplicado na DEAE Sepharose CL-6B pré-equilibrada em tampão HDG contendo 0,2 M KC1. A actividade de acetiltransferase foi eluida com o mesmo tampão a 24 ml/h. As fracções contendo a actividade de acetiltransferase foram reunidas e cori centradas para um volume de 50 ml usando uma membrana de ultra filtrãçãò FfflCSO. Este eluato concentrado foi dialisado durante a noite contra 4 litros de tampão HDG contendo 50mM KC1 e depois aplicado numa coluna de DEAE Sepharose CL-6B pré-equilibrado em tampão HDG contendo 50mM KC1. A coluna foi desenvolvida com um gradiente linear entre 0,05 M (250 ml) e 0,5M (250ml) de KC1 em tampão HDG a 24 ml/h e as fracções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas e concentradas para um volume de 5 ml.

Cromatografia em hidroxilapatite eluato concentrado foi dialisaGb durante a noite contra 4 litros de tampão fosfato de potássio, pH 7,4, 0,5 mM DTT, 10% (v/v) de glicerol, 0,02% NaN^ e aplic_a do numa coluna de hidroxilapatite (2,5x40cm) pré-equilibrada com tampão de diálise. A coluna foi desenvolvida com um gradien te linear entre 0 ,05M (200 ml e 0 ,5M (200ml) de tampão fosfato

de potássio, pH 7,4, em 0,5 mM DTT, 10% (v/v) de glicerol,

0,02% de NaN^ e as fracções contendo actividade de acetiltrans. ferase foram reunidas e concentradas para um volume de 2,5 ml.

Cromatografia em DE-52

Este eluato concentrado foi dialisado durante a noite contra 4 litros de tampão HDG contendo 50mM KC1 e depois aplicado numa coluna DE-52 (Whatman; (2,5 χ 55 cm) pré-equilibrada em tampão HDG contendo 50 mM KC1. A coluna foi desenvolvida com um gradiante linear entre 0,05M (250 ml) e 0,5 M (250 ml) KC1 em tampão HDG a 24 ml/h e as frac ções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas e concentradas para um volume de 1 ml.

Cromatografia em gel Affi-Gel Blue

Este eluato concentrado foi dialisado durante a noite contra 4 litros de tampão HDG contendo 50mM KC1 e depois aplicado numa coluna de gel Affi-Gel Blue (1,5 x 25 cm) (Bio-Rãd) Pré-equilibrada com tampão HDG contendo 50 mM KC1. A coluna foi desenvolvida com um gradiente linear en tre 0,05 M (150 ml) e 1M (150 ml) KC1 em tampão HDG a 12 ml/h e as fracções contendo actividade de acetiltransferase foram reunidas e concentradas.

Electroforese em gel de Dodecilsulfato de sódio-poliacrilámida

E FILTRAÇÃO EM GEL

Amostras de acetiltransferase pu rificada foram aplicadas em gás de SDS-8% de poliacrilamida e sujeitas a electroforase em condições redutoras , conforme des-42crito por Laemmli, U . K . , Nature 22 7: 680-685 (1970). Para a determinação do peso molecular aplicaram-se paralelamente amostras de miosina (205 000 ) , ^-galactosidase (116 000 ) , fosforilase (97000), albumina bovina (66000), albumina do ovo (45000) e anidrase carbónica. As bandas de proteína foram coradas com Coomassie Brilliant Blue R em metanol-ácido acético. A deternd nação do peso molecular aparente por filtração em gel foi efec tuada usando uma coluna de Sepharose Ch-4B (2,5 x 96 m). O tampão de eluição foi tampão HDG contendo 0 ,2 M KC1 e o caudal foi de 20 ml/h. O volume de eluição da acetiltransferase foi deter minado pelo ensaio convencional e o peso molecular aparente calculada a partir dos volumes de eluição relativos das prote_í nas padrão incluindo tiroglobulina (669000), apoferritina (443 000 ) .^-amilase (2000 000 ) , álcool-desidrogenase (150 000 ) , albumina (66000) e anidrase carbónica (20000).

