PT90465B - Processo de preparacao de derivados da guanina imuno-estimulantes e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

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REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

INVENTORES:

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 465

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION,nor te-americana (Estado de Califórnia), com sede em 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Califórnia 92037, EStados Unidos da América.

” PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DA GUANINA IMUNO-ESTIMULANTES E DE COMPOSI ÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM .

Michael Goodman, William Weigle, Stanley Bell, Robert Chen, Roland K. Robins e William J. Hennen.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, em 05 de Maio de 1988, sob o ns.190,697.

1NPI. MOO. 113 RF 18732

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SCRF 124.OA

PATENTE N2 90 465

Processo de preparação de deri. vados da guanina imuno-estimulantes e de composições farmacêuticas que os contêm para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, pretende obter pri vilégio de invenção em Portugal

RESUMO presente invento refere-se a um processo de preparação de um derivado de guanina-nucleósido substituído com a fórmula

onde

X é 0, S, Se ou NCN;

r! é um radical hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, com um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo;

3

R e R são radicais iguais ou diferentes seleccionados entre os do grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alca2 3 noiloxilo inferior e benzoxilo, ou R e R constituem juntos um radical alquilidenodioxilo inferior;

R é um radical seleccionado entre os do grupo consistin69 188

SCRP 124.OA <T

-2do de hidrogénio, alcanoilo inferior, e benzoilo; e dos seus sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por:

a) se reagir l-amino-8-oxoguanosina com um agente de alqui lação que é um composto hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, para formar um produto l-amino-7-substituída-8-oxoguanosina;

b) se isolar o produto do passo a);

c) se dissolver o referido produto isolado do passo b) em HC1 concentrado para formar uma solução;

d) se misturar a referida solução do passo c) com nitrito de sódio aquoso e se manter a mistura resultante durante um pe ríodo de tempo suficiente para desaminar o grupo amino da refe rida l-amino-7-substituída-8-oxoguanosina; e

e) se isolar o produto 7-suhstituída-8-oxoguanosina resul tante;

ou a') se reagir 8-tioxoguanosina com um agente de alquilaçâo que possui a estrutura Br-Cl·^- CR=CH₂ na qual R é hidrogénio, alquilo inferior ou benzilo, para formar um produto 8-tio xoguanosina cujo átomo de enxofre na posição 8 está substituído por um grupo -CH^-CR^Cl·^;

b’) se aquecer o referido produto a uma temperatura de cerca de 50° a cerca de 200°C para formar um produto 7-substituída-8-tioxoguanosina, cujo 7-substituinte tem a estrutura -CH₂CR=CH₂;

e c’) se isolar o referido produto 7-substituída-8-tioxogua nosina, ou a'') se reagir o produto isolado no passo c') com um agen te de S-alquilação para formar um produto S-alquilado;

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-3b’’) se isolar o referido produto S-alquilado;

c’’) se reagir o referido produto S-alquilado isolado com seleneto de sódio para formar um produto 7-substituída-8-selenoxoguanosina; e d’’) se isolar o referido produto do passo c'’);

ou a’’’) se reagir o produto isolado do passo b’’) com cianamida e com hidreto de sódio para formar um produto 7-substi tuída-8-cianiminoguanosina; e b’’’) se,isolar o referido produto do passo a’¹’);

ou a' ¹’’ ) se reagir qualquer dos produtos isolados nos passo e), c’)» d’’) oub¹) comum composto alquilidenodioxilo inferior, com um composto acilo inferior ou benzoilo para formar

3 4 um produto no qual R , R e R sSo como acima definidos; e b’’’’) se isolar o produto do passo a’’’’).

Estes derivados de guanosina-nucleósido 7,8-dissubstituídos sSo agentes melhoradores da resposta imunitária muito potentes, em células humanas e animais.

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SCRF 124.OA •r»;

-4MEHÓRIA DESCRITIVA

Campo da invençSo

O presente invento refere-se ao processo de preparaçSo de compostos que aumentam a imuno-resposta, (imuno-estimulantes), e mais particularmente, ao processo de preparação de derivados de guanina-nucleósido que estSo substituídos nas posições 7 e 8 do anel de guanina, bem como ao processo de preparaçSo de com posições contendo esses derivados e a métodos que os utilizam.

Antecedentes da invençSo

Um imuno-sistema de um animal compreende numerosos elemen tos que actuam separadamente e/ou em conjunto, para contractuar, para eliminar, ou para neutralizar substâncias que sSo reconhecidas, por esse sistemas, como estranhas ao animal hospedeiro. Geralmente, mas nSo necessáriamente, a substância reconhecida pelo sistema imunológico como estranha tem uma origem que é exógena ao hospedeiro. Exemplo destas substâncias exógenas sSo as bactérias infecciosas e os subprodutos da sua actividade celular, as partículas de vírus e as suas proteínas, as proteínas injectadas por picadas de insectos, etc.. Em doenças auto-imunes, tal como a artrite reumatóide, o imuno-sistema do hospedeiro reconhece as proteínas produzidas no hospedeiro ou as proteínas auto-produzidas, como estranhas.

Os protagonistas principais do sistema imunológico sSo os leucócitos, que incluem os linfocitos de origem tímica (células T), os linfocitos produzidos na medula óssea (células B), os neutrófilos que inter alia, produzem enzimas que fabricam agen tes oxidantes tais como peróxido de hidrogénio que tem efeitos citotóxicos nas bactérias, e os macrofagos que apresentam a su bstância estranha, ou o antigénio, às células T e que produzem também uma proteína designada por interleucina-1 que assiste a transformaçSo das células T em células T auxiliares. 0 comple mento que é uma mistura complexa de proteínas que actua de uma forma ordenada e em cascata na substância estranha, desempenha

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-5também um papel importante nas imuno-respostas.

A células B podem distinguir-se das células T, inter alia, pela presença de imunoglobulinas nas superfícies da membrana.

As imunoglobulinas ligadas à membrana funcionam como receptores de antigénio; as imunoglobulinas segregadas funcionam como anticorpos .

Existem cinco classes conhecidas de imunoglobulinas, iden tificadas por IgA, IgD, IgE, IgG e IgM com base em cinco proteínas de cadeia pesada antigenicamente diferentes que constituem parte da molécula de imunoglobulina. As células B compre endem também marcadores de célula que não são imunoglobulinas, incluindo um receptor de complemento (CR), um receptor para a porçSo Fc da imunoglobulina (FcR), antigénios associados à região I (la) e um conjunto de antigénios de diferenciação (Lyb

1-7) que são identificados por todos os anti-soros e que estão correlacionados com vários aspectos da maturação e da activação das células B. Estes marcadores sSo úteis na identificação fenotípica das células B.

Enquanto que as imunoglobulinas das células B interactuam com a substância estranha ou como antigénio, cre-se que as células T, e em particular, as células T auxiliares, são necessá rias para estimular a divisão e a diferenciação das células B em células produtoras de anticorpos para a imunidade humoral.

As células T supressoras contribuem para a regulação da imunidade humoral enquanto que as células T citotóxicas e os mediadores de células T de hipersensibilidade do tipo retardado, são os principais intervenientes da imunidade mediada por células .

As células T compreendem antigénios designados por Lyt 1,

2, e 3 bem como por L3T4, que estão relacionados com as funções das células T. Os precursores de células T auxiliares são do fenotipo Lyt 1⁺, 2”, 3 e L3T4⁺. São estas células que participam normalmente na activação e na regulação das células B

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-6É conhecido que as células T auxiliares auxiliam a activação e a diferenciação das células B que segregam imunoglobu lina, após as células B receberem uma primeira mensagem do agente antigénico activante. Contudo, actualmente, não se com preende inteiramente o modo pelo qual as células T fornecem a segunda mensagem de activação e diferenciação às células B.

monofosfato de guanosina-3¹> 5'-cíclica (cGMP) tem sido implicado como o agente natural que constitui a segunda mensagem requerida para a proliferação das células B. Tem-se verificado que o monofosfato de 9-bromoguanosina-3', 5'-cíclica (8-BrcGMP) é um mitogéno de linfocito intracelular sintético fraco.

A imuno-resposta pode ser modificada artificialmente por supressão (imuno-supressão) ou por aumento (imuno-potenciação ou imuno-estimulação). A imuno-supressâo; i.e., uma menor res posta induzida artificialmente, pode ser conseguida por seis métodos gerais: (l) bloqueio por antigénio, (2) administração de anti-soros ou de anticorpos, (3) uso de outros reagentes biológicos tais como anti-soros anti-linfocitos, (4) uso de drogas ou hormonas, (5) radiação e, (6) remoção cirúrgica do tecido linfóide. A imuno-potenciação pode incluir a administração de um agente que provoque um aumento na velocidade à qual a imuno-resposta se desenvolve, um aumento na intensidade ou no nível da resposta, uma prolongação da resposta, ou o desenvolvimento de uma resposta a uma substância que, de outro modo, seria não-imunogénica.

Os agentes que se conhecem e que aumentam as imuno-respostas são geralmente designadas por adjuvantes e podem ser colocados nas duas classes gerais: (l) os que conferem uma po tenciação geral; i.e., as substâncias que aumentam as imuno-respostas celular e/ou humoral para uma grande variedade de antigénios, e (2) os que conferem uma imuno-potencação especí. fica, i.e., substâncias que aumentam as respostas específicas apenas em relação a certos antigénios.

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-7As substâncias que podem actuar como adjuvantes da classe 1 podem ser agrupadas nas categorias seguintes: (1) emulsões de água e óleo, p.e. adjuvante de Freund, (2) polinucleótidos sintéticos, (3) hormonas, drogas e nucleótidos cíclicos, (4) endotoxinas, (5) linfoquinas e monoquinas proteínaceas, p.e., interleucinas.

Um estado imuno-potenciado pode ser ilustrado pela condi, ção do organismo após a vacinação. Aqui, a imuno-resposta es. tá já aumentada devido a uma resposta antigénica, mas pode ser ainda benéficamente aumentada para se obter um melhor grau e/ou duração da imunidade.

A imuno-potenciação pode ocorrer em animais que exibem uma imuno-resposta normal, hem como em animais que exibem uma imuno-resposta comprometida. Na última situação, a imuno-potenciação é relativa ao estado imuno-comprometido do animal hospedeiro, e, em vez de aumentar a resposta até níveis super normais, procura-se um grau protector de imunidade (i.e., pro. ximo dos níveis normais) e designa-se por imuno-reconstituição. As referencias que aqui depois se farão a imuno-aumentos devem ser entendidas como incluindo a imuno-reconstituição.

Em algumas doenças e condições fisiológicas tais como a SIDA, as agamaglobulinemias ligadas a X, a senescância e a imuno-supressão induzida por drogas, a activação e diferencia ção de células B dependente de antigénio, não existe e/ou existe apenas a um nível reduzido, diminuindo deste modo a imu-resposta humoral do hospedeiro. Estas doenças e condições são representativas de estados imuno-suprimidos. Aqui, a acti. vação e a diferenciação aumentadas, se se puderem efectuar, tendem a diminuir beneficamente a manifestação da doença e/ou a melhorar a condição do paciente.

A patente dos E.U.A co-atribuida n- 4539205 de Goodman e Víeigle descreve a modulação de respostas celulares animais com derivados 8-suhstituidos de guanina ligados 9-1' a uma aldose com 5 ou 6 átomos de carbono na cadeia aldose (anel). As mo69 188 SGRP 124.OA

-8dulações celulares que se descrevem nessa patente referem-se principalmente à imuno-modulaçSo, tal como a adjuvanticidade, no aumento das imuno-respostas primárias e secundárias. A actividade contra certas condições neoplásticas é também refe rida, bem como a actividade de substituição das células T, uma actividade do tipo IL-1 (testada em timocitos) e a indução da libertação de enzimas lipossómicas de neutrófilos. Os substi tuintes, na posição 8 dessas moléculas, tem efeitos indutivos de atractores de electrões em relação ao hidrogénio. Assim, os substituintes, halo, mercapto ou o seu tautómero tioxo, mer capto de acilo, sulfureto de alquilo, nitro, ciano, ceto, halometilo e alquilmetilenoxilo, etc, foram referidos como úteis, enquanto que’ se verificou que os substituintes doadores de elec troes, tais como o grupo amino, eram inactivos.

Adicionalmente, a patente dos E.U.A. co-atribuida n² 4643992 e o seu pedido de patente Europeia, publicado, n² 83306791.1, correspondente, descreve ainda o uso de derivados de 8-hidroxiguanosina (8-oxoguanosina), 7-metil-8-oxoguanosina e 7-metil-8-tioxoguanosina na modulação das respostas celulares animais. Outro.s resultados usando derivados da guanina que se descrevem na patente dos E.U.A. n² 4539205 são também descritos na patente dos E.U.A. n² 4643992, tal como os resultados similares usando derivados de guanina que se descrevem pe. la primeira vez nessa patente.

Tem sido também publicados vários artigos e capítulos de livros por alguns dos presentes inventores e pelos seus colaboradores referentes ainda a outros efeitos dos compostos que se descrevem e reivindicam na patente dos E.U.A. n² 4 643 992. Exemplos destes artigos publicados são Goodman, Proc. Soc. Exp. Biol. I-ied., 179:479 (1985); Goodman, J . Immunol., 136: 3335 (1986); Goodman e Weigle em Eurine Metabolism In Man, Part B, Nyhan e Thompson, eds., Plenum Press, New York, pág. 451 e 443 (1986); Goodman e Weigle, J. Immunol., 155:3284 (1985); Goodman e Wolfert, Immunol. Res., 5.:71 (1986); Goodman, J. Immunol.,

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-9157:5755 (1986); e Goodman e Hennen, Cell. Immunol., 102;595 (1986).

Breve sumário da invençSo

Os guanina-nucleósidos 7,8-dissubstituídos (derivados de guanosina) são utilizados para aumentar uma imuno-resposta em células humanas e animais. Um guanina-nucleósido dissubstituí. do útil tem uma estrutura que corresponde à fórmula:

onde

X é 0, S, Se ou NCN; é um radical hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, que tem um comprimento superior ao de um grupo etilo (mais do que dois átomos de carbono) e inferior ao de um grupo decilo (menos do que dez átomos

3 de carbono); R e R sSo radicais iguais ou diferentes seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia curta, alcanoiloxilo de cadeia curta e ben2 5 zoxilo, ou R e R formam juntos um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta; e R^ é seleccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo e benzoilo de cadeia curta. Os derivados de guanosina preferidos do presente invento sSo aqueles onde X é 0 ou S e onde R^ tem um comprimento superior ao do etilo e inferior ao do hexilo. Derivados da guanosina particularmente preferidos sSo a 7-alil-8-tioxoguanosina, 7-alil-8-oxoguanosina, 7-butil-8-oxoguanosina, 7-(2-butenil)-8-oxoguanosina, 7-benzil-8-oxoguanosina e 7-propil-8-oxoguanosina. A

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-107-alil-8-oxoguanosina é a mais preferida. São também contemplados os sais de adição de base dos compostos com a fórmula I, farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos.

É também contemplada no presente invento uma composição que aumente a imuno-resposta que contenha uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável, conjun tamente com uma quantidade eficaz imuno-potenciante (ou imuno-estimulante) de um derivado de guanina-nucleósido dissubstituído, anteriormente referido, como ingrediente activo.

É também contemplado um processo para aumentar uma imuno-resposta, e particularmente, uma imuno-resposta específica de antigénio. Aqui os leucócitos são postos em contacto, num meio aquoso, com uma composição contendo uma quantidade imuno-estimulante de um derivado de guanina-nucleósido anteriormente referido. Mantem-se o contacto entre a composição e os leucócitos por um período de tempo suficiente para que as células em contacto manifestem um aumento da sua imuno resposta. Este mé todo pode ser praticado in vivo ou in vitro para culturas de células. Os leucócitos postos em contacto são preferivelmente linfócitos B.

presente invento refere-se também a um processo de preparação de uma 8-oxo, 8-tioxo, ou 8-selenoxo purina substituída na posição 7 com um grupo alilo ou com um grupo alilo substituído com hidrocarbilo. De acordo com este processo, utiliza-se um material de partida de purina, substituída na sua posição 8 com um grupo -X-CH^-CR^H^, onde XéS, OouSeeRé hidrogénio, alquilo de cadeia curta, ou benzilo de cadeia curta, e substituída na sua posição 9 com um grupo bloqueante. Aquece-se o material de partida de purina 8-substituída a uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 200°C, preferivelmente, num meio líquido diluente, inerte. Mantem-se a temperatu ra por um período de tempo suficiente (durante cerca de uma hora a cerca de duas semanas) para que, a partir do material de partida de purina, se forme um produto de purina substitui

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-lida (i) na posição 8 com o grupo = X, onde X no produto é o mes mo X presente no material de partida, e (ii) na posição 7 com um grupo -CH^-CI^CKL·,. A reacção pode também ser catalisada pe la inclusão de uma quantidade catalítica de PdC^ no meio líquido. Preferivelmente, o produto é isolado. Também preferivelmente, a purina é um nucleósido ligado 9-1' a uma ribose ou a uma desoxinibose e o produto de purina é um derivado de guanosina, adenosina ou inosina. Muito preferivelmente, esse nucleósido de purina é um derivado de guanosina tal como aqui anteriormente se referiu.

Breve descrição dos desenhos

...... I ¹

Nos desenhos que fazem parte da presente descrição:

A Figura 1 é um gráfico que ilustra a actividade de substituição de células T de uma composição aquosa contendo 7-alil-8-oxoguanosina (7a8oGuo) usado para o contacto com culturas de células B de ratinho CBA/CaJ desprovidas de células T, mas que continham glóbulos vermelhos de ovino (SRBC) como antigénio específico. Os pontos da linha a cheio ilustram a formação de placas na presença de quantidades incrementais de 7a8oGuo com uma quantidade constante de SRBC presente na cultura. A linha a tracejado representa os resultados na ausência de SRBC.

A ordenada está em unidades de células de formação de placas (PFC) anti-SRBC directa, vezes 10 por cultura. A abcissa e.s tá em unidades de concentração (molaridade, M) de 7a8oGuo presente na composição de contacto. Apresentar-se-ão aqui depois outros pormenores.

A Figura 2 é um gráfico que ilustra a reconstituição in vitro da imuno-resposta humoral primária a um antigénio específico, SRBC, em células de baço de ratinho CBA/N imuno-deficiente (linha a ponteado) cultivadas, obtida pondo em contacto essas células com uma composição aquosa contendo 7a8oGuo na presença adicional de SRBC. Kostra-se também no gráfico, para comparação, um estudo similar usando células de baço de ratinhos CBA/CaJ imuno-competentes (linha a cheio). Os pontos em

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-12cada linha representam o valor de PFC ohtido na presença da quantidade indicada de 7a8oGuo mais SRBC. A ordenada e a abcissa são as mesmas que na Figura 1. Apresentar-se-ão aqui depois mais pormenores sobre este estudo.

Na Figura 3 mostra-se um gráfico de barras que ilustra a reconstituição in vitro da imuno-resposta humoral primária ao SRBC em células do baço de ratinho CBA/CaJ (156 semanas de ida de) senescentes imuno-deficientes quando comparada com a de cê. lulas do baço de ratinhos CBA/Caj (8 semanas de idade) imuno-competentes, obtida pondo em contacto essas células com uma composição aquosa contendo 7a8oGuo. A esquerda indica-se a idade, em semanas, dos ratinhos a partir dos quais se obtiveram as células, a presença (+) ou a ausência (-) de SRBC, e a ausência (-) ou a concentração micromolar (^m) de 7a8oGuo.

Os comprimentos das barras têm as mesmas unidades que as ordenadas das Figuras 1 e 2. Apresentar-se-ão aqui depois mais pormenores sobre este estudo.

