PT93300B - Processo para a sintese de proteinas utilizando vectores de expressao na levedura de cisao schizosaccharomyces pombe - Google Patents

Description

A invenção refere-se a vectores de expressão particularmente apropriados para a síntese de proteínas na levedura de cisão Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Estes vectores de expressão possuem, para além de outros elementos vantajosos, um forte promotor homólogo.

Utilizando métodos de engenharia genética foi possível sintetizar proteínas tanto homólogas como heterélogas, em grandes quantidades, em levedura. Como hospedeiro utilizou-se até agora o fermento de padeiro Saccharomyces cerevisiae, porque foi para esta levedura que se desenvolveram em primeiro lugar sistemas de expressão e métodos de transformação. Para outras leveduras, como por exemplo representantes do género Kluyve romyces, Hansennha, fichia e Schwannomyces, sé mais tarde se desenvolveram sistemas de expressão, uma vez que, utilizando estas leveduras, se tinha um menor conhecimento geral da genética clás sica e molecular. Para a síntese de proteínas heterélogas na le1

vedura de cisão S, pombe existiam até agora apenas um reduzido número de referências. S. pombe é uma das quatro espécies do género Schizosaccharomyces (Lindnor). As outras três espécies são:

S. japonicus, S. malidovorans e S. Octosporus. Apenas da espécie

S. pombe existem estirpes auxotropicas, que possibilitam trabalhos de engenharia genética em analogia com o fermento de padeiro .

S. pombe está, do ponto de vista da evolução, num ponto mais elevado do que o fermento de padeiro e comporta-se em muitos aspectos mais como as células dos mamíferos do que como o fermento de padeiro. Deste modo, por exemplo Lee e Nurse (Nature 327, (1987), pag. 31-35) puderam identificar o gene humano que 1 tem homologia com o gene cdc2 de S. pombe, por meio de complemen tação neste organismo. As paredes celulares do fermento de padei ro são constituídas principalmente por hidratos de carbono, em especial por manano e chitina. As leveduras de cisão contêm para além de β-glucano (46-54$) e de o(-glucano (28$), ao contrário do fermento de padeiro, também galactomanano (9-14$) na parede celular, nomeadamente na periferia da parede celular e próximo do plasmadema. 0 galactomanano é constituído por um esqueleto ligado (l-6) com duas unidades de manose ligadas (l-2) e grupos galactose terminais. A invertase de S. pombe é uma glicoproteína, que possui unidades galactose terminais, enquanto que a parte de hidratos de carbono da invertase do fermento de padeiro é apenas constituída por manose. A capacidade das leveduras de cisão de poderem construir hidratos de carbono e glicoproteínas mais complexas do que o fermento de padeiro, pode ser um critério decisi; vo para a actividade, estabilidade e antigenidade biológicas das proteínas recombinantes. Uma outra vantagem de S. pombe em relação ao fermento de padeiro em processos de biotecnologia pode ser a propriedade de se multiplicarem a 37° 0-42° C. Para se poder utilizar determinados organismos como hospedeiros para a pre paração de proteínas por engenharia genética, tanto esses organismos como os vectores de clonagem têm de obedecer a determinadas condições.

. São desejáveis as seguintes características:

. 1. A estirpe de levedura deve ter um ou mais marcadores auxotré~ 2 =

ficos, de preferência defeitos nos enzimas biossintéticos do metabolismo dos aminoácidos ou das purinas-pirimidinas.

2. 0 vector deve

a) possuir, para a replicação autónoma, as chamadas ^l(origins of replication” (Ori) ou “autonomously replicating sequences” (ars), tanto para a levedura como para uma célula procariética, de preferência para E, coli

b) dispor de um promotor forte para a iniciação da desejada transcripção de mRNA

c) possuir um terminador de transcrição, de modo que o transcripto de mRNA exprimido tenha um comprimento definido

d) dispor de uma posição de corte de restrição singular entre o promotor e o elemento terminador para a clonagem do DNA estranho

e) possuir um gene resistente para a seccionação em bactérias (p. ex, resistência à ampicilina)

f) possuir genes para a complementação dos marcadores auxotréficos da estirpe, que conferem à estirpe a correspondente prototera.pia

g) não ser demasiado grande apesar de todas as funções desejadas, pois caso contrário diminui muito, por exemplo, a eficiência de transformação,