Análise dos aminoácidos e da sequência da proteína

A composição em aminoácidos foi obtida usando um Beckman 6300 Amino Acid Analyzer após 24 h de hidrólise a 110°C em HC1 6N contendo 0,1% de fenol. A análise da sequência da proteína foi efectuada usando um Applied Biosystems 470 A Proteína Sequencer e um Applied Biosystem 120 A Pth Analyzer.

EXEMPLO 2

Clonagem molecular e seguenciação de um N pt-acetiltransferase de Saccharomyces cDNA codificador de Cerevisiae

Materiais e métodos

Análise da sequência proteica de N^-acetiltransferase

-43N^-acetiltransf erase foi purifica, da a partir de levedura como previamente descrito. N°<-acetiltransferase (3 mmole) foi reduzida e alquilada, precipitada com clorofórmio/metanol frio, redissolvida em O,1M NH^HCO^, incuba da com trepsina tratada com TPCK (EC 3,4,21,4; Cooper Biomedical, Malvern, PA) (120 pmoles) durante 24 h a 37°C, recuperada por liofilização e dissolvida em hidrocloreto de guanidina 6M em 0,1% CF₃COOH para HPLC.

Os peptídeos tripticos foram sepa rados numa coluna de HPLC Vydac fenil (0 ,45 x 25 cm) e fracções selecccionadas foram recromatografadas isocráticamente uma ou duas vezes (Wong, W.W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7711-7715 (1985)^ Os picos cromatograficos foram detectados a 214 e 280 nm, colhidos manualmente e liofilizados. Os peptídeos tripticos foram sequenciados por degradação automática de Edmam efectuada com um Applied Biosystems 470 A Protein Sequencer e um Applied Biosystems 120 Pth Analyzer and Biology of peptides, Meienhofer ^Moore, S., In: Chemistry J. (ed.), Ann. Arbor

Science Ann Arbor, MI, pág. 629-652 (1972

Construção e despiste da biblioteca de cDNA

Isolou-seRNA de levedura como descrito por Sherman et al. (Sherman , F. , et al., Methods in

Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harto NY (1986). Seleccionou-se RNA poli (A)⁺ numa coluna de oligo (dt)-celulose (Aviv, Η., et al, Proc. Natl. Acad. Sci-USA 69 1408-1412 (1972)). O cDNA foi sintetizado a partir de 10 pg de RNA poli (A)⁺ pelo método de Okayama e Berg (Okyama, H.,

-44et al. , Mol Cell Biol. 2.: 161-170 (1982)), com forma modificado por Gubler e Hoffman (Gubler., U. et al. Gene 25:263-269 (1983 ), excepto 10% da segunda cadeia ser marcada com [ PJ .

OcDNA foi preparado para ligação a barços Jgtll usando um método introduzido por Dr. Brian Seed Department of Molecular Biology, MGH. Após os extremos do cDNA serem tornados cegos com DNA-polimerase de T4, o cDNA foi liga do a adaptadores consistindo em dois oligonucleotídeos: 3'CTC TAAAG'5 e S'ACACGAGATTTC 31 Este CDNA foi fraccionado num gra diente linear de 5 a 20% de KOAc (50 ml) usando um rotor Beckeman SW55 centrifugado durante 3 h a 50 000 rpm a 22°C. As fracções (0,5 ml) foram colhidas a partir do fundo do tubo. O cDNA foi precipitado pela adição de etanol e poliacr ilamida li. near (20 jig/ml). O tamanho dos cDNA em cada fracção foi determinada num gel de 0,1% de agarose e as fracções contendo cDNAs entre 1 e 8 Kb foram reunidas. Dez microgramas de DNA de gtll (Young, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1194-1198 (198.3.) ) , f.g_L-d.igerido com Eco RI e ligado a adaptadores ( 3 ' GTGT GACCAGATCCTCTTAA 5'e 5 ¹ CTGGTCTAGAG 3 ' ) e precipitado com PEG 8000. 600 mg de DNA de gtll tendo adaptadores foi ligado a 150 mg de cDNA seleccionado por tamanho tendo adaptadores complementares em 2 jjí e encapsidado in vitro (Maniatis, T. ,et al. Molecular Cloning: A Làboratory MAnual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982 ) (Stratagene). Escherichia coli estirpe yl088 foi infectada com fago recombinante e a biblioteca foi amplificada uma vez. A frequência de recombinantes foi de aproximadamente 82%.