A Figura 4 é um gráfico contendo um certo número de repre sentações que ilustram a cinética in vivo das respostas de anticorpos anti-albumina de soro hovino-tri-nitrofenilo (TNP-BSA) melhoradas, induzidas pelo contacto de leucócitos in vivo com uma composição contendo 7-alil-8-mercaptoguanosina (7a8MGuo) Aqui, o derivado de guanosina (0,2 ml de 7a8MGuo com uma concentração de 5 mg/ml) estava num veículo de 100 por cento de óleo de sésamo (linha a cheio) ou de 2 por cento de óleo de s£ samo em solução salina (linha a ponteado), quando foi introduzido no animal.

Utilizaram-se três grupos de ratinhos CBA/Caj. Cada grupo foi imunizado com o conjugado TNF-BSA. Um grupo recebeu o derivado de guanosina-óleo de sésamo a 100 por cento, um segun do grupo recebeu o derivado de guanosina-óleo de sésamo a 2 por cento e o terceiro grupo (linha a tracejado) não recebeu derivado de guanosina e foi utilizado como controlo.

Os títulos de anticorpos para o TNP-BSA foram determinados

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-13durante um período de 37 dias utilizando um ensaio de imuno-sorbente ligado a enzima convencional (ELISA) com TNP-3SA como antigénio. Os resultados apresentam-se como a razão do título obtido, usando qualquer das composições contendo guanina, em relação ao título de controlo. Assim, 37 dias após a imunização, os animais que receberam a 7a8MGuo com o veículo de 100 por cento de óleo de sésamo exibiram cerca de 5 vezes o titulo dos animais de controlo, enquanto que os animais que re ceberam 7a8MGuo com o veículo de 2 por cento de óleo de sésamo exibiram cerca de 4 vezes o título dos animais de controlo. Discutir-se-ão aqui depois mais pormenores sobre estes estudos.

A Figura 5 é um gráfico que mostra a relação em função da estrutura, entre o comprimento de um substituinte na posição 7 de uma 7-hidrocarbil-substituída-8-oxoguanosina e a resposta de PFC, específica do antigénio, de linfócitos murinos em relação ao SRBC, in vitro. Os valores de PFC são os da Tabela _5 com uma concentração de derivado de guanosina de 1x10 molar (l»l). Os pontos obtidos são para a 7m8oGuo, e para os derivados de 7-etilo (23643), 7-alilo (21757), 7-propilo (24069),

7-butilo (23644), 7-(2-butenilo) (23679) e 7-hexilo (23924). Para obter os valores da ordenada dividiu-se cada valor de PFC anti-SRBC directo/cultura, menos o valor de controlo, pelas mi cromoles de derivado de guanosina presentes nas culturas de 1 ml ^M)/(1O litro)_7· As coordenadas em abcissa correspondem ao n⁹ de átomos de carbono presentes na cadeia linear de átomos de carbono, mais comprida, do substituinte 7. Consi derou-se a cadeia alilo ligeiramente mais comprida do que a do propilo e considerou-se o 2-butenilo ligeiramente mais comprido do que o butilo. Apresentam-se aqui depois outros pormenores em relação a este gráfico.

A Figura 6 é outro gráfico similar ao da Figura 5. Os pon tos deste gráfico foram obtidos, durante um certo período de tempo, a partir de vários estudos usando linfócitos murinos de vários animais. Representa-se a média dos picos de PFC anti69 188

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-14-SR3C directo - os valores de controlo, em função do número de átomos de carbono presentes na cadeia linear de átomos de carbono, mais comprida, do substituinte 7. Os valores de pico fo ram obtidos subtraindo primeiro o valor de PFC de controlo/cul tura a cada valor obtido com diferentes concentrações de derivado de guanosina, para obter um valor de PFC líquido. Cada valor de PFC líquido assim obtido foi depois dividido pelas mi cromoles de guanosina presentes no estado que produziram o valor líquido, para obter um valor de PFC de pico por micromole. Os valores de PFC de pico assim obtidos para cada derivado de guanosina a partir de estudos, utilizando o derivado particular, foram depois ponderados. Esses valores médios são apresentados no gráfico.

Os números com cinco digitos aqui utilizados para identi ficar os derivados de guanosina são também usados nesta figura e são os mesmos da Figura 5. Adicionalmente, apresentam-se também na Figura 6, valores para a 7-benzilo (24234), 7-cinamilo (22827) e 7-decilo (23894) 8-oxoguanosinas.

As coordenadas em abcissa para os derivados de guanosina que também aparecem na Figura 5 sSo repetidas nesta figura. Adicionalmente, ao derivado de 7-benzilo foi atribuída uma coordenada em abcissa ligeiramente inferior à do pentilo e ao d_e rivado de 7-cinamilo foi atribuída uma coordenada em abcissa ligeiramente inferior à do heptilo. Apresentam-se aqui depois mais pormenores em relaçSo a esta figura.

presente invento tem vários benefícios e vantagens.

Um dos benefícios importantes do presente invento consiste no facto dos seus compostos serem geralmente mais eficazes,

i.e., têm uma resposta similar com uma dose pequena ou têm uma maior resposta com uma dada dose, do cue os imuno-estimulantes de guanosina anteriormente conhecidos.

Uma vantagem da invenção consiste no facto de o uso de uma das suas composições poder fornecer a segunda mensagem necessária para a activação e diferenciação de linfócitos B em respos69 188

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-15ta a uma primeira mensagem (antigénica).

Um outro benefício da invenção consiste no facto de a imuno-resposta melhorada se poder efectuar, tanto na presença como na ausência, de actividade de células T auxiliares. Assim nota-se uma imuno-resposta melhorada, tanto em sistemas dependentes de células T, como em sistemas independentes de células T.

Outra vantagem do presente invento consiste em se poderem melhorar e atenuar, pelo uso da presente invenção, condições imuno-suprimidas e imuno-deficientes e manifestações de doença particulares. Ainda outros benefícios e vantagens da invenção serão evi dentes para os peritos na arte a partir da discussão que se s.e gue.

As descrições antropomórficas, tais como o envio e a recejs ção de mensagens, por e para químicos e células, são aqui utilizadas para propositos descritivos como auxílio para a compreensão dos fenómenos utilizados.

Descrição detalhada da invenção

I. Introdução presente invento contempla um agente melhorador da imuno-resposta (imuno-estimulante) que estimula o imuno-sistema do mamífero hospedeiro ao qual é administrado, bem como estimu la os leucócitos em cultura de células. A imuno-estimulação particularmente contemplada é predominantemente específica do antigénio, para o antigénio imunizante.

Ao estudar os efeitos de alguns derivados de guanosina mitogénicos já anteriormente descritos, p.e., monofosfato de guanosina 3¹,5'-cíclica e o seu derivado de 8-bromo, verificou-se que uma nova classe de derivados de guanina-nucleósido de baixo peso molecular, quando presentes numa quantidade efi caz como ingredientes activos de uma composição contendo uma

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SCRE 124.OA /7

-16quantidade diluente de um transportador fisiologicamente aceitável, possuiam efeitos notáveis na modulação das respostas de células de mamíferos. 0 aumento das imuno-respostas humorais específicas de antigénio, que resultaram numa adjuvanticidade patente, em actividade do tipo factor de substituição de cêlu las T, actividade de células T auxiliares, secreção de linfoquina derivada de células T, actividade citotéxica de células T e em actividade de imuno-reconstituição, são exemplos parti culares de respostas celulares que se verificou serem moduladas. Esses compostos e os seus métodos de utilização estão descritos nas patentes dos E.U.A. n² 4 539 205 e 4 643 992.

Verificou-se que os compostos do presente invento eram surpreendentemente mais activos do que os compostos das duas patentes anteriores. Esta constatação da maior actividade foi surpreendente por um certo número de razões.

composto mais activo que se descreve nas patentes dos E.U.A. anteriormente referidas era a 7-metil-8-oxoguanosina (7m8oGuo), tanto como mitogénio de leucócitos como adjuvante específico de antigénio. Tal como será aqui depois discutido a mitogenicidade e a adjuvanticidade são fenómenos que não estão necessariamente relacionados.

Em face dos resultados subsequentemente obtidos, foi sur preendente que a 7m8oGuo exibisse uma actividade melhorada em relação a compostos tais como a 8-hidroxiguanosina (designada como o seu tautómero, 8-oxo guano sina; SoGuo), ou a 8-mercapto. guanosina (designada por SMGuo, ou como o seu tautómero 8-tio. xogunosina). Mais especificamente, resultados posteriores, alguns dos quais são aqui depois apresentados como exemplo, re velaram que a actividade (tanto a mitogenicidade como a adjuvanticidade) de uma série de guanosinas substituídas na posição 8 diminuía com o aumento da dimensão do grupo substituinte na posição 8.

Assim, uma vez que o grupo metilo da 7m8oGuo está ligado, no anel de guanosina, numa posição adjacente à posição 8 onde

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-17se verificou um efeito da dimensão do substituinte, esperava-se que a adição desse grupo, ou de qualquer grupo na posição 7 onde previamente não existia qualquer substituinte, provocasse também uma diminuição na actividade, meramente em virtu de de a molécula em questão ser maior numa posição adjacente em relação à posição do anel sensível ao tamanho. A maior adjuvanticidade dos compostos do presente invento, com substituintes ainda maiores na posição 7 no anel de guanosina, em relação ao 7m8oGuo foi ainda mais inesperada e surpreendente.

II. Os Compostos

Os compostos imuno-estimulantes aqui contemplados são de rivados de guanina-nucleósido 7,8-dissubstituídos (também aqui designados por guanosinas ou por derivados de guanosina).

Estes compostos tem estruturas que correspondem à fórmula I que a seguir se apresenta:

onde X é 0, S, Se ou NCN;

r! é um radical hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, com um comprimento superior ao de um grupo eti lo e inferior ao de um grupo decilo;

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R e R são radicais iguais ou diferentes seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia curta, alcanoiloxilo de cadeia curta, e benzoxilo,

3 ou R e R formam juntos um radical alquilenodioxilo de cadeia

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-18curta;

R^ é um radical seleccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo de cadeia curta e benzoilo.

É de notar que o grupo ribosilo na fórmula anterior preten de ser mostrado ligado na posição 1 desse anel, com a ligação na configuração-beta. Adicionalmente, deve entender-se que se pretende a forma D do grupo ribosilo.

Os derivados de guanosina preferidos são aqueles onde X é 0 ou S, r! tem um comprimento superior ao do etilo e inferi2^3 or ao do hexilo, e R e R são hidroxilo ou acetoxilo. Na prá tica particulármente preferida, X é 0, R^ é seleccionado entre o grupo consistindo de propilo, alilo, butilo, 2-butenilo e benzilo, R^Z e R² são hidroxilo, e R^ é hidrogénio. Muito pre ferivelmente, X é 0, R^ é alilo, R^ e são hidroxilo e R^ é hidrogénio.

Como anteriormente se referiu, um radical R^ tem um comprimento superior ao de um grupo etilo. Um radical R^ tem tam bém um comprimento que é inferior ao de um grupo decilo. Isto equivale a dizer que R^ é um radical hidrocarbilo com um comprimento superior ao de uma cadeia de dois átomos de carbono saturada e inferior ao de uma cadeia de dez átomos de carbono saturada; cada comprimento incluindo os átomos de hidrogénio apropriados. Deve entender-se que um radical hidrocarbilo de signado simplesmente por propilo, butilo, hexilo, decilo ou similares, é um radical normal de cadeia linear. Os radicais de cadeia ramificada são indicados pelos prefixos numéricos ou abreviados usualmente usados, tais como 2-propilo ou iso-propi. lo, respectivamente.

Os comprimentos das cadeias dos radicais hidrocarbilo são medidos ao longo da cadeia de carbono linear mais comprida na molécula. Estes comprimentos podem ser facilmente determinados utilizando ângulos de ligação, comprimentos de ligação e raios atómicos publicados, conforme necessário para desenhar

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-19e medir tuna cadeia alternada, ou construindo modelos usando peças comercialmente disponíveis cujos ângulos de ligação, com primentos de ligaçSo e raios atómicos estão de acordo com os valores aceites publicados. Os comprimentos dos radicais podem também ser determinados de uma forma um pouco menos exacta assumindo que as ligações nSo saturadas tem o mesmo compri mento que as ligações saturadas e que os ângulos de ligaçSo para as ligações não saturadas sSo os mesmos que para as liga çÕes saturadas, ainda que se prefiram os métodos de determina çSo anteriormente referidos. Os comprimentos s£o determinados como sendo o comprimento mais longo do radical.

R^ é um radical hidrocarbilo com um comprimento particular. Sendo um radical hidrocarbilo, os grupos contem apenas átomos de carbono e de hidrogénio.

Os hidrocarbonetos e os radicais hidrocarbilo podem ser genericamente divididos em radicais alifáticos e aromáticos.

Os radicais alifáticos incluem (i) alcano saturado (radicais alquilo) e (ii) alcenos e alcinos mono- e poli-insaturados (radicais alcenilo e alcinilo), respectivamente. Os radicais cíclicos, de cadeia linear e ramificada, existem para cada ti po de radical aiifático. Os radicais ρΛ aromáticos incluem um anel aromático de benzeno ou de naftaleno. Os radicais aralcano aralceno e aralcino que contem um anel aromático ligado a um grupo aiifático sSo também contemplados, tal como o sSo os derivados de benzeno e de naftaleno substituídos com alqui lo. Descrevem-se depois exemplos de radicais R¹.

Como já se referiu, os radicais tem um comprimento su perior ao de um grupo etilo e um comprimento inferior ao de um grupo decilo. Os radicais alquilo desse grupo podem desse modo ser designados por radicais alquilo C--Cg. Os radicais alquilo C^-Cg incluem vários membros da classe aqui depois designada por radicais alquilo de cadeia curta que sSo também úteis

3 4 como partes dos radicais R , R e R , tal como aqui depois se discute. Assim é apropriado discutir nesta altura os radicais

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-20alquilo de cadeia curta.

Os grupos e radicais aqui designados por de cadeia curta contêm de 1 a cerca de 6 átomos de carbono. Esta definição apli ca-se ao uso da expressão de cadeia curta tal como é utiliza12 3 4 2 3 4 da em todos os grupos R , R , R e R . Rara R , R e R prefere-se usar um radical de cadeia curta que contem 1-3 átomos de carbono.

Os radicais alquilo de cadeia curta incluem tanto os grupos de cadeia linear como os grupos de cadeia ramificada, tais como, por exemplo, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-buti lo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, 3-metil-2-butilo, 1-metil butilo, 2-metilbutilo, neo-pentilo, n-hexilo, 1-metilpentilo,

3-metilpentilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 2-hexilo, 3-hexilo e similares. 0 grupo de radicais alquilo C^-Cg de R^ exclui os radicais metilo e etilo do grupo dos radicais alquilo de ca deia curta, e inclui os radicais heptilo, octilo e nonilo, bem como outros radicais de cadeia ramificada, tal como o radical

2-metil-heptilo, que são radicais alquilo substituídos com alquilo. Os radicais R^ mais preferidos têm um comprimento superior ao do etilo e inferior ao do hexilo, e têm uma cadeia linear; os radicais alquilo de cadeia curta mais preferidos pa ra R^ incluem propilo, butilo e pentilo.

Os radicais alifáticos cíclicos são também contemplados, e podem ser incluídos no grupo dos radicais alquilo, bem como no grupo dos radicais não saturados alcenilo e alcinilo. Estes radicais incluem os radicais ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo. São também incluidos neste grupo os radicais não saturados tais como 2-ciclopentilo, 2-ciclo-hexenilo, 3-ciclo-heptenilo e similares.

Os radicais alifáticos cíclicos contemplados incluem ainda radicais com um ou mais substituintes alquilo de cadeia cur ta ligados a um anel, onde o anel está ligado directamente à posição 7 de um anel de guanina, bem como os radicais com um

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-21radical alquileno, alcenileno ou alcinileno ligado entre o áto mo de azoto na posição 7 e a estrutura de anel cíclica. Exemplos de radicais do primeiro grupo de radicais cíclicos incluem

2-metilciclopentilo, 3-etilciclo hexilo e 4-iso-propilciclo-hep tilo. Exemplos de radicais do último grupo de radicais cíclicos incluem 2-(ciclopentil)etilo, 2-(ciclo-hexil)butilo e simi lares.

Os radicais não saturados constituem ainda outro grupo de radicais alifáticos. Exemplos de compostos mono-insaturados incluem 3-butenilo, 2-metil-3-pentenilo, 3-hexinilo e similares. Os radicais cíclicos que contem também uma ou mais liga ções insaturadas mas que são aromáticos, são considerados radicais cíclicos, tal como anteriormente. Os radicais poli-insaturados incluem butadienilo, 2-metil-2,4-pentadienilo e similares.

Os radicais beta-alcenilo C^-Cg sSo um grupo particularmente preferido de radicais hidrocarbilo não saturados. Os ra dicais beta-alcenilo C^-Cg contem uma ligação dupla etilénica na posição beta em relação ao átomo de azoto na posição 7 da guanosina. Exemplos de radicais incluem, alilo (2-propenilo),

2-butenilo, 2-pentenilo, 3-metil-2-pentenilo e similares.

Os radicais aromáticos constituem outro grupo de radicais hidrocarbilo r\ Exemplos de radicais aromáticos incluem os radicais fenilo e naftilo. Os radicais aromáticos substituídos com alquilo tais como os radicais 3- ou 4-metilfenilo, 3- ou

4-isopropilfenilo, 3-etilnaftilo, 5-metilnaftilo e similares, são também contemplados.

Os radicais aralquilo são ainda outros radicais R^3- contem piados. Os radicais benzilo, feniletilo e 3-fenilbutilo são exemplos deste grupo. 0 benzilo é um radical R³' particularmente preferido.

radical cinamilo (3-fenil-2-propenil) é um radical muito parecido, sendo um radical aralcenilo. 0 radical cinamilo

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-22pode também ser encarado como um radical alcenilo beta-substituído que é mais comprido do que um radical beta-alcenilo mas, para o seu comprimento, e surpreendentemente activo como adjuvante.

3

Os radicais R e R podem ser iguais ou diferentes, e são seleccionados entre o grupo consistindo de hidrogénio, hidroxi lo, alcoxilo de cadeia curta, alcanoiloxilo de cadeia curta e henzoxilo. R e R podem também formar juntos um radical 2’,

3¹-alquilidenodioxilo cíclico de cadeia curta. Discutem-se 2 3 depois exemplos de radicais R e R .

Os radicais alcoxilo de cadeia curta são radicais alquilo de cadeia curta ligados ao anel de açúcar da guanina através de um átomo de oxigénio. Exemplos de radicais alcoxilo de cadeia curta incluem metoxilo, etoxilo, iso-propoxilo, butoxilo, hexiloxilo e similares. Os radicais alcanoiloxilo de cadeia curta são ésteres formados entre um grupo hidroxilo do anel de açúcar da guanina e um ácido alquilcarboxilico de cadeia curta. Exemplos de radicais alcanoiloxilo de cadeia curta incluem for moxilo, acetoxilo, propionoxilo, hexanoiloxilo e similares.

Os derivados acetal e cetal de alquilo de cadeia curta de grupos 2'- e 3'-hidroxilo são designados por alquilidenoxilo 2', 3'-cíclico de cadeia curta, ou mais simplesmente, por radicais alquilidenodioxilo de cadeia curta. Estes radicais for mam-se pela reacção de um aldeído, tal como formaldeído, acetaldeído ou similares, ou de uma cetona, tal como acetona ou metiletilcetona, com os grupos 2'- e 3'-hidroxilo de um grupo ribosilo de guanosina substituída.

3

Frefere-se que R e R sejam hidroxilo, alcanoiloxilo de cadeia curta ou benzoxilo e mais oreferivelmente hidroxilo ou acetóxilo. Quando R e R são alcanoiloxilo de cadeia curta ou benzoxilo, estes radicais podem perder-se durante ou logo após o passo de contacto com leucócitos do processo da invenção, e assim pode constituir uma forma pró-droga do deriva2 3 do de guanosina. Muito preferivelmente, R e R são hidroxilo.

