PT91410B - Processo para a identificacao e de utilizacao de genes biossinteticos ou de regulacao para a producao melhorada de metabolitos secundarios - Google Patents

Description

Descrição

PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DE GENES BIOSSINTfiTICOS OU DE REGULAÇÃO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE META.

BOLITOS SECUNDÁRIOS

INTRODUÇÃO

Domínio Técnico domínio da presente invenção diz respeito ao isolamento e ao uso de genes para a produção de metabolitos secundários.

Antecedentes e Literatura de Interesse

Como resultado dos melhoramentos na estirpe classica, a produção de penicilina ausentou enormemen te nas ultiaas quatro décadas* Estes melhoramentos da estirpe clássica foram inicialmente baseados em tratamentos mutagénicos de Penicillium chrysogenua e selecção subsequente dos mutantes que produzem mais penicilina. 0 desenvolvimento de téc_ nicas de clonagem contudo introduziu uma nova ferramenta po— tenclalmente mais poderosa para uma melhoria adicional da pr<> duçao de penicilina neste fungo.

A penicilina é produzida pelo fungo filamentoso P. chrysogenua em várias fases enzimáticas (por exemplo E. Alvarez et al., Antimlcrob. Agents Chemother. 31 (1987) pp. 1675-1682). Estas fases são apresentadas na Figura

1. Ao longo da presente memória descritiva entende-se por genes directamente envolvidos na via biosintética, aqueles genes que codificam as enzimas activas em várias fases que conduzem ã produção de um metabolito secundário. Deste modo, no caso da produção de penicilina G ou V, os genes que codificam para as enzimas estão representados na Figura 1. A primeira reacçao é a formação do tripeptldeo £ -(L-ó^— amlnoadipil)—L-cis. teini1-D-vanila a partir de ácido -amino-adípico, cistelna e valina. A enzima que é responsável por esta reacçao é a sinte^ tase de ACV (daqui em diante referida como ACVS), uma enzima multifuncional de grande dimensão. 0 tripeptldeo é cicllzado pela acção da sintetase de isopenlcllina N (daqui em diante referida como IPNS) ou da ciclase. 0 produto de reacção é a isopenlcllina N, um composto que contem a estrutura de anel deO-lactama típica e que possui activldade antibacteriana. A fase final na formaçao da penicilina consiste na troca da cadeia lateral do ácido ot -aoinoadlpico da isopenlcllina N por uma cadeia lateral mais hidrofóbica. As cadeias laterais hidrofóbicas geralmente usadas na produção industrial sao quer o ácido fenilacético, dando como resultado a penicilina G, quer o ácido fenoxiacético, dando como resultado a penicilina

V. Foi sugerido que a troca da cadeia lateral era uma reacçao catalisada por uma única enzima (A.L. Demain (1983) in: A.L. Demain e N.A. Solooon (ed), Àntibiotics containing theJ3-lactam structure I. Springer Verlag, Berlin; pp. 189-228). Contju do, é também possível uma reacção de duas fases que envolve o

6-ÀPA como intermediário (E. Alvarez et al. , vide supra). A enzima que foi identificada como estando envolvida na reacção final é a acilCoA;6—APA-aciltransferase (daqui em diante refe_ rida como AT); esta enzima foi purificada até à homogeneidade (E. Alvarez et al.. vide supra). 0 envolvimento duma segunda enzima, catalisando a transformação de IPN em 6-APA, não pode ainda ser confirmada nem excluída.

Nao é claro se uma ou mais reacçoes enzimátlcas limitam a velocidade qo processo da biosíntese da penicilina e se assim fôr, quais as fases enzimáticas que estão envolvidas.

Uma vez que a via biossintética da penicilina começa coo três ácidos aminados, os quais cada um por sua vez participam em outras vias metabólicas, as fases reguladoras nessas vias irão também influênciar a biossíntese da penicilina penicilina. Por outro lado, a produção de penici la é sujeita a um complexo mecanismo de repressão catabóllca das fontes de carbono e á regulaçao da fonte de azoto (J.F. Martin et al. In: H. Kleinkauf, H. von Dohren, R. Donnauer and G Neseman (eds), Regulation of secondary metbollte formation. VCH Verlaggesellschaft, Weinheim (1985), pp. 41-75). Poj dem também estar envolvidas nestes tipos de regulaçao proteínas reguladoras. Estas proteínas reguladoras e as proteínas reguladas por elas, são definidas como estando indirectamente envolvidas na via biossintética de um metabolito secundário, neste caso a penicilina.

Até recentemente, apenas tinha sido clonado e sequenciado o gene de uma só das enzimas activas na via biossintética para a penicilina G, a sintetase de isopeni. cilina N (IPNS) ou ciclase (L.G. et al., Gene 48 (1986) pp. 257—266), usando o gene correspondente de Acremonium Chrysogenum (S. M. Samson et al. Nature 318 (1985) pp. 191-194). Es_

te gene foi clonado e identificado purificando a proteína IPNS, determinando a sequência de ácidos aainados amino-termi. nal, preparando um conjunto de oligodesoxirrlbonucleõtidos de acordo com esta sequência e sondando um banco genómico de cojb mídeos com estes oligodeoxyribonucleótidos misturados (S.M. Samson, vide supra).

Estudos de melhoria de estirpes usen do os genes de sintetase de isopenicilina N de Penicillium chrysogenum clonados em Penicilium chrysogenum tiveram como resultado o reforço da actividade da enzima, mas não se obteve qualquer melhoria na produção da penicilina, nem se verifi. cou estimulação da síntese da penicilina (P.L. Slcatrud et al., Póster presentation 1987 Ânnual meeting of Society of Industrial Microbiology, Baltimore, August 1987, resumo publicado in SIM News 37 (1987) pp. 77).

Foi descrito que a biossíntese dos antibióticos de β—lactama á submetida a repressão pela glucose (J.F. Martin e P. Liras, TIBS 3^ (1985), pp. 39-44). Esta repressão pela glucose foi inequivocamente estabelecida para a formação do tripeptídeo pelo ÀCVS e para a actividade dos IPNS (Revilla et al., J. Bact. 168 (1986), pp. 947-952). Para a aciltransferase, por outro lado, os dados são menos convincentes. Revilla et al (vide supra) referem que a AT nao é sub metida á repressão pela glucose, mas outros dados sugerem que a actividade de AT está ausente, ou pelo menos diminuída, na presença da glucose (B.Spencer e T. Maung, Proc. Biochem. Soc. 1970,pp. 29-30).

Nao se conhece em que fase da expres. sao é exercida a repressão pela glucose; esta repressão tanto se pode dar no nível da transcrição como no nível da traduçao. Se se aplica a primeira regulaçao, as diferenças em níveis de RNAm entre as culturas que produzem e as que nao produzem podem ser utilizadas para isolar os referidos genes.

Existe para além disso incerteza nos níveis dos RNÀm’s que codificam para as várias enzimas nas cá.

lulas que produzem penicilina.

RESUMO DA INVENÇÃO

São utilizados métodos de isolamento por subtracção para identificar genes associados com a produção de metabolitos secundários em microorganismos. 0 método é exemplificado com a produção de penicilina em P. chrysogenum.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Figura 1

A via biossintética para a penicilina 6 ou V em P. chrysogenum *é apresentada esquematicamente.

Figura 2

Mapa físico dos clones lambda isolado pelo método da presente invenção. Os clones lambda G2 e lambda B21 contêm o aglomerado dos genes da ciclase e da acil_ transferase. Os clones lambda B9, G5 e L5 contêm o gene críptico Y. Outros clones lambda contêm outros genes crípticos.

E — EcoRI; B - BamHI; H « HindIII; K - Xpnl; Sa « Saci;

Sp - Sphl; P - PstI; X - Xhol; Xb · Xbal; Hp · Hpal;

N - Ncol e Bg - BglII

K\\\\\\\\\5NS5NI · braço direito do bacteriófago lambda EMBL3 (9 Xb) | | « braço esquerdo do bacteriófago lambda EMBL3 (20,3 kg) _n região que hibrida para pen⁺ ADNc ------ · região nao clara do mapa ( ) - posição/ocurrência de local de restrição não níti_ do la e ra são o braço esquerdo e o braço direito respectivamente do bacteriófago lambda.

Figura 3

Sequência de nucleótidos e sequência de ácidos aminados deduzida a partir do gene de aciltransfera.

se de _P. chrysogenua.

Figura 4

Sequência de nucleótidos e sequência de ácidos aminados deduzida do gene pyrG de P_ chrysogenua. Es. ta sequência forna a maior parte do fragmento EcoRI de 2,4 kb que actua como uma sequência de estímulo da transformação.

Figura 5

Sequência de nucleótidos do pronotor do gene de quinase de fosfo^licerato de P. chrysogenua.