De entre várias sequências peptidicas, escolheram-se dois peptídeos (peptídeos 27-3 e 11-3-2; Figura 12A) para a construção de duas sondas oligonucleotídicas (N^ e N₂) baseado na utilização de codões mais provável (Lathe, R., J. Mol. Biol. 183: 1-12 (1985)). As sondas de oligonucleotídeas foram sintetizadas com um sintetizador de DNA Applied Biosystems 380 A usando o método de fase sólida baseado

-45em silica (Matteucci, M.D., J. Am. Chem. Soc. 10 3: 3185-3181 (1981)) e o método de nuclosideo-fosforamideto activado com protões (Beaucage, S.L., Tetrahedron Lett.22: 1859-1862 (1981) Os oligonucleotídeos purificados foram isolados a partir das misturas sintéticas brutas por PAGE e marcados com uma actividade específica de 2-8 χ 10 cpm/Mg usando [ - P]-ATP (New En gland Nuclear) e polinucleotídeo-cinase de T4 (New England Bio lais) (Zoeller, M., et al., DNA 3:479-488 (1985)).

No despiste inicial, 5000 000 clone recombinantes da biblioteca de cDNA de levedura em Zgtll foram semeados em _E. coli Y1088. Fizeram-se transferências de duplicados dos clones para nitrocelulose e os filtros foram prepara dos para hibridação (Zoeller, M., et al.,DNA 3: 479-488 (1985) Em seguida os filtros foram lavados duas vezes à temperatura ambiente em 6x55C (0,15M NaCl/15mM 42 citrato de sódio (Nacl/ /lit) contendo 0,1% SDS e 0,05% NaPPi), lavado uma vez a 5°C abaixo da td mínima (temperatura de dissociação da sonda baseado no 'teor G/C) e exposto a filme de raios-X durante 2 a 4 dias. As td máxima e minima foram determinadas para dois conjuntos de sondas oligonucleotídicas redundantes (N^ e N^) (Sggs, S.U. et al., Em: Developmental Biology Using Purified Genes, Brown, D. (ed). Academic Press. New York. pág.683-693 (1981) ).

Sequênciação de DNA e análise de transferência

Os fragmentos de cDNA foram remo vidos do DNA dos fagos gtll recombinantes por digestão com Eco RI. Os fragmentos de CDNA foram separados por electroforese em agarose de ponto de fusão baixo. A banda da DNA correcta foi retirada, o gel fundido a 65°C e o DNA extraído com fenol. Os fragmentos de cDNA purificados foram clonados no plasmideo Bluescript (Stratagene) . Ambas as orientações da sequência com pleta do gene da tA-acetiltransferase de levedura (AAA1) foram determinadas por delecção com exonuclease III (Henikoff,·S.,

-46Gene 28: 351-359 (1984)), pelo método de terminação de cadeias didesoxi de Sanger (Snager, F., et al., J. Mol.Biol 94: 441-448 (1975)) midificado para sequenciação de cadeia dupla por Guo et al. , (Guo, L. H-. , et al. , Nucle. Acids Res 11 , 5521-5539 (1983) e iniciação específica com oligonucleotídeos sintéticos. Todas as enzimas de restrição foram adquiridas à New England Biolabs. Os marcadores de RNA e DNA foram adquiridos à Bethesda Research Laboratories. A membrana de nylon Biotrans foi da INC. O RNA poli(A)⁺ foi analisado por hibridação de transferências Northern (Lehrach, H., Biochemistry 16:4743-4751 (1977); Thomas P.S., Proc. Natl. Acad. Sei USA 77:-5201-5202 (1980)). O DNA genómico foi isolado a partir de levedura / Sherman, F., et al Methods in , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)), digestão com enzimas de restrição e analisado por hibridação de transferências Southern (Southern, E., J.Mol.Biol 98: 503-517 (1975)). O cromossoma portador do gene AAAl foi localizado por hibridação com um cromo-di-hibridizãdor de Saccharomyces) (i.e. uma transferência cromossónica de levedura).