Dos critérios aqui apresentados, conseguiram-se as propriedades específicas do hospedeiro com três estirpes de S. pombe, que apresentam defeitos no metabolismo do uracilo, ou da leucina ou da arginina. Existe assim uma estirpe de S, pombe que é deficiente para a oritidina 5’-fosfatodescarboxilase (ura 4). Uma outra estirpe já não é capaz de sintetizar a isopropilmelatodesidrogenase Intacta (Leu l). 0 marcador ura 4 de S. pombe pode ser complementado pelo correspondente gene Ura 3 de S. cerevisiae, e o gene Leu 1 de S. pombe pelo gene Leu 2 do fermento de padeiro. Uma estirpe Arg 7-1 de S. pombe pode ser complementa da pelo gene Arg 7 elonado, que codifica para a argininosuccinatoliase.

As transformações de S. pombe com um plasmídeo (pDB248) encontram-se descritas pela primeira vez por Beach e Nurse (Nature 290,(1981), pag. l4o-l42). 0 vector construído por estes autores possui um elemento que capacita o plasmídeo para a replicação autónoma, mas verificou-se que este vector não se mantém estável nas células e se decompõe durante a segregação mitótica. Um outro vector (pFL20), que foi desenvolvido por Losson e Lacroute (1983) Cell 3-2, 371-377, contém ainda, para além do elemento ars, uma unidade de DNA (stb), que possibili ta que o plasmídeo na mitose se continue a transmitir simetricamente à célula mãe e à célula filha. Enquanto que o vector pDB248 permite às estirpes leu 1 uma prototrofia da leucina, o plasmídeo pFL20 confere às estirpes ura 4 a capacidade para a síntese do uracilo. Os respectivos transcriptos de mRNA iniciam-se por meio de promotores dos genes de fermento de padeiro na levedura de cisão. Estes exemplos mostram que os sinais de início de transcripção do fermento de padeiro são funcionais na levedura de cisão.

Os inícios de transcripção dos genes do fermento de padeiro não são contudo idênticos às posições correspondentes em sistemas homólogos em S. pombe (Russel, (ΐ9θ3) Nature 301, pag. I67-I69). Existem também diferenças na terminação de transcripção.

Descobriu-se então que a expressão de genes estranhos em S. pombe pode ser aumentada quando se utilizam promotores e terminadoree de S. pombe. Isto é válido em geral para a utilização de promotores e terminadores homólogos em Sohizosaccharomyces.

À invenção refere-se sucessivamente e de preferência a vectores para a expressão de genes estranhos em S. pombe, contendo estes vectores um promotor de S. pombe, de preferência o promotor do gene alcooldesidrogenase de S, pombe, e um terminador de S. pombe, de preferência o gene activa de S, pombe, para além de outros elementos da estrutura do vector. Estes outros elementos são isoladamente ou em combinação um gene de resistência a antibióticos em E. coli, uma origem de replicação em E, co li, uma origem de replicação e o elemento ”stb” para S. pombe e

um gene complementar para a auxotrofia desejada do hospedeiro de S. pombe, de preferência o gene Ura 3 de S, cerevisiae para a complementação da deficiência ura 4 de S. pombe, e ainda, por exemplo o gene Arg 7 de S. pombe ou o gene Leu 2 de S. cerevisiae,

A invenção encontra-se ilustrada em detalhe nos exem pios e nas reivindicações da patente.

Exemplos;

Exemplo 1; Construção de vectores vector pFL20 serviu como substrato para a mediação da resistência à ampicilina em E, coli, da função “ori¹· em E. coli, da função ori e ”stb” em S. pombe e do gene Ura 3 de S. cerevisiae para a complementação do gene Ura 4 de S. pombe. Digeriu- se o plasmídeo pFL2O com BamHI e PvuII, encheram-se os extremos 5’ salientes com polimerase (fragmento de Klenow) e isolou-se o fragmento de DNA com cerca de 5»9 hbp de comprimento. Neste vector preparado que já não tem o gene de resistência à tetraciclina original clonou-se a região de controle (promotor do gene de alcooldesidrogenase (ADH) de S. pombe, na qual se situam as posições de reconhecimento para a iniciação e para a transcripção. Para tal utilizou-se um fragmento de DNA de cerca de 0,7 kbp que tem o extremo 5* antes do sinal de iniciação de translacção do gene ADH e que termina com a posição EcoRI até à posição 54 bp antes do codão de início ATG. Como fonte para o fragmento promotor ADN utilizou-se o fragmento de DNA Sphl-Hind III de 0,7 hbp do plasmídeo pEVPll, que por sua vez se obteve clonando o fragmento de DNA EcoRI-Sphl, que contém o promotor ADH de S, pombe, juntamente com o fragmento de polilincagem EcoRI-HindIII de pUCl2 no vector cápsula ΎΕρ13 de S. cerevisiaeΞ. coli, após digestão com EcoRI e Sphl (Fig. l).

novo vector obtido pMB 229 tem, em relação ao pias, mídeo pEVPll, a vantagem de; l) se poder replicar em S, pombe de forma estável e autónoma, 2) se terem removido as zonas de DNA não essenciais, como as zonas codificantes do gene de tetraciclina de E. coli e do 2 u DNA de S. cerevisiae, e 3) o vector = 5 =

com cerca de 6,6 ter, como vector de levedura, a dimensão correç ta. A posição de corte singular BamHI no extremo 8* do promotor ADH oferece a possibilidade de clonar genes estranhos e de controlar assim a expressão do gene estranho sob a acção do promotor ADH.

No extremo 3’ a contar do promotor ADH introduziu-se uma unidade de terminação de transcripção no vector pMB229. Para tal isolou-se o fragmento de DNA Bam HI-HaelII de 0,42 kbp do gene activa de S. pombe, que contém o terminador de transcripção, a partir do plasmídeo pSPA2 (Mertins e Gollwitz, Nucleic Acids Research 15, 7369-7379 (ΐ9θ7))» e clonou-se em pMB229. Para isso digeriu-se primeiro o pMB225 com Nhel, encheram-se os extre mos 5’ salientes com polimerase I (klenow), digeriu-se depois o plasmídeo com BamHI, e isolou-se o fragmento de DNA com 6,45 kbp e ligou-se com o fragmento de DNA de 0,42 kbp de p SPA 2. Assim, o novo plasmídeo pMB332 (Fig· l) possui uma unidade de iniciação de transcripção e de terminação a partir de dois genes diferentes de S. pombe, nomeadamente do gene ADH e do gene actina. A transcripção na parte promotora do ADH deve começar 2 h bp antes da posição BamHI singular, de modo que na clonagem de um gene estranho se forme um iriRNA híbrido contendo partes do gene ADH, do lincantes de DNA originário de pUCl2, e do DNA clonado no vector pMB322. Entre o início de transcripção e a posição Bam Hl não existe qualquer codão de início de translacção, de mo do que o primeiro tripleto ATG do mRNA recombinante pode funcionar como início de translacção. Os sinais para a terminação da transcripção situam-se a 8 bp do extremo 3’ da posição Ciai. No gene activa a terminação ocorre nos bp + 59 θ + 60. No vector pMB 332 estes fins de terminação situam-se a 117 e 118 bp do extremo 3* das posições BamHI singulares, de modo que, conforme o DNA estranho clonado, existe uma zona 3’-não translaccionável no RNA recombinante, isto é, no DNA estranho clonado existem sinais de transcripção eficientes.

Exemplos 2 e 3í

A aplicabilidade do vector de expressão para a sínte se de proteínas estranhas em S, pombe, testou-se numa proteína = 6 =

procariótica, a beta-galactosidase (betagal) de E. coli, e numa proteína eucariótica, o factor de coagulação FXIII a humano.

Exemplo 2: Síntese da beta-galactosidase

Para a síntese da betagal e S. pombe preparou-se o plasmídeo pMB33^· A construção efectuou-se do «eguinte modo: Tratou-se o fragmento de DNA Hind-III-Ncol de cerca de 3000 bp, codificante da betagal, do vector pLG400 (Guarente et al., Cell 20, (1980) 5^3-553) com o fragmento polimerase I de Klenow, e clonou-se na posição Bam HI de pMB33^, também tratado com Pol I. No novo plasmídeo pMB33^ a transcripção do DNA codificante da betagal está agora sob controle do promotor ADH. 0 vector pMB334 transformou-se na estirpe uracito-auxotrófica de S. pombe ura 4-294, de acordo com o método de Broker (Biotechniques, (1987) 516-517). Em extractos celulares destes transformantes, conseguiu identificar-se , em testes, de acordo com o método de Miller, betagal enzimaticamente activa, e as colónias de S. pombe (pMB33M aparecem coradas, em meio nutriente de agar, com o indicador azul de XGal, enquanto que as células não transformadas permanecem incolores.

Exemplo 3* Síntese do factor (F) XlIIa

Para a síntese de FXIII em S. pombe preparou-se o plasmídeo ρΜΒ333· A construção efectuou-se do seguinte modo: Tratou-se o fragmento de DNÁ. BcoEI-Hind III de cerca de 2400 bp, do vector pTrcSSA-FXIIIa (Amann et al., Gene 69, 301-315,

1988), que contém o cDNA para o FXIIIa, com Poli, e ligou-se na posição singular BamHI do plasmídeo pMB332, também tratada com Poli. No novo plasmídeo a transcripção do cDNA do FXIIIa está sob controle do promotor ADN. 0 vector pMB333 transformou-se em S, pombe ura 4-294. Em extractos celulares, cultivados num meio complexo com agitação, puderam identificar-se, num teste ELISA específico específico, 2 mg de FXIIIa/l. Num teste de actividade de acordo com o método de Karges (em: Methods in Enzymatic Ánalysis, Vol. 5» pag. 400-405 (Bergmeyer, H.V.ed.), 1984) determinou-se a mesma concentração de FXIIIa, Em análises Western . Blot conseguiu provar-se que o FXIIIa de levedura tem o mesmo ’ comportamento de eluição que o FXIIIa placentário, sendo por = 7 =

isso idênticos os respectivos pesos moleculares.

Exemplo 4: Construção de um vector ATG” de S, pomtoe

Quando é necessário exprimir fragmentos de proteína que não possuem metisina aminoterminal, que é codificada pelo codão de início de translacção, este sinal pode ser transmitido através do vector. Para isso transformou-se o plasmídeo pMB332 num vector ATG” (ρΜΒ34θ).

Abriu-se o pMB33^ com BamHT e digeriram-se as cadeias simples de DNA salientes eom Sl-Nuclease de feijão de soja. Construiu-se assim um oligonucleótido que inclui um sinal de início de translacção ATG (vide Fig. 2). Ao codão ATG seguem-se uma posição BamHI e uma posição Bglll, nas quais se pode introduzir DNA estranho, de modo que a sequência codificante da proteína esteja na ordem de leitura com o codão ATG^^. Directamen te a seguir ao tripleto ATG segue-se um codão TCT, que codifica para a serina. Garante-se assim que a proteína exprimida tenha um tempo de vida média longo; pois as proteínas que começam por Met-Ser aminoterminal possuem ura tempo de vida médio longo. A partir destas proteínas remove-se a metionina através da metioninaminopeptidase e modifica-se a serina por meio de uma N-acetiltransferase. Um produto de translacção primário, codificado pelo vector pMB34O, tem assim a formula Met-Ser-polipéptido, podendo modificar-se a proteína recombinante pés-translaccional no Ac-Ser-polipéptido.

Além disso, pode cortar-se com Dral o DNA clonado no vector pMB34O e introduzir-se como cassete noutros vectores. Na transferência transmite-se também a sequência de pares de bases AAA, que se situa no extremo 5' antes do codão de início de translacção ATG, o que oferece a vantagem de na posição 3 antes do início de translacção no mRNA existir uma A, o que origina uma translacção eficiente. 0 vector ρΜΒ34θ oferece assim a possi bilidade de exprimir eficientemente cada fragmento de proteína em S. pombe, encontrando-se de dois a seis aminoácidos adicionais no terminal aminados da proteína recombinante.

Exemplo 5s Expressão de FNIIIa’ por meio do vector ATG” pMB34O

Transforma-se FXIIIa, por acção da trombina, em = 8 =

FXIIIa· activo. Para tal cinde-se a sequência peptídica aminoterminal (péptido de activação) entre as unidades Arg^ e Gly^g. Nestas posições de corte da trombina encontra-se, ao nível do cDNA, uma posição de corte Smal singular, com a qual se pode separar a região de CDNa codificante do FXIIIa· da região codificante de péptido de activação. Em seguida digeriu-se o cDNA do FXIIIa com Smal e HindIII, encheu-se a posição HindIII com polimerase I de Klenow na presença de dNTPs e ligou-se um lincante BglII de oito elementos (5’-CAGATCTG-3’) ao cDNA que agora codifica para o FXIIIa·. Após digestão com BglII ligou-se o cDNA específico para o FXIIIa’ ao pí-ÍB34o linearizado com BamHI 0 novo vector pI«IB357 codifica assim para nm FXIIIa já activado que, devido ao vector e ao processo de clonagem possui cinco ami. noácidos adicionais no terminal aminado.

Este FXIIIa’ modificado sintetizado em S. pombe tinha já sem activação pela trombina actividade de transglutamina se.

Estes exemplos mostram que, por meio dos novos plasmídeos de expressão obtidos pMB332 e ρΜΒ34θ, se podem preparar proteínas estranhas procarióticas e eucarióticas, numa forma activa, em S. pombe. Além disso, podem introduzir-se posições de restrição 3’-terminais adicionais do promotor ADH, que permitem ligações de DNA estranho na orientação desejada. Através da introdução de uma sequência do DNA com a sequência de bases ATG pode criar-se um sinal para a iniciação da translacção e, desse modo, conseguir também a expressão de fragmentos de genes sem sinal de início de translacção próprio. Uma vez que o tempo de vida media da proteína estranha e das modificações pós-translaccionais podem ser dependentes da estirpe, pode também, por meio da troca do marcador ura no plasmídeo pNB332 p.ex. pelo marcador Leu 2 ou pelo marcador Arg 7» modificar o vector de expressão, pois também se podem transformar as estirpes anxotróficas de S. pombe Leu 2 ou Arg 7·

Claims (1)

1. Processo para a preparação, por engenharia genética, de proteínas estranhas em representantes da estirpe (género) Schizosaccharomyces (S,), caracterizado por se empregarem vectores de expressão que, para além da estrutura básica do vector que garante tuna replicação autónoma e estável do plasmídeo em S. pombe, contém ainda os seguintes elementos:

   (a) um promotor do género Schizosaccharomyces e (b) um terminador do género Schizosaccharomyces.

   - 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem proteínas utilizando vectores nos quais os elementos (a) e (b) acima definidos são homólogos à espécie hospedeira.

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se prepararem proteínas por expressão de genes estranhos em S, pombe, em cujos vectores de expressão:

   (a) é um promotor de S. pombe, e (b) é um terminador de S. pombe, _ 4- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se prepararem proteínas utilizando vectores de expressão, nos quais:

   (a) é o promotor ADH de S. pombe, e (b) é o terminador do gene activa de S. pombe.

   _ 5& „

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   - 10 a

   1, 2, 3 ou 4, caracterizado por se prepararem proteínas empregando o vetor de expressão PMB332.

   - 6s Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem proteínas empregando o vector de expres são ATG PMB34O.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido ale mão apresentado em 2 de Março de 1989» sob ο N9 p 39 06 540.5»