Figura 6

cional	de 7	pUC13i ípyrG.	Um	local	de	restrição e	um mapa fun-
			Um	local	de	restrição e	um mapa fun-
cional	de	pPS54.

Figura 8

Um local de restrição e um mapa funcional de pRR05.

Figura 9

Um local de restrição e um mapa funcional de pGJOl A e B.

Figura 10

Um local de restrição e um mapa fun- 6 cional de pPS47.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS ESPECÍFICAS DE CONCRETIZAÇÃO

De acordo com a presente invenção, ldentlflcam—se fragmentos de ADN que incluem sequências que são Donocistrõnicas ou policistrónicas. Os gene(s) codificado (s) pelas sequências são traduzidos em enzimas relacionadas com a produção de metabolitos secundários ou de outros produtos de interesse comercial. Estas sequências de interesse são identificadas por comparação com sequências de ARN isoladas de um organismo competente para produzir o metabilito secunda rio, no qual os genes de interesse são activamente expressos, e um microorganismo no qual a expressão é silenciosa. Por esta via é possível obter fragmentos de ADN que codificam um ou maia genes que são expressos diferencialmente e que estão envolvidos na formaçao de um produto de interesse comercial.

termo expresso diferencialmente é usado através da sua aplicaçao para expressão do gene ou dos genes de interesse que sao especificamente activos somente sob certas condlçoes definidas e que está ausente (o que significa na presente memória descritiva estar presente a um ba^ xo nível de 5X ou inferior comparado com a fase actlva) sob outras condiçoes Igualmente bem definidas. A ausência de expressão pode ser um resultado de repressão ou da falta de indução da expressão do gene, de mutaçao ou de outros acontecimentos que têm como resultado o silêncio da transcrição do ge ne(s) de interesse. 0 ADN que e isolado pode resultar de uma selecção a partir de um banco de genes, quer seja de um banco genómica quer um banco que contem ADNc contido por exemplo num vector lambda ou num vector de clonagem cosmídico ou num vector de expressão. Pelo emprego de uma sonda de ADNc enriquecida por sequências expressas durante a biossíntese de me— tabolitos secundários, podem ser identificados híbridos positivos no banco para manipulaçao subsequente a fim de permitir a preparaçao de construções de expressão para as enzima(s) as. sociadas com a produção do metabolito secundário. Por conse—

guinte procede-se a uma busca num banco de genes de um microorganismo usando duas sondas de ADNc, uma das quais é enrique^ cida em sequências do estado activo de transcrição e a outra é derivada da situaçao de silêncio de transcrição. Por comparação e subtração, é possível isolar os clones que contêm gene(s) que sao activamente expressos somente sob as condiçoes activas definidas.

método é exemplificado pelo isolamento de genes envolvido na biossíntese de um metabolito secundário, ma is especif icamente de penicilina, usanido duas eon das de ADNc, a partir de micélio cultivado em lactose (produtor) e micélio cultivado em glucose (não produtor).

As sequências de ADN identificadas contêm pelo menos um gene que codifica para uma enzima biossíntetica de antibiótico e/ou para uma proteína reguladora a partir da via sitética integral ou mais geralmente qualquer proteína que se encontre envolvida seja qual for o caminho, quer positivo quer negativo, na biossíntese do referido antibiótico.

As construções que actuam positivamente, quando devidamente introduzidos num raicroorganismo hos^ pedeiro adequado, aumentam a eficiência das vias biossínteticae operativas na produção de microorganismos que produzem — lactamas por aumento da dosagem do gene ou por expressão mais elevada do gene. Por outro lado, podem ser isoladas construções que têm um efeito negativo na produção de antibiótico (p.e. formação de produtos secundários). Estas construções são utilizados para inactivar o gene que actua negativamente por substituição do gene ou por outros métodos com um efeito semelhante. Ambas as utilizações dão como resultado rendimentos mais elevados do antibiótico pretendido durante a produção industrial. Este método Ó exemplificado por microorganismos que produzem —lactama para a produção de antibióticos, particularmente penicilinas, e encontra particular aplicação nestes casos. De preferência, o bloco integrado de expressão (cassete de expressão) incluirá genes que codificam para enzi.

mas que catalisam fases que limitam a velocidade ou genes que codificam para proteínas reguladoras para a indução de transcrição ou qualquer outros.

método exposto para além disso pro porciona sequências para as quais o produto codificado nao é conhecido, mas verifica—se que a sequência proporciona uma ae lhorla do rendimento de um produto pretendido. Estas sequências sao referidas como genes crípticos, o que significa se quências que se podem obter por métodos de isolamento aqui descritos, sequências estas que abrangem genes para os quais nao é ainda atribuível qualquer função conhecida. Estes genes sao caracterizados por serem doseados e/ou expressos em quantidades mais elevadas nos microorganismos hospedeiros transformados em comparaçao com os seus hospedeiros nao transforoja dos. Para além dos genes crípticos, outros genes proporcionados são os genes de IPNS e de aclltransferase. Verificou-se que um gene críptico chamado Y proporciona uma biossíntese da penicilina melhorada.

Os microorganismos utilizados na prje sente invenção incluem tanto procariontes como eucariontes, incluindo bactérias, tais como as pertencentes ao grupo taxonõmico dos Actinomycetes ou dos Flavobacterium, ou fungos incluindo leveduras, pertencentes aos géneros Aspergillua, Acre monium ou Penicillium.

Em dependência da origem dos fragmen. tos, é possível construír vários blocos integrados de expressão, quer genómicos ou de ADNc, quer procariéticos ou eucario ticos. Com ADN genómico de uma bactéria, o fragmento que contém uma região de codificação monocistronica ou policistroni— ca pode incluir a sua própria região de regulaçao de início de transcrição bem como uma região de terminação de transcrição e sinais de traduçao apropriados, por exemplo uma sequência de Shine—Delgarno e codoes de paragem. Quando o ADN geno— mico é de um fungo, normalmente apenas um gene está associado com uma região de regulaçao de início de transcrição, de tal modo que cada gene possui a sua própria região de regulaçao do início de transcrição independente. Quando se utiliza ADNc,

e necessário proporcionar uma região de regulação de início de transcrição apropriada, dependendo do organismo hospedeiro usado para a expressão subsequente.

Os genes de interesse podem ser obti dos por busca num banco de ADN preparado a partir do referido microorganisao com sondas obtidas de ARNm ou de ADN derivado de uma₍primeira cultura do referido microorganismo que produza o referido metabolito secundário; por busca do referido banco de ADN com sondas obtidas de ARNm ou de ADN derivado de uma segunda cultura do referido microorganismo ou de um seu autante, que não produza o referido metabolito secundário; e identificação de fragmentos que contêm genes transcritos na referida primeira cultura que não são substancialaente transcritos na referida segunda cultura.

Genes especialmente valiosos incluem os genes que são expressos especificamente durante a biossíntese de antibióticos, incluindo os genes que codificam para enzimas biossintáticas de ^-lactamas conhecidas na especialidade, por exemplo sintetase de tripeptídeo (ACVS), ciclase (INPS), aciltransferase (AT), epimerase, expandase, hidroxila^ se, transcarbamoilase, metoxilase e transacetilase. De preferência os genes que codificam para IPN:6-APÀ-aciltransferase ou o gene críptico ϊ sao doseados ou expressos em quantidades superiores o que dá como resultado rendimentos mais eleva, dos do antibiótico pretendido no fungo transformado.

Será de interesse para os especialis. ta na matéria que os gene(s) a serem expressos num hospedeiro que produz uma lactama possam conter a sua própria sequência de promotor nativa que é reconhecida por uma polimerase de ARN da célula hospedeira, ou possam ser ligados a qualquer oti tro promotor adequado, p.e. o de um gene biossintético de · ~ lactama diferente ou o de um gene glicolítico tal como quinase de fosfoglicerato, deidrogenase de fosfato de gliceraldeído, isomerase de fosfato de trlose ou a do factor de elongaçao de translacção, Ef-Tu, ou similares.

Um tal promotor pode ser utilizado para influenciar a regulaçao da expressão de um ou de vários

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genes que codificam para as referidas enzimas. Isto conduzirá a uma produção aumentada do antibiótico depois da transformação, uma yez que a produção da penicilina á agora possível sob condições em que na estirpe de hospedeiro não transformada não levam á produção de penicilina, por exemplo, enzimas gllcolltos sao expressas na presença de glucose, enquanto a produção de penicilina, por outro lado, ó reprimida na presen. ça de glucose (J.F. Martin, vide supra). Submetendo a expressão dos genes biosslnteticos da penicilina à regulaçao de um promotor de um gene glicolltlco, os genes podem também ser ex pressos na presença da glucose e deste modo a penicilina pode ser produzida mais cedo na fermentação, quando uma alta concentração de glucose é necessária para a produção de uma quan^ tidade suficiente de micélio. Também o marcador de selecção pode ser mantido sob a regulação deste promotor.

A presente invenção exemplifica o promotor do gene de fosfogliceratoquinase de P. chrysogenun como um promotor para ser usado para superar a repressão pela glucose da blosslntese da penicilina. Este promotor foi isola, do a partir do banco genómico de P, chrysogenum por métodos normais, usando sondas de ollgodesoxirribonucleótldos da sequência de levedura publicada por R.A. Hitzman et al., Nucleic Acids Res. 10 (1982) pp. 7791—7808. A sequência de nucleótldos de um promotor de fosfogliceratoquinase encontra-se especificada na Figura 5.

Para a transformaçao de Penicillium. empregam—se construções que incluem pelo menos um marcador pa. ra a selecção de células transformadas e, de preferência, para reforçar a conservação do ADN integrado. Contudo, de prefe^ rência o vector inclui uma sequência de ADN conhecida por aumentar a eficiência de transformaçao. Um exemplo de uma sequência de ADN com esta propriedade é o elemento ans, isola, do a partir de Aspergillus nidulans (cf. Ballance and Tutner, Gene 36 (1985) pp. 321-331). A presente invenção proporciona uma sequência de ADN, isolada a partir de um genoma de P. chrysogenum. que foi identificada como uma sequência com um efeito semelhante ao efeito da sequência βοβ. Uma vez que

esta sequência é nativa em relação a P. chrysogenua, pode ser usada para aumentar as eficiências de transformação em P. chrYsogenum. A sequência de ADN abrange o gene PyrG de P. chrysogenua e pode ser usado quer isoladamente, em combinação com um hospedeiro de pyrG. caso este em que a citada sequência de ADN proporciona tanto a selecçao de transformantes como o efeito de aumento da transformaçao (cf. EPA-260762), quer em combinação com um outro marcador de selecçao, por exemplo um gene que codifica para resistência a um biocida, tal como íleo, micina. Neste último caso a selecçao de transformantes e o efeito de realce da transformação são proporcionados por duas sequências separadas de ADN e a única função do elemento pyrG é de realçar as frequências de transformação.

Marcadores úteis para a selecçao de clones de transformantes podem ser genes biossintéticos homólogos ou heterólogos capazes de complementar uma necessidade auxotrífica da célula hospedeira, causada por um defeito na via metabólica para um ácido aminado, por exemplo arginina, para um precursor de um nucleótido, por exemplo uracilo, e si^ milares.

gene estrutural que proporciona o marcador para selecçao pode ser nativo em relaçao ao hospedei, ro Penicillium de tipo selvagem ou um gene estrutural heteró— logo que é funcional no hospedeiro. Por exemplo, genes estruturais que codificam para uma enzima numa via metabólica podem ser derivados de Penicillium ou de outros fungos filamentosos, por exemplo Aspergillus. Neurospora, Podospora. ou de leveduras, em que o gene estrutural e funcional no hospedeiro Penicillium e complementa a auxotrofia para prototrofia.

gene estrutural complementar pode ser derivado de uma via metabílica, tal como a síntese de purinas ou de pirimidinas (nucleósidos) ou de ácidos aminados.

De interesse particular são os genes estruturais que codificam para enzimas na via da pirimidina, por exemplo o gene que codifica para a enzima descarboxilase de orotidina-5'-fosfato (pyrG ou pyr4). Outros genes de interesse sao os genes bios- 12

sintéticos de ácidos aminados, por exemplo transferase de or— nitina—carbamoílo (arqB) e liase de arginino-succionato (arq4) 0 nso dos marcadores de selecçao anteriormente referidos é proporcionado por EP-A-260762.

Em vez de marcadores auxotróficos, podem ser usados marcadores de fermentação, tais como a capacidade do uso de amidas como única fonte de carbono ou de azo, to, a cultura em vários açúcares, por exemplo em galactose, ou semelhantes.

Para além disso, podem ser usados os genes que codificam para a resistência a biocidas, tais como higromicina, gentamicina, fleomicina, glifosato, bialafos, e similares.

Sao proporcionadas construções que contêm a sequência de interesse e que podem incluir outras funções, tais como sistemas de replicação em um ou vários hos. pedeiros, por exemplo em hospedeiros de clonagem e/ou em hospedeiros alvo para expressão do oetabolito secundário; um ou mais marcadores para selecçao em um ou vários hospedeiros, co mo indicado acima; genes que realçam a eficiência da transfo£ aaçao; ou outra função especializada.

A construção deve conter pelo menos um gene isolado pelo método da presente invenção. A construção pode ser preparada pelos meios convencionais isolando outros genes pretendidos dum hospedeiro adequado, sintetizando todos ou alguns dos genes ou as suas combinações. De mouo semelhante os sinais de regulaçao, as regiões de início de trans. criçao e de traduçao e as regiões de terminação podem ser iso. ladas de uma fonte natural, podem ser sintetizadas ou podem ser obtidas por combinações destes métodos. Os vários fragmen. tos podem ser submetidos a digestão por endonucleases (restr_i. çao), a ligaçao, a sequenciaçao, a mutagénese in vitro. a reparaçao por iniciadores ou a técnica semelhante. As várias ma nlpulações são bem conhecidas na literatura e podem ser utiM zadas para atingir fins específicos.

Os vários fragmentos podem ser combi.

nados, clonados, isolados e eequenciados de acordo com as téç, “ 13 -

nicas convencionais. Depois de cada manipulaçao o fragmento de ADN ou a combinação de fragmentos podem ser inseridos no vector de clonagem, o vector pode ser transformado num hospedeiro de clonagem, por exemplo em E. coli, o do hospedeiro de clonagem pode ser cultivado e lisado, o plasmídeo pode ser isolado e o fragmento pode ser analisado por análise de restrição ou por sequenciação, suas combinações ou por operações similares. 0 E. coli pode também ser usado como hospedeiro pa, ra a expressão de genes de interesse com o objectivo de produ. zir elevadas quantidades de proteína.

Podem ser utilizados vários vectores durante o decurso do desenvolvimento da construção e a transformação da célula hospedeira. Estes vectores podem incluir vectores de clonagem, vectores de expressão e vectores que proporcionam a integração no hospedeiro ou o uso de ADN simpli para transformaçao e integração.

vector de clonagem será caracteri— zado, na sua maior parte, por um marcador para aelecçao de um hospedeiro que contém o vector de clonagem e opcionalmente uma sequência de estimulação de transformaçao, pode ter um ou mals poliligantes, ou sequências adicionais para inserção, se_ lecção, manlpulaçao, facilidade de sequenciaçao, excisao ou similares.

A inserção de uma construção que inclui a região de início de transcrição e de tradução e as regiões de terminação pode normalmente ser conseguida por meio de vectores de expressão; em alternativa a construção pode li. gar uma ou ambas as regiões de regulaçao, que serão fornecidas pela expressão do vector na inserção da sequência que codifica para o produto proteico.

ADN que codifica as enzima(s) de interesse pode ser introduzido num hospedeiro Penicillium de acordo de forma substancial com o procedimento descrito em EP-A-260762.

A transformaçao eficiente de Penicil liun é proporcionada para produzir transformantes que têm um ou maia genas estruturais capazes de expressão, particularmejn

te integrados no genoma do hospedeiro (integrantes). São preparadas construções de ADN que permitem a selecçao de células hospedeiras transformadas. Sao utilizadas condiçoes para a transformaçao as quais têm como resultado uma elevada frequên. cia de transformaçao para deste modo assegurar a selecçao e o isolamento dos hospedeiros transformados que expressam o gene (s) estrutural de interesse. Os transformantes proporcionam a manutenção estável e a expressão do ADN integrado. É de notar que o hospedeiro transformado de acordo com a presente invenção pode ser usado como estirpe inicial nos processos de melhoria de estirpe em vez de se usar uma transformaçao de mediação de ADN, por exemplo, fusão de protoplastos, emparelha— mento em massa e mutaçao. As estirpes resultantes sao conside. radas como fazendo parte da presente invenção.

Os genes com interesse para serem in. troduzldos por transformaçao podem formar uma parte integral do vector de transformaçao, mas será muitas vezes mais conveniente proporcionar estes genes num vector separado na mistura de transformaçao, introduzindo deste modo os referidos genes por cotransformação em conjunto com o vector selectivo, o que é um processo razoavelmente eficiente em fungos filamento, sos (P.J. Punt et al., Gene 56 (1987) pp. 117-124; X. Wernars et al, Mol. Gen. Genet: 209 (1987) pp. 71-77; I.E. Mattern et al., Mol. Gen, Genet. 210 (1987) pp. 460-461).

Como resultado da transformação have. rã pelo menos uma copia do gene(s) com interesse, frequentemente duas ou mais, normalmente nao excedendo cerca de 100, mais habitualmente nao excedendo cerca de 10. 0 numero dependerá acima de tudo de se empregar integração ou manutenção episomal estável, do número de cópias integrado e de a construção que se pretende preparar ser submetida a amplificaçao e de factores semelhantes.

A presente invenção exemplifica um método para isolar genes que envolve a biosslntese da penicilina a partir de um banco de genes do organismo produtor, P.. chrysogenum, usando sondas de ADNc específicas, método este que é paradigmático para a identificação de genes criptícos

para a melhoria da produção de metabolitos secundários. Este método para o isolamento de construções de ADN que codificam um ou mais genes que tomam parte na biossíntese de metabolitos secundários, compreende a busca num banco de genes com uma sonda de ADNc enriquecida em sequências expressas especificamente durante a biossíntese. Por expresso especificamen— te pretende-se significar que a expressão destes genes á silenciosa ou a um nível muito baixo (por exemplo menos que 5% do nível de produção) na ausência de produção de penicilina e em contraste á alto durante a produção da penicilina. Para e_s te fim, sintetizam—se sondas de ADNc marcadas por radioisõto— pos ou de outra forma em moldes de RNAm isolados a partir de micálio de P. chrysogenum durante a fase de produção de penicilina .

As sondas sao em seguida enriquecidas em sequências que hibridam especificamente com os genes pretendidos eliminando aquelas sequências de ADNc que hibri— dam com ARNm derivado de uma fermentação de Penicillium sob condiçoes que nao permitem a produção de penicilina, por exea pio concentração de glucose alta. Usando esta sonda enriqueci, da seleccionam-se clones de um banco de genes de chrysogenum que nao hibrida com uma sonda derivada de um micálio nao produtor. Parece que um grande número de clones assim isolados codificam para a enzima biossintética de penicilina sinte^ tase de isopenicilina N (IPNSou ciclase).

Para além disso, verifica-se estarem presentes entre os clones seleccionados algumas cópias do gene que codifica para a enzima de permuta da cadeia lateral (aciltransferase). Esta presença á provada com experiências em que se utiliza uma sonda de ADN, com base na sequência pe£ tídica aminoterminal da enzima purificada. A entidade destes clones á verificada por via bioquímica e biológica. A sequência nucleotídica e a sequência deduzida de ácidos aminados do gene de aciltransferase são especificados na Figura 3. Surpre. endentemente, os genes que codificam para as enzimas sintetase de isopenicilina N e aciltransferase estão presentes ambos

num fragmento de ADR. Esta presença foi demonstrada pela hibridação de um banco genõmico de chrysogenua no vector laio da EMBL3 com sondas separadas, específicas para cada um dos dois genes referidos. Clones idênticos hibridam separadaaente com as duas sondas.

Para além disso, depois da construção de um mapa físico de um clone lambda genõmico e da hibridaçao de produtos de digestão do clone lambda com sondas sepa, radas para os dois genes, a organização genómica é verificada ser conforme delineado na Figura 2 (clones B21 e G2). A presença dos dois genes de um fragmento de ADN extenso permite a construção de estirpes de P. chrysogenum com uma dosagem maior dos genes da sintetase de isopenicilina N e da aciltransferase , sem perturbação da organização relativa ou da expressão equilibrada dos dois genes. Para além disso, a introdução de coplas múltiplas do referido fragmento de ADN extenso permite a expressão dos dois genes do referido fragmento no seu meio natural com sequências a montante e a jusante que são idênticas à situação normal.

Tanto a expressão equilibrada como a manutenção do meio natural podem ser beneficas para a eficiêii cia do gene de expressão e deste modo para a produção da penjL cilina. As técnicas de isolamento do aglomerado dos genes da sintetase de isopenicilina N e da aciltransferase podem ser aplicadas com vantagem para o Isolamento de outros genes bios. sínteticos de penicilina por técnicas de movimentação cromos— sómica, na qual os genes biossinteticos de penicilina podem ser aglomerados.

Para além disso, isolaram-se vários genes crípticos, para os quais nenhuma função foi assinalada ainda mas que provavelmente desempenham um papel na biossínte_ se da —lactamas. Na figura 2 apresenta—se um mapa físico dos genes crípticos da presente invenção (clones B9 a B23).

Destes genes criptícos, o gene designado por Y, presente nos clones B9, L5 e G5, quando utilizado na transformaçao (num sub—fragmento Sphl + BamRI de 3,0 kb) dum hospedeiro adequado, estimula a produção de penicili17

na em 26Z, em conparaçao cora o hospedeiro nao transformado. Este facto demonstra o envolvimento do produto do gene Y na biossíntese da penicilina. Para além disso, esta observação demonstra que a transformação asando os genes que isolados pe. lo método da presente invenção, sem conhecimento da sua função ou da sua identidade, podem ser aplicadas sucessivamente na melhoria da estirpe de P.. chrysogenum.

A presente invenção é para além disso exemplificada pela transformação de Penicillium chrysogenoa com genes que sao especificamente expressos sob condiçoee nas quais o antibiótico é sintetizado, e que codificam para produtos génicos que catalisam reacçoes biossintéticas que lje vam aos referidos antibióticos.

Uma destas enzimas, a aciltransferase (daqui em diante referida como AT), cataliza a fase final na biossíntese da penicilina, isto é a permuta da fracção de amlnoadipilo da Isopenicilina N com um precursor da cadeia la. teral de acilo hidrifóbica, por exemplo ácido fenilacético ou ácido fenoxiacético, dando assim origem a penicilina G ou a penicilina V, respectivamente.

Apreeenta-se o gene de aciltransf era. se de P_. chrysogenum, incluindo a sequência de ácido nucleíco. A presente invenção proporciona mutações conservativae, em que as sequências codificam para as mesmas sequências de ácidos aminados, mas podem ter ate 30Z de bases diferentes, ou mutações que não são conservativae, em que menos que cerca de 10Z, mais usualmente menos que cerca de 5Z, e de preferência não mais do que IX dos ácidos aminados sao substituídos ou eli^ minados, e há menos de 5Z de ácidos aminados inseridos, sendo a percentagem baseada no número de ácidos aminados de ocurrên. cia natural. Para além disso podem ser utilizados como sondas para a produção de anticorpos fragmentos dos dois ácidos que codificam para a enzima, normalmente de pelo menos cerca de 9 codoes, mais normalmente de pelo menos cerca de 15 codoes, bem como os seus produtos de expressão ou semelhantes. As son. das podem ser usadas para identificar a enzima em outras espe^ cies pelo emprego de ácidos nucleicos para hibridação ou dos

anticorpos para Identificação das proteínas de reacção cruzada.

 pesquisa de precursores de cadeia lateral não natural ou de outras penicilinas ou cefalosporinas que podem servir como substrato para a aciltransferese po. de ser complementada pela pesquisa de enzimas de aciltranafe— rese mutantes que podem aceitar como substrato precursores de uma cadela lateral diferentes do ácido fenilacático ou do áci^ do fenoxiacético, ou penicilinas ou cefalosporinas que não ee jam isopenicilina N. A presente invenção proporciona a matéria prima para tal pesquisa de uma enzima de aciltransferase mutante. 0 melhor hospedeiro para experiências de clonagem muta. cional é o E.. coli: uma vez que o E. coll não tem a aparelhagem de corte para a remoção dos iroes presentes no gene de aciltransferase, um clone de ADNc do gene de aciltransferase é a sequência preferida para a expressão da enzima ee E. coll. Esta sequência de ADNc pode ser facilmente mutata por processos bem conhecidos na especialidade tais como, por exemplo, tratamento com radiaçao (raios X ou UV) ou substâncias químicas mutagénicas tais como metanossulfonato de etilo, nitrosoguanldina ou metanossulfonato de metilo) ou mutagéneae especX fica para um local, para obter enzimas mutantes que por um la. do reconheçam os precursores de cadeia lateral nao natural co mo substrato e catalizem a formação de penicilinas nao naturais a partir da isopenicilina N, ou por outro lado catalizem a reacção de permuta em penicilinas e cefalosporinas que não sejam a isopenicilina N.

isolamento dos genes da AT e Y e outros genes biosslntéticos permite a identificação de elemen^ toa reguladores dos genes individuais tais como um promotor, uma sequência activadora a montante (SAM), um terminador e si. milares. Isto pode ser conseguido por comparaçao de sequência dos genes entre eles próprios e por comparaçao com a sequência como é obtida para o gene biossintético de sintetase de isope. nicillna N e outros genes referidos. Esta última comparaçao, contudo, pode apresentar a natureza específica da regulaçao da expressão do gene do grupo de genes biosslntéticos de penl

cilina.

A identificação de um tal elemento regulador bioasintetico de penicilina leva ã identificação de proteínas reguladoras específicas por meio de técnicas nor_ mais como retardamento de gel, ligação cruzada, rasto de ADN e similares. 0 isolamento de proteína reguladora específica por cromatografia de afinidade tem como resultado a clonagem do gene que codifica para a referida proteína e a subsequente menlpulaçao num hospedeiro adequado.

Pela utilização do gene AT, do gene Y e de outros genes biossinteticos de penicilina clonados, po_ dem ser projectadas e sintetizadas enzimas modificadas. Estas modificações darão como resultado modificação das caracterís— ticas das enzimas, tal como uma mudança nos valores óptimos de pH ou de temperatura, uma mudança na estabelidade ou uma mudança na especificidade do substrato. As estirpes hospedeiras, transformadas com genes que codificam para estas enzimas modificadas, podem ser programadas para realizar a síntese de antibiótico sob condições diferentes ou para sintetizar antibióticos alternativos, por exemplo ampicillna em vez de penicilina.

Num outro aspecto da presente invenção, os genes clonados podem ser usados para transformar as estirpes hospedeiras que nao possuem naturalmente estas enzimas. δ conhecido que em Streptomyces e em Acremonlum nao ocor re a enzima AT, enquanto que por outro lado em Penlcillium nao ocorrem os genes das enzimas blossintéticas da cefalosporina e da cefamicina. A introdução de tais genes nos hospedei^ ros dará como resultado a blossíntese de cefalosporina ou de cefamicina por Penlcillium ou de penicilina ou cefalosporinas com uma cadeia lateral hidrofóbica por Acremonlum.

É evidente a partir dos resultados seguintes que a produção de metabolitos secundários pode ser grandemente aumentada utilizando processos de selecçao que permitem a identificação de ADN associadas com a produção de um metabolito secundário. Usando métodos de subtracçao em sequências específicas de identificação associadas com a produ—

çao de metabolitos secundários, á possível isolar e identificar o ARNm e o ADNc para ser usados como sondas. Assim, verifica—se que fragmentos que contêm genes crípticos, que ainda nao tenham uma função conhecida, apresentam uma produção de metabolitos secundários grandemente aumentada e pode ser utilizados para transformar um hospedeiro para a produção do metabolito secundário. Este processo á especificamente exemplificado para penicilina.

Adicionalmente, um gene de aciltrans ferase de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em várias vias, como uma enzima para a modificação de compostos de -lactama, como uma marca, como uma fonte de um antige ne para a produção de anticorpos para aciltransferase, como uma fonte para uma sequência de promotor, como uma fonte para expressar quantidades elevadas de proteína para cristalizaçao como um molde para mutagénese in vitro para obter uma enzima com características modificadas, etc..

Todas as publicações e pedidos de pja tente referidos na presente memória descritiva sao aqui inco£ poradas por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente forem especificamente e individualmente indicadas para ser incorporadas por referência.

Apesar de a invenção precedente ter sido descrita com todo o pormenor por meio de ilustrações e e. xemplos com intuitos de clareza e compreensão, será rapidamen. te evidente para os especialistas no assunto á luz dos ensina, mentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem que se ultrapasse o espírito ou âmbito das reivindicações em apêndice.

Os exemplos apresentados em seguida destinem—se a ilustrar a invenção sem limitar o seu âmbito.

EXEMPLO 1

Construção de um banco genómico de Penicillium ctinsogenua

Construíu-se um banco genómico de Pe niclllium chrysogenum (ATCC 28089) substancialmente de acordo com os processos conhecidos na especialidade (T. Maniatis et al.,(1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.). 0 ADN croraossómico foi extraído de Penicillium chrysogenum pela formaçao de protoplás— tos a partir do micélio como descrito previamente em EP-A260762.

Os protopplastos foram então lisados por diluíçao da suspensão isotónica (XC1 0,7 M) com quatro vo lumes de tampão TES (Tris-HCl 0,05 M pH 8,0, EDTA 0,1 M, NaCl 0,15 M). Ao lisado juntou-se lauril-sulfato de sódio a 1Z e a mistura foi incubada a 55°C durante 30 minutos. Depois de uma extracçao com fenol e duas extracçoes cora clorofórmio, o ADN foi precipitado com etanol, seco e dissolvido em tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A solução de ADN foi então tratada com 100 ^.i.g/ml de RNase a 37°C durante 1 hora e a seguir com proteinase K a 200 /t g/ml a 42°C durante 1 hora. A so lução foi extraída uma vez com fenol e duas vezes com clorofórmio. Um volume igual de isopropanol foi deitado por cima da fase aquosa e o ADN foi recolhido na interface rodando a volta com uma vareta de vidro. Depois de seco o ADN foi dissolvido em tampao TE. 0 peso molecular duma preparaçao de ADN β

assim obtida foi de cerca de 10 . 0 ADN foi parcialmente dige^ rido com Sau3A. ligado a EMBL de 3 braços desfosforilado cortado com BamHI (Promega Biotec, Madison WI, USA), e empacotado em capsídeos de bacteriófago lambda usando o Packagene Sys. tem de Promega Biotec. Todas as reacções foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante excepto no que se refere à reacçao de empacotamento que foi realizada a 22 C du_ rante 2 a 3 horas. Os bancos foram amplificados por inocula22

çao em placas dos fagos empacotados, incubaçao durante 7 a 8 horas a 37°C e eluiçao dos fagos usando 4 ml de tampão SM (NaCl 0,1 M, MgS0₄ 0,01 M, Tris HC1 0,o5 M pH 7,5, gelatina 0,012) por placa de Petri.

EXEMPLO 2

Isolamento de genes expressos especificamente durante a bios— síntese da penicilina usando um processo de separação diferen ciai.

Os genes que sao expressos específica ou predominantemente durante a biossíntese da penicilina foram identificados sondando o banco genómico do Exemplo 1 com sondas de ADNc marcadas sintetizadas em moldes de ARNm ex_ traídos de micélio produtor (cultivado em lactose) e nao produtor (cultivado em glucose), e seleccionado os clones que dão predomonantemente um sinal positivo com a sonda (+) anterior.

Isolaram-se ARNs mensageiros de culturas com 3 ou 6 dias no meio de produção (cf. Exemplo 3) (preparação +) ou no mesmo meio com a lactose substituída por glucose (preparação-). 0 micélio foi recolhido por filtraçao, congelado em azoto líquido e homogeneizado e o ARNm foi isola, do usando o método de isoriocianato de guanidínio como descri, to por T. Maniatis et al. (vide supra).

Sintetizaram-se ADNc’s e marcaram-se 3 2 para uma actividade específica alta com Q*- pJ~ dATP contra as duas populações de ARNm numa mistura reaccional de 30 1 que contem

12,5	mM	MgCl2
50	mM	Tris-HCl pH 8.3
100	mM	KC1
125	mM	DTT
2	u/a1	RNasin
500	am	dGTP

500	aM	dCTP
500	am	dTTP
25	AM	dATP
0,1	Ag/ml	BSA
100-200	Ag/ml	poli A+ARN
50-60	Ag/ml	oligo dT12_18
1,2	u/a!	tranacriptase inversa
1,67	/Ai/ 1	U?-32p] dATP

ηοβ quais o PoliA⁺ ARN e oligo-dt foram misturados separadamente, aquecidos a 100°C durante 1 minuto e arrefecidos em agua gelada antes de adicionar à mistura reaccional. Depois de 1,5 horas de incubaçao a 42°C, adicionaram-se 5/tl de dATP 1 mM e continuou-se a incubaçao durante 30 minutos. Subsequen. temente, a mistura reacional foi levada a 20 mM em EDTA, 40mM em NaOH (volume final 100 χΐ) e aquecida a 65°C. Depois de 1 hora de incubaçao adicionaram-se 5 /íl de Tris-HCl 1 M pH 8,3,

1 de HCl 0,01 N, 7 g de ADN de timo de vitela, 100 1 de tampao TES (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, SDS a 1Z pH 7,5) e 200 yjJL de acetato de amónio 5 mM e precipitou-se o ADN com 800 1 de etanol durante 16 horas a -20°C.

Separou-se o precipitado por centrifugação, lavou-se com etanol a 702, secou-se e dissolveu-se em 32,5 1 de tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A pre^ paraçao de ADNc ( + ) foi então enriquecida nas sequências expressas especificamente durante a biossíntese da penicilina por dois ciclos sucessivos (cascatas) de hibridaçao contra uma preparaçao de ARNm ( —) numa mistura reaccional de 75 /<.1 que contém

32.5	/.(1	(+) ADNc
10	Al	(-) ARNm (l^g/Al)
30	,«1	1M NaPO^ pH 6.8
1.5	Al	102 SDS
1		0.5 M EDTA

Depois de incubaçao durante 16 horas a 68°C, adicionaram-se 102„ 1 de água (concentração final de fosfato 170 aM) e passou-se a mistura através de usa coluna de hidroxilapatite equilibrada ea fosfato 170 mM a 68°C. Sob estas condlçoes, os ácidos nucleicos de dupla cadeia ligam—se à coluna enquanto que os ácidos de cadeia simples são eluídos. Recolheu-se o eluído, dlallsou-se contra tampão TE durante

1,5 horas e precipitou-se com etanol depois da adição de 4 ju.g de ADN veículo (timo de vitela). Repetiu-se este processo e o ADNc final veículo (timo de vitela). Repetiu-se este processo e o ADNc final não ligado foi usado directamente como uma son da para efectuar uma busca no banco genómico de uma estirpe de Penicillium como se segue:

Inoculou-se uma amostra do banco amplificada do Exemplo 1 sobre 5 cápsulas de Petrl de modo a que cada cápsula contivesse 1500 placas. As placas foram tranjs feridas em duplicado para filtros Genes Screen Plus (New England Nuclear) de acordo com as recomendações do fabricante. Sondou-se um conjunto de filtros com a preparaçao de ADNc (+) enriquecida marcada; o conjunto duplicado foi sondado com o ADNc (—) para comparaçao.

As placas positivas foram purificadas e submetidas a uma segunda selecção. Por este melo, foram seleccionadas 96 placas que deram um sinal predominantemente positivo com a sonda ADNc (+).

Os ADNs dos fagos recombinantes que tinham dado que tinham dado um sinal forte ou moderado na se— 32 lecçao inicial foram mercados com p e foram usados como eoii das para efectuar uma busca de manchas em Northern de ARNs de Penicillium isolados a partir de um micéllo produtor e não produtor, a fim de estabelecer os níveis de expressão sob ambas as condições. Por este meio os clones recombinantes foram divididos em três grupos:

Classe 1 contêm genes expressos dum modo elevado durante a biossíntese da penicilina e é exemplificada pelos clones

* G2 * Β9, L5 e G5 * L12 * K9

Classe 2 expressa de modo moderado, exemplificado por * C12 * P3 e 111 * B13 * B20

Classe 3 expressa fracamente, exemplificado por * G3 * G1 * 116 * LIO * B23

Os mapas físicos destes fagos recom— binantes sao apresentados na Figura 2. Os clones G2 e B21 deram um sinal de hlbrldaçao positivos quando sondados com uma sonda específica de sintetase de isopenicilina N (S.M. Samson et al., vide supra). Surpreendentemente, parece que os mesmos clones hibridam com uma sonda específica de aciltransferase (ver Exemplo 5).

EXEMPLO 3

Purificação da aciltransferase

A estirpe Penlcillium chrysogenum (ATCC 28089) foi Inoculada (a 2 x 10^ conldeos/ml) num meio de Inoculação complexo contendo: líquido de maceraçao de milho (20 g/1); solúveis de destilaria (20 g/1); sucrose (20 g/1); CaCOg (5 g/1) (pH antes da esterilização 5,7). Depois de 36 horas de incubaçao a 25°C e a 250 rpm, a cultura obtida foi usada para inocular vinte volumes de meio de produção coe plexo contendo: sólidos de maceraçao de milho (35 g/1)? lacto, se (25 g/1); fenilacelato de potássio (2,5 g/1); MgSO^^E^O

(3 g/1); KH₂PO₄ ( g/1) j Óleo de milho (2,5 g/1); CaC(>₃ (10 g/1). Depois da continuação da incubaçao por mais 48 horas, recolheu-se o micélio por filtraçao e lavou-se o bolo de filtro quatro vezes com NaCl 0,15 M frio.

Suspenderam-se 200 g (peso húmido) de micélio em 700 ml de tampão de Tris-HCl 0,05 M (pH 8) contendo dltiotreltol 5 mM (daqui por diante referido como tampão TD) e desintegrou-se o micélio num desintegrador Braun (Braun, Meleungen, R.F.A.) usando esferas de vidro Ballotini (Sigma tipo V, 450 a 500 /í· de diâmetro) por períodos de 30 s a intervalos com refrigeração nua banho de etanol/gelo seco.

extrato foi em seguida centrifugado durante 30 minutos a 20 000 x g. Esta e todas as fazes seguintes foram realizadas a 4°C. Adicionaram-se lentamente a 640 al de extrato 27 al de uma solução de sulfato de protaaina a 10Z p/v em Tris-HCl 0,05 M a pB 8. Depois de agitar durante 45 minutos o ácido nti cleico precipitado foi removido por centrifugação a 20 000 x g e o sobrenadante foi fraccionado por precipitação coa sulfato de amónio enquanto se mantinha o pH da solução a 8,0 durante as adições de sulfato de amónio. A fracçao que precipitou entre 40Z e 55Z da saturação foi dissolvida em tampão TD que continha sulfato de amónio 1 M eaplicada a uma coluna de fe— nilsefaroee CL-4B (1,8 x 16 cm) equilibrada com o mesmo tampao. A coluna foi lavada com tampao TD a uma velocidade de 5 ml/min até não se libertarem mais proteínas nao ligadas.

Em seguida a aciltransferase foi elulda da coluna coa etileno—glicol a 40Z em Tris-HCl 0,05 M a pH 8,0.

As fracções eluídas foram analisadas para a detecçao de actividade de aciltransferase por incubação a 25°C numa mistura reaccional que contém fenilacetilcoeii ziaa A o,2 mM, ácido 6— aainopenicilânico 0,2 mM, ditiotrei! tol 5 mM, Tris-HCl 0,1 M a pH 8,0 e extrato de enzima num volume final de 200 /tl. Depois de 10 minutos a reacçao foi interrompida por adiçao de 200 /zl de metanol. Centrifugaram—se as amostras a 5000 x g e a penicilina G foi analizada no so—

brenadante por métodos convencionais microblológicos.

As fracções activae da coluna de fenilsefarose foram reunidas e aplicadas numa coluna de Sephacel-DEAE (1.5 x 20 cm) equilibrada com tampão e eludíu-se a actividade de aciltransferase com um gradiente de NaCl (0 a 0,25 M) linear em tampão TD a uma velocidade de fluxo de 0,25 ml/mln. As fracções activas reunidas foram precipitadas com sulfato de aménio a 70% e o sólido foi dissolvido em3ml de tampão TD e aplicado numa coluna de Sefadex G—75 (de grão grosseiro) (2,6 x 70 cm) equilibrada com tampão TD. A aciltransferase foi eluída usando tampão TD com um caudal de 9 ml/h e foi recolhida na ultima parte das fracções eluídas como um pico simétrico de proteína que corresponde à actividade da aciltransferase: A purificação final foi de 258 vezes.

EXEMPLO 4

Determinação da sequência de ácidos aminados aminoterminal de aciltransferase e projecto das correspondentes misturas de sondas de ollgonucleótido.

A preparação enzimática, obtido como descrito no Exemplo 3, foi feita correr num gel de SDS-PÀGE (U.K. Laemmli, Nature, 227 (1970) pp. 680 ff) (acrilamida a 132, 50 A). Separou-se uma banda de 29 kD (cerca de 10 g de proteína) do gel de SDS e transferiu-se por electroforese a proteína para uma membrana de PCGM-2 (fibra de vidro impregna, da de polibreno, Jansen, Beerse, Bélgica), usando uma unidade de mancha Nova Multlphor II (LXB; 0,8 mÀ/cm ; 90 min; tampao de eléctrodo de borato de sódio 5 mM a pH 8,0). Depois de rea lizada a mancha, a membrana de PCGM foi levada quatro vezes com uma solução contendo NaCl 25 mM e borato de sodlo 10 mM a pH 8,0 e foi seca ao ar. A banda de proteína absorvida por PCGM assim obtida foi analizada para determinação da sequência N-terminal de ácidos aminados, usando um sequênciador de fase gasosa (Applied Biosystems modelo 470 a). Foi determinada a sequência seguinte:

De acordo com a parte sublinhada da sequência de ácidoa amina. dos, sintetizaram-se os seguintes conjuntos de oligodeaoxirri. bonucleótidos:

T

A C A T T

5* CA GG CA AA TGGGA 3’

G A G C C

A sequência aoinoterminal de ácidos aainados de una banda de 10 kD presente algumas vezes na pre— paraçao foi também determinada, mas nao foi usada para a cons^ truçao de uma sonda de oligodesoxirribonucleõtido. A sequência obtida é:

Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Gli£ -His-Gly-Ser-Ala—Ala-Lys-Ala-Val-Ile-Ala.

EXEMPLO 5

Identificação do gene da aciltransferase

ADN de vários clones do Exemplo 2 foi digerido com a endonuclease de restrição Sail, os fragmen. tos foram separados num gel de agarose a 0,7Z, transferidos para Genescreen Plus e hibridados com as misturas de oligonucleótidos do Exemplo 4 marcadas na extremidade por E^Pj. Os clones que davam um sinal positivo foram mapeados por análise de restrição usando métodos normais. Dois mapas físicos repre. sentativos derivados dos fagos recombinantes, lambda B21 e lambda G2, sao apresentados na Figura 2. A mistura de oligode^ soxirribonucleótidos hibrida especificamente com o subfragaeii to EcoRI/HindIII indicado no mapa. Este e os fragmentos adjacentes foram reclonados em pTZ 18/19 (United States Biocheaical Corporation) e submetidos a análise de sequência de nucleó^

tidos. A sequência determinada e a sequência de ácidos aminados deduzida sao apresentadas na figura 3.

A sequência amino-terminal de ácidos aminados de uma banda de 10 kD também presente na preparação foi determinada e verificou-se corresponder a uma sequência de ADN a montante da sequência de 29 kD. Por conseguinte, a AT é provavelmente sintetizada sob a forma de uma proteína de 40 kD. Esta noção é confirmada pelo comprimento do mensageiro de AT, que foi demonstrado ser de 1500 bases (semelhante ao ARNm de sintetase de isopenicilina N que codifica para uma proteína de 38kD), tomando assim em consideração as regiões nao traduzidas de 3' e 5* de 100 bases.

As sequências de ácidos aminados das proteínas de 29kD (que foram extendidas para Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys—Gln-Leu—Pro—Asp—Gly—Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Trp—Àsp-Phe— -Ser-Ala—Thr-Lys-Gln-Ala) e de 10 kD revelaram a presença de dois lntroes. Um terceiro intrao é postulado com base na composição bruta eo ácidos aminados de proteína de 10 kD (97 resíduos) e na sequência de consenso para os seus limites (D.J. Ballance, Yeast 2 (1986)pp. 229-236). A presença do terceiro intrao foi confirmada por exteneão de iniciador e hibridaçao de mancha de Northern usando sondas ollgonucleótidlcas a partir de regiões de codificação e de nao codificação.

EXEMPLO 6

Construção de pPS47 gene da quinase de fosfogiicerato (pgk) foi isolado a partir dum banco genómico de Penicillium por métodos normais (Manlatis; Exemplo 1), usando o gene de levedura correspondente (Hitzeman et al., vide supra) como uma sonda de hibridaçao. A região do promotor de pgk é em par. te especificada pela sequência apresentada na Figura 5, a qual é localizada directamente a montante da região de codificação Pgk.

promotor de pgk de P.. chrisogenua

foi clonado em pTZ8R como um fragmento HlndlII de 1,5 kb e sjb leccionou-se um clone que tivesse a orientação desejada.

Subsequentemente, o gene de resistên. cia a fleomicina foi clonado num local de BamHI do poliligante deste clone sob a forma de um fragmento BaaHI - BglII de 1,0 kb, Isolado a partir de pUT702 (Cayla, Toulouse Cedex, France). 0 promotor de pgk foi fundido ao gene de resistência de fleomicina em concordância de quadro por fecho exterino do ciclo da sequência a ser apagada usando um oligonucleõtido com a sequência: í*

I

I

5*-GGA ACG GCA CTG GTC AAC TTG GCC ATG GGT AGT TAA TGG TAT G-3’

Para além disso, este oligonucleótido introduz um local Ncol na posição de ATG (sublinhado).

EXEMPLO 8

Verificação biológica e bioquímica

PA IDENTIDADE DOS CLONES AT

A identidade dos clones AT foi verificada por complementação de um mutante negativo em relação a aciltransferase de J?. chrysoRenum Wis 54 - 1255, npe 8.

Cotransformarem—se 2 x 10? protoplas^ tos de um derivado que necessita de uracilo de estirpe Wis 54— 1255 npe 8, Wis 54 — 1255 npe 8 pyrG (CBS 512.88) com uma mistura de 5 jj-g do plasmídeo selectivo pDC 13:: pyrG e 15 ^.g de ADN de B21 lambda como descrito previamente (EP-A-260762).

Obtiveram-se algumas centenas de transformantes dos quais se separam os conídios e depositaram em placas no meio de produção complexo do Exemplo 1 numa densidade de uma a dez colónias por cápsula de Petri. Depois de três dias de incubação a 25θϋ, as placas foram cobertas com uma suspençao de esporos de uma estirpe de um indicador Bacil las subtilis sensível à penicilina e incubadas toda a noite a

ο — —

C para determinar a dimensão das zonas de inibição no campo bacteriano.

A maior parte dos transformantes (75Z) apresentavam halos muito pequenos, semelhantes na dimejn sao aos da estirpe receptora pyrG npe 8 não produtora de peni. cilina. Os restantes 25Z mostravam largas zonas de inibição comparáveis ás da estirpe de tipo selvagem, Vis 54-1255. Concluíu-se que a primeira classe recebeu somente o plamídeo se— lectlvo pUC 13: :pyrG. enquanto o último tinha recebido tanto o pOC::pyrG como o lambda B21, que restabelece a produtividade da penicilina.

Para vários clones transformantes dos dois grupos o nível de actividade de AT em extractos isen. tos de células foi determinado como se segue: recolheu-se micélio depois de dois dias de incubação como descrito no Exemplo 3, lavou-se, congelou-se em azoto líquido e pulverizou-se. Para cada análise, suspenderam-se 2,5 de micéllo triturado em tampão de fosfato de potássio 50mH (pH 8,0) contendo ditiotrei. tol 5 mM e EDTA 5 mH (volume final 12,5 ml) e agitou-se duran te 25 minutos. 0 extrato isento de células foi obtido por cen trifugaçao da suspensão (5 minutos a 1000 x g).

Analizou-se a actividade AT por incju bação de 2 ml de extrato livre de células com 0,1 ml de ditio. treitol (10 mg/ml), 0,2 ml de ácido 6-aminopenlcilânlco (10 mg/ml) e 0,2 ml de solução de fenilacetil—coenzima A (20 mg/ ml) a 25°C.

Depois de 15 ou 30 minutos, a reac— çao foi interrompida por adiçao dum volume igual de metanol e centrifugou-se a amostra (20 minutos a 5000 x g). 0 sobrenadante foi em seguida analisado para determinar a penicilina G formada por métodos cromatográficos conhecidos na especlalida. de (HPLC). 0s resultados dum ensaio típico sao apresentados no Quadro 2 abaixo. Estes dados mostrem que nas estirpes transformadas (3) e (4) o nível da actividade de AT é aumenta, da 2 a 3 vezes para além da do tipo selvagem de acordo com a dosagem aumentada do gene.

aglomerado de IPNS mais AT foi sub.

clonado em pPS54, dando origem a pGJOl A e B. UM fragmento de 5 kb foi neutralizado pela acçao de uma poiimerase T4 de ADN e ligado no local HindIII singular de pPS54, depois do tratamento deste vector com poiimerase T4 de ADN.

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EXEMPLO 9

Aumento da produção da penicilina nuca estirpe hospedeira transformada com o gene críptico Y

Para mostrar o efeito dos genes aqnl identificados como envolvidos na produção da penicilina, a do, sagem genica de um destes genes foi aumentada numa estirpe hospedeira de Penicillium. Para este fim o gene Y, contido em clones lambda B9, L5 e G5, foi subclonado sob a forma de um fragmento BamHI-Sphl de 3,0 kb em pPS47. A construção resultante, pRH05, foi utilizada para transformação de £. chrysogenum Wis 54-1255 (ATCC 28089) e isolaram-se clones resistentes ã fleomicina. Vários clones foram testados para produção de penicilina em balões de Erlenmeyer agitados.

Os resultados obtidos para um transformante isolado sao apresentados no Quadro seguinte.

Quadro 3 estirpe produção relativa de penicilina

Wis 54-1255 100

Wis 54-1255::pRH05 122

A dosagem genica aumentada do gene Y no transformante, por comparaçao com o hospedeiro nao-trans— formado, foi confirmada por análise de mancha de Southern.

Por consequência, a dosagem genica aumentada do gene Y, um ge ne críptico, isolado pelo método da presente invenção, resulta num substancial aumento na produção de penicilina.

A dimensão da transcrição para o gene Y foi determinada por hibridação de mancha de Northern: a transcrição tem cerca de 1,0 kb de comprimento.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 1· Processo para o isolamento de fragmentos de ADN que se expressam durante o metabolismo de licro organismos e que são essenciais directa e indlrectamente para a produção de um metabolito secundário neste microorganlsmo, de preferência uma bactéria ou um fungo, caracterizado por compreender as fases de :

   (a) escrutínio de um banco de ADN preparado a partir do referido microorganlsmo com sondas obtidas a partir de ARNm ou de ADN derivado de uma primeira cultura do referido microorganlsmo, que produz o referido metabolito secundário;

   (b) escrutínio do referido banco de ÀDN com sondas obtidas a partir de ARNm ou de ADN derivado de uma segunda cultura do referido microorganlsmo ou de um seu mutante que não produz o referido metabolito secundário; e (c) identificação do gene contendo fragmentos transcritos na referida primeira cultura que nao sao substancialmente transcritos na referida segunda cultura.

   - 2· Processo para a preparação de uma construção de ADN caracterizado por compreender as fases de:

   (a) isolamento de fragmentos que sao expressos duran te a produção de um metabolito secundário de acordo com a reivindicação 1; e (b) subclonagem dos fragmentos Isolados para formar uma construção de ADN que contém o gene ou os ge. nes de interesse e todos os elementos de transcrição e de tradução necessários e opcionalmente um marcador de selecçao.

   - 36 3 (a) (b) (c) (d)

   4 _

   Processo para a obtenção ou para a elevação da produção de um metabolito secundário num hospedeiro microbiano caracterizado por compreender as fases de:

   preparação de construções de ADN de acordo com a reivindicação 2;

   transformação de um candidato a hospedeiro com estas construções de ADN;

   clonagem dos transformantes resultantes; e identificação de clones que produzem o referido metabolito secundário num nivel mais elevado do que o! referido candidato a hospedeiro.

   ί

   - 4* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas primeira e segunda culturas possuírem a capacidade de produzirem antibióticos de βlactama.

   - 5*

   I

   Processo de acordo com a reivindicação 1, i

   caracterizado por as referidas primeira e segunda culturas i

   serem culturas Penicillium, Aspergillus, Acremonium, Flavobacterium ou Actinomycetes . j

   -^6<* !

   I

   Processo para a preparação de um vector por incorporação de uma sequência que codifica um gene envolvido directa ou indirectamente na via biossintética que conduz a um metabolito secundário, opcionalmente um marcador para selecçãoi num hospedeiro que produz o referido metabolito secundário eí opcionalmente uma sequência para melhorar a efi37 ciência da transformação do referido vector no referido hospe^ deiro, caracterizado por o referido gene se_r seleccionado a partir de um grupo constituído pelo gene de aciltransferase, pelo gene críptico Y e pelos genes crípticos contidos inteira^ ente ou parcialmente nos fagos L12.I9, C12, P3, Kll, B13, B20, G3, Gl, LIO, Í16 e B23.

   - 7^a Processo para a preparação de um vector caracterizado por se incorporar uma sequência que codi. fica para a aciltransferase com uma estrutura conforme indica, da na Figura 3.

   - 8^a Processo de acordo com a reivindica, çao 6 caracterizado por se incorporar uma sequência que codifica para a aciltransferase a qual foi modificada por mutagénese de inserção, mutagéneee de supressão, uma combinação de utagéneses de inserção e de supressão ou mutagénese específi. ca para um local da sequência de AON especificada na Figura 3.

   - 9^a Processo de acordo com a reivindica, çao 6 caracterizado por o referido gene conter um promotor pa. ra a transcrição diferente do promotor endógeno.

   - 10^a Processo para a preparação de um hospedeiro transformado caracterizado por se utilizar na trans^ formação uma construção de ADN preparado de acordo com o processo da reivindicação 2.

   Processo para a preparaçao de um hospedeiro transformado em que se incorpora como resultado dè uma transformação uma cópia de uma sequência contendo um gene funcional no referido hospedeiro e que codifica para uma proteína directa ou indirectamente envolvida na via biossintétlca que conduz a um metabolito secundário dando como resultado uma produção mais elevada no referido metabolito secundário caracterizado por o referido gene ser selectionado a partir de um grupo constituído pelo gene da aciltransferase, pelo ge. ne críptico Y e pelos genes crípticos contidos inteiramente ou parcialmente nos fagos L12, 19, C12, P3, 111, B13, B20, G3, Gl, LIO, K16 e B23.

   - 12» Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11 caracterizado por o referido hospede^ ro possuir a capacidade de produzir antibióticos de $— lactama .

   - 13» Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11 caracterizado por o referido hospedei, ro ser um Penicillium. Aspergillus, Acremonium, Fiavobacterlum ou ActinomYcetes♦

   - 14» Processo de acordo com a reivindica, ção 10 caracterizado por o referido metabolito secundário ser uma £ -lactama.

   - 15^aProcesso de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por a referida β-lactama ser penicilina.

   - 16^a Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido hospedeiro ser da espécie Penicillium chrysogenum ou Acremonium chrysogenum ou E. coli.

   - 17 ^a Processo de acordo com a reivindicação 13j caracterizado por o inicio de transcrição do referido gene set regulado por uma região de regulação de inicio de transcrição !> i diferente da de tipo selvagem.

   h í; - 18 ^a - ί

   Processo para a preparação de uma construção de ADN caracterizado por se incorporar o promotor do gene da quinase de fosf oglicerato de P. chrysogenum e genes preparados de acordo com a reivindicação 2 sob a regulação dei transcrição do referido promotor.

   Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o marcador de selecção ser um gene dei resistência à fleomicina o qual é expresso sobe a regulação de transcrição do promotor do gene de quinase de fosfoglicerato.

   i

   - 20^a !

   í

   Processo para a preparação de uma construção de ADN recombinante caracterizado por se incorpo40 rar o promotor e a sequência de activação de tradução do gene de aciltransferase de Penlcillium chrvsogenum.

   - 21· Processo para a preparação de uma construção de ADN recoabinante caracterizado por se incorporarem as sequências de regulaçao 3' do gene de aciltransferase de Penlcillium chrysogenum.

   - 22· Processo para a preparaçao de uma construção de ADN caracterizado por se incorporar una sequência de reforço de transformação que contém a sequência da Figura 4 junta a uma outra sequência diferente da de tipo selva.

   gem.

   - 23· Processo de acordo com a reivindica^ ção 22 caracterizado por a referida sequência diferente da de tipo selvagem conter um gene que codifica para uma actlvldade enzimátlca ou Penlcillium.

   - 24· Processo para melhorar os rendimentos de um metabolito secundário antibiótico caracterizado por compreender as fases de:

   (a) cultura de um hospedeiro transformado contendo uma copla extra de uma sequência contendo um gene, Isolado de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1 ou 2, que codifica para uma proteína directa ou indirectamente envolvida na via biossintética de um metabolito secundário an. tlblótlco dando como resultado uma produção mais (b) elevada do referido antibiótico; e isolamento do antibiótico resultante.

   - 25« Processo de acordo com a reivindica, ção 24 caracterizado por o referido antibiótico ser uma -laç. taaa.

   - 26^a Processo de acordo com a reivindica, ção 25 caracterizado por o referido hospedeiro ser um Penicll llum, Aspergillua, Acremonium, Flavobacterium ou Actinomycetes.

   - 21* Processo de acordo com a reivindica, ção 26 caracterizado por o referido hospedeiro ser Penicillium chrysogenum.

   - 28^a Processo de acordo com a reivindica^ çao 24 caracterizado por o referido gene codificar para a a— ciltransferase.

   I

   - 29^a Processo de acordo com a reivindica, çao 24 caracterizado por o referido gene codificar para uma proteína com uma estrutura conforme a apresentada na Flg. 3.

   - 30^a Processo de acordo com a reivindica.

   çao 24 caracterizado por o referido gene críptico Y.

   A requerente reivindica as priorida. des dos pedidos de patente europeia apresentados ea 11 de A— gosto de 1988 e ea 3 de Março de 1989, sob os n^fls 88201714.8 e 89200522.4, respectivaoente

   Lisboa, 9 de Agosto de 1989 o AfiE5i2 OFICIAL DA PROPRIEDADE LVA LS^l.lAL

   RESUMO

   PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DE GENES BIOSSINTÊTICOS OU DE REGULAÇÃO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE METABOLITOS SECUNDÁRIOS

   A invenção refere-se a uo processo para o isolamento de fragmentos de ADN que se expressam durai* te o metabolismo de microorganismos e que são essenciais directa ou indirectamente para a produção de um metabolito secundário ou indirectamente para a produção de um metabolito secundário neste microorganisfco, de preferência uma bactéria ou um fungo, que compreende as fases de:

   (a) escrutínio de um banco de ADN preparado a partir do referido microorganismo com sondas obtidas a partir de ARNm ou de ADN derivado de uma primeira cultura do referido microorganismo, que produz o referido metabolito secundário;

   (b) escrutínio do referido banco de ADN com sondas obtidas a partir de ARNm ou de ADN derivado de uma segunda cultura do referido microorganismo ou de um seu mutante que não produz o referido metabolito secundário: e (c) identificação dos genes na referida primeira cul. tura que não são substanclalmente transcritos na referida segunda cultura.