Análise de Peptideos trípticos da N^acetiltransferase

O método adoptado para a identificação e clonagem das sequências de cDNA derivado de mRNA de N^-acetiltransferase utiliza sondas oligonucleotidícas que fo ram construídas com base nas sequências de aminoácidos de peptídeos trípticos de N^-acetiltransferase purificados e nos dados de frequência de utilização de codões (Lathe, R., J.Mol. Biol 183:1-12 (1985)). Os péptideos trípticos da N°^acetiltraní_ ferase de levedura, foram separados por HPLC de fase reversa e colhidos em 62 conjuntos representando picos distintos ou patamares (Figura 11). Três nanomoles de N^acetiltransferase foi reduzido alquilado, digerido com trípsina e cromatografado numa coluna de HPLC Uydac fenil 0,46 χ 25cm com 0,1% de CF^COOH num gradiente linear de 0-60% de CH^CN durante 2 h. Após uma

-47ou duas separações isocráticas adicionais por HPLC para resolver outros peptídeos tripticos individuais sequenciáveis (Wong,

W.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 82:7711-7715 (1985 )),determinaram-se as sequências de 16 peptídeos, compreendendo apro ximadamente 30% de toda a molécula de N^U-acetiltransferase.

Sintese das sondas oligonucleotidicas

Dois oligonucleotídeos sintéticos baseados na utilização de codões com 57 bases (Nl) e 48 bases (N2), correspondendo à sequência de um peptideo de 19 (peptídeo 27-3) e 16 resíduos (peptideo 11-3-2), respectivamente, foram usados no despiste inicial da biblioteca de cDNA (Figura 12A). Em adição, duas sondas oligonucleotidicas degeneradas de 23 (5¹CCXTTGACYTTY TTR CAAGATAA 3') e 20 bases (3¹TCRTCRGCATYTG RAART A¹ 5') com 64 e 32 vezes de redundância, designadas N^ e N^, foram sintetizadas com base nos dados de sequênciação dos peptfdeos.,-2.9—1 e 10-3-1, respectivamente. A utilização de quatro sondas oligonucleotidicas derivadas de quatro sequências de aminoácidos discretas permitiu a identificação inequívoca dos clones de cDNA codificadores de N -acetiltransferase. As análi ses da sequências proteicas foram completadas com rendimentos repetitivos entre 87% e 93% para 100-200 mmoles de cada peptíde)

Clonagem do cDNA de N^-acetiltransferase de levedura

Após despiste inicial de 500 000 clones recombinantes de cDNA da biblioteca de cDNA de levedura em Jgtll, onze clones hibridaram com ambos os oligonucleotideoí Nl e Nr. Estes clones designados N¹ a N¹¹, também hibridaram com os oligonucleotideos N 3 e N 4 e as suas inserções de cDNA foram analisados por digestões com enzimas de restrinção e análise de transferências Souther. A digestão com Eco RI revelou inserções sem os locais EcoRI internos e variando entre

-482,0 a 2,7 Kb. As seis inserções de cDNA maiores foram subclona das como fragmentos Eco RI no plasmídeo Bluescript e efectuaram -se mapeamentos com enzimas de restrição adicionais, análises de transferências Southern e análise de sequências de nucleotídeos. Os seis clones de cDNA (pBNl, pBN3, pBN7, pBN9 , pBNIO e pBNll) apresentaram mapas de restrição idênticos. (Figura 12B)

Análise da sequência dos clones de cDNA

A sequência de nucleotídeos com pleta, ambas as orientações, dopBNl foi determinada usando deleções com exonuclease III e o método de terminação de cadeias didesoxi para cadeias duplas. A sequência da proteína traduzida a partir da sequência da inserção de cDNA de 2,71 Kb do pBNl continha sequências idênticas às determinadas a partir da anál_i se de sequência proteica de 16 peptídeos tripticos (Figura 12C) No entanto, houve um codão de paragem situado nos nucleotídeos 1409-1411 e a fase de leitura putativa mudou depois desta codão de paragem. Assim, as sequências de nucleotídeos dentro da região correspondente dos outros 5 clones de cDNA foram determinai das usando iniciadores oligonucleotidicos sintéticos. Estes 5 clones tinham cada um, um T adicional que mantinha uma grelha de leitura aberta. É evidente que o codão de terminação no pBNl foi introduzido por deleção de um T no nucleotídeo 1410, presumivelmente resultando de uma ausência de fidelidade para a reac ção da transcriptase reversa durante a síntese de cDNA.