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-23R^ é um radical seleccionado entre o grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo de cadeia curta e benzoilo. Muito preferivelmente R⁴ é hidrogénio. Quando R⁴ é alcanoilo de ca deia curta ou benzoilo, crê-se também que o grupo carboxilo possa ser clivado tal como anteriormente se descreve, constituindo de novo uma pró-droga”.

Uma guanosina útil está substancialmente isenta de carga iónica aos valores de pH fisiológicos; i.e., um valor de pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,5, excepto para as cargas iónicas que possam ser fornecidas pelos átomos de azoto do anel na po sição 1 relativamente ácidos. Assim, uma molécula útil está isenta de porções contendo ácido e base, que não estão presen tes na guanosina. Esta ausência de grupos ácidos e básicos estende-se do radical R⁴, por definição, e ao longo de toda a molécula de guanosina.

As guaninas são ácidos e como tal podem formar sais de adição de base. Estes sais são úteis na obtenção de estabilidade para armazenamento e não conferem uma carga iónica adi cional ao derivado de guanina usado num método da invenção, devido ao efeito de tampão obtido com os sistemas sanguíneos e linfáticos do hospedeiro, ou devido ao tampão de um meio de cultura.

São úteis no presente invento os sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, dos derivados de guanina, e podem ser preparados por tratamento do agente melho rador da imuno-resposta com uma base apropriada, num solvente adequado, tal como água, ou um álcool de alquilo de cadeia cur ta, tal como metanol ou etanol. Exemplos de bases inorgânicas incluem, hidróxido de sódio, potássio e amónio, e bases simila res. Exemplos de bases orgânicas incluem tris-(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazinoetanos sulfónico (HEPES) e bases similares. Inversamente, a forma de sal de adição de base pode ser convertida na forma de guanosina livre por tratamento com ácido.

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-24Os derivados de guanina-nucleósido substituídos úteis no presente invento são facilmente preparados de acordo com procedimentos publicados na literatura química, ou por procedimen tos análogos aos que ai se descrevem. Na secção de Materiais e Métodos apresentam-se aqui depois vários exemplos de sínteses. As sínteses de derivados de guanina-nucleósido 7,8-di-substituídas começam tipicamente com a ligação 9-1’-beta-aldoglicosido já formada, ainda que a formação inicial dessa li gação não seja necessária. Aqui depois na secção V descreve-se um novo e inesperado processo de preparação de alguns dos compostos do presente invento.

Em adição aos exemplos de sínteses que aqui depois se apresentam, descrevem-se aqui resumidamente tres processos ge rais de preparação. Estes processos são exemplos dos processos que se descrevem na literatura e são apresentados usando, como composto a ser preparado, uma 8-tioxoguanosina substituída na posição 7 com um hidrocarbilo.

Num primeiro processo faz-se reagir a 8-tioxoguanina, subs tituída na posição 7 com um hidrocarbilo, com um derivado adequado de ribose substituída com um grupo rejeitado alfa-1, tal como alfa-l-cloro (ou bromo ou acetoxi)- 2,9,5-tribenzioil-D-ribose, num solvente adequado, para formar o derivado de beta-ribosilo. Recolhem-se os produtos da reacção e separam-se por HPLC para obter o derivado de guanosina desejado.

Num segundo processo, oxida-se a 7-alil-8-tioxoguanosina (22444; Exemplo 9) para se obter o aldeído correspondente.

A 7-(2-etanol)-8-tioxoguanosina resultante é depois condensada via uma reacção de Wittig para formar uma guanosina substituída na posição 7-beta com um radical alcenilo C^-Cg (ou outro) que é separado dos outros produtos presentes para uso.

Essa guanosina não saturada pode depois ser reduzida para for mar um substitulnte saturado.

Num terceiro processo, usa-se uma reacção de fecho de anel por reacção de tiofosgénio com uma 2,5,6-triamino-4-hidroxipi-

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-25rimidina apropriadamente substituída. I-Iais especificamente faz-se reagir uma 2-amino-4-hidroxil-5-amino substituído com hidrocarbilo-6-beta-D-ribosilpirimidina com tiofosgénio, na presença de uma base extractora de ácido, para se obter um de rivado de 7-hidrocarbil-8-tioxoguanosina que pode ser separado dos outros produtos da reacção para uso.

III. As Composições

Uma composição do presente invento compreende uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável misturado com uma quantidade eficaz imuno-potenciante (melhoradora da imuno-resposta ou imuno-estimulante) de um derivado de guanina-nucleósido substituído do presente invento, tal co mo anteriormente se descreveu.

Uma composição para administração in vivo é preparada, para administração oral ou parenteral, na forma de composições de unidades de dosagem usuais. 0 termo unidade de dosa gem e os seus equivalentes gramaticais, tal como são aqui uti lizados, referem-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para pacientes humanos ou animais, cada unidade contendo uma quantidade eficaz predeterminada do ingrediente activo de guanosina, calculada para produzir o efei to terapêutico desejado, em associação com o transportador fisiologicamente tolerável necessário, p.e., um diluente ou um veículo. As especificações das novas formas de unidades de do. sagem do presente invento são ditadas por, e são directamente dependentes, (a) das características únicas do ingrediente de derivado de guanosina activo e do efeito terapêutico particular que se quer obter, e (b) das limitações inerentes na arte de preparação de compostos para uso como ingredientes activos para uso terapêutico in vitro, bem como in vivo, em humanos e em outros animais.

Exemplos de formas de unidades de dosagem adequadas de acordo com o presente invento são comprimidos, cápsulas, comprimidos, saquetas de pó, grânulos, bolachas e similares, mui69 188

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-26tiplos segregados de quaiquer das formas anteriores, bem como soluções, emulsões e suspensões líquidas. As composições líquidas podem ser administradas das formas usuais, por exemplo, subcutaneamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, peroralmente ou de modo similar.

A quantidade de ingrediente activo, que é administrada in vivo como quantidade eficaz imuno-estimulante, depende da idade e do peso do paciente, da condição particular que está a ser tratada, da frequência da administração e da via de admi nistraçâo. A gama de dose diária total pode ser de cerca de 0,01 a cerca de 200 miligrama por quilograma de peso de corpo, e, muito preferivelmente, de cerca de 1 a cerca de 15 miligramas por quilograma de peso de corpo. A dose para um humano adulto está compreendida entre cerca de 5 e cerca de 1400 mili grama por dia, administradas, quer na forma de uma única dose, quer divididas em 3 ou 4 doses. As dosagens veterinárias correspondem às dosagens humanas sendo as quantidades administradas proporcionais ao peso e à velocidade metabólica do animal em comparação com humanos adultos.

Será de notar pelos peritos na arte que as concentrações úteis in vivo podem variar de espécie animal para espécie animal. Os trabalhadores experientes sabem também que as concentrações apropriadas podem ser facilmente determinadas.

As concentrações para o contacto in vitro com células ani mais estão compreendidas entre cerca de 1x10 molar e cerca de 3x10 molar, nara concentrações de células de cerca de 10 7

-10 células por mililitro. Mais preferivelmente a concentra-5 -4 ção é de cerca de 1x10 molar até cerca de 1x10 molar. Como se irá observar na secção dos Resultados que aqui depois se apresenta, a concentração de pico; i.e., a concentração com a qual se obtem a maior adjuvanticidade, para uma dada guanosina pode variar de 10-100 vezes quando é estudada em sistemas de linfócitos murinos ou humanos.

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-27Uma composição pode ser um sólido ou um líquido. Os trans portadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na arte. Exemplos de transportadores líquidos são as soluções aquosas estéreis que não contém quaisquer materiais além do in grediente activo de derivado de guanosina e de água, ou que contém um tampão, tal como fosfato de sódio, a um valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como so lução salina tamponizada com fosfato. Os transportadores aquo. sos podem ainda conter mais do que um sal tampão, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose e outros solu tos. Exemplos dos últimos transportadores são a Injecção de Ringer, a Injecção de Dextrose, a Injecção de Dextrose e de Cloreto de SÓdio e a Injecção de Ringer lactada.

As composições líquidas podem também conter fases líquidas, adicionalmente ou com a exclusão da fase aquosa. Exemplos destas fases adicionais são a glicerina, óleos vegetais tais com óleo de semente de algodão, óleo de sésamo e emulsões de água-óleo.

Exemplos de transportadores sólidos incluem aqueles materiais normalmente usados no fabrico de comprimidos ou pastilhas e incluem, amido de milho, lactose, fosfato de di-cálcio, espessantes tal como goma de tragacanto e metilcelulose U.S.F., SiO₂ finamente dividida, polivinilpirrolidona, estearato de magnésio e similares. Adicionalmente, o transportador sólido pode incluir polímeros biodegradáveis e não biodegradáveis, transportadores de polipéptido, transportadores de afinidade tal como AFFI-Gel 601 (resina de boronato de fenilo disponível nos laboratórios BIO-RAD, Richmond, Califórnia E.U.A.), lipossomas e polímeros sintéticos, tal como é conhecido na arte.

Os antioxidantes tais como o metilparabeno e o propilparabeno podem estar presentes em ambas as composições sólidas e líquidas, bem como adocicantes tal como o açúcar de cana ou de beter raba, sacarina de sódio, ciclamato de sódio e o adocicante de éster de metilo do dipéptido ácido aspartico-fenilalanina ven69 188

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-28dido com o nome comercial de NUTRASWEET (aspartamo) por G.D. Searle Co.

IV. Método de Imuno-estimulação

No presente invento é também contemplado um processo de melhorar a imuno-resposta de leucócitos. Preferivelmente, a imuno-resposta é uma resposta específica de antigénio. De acor do com este processo, põem-se em contacto leucócitos tais como células B, células T, neutréfilos e macrofagos, separadamente ou em combinações, num meio aquoso com uma composição descrita anteriormente contendo uma quantidade eficaz imuno-estimulante de um derivado de guanina-nucleósido descrito anteriormente.

processo pode ser praticado, in vivo, em humanos, mamí feros de laboratório tais como ratinhos, ratazanas e cohaias, e em animais domésticos tais como porcos, cavalos, bovinos, caõs e gatos. 0 método pode também ser praticado in vitro em culturas de tecidos tais como em cultura de hibridomas para a produção de anticorpos monoclonais.

contacto com os leucócitos realiza-se num meio aquoso independentemente de a composição do derivado de guanosina ser ela própria ou não um sólido ou um líquido, ou de o líquido da composição ser ou não aquoso. Para o processo in vivo, o meio aquoso é constituído, pelo menos em parte, pela água do sangue ou do linfo. Para os métodos in vitro, o meio aquoso é constituído, pelo menos em parte, pelo meio de cultura usado.

contacto entre a composição e os leucócitos é mantido por um período de tempo suficiente para que as células postas em contacto manifestem a melhoria da sua imuno-resposta. Essa imuno-estimulação pode ela própria manifestar-se na proliferação células, na secreção melhorada de anticorpos, na actividade melhorada das células T auxiliares, na produção melhorada de citoquina a partir de células T e de macrofagos, na secreção de enzima a partir de neutrofilos, e em manifestações similares. Os resultados que aqui se discutem ilustram respostas

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-29mitogénicas não específicas de células de baço murino, respostas específicas de antigénio de células B murinas e de linfoci tos de sangue periférico humano desprovidos de células T supres soras, proliferação, específica de antigénio, de células T, a reconstituição in vitro da imuno-resposta primária em células B murinas imunodeficientes, a actividade de substituição de células T supressoras para uma resposta específica de antigénio em células B murinas, e um aumento in vivo, específico de antigénio, da produção de anticorpos murinos. Estas imuno-respostas melhoradas devem ser entendidas como ilustrativas do uso de um processo da invenção e não devem ser entendidas como limitativas .

Para utilização in vivo, o contacto entre os leucócitos e as concentrações óptimas da composição é tipicamente mantido por um período de tempo suficiente para que o animal elimine do seu organismo o derivado de guanosina, por metabolismo, por excreção ou por ambos os processos. Esse período de tempo pode ser maior do que o requerido para que a imuno-estimulação se manifeste. 0 contacto com uma unidade de dosagem individual é tipicamente mantido por um período de tempo de horas a cerca de uma semana ou mais, dependendo do transportador ou veículo utilizado. 0 contacto contínuo pode ser vantajoso pa ra um animal hospedeiro imunodeficiente.

contacto in vitro pode ser mantido por um período de tempo suficiente para que uma das imuno-estimulações anterior mente descritas se comece a manifestar, tal como se pode determinar por técnicas de ensaio padrão. Estes tempos de contacto demoram, tipicamente, de cerca de um a cerca de sete dias e mais usualmente de cerca que 2 a cerca de 6 dias.

V. Processo de Preparação presente invento contempla ainda um processo de preparação de derivados de 7-alil-ou 2-(alil substituído com hidrocarbilo)-,8-oxo-,8-tioxo-ou 8-selenoxo-purina cujo átomo de

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-30azoto na posição 9 está bloqueado não podendo reagir. Os derivados de purina parti cularmente contemplados são os derivados de guanosina, adenosina e inosina ou os seus análogos de desoxirribosido. A purina que mais preferivelmente se prepara é um derivado de guanosina tal como aqui se discutiu em pormenor.

Os átomos de azoto na posição 9 das purinas particularmen te contempladas estão bloqueados não podendo reagir, estando ligados a um grupo bloqueante. Muito preferivelmente, o grupo bloqueante é um radical ribosilo ou um radical desoxirribosilo, e a guanina está ligada 9,1’-beta ao radical ribosilo ou desoxirribosilo. , São também contemplados outros grupos bloqueantes incluindo outros 1-glicósidos tais como glucosilo e arabinosilo, grupos acilo tais como acetilo, benzoilo e t-butiloxicarbo nilo, e outros grupos bloqueantes removiveis e não removiveis, tais como benzilo e alquilo C^-Οθ, respectivamente. Não se crê que a identidade específica do grupo bloqueante da posição 9 seja importante desde que esse grupo não interfira com a reacção nas posições 8- e 7- da molécula de purina. Similarmente, podem estar presentes outros substituintes nas posições 1-,

2- e 6- da purina desde que não interfiram com a reacção.

De acordo com este processo utiliza-se um material de par tida de purina substituída na sua posição 8 com um grupo -X-CH^CR^^, onde XéO, SouSe, eRé hidrogénio, alquilo de cadeia curta ou benzilo. 0 material de partida de purina

8-substituída é aquecido a uma temperatura elevada de cerca de 50°C a cerca de 200°C. A temperatura elevada é mantida durante um tempo suficiente (de cerca de uma hora a cerca de duas semanas) para que o material de partida 8-substituído se rearrange e se forme um produto de purina substituída (i) na posição 8 com o grupo =X, onde ο X no produto é o mesmo X no material de partida, e (ii) na posição 7 com um grupo -CH^-CR^CH^, onde R é o mesmo R do material de partida. 0 produto derivado de purina 7,8-dissubstituído bloqueado na posição 9 é preferivelmente isolado utilizando métodos bem conhecidos.

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-31A reacção anterior realiza-se preferivelmente com o material de partida de purina dissolvido ou disperso num meio de solvente líquido que é inerte nas condições da reacção. Exemplos de solventes líquidos inertes para estes propósitos inclu em, água, dimetilformamida e dimetilsulfóxido, tal como aqui depois se descreve na secção de Materiais e Métodos.

z

E de notar que o derivado de purina de partida não neces sita ser um material isolado, purificado. Contráriamente, a sua presença pode ser circunstancialmente inferida a partir da estrutura dos reagentes precursores e do produto final, fazendo reagir uma. mistura reaccional obtida pela formação do compos to 8-oxo-, 8-tioxo- ou 8-selenoxoalilo através do passo de rearran j o.

As temperaturas úteis na reacção anterior e a duração da sua manutenção, podem variar grandemente. As temperaturas óptimas parecem ser de cerca de 100°C, quando X=0, e de cerca de 135°C quando X=S ou X=Se. 0 análogo de enxofre necessitou de um tempo de reacção mais prolongado do que qualquer dos análogos de oxigénio ou selénio.

Sem se pretender ligar demasiado à teoria, crê-se que a reacção descrita é um rearranjo que se dá através da formação de um anel intermediário de seis membros ou de um estado de transição. Pensa-se que esse anel de seis membros é formado pelos átomos de azoto na posição 7 e de carbono na posição 8 do anel de purina, pelo átomo X e pelos primeiros três átomos de carbono (delineados) do grupo com o átomo de carbono =CH2 do material de partida fechando o anel pela formação de uma ligação com o átomo de azoto na posição 7.

Num outro aspecto desta concretização da invenção, o rearranjo é catalisado usando dicloreto de paládio (PdCl^), num solvente de ponto de ebulição relativamente baixo, tal como tetra-hidrofurano (ponto de ebulição 65°C). Tal como no caso do rearranjo não catalisado, os vários grupos reactivos da gua

188

SCRF 124.OA

-32nosina, além do átomo de azoto na posição 9, tal como cada um dos grupos hidroxilo do anel de açúcar, o grupo 6-oxo (hidroxi) e o grupo 2-amino, são tipicamente bloqueados, durante o rearranjo catalisado, com grupos bloqueantes removiveis adequados, tal como grupos trimetilsililo. Este bloqueamento não é neces sário para a reacção não catalisada.

Num exemplo de rearranjo catalisado o material de partida de guanosina 9-bloqueado-8-X-CH2“CR=CH2 é misturado com uma quantidade catalítica de PdC^» com uma proporção molar de catalisador para guanosina de cerca de 1:1 a cerca de 1:10, e le va-se a mistura resultante ao refluxo, num solvente tal como tetra-hidrofurano, por um período de tempo adequado, por exemplo de cerca de 10 a cerca de 20 horas, para realizar o rearran jo. Os produtos da reacção são depois tipicamente separados e recolhidos.

Quando se utilizam durante a síntese, grupos bloqueantes removiveis, esses grupos bloqueantes são também tipicamente removidos antes da recolha do produto derivado de ϊ-ΟΙ^-ΟΗ^ΟΙί^-8-X-guanosina desejado. Quando se usam grupos trimetilsililo como grupos bloqueantes removiveis, esses grupos podem ser removidos por tratamento do produto bloqueado com um ácido tal como ácido acético.

Tal como se poderá observar a partir de um exame do Exemplo 9 que aqui depois se apresenta, obteve-se, com a reacção catalisada, um rendimento em 7a8KGuo (42,5 por cento) mais ele vado do que com a reacção não catalisada (36 por cento), o mesmo acontecendo num tempo de reacção mais curto; i.e., 16 ho ras vs. 9 dias, e a uma temperatura mais baixa; i.e., 65°G vs.

130°C. Para a reacção catalizada o rearranjo realiza-se tipicamente a uma temperatura de cerca de 50°C a cerca de 100°G, enquanto que o rearranjo não catalisado se realiza tipicamente a uma temperatura de cerca de 100°G a cerca de 200°C.

VI. Resultados

188

SCRF 124.OA

-33Obtiveram-se resultados específicos utilizando os compos. tos, composições e métodos de acordo com a invenção, e esses resultados têm sido frequentemente comparados com os resultados similares obtidos usa os compostos, composições e métodos que se descrevem na Patente dos E.U.A. n- 4 643 992. A maioria destes resultados tem sido obtida usando 7-(2-propenil)-8-oxoguanosina (também aqui designada por 7-alil-8-oxoguanosina) e 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina (também aqui designada por 7-alil-8-tioxoguanosina e por 7-alil-8-mercaptoguanosi na). Esses dois compostos são convenientemente designados por 7a8oGuo e 7a8MGuo, respectivamente, usando a mesma notação abreviada anteriormente discutida para a 7-metil-8-oxoguanosina (7m8oGuo), 8-mercaptoguanosina (8MGuo) e 8-oxoguanosina (8oGuo). Outra notação abreviada usada para um composto sobre o qual também sâo feitas comparações é 8-BrGuo para a 8-bromoguanosina.

Os resultados que aqui depois se discutem foram obtidos usando um ou mais compostos da invenção, a não ser onde se in dica ter sido de outro modo, numa composição da invenção que é usada de acordo com um método da invenção. Resumindo, e pa ra facilidade da descrição, apenas aqui serão referidos os compostos com o pressuposto de que esses compostos são utilizados em composições e em métodos da invenção.

A cada um dos novos compostos cuja actividade é aqui de_s crita ou comparada, foi também dada um número de identificação de cinco digitos. Esses números são indicados no título do Exemplo que descreve a preparação do composto. 0 número de cinco digitos e/ou o número do Exemplo, são utilizados nas ta belas e na discussão que se segue para auxiliar a identificação desses compostos.

A. Actividades das guanosinas 8-substituídas

Tal como foi anteriormente referido examinaram-se a adjuvanticidade e a mitogenicidade de uma série de guanosinas 869 188

SCRF 124.OA

t'

-34-substituídas, que não são do presente invento, com tioéteres de vários comprimentos. Nas Tabelas 1 e 2 seguintes apresentam-se os resultados desses estudos, onde, nas tabelas, as li nhas horizontais através de toda a tabela são usadas para dis tinguir estudos separados uns dos outros.

Tabela 1

Adjuvanticidade específica de antigénio

de 8-Tioéter-guanosinas4
	Concen-	RFC anti-SRBC	directo/Cultura
Composto^	tração3	CBA/CaJ	C57B1/6J
22359	IO4	123+21	-
(cinamilo;11)	3xl0-4 IO-3	157+7 653+52	2620+100 3110+350
22435	IO'4	247+38	—
(2-butenil;3)	3xlO“4 10“3	582+52 607+57	9130+1110 12 080+470
8MGuo	3xl04	527+25	11 000+140
Controlo	(sem nucleósido) (Antigénio presente)	75+10	486+70
22300	IO-4	420+105
(alilo; 9)	3x10 4 10-?	870+70 490+133	—
8MGuo	IO4 3xlO-4	813+129 782+123	-
Controlo	(Sem nucleósido) (Sem antigénio)	8+4	-
Controlo	(Sem nucleósido) (Antigénio presente)	307+61	-

188

SCRE 124.OA

-351 Mediram-se as adjuvanticidades contra glóbulos vermelhos de ovinos /SRBC_7, em células de formação de placas directa por cultura de linfócitos, das estirpes de ratinho indicadas.

Na secção de Materiais e Métodos apresentam-se pormenores des. te estudo. Os erros padrão dos valores médios enumerados são indicados pelo ”+ número”.

Os nucleósidos são identificados pelos seus números de cinco digitos. Entre parêntesis está o radical ligado ao grupo 8-tio e o número do Exemplo no qual se mostra a preparação do composto.

Concentração do nucleósido, em moles por litro, no meio aquoso no qual se deu o contacto com os linfócitos.

⁴ Usaram-se linfócitos de linhagens de ratinhos consangui neos CBA/CaJ ou C57B1/6J.

Tabela 2

Mitogenicidade de

8-Tioeterguanosinas^

Incorporação de z~ Y _7TdR

Composto^	ConcentraçãoJ	(cpm/cultura)
22359	104	1600+90
(cinamilojll)	3xlO“4 IO-5	1300+80 1700+280
22435	10“4	4500+120
(2-butenilo;3)	3xlO~4 IO-3	8800+200 11 200+202
SMGuo	IO-5	41 100+390
Controlo	(Sem nucleósido)	2100+60

188

SCRF 124.OA

-36-
22300	104	2700+130
(alilo;9)	3xl04	4100+70
	10“3	16 400+1130
SMGuo	IO3	25200+950
Controlo	(Sem nucleósido)	2400+90

*1 - *Z

Mitogenicidade medida pela incorporação de c ⁹H_7ldR (desoxirribonucleésido de timidina marcada com tritio) tal co mo é determinada por medição da contagem por minuto (cpm), por cultura de células usando as condições que se discutem na secção de Materiais e Métodos. Os erros padrão são indicados na Tabela 1.

2’³ Ver notas 2 e 3 da Tabela 1.

Os resultados anteriores ilustram que, à medida que o com primento do substituinte aumenta, a actividade do derivado de guanosina 8-substituído diminui, em relação à 8MGuo cujo átomo de enxofre na posição 8 está ligado apenas a um átomo de hidro gênio. Assim, a adjuvanticidade específica de antigénio do derivado de 8-(2-butenil) (22435) é maior do que a do derivado de 8-cinamilo mais comprido (22359) mas menor do que a do com posto de 8-mercapto (SMGuo). 0 derivado de 8-alilo (22300) tem uma adjuvanticidade aproximadamente igual à da SMGuo para as concentrações apresentadas. Os resultados para a mitogeni cidade para os mesmos compostos mostram uma tendencia ainda mais pronunciada obtendo-se com 8-substituintes cada vez mais compridos resultados cada vez mais pobres.

B. Adjuvanticidade e mitogenicidade

Os compostos, composições e métodos da invenção são úteis na indução e melhoramento das respostas mitogénicas e policlonais, e na adjuvanticidade tal como os compostos cujas actividades se ilustram nas Tabelas 1 e 2. Pensa-se que as propriedades mitogénicas e de adjuvante dos compostos do presente in69 188

SCRF 124.OA /7

-37vento resultam de pelo menos dois percursos diferentes nos quais a mitogénese e uma resposta policlonal são muitas vezes resultados coincidentes, enquanto que os resultados da adjuvanticidade diferem frequentemente. Ver, por exemplo Goodman et al.,

J . Exp. I-íed., 147:800 (1978) e Mclntire et al., J . Immunol.,

117:674 (1976). Na patente dos E.U.A. n⁵ 4 643 992 discutem-se algumas diferenças similares.

Este desemparelhamento de actividades está também patente para alguns dos compostos que aqui se discutem, tal como se po. de observar dos resultados das Tabelas 3 e 4, seguintes.

Tabela 3

Adjuvanticidade especifica de antigénio de algumas 8-oxoguanosinas

7-substituídas no sistema humano

7m8oGuo	10“4 3xl0“4 103	2613+192 5775+214 1517+205
23643	IO-4	5492+137
(etil;6)	3xlO-4	9059+310
	IO-3	1950+189
7a8oGuo	104	10 075+628
	3xlO~4	11 938+762
	10“3	2 807+381
23644	104	11 838+1337
(butil;2)	3xlO“4	12 238+150
	10“3	7 363+325
Controlo	(Sem nucleósido) (Sem antigénio)	12+4
Controlo	(Sem nucleósido) (Antigénio presente)	652+86

188

SCRF 124.OA

-381 Os estudos foram realizados de um modo similar aos da Tabela 1, com a excepção de se ter usado uma preparação de lin fócitos humanos.

2’·^ Ver notas 2 e 3 da Tabela 1.

Tabela 4

Mitogenicidade de algumas

8-oxoguanosinas-7-substituídas no sistema murino

Incorporação de / ^JH_7TdR

3

Composto Concentração (cpm/cultura)_

7m8oGuo	IO4 3xlO4 IO3	23 640+770 39 620+1160 35 070+1830
23643	IO-4	37 490+540
(etilo;6)	3xlO~4	48 690+1120
	IO-3	34 160+780
7a8oGuo	IO4	39 830+780
	3xlO-4	59 150+420
	IO-3	51 340+1050
23644	IO’4	30 720+1030
(butilo;2)	3x10 4	41 180+410
	IO-3	33 220+1330
Controlo	(Sem nucleósido)	1640+50

_no^_as e 3 da Tabela 2.

Os resultados que se apresentam na Tabela 4 ilustram que a 7-metil-, a 7-etil-, a 7-alil- e a 7-butil-8-oxoguanosina exibem todas aproximadamente as mesmas mitogenicidades no sis69 188

SCRE 124.OA

-39tema murino na mesma gama de concentrações. Contudo, quando se examina a adjuvanticidade no sistema humano (Tabela 3), os valores de pico são cerca de 100 por cento superiores para os compostos do presente invento (7-alil- e 7-butil-8-oxo guano sina) quando comparados com a 7-metil-8-oxoguanosina (7m8oGuo). Interessantemente, as células B periféricas humanas, o mesmo tipo de células usadas na Tabela 3, que exibiram uma adjuvanticidade melhorada na presença de um derivado de guanosina do presente invento, não exibem uma resposta mitogénica na presença de qualquer derivado de guanosina. Os resultados anteriores e a ausência de mitogénicidade exibida por células humanas que exibiram uma resposta de adjuvante, confirma adicio nalmente que a mitogenicidade e a adjuvanticidade não estão necessariamente ligadas e que podem ocorrer por percursos diferentes .

G. Estudos de adjuvanticidade

Realizaram-se um grande número de comparações de adjuvan ticidade usando linfócitos humanos e murinos como fonte de leu cocitos, com os compostos da invenção bem como com novos compostos excluidos do presente invento. Em virtude das diferenças nas respostas de linfócitos mesmo a partir de ratinhos cru zados, sem contar com a população humana não consanguínea, estes resultados são melhor comparados para um dado estudo com os compostos usados no mesmo estado e com os controlos para ca da estudo. As comparações entre os vários estudos são contudo úteis para mostrar tendências e grandes diferenças. Nas tabelas 5,6 e 7 seguintes, apresentam-se resultados exemplares de.s tes estudos nos quais apenas se mostra, para cada composto, a actividade na concentração de pico, e onde se omitem os resultados obtidos para os controlos. Os resultados para cada estudo são distinguidos uns dos outros por uma linha horizontal na tabela.

188

SCRF 124.OA tf

-40T abei a 5

Estudos de Adjuvanticidade no sistema murino⁴

		RFC anti-SRBC directa
Composto^	5 ConcentraçSo de pico -6	do pico/cultura
7a8MGuo	3x10	1850+70
22827 (cinamilo;11)	3xlO4	1357+226
7m8oGuo	3xl04 '	723+143
24234 (benzilo;23)	3xlO“5	2004
7a8oGuo	10“5	1827
23643 (etilo;6)	3xlO-5	1009+97
23644 (hexilo;4)	3xlO5	1058+154
23894 (decilo;7)	3xl0-6	90+15
23643 (etilo;6)	3xlO5	2067+230
8BrGuo	103	2450+325
23369 (7-alil-8-selenoxo;10)	3xlO“5	2425+229
7a8MGuo	3xlO-4*	925+80

188

SCRF 124.OA

-41^*2 γθ_Γ notas 1 e 2 da Tabela 1.

O valor apresentado é o da concentração com a qual se obteve, para um dado estudo, o maior número de placas por cul tura, excepto onde o símbolo (*) é utilizado para mostrar que se usou uma concentração supra-facultativa.

número de pico de PFC/cultura apresentado foi ligeira mente inferior ao do controlo, sendo desse modo o aumento de PFC/cultura efectivamente zero.

Os resultados da Tabela anterior ilustram vários pontos. Em primeiro lugar, os compostos do presente invento são mais activos do que os compostos descritos na Patente dos E.U.A. n- 4 643 992 com os quais foram comparados. Essa melhoria na actividade manifestou-se, quer numa concentração para a qual se observou uma adjuvanticidade de pico (concentração de pico) de cerca de 0,5 a uma unidade log (potência de dez) inferior, quer numa adjuvanticidade para uma dada concentração de pico que era significativamente superior, usualmente pelo menos cerca de 100 por cento superior, à exibida para um composto dessa patente.

A adjuvanti cidade melhorada pode ser observada no primei, ro grupo de compostos da Tabela 5 onde se comparam 7a8bIGuo, 7m8oGuo e 7-cinamil-8-oxoguanosina (22827). Assim, a 7a8KGuo foi mais do que 100 por cento mais activa do que a 7m8oGuo, para uma concentração dois logs inferior. A 7-cinamil-8-oxiguanosina foi mais do que cerca de 100 por cento mais activa do que a 7m8oGuo para a mesma concentração de pico. Próximo do fundo da Tabela 5, onde se comparou a 8-BrGuo com a 7-etil-8-oxoguanosina (23643), mostram-se resultados similares, tendo ambos os compostos números similares de placas por cultura, embora o último composto tenha exibido esses valores para uma concentração 1,5 unidades log inferior. (A partir de outro trabalho a ser aqui depois discutido, o resultado apresentado para a 7-etil-8-oxoguanosina parece ser anormalmente elevado).

188

SCRF 124.OA

-420 melhoramento substancialmente nulo do FFC/cultura exibido pelo uso da 7-decil-S-oxoguanosina (25894) serviu de base para o radical R^ ser inferior em comprimento a um radical decilo.

Os resultados que se mostram na Tabela 6, seguinte, foram obtidos de um modo similar aos da Tabela 5, com a excepção de os imuno-estimulantes da Tabela 6 terem vários outros substituintes nos grupos ribosil-hidroxilo e em algumas posições do anel.

Tabela 6

Estudos de ad juvanticidade, com substituição adicional do ribosilo, no sistema murino^b

Composto

Concentração de pico

RFC anti-SRBC directo de pico/cultura

25085 10⁴ 2150+250 (21)

7a8MGuo 3xlO^-5 1867+150

25287 (18)	10 4
8BrGuo	3x10'
25551a (21)	IO-4
25314b (19)	105
25350c (20)	10“5

1650+63⁴ 1675+298

1167+68

655+96

1451+154

245+19

45+8

188

SCRF 124.OA z

«J*

-437a8MGuo

3x10

3x10

3x10

-4*

1850+50^a 925+80^b 1975+109°

22360 10 ⁵ 743+48⁵ (22)

8MGuo 3xlO^-4 527+25

T 2 3 ^λ ’ ’ Vêr notas 1,2 e 3 da Tabela 5, excepto qu.e o nome do substituinte na posição 7 é omitido devido à presença de outros substituintes nos compostos, de modo a evitarem-se possíveis confusões com entradas aparentemente similares em outras tabelas.

⁴ Realizaram-se dois estudos, com o primeiro número de ca da par estando relacionado com um primeiro estudo e com o segundo número de cada par estando relacionado com um segundo es tudo.

valor apresentado parece ser anormalmente baixo em fa ce de outros resultados aqui apresentados, p.e., ver Tabela 8.

^a,b’^c Cada um dos compostos 23351, 23314 e 25350 foi comparado com a 7a8MGuo em estudos separados. Os resultados de cada estudo foram assinalados com a, b ou c conforme apro priado.

No estudo b usou-se uma quantidade supra-optima de 7a8MGuo.

Os resultados na Tabela 6 ilustram que uma guanosina subs tituída nas posições 7 e 8, tal como anteriormente se descreveu, pode ser também eficaz se os seus hidroxilos do ribosilo compreenderem grupos substituintes. Assim, uma 7-alil-8-tioxoguanosina, cujos hidroxilos 2' e 3' estavam ligados a um anel isopropilideno (23083), exibiu uma actividade substancialmente idêntica à da 7a8oGuo, ainda que para uma concentração cerca

188

SCRF 124.OA

-44de meio log superior. Similarmente o éster de 5’-acetilo desse derivado de isopropilideno (23287) exibiu também uma adjuvanticidade de pico que era cerca do dobro da exibida pela 8-bromoguanosina (SBrGuo), cuja actividade do pico era cerca de meio log superior, em concentração.

Quando se substituiu o grupo 5’-acetilo (acetoxilo) por um grupo benzoilo (benzoxilo) (23351) obteve-se um resultado similar. Interessantemente, quando se adicionou um outro gru po benzoilo ao composto 23351 no grupo amino da posição 2, o composto resultante (23350) era substancialmente inactivo nas concentrações utilizadas nos estudos.

Quando todos os três grupos hidroxilo 2', 3' e 5’ do gru po ribosilo foram acetilados (composto 22360), o composto man teve a sua actividade elevada. Os resultados aqui depois apre. sentados na Tabela 8 indicam que este composto de tri-O-acetilo é dos mais activos de todos os compostos estudados, particular mente para baixas concentrações.

Os resultados apresentados na Tabela 7 seguinte, foram obtidos de um modo similar aos anteriormente discutidos mas usando linfocitos humanos. Alguns destes estudos utilizaram linfocitos de mais do que um individuo e são deste modo apresentados com entradas múltiplas.

Tabela 7

Estudos de Adjuvanticidade no Sistema Humano^

Composto

7a8oGuo

3038+288^a 9250+1010^b 4831+270^c

69 188 SCRF 124.OA	, //
	-45-
7m8oGuo	10-3	125O+125a
	103	830+ 67°
	10“3	1225+175°
22360	3xl0-4	925a
(22)	3xlO5	6008b
	10“4	5050°
7a8MGuo	3xl0-4	673a
	IO-4	6475b
	IO4	3058c
7a8oGuo	3xl04	477a
	3xlO-4	10 313b
	104	4413°
7m8oGuo	IO-3	528a
	IO3	297b
	H O 1	263°
7m8oGuo	3x10 4	5775+214
23643	3xl0“4	9045+310
(etilo;6)
	-A
7a8oGuo	3x10 '	11 938+762
23644	3xl0-4	12 238+150
(butilo;2)
23369	3xlO“4	2204+370
(7-alil-8-
-selenoxo;10)
23644	3xl0-4	3371+120
(butilo;2)
23679	3xlO-4	3129+252
(butenilo;3)

188

SCRF 124.OA

7a8oGuo	3x10 4	4079+102
22827 (cinamilo;11)	3xlO-4	2577+300
7a8oGuo	3xlO-4	7075+260
7m8oGuo	IO-5	780+142

3 ^λ ’ '^? Ver notas 1,2 e 3 da Tabela 5 com a excepção de se omitir o nome do substituinte na posição 7 quando os substituiu tes do anel de açúcar estão também presentes.

^a’^^,C Os compostos foram comparados usando preparações de linfócitos de três pessoas designadas por a, b e c. As comparações entre os compostos foram pois feitas com uma dada prepa ração de linfócitos. Os resultados indicados com a são comparados com eles próprios, tal como acontece com os marcados com b e com c.

Os resultados da Tabela 7 mostram de novo a eficácia melhorada dos compostos do presente invento quando comparada com a da 7-metil-8-oxoguanosina, no sistema humano. Esses resultados ilustram também a presença dos substituintes na posição 7 que são mais curtos em comprimento do que um grupo hexilo. Assim, ainda que a 7-cinamil-8-oxoguanosina (22827), que é mais comprida do que um grupo hexilo, tenha sido bastante activa em relação à 7m8oGuo, foi substarcialmente menos activa do que a 7a8oGuo.

É também ilustrada a semelhança na adjuvanticidade da 7a8oGuo, da 7-butil-8-oxoguarosina (23644), e da 7-(2-butenil)-8-oxoguanosina (23679), cujos substituintes na posição 7 são todos mais curtos do que um grupo hexilo e mais compridos do que um grupo etilo. Similarmente, pode observar-se a adjuvan ticidade melhorada dos compostos com um substituinte na posição 7 mais comprido do que um grupo etilo, comparando a adju69 188

SCRF 124.OA

-47vanticidade da 7-etil-8-oxoguanosina (23643) quer com a da 7a8oGuo quer com a da 7-butil-8-oxoguanosina (23644).

As diferenças de adjuvanticidade entre os compostos particularmente preferidos do presente invento, cujos radicais r! são mais compridos do que o etilo e mais curtos do que o hexilo, e cujos grupos rihosilo estão não substituídos, e a 7m8oGuo e a 7-etil-8-oxoguanosina, podem ser observadas nos resultados da Tabela 8 seguinte. Esses resultados foram obtidos num único estudo, maior, realizado usando linfocitos murinos e nove derivados da guanosina, onde o derivado da guanosina foi posto em contacto com os linfocitos em concentrações relativamente baixas que são desejáveis para uso. Estes resultados são apresentados na Tabela 8 seguinte.

Tabela 8

Estudos de adjuvanticidade a baixa concentração no sistema murino^

	FFC anti-SRBC directo/cultura a
Composto^	7,5x10 6H	1x10
23924 (hexilo;4)	103	243
7m8oGuo	128	145
23644 (butilo;2)	292	900
23643 (etilo;6)	313	270
23679 (2-butenilo;3)	383	612
24069 (propilo;5)	793	1306
7acoGuo	1028	1387
7a8MGuo	1130	1049
22360 (22)	1391	1176
Controlo (antigénio +
sem nucleósido)	57

188

SCRF 124.OA

-481 P «* ’ Ver notas 1 e 2 da Tabela 5, excepto para o composto 23360 (7-alil-8-tioxo-2', 3’, 5’-triacetoxiguanosina).

Concentrações dos compostos em moles por litro (M).

A análise da Tabela 8 revela que a 7-hexil-8-oxoguanosina (23924) é, aproximadamente, igualmente activa quando comparada com a 7m8oGuo à concentração mais baixa, e cerca de duas vezes mais activa à concentração mais elevada. A 7-butil- (23644), a 7-etil- (23643), e a 7-(2-butenil)-8-oxoguanosinas são todas pelo menos duas vezes maior activas do que a 7m8oGuo para a concentração mais baixa, com as 7-butil- e 7-(2-butenil)-8-oxoguanosinas exibindo aumentos de cerca de 100 a cerca de 200 por cento na adjuvanticidade em relação a 7-etil-8-oxoguanosina, para a concentração mais elevada.

A 7-propil-8-oxoguanosina (24069) e a 7a8oGuo, bem como a 7a8MGuo e o seu derivado de 2', 3' , 5'-triacetilo (22360) fo_ ram todos várias vezes mais activos como adjuvantes do que a 7-etil-8-οχοguanosina, e ainda mais activos quando comparados com a 7m8oGuo.

Na figura 5 mostra-se uma representação do valor de (PFC-FFC de controlo) por micromole dos resultados da Tabela 8, para as 8-oxoguanosinas 7-substituídas, para a concentração mais elevada dessa Tabela, em junção do comprimento da cadeia de átomos de carbono mais comprida no substituinte, admitindo que o alilo é ligeiramente mais comprido do que o propilo, e que 0 2-butenilo é ligeiramente mais comprido do que 0 butilo, e ilustra a relação entre a adjuvanticidade e o comprimento da cadeia. Tal como se pode observar, os picos de adjuvanticidade para um comprimento de cadeia entre cerca de 3 e cerca de 4 átomos de carbono, os substituintes com menos do que três carbono; i.e., metilo e etilo, exibem actividades substancialmente menores. 0 radical hexilo substituinte exibe uma activi^ dade similar à dos radicais metilo e etilo.

Esta constatação de uma relação aparente estrutura-acti69 188

SCRF 124.OA

-49vidade baseada no comprimento aproximado da cadeia do substituinte da posição 7, foi bastante surpreendente. R. Gallo, in Progress in Physical Organic Chemistry, vol. 14, R. Taft, ed., John Wiley & Sons, New York, (1983) pag. 115-163, discutiu as relações quantitativas estrutura-actividade, e publicou várias relações de energia livre em sistemas biológicos que eram lineares usando o parâmetro de TaftEs. 0 parâmetro de Es traduz uma energia livre relativa para os efeitos estereoquimicos.

artigo de Gallo, por exemplo, descreve que outros publi caram resultados referentes a uma correlação de Es para a acilação e desacilação da alfa-quimotripsina, para o metabolismo de álcoois primários a glucuronidos em coelhos, para a activi dade locomotora de anfetaminas em ratinhos, na inibição da co linesterase por fosfatos de fenilo substituído com dietilo, no inibidor da fenoxietilciclopropilamina monoamina oxidase e nas anti-histaminas de difenil-hidramina, bem como na acção de drogas tuberculostáticas do tipo hidrazida de ácido isonicotínico (Ver Gallo na pag. 125.)

Assim, podia ser de esperar que se encontrasse uma correlação similar para os substituintes na posição 7 de uma guanosina, na presente situação, usando, quer o Es quer o seu parâmetro estereoquimico correlativo nu que se diz ser baseado no raio de Van der Waals e que foi desenvolvido por Charton,

J. Am. Chem. Soc., 97.:1552-1556 (1975). Contudo, um exame dos valores de nu e de Es para substituintes hidrocarbilo de cadeia linear na posição 7, tais como propilo, butilo, pentilo e octilo, mostra que os valores de nu são todos 0,68 para estes substituintes, enquanto que os valores de Es são, resz pectivamente -0,56, -0,39, -0,40 e -0,33. E bastante evidente que os resultados de PFC/cultura da Tabela 8, quando repre. sentados quer em função de nu, quer em função de Es, não mostrem qualquer correlação linear, nem qualquer correlação entre os resultados e esses parâmetros estereoquimicos.

188

SCRF 124.OA

-50É também de notar que /. J« Org. Chem., 41:2217-2220 (1976)_7 descreve um valor de nu também de 0,68 para os radicais alquilo de cadeia linear Οθ, C-^, C^, C^ e Ο^γ, o que implicaria que um radical 7-butilo e um radical 7-decilo conduzisse um PFC/cul tura similar, se a adjuvanticidade aqui estudada fosse correlacionável tal como o eram os outros processos biológicos anteriormente mencionados. Contudo, mesmo quando se compara a adjuvanticidade aproximadamente nula exibida pela 7-decil-8-oxogua nosina (23894) com a dos derivados 7-etil- e 7-hexil-8-oxoguanosina (23643 e 23644, respectivamente) da Tabela 5 cujos valo, res de nu são respectivamente, 0,56 e 0,73, é de novo muito evi dente que a adjuvanticidade melhorada por um composto do presen te invento não se correlaciona com nu, nem com o seu parâmetro correlativo Es, nem pode a adjuvanticidade ser prevista por qualquer parâmetro.

Uma outra propriedade inesperada dos compostos mais preferidos; i.e., onde R^ é mais comprido do que o etilo e mais curto que o hexilo, e onde 0 grupo ribosilo está não substituído, é que a curva de dose-resposta é mais larga, próximo da concentração do pico, do que uma curva similar obtida para a 7m8oGuo. Esta resposta alargada não é observada nas tabelas de valores discretos anteriores.

Em alguns casos, a largura adicionada aparece para concen trações inferiores â.s da concentração do pico e noutros aparece para concentrações mais elevadas do que a concentração do pico. Este assimetria evidente das curvas dose-resposta é mui to provavelmente uma função da variação da concentração do nu cleósido usado nos estudos em meias unidades log.

Independentemente da razão para a assimetria aparente das curvas de dose-resposta, pode obter-se uma medida do alargamen to relativo somando 0 número médio de placas (PFC/cultura) encontrado em intervalos de meio log, dentro de uma unidade de concentração de um log, da concentração do pico, incluindo 0 PFC/cultura para a concentração do pico. A soma obtida é de69 188

SCRF 124.OA

pois dividida por três (o número de valores somados) por forma a obter-se a média do valor de placa de 1 log. Esse valor de placa de 1 log médio pode assim ser obtido a partir do valor de pico médio mais os valores médios de meio log em ambos os lados da concentração de pico, ou a partir do valor de pico médio mais os valores médios obtidos a partir da concentra ção meio log mais elevada e um log mais elevada (ou meio log mais baixa e um log mais baixa) do que a concentração de pico Os valores de placa médios são seleccionados por forma a obter-se a maior soma e o valor residual onde os SRBC sózinhos estavam presentes é subtraído a cada valor antes deste ser so mado. Cada valor é dividido pelo número de micromoles de nucleósido presentes na cultura, somam-se os três maiores valores obtidos na gama de 1 log, e dividem-se por três para se obter o 1 log médio por micromole.

Quando se realizam cálculos como os anteriores e se ponderam para vários estudos nSo relacionados usando um derivado de guanosina particular, verifica-se que os valores médios de placa de 1 log por micromole, para os compostos mais preferidos da invenção, são muito superiores ao valor para a 7m8oGuo Estas diferenças em valores são encontradas quando se examinam resultados obtidos em sistemas de linfocitos humanos e mu rinos. Na Tabela 9 seguinte ilustram-se valores representativos .

Tabela 9

2 Composto	Valores de placas de 1 log médio*'
3 Lunno	Humano
7a8oGuo	98 237+42 041	22 640+4187
24254 (benzilo;23)	110 777+42 823	-
7a8MGuo	326 840+170 907	45 630+28 808

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7m8oGuo	22	359+5154	867+217
23644 (butilo;2)	118	886+80 092	52 597*
23679 (2-butenilo;3)	52	332*	—
22360 (22)	53	695+28 444	38 508+26 802
1 Os valores	foram	obtidos como	anteriormente se descreveu

Ver nota 2 da Tabela 1.

Hurino = sistema de linfocito murrno tal como se descre ve nas Tabelas 1, 4, 5, 6 e 8. Humano = sistema de linfocito humano tal como se descreve nas Tabelas 3 e 7.

Valor obtido de um único estudo.

Uma curva de dose-resposta pode ser muito estreita e não permite desse modo a dosagem apropriada de um recipiente particular. For exemplo, os resultados para o sistema humano apresentado na Tabela 7 ilustram diferenças de tanto como um factor de três a dez (meia a uma unidade log) na concentração de pico dos compostos estudados, quando se compararam prepara çães de linfócitos de três individuos diferentes. Se a curva de dose-resposta fosse muito estreita, uma dosagem selecciona da usual para os recipientes podia geralmente ser muito eleva da ou muito baixa para um recipiente particular. Assim, as curvas dose-resposta alargadas, para os compostos mais preferidos do presente invento, oferecem uma vantagem adicional quando comparados com a 7m8oGuo. Os resultados da Tabela 9 mostram que os valores médios de placa de 1 log no sistema humano são cerca de 25 a cerca de 60 vezes superiores, para os compostos mais preferidos, aos da 7m8oGuo.

Pode obter-se um outro perfil de actividade de estrutura,

188

SCRE 124.OA

-53similar em forma ao que se mostra na Figura 5, usando valores de EEC de pico/cultura para os mesmos derivados de guanosina e para derivados adicionais obtidos em vários estudos. Aqui usa-se um valor de PFC de pico simples para cada estudo.

Esse valor é obtido dividindo os valores de PEC por cultura obtidos, pelo número de micromoles de guanosina presentes no estudo com que se obtem o valor de EEC, após subtrair as placas residuais de um controlo das do estudo. Os valores de pi co assim obtidos para cada estudo, usando um dado composto, são depois ponderados para diminuir flutuações na resposta de estudo para estudo, o que se notou ter ocorrido anteriormente.

Na Figura 6, mostra-se uma representação destes valores de pico ponderados para o sistema murino, cujas posições na abcissa foram determinadas tal como se indicou na Figura 5.

Os valores de pico médios que se apresentam na Figura 6 não são tão precisos como os da Figura 5 devido às flutuações observadas entre os vários estudos utilizados para a sua obtenção. Adicionalmente, os vários pontos no gráfico são resulta do de estudos simples ou de dois estudos com os quais se obti veram resultados variando grandemente. For exemplo, o valor de pico médio para a 7-butil-8-oxoguanosina (23644) obtido a partir de dois valores de pico muito diferentes parace ser anormalmente alto, em face dos resultados da Tabela 8 para o sistema murino, e da Tabela 7 para o sistema humano. Assim, o substituinte hidrocarbilo com o qual se obtem o maior valor EEC de pico/cultura parece ser um a dois átomos de carbono mais comprido na Figura 6 do que na Figura 5. Apesar disso, a tendência na relação estrutura-actividade que se mostra no gráfico da Figura 6 ê substancialmente similar á que se mostra na Figura 5, cujos valores se crêem ser precisos e direc: tamente comparáveis, emprestando deste modo crédito aos resultados apresentados na Figura 6. Esses resultados substancialmente similares mostram que os radicais R^ mais compridos do que o etilo mas mais curtos do que o hexilo, conferem, subs

188

SCRF 124.OA

-54tancialmente e imprevizivelmente, uma adjuvanticidade melhorada, em comparação com a 7m3oGuo.

A 7a8oGuo exibe, não apenas uma adjuvanticidade inesperadamente elevada para uma concentração mais baixa de pico do que a 7m8oGuo e uma curva de dose-resposta alargada, mas também é inesperadamente mais solúvel na urina humana do que a 7m8oGuo. Essa solubilidade inesperadamente elevada na urina é contrária à solubilidade prevista em água baseada nos valores da constante pi calculados. Usou-se a urina nos estudos de solubilidade pois os compostos do presente invento são na sua maior parte eliminados através da urina, dos organismos dos animais .aos quais são administrados. A insolubiladade na urina pode conduzir â precipitação do composto no rim com con sequente danificação desse orgão.

Os valores da constante pi são uma medida da solubilidade relativa em 1-octanol e em água tal como é determinado pelos coeficientes de partição entre os dois solventes. Diz-se que o valor da constante pi é o parâmetro de escolha para a corre lação da ligação a macromoléculas biológicas e do transporte através de um sistema biológico. Norrington et al., J. Med. Chem., 18, 604 (1975).

Os parâmetros da constante pi foram desenvolvidos por leo e Hansch e pelos seus colaboradores. Ver por exemplo, Leo et al., Ghem. Rev., 71, 525 (1971), e C. Hansch e A. leo, Subs tituent Constants for Correlation Oonstants in Chemistry, Wiley Interscience, New York, 1979.

valor da constante pi, usualmente indicado usado a letra grega, (7T) é calculado usando a equação:

7Γ = log Ρ_χ - log p_h onde P é o coeficiente de partição para o composto de inte-X» resse e P^ é o coeficiente de partição para o composto não

188 SCRF 124.0A

-55substituído correspondente. Uma vez obtida uma série de valores da constante pi para um grupo de substituintes para compos tos relacionados, esses valores podem ser usados para outros compostos, não relacionados, compreendendo esses substituintes sem ter de realizar os estudos de partição para esses compostos não relacionados. Ao hidrogénio como substituinte é atribuido o valor de zero.

Tal como pode ser determinado a partir da análise da eq.ua ção anterior, os substituintes que conferem maior solubilidade em água conduzem a valores da constante pi que são relativamen te mais negativos. Inversamente, os substituintes que conferem maior solubilidade em 1-octanol conduzem a valores da constante pi que sâó relativamente mais positivos.

Os valores da constante pi encontrados no livro de Hansch e Leo, anteriormente referido, são 0,56 para um radical metilo e 1,10 para um radical alilo. Assim, é de prever que um composto compreendendo um radical alilo seja mais solúvel em 1-octa nol do que um composto similar compreendendo um radical metilo. Inversamente será de esperar que a presença de um radical metilo num dado composto conduza a uma maior solubilidade desse com posto em água quando comparado com um composto similar compreendendo um radical alilo em vez do radical metilo.

Usando a opção LSE do programa de computador ChemLab para calcular valores de log P para os valores da constante pi ante riores, e depois calculando valores da constante pi para a 7m8oGuo e para a 7a8oGuo os valores para log P são -8,43 e -7,46, respectivamente, onde x é, respectivamente, metilo e alilo. 0 programa de computador utiliza o formalismo de R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragment Constant, Elsevier, New York (1977) Assim de novo, o uso da constante pi prevê uma maior solubilidade em água para a 7m8oGuo do que para a 7a8oGuo.

Quando se realizaram estudos de solubilidade na urina humana para a 7m8oGuo e para a 7a8oGuo, encontraram-se solubili69 188

SCRF 124.OA

-56dad.es de 4,88 mg/ml e de 16,5 mg/ml, respectivamente. Assim a 7a8oGuo possuia uma solubilidade três vezes maior do que a 7m8oGuo, embora fosse previsto, por uma análise da constante pi, ser menos solúvel. Seria de esperar que as solubilidades em urina fossem inferiores às solubilidades em água devido ao teor em sal na urina que é relativamente mais elevado do que o encontrado na água.

Não se realizou uma análise da constante pi para a 7a8MGuo ou para outros compostos que aqui se descrevem. Os estudos an teriores de solubilidade usando urina humana incluiu a 7a8MGuo, e verificou-se que esse composto era relativamente insolúvel (0,30 mg/ml) tal como seria de esperar pela presença do seu átomo de enxofre.

Os estudos anteriores de solubilidade foram realizados agitando um excesso de cada composto em urina humana a 37°C por um período de tempo de cerca de 18 horas; os recipientes da amostra foram saturados com argon gasoso antes da mistura. Filtrou-se cada amostra através de um filtro com poros de 5 micron, diluiu-se como necessário com fase móvel de HPLC e depois quantificou-se por HPLC.

D. Actividade de substituição de células T

Na Figura 1 ilustra-se a capacidade das composições do presente invento para substituir as células T na resposta de anticorpo para um antigénio dependente de células T. Aqui, as células B geradas in vitro por tratamento com anti-ti 1.2 mono clonal mais complemento foram cultivadas com ou sem SRBC, como antigénio, na presença de composições contendo concentrações incrementais de 7a8oGuo.

Os valores na Figura 1 ilustram que, sob estas condições, as culturas de células B isoladas responderam pobremente ao an tigénio, a não ser quando suplementadas com 7a8oGuo. A respos^ ta modulada pela 7a8oGuo era dependente da dose bem como depen dente do antigénio. Adicionalmente, esta resposta não pode ser

138

SCRE 124.OA

-57atribuida à activação policlonal, não específica, de células B em virtude da omissão do antigénio diminuir acentuadamente a resposta (linha tracejado); a resposta das células de baço normais ao SRBG está compreendida entre cerca de 200 e cerca de 600 RFC por cultura.

Os resultados da Figura 1 ilustram que o contacto de células B in vitro com uma composição do presente invento confe re a essas células contactadas um sinal do tipo células T. Esses resultados mostram também que o resultado é específico do antigénio e dependente da dose, bem como do derivado de gua nino-nucleósido.

E. Reconstituição in vitro da imuno-resposta humoral primária

As células B usadas na obtenção dos dados da Figura 1 eram imuno-competentes, e foram obtidas a partir de ratinhos CBA/CaJ. Os ratinhos CBA/N possuem uma imunodeficiencia de células B primária ligada ao cromossoma x (x-ligada), e podem deste modo constituir um modelo murino para a imunodeficiencia ligada ao sexo.

Pensa-se que a estirpe CBA/N é deficiente na actividade funcional de uma subpopulação de linfócitos B maduras compreendendo antigénios Byb 3/5/7. Ver Huber et al., J. Exp. Med., 145:1 (1977); Ahmed et al., J.Sxp.Med., 145:101 (1977); e Subbaro, J. Immunol., 122:2279 (1979).

Erepararam-se culturas de células de baço de ratinhos ma chos e fêmeas homozigóticos CBA/N e de ratinhos macho heterozigóticos para o gene CBA/N, designado por gene xid, (o ratinho macho contem o cromossoma X), tal como se descreve na sec ção Materiais e Métodos. Adicionaram-se às culturas 0,1 ml de uma suspensão de SRBG, sózinhc, a 0,1 por cento (v/v) ou a suspensão de SRBG conjuntamente com quantidades incrementais de 7a8oGuo, usando 5x10^ células/ml. Após 4 dias de cultura determinaram-se as culturas formando placas anti-SRBC directo nor cultura.

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SCRF 124.OA

-58Na Figura 2 mostram-se os resultados deste estudo comparando células de ratinhos CBA/N com uma preparação de células de baço de ratinhos CBA/CaJ. 0 exame da Figura 2, para um ní vel de concentração de derivado de guanosina de zero, mostra que não existe substancialmente qualquer resposta, quando se compara com um valor de cerca de 250 PFC/cultura para as célu las CBA/CaJ imuno-competentes.

Um exame adicional da Figura mostra que tanto as células CBA/CaJ imuno-competentes como as células CBA/N originalmente imuno-incompetentes foram tornadas capazes de produzir aproxi madamente o mesmo número de PFC/cultura na presença de 7a8oGuo. Surpreendentemente, esses valores similares foram obtidos pondo em contacto as células com composiçoes contendo apenas uma _5 diferença de meio log na concentração de 7a8oGuo, 10 M vs 3xl0^-^M para as células CBA/CaJ e CBA/N, respectivamente.

Os valores da Figura 2 ilustram deste modo que, pondo em contacto células do baço imuno-deficientes com uma composição do presente invento se pode reconstituir a imuno-resposta humoral primária ao SRBC dessas células que de outro modo seriam imuno-deficientes.

A imuno-deficiência em ratinhos, bem como em outros mamíferos, pode resultar da idade avançada ou da senescência, bem como por defeito genético tal como se discutia anteriormente em relação à Figura 2. Assim, animais que eram imuno-competen tes quando jovens ou adultos podem tornar-se imuno-deficientes quando atingem uma idade avançada. Esse é o caso da estirpe de ratinhos CBA/CaJ consanguíneos.

Realizou-se um outro estudo da reconstituição de uma resposta de anticorpo humoral primária ao SRBC, usando células de baço de ratinhos CBA/CaJ senescentes, de 156 semanas de idade, que se tornaram imuno-deficientes com a idade. As respostas in vitro dessas células do baço ao SRBC num ensaio de formação de placas foram comparadas com respostas similares de outro

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-59grupo de ratinhos CBA/CaJ adultos saudáveis, com 8 semanas de idade. Esta comparação foi realizada como anteriormente se descreveu em relação à Figura 2, usando de novo uma composição contendo 7a8oGuo para o contacto com as células de baço. Os resultados são apresentados na Figura 3.

Tal como se pode observar de um exame da Figura 3, os valores de FFC/cultura para os ratinhos adultos saudáveis de con trolo, contendo SRBC mas não contendo derivado de guanosina, foram várias vezes o número formado na ausência do SRBC e da guanosina. Os PFC/cultura para os controlos para os ratinhos senescentes foram usuais para esses ratinhos, sendo aproximadamente iguais para ambos, e -elevados em comparação com os obtidos para os ratinhos adultos saudaveis. Pensa-se que essas respostas relativamente elevadas e similares sejam devidas a formação de clones auto-produtores de anticorpos.

Um outro estudo da Figura mostra uma resposta ao SRBC relacionada com a dose de derivado da guanosina, na presença de concentrações 3 e 10 micromolar (/*M) de 7a8oGuo. Essa respos^ ta foi observada tanto para as células de baço de ratinhos adul tos saudaveis imuno-competentes como para as células de baço de ratinhos previamente imuno-deficientes, mas agora senescentes com a resposta humoral primária reconstituída.

Os resultados que se apresentam na Figura 3 ilustram deste modo que, o contacto de células do baço de ratinhos imuno-deficientes senescentes com uma composição do presente invento pode reconstituir esta imuno-resposta deficiente. Os resul tados das Figuras 2 e 3 ilustram essa reconstituição tanto na imuno-deficiência X-ligada como na imuno-deficiência associada a idade.

F. Respostas de anticorpos in vivo

Imunizaram-se ratinhos CBA/CaJ, intraperitonealmente (i. p.) usando um conjugado (TNP-BSA) preparado por reacção de áci do 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS) e de albumina de soro

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-60bovino (BSA) num tampão de cacodilato 0,28 molar, a pH 6,9. Cada animal recebeu uma injecção intraperitoneal (i.p.) conten do 50 microgramas (/g) do conjugado imunizante. Um grupo de ratinhos recebeu depois (cerca de 30 minutos depois) outra injecção i.p. que continha 7a8MGuo, quer em óleo de semente de sésamo a 100 por cento , quer numa composição aquosa contendo 2 por cento em volume de óleo de sésamo sonicado com solução salina. Cada animal recebeu 0,2 ml das composições cuja concentração em 7a8MGuo era, em cada uma, 5 mg/ml. Um terceiro grupo de ratinhos recebeu a imunização, mas não a composição do presente invento, e servia como controlo. Determinou-se de pois a secreção de anticorpo anti-TNB-BSA de cada grupo, duran te um período de 37 dias, por técnicas padrão de ensaio de imu no-sorbente ligado a enzima (EIISA) usando TNB-BSA como antigé nio.

Na Figura 4 mostram-se os resultados deste estudo que são ilustrados como a razão entre os títulos de anticorpos ELISA obtidos usando qualquer das composições contendo 7a8MGuo e o título do controlo. Tal como se pode observar na Figura 4, o uso de uma composição contendo 7a8MGuo fez com que os títulos de anticorpos anti-TNB-BSA fossem superiores aos dos controlos, a partir da medição dos títulos do primeiro dia (dia 9 após a administração) até ao fim do estudo (37 dias após a administra ção).

Um aspecto que não se mostra na Figura 4 consiste no facto de o nível de anticorpo do controlo ter tido um pico para um tempo de aproximadamente duas semanas após a administração e depois ter começado a diminuir. Contrariamente, os títulos de anticorpos para os animais que receberam a 7a8tIGuo aumentaram durante um período de cerca de duas semanas após a administração e depois permaneceram aproximadamente no mesmo nível eleva do durante o estudo. Assim após os valores obtidos duas semanas após o início do estudo, os valores da Figura 4 ilustram a constância relativa dos títulos de anticorpo após a administra69 188

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-61ção da 7a8MGuo e a queda dos títulos dos controlos.

G. Activação de células T auxiliares

Os linfócitos T activados por determinantes de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) estranho ou auto-modi ficado são considerados como representado células efectoras cruciais envolvidas no controlo da auto-integridade; a rejeição allograft e a eliminação de estruturas, virai ou quimicamente auto-alteradas, representam exemplos clínicos deste mecanismo de defesa. A proliferação de células T na presença de um aloantigénio pode fornecer uma correlação com a actividade T auxiliar, e com o seu aumento. Pohor et al., Scan. J. Immunol. 18:207-215 (1983). Realizaram-se pois estudos de pro liferação de células T na presença de um aloantigénio e na pre sença adicional ou na ausência de um derivado de guanosina do presente invento, estudos estes que aqui depois se discutem.

Na avaliação do efeito de um derivado de guanosina na pro. liferação induzida por aloantigénio, é imperativo minimizar a resposta mitogénica simultânea das células B a por em contacto com um derivado de guanosina. Usaram-se células de baço de ra tinhos SJL (cujas células B são hipo-responsivas ao efeito mitogénico de um derivado de guanosina, mas não à sua actividade adjuvante), como células respondentes, em dois estudos. Essas células respondentes foram estimuladas com células alogénicas irradiadas (de ratinhos CBA/CaJ) na ausência de nucleósido, na presença de quantidades incrementais de um derivado de guanosi. na da invenção, 7m8oGuo, ou na presença de outro derivado da guanosina, 8MGuo, usado como controlo positivo.

Um terceiro e um quarto estudo utilizaram timocitos de ra tinhos CBA/CaJ como células estimuladas (respondentes) e células de baço de ratinho BUF^ com células estimulantes. Rara es tes estudos usaram-se dois derivados de guanosina do presente invento, 7a8MGuo e 7a.8oGuo, servindo a 8MGuo como controlo positivo para um dos estudos.

188 /?

SCRF 124.0A ^r' -⁷ r

-62Os timocitos são células T grandemente imaturas que não respondem vigorosamente a células alogénicas. Contudo, na pre sença da interleucina-2 (IL-2), essas células desenvolvem resposta ao estímulo alogénico. Os presentes estudos utilizando timocitos foram pois realizados na presença de uma quantidade co-estimulante de 11-2.

Na Tabela 10 seguinte mostram-se os resultados dos quatro estudos de proliferação de células T. Cada um desses estudos utilizou populações de células separadas, de modo que os resultados são melhor comparados apenas dentro de cada estudo. Tabela 10 Proliferação de células T em culturas mistas de leucócitos4
Células	Res-	Células Estimu-		Incorporação
pondentesz	1antes Irradiadas	Nucleósido4	de Λ3Η 7TdR
		Estudo 1
Células	de	Células de baço
baço de	SJL	de CBA/Caj
+		—	—	21 600+900
+		-	10_5(7a8MGuo)	36 700+2400
-		+	—	1300+50
-		-	10-5(7a8MGuo)	300+110
+		+	-	40 100+2300
+		+	105(7a8MGuo)	67 500+2900
+		+	10-3(8MGuo)	28 100+2700

Estudo 2

188

SCRF 124.OA

Células de	Células de baço
baço de SJ1	de CBA/CaJ
+			16	600+1100
+	-	105(7a8MGuo)	19	100+1100
-	+	-		500+30
-	-	105(7a8MGuo)	2300+200
+	+	-	16	500+1300
+	+	105(7a8MGuo)	36	400+3800
+	+	10“5(8MGuo)	30	800+1300
	Estudo 3
Timocitos	Células de baço
de CBA/CaJ	de BDF-l
+	—	—	3	100+300
-	+	-		300+70
+	+	-	12	500+90
+	+	10“6(7a8MGuo)	11	800+400
+	+	IO-5(7a8MGuo)	15	300+600
+	+	104(7a8MGuo)	21	400+1200
+	+	10“5(8MGuo)	15	600+1000
+	+	10-4(8MGuo)	13	800+1000
	Estudo 4

Timocitos Células de baço de CBA/CaJ de BDF^

780+70

300+60

5400+200

69 188 SCRF 124.OA
+	+	-64- 10“6(7a8oGuo)	8300+300
+	+	10~5(7a8oGuo)	8000+300
+	+	10-4(7a8oGuo)	10 000 +800

^x Os sinais mais ( + ) são utilizados para indicar a presen ça do material, indicado no topo da coluna, no meio de cultura, enquanto os sinais menos (-) são utilizados para mostrar a ausência desse material no meio de cultura. Na secção de Materi ais e Métodos são apresentados pormenores dos procedimentos e dos meios de cultura utilizados.

Células cuja proliferação se testou.

Células alogénicas usadas para co-estimular a proliferação, após exposição a 2500 rad.

⁴ As concentrações de nucleósido estão em molaridade multiplicada pelo número na coluna. As abreviaturas entre parêntesis 7a8oMGuo, 7a8oGuo e 8MGuo são definidas como anteriormen te.

⁵ Incorporação de /”⁵H_7Tdr em contagens por minuto.

Os resultados que se apresentam na Tabela anterior ilustram que o contacto de populações respondentes contendo células T com uma composição do presente invento, na presença de células estimulantes alogénicas provoca uma proliferação aumentada dessas células respondentes. Essa proliferação de células T induzida excede o efeito proliferativo provocado pelas próprias células alogénicas quando o derivado de guanosina-nucleósido estava ausente. Adicionalmente, comparações intra-estudos dos efeitos verificados usando um composto do presente invento quan do comparado com um composto anteriormente conhecido, 8MGuo, mostraram geralmente uma melhoria inesperada quando se usou um composto do presente invento.

Tendo descrito genericamente o presente invento pode terse uma compreensão adicional por referência a sinteses e a pro69 188

SCRF 124.OA

-65cedimentos que seguidamente se apresentam com propósitos de ilustraçSo.

VIII. Materiais e Métodos

A. Sínteses

Exemplo 1: Procedimento geral para a preparação de 8-oxoguanosinas 7-hidrocarbil-substituidas

Utilizou-se a l-amino-8-oxoguanosina (aqui depois designada por composto A) como material de partida para várias sínteses usando um procedimento a dois passos. Esse material foi preparado essencialmente como se descreve em Rizkalla et al., Bi ochim Biophys. Actà., 195:285-295 (1969).

Passo 1:

A uma solução do composto A [_ 9,5 grama (g), 30 milimoles (mmole)_7 em dimetilformamida (DMF), adicionou-se metóxido de sédio (33 mmole) em 250 mililitro (ml) de DMF. Agitou-se a mis. tura reaccional à temperatura ambiente (cerca de 18-22°C) duran te 30 minutos. Adicionou-se uma solução em DMF (10 ml), conten do o agente alquilante, usado para formar o substituinte na posição 7, em ligeiro excesso molar em relação ao Composto A (p. e., 33 mmole vs. 30 mmole), e agitou-se a mistura reaccional alquilante resultante, durante um período de tempo de cerca de 16 horas a uma temperatura de cerca de 20 a cerca de 40°C.

Removeu-se depois o solvente in vacuo e tratou-se o resíduo com água destilada ou desionizada (150 ml) e com diclorome tano (150 ml). Filtrou-se o sólido obtido e recristalizou-se a partir de um solvente apropriado por forma a obter-se a 1-amino-8-oxoguanosina 7-substituída, e completa-se o Passo 1 do procedimento de sintese a dois passos normalmente usada.

Passo 2

Depois dissolveu-se o produto do Passo 1 em HC1 concentra do (p.e., 4,65 mmole em 15 ml de HCl), adicionando-se nitrito

188

SCRF 124.OA

-66de sódio aquoso (p.e. 4,19 nunole em 5 ml de água) a zero graus C, agitando-se seguidamente durante cerca de uma hora. 0 produto desaminado resultante foi depois obtido por técnicas de cristalização convencionais, a não ser onde se indique outro processo.

Descreve-se seguidamente a preparação de exemplos de compostos específicos, usando o método a dois passos anterior e outros métodos, hem como outras sinteses.

Exemplo 2: 7-Butil-8-oxoguanosina (23644)

Seguindo,o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando iodeto de butilo como agente alquilante, obteve-se o compos to do título, com um rendimento global de 15 por cento, na for ma de um pó branco com um ponto de fusão superior a 230°G.

RMN (DMSO-dg):δ 10,8 (bs,lH); 6,4(bs,2H); 5,6(d, J=5Hz, 1H).

I.V. (KBr): 1680, 1610 e 1510 cm^-1.

Análise Calculada nara o C-, Nr-0<:

2 5 6

C, 47,32; H, 5,96; N, 19,71

Encontrado: C, 47,03; H, 5,86; N, 19,56.

Exemplo 3: 7-(2-Butenil)-8-oxoguanosina (23679)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando brometo de 2-butenilo como agente alquilante, obteve-se o composto do título, com um rendimento global de 10 por cento, na forma de um pó branco com um ponto de fusão de 167-17O°C. RMN(DMSO-dg): δ 10,7 (bs, 1 H); 6,4(bs, 2H); 5,4-5,6(bs, 3H); 3,3(bs, 3H). IV (KBr): 1690, 1650 e 1600 cm

Análise calculada nara o C, .H. _nN_c0<-H_o0:

19 5 6 2

C, 45,28; H, 5,70; N, 18,86 Encontrado: C, 45,16; H, 5,61; N, 18,82.

Exemplo 4: 7-Hexil-8-oxoguanosina (23924)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando iodeto de hexilo como agente alquilante, obteve-se o compos

188

SCRF 124.OA

-67to do título, com um rendimento global de 8% na forma de um pó castanho claro com um ponto de fusão de 196-199°O. RMN (DMSOôl0,8(bs, 1H); 6,5(bs, 2H). IV (KBr) :1680, 1640, e 1600 cm~

Anal. Calculada para o 6^25^5^6’

0, 50,12; H, 6,57; N, 18,27

Encontrado: G, 49,93; H, 6,52; N, 18,24 Exemplo 5: 7-Fropil-8-oxoguanosina (24069)

Agitou-se uma mistura de 7-alil-8-oxoguanosina (Exemplo 8; l,0g, 2,9 mmole), 10% de Fd em carvão activado (100 mg) e etanol (100 ml), à temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidro génio durante 3 horas. Filtrou-se o catalizador através de um leito de Celite e lavou-se com etanol (100 ml). Concentrou-se o filtrado combinado in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em meta nol (20 ml) e tratou-se com éter (200 ml). Filtrou-se o sólido resultante e secou-se a 60°C obtendo-se o composto do título, com um rendimento de 55%, na forma de um pó branco com um ponto de fusão de 151-153°C. RMN(DMSO-dg): δ10,8(bs,lH); 6,5(bs, 2H); 5,5(d J=5,5Hz, 1H); 0,8(d, J=7Hz, 3H). IV (KBr): 1680 e 1640 cm \

Análise calculada para o ^C13^H19^N5°6^:

0, 45,75; H, 5,61; N, 20,56

Encontrado: C, 45,41; H, 5,56; N, 20,09.

Exemplo 6: 7-Etil-8-oxoguanosina (23643)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando iodeto de etilo como agente alquilante, obteve-se o composto do título, com um rendimento global de 15 por cento, na for ma de um pó branco com um ponto de fusão de 185-187°C. RMN(DMSO-d₆): J 6,7(bs; 2H); 5,7(d, J=5Hz, 1 H); 1,2 (t, J=6Hz, 3H). IV(KBr): 1680, 1640, 1610 e 1460 cm^-1.

Análise calculada para ο Ο-^Η^γΝ^Ο^.Ι/^ϊ^Ο:

C, 42,86; H, 5,39; N, 20,82

Encontrado: C, 43,17; H, 5,24; N, 20,45.

X

188 /g./L.

SCRF 124.OA

-68Exemplo 7: 7-Decil-8-oxoguanosina (25894)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando iodeto de decilo como agente alquilante, obteve-se o composi to do título, com um rendimento global de 10 por cento, na for ma de um pó branco com um ponto de fusão de 174-176°C. RMN(LMSO-d₆): 610,8(bs, 1 H); 6,4(bs, 2H); 5,6(d, J=5Hz, 1 H). IV(KBr): 1690, 1590 e 1450 cm^-1.

Análise calculada para ο ^20^33^5°6^:

C, 54,66; H, 7,57; N, 15,93

Encontrado: C, 54,17; H, 7,44; N, 15,90.

Exemplo 8: 7-(2-Propenil)-8-oxoguanosina (21757) ^Também, 7-alil-8-oxoguanosina_7

Na preparação do composto do título, que é também aqui de signado por 7-alil-8-oxoguanosina, utilizaram-se dois procedimentos .

Procedimento 1

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usando brometo de alilo (3-bromopropeno) como agente alquilante, preparou-se o composto do título a partir do composto de 1-amino correspondente, com um rendimento de 40 por cento, na forma de um pó branco com um ponto de fusão de 23O-231°C. RMN(DMSO-dg) 6 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 6,5 (bs, 2H); 10,8 (bs, 1H). IV (KBr): 1660, 1590 e 1560 cm

Análise calculada para ο ^ρ₂^17^3θ6^:

0, 46,02; H, 5,05; N, 20,64

Encontrado: C, 45,63; H, 5,10; N, 20,56.

Procedimento 2

A. Passo 1: 8-(2-Propenil)oxiguanosina

Aqueceu-se uma mistura de 8-bromoguanosina (p.e., da Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo E.U.A. 10 g, 29,5 mmole), hidreto de sódio (60% em éleo, 5 g, 125 mmole), alil-alcóol •x

138 SCRF 124.OA

-69(20 ml) e dimetilsulfoxido (DKSO: 200 ml), a 60°C sob durante 3 horas. Deixou-se a mistura arrefecer até uma temperatura próxima da temperatura ambiente e depois, adicionou-se a éter etílico (l litro) obtendo-se um precipitado cinzento.

Decantou-se a fase de éter e desprezou-se. Tratou-se o resíduo sólido com água (50 ml) e com ácido acético (10 ml). Filtrou-se o sólido e purificou-se por HPDC de fase inversa (C-18) obtendo-se o éter de 2-propenilo na forma de um pó bran co com um rendimento de 20 por cento (1,8 g). RMN (DKSO-d^): ô 6,3 (bs, 2H); 6,2-5,8 (m, 1H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H).

B. Passo 2: 7-alil-8-oxoguanosina

Aqueceu-se uma mistura de 8-(2-propenil)-oxiguanosina (40 ml, 0,12 mmole) em água (50 ml) ao refluxo durante 3 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e obteve-se o composto do título por HPDC de fase inversa (C-18) com um rendimento de 85 por cento.

Exemplo 9: 7-(2-Propenil)-S-tioxoguanosina ^Também, 7-alil-8-tioxoguanosina_7 (22444) composto do título, também aqui designado por 7-alil-8-tioxoguanosina e por 7-alil-8-mer capto guano sina (7a8MG-uo) foi preparado a partir da 8-(2-propenilmercapto)guanosina usando dois procedimentos de rearranjo diferentes.

A. Passo 1: 8-(2-propenilmercapto)guano sina (22300)

A uma mistura de 8-tioxoguanosina (20 g, 63,5 mmole) e de carbonato de potássio (10 g, 72 mmole) em DMF (300 ml), adi cio. nou-se brometo de alilo (8 g, 63,5 mmole) e aqueceu-se a mistu ra resultante com agitação a uma temperatura de 45°C durante 90 minutos.

Arrefeceu-se depois a mistura até à temperatura ambiente e adicionou-se a uma solução de éter etílico (1,4 1) e ácido acético (5 ml). Filtrou-se o sólido resultante e lavou-se com água (250 ml), com acetona (200 ml), e depois, com éter etilico,

188

SCRF 124.OA

-70e secou-se depois numa estufa a 60°C obtendo-se o tioéter do título (14,7 g, 67 por cento de rendimento) na forma de um pó branco com um ponto de fusão de 225°C (decompõe-se).

RMN (DMSO-dg): δ 5,70-5,91 (m, 2H); 6,38 (bs, 2H). IV (KBr): 1700, 1640 e 1610 cm¹.

Análise calculada para o C^^H^yN^O^S:

C, 43,93; H, 4,82; N, 19,71

Encontrado: C, 44,10; H, 4,82; N, 19,69.

B. Re arranjo

Passo 2: Procedimento 1: 7-alil-8-tioxoguanosina

A uma suspensão de 8-(2-propenilmercapto)guanosina (20 g, 56,3 mmole) como material de partida, em clorofórmio (500 ml ), adicionou-se bistrimetilsililacetamida (72 g, 354,7 mmole), e aqueceu-se a mistura resultante, ao refluxo sob durante 16 horas. Após arrefecimento, removeu-se a maior parte do solven te in vacuo e aqueceu-se o resíduo a 40°C in vacuo durante 6 horas.

Misturou-se o resíduo oleoso com tetra-hidrofurano (500 ml), PdCl^ (10,3 g, 58,3 mmole) e benzonitrilo (12,1 g, 117 mmole), e aqueceu-se a mistura ao refluxo sob durante 3 horas. Arrefeceu-se depois essa mistura até à temperatura ambiente, misturou-se também com piridina (25 ml) e agitou-se de um dia para o outro (durante cerca de 16 horas). Filtrou-se a mistura através de sílica gel e lavou-se com diclorometano (2x 300 ml). Concentrou-se o filtrado combinado in vacuo e misturou-se o resíduo com uma mistura de água, metanol e ácido acético (500 ml; 10:10:1) e agitou-se durante um período adicional de cerca de 16 horas. »

Removeu-se a maior parte dos solventes adicionados in vacuo dissolveu-se o resíduo em DMF (l litro) e tratou-se depois com carvão activado. Filtrou-se a suspensão assim obtida através de um leito de celite e concentrou-se o filtrado in vacuo.

188

SCRF 124.OA

-71Tratou-se o resíduo com metanol e filtrou-se o sólido resultan te, lavou-se com acetona e secou-se numa estufa a 60°C obtendo, -se a 7-alil-8-tioxoguanosina (8,5 g, 42,5 por cento de rendimento) na forma de um pó esbranquiçado com um ponto de fusão superior a 230°C. RMN (DMSO-d^):δ 5,90 (m, 1H); 6,32 (d, J=5Hz, 1H); 6,56 (bs, 2H); 10,60 (bs, 1H). IV (KBr): 1700, 1635, 1605 e 1450 cm”⁴.

Análise calculada para o

0, 43,93; H, 4,82; N, 19,71

Encontrado: C, 43,96; H, 4,87; N, 19,62.

Passo 2: Procedimento 2: 7-alil-8-tioxoguanosina

Aqueceu-se uma solução contendo a 8-(2-propenilmercapto)guanosina (60 g), como material de partida, em DMF (60 g), a uma temperatura de banho de 130°C sob azoto, durante um período de 9 dias. Arrefeceu-se a mistura reaccional resultante até a temperatura ambiente e removeu-se o solvente in vacuo. Tratou-se o resíduo com metanol. Filtrou-se o sólido resultante e lavou-se com acetona, e secou-se depois numa estufa a 60°0 obtendo-se o composto do título (21 g, 36 por cento de rendimento) na forma de um pó esbranquiçado.

Exemplo 10: 7-(2-Propenil)-8-selenoxoguanosina (23369 ) composto do título, também aqui designado por 7-alil-8-selenoxoguanosina, foi preparado fazendo reagir 8-selenoxoguanosina /“chu et al., J. Med. Chem., 18:559-564 (1975)_7 e brometo de alilo, tal como se descreve no Exemplo 9, seguindo-se um rearranjo térmico. Recristalizou-se o produto a partir de água e secou-se, ponto de fusão 227-230°C.

Análise calculada para o C, 38,28; H,

Encontrado: C, 38,77; H, ^G13^H17^N5°5^Se· 4,26; N, 17,41 4,25; N, 16,92.

Exemplo 11: 7-/~(3-Fenil)-2-propenil_7-8-oxoguanoslna (também, 7-cinamil-8-oxoguanosina) (22827)

188

SCRF 124.OA

-720 composto do título foi preparado a partir do derivado de 1-amino correspondente seguindo o procedimento geral a dois passos do Exemplo 1. No Passo 2, a uma solução dessa 1-amino~1-L (3-fenil)-2-propenil_7-8-oxoguanosina (2 g, 4,65 mmole) em HC1 concentrado (15 ml) adicionou-se nitrito de sódio (0,29 g, 4,19 mmole) em água (5 ml), a zero graus. Agitou-se a mistura resultante durante uma hora. Removeu-se a maior parte do solvente in vacuo obtendo-se um sólido amarelo claro. Triturou-se esse sólido com metanol obtendo-se o composto do título na forma de um pó branco (65 por cento de rendimento), com um ponto de fusSo de 240°C. RMN (DMSO-dg):δ 10,8 (bs, 1H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1680, 1610 e 1530 cm^-1.

^C19^H21^N5°6^:

5,10; N, 16,86 5,10; N, 16,90.

Exemplo 12: 8-0ianoimino-7-(2-propenil)guanosina (24328)

Análise calculada para o C, 54,94; H,

Encontrado: G, 54,70; H,

A uma solução de 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina (Exemplo 9; 10 g 28,2 mmole) em DMSO (200 ml) adicionou-se iodeto de me tilo (6 g, 42,3 mmole) à temperatura ambiente sob azoto, e agi tou-se a mistura resultante durante 3 horas. Arrefeceu-se a mistura a zero graus G e adicionou-se cianimida (2,4 g, 56,5 mmole) seguida de hidreto de sódio (dispersão em óleo a 60%, 1,79 g, 44,8 mmole). Deixou-se a mistura resultante aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 1 hora.

Adicionou-se a mistura a éter etílico (l,4 l) e agitou-se durante 10 minutos. Decantou-se a fase orgânica e tratou-se ainda o resíduo com éter etílico (1,4 1) e com ácido acético (50 ml). Decantou-se a fase orgânica e dissolveu-se o resíduo em água (500 ml).

Purificou-se a fase aquosa por HPLC de fase inversa (C-18) obtendo-se o composto do título com um rendimento de 35%, na forma de um pó branco com um ponto de fusão de 194-197°C.

RMN (DMSO-dg): 611,0 (bs, 1H); 6,5(bs, 2H), 5,5 (d, J=5Hz, 1H).

188

SCRF 124.OA

-73IV (KBr): 2190, 1700 e 1640 cm^-1.

Análise calculada para o C, 45,16; H,

Encontrado: C, 45,00; H, ^C14¾7^N7^O5~¹/^{2 H}2°* 4,87; N, 26,33 4,66; N, 26,07.

Exemplo 13: 8-(2-Butenilmercapto)guanosina (22455)

Seguindo o primeiro procedimento para a preparação da 8-(2-propenilmercapto)guanosina (Exemplo 9), mas substituindo o brometo de alilo por cloreto de 2-butenilo, obteve-se o com posto do título, com um rendimento de 48 por cento, na forma de um pó branpo com um ponto de fusão de 210°C (decompõe-se). RMN (DMS0-d_&): 6 6,3 (bs, 2H); 5,6 (d, J=5Hz, 1H); 1,6 (d, J=6Hz, 3H). IV (KBr); 1690, 1630, 1600, 1510 e 1365 cm'

Análise calculada para o C-^^H^gN^O^S:

C, 45,52; H, 5,18; N, 18,96

Encontrado: C, 45,38; H, 5,32; N, 18,79. Exemplo 14: 8-(cinamilmercapto)guanosina (22359)

Seguindo o procedimento para a preparação da 8-(2-propenilmercapto)guanosina (Exemplo 9A), mas substituindo o brometo de alilo por brometo de cinamilo, obteve-se o composto do títu lo, com um rendimento de 33 por cento na forma de um pó esbran quiçado com um ponto de fusão de 172°C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg): 07,25 (br, 5H); 6,7-6,2 (m, 4H); 5,7 (d, J=5Hz, 1H).

IV (KBr): 1690, 1640 e 1600 cm^-1.

Análise calculada para o C, 52,89; H,

Encontrado: C, 53,26; H, ^19^21^05S:

2,91; N, 16,23 4,90; N, 16,08.

Exemplo 15: Hemi-hidrato de 7-(2-Fropenil)-8-tloxo-2¹,5¹-0-isopropilidenoguanosina (23083)

Agitou-se uma mistura de 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina (Exemplo 9; 6 g, 16,9 mmole), 2,2-dimetoxipropano (5 ml, 40,7 mmole), acetona (200 ml) e ácido sulfurico concentrado (10 go69 188

SCRF 124.OA

-74tas), sob 1^2 à temperatura ambiente durante 52 horas. Arrefeceu-se a mistura a zero graus C e tratou-se com solução concen trada de hidróxido de amónio (5 ml). Removeu-se a maior parte do solvente in vacuo, e filtrou-se o sólido branco, lavou-se o sólido com água, depois com acetona e depois com éter etílico, e secou-se então numa estufa a 60°C obtendo-se o composto do título na forma de um pó amarelo claro, com um rendimento de 75 por cento, ponto de fusão 237°C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg): <51,32 (s, 3H); 1,52 (s, 3H); 5,92 (m, 1H); 6,58 (bs, 1H), 6,95 (bs, 2H). IV (KBr): 1695, 1630, 1600 e 1450 cm¹

Análise calculada para ο ^0:

C, 47,51; H, 5,48; N, 17,32

Encontrado: C, 47,08; H, 5,12; N, 17,30.

Exemplo 16: Hemi-hidrato de 7-cinamil-2',3¹-isopropilideno-8-oxoguanosina (23803)

Seguindo o procedimento do Exemplo 15, mas substituindo a 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina pela 7-cinamil-8-oxoguanosina (Exemplo 11), obteve-se o composto do título, com um rendimento de 35 por cento, na forma de um pó esbranquiçado com um pon to de fusão de 230°0. RMN (DMS0-d_g): ó 10,9(bs, 1H); 7,3-7,6 (m,5H); 6,6(bs, 2H), 6,4(m, 2H). IV (KBr): 1680, 1630, 1590, 1450, 1420 e 1380 cm¹.

Análise calculada para o :

0, 56,89; H, 5,64; N, 15,07

Encontrado: C, 57,08; H, 5,53; N, 15,12.

Exemplo 17: Hemi-hidrato de 8-Cianoimino-7-(2-propenil)2',3’-Q-isopropilidenoguanosina (24456)

Seguindo o procedimento do Exemplo 12, mas substituindo a 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina pela 7-(2-propenil)-8-tioxo-2',3'-0-isopropilidenoguanosina (Exemplo 15), obteve-se o com posto do título, com um rendimento de 51 por cento, na forma de um pó castanho claro com um ponto de fusão de 222°C (decom69 188

SCRF 124.OA

-75põe-se). RMN (DMSO-d^):ô 7,45(bs, 1H); 6,9 (bs, 2H); 6,2 (bs, 1H); 1,5 e 1,3 (ambos s, 3H cada). IV (KBr); 2185 e 1595 cm¹

Análise calculada para o C-^^H^^N^O^-l/l H^O:

C, 49,51; H, 5,38; N, 23,79

Encontrado: C, 49,34; H, 5,22; N, 23,06.

Exemplo 18: 5¹-Acetil-7-(2-propenil)-2¹,3¹-O-isopropilideno-8-tioxoguanosina (23287)

Agitou-se uma mistura de 7-(2-propenil)-2',3’-O-isopropilideno-8-tioxoguanosina (Exemplo 15; 1,2 g, 3 mmole), trietila mina (3 ml), anidrido acético (0,3 g, 2,9 mmole) e diclorometa no (100 ml), à temperatura ambiente durante 16 horas. Adicionou-se a mistura a água (100 ml), separou-se a fase orgânica, e extractou-se a fase aquosa com diclorometano (2x50 ml).

Secou-se a fase orgânica combinada (Na2SO^) e removeu-se o solvente in vacuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia de coluna em silica gel /^-100 g, acetato de etilo/hexano (9:1 v/v)_7 obtendo-se o composto do título na forma de um pó esbranquiçado (950 mg), com um rendimento de 70 por cento, ponto de fusão 179°C (decompõe-se). RMN (DMSO-dg): ó11,1 (bs, 1H); 6,85 (bs, 2H); 6,6 (s, 1H); 2,01 (s, 3H); 1,45 e 1,32 (ambos s, 3H cada). IV (KBr): 1730, 1710, 1680 e 1630 cm^-1.

Análise calculada para o C^g^^N^OgS:

0, 49,42; H, 5,30; N, 16,01

Encontrado: C, 49,33; H, 5,36; N, 15,50.

Exemplo 19: 7-(2-Propenil)-6,5¹-dibenzoil-2',3¹-O-isopropilideno-8-tioxoguanosina (22314)

Seguindo o procedimento geral do Exemplo 18, mas substituindo o anidrido acético por cloreto de benzoilo, obteve-se o composto do título na forma de um pó amarelo com um rendimento de 12 por cento, ponto de fusão 99-101°C. RMN (CDCl^): δ 8,3-7,4 (m, 10H), 6,85 (d, J=lHz, 1H); 1,61 e 1,38 (ambos s, 3H cada). IV (KBr): 1760, 1720, 1640, 1600 e 1450 cm^-1.

188

SCRF 124.OA

-76Análise calculada para ο

0, 59,69; H, 4,84; N, 11,60

Encontrado: C, 59,73; H, 4,88; N, 11,49.

Exemplo 20: Hemi-hidrato de 7-(2-Propenil)-2-N,5’-0-dibenzoil-2’,3’-0-isopropilideno-8-tioxoguanosina

Por eluição contínua da coluna de silica gel usada para purificação no Exemplo 19, com acetato de etilo/hexano (3:7 v/v) obteve-se o composto do título na forma de um pó amarelo claro com um rendimento de 20 por cento, ponto de fusão 134-136°C. RMN (CDCl^): δίΟ,Ι (bs, 1H); 8,2-7,3 (m, 10H); 1,65 e 1,34 (ambos s, 3H cada). IV (KBr): 1710, 1680, 1610 e 1588 cm \

Análise calculada por Ο^θ^θΝ^Ογβ-ΐ/Ζ Σ^Ο:

C, 58,81; Ξ, 4,94; N, 11,43

Encontrado: C, 58,77; H, 4,82; N, 11,50.

Exemplo 21: Quarter-hidrato de 7-(2-propenil)-5'-benzoil-2¹,3'-0-isopropilidenoguanosina-8-tioxoguanosina (23351)

Ainda por outra eluição da coluna de silica gel usada nos Exemplos 19 e 20 com acetato de etilo/hexano (4:1 v/v) obteve-se o composto do título, na forma de um pó amarelo claro, com um rendimento de 21 por cento, ponto de fusão 214°C (decompõe-se). RMN (DMSO-dç): δ 11,1 (bs, 1H); 7,9-7,3 (m, 5H); 6,7 (bs, 2H); 6,6 (s, 1H); 1,6 e 1,4 (ambos s, 3H cada). IV (KBr): 1700; 1630, 1590 e 1450 cm \

Análise calculada para o :

C, 54,80; H, 5,10; N, 13,90

Encontrado: C, 54,77; H, 4,99; N, 13,85.

Exemplo 22: 7-(2-Propenil)-8-tioxo-2',3¹,5'-triacetilguanosina (22360)

A uma mistura de 7-(2-propenil)-8-tioxoguanosina (7a8MGuo; 1 g, 2,8 mmole), trietilamina (2 ml), anidrido acético (1,2 ml,

188

SCRF 124.OA

-7713 mmole) e diclorometano (50 ml) adicionou-se 4-N,N-dimetilamino-piridina (10 mg). Agitou-se a mistura reaccional resultante sob N^, durante 16 horas à temperatura ambiente.

Adicionou-se mais diclorometano (50 ml) e lavou-se a solução com HC1 IN, salmoura, e depois, com água, e secou-se (Na^SO^). Removeu-se o solvente in vacuo e purificou-se o resíduo por cromatografia de coluna em silica gel (200 g) usando acetato de etilo como eluente. Obteve-se o composto do título na forma de um pó amarelo claro com um rendimento de 54 por cen to, ponto de fusão 100-102°C. RMN (CDGl^):6 2,01 (s, 3H); 2,10 (s, 6H); 6,79' (d, J=3Hz, 1H). IV (KBr): 1740, 1690, 1630, 1450 e 1230 cm 1.·

Análise calculada para o C^gí^N^OgS:

0, 47,39; H, 4,82; N, 14,55

Encontrado: C, 47,29; H, 4,84; N, 14,19.

Numa segunda preparação em maior escala do composto do título obteve-se esse composto com um rendimento de 26 por cen to, e também a 7-(2-propenil)-8-tioxo-2¹,3’,5’, 2-N-tetra-acetilguanosina (25177) com um rendimento de 40 por cento, ponto de fusão 90-92°0. RMN (DMSO-dg):δ 12,1 (bs, 1H); 11,4 (s, 1H);

6,4 (d, J=5Hz, 1H); 2,15, 2,00,1,94 e 1,90 (ambos s, 3H cada). IV (KBr): 1750 e 1690 cm^-1.

Análise calculada oara o C_o-,H_ocNr-O_nS:

25 5 9

G, 48,18; H, 4,81; N, 13,38

Encontrado: G, 48,20; H, 4,69; N, 13,32.

Exemplo 23: 7-Benzil-8-oxoguanosina (24234)

Seguindo o procedimento a dois passos do Exemplo 1, usan do brometo de benzilo como agente alquilante, obteve-se o com posto do título, com um rendimento global de 20%, na forma de um pó esbranquiçado com um ponto de fusão de 175°C. RMN (LMS0-d₆): 10,7 (bs,lH), 7,3 (s,5H), 6,4 (bs, 2H), 5,6 (d,

J=5Hz, 1H). IV (KBr): 1680, 1600 e 1450 cm^-1.

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SCRF 124.OA

C, 52,44; H, 4,92; N, 17,99

Encontrado: C, 52,47; H, 5,03; N, 17,10.

B. Exemplos de composições para administração.

Descrevem-se seguidamente exemplos de composições sólidas e líquidas, adequadas para administrar os compostos do presente invento, usando cinco dos derivados de guanina-nucleósido mais preferidos como exemplos de ingredientes activos. Comprimidos

Os comprimidos são preparados a partir dos ingredientes seguintes:

Fartes em peso

7-Alil-8-oxoguanosina lactose em pó Amido de milho seco SiO^ finamente dividida Polivinilpinolidona Estearato de magnésio

2.5

36.4

34.5

5.6 0,6 0,4

80,0

Mistura-se muito hem o derivado de guanosina com a lactose, 25 partes em peso de amido de milho e 4,0 partes em peso de SÍO2. A mistura resultante é depois uniformemenie molhada com uma solução etanólica a 5% de polivinilpinolidona. Faz-se depois passar a massa molhada através de um peneiro com uma ma lha de um milimetro para produzir um granulado. Seca-se o gra nulado resultante durante cerca de 24 horas a 60°C numa câmara de secagem. Faz-se passar, de novo, o granulado seco através de um peneiro com uma malha de um milimetro. Misturam-se 70,0 partes do granulado ohtido, num misturador adequado, com uma mistura consistindo na restante SÍO2, no restante amido de milho e em todo 0 estearato de magnésio, mistura esta que tinha sido previamente passada através de um peneiro com uma malha

188

SCRF 124.OA

-79de um milimetro. Prensa-se depois a mistura assim obtida em comprimidos pesando cada um 800 miligramas e contendo 25 miligramas da guanosina.

Cápsulas de amido

Os conteúdos das cápsulas são preparados a partir dos in gredientes seguintes.

Partes em peso

7-Butil-8-οχοguanosina 10,0 lactose 450,0

Amido de milho 540,0

1000,0

Mistura-se gradualmente o derivado de guanosina com a lac tose. Quando toda a lactose foi misturada, liga-se a mistura obtida com o amido de milho. Usa-se depois a mistura resultan te para encher cápsulas comportando 1,0 grama da mistura. Cada cápsula contém 10 miligramas do derivado de guanosina. Comprimidos

Prepara-se um lote de 10 000 comprimidos, contendo cada um 50 miligramas de 7-(2-butenil)-8-oxoguanosina a partir dos tipos e quantidades de ingredientes seguintes:

7-(2-Butenil)-8-oxoguanosina	500	grama
Fosfato de di-calcio	1000	grama
Metilcelulose, U.S.P. (15 cps)	75	grama
Talco	150	grama
Amido de milho	250	grama
Estearato de magnésio	25	grama

2000 grama

Misturam-se bem o derivado de guanosina e o fosfato de di -cálcio, granula-se a mistura com uma solução a 7,5 por cento de metilcelulose em água, faz-se passar a mistura através de

188

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-80um peneiro n- 8 (U.S.Standart Sieve Series) e seca-se cuidadosamente. Fazem-se passar os grânulos secos através de um pe neiro n- 12 (U.S.Std. Sieve Series), misturam-se bem com talco, o amido e o estearato de magnésio, e prensam-se em comprimidos .

Preparação Injectâvel

Prepara-se uma formulação estéril, adequada para injecção intramuscular, subcutânea ou intracavitária e contendo 50 mili grama de 7-benzil-8-oxoguanosina em cada mililitro de ingredientes, a partir dos tipos e quantidades de ingredientes seguin tes:

7-benzil-8-oxoguanosina 5 grama

Solução salina fidiolégica 98 mililitro

Óleo de sésamo 2 mililitro

Misturam-se o derivado de guanosina e a solução salina e sonicam-se por um período de tempo suficiente para se obter uma dispersão substancialmente homogénea. Mistura-se depois o óleo de sésamo e homogeniza-se a nova mistura de um modo similar por forma a obter-se uma emulsão. Após a emulsionação injectam-se cinco a quinze por cento do volume final desta preparação estéril, subcutânea ou intraperitonealmente, uma ou duas vezes por semana para melhorar a imunidade.

Formulação aquosa para uso oral

Prepara-se uma formulação aquosa, para uso oral, contendo cada 5 mililitros (1 colher de chá) 25 mg de 7-propil-8-oxogua nosina, a partir dos ingredientes seguintes:

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7-Propil-8-oxoguanosina		5,0	grama
Metilparapeno, U.S.P.		0,75	grama
Propilparapeno, U.S.P.		0,25	grama
Sacarina-sódio		1,25	grama
Ciclamato de sódio		0,25	grama
Glicerina		300	mililitro
Pó de tragacanto		1,0	grama
Sabor de óleo de laranja		1,0	grama
Corante laranja F.D. e C.		0,75	grama
Água desionizada	q.s. para	1000	mililitro

C. Métodos

Culturas de linfócitos. 0 meio de cultura contendo soro foi preparado para conter, por 100 mililitros, o seguinte:

91,9 mililitros de RPMI 1640 (Flow Laboratories, Inc. Rockville MD, E.U.A.), 0,1 mililitros de 100 x glutamina, 1,0 mililitro de 100 x piruvato de sódio, 1,0 mililitro de 50 x aminoácidos não essenciais, 1,0 mililitro de água contendo 10⁴ unidades de penicilina G e 10⁴ microgramas de estreptomicina, e 5,0 mi lilitros de um lote suportante de soro fetal de vitelo (FCS). Misturaram-se estes ingredientes até uma homogeneidade aparente. Prepararam-se suspensões de células do baço e populações enriquecidas com células B esplénicas, tal como se descreve em Goodman et al., J. Immunol., 121:1905 (1978).

Para avaliação da imuno-resposta humoral primária a eritro 6 *7 eitos de ovelha (SRBC), cultivaram-se 5x10 a 10 células de baço murinas em 1,0 mililitro de meio contendo 5% de FCS, durante 4 ou 5 dias, na presença e na ausência de imunogénio. Incubaram-se as células em placas de cultura (Costar, Cambridge MA, E.U.A.) a 37°G numa atmosfera humidificada de 10% de CO2 em ar usando caixas de cultura de tecido (CBS Scientific, Del Mar, GA, E.U.A.) que foram agitadas a uma frequência de 7 ciclos por minuto. 0 SRBC em meio líquido está disponível na

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-82Colorado Serum Co., Denver CO, E.U.A..

Prepararam-se linfocitos de sangue periférico humano (PBL), a partir de sangue venoso heparinizado normal, por centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll-diatrizoato. Os PBL foram desprovidos de células T supressoras, compreendendo o re ceptor de histamina tipo 2, fazendo com que eles aderissem às superfícies de caixas de petri de plástico revestidas com histamina-albumina de soro de coelho (Cell-ect 2 kit; Seragen, Boston, MA, E.U.A.) e recuperando as células não aderentes por lavagem tal como se descreve em Wysocki e Sato, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 75:2844 (1978) e como foi modificado por Cavagnaro e Osband, Biotechniques, Janeiro/Fevereiro:30 (1983).

meio de cultura utilizado nestes estudos para linfocitos humanos foi preparado como se segue: Cem mililitros (ml) conti nham 87,9 ml de RPMI 1640 (Flow Laboratories, Rockville, MD,

E.U.A.), 0,1 ml de 100 x glutamina, 1,0 ml de tampão HEPES 1,0

M (Microbiological Associates, Betheseda, MD, E.U.A.), 1,0 ml , a 4 de água contendo 10 U de penicilina G e 10 microgramas de es. treptomicina, e 10 ml de plasma desactivado por calor autologo fresco. Para avaliação da imuno-resposta humoral primária ao SRBC, cultivaram-se células linfoides, preparadas como anteriormente, a uma densidade de 2xl0^/ml num volume de 1,0 ml contendo 5x10 SRBC como antigénio (Colorado Serum Co., Denver Co, E.U.A.) conjuntamente com IL-2 (obteve-se uma preparação parei almente purificada de IL-2 humana, que estava isenta de activi dade de interferon-gama, na Electro-Nucleonics, Inc., Silver Spring, MD, E.U.A.) e com o derivado de guanina-nucleósido.

Teste de células formando placas (PFC). As PFC segregando anticorpos contra o SRBC foram avaliadas após 4 ou 5 dias de cul tura usando uma modificação do ensaio de placa hemolitica de Jer ne e Nordin, Science, 140:405 (1963). As células foram cultivadas em meio completo antes da formação das placas; foram colocadas em placas em agarose de baixo M padrão (Bio-Rad La69 188

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-83boratories, Richmond CA, E.U.A.) e incubaram-se em complemento de cobaia absorvido com SRBC, durante uma hora após 1,5 hora de incubação sem complemento.

Actividade de substituição de células T. Cultivaram-se 5x10^ células B de ratinho CBA/OaJ, viáveis. Tal como aqui depois se descreve em maior pormenor, estas células foram geradas tratando sequencialmente células de baço, primeiro com anticorpos monoclonais que fixam o complemento dirigidos contra antigénios thy 1,2 de células T e depois, com complemento para lisar quaisquer células T presentes (New England Nuclear, Boston, MA, E;U.A.). As células assim tratadas foram depois cultivadas com ou sem 0,1 ml de SRBC a 0,1 por cento (v/v), como imunozénio, em meio contendo soro, contendo também quan tidades incrementais de derivado de guanosina numa quantidade -4 compreendida entre zero e 10 molar. As FFC directas em relação ao SRBC são determinadas 4 dias depois.

Ratinhos. Os ratinhos CBA/CaJ, com 8-16 semanas de idade são adquiridos no Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, E.U.A. Um núcleo de criação de ratinhos CBA/N foi fornecido pela Animal Production Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD, E.U.A.. Os ratinhos SJ1, BDF^ e C57BL/6J com 8-16 semanas de idade foram obtidos na instalação de criação de ratinhos na Scripps Clinic and Research Foundation, Da Jolla, CA, E.U.A.. Todos os ratinhos foram mantidos com pelotas Wayne Dab Blox F6 (Allied Mills, Inc., Chicago IL, E.U.A. e com água clorada acidificada com HC1 a um valor de pH de 3,0.

Preparações de células. As suspensões de células do baço e do timo foram preparadas tal como se descreve em Goodman et al., J. Immunol., 121:1905 (1978). As populações enriquecidas —“ Q com células B foram preparadas tratando 10 células de baço com uma diluição 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-Thy 1,2 (New England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.) durante 30 minutos a 4°C. As células tratadas foram centrifugadas a 280 x g du69 188

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-84rante 10 minutos, removeram-se os anticorpos e ressuspenderam-se as células numa diluição 1:6 de CBA RBC-complemento de cobaia absorvido a 37°C durante 45 minutos. As células foram de pois lavadas e cultivadas tal como anteriormente.

Injecções. Os ratinhos foram injectados i.p. com uma solução contendo 50 /íg de TNB-BSA. Cerca de 30 minutos após a injecção de imunização, os dois grupos de seis ratinhos receberam também injecções, de 0,2 ml i.p., de 7a8MGuo em óleo de sésamo a 100 por cento ou em 2 por cento (v/v) de óleo de sésamo sonicado em solução salina normal, estando a 7a8MGuo presente numa concentração de 5 mg/ml. Um terceiro grupo de 6 ratinhos recebeu a imunização mas não recebeu derivado de guanosina. Os títulos de anticorpos anti-TNB-BSA foram determina dos usando técnicas convencionais.

Activação de células T auxiliares. Culti var am-se 1,5x10 células de baço de ratinho SJL ou timocitos de ratinho CBA/CaJ viáveis, com ou sem um número igual de células de baço irradia das (2500 rads) de ratinhos CBA/CaJ ou BDF^, respectivamente, em 0,2 ml de meio de cultura na presença de concentrações incrementais dos derivados de guanina 7,8-dissubstituídos exemplares. 0 meio de cultura de linfócitos utilizados foi o que anteriormente se descreveu e foi ainda suplementado com 2-mer captoetanol até uma concentração final de 50 /λΜ. As culturas de timocitos continham também 10 por cento (v/v) de um meio de células de baço de ratazana, condicionado com concanavalina A, vendido com o nome de Rat T Cell Monoclone pela Oollaborative Research. Após 90 horas de cultura, misturou-se um microCurie de H_7TdR por cultura, e manteve-se a cultura resultante du rante um período adicional de seis horas.

Colheram-se as culturas com um colhedor de células Brandel (M24V, Biological Research and Development Laboratories, Rockville, MD, E.U.A.) para discos de filtro de fibra de vidro.

Os discos de filtro foram transferidos para frascos de cinti69 188

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-85lação de plástico, cobertos com meio líquido de cintilação, e contados num contador de cintilação de líquido Beckman LS57OO.

Descreveu-se o presente invento em relação às suas concre tizações preferidas. Será evidente para os peritos na arte que se podem realizar modificações e/ou variações da matéria que se acabou de descrever sem se afastarem do espirito da invenção aqui apresentada.

188

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Claims (4)

REIYIHDICAgÕSS

1^. - Processo de preparação de um derivado de guanina-nucleósido substituído com a fórmula onde

X é 0, S, Se ou NCN;

r! é um radical hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, com um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo;

2 3

R e R são radicais iguais ou diferentes seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo inferior, alcanoiloxilo inferior e benzoxilo, ou R^ e R^ constituem

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7^*

-90juntos um radical alquilidenodioxilo inferior;

A

R é um radical seleccionado do grupo consistindo de hidro génio, alcanoilo inferior e benzoilo;

e dos seus sais de adição de base, não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

11^. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos leucócitos serem postos em contacto in vitro num meio de cultura.

12ã. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracte rizado por os referidos leucócitos serem células B, células T ou neutrófilos.

13-. - Processo de preparação de um derivado da purina compreendendo os passos de:

(a) obtenção de um material de partida de purina substituída na posição 8 por um radical -X-CH^CR^^, onde X é sele^ cionado do grupo consistindo de S, 0 e Se e onde R é hidrogénio alquilo inferior e benzilo incluindo ainda o referido material de partida de purina um grupo bloqueante ligado ao átomo de azo to da posição 9;

(b) aquecimento do referido material de partida de purina a uma temperatura elevada de cerca de 50°G a cerca de 200°C; e (c) manutenção da referida temperatura elevada por um período de tempo suficiente para formar um produto de purina rearranjada substituído (i) na posição 8 pelo grupo =X, onde X no referido produto ê igual ao X no material de partida de purina, e (ii) na posição 7 por um grupo -Cí^-CR^C^.

14-. - Processo do o passo adicional rina produto.

de acordo com a reivindicação 13, incluin de isolamento da referida molécula de pu

15^â. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado por o referido meio de solvente líquido incluir ainda uma quantidade catalítica de PdC^, e por o referido material

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-91de partida de purina ser aquecido a uma temperatura de cerca de 5O°C a cerca de 100°C.

16§. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caract£ rizado por o átomo de azoto na posição 9 estar ligado 9-1'-beta a um radical ribosilo ou desoxi-ribosilo como o referido grupo bloque ante.

17-. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado por o referido material de partida de purina ser a 8-(2-propenil)oxiguanosina.

Lisboa,

2 3

R e R são radicais iguais ou diferentes seleccionados entre os do grupo consistindo de hidrogénio, hidroxilo, alca2 3 noiloxilo inferior e benzoxilo, ou R e R constituem juntos um radical alquilidenodioxilo inferior;

R é um radical seleccionado entre os do grupo consistindo de hidrogénio, alcanoilo inferior, e benzoilo; e dos seus sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por:

a) se reagir l-amino-8-oxoguanosina com um agente de alquilação que é um composto hidrocarbilo de cadeia linear, cíclica ou ramificada, possuindo um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo, para formar um produto l-amino-7-substituída-8-oxoguanosina;

b) se isolar o produto do passo a);

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-87c) se dissolver o referido produto isolado do passo b) em HC1 concentrado para formar uma solução;

d) se misturar a referida solução do passo c) com nitrito de sódio aquoso e se manter a mistura resultante durante um período de tempo suficiente para desaminar o grupo amino da referida l-amino-7-substituída-8-oxoguanosina; e

e) se isolar o produto 7-substituída-8-oxoguanosina resul tante;

ou a’) se reagir 8-tioxoguanosina com um agente de alquilação que possui a estrutura Br-CH^- CR=CH₂ na qual R é hidrogé nio, alquilo inferior ou benzilo, para formar um produto 8-tio xoguanosina cujo átomo de enxofre na posição 8 está substituído por um grupo -CH₂-CR=CH₂;

b^f) se aquecer o referido produto a uma temperatura de cerca de 50° a cerca de 200°C para formar um produto 7-substituída-8-tioxoguanosina, cujo 7-substituinte tem a estrutura -CH₂CR=CH₂; e c’) se isolar o referido produto 7-substituída-8-tioxoguanosina, ou a'¹) se reagir o produto isolado no passo c') com um agen te de 3-alquilação para formar um produto S-alquilado;

b’’) se isolar o referido produto S-alquilado;

c¹’) se reagir o referido produto S-alquilado isolado com seleneto de sódio para formar um produto 7-substituída-8-selenoxoguanosina; e d'·) se isolar o referido produto do passo c’’); ou a'’¹) se reagir o produto isolado do passo b’ ' ) com ciana mida e com hidreto de sódio para formar um produto 7-substituí da-8-cianiminoguanosina; e b’’’) se isolar o referido produto do passo a'¹’); ou a’ ’ ’ ’ ) se reagir qualquer dos produtos isolados nos pas69 188

SCRF 124.OA

-88-tf* sos e), c’), d.'¹) ou b ’ ' ’) comum composto alquilidenodioxilo inferior, com um composto acilo inferior ou benzoilo para for b ’ ’ ’ ’) se isolar o produto do passo a’’'¹).

2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o agente de alquilação do passo a) ser seleccionado do grupo que consiste em iodeto de butilo, brometo de 2-buteni lo, iodeto de hexilo, brometo de alilo, brometo de cinamilo e brometo de benzilo.

3-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado por o referido agente de alquilação e o 7-substituinte do produto isolado no passo e) conterem insaturaçâo etilénica e por incluir os passos adicionais de i’) hidrogenação catalítica do produto isolado do passo 3) para formar um novo produto cujo 7-substituinte está saturado; e ii) isolamento do referido produto novo.

4^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado por o produto isolado do passo ii) ser 7-propil-8-oxoguanosina.

5-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o produto isolado do passo e) ser seleccionado do grupo consistindo em 7-alil-8-oxoguanosina; 7-butil-8-oxoguanosina; 7-(2-butenil)-8-oxoguanosina e 7-benzil-8-oxoguanosina.

6a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado por o produto isolado do passo b''¹’) ser 7-alil-8-tioxo-2^3^5¹ -triacetilguanosina.

7-. - Processo de preparação de uma composição farmacêuti. ca caracterizado por compreender a mistura de uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável com uma quantidade imunopotenciante eficaz de um derivado de guanina-nucleásido substituído melhorador da resposta imunitária preparado de acordo com a reivindicação 1.

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SCRF 124.OA

-898§. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido radical hidrocarbilo ser um radical de cadeia linear seleccionado entre o grupo consistindo de um alqui lo C^-Cg de cadeia linear, um beta-alcenilo O^-Cg de cadeia li near e um radical benzilo e por X ser 0 ou S.

9-. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri zado por o referido radical R^ ser seleccionado entre o grupo consistindo de propilo, butilo, alilo, 2-butenilo e benzilo, e por X ser 0.

10^â. - Processo para melhorar uma imuno-resposta, caracte rizado por compreender o contacto de leucócitos num meio aquoso com uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador tolerável fisiologicamente misturado com uma quantidade eficaz imunopotenciante de um derivado de guanina-nucleósido substituído, possuindo o referido derivado de guanina-nucleósido substituído uma estrutura que corresponde à fórmula onde X é 0, S, Se ou NCN;

r! é um radical hidrocarbilo de cadeia linear cíclica ou ramificada com um comprimento superior ao de um grupo etilo e inferior ao de um grupo decilo;

-4.‘W

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