A sequência de nucleotídeos com pleta do cDNA de N*-acetiltransferase de levedura está apresentada na Figura 12C. O sítio de iniciação da tradução foi determinado inequivocamente, porque existe apenas um codão ATG (nucleotídeo 22-24), que é precedido por um codão de terminação em fase (nucleotídeos 13-15), situado a montante e na mesma grelha de leitura da sequência de DNA codificadora de um peptídeo triptico (resíduos 61-82) que precede a metionina seguin

-49te na sequência situada no resíduo 101. Existe uma grelha de leitura aberta de 2562 nucleotídeos codificando os 845 resíduo de aminoácidos da N^acetiltransferase , um codão de termina ção (TAG) nos nucleotídeos 2584-2586 e um sinal de poliadenila ção (ATAAAA) situado 18 nucleotídeos a montante de cauda poli (A ) .

Comparação dos dados de sequenciação de DNA e proteina para o cDNA de N^-acetiltransferase de levedura com as bases de dados de sequências de DNA e de proteina

O EMBL Nucleic Acid Database revelou uma identidade de 842 bases entre uma região 3' do cDNA codificador de N^-acetiltransferase, começando no núcleo tídeo 1858 e terminando no nucleotídeo 2699 e a sequência de DNA genómica e montante do extremo 5' do gene STR2 situado no cromossoma 4 (resultados não publicados de Shore, D., et al.

(Shojre,·· A_r--et al, EMBO J. 3j 2817-2823 (1984)) e depositada no EMBL Nucleic Acid Database). As comparações entre a sequência de proteina da N -acetiltransferase de levedura e a colina-acetiltransferase de fígado de galinha (Deguchi, T. et al., J. Biol. Chem 263: 7528-7533 (1988)) revelou uma semelhan ça percentual de 10%, 12%, 12%, 14%, e 15%, respectivamente, se bem que haja sequências de 6 a 16 resíduos de aminoácidos que têm semelhanças percentuais entre 44% e 83% (Devereux, J. et al:; Nucl. Acids. Res. 12:387-395

Análises de transferências Northern, Southern e

Cromossónicas

A análise de transferências Northern de mRNA poli(A)⁺ de levedura usando uma sonda de cDNA de N^-acetiltransferase de levedura marcada com ?²p7

-50 (pBNl) revelou uma banda de RNA de 2,7 kb. O DNA de levedura (10 ug) foi digerido com as enzimas de restrição indicadas. Os fragmentos de restrição foram sujeitos a electroforese em 0,8% de agarose em tampão Tris-borato. 0 DNA foi transferido para um membrana de nylon e hibridado com cDNA de AAA1 marcado com /32P (derivado de pBNl) durante 24 horas e lavado (Southern, E., J. Mol Biol. 98: 503-517 (1975)).

A análise de transferência Southern de DNA genómico de levedura digerido com enzimas de restr ção revelou que os tamanhos dos fragmentos eram semelhantes aos tamanhos dos fragmentos de restrição do cDNA de N -acetiltran^s ferase de levedura (pBNl) (Figura 12B). 0 RNA poli(A)⁺ de leve dura (10 mg) foi sujeito a electroforese num gel de 1,2% de agarose/formaldeido (Maniatis, Τ. , et al ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, NY (1982). O mRNA foi transferido para uma membrana de 32 nylon e hibridado com cDNA de AAA1 marcado com P \ (derivado de pBNl·.) -fiur-ante 24 horas e lavado (Lehrach, H., Biochemis try 16.:4 743-4751 (1977); Thomas , P.S. Proc. Nath. Acad. Sei USA 77:5201-5202 (1980)). A faixa de gel contendo os marcadores de RNA foi cortada, corada com brometo de etídico e usada para determinação do peso molecular do mRNA poli(A)⁺ de levedura.

A análise de transferência cromes sónica com a sonda indica que o gene da N0L-acetiltransferase de levedura (AAA1) está situado no cromossona IV. Um gel de agarose do DNA cromossónico de levedura foi hibridado com cDNA 32 de AAA1 marcado ao acaso com P(derivado do pBNl) durante 24 horas e lavado de acordo com as tecomendações do fabricante.

-51Perfil de hidrofobicidade da N^t-acetiltransferase de levedura perfil de hidrofobicidade na F gura 13 foi determinado usando o algoritmo de kyte e Doolittle (kyte , J. et al., J. Mol Biol 15 7:10 5-132 (1982)) com um tama nho de janela de 9 (Figura 13). A proteína é rica em aminoácidos com carga, incluindo 96 resíduos de lisina, 37 de arginina 59 de ácido aspártico e 60 de ácido glutâmico. Em adição, exij; te uma região hidrofilica prolongada entre os resíduos 508 e 720 , que é rica em resíduos associados ás conformações B (Chem P.Y. et al., Em: Peptides:Proceedings of the Fifth American Peptide Syuposium, Goodman, M. et al., (eds) , Jhon Wileu and

Sons, New York, pág. 284-287 (1977)).

Se bem que o que foi descrito se refira a realização particulares preferidas, compreende-se que o presente invento não lhes está limitado. As pessoas famialict rizadas com a matéria ocorrerá que várias modificações podem ser feitas às realizações divulgadas e que tais modificações são para serem incluídas no âmbito do presente invento.

Claims

REIVINDICAÇÕES lã. - Método para a recuperação de

N ^-acetiltransferase substancialmente purificada a -partir de uma amostra contendo N<K-acetiltransf erase, caracterizado por compreender; os passos seguintes:

(a) recuperação de NMcetiltransferase bruta a partir de uma amostra contendo, a referida N<\-acetiltransf erase;

(b) sujeição da referida NíÇ-acetiltransferase bruta do pas^ so (a) a cromatografia de permuta iónica para se obter fracções activas de N K-acetiltransferase definida como lpmole de resíduos acetilo incorporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) nas con dições de ensaio padrão;

(c) aplicação das referidas fracções activas de NK-acetil.transferase do passo (b) a cromatografia de adsorção com hidroxiapatite para se obter N ^.-acetiltransferase parcialmente purificada; e (d) purificação de Ν K-acetil transf erase até à homogeneidai de através da aplicação da referida N í*·—acetiltransf erase parcialmente purificada do passo (c) a uma cromatograf ia de afinidade e eluição da N A<_acetiltransferase substancialmente purificada, tendo as seguintes caracte risticas:

(a) um peso molecular de aproximadamente 180000;

(b) duas subunidades peptídicas tendo pesos moleculares de aproximadamente 95000 cada;

(c) pH óptimo 9,0;

(d) actividade máxima nas temperaturas entre 30° e 42°C em que uma unidade de actividade é definida como 1 pmole de resíduos acetilo incorporados em hormonas adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) nas condições padrão ;

-53(e) inibida por catiões divalentes Cu^ ⁺ e Zn^⁺; e (f) especificidade do substracto dependente do residuo amin£ -terminal.
2â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma N K-acetiltransferase tendo actividade enzimática superior a 100 em que uma uni dade de actividade é definida como 1 pmole de resíduos acetilo incorporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) em condições de ensaio padrão.
3ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por se obter uma N£x-acetiltransferase --terido^-mrti vidade enzimática superior a 300 em que uma unidade de actividade é definida como 1 pmol de resíduos acetilo incorporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) nas condições de ensaio padrão.
4â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma N«-acetiltransferase tendo actividade enzimática superior a 1000 em que uma uni dade de actividade é definida como 1 pmole de resíduos acetilo incorporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos 1-24) em condições de ensaio padrão.

-545ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma N^acetiltransfera se tendo actividade enzimática superior a 7 000 em que uma unida^ de de actividade é definida como 1 pmole de resíduos acetilo iri corporados na hormona adrenocorticotrópica (ACTH) (aminoácidos

1-24) em condições de ensaio padrão.
6â. - Processo para a preparação de uma molécula de DNA recombinante, caracterizado por se inco£ porar na referida molécula uma sequência genética codificadora do NtC-acetiltransferase tendo a sequencia de aminoácidos mostra da na Figura seguinte: