PT93685A - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra compostos tetraciclicos - Google Patents

Description

0 invento diz respeito a anticor pos monoclonais dirigidos contra R-(-)-oxaprotilina e contra o seu metabolito beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina, seus derivados, processos para a preparação destes anticorpos e seus derivados, linhas celulares de hibridomas que secretam os anticorpos monoclonais, pretendidos , processo para a prepara, ção de tais hibridomas, "Kits" de testes contendo os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados e à utilização dos anticorpos monoclonais e/ou seus derivados para a determinação qualitativa e quantitativa de R-(-)-oxaprotilina e beta-glucu roneto de R-(-)~oxaprotilina e para o tratamento de uma toxi-cose provocada por uma sobredose de R-(-)-oxaprotilina.

Fundamento do invento A R-(-)-oxaprotilina é um composto tetraciclico da fórmula (I). ^ \ /l\ / ^ ' · · ·

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á útil como anti-depressivo e apresenta, por exemplo, propriedades anti-agressivas e anti--histaminicas, A produção de R-(-)-oxaprotilina está descrita na Patente Europeia 0014433. No organismo humano, a R-(-)-o- -4— xaprotilina é predominantemente metabolizado para beta-glucu-roneto de R-(-)-oxaprotilina da fórmula -4—/\ /í\/\ #' ·. · · · (II)

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/ Íh o qual é excretado na urina.

Quando do tratamento de um paciente que sofre de depressão usando um anti-depressivo como se ja R-(-)-oxaprotilina, deve-se ter em consideração que cada indivíduo reage de modo diferente devido à grande variabilida de individual dos metabolismo da droga nos doentes e portanto da relação entre dose,, nível no plasma e resposta clínica, á portanto necessário prescrever a dose terapeuticamente eficaz individualmente para evitar riscos devido à sobredosagem e para controlar cuidadosamente a terapia anti-depressiva. Ainda, o sucesso da terapia baseia-se em grande parte na concordância do doente, i.e.f o grau em que as ordens do médico são seguidas relativamente à medicação. 0 problema da não concordância do paciente é muito vulgar o que torna dificil de avaliar a resposta do doente à droga e também provoca custos des necessários quanto a medicação é receitada e não ingerida.

Para os fins atrás descritos, os métodos de determinação do composto terapêutico ou seus meta-bolitos no sangue total, plasma, soro e/ou urina são os mais

,ο adequados. Em princípio existem várias técnicas analíticas para a medição da concentração da droga era fluídos do corpo, e. g, cromatografia gasosa, cromatografia liquida de alta pressão e similares. Poucos serviços médicos e laboratórios podem suportar o seu uso de rotina devido aos custos elevados e à necessidade de técnicas especialmente treinados. Especialmente nos consultórios médicos privados é óbvio que é impraticável fazer qualquer controle de drogas que necessite de instrumentação sofisticada. Ê pois desejável desenvolver testes analíticos mais fáceis e menos dispendiosos para a R-(-)-oxaprotili_ na e/ou seus metabolitos. 0 mais adequado para resolver este problema serão os imunoensaios baseados em anticorpos monoclo nais selectivos dirigidos contra R-(-)-oxaprotilina e seus metabolitos como seja beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina.

Objectivo do invento

Constitui um objectivo deste invento proporcionar anticorpos monoclonais que são altamente es» pecíficos para o -.aniidepressivo R-(-)-oxaprotilina e seu meta-bolito beta-glucuroneto de R-(~)-oxaprotilina. Os anticorpos monoclonais podem ser usados para controlar a distribuição e concentração da droga no sangue total, plasma ou soro e para detectar e determinar o metabolito na urina. Assim, eles são instrumentos preciosos no controle de uma terapia anti-depres-siva com R-(-)-oxaprotilina relativamente à determinação da do se eficaz e concordância do paciente. Ainda, tais anticorpos monoclonais podem ser usados na desistoxicação de pacientes com sobredosagem devido a sua elevada afinidade de ligação à R-(-)--oxaprotilina. -6-

Descrição do invento 0 invento diz respeito a anticorpos monoclonais dirigidos contra R-(-)~oxaprotilina e/ou contra o seu principal metabolito beta-glucuroneto de R-(-)--oxaprotilina, de preferência dirigido contra R-(-)-oxaproti-lina e seus derivados gue mantêm a sua especificidade para determinantes antigénicos dos referidos compostos. São preferidos os anticorpos mo noclonais e seus derivados qua apresentam pouca ou nenhuma reactividade cruzada com substâncias que sejam estruturalmente semelhantes k R-(-)-oxaprotilina e ao seu beta-glucuroneto especialmente anticorpos monoclonais e seus derivados que se-lectivamente se liguem a R-(-)-oxaprotilina na presença de ou tros compostos de dibenzobiciclo /2,2,2 /-octadieno que diferem da R-(-)-oxaprotilina em modificações químicas da estrutu ra do anel tetraciclico e/ou na cadeia lateral alifática. São também preferidos anticorpos monoclonais e/seus derivados que selectivamente se liguem a R-(-)-oxaprolilina na presença de outras drogas terapêuticas sem o esqueleto dibenzobiciclo/2, 2,2/-octadieno as quais são potencialmente usadas em combinação com R-(-)~oxaprotilina, por exemplo neurolépticos, ansio-liticos, psicotrópicos, anti-epilépticos ou anti-arritmicos. São também preferidos os anticorpos monoclonais e seus derivai dos que selectivamente se liguem a R-(-)-oxaprotilina na presença de S-(+)~oxaprotilina, São mais preferidos os anticorpos monoclonais com a designação MAb 1219S59.il, MAbl219S78.6, MAfo 1220S36.3, MAb 1225S93.2, MAb 1226S31.3, MAb 1228P54.6 e u

MAb 1228P63.1, especialmente o MAb 1219359*11, MAb 1219S78.6, MAb 1226S31.3 e MAB 1228B63 e seus derivados.

As afinidades dos anticorpos m£ noclonais do invento para R-(-)-oxaprotilina podem ser determinadas por exemplo num imunoensaio de inibição de enzimas de acordo com Friguet et al., (J, Immunol. Methods 77, 305, 1985] em que o anticorpo monoclonal a ser testado é pré-incubado com R-(-)-oxaprotilina e, num segundo passo, exposto a uma fase sólida revestida com um conjugado adsorvível de R-(-)-oxaprotj_ lina, e.g., um conjugado de proteína. A fracção do anticorpo monoclonal não envolvida nos imunocomplexos liga-se à fase só lida e é quantificada por um conjugado de enzima-segundo anticorpo dirigido contra o anticorpo monoclonal. Ao afinidades são expressas em valores de IC^q (concentração de inibição), i.e., a concentração do antigénio livre que provoca uma inibi ção de 50% da ligação do anticorpo ao antigénio na fase sóM da. A selectividade dos anticorpos monoclonais do invento é testada através da análise da inibição da ligação do anticorpo monoclonal a R-(-)-oxaprotilina por compostos estruturalmente semelhantes, e.g. por outros com postos de dibenzo-biciclo/2,2,2/octadieno que diferem da R--(-)-oxaprotilina por modificações químicas da estrutura do anel tetraciclico e/ou cadeia lateral alifática por compostos terapêuticos que não possuem o esqueleto dibenzobiciclo/2,2, 2/-octadieno os quais são potencialmente usados em combinação com o anti-depressivo e pelo enantiómero S-(+)-oxaprotilina. Isto pode ser feito, por exemplo, num imunoensaio de inibição com enzimas em que os anticorpos monoclonais do invento são pré-incubados com qualquer um dos compostos solúveis referidos -8- atrás e a mistura de incubação é então testada no imunoensaio com enzimas descrito atrás.

Os derivados dos anticorpos mono clonais deste invento retêm a sua especificidade para os detejc minantes antigéniass de R-(-)-oxaprotilina e/ou beta-glucurone to de R-(-)-oxaprotilina, i,e. eles mantêm o padrão de ligação característico do anticorpo parental aos referidos compostos. São exemplos de tais derivados conjugados dos anticorpos mono-clonais com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca qui-mioluminescente, um quelato de metais, avidina, biotina ou similares, anticorpos ou fragmentos de anticorpos marcados radio activamente.

As enzimas usadas para os conjugados de anticorpos do invento são por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, B-D-galactosidade, glu-cose-oxidase, glucoamilase, carbo-anidrase, acetilcolinestera-se, lisozima, malato-desidrogenase ou glucose-6-fosfato-desi-drogenase. Os marcadores fluorescentes conjugados com os anticorpos monoclonais do invento são fluorescentes fluorocrómio, rodamina e aimilares. As marcas quimioluminescentes são e.g., ésteres de acridinio ou luminol. Em tais conjugados o anticorpo é ligado ao par de conjugação directamente ou através da um espaçador ou grupo de ligação. São exemplos de metais guelato-res o ácido etilenodíaminatetracético (EDTA), ácido dietileno-triaminopentacético (DPTA), 1,4,8,11-tetra-azatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetra-azatetradecano-l,4,8,11-tetracético, ácido l-oxa-4,7,12,15-tetra-aza-haptadecano-4,7,12,15-tetra-acétjL co ou similares. -9-

Os anticorpos monoclonais marca- 123 125 dos radioactivamente contêm e.g. iodo radioctivo ( I, I, 131I), itrío (90Y), tecnécio ("mTc) ou similares.

Os fragmentos de anticorpo do invento são por exemplo os fragmentos univalentes Pab (Fab= fragmento de ligação ao antigénio) ou Fab* e o fragmento diva-lente F (ab') 2 ·

Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se, caracterizados por células de hibridomas como definidos abaixo secretarem os anticorpos monoclonais pretendidos serem multiplicados de acordo com métodos conhecidos in vitro ou Quando necessário os anticorpos monoclonais resul tantes são isolados e/ou convertidos nos seus derivados. A multiplicação in vitro foi efectuada em meios de cultura adequados, os quais são os meios de cultura convencionais, por exemplo Dulbecco's Modified Eagle Médium {DMEM) ou meio RPMI 1640 , facultativamente suplementado por um soro de mamífero, e.g, soro fetal de vitela ou micronu-trientes e elementos de suporte do crescimento, e.g, células de suporte tais como células do exudado peritoneal de ratinhos normais, células do baço ou macrófagos da medula óssea, 2-ami-noetanol, unsulina, transferrina, lipoproteína de baixa densidade, ácido oleico ou similares. -10-

A produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puros e permite um au mento de escala para se obter grandes quantidades dos anticor pos pretendidos. As técnicas para a cultura de hibridomas em larga escala em condições de cultura de tecidos são conhecidos e incluem cultura em suspensão homogénea, e.g. num reac-tor com entrada de ar ou num reactor de agitação contínua ou cultura de células imobilizadas, e.g. em fibras ocas, microcá psulas ou microesferas de agarose ou cassetes de cerâmica.

Para isolamento dos anticorpos monoclonais, as imuno globulinas nos sobranadantes de cultura são primeiro concentradas, e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise material bigroscópico como seja polietile-noglicol (PEG), filtração, através de membranas selectivas ou similares. Se necessário e/ou pretendido, os anticorpos concentrados são purificados pelos métodos de cromatografia habi, tuais, por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuto iónica, cromatografia em DEAE-celulose ou Proteína A ou coomsi tografia de imuno afinidade.

Grandes quantidades dos anticojr pos monoclonais pretendidos podem também ser obtidos através da multiplicação de células de hibridoma in vivo. Os clones celulares são injectados em mamíferos os quais 3ão histocompa tíveis com as células parentais, e.g. ratinhos singeneicos, para provocar o crescimento de tumores produtores de anticorpo Facultativamente, os animais são primeiro injectados com um hjl drocarboneto, especialmente óleos minerais tais como pristano (tetrametil pentadecano) antes da injecção. Como exemplo, as célulae de hibridoma derivadas de ratinhos Balb/c são injecta das intraperitonealmente em ratinhos Balb/c facultativamente pré-tratados com pristano e passadas uma ou duas semanas o li quido ascático destes ratinhos é colhido. Os anticorpos mono-

clonais pretendidos são isolados a partir dos fluidos corporais por métodos convencionais como descrito atrás.

Os conjugados de anticorpos do invento são preparados por métodos conhecidos, e.g. por reacção de um anticorpo monoclonal preparado como descrito atrás com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, e.g. aluta raldeído, periodato, N,N'-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimi-dobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-/ 2 '-piridilditio/-£>ropionoxi )--succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Os conjugados com avidina são preparados de modo s_e melhante. Os conjugados com biotina são preparados e.g. através da reacção de anticorpos monoclonais com um éster activa-do de biotina como seja o'ésfeerde biotina e N-hidroxi-succinjL mida. Os conjugados com marcas fluorescentes ou quimiolumines-centes são preparados na presença de um agente de acoplamento e.g. os apresentados atrás, ou através da reacção com um iso-tiocianato, de preferência isotiocianato de fluoresceina. Os conjugados de anticorpos com quelatos de metais são preparados de modo análogo.

Os anticorpos monoclonais marca-191¾ 19Π dos radioactivamente com iodo (I, I, I) são obtidos a partir de anticorpos monoclonais de acordo com o invento por iodinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou potássio radioactivo e um agente oxidante químico, como seja hipoclorite de sódio, cloramina T ou similares, ou uffo agente oxidante enzimático, como seja lactoperoxidase ou glucose-oxjl dase e glucose. Os anticorpos monoclonais de acordo com o in 90 vento são acoplados a itrio ( Y) por exemplo por quelatação com o ácido dietilanotriaminopentacético (DPTA). Os anticorpos marcados com tecnécio-99m são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de pertecnato -12- (Tc04-) com solução de ião estanhoso, guelatação do tecnécio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicação do anticorpo a esta coluna ou por técnicas de marcação directa, e.g.por incubação de pertecnato, um agente redutor tal como SnCl2, uma solução tampão tal como solução de fetalato de sódio e potássio e o anticorpo.

Fragmentos de anticorpos monoclo nais, por exemplo fragmentos Fab, Fab' ou F(ab,)2 podem ser obtidos a partir dos anticorpos preparados como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e.g. por digestão com enzimas tais como pepsina ou papaína e/ou clivagem das ligações dissul furato por redução química. 0 invento diz ainda respeito a li nhas celulares de hibridomas, caracterizadas por secretarem anticorpos monoclonais como aqui descrito atrás dirigidos con tra R-(-)-oxaprotilina e/ou beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotá. lina, especialmente dirigidos contra R-(-)-oxaprotilina.

Em particular o invento diz respeito a linhas celulares que são lúbridos de células de mielo ma, especialmente células de mieloma de ratinho e linfócitos B de um mamífero, de preferência um ratinho singeneico, imunji zado com um conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina, São descritos abaixos conjugados imunogénicos adequados de R—(—)— -oxaprotilina. São preferidas as linhas celulares de hibridoma com a designação 1219S59.il, 1219S78.6, 122QS36.6, 1225S93.2, 1226S31.3, 1228P54.6 e 1228P63.1,. As linhas celulares de hibridoma com a designação 1219S59.il, -13- ι

1219S73.6, 1220S36,S, 1225S93.2 e 1226S31.3 são híbridos da linha celular de mielona de ratinho Sp2/0-Agl4 e de linfóci-tos B do baço de ratinhos Balb/c imunizados com conjugados de R-(-)-oxaprotilina com albumina do soro bovino (BSA). As linhas celulares de hibridoma com a designação 1223P54.6 e 1228P63.1 são híbridos da linha celular de mieloma de ratinho PAI e linfócitos B do baço de ratinhos Balb/c imunizados com conjugados de R-(-)-oxaprotilina com BSA. São particularmente preferidas as linhas celulares de hibridoma 1219S59.il, 1219S78*6 e 1228P53.1, as quais foram depositadas em 14 de Março de 1989, na Europein Collection of Animal Cell Culturas (S.C.A.C.C.), PHZS Centre for Applied Microbiology & Research Porton Down, Salisbury, Wilts, SP4 0JG, U.K., com os números de depósito 89031404, 89031403 e 89031405, respectivamente e a linha celular de hibridoma 1226S31.3 a qual foi depositada na E,A,A.C.C. em 21 de Março de 1989 com o número de depósito 890 32104.

As linhas celulares de hibridoma do invento são geneticamente estáveis, secretam os anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser mantidas em culturas congeladas e reactivadas por descongelação e reclonagem facultativa. O invento diz também respeito a um processo para a produção de linhas celulares de hibridoma recretoras dos anticorpos monoclonais do invento, caracteri-zado por um mamífero adequado ser imunizado com um conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina, as células produtoras de anticorpos deste mamífero serem fundidas com células de uma linha celular contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas e os clones celulares secretando os anticorpos pretendidos serem seleccionados.

Para se obter rendimentos elevados de anticorpos, é necessário usar um conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina para a imunização, uma vez que a R-(-)--oxaprotilina I um hapteno e não é imunogénica por si só» Os conjugados adequados de R-(-)-oxaprotilina são a seguir descri tos. No conjugado, R-(-)-oxaprotilina é acoplada a uma molécu la veículo. Moléculas veículo adequadas são por exemplo proteí. nas de alto peso molecular com sejam albumina do soro bovino (BSA; PM 66 200 ) , alfa-amilase de Bacillus subtilis (PM 58000 ) ou hemociamba de lapa (KLH;, PM 1000 000 ) as quais podem ser adquiridas comercialmente em grandes quantidades. Podem também ser empregues como veículos tiroglobulina porcina, toxinas tais como as do tétano, cólera ou difteria, albumina do sero humano (HSA), beta-2 microglobulina e similares e fracção IgG purificada de coelho contra IgG (H + L) de ratinho (Kawamura & Berzofsky, J.Immunol. 136, 58, 1986). Outras moléculas veículo possíveis incluem polissacáridos, lipopolissacáridos naturais ou sintéticos, polipeptídeos sintéticos tais como poli. lisina, membranas activadas, partículas de latex, bactérias tais como Salmonella e similares. É preferido num conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina em que R-(-)-oxaprotilina é acoplada a albumina do soro bovino (BSA), Os conjugados de R-(-)-oxaprotilina do invento são preparados por métodos conhecidos per se, quer por adsorçêo de R-(-)-oxaprotilina ao veículo quer por acoplamento usando carbodiimidas, periodata, glutaraldeído, Ν,Ν'-o-fenilenodianaleimida, N-(m-maleimidabeii zoiloxi-)-succinimida, N-(3-/2'-piridilditio/-propionoxi)--succinimida ou similares. O conjugado imunogénico de R-(-) -oxaprotilina pode ser misturado com adjuvantes, i.e. agentes -15- que aumentarão mais a resposta imune, para o processo de imu nização. São possíveis adjuvantes o adjuvante completo da Freund (emulsão da óleo mineral, água e extractos microbacte-rianos), adjuvante incompleto de Freund (emulsão de água e óèlo apenas), gás de hidróxido de alumínio, ets. 0 conjugado imunogénico de R-(-)--oxaprotilina é usado para imunizar mamíferos adequados que reconhecem o conjugado como uma molécula estranha, especialmente ratinhos ou ratos, de preferência ratinhos. São particu larmente preferidos os ratinhos Balb/c.

As vias de imunização incluem, en tre outras injecções intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular e intracraniais. Uma vez que se pretendem titulos de anticorpos elevados, dá-se normalmente uma série de injecções. A imunização é por exemplo efectuada por injecção do conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina, facultativamente misturado com adjuvante incompleto ou compl£ to de Freund, três a oito vezes parenteralmente, e.g. intrape ritonealmente e/ou subcutâneamente, em quantidades à volta de 30 mg em ratinhos Balb/c em intervalos de 1-3 semanas, seguido de uma injecção de memória de aproximadamente 30 mg 1-3 dias antes do sacrificio dos animais.

As células produtoras de anticor pos dos mamíferos iminizados, de preferência células linfóides tais como linfócitos do baço, retiradas por exemplo 1-3 dias após a injecção final de memória, são fundidas com as células de uma linha celular contínua, i.e. um clone de células de re plicação contínua que confere esta capacidade de replicação às células hibridasd resulàantes da fusão. Um exemplo de tal linha celular é uma linha de células de tumor (mieloma) ela -16- própria não sendo produtora de imunoglobulinas ou dos seus fragmentos mas que tem o potencial para produzir e secretar grandes quantidades de anticorpo e que possui uma marca genética de tal forma que as células híbridas podem ser seleccio-nadas contra células parentais não fundidas. São conhecidas várias linhas celulares de mieloma adequadas. São preferidas as linhas celulares de mieloma sem a enzima hipoxantina-guamjL na-fosfo-ribosil-transferase (HGPRT) ou a enzima timidina ci-nase (TK), as quais são sobrevivem portanto num meio de .cult£ ra selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). São particularmente preferidas células de mieloma e linhas celulares derivadas que não sobrevivem em meio HAT e que não secretam imunoglobulinas ou seus fragmentos, tais como as linhas celulares Sp2/0-Ag 14 ou PAT. A fusão é efectuada na presença de um promotor de fusão, por exemplo vírus Sendai ou outros paramixovirus, facultativamente na forma inactivada por (JV, de agentes fusogénicos químicos tais como iões cálcio, lípi-dos tensoactivos, e.g. lisolecitina ou polietilenoglicol (PEG) ou por electrofusão. De preferência, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células do baço de animais imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietilenoglicol de um peso molecular entre 1000 e 4000 .

Após a fusão, as células são rejs suspensãe e cultivadas num meio selectivo por exemplo meio HAT. Neste meio, apenas as células de hibridomas sobreviverão uma vez que elas combinam a capacidade de crescer e replicar in vitro tal como as células de mielomas parentais e os genes HGPRT ou TK ausentes essenciais à sobrevivência em meios HAT herdados das células do baço produtoras de anticorpos dos ani mais imunizados. -17-

Os meios de cultura adequados à expansão das células de hibridoma são os meios de cultura con vencionais, tais como meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM), meio minimo essencial, meio RPMI 1640 e similares, facultativamente suplementadas por um soro de mamífero, e.g. 10 a 15% de soro fetal de vitela. De preferência, c-élulas de suporte, e.g. células normais de exudato peritoneal de ratinhos normais, células do baço, macrofagos de medula óssea ou similares, são adicionados no começo do crescimento celular iroedia tamente antes do passo de fusão para alimentaçãas células hibridoma e suportar o seu crescimento, especialmente quando as densidades celulares são baixas, ao proporcionar factores de crescimento e similares. Se as células fagocéticas tais como macrofagos ou monócitos foram usados elas podem desempenhar um serviço útil na limpeza dos detritos de células de mieloma mortas sempre encontradas após tratamento com aminopterina. Os meios de cultura são suplementados com meio selectivo de modo a evitar que as células de mieloma cresçam mais do que as células de hibridoma,

Os sobrenadantes das culturas de células de hibridomas são despistados quanto aos anticorpos monoclonais pretendidos, de preferência com um imunoensaio com enzimas ou um radioimunoensáio. As células de hibridoma positi. vas são clonadas, e.g. por diluição limite em agar mole, de preferência duas ou maisr vezes. Facultativamente , as células de hibridoma são passadas através de animais, e.g. ratinho, por injecção intraperitoneal e colheita de ascites, o que estabiliza os hibridomas e melhora as características de crescimento. As linhas celulares donadas podem ser congeladas de mo do convencional.

Os anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados são úteis na determinação qualitatjl va e quantitativa de R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucuroneto -18- de R-(-)-oxaprotilina, por exemplo que sangue total, plasma ou soro para determinação da dose eficaz e controle terapêuti co da droga ou na urina para testar a concordância do paciente.

Por exemplo os anticorpos ou seus derivados podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios co nhecidos que se baseiam na interacção da ligação entre os determinantes antigénicos de R-(-)-oxaprotilina e beta-glucuro-neto de R-(-)-oxaprotilina, respectivamente, e os paratopos dos anticorpos monoclonais. Tais imunoensaios são menos dispen diosos e demorados do que os métodos conhecidos e conduzam a resultados de confiança e reprodutíveis sem ser necessário ins trumentação complicada e dispendiosa. São exemplos de tais imunoensaios adequados os radioimunoensaios (RIA) e imunoensaios com enzimas, iminofluorescéncia, guimioluminescência, imunoprecipitação, aglatinação de latex ou hemaglutinação. Tais imunoensaios são úteis e.g. na determinação qualitativa e quan titativa da droga ou do seu metabolito em fluidos biológicos, emgm em sangue total, plasma, soro e urina, respectivamente, de pacientes submetidos a terapia com antidepressivos. Os anti corpos de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados marcados radioactivamente çum radioimunoen-saio (RIA). Qualquer uma das modificações cpnhecidas de uma RIA adequada a pequenas moléculas pode ser usada, por exemplo RIA em fase solúvel (homogénea), RIA em fase sólida (heterogénea), RIA simples ou dupla (sanduíche) com determinação direc-ta ou indirecta (competitiva) de R-(-)-oxaprotilina ou de be-ta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina.

Um exemplo de tal radioimunoen-saio é uma RIA em que uma solução contendo uma quantidade de£ conhecida de R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucuroneto de R-(-)--oxaprotina é incubado com um anticorpo monoclonal do invento -19- e marcado radioactivamente, e.g» R-(-)-oxaprotilina marcada n. . 123*125— 131— 14— 3,, _ . radioaativamente com I I, I, C ou Η, o complexo imune formado é separado e medida a quantidade de radioactivida-de no complexo imune. A separação é efectuada por precipitação do complexo imune através da adição de imunoglobulina irrelevante, e.g. imunoglobulina bovina, equina, coelho ou rato, se guido da adição de solventes adequados, e.g. polietilenoglicol Por outro lado o complexo imune pode ser adsorvido num material de cromatografia de afinidade com os anticorpos monoclonais de elevada afinidade do invento, e.g. material de cromatografia acoplado à proteina A ou a um anticorpo que reconhece e se liga aos anticorpos monoclonais do invento como sejam anticorpos de coelho anti-imunoglobulina de ratinho. Para facilitar a separação do complexo imune, o anticorpo monoclonal do invento pode ser substituído por um conjugado de tal anticorpo monoclonal com um veículo sólido, por exemplo esferas, partículas filtráveis ou partículas paramagnéticas que podem ser colhidas e separadas com a ajuda de um magnete, 0 material veículo pode ser de origem inorgânica ou orgânica, e.g. esferas de plástico ou vidroV partículas filtráveis úteis como veículos na cromatografia de imunoafinidade como seja agarose interligada, dextrano interligado ou partículas de poliacrilamida ou partículas de óxido inorgânico paramagnético.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com enzimas num imunoensaio com enzimas. Como descrito atrás para os radioimunoensaio pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de uma imunoensaio enzimática para moléculas pequenas. Os testes são efectuados de modo análogo aos radioimunoensaios descritos atrás usando uma marca enzimática em lugar de uma marca radioactiva. -20- A quantidade de complexo imune formado é determinada pela adição uma solução de substrato da enzima. A reacção do substracto da enzima resulta, por exemplo numa mudança de cor que pode ser observada a olho nu ou com um sistema de medição óptica.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados do invento conjugados com marcadores guimiolurainesc® tes em sensaios de guimioluminescência. Tal como descrito atrás para os radioimuneensaio pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de um ensaio de quimioluminescência adequado a moléculas pequenas.

Os testes são efectuados de modo análogo aos radioimunoensaio descritos atrás usando uma marca quimioluminescente, e.g. éster de acridínio, em vez de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formado que corresponde à quantidade de antigéneo presente na solução a testar é determinada pela adição de um composto que aapta a luminescência, e.g. H2<>2 e NaOH e medindo a emissão de luz com dispositivo de medição óptica. A utilização de acordo com o invento, dos anticorpos monoclonais e seus derivados como aqui descrito atrás para a determinação qualitativa e quantitativa de R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucoroneto de R-(-)-oxaprotili_ na também inclui outros imunoensaios adequados a pequenas moléculas conhecidas per se, por exemplo ensaios de imunofluores cência, aglutinação de letex com partículas de latex revestida com anticorpo ou revestidas com antigénio, hemaglutinação com corpúsculos de eritrócitos revestidos com anticorpos ou reve£ tidos com antigénio, ensaios com comprimento de onda -21- evanescentes usando uma fibra óptica revestida com anticorpo e outros imuno-sensores de actuação directa os quais convertem a ligação num sinal eléctrico ou óptico, ou similares. 0 invento está também relaccio-nado com "Kits" de testes para a determinação qualitativa e quantitativa de R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucuroneto de R—(—)—oxaprotilina compreendendo anticorpos monoclonais do in vento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticor pos monoclonais ou policlonais e/ou aditivos. "Kits" de testes de acordo com o invento para um radioimunoensaio compreendendo por exemplo, um veículo adequado, e.g. placas de microtitulação ou particu las paramagnéticas, não revestidas ou revestidas com um anti-í corpo monoclonal do invento, facultativamente soluções liofi-lizadas ou concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e/ou um seu derivado marcado radioactivamente ou R-(-)-oxapro tilina marcada radioactivamente, R-(-)-oxaprotilina ou soluções padrão de R-(-)-oxaprotilina, soluções tampão e, faculta tivamente, polipeptídeos, detergentes e aditivos para a preven ção de adsorção inespecífica e formação de agregados, pipetas vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de instruções e similares. "Kits" de testes de acordo com o invento para um imunoensaio enzimático compreendem por exem pio, um veículo adequado, e.g. placas de microtitulação ou fo lhas de nitrocelulose, revestidas ou não revestidas'com um an ticorpo monoclonal do invento ou com um conjugado de R-(-)oxa protilina, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e/ou de um anti^ corpo policlonal ou monoclonal contra R-(-)-oxaprotilina mar- -22-

cado com uma enzima ou contra um primeiro anticorpo que reconhece R-(-)-oxaprotilina, ou de R-(-)-oxaprotilina marcada com enzima, substratos de enzima na forma sólida ou dissolvida, R-(-)-oxaprotilina ou soluções padrão de R-(-)-oxaprotili na, soluções tampão e, facultativamente, polipeptídeos, deter gentes e aditivos, pipetas, vasos de reacção, curvas de caljL bração, tabelas com escalas de cores, manuais e similares.

Os "Kits" de testes de acordo com o invento para um teste quimioluminescente compreendem, por exemplo, um veículo adequado, e.g. tubos de polistireno, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e de um anticorpo policlonal que reconhece o anticorpo do invento conjugado com uma marca quimioluminescente, e.g. éster de acridinio, soluções de um composto que capta a emissão de luz, e.g. e Na0H' solu ções tampão, R-(-)-oxaprotilina ou soluções padrão contendo R-(-)-oxaprotilina e facultativamente, polipeptídeos, detergentes e aditivos, pipetas, vasos de reacção, manuais de in£ truções e similares.

Uma realização especial de um "Kit" de testes de acordo com o invento é uma "imunotira" (vareta) feita de uma fase sólida porosa, e.g. nitro celulose impregnada com um anticorpo monoclonal não marcado do invento numa zona de detecção. 0 anticorpo está firmemente imobiliza, do. A solução a testar, e.g. sangue total, plasma, soro ou urina, contendo R-(-)-oxaprotilina ou o seu beta-glucuroneto é aplicada numa parte da tira teste e é deixada penetrar no material da tira, geralmente com a ajuda de um solvente de eluição como seja água. Assim, a amostra progride para ou através da zona de detecção. 0 grau em que R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina da amostra fica li- -23- gada naquela zona pode ser determinado com a ajuda de reagentes de ligação marcados, os quais podem também ser incorporadosi na tira teste ou aplicados nela subsequentemente. O reagente de ligação marcado é móvel livremente dentro do veículo poroso quando no estado humedecido e é ligado na zona de detecção durante a migração. 0 reagente de ligação marcado é um par de ligação específica para ^-(-)-oxaprotilina ou para o seu beta--glucuroneto, e.g. num anticorpo monoclonal marcado do invenòo que reconhece um epítopo diferente de R-(-)-oxaprotilina ou de beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina do reconhecido pelo anticorpo imobilizado. Como alternativa, o reagente de ligação marcado é R-(-)-oxaprotilina ou o seu próprio beta-glucuroneto que foi conjugado com uma marca, A marca produz um sinal fácil^ mente detectável, por exemplo uma formação de côr ou alteração de cór, na zona de detecção. É uma marca directa, como seja uma solução metálica (e.g. ouro) ou de corante, ou uma marca indirecta, como seja uma enzima, e.g. fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre. A marcação é efectuada de acor do com métodos conhecidos. Facultativamente, a imunotira pode estar incluida num dispositivo de testes analítico compreenden do uma caixa construída de material sólido à prova de humidade.

Um exemplo típico é uma imunotira usando o princípio do imunoensaio competitivo. Uma tira de fase sólida porosa, de preferência nitrocelulose é impregnada numa primeira zona com R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucu roneto de R-(-)-oxaprotilina e uma marca, por exemplo uma mar ca directa como seja um corante ou uma marca indirecta como seja enzima, e.g. fosfatase alcalina. A R-(-)-oxaprotilina ou beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina marcado é retirada na primeira zona enquanto o material poroso está no estado seco mas pode migrar quando o material poroso está humedecido por exemplo através da aplicação de uma amostra líquida aquosa a testar. Numa segunda zona (detecção), que é especialmente distinta da primeira zona, um anticorpo monoclonal do in- -24- vento está firmemente imobilizado no material poroso de modo que não está livre para migrar através do material poroso no estado húmido. Após aplicação da amostra a testar, e.g. sangue total, plasma, soro ou urina contendo uma quantidade desconhecida de R-(-)-oxaprotilina ou do beta-glucuroneto de R-(-)-oxet ppotilina a ser determinada, a R-(-)-oxaprotilina ou beta-glu-curoneto de B-(-)-oxaprotilina da amostra a testar e a R-(-)--oxaprotilina e o beta-glucuroneto de oxaprotilina marcados πά gram d através do material poroso e vão competir para os si-tios de ligação do anticorpo monoclonal imobilizado na zona de detecção. A quantidade do complexo imune formado na zona de dje tecção é determinada por detecção da marca, por exemplo através da detecção da cór gerada na zona de detecção a olho ou c com um sistema de medição óptica, directamente quando se usa um corante como marca ou após a adição de uma solução substrato adequada quando se usa uma enzima como marca.

Os anticorpos monoclinais do invento ou seus deriv ados podem ser também usados em qualquer uma das modificações conhecidas de uma imunotira empregando o principio dos imunoensaios tais como radioimunoensaios, imuno-ensaios quimioluminescentes e similares, como aqui descrito atrás.

Os anticorpos monoclonais do invento também são úteis na terapia de uma sobredose de R—(—)— -oxaprotilina. Os anticorpos monoclonais são aplicados na forma de preparações farmacêuticas que compreendem uma quantidade te rapêuticamente eficaz dos anticorpos monoclonais facultativa-mente juntamente ou misturado com veículos farmacêuticamente aceitáveis sólidos ou líquidos, inorgânicos ou orgânicos. -25-

As preparações farmacêuticas de acordo com o invento são aquelas usadas para administração parenteral , e.g. intranasal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa, a animais de sangue quente, por exemplo humanos. Be pendendo do método de administração pretendido, as preparações farmâcêuticas podem ser na forma de unidade de dosagem, por exemplo em ampolas, frascos, supositórios, drageias, comprimidos, cápsulas ou aspersores nasais na forma líquida ou sólida. A quantidade dos compostos terapêuticamente eficazes a ser admiHistrada depende do estado do animal de sangue quente, por exemplo homem, como sejam o pe so do corpo e o estado geral, da quantidade de R-(-)-oxaprotji lina que levou aos sintomas de uma toxicose e também ao modo de administração e é efectuado de acordo com o médico que está a dar o tratamento. A dose eficaz é da ordem de grandeza de 1 a 100 mg por kg de peso de corpo e é aplicada como uma dose única ou em várias doses dentro de um, dois ou três dias.

As preparações farmacêuticas de acordo oom o invento compreendem os habituais veículos inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos, farmacêuticamente aceitáveis, facultativamente juntamente com outros compostos e/ou aditivos terapêuticamsnte eficazes. Existem soluções ou suspensões dos anticorpos preferencialmente usadas, especialmen te soluções ou suspensões aquosas isotónicas ou também prepara ções liofilizadas as quais são dissolvidas em água imediatamen te antes de serem usadas. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou conterem preservativos, estabilizantes agentes molhantes, emulsionantes, solubilizantes , substâncias que aumentam a viscosidade, sais para regulação da pressão os-mótica e/ou tampões e também outras proteínas por exemplo preparações de albumina do soro humano ou de plasma de sangue hu-

mano

Os exemplos que se seguem íIue» tram o invento sem que o limitem em qualquer grau.

As abreviaturas usadas nos exem pios têm o seguinte significado: BSA albumina do soro bovino BSS solução salina equilibrada DMF N,N-dimetilformamida FCS soro fetal de vitela HAT hipoxantina/aminopterina/timidina

Ig imunoglobulina P3S tampão de fosfatos salino

Exemplo 1

Preparação de linhas celulares de hibridoma secretores de anticorpos monoclonais contra R-(-)-»oxaprotilina. 1-1 Preparação de conjugados imunogénicos de R-(-)-oxaprotília; i 0 imunogénio usado para induzir anticorpos é um conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina com BSA succinilada que foi preparada pelos processos que se seguem. -27-

Para a preparação de BSA succi-nilada, 1 g de BSA (Sigma) foi dissolvido em 50 ml de 100mM PSS pH 7,1. Adicionou-se 1 g de anidrido succinico aos poucos mantendo um pH entre 6,7 e 7,3. A mistura foi dialisada quatro vezes contra água destilada a 4°C durante ôh, depois liofiliza da.

Em seguida, a BSA succinilada foi incubada com 33mg de R-(-)-oxaprotilina preparada de acordo com a EP0 014 433 e 84,3 mg de N-etil-N'-(3-dimetilaminopro-pil)-carbodiimida durante 2h à temperatura ambiente. A mistura foi exaustivamente dialisada contra água destilada para eliminar o excesso de reagentes, O conjugado obtido de R-(-)-oxapro tilina-BSA foi liofilizado. 1-2 Imunização de ratinhos Balb/c

Ratinhos Balb/c com 5-6 semanas de idade foram injectados subcutânea e intraperitonealmen te com 30 ug do conjugado de R-(-)-oxaprotilina-BSA do exemplo 1,1 em adjuvante completo de Freand (300 ul). Quatro semanas mais tarde injectou-se intraperitoneal e subcutâneamente 30 ug do conjugado em adjuvante incompleto de Freund. Após mais 3 semanas, 30 ug do conjugado em tampão de fosfatos salino foram injectados intraperitonealmente. Após mais uma a duas semanas retirou-se sangue dos ratinhos e o soro foi testado pelo imuáo ensaio do exemplo 1,4.

Deu-se mais uma injecçao de memória intravenosamente, 30 ug do conjugado de R-(-)-oxaprotilina-BSA em soro fisiológico, 2 a 3 semanas mais tarde. Três -23-

ciias depois os baços dos ratinhos cujo soro deu positivo no imunoensaio do exemplo 1-4 foram removidos. 1-3 Fusão celular O processo de fusão segue uma modificação do protocolo geral descrito por G.Kohler e C.Milí3 η tein (Nature 256, 495, 1975). Os sedimentos de 10 x 10 célu ™ 7 las de laaço e 1-2x10 ' células de mieloma Sp 2/0-Agl4 (Shulman et al., Nature 276, 269, 1973) ou PAI (Stocker et al. Hoffmann-La Roche Research Disclosura No.21713, 1982) são mis turadas na presença de 41% de polietilenoglicol (PSG 4000, Merck), lavada em meio RPMI 1640 e ressuspensas em RPMI 1640 contendo 10% de FCS a 2x0.0 células por ml. As células são dis tribuidas em amostras de 0,5 ml em poços de placas de microti tulação de 24 poços (Costar). No dia 1,8,10 e 12, adicionou-de meio ffrasco contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). No dia 15 o meio HAT é substituído por meio HT sem ami nopterina. No dia 29 as células de hibridoma sobreviventes são cultivadas em RPMI 1640/10% FCS. Os sobrenadanies dos clones era crescimento são testados quanto à presença de anticorpos contra .R-(-)-oxaprotilina pelo imunoensaio do exemplo 1-4. Os hibridomas positivos são clonados por diluição limite na presença de macrófagos peritoneàis de ratinhos singeneicos (10 000 células por poço) em placas de microtitulação. As célu las de hibridoma podem ser cultivadas em cultura, congeladas a -80°C ou azoto líquido a depois reactivadas. 1-4 Despiste de anticorpos com um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) -29-

Os hibridomas em crescimento são testados quanto à presença de anticorpos antiOR-(-)-oxaprotili. na por um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), Os ΦΜ poços de uma placa de microtitulação (Dynatech Microtest ) são revestidos com um conjugado de R-(-)-oxaprotilina com muci na de modo a evitar qualquer interferência com anticorpos corr: tra BSA. 0 conjugado de R-(-)-oxaprotilina-mucina ê preparado pelo processo que se segue. 28 mg de mucina de glândulas sub maxilares bovinas (tipo I, Sigma H-450 3) são dissolvidas em 5 ml de água. Adiciona-se 85 ul de periodato de sódio 0,1 M, a solução é deixada à temperatura ambiente durante lh e a misturê. é dialisada contra água. Adiciona-se 125 ul do cianoboro-hidrjs to de sódio 1M, seguido de 6,3 mg de R-(-)-oxaprotilina disso], vida em 1 ml de água e 0 ,5 ml de Hcl IN. Forma-se um precipitai do. A mistura é mantida a 70°C durante 1,5 h e dialisada contra água e cloreto de guanidinio 4M. A solução de conjugado (0 ,66 mg/ ml) é diluida 1000 vezes em tampão de revestimento pH 9,8 (477 mg de carbonato de sódio, 897 mg de hidrogeno-carbonato de sódio, 60 mg de eaziràa de sódio, 300 ml de água destilada) e incubada nos poços de uma placa de microtitulação durante 2 dias a 4°C. Os poços são lavados três vezes com PBS contendo TWeen 20 (Sigma) 0,1%). Os sítios de adsorção residuais na placa são saturados por incubação com 100 ul de PBS/Tween 20 dtirante lhf 100 ul de uma solução a ser testada quanto à presença de anticorpos contra E-(-)-oxaprotilina são incubados nos poços duran te 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS/ /Twean 20, adiciona-se um anti-soro anti-IgG de ratinho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) numa diluição de 1000 vezes durante lha 37°C. A placa de microtitulação é levada cin co vezes com PBS/Tween 20, e o anti-soro ligado conjugado com -30- 1

enzima é revelado com o substrato de fosfatase alcalina consiss tindo em tampão p-nitrofenilfosfato di-sódico (1 mg/ml; Sigma!1 em dietanolamina pH9,3. 0 substrato dá uma coloração amarela que é medida com um colorimetro (Titer tek Multiskan) num comprimento de onda de 40 5 nm após S0 min.

Para se ter a certeza que os an ticorpos ligados que reconhecem o conjugado de R-(-)-oxaproti lina-mucina são dirigidos contra o haptano e não contra a ligação entre mucina e R-(-)-oxaprotilina ou uma conformação es pecial da R-(~)-oxaprotilina ligada, faz-se um teste de inibi^ ção da R-(-)-oxaprotilina livre como descrito no exemplo 3,4.

Os hibridomas com a respectiva designação 1228P54.5 e 1228P53.1 (pjarceiro de fusão: linha ce lulars PAI) assim como 1219S59,11, 1219S73,6, 1220S36.6, 1225S93.2 e 1225S31.1 (parceiro de fusão; linha celular Sp/O-Agl4) foram escolhidos para posterior caracterização. Os anti^ corpos monoclonais eecretados por estes hibridomas são designados pelo prefixo "MAb" e pelo nó.mero do respectivo hibrido ma, e.g. MAb 1219S59.il.

Exemplo 2

Isolamento e purificação de anticorpos monoclonais

Ratinhos Balfo/c com 4-6 semanas de idade são pré-tratadas intraperitonealmente com 0,3 ml de pristano (Aldrich), 1-3 semanas mais tarde, 1-2 x 10 células de hibridoma clonado em 0,2 ml de BSS a 9,2 ml de pristano são inoculadas intraperitonealmente. Após 8-10 o fluido asei- -31- Ν tico é colhido, centrifugado a 800 xg a guardado a -20 o O fluido ascítico descongelado é centrifugado a 50 000 mg durante 60 minutos . Uma camada de gordura flutuando na superfície é cuidadosamente removida e a concentração proteica ajustada a uma concentração de 10 mg/ml, A invunoglobulina bruta é precipitada pela adição gota a gota de 0,9 volumes eguivalentes de sulfato de amónio saturado a 4^C, depois dissolvida em 20 mM trisHCl e 50mM MaCl pH 7,9 e dialisada três vezes contra este tampão. A solução é diluída com 20mM Tris-HCl pH 7,9 a 1:1 (v/v) e os anticorpos são purjL ficados por cromatografia em DEAE celulose (Whatman). As frac ções positivas no imunoensaio do exemplo 1-4 são combinadas e dialisadas contra 0,5 M PBS pH 7,2. È também possível obter guanti-dades mais pequenas de anticorpos monoclonais (ca. lmg) por propagação in vitro . As células hibridomas são cultivadas à temperatura fisiológica (ca. 37°C) em meio de cultura (RPMI 1640 suplementado com 10¾ PCS) em frascos de plástico (Costar) até uma densidade celular de 5 x 10-10 células/ml. A pré-cul tura completa é transferida para frascos "spinner" Bellco gra duados até um volume de 3000 ml. Adiciona-se meio de cultura para dar um volume final de 1500 ml. A cultura I agitada durante dois a três dias a 30 rpm numa atmosfera enriquecida com 5¾ C0o á temperatura fisiólogica. O volume da cultura é aumen tado para 3000 ml com mais meio de cultura. A cultura é ®ultji vada durante mais 7-10 dias usando as condições de cultura atrás descritas. O meio contendo as células é centrifugado a 1000 x g durante 20 min. a 4°C. O sobrenadante é filtrado (poro 0,2 um) e concentrado em condições estéreis. A imuno-globulina bruta é obtida pela adição de sulfiato de amónio saturado, depois purificado como aqui descrito atrás. -32-

Exemplo 3

Caracterização dos anticorpos monoclonais ant.i-R-(-)-oxaproti-lina 3-1 Determinação da classe e subclasse 0 isotipo dos anticorpos mono- clonais foi determinado por análise de ELISA com anti-soro de

coelho contra classes e subclasses de Ig de ratinho (Biorad TM

Mouse Typer Sub Isotyping Kit), Todos os anticorpos monoclonais eram do isotipo XgGl com excepção do MAb 12$SS73.6 gue é IgG2b, 3-2 Inibição da ligação de anticorpos monoclonais a R-(-)-oxa-protilina por drogas terapêuticas e aminas biogénicas A capacidade de uma série de dro gas terapêuticas, algumas das quais são usadas em combinação com antidepressivos, e das aminas biogénicas para inibir a ligação dos anticorpos monoclonais do invento ao antigénio foi determinada num imunoensaio com enzima de inibição em dois pas sos para estabelecer a selectividade dos anticorpos monoclonais contra os compostos testados. O ensaio ê efectuado como descri to a seguir. Uma concentração definida do anticorpo monoclonal a ser testado (equivalente à quantidade de anticorpo resultan do numa extinção 20 vezes acima dos testemunhos na ELISA do exemplo 1-4) em 60 um de BBS/Tween 20 (0 ,0 5¾) foi pré-incubada durante a noite em placas de microtitulação de 95 poços não

rovosticeas com «mostras contendo 60 «1 ãe concent r e.çoes distintas ie cada im ãos vários compostos a saram tostados (I laí-liD p!4) era PdS/‘Svieon 20 (Ô ,05$) ♦ & mistura de incubação xoi então transferido para placas úa microtitulação revertidas com u-(-)-oK5protiiiiaa-muc;xaa o a concentração relativa úo anticorpo não envolvido m iauaocGraplcxoo com o composto solúvel foi ueterminada como descrito ao exemplo 1-4. h afinidanç de libação relativa doo anticorpos monoclonsio aos compostos solúveis (. expressa am iCgg (concentração de iailxição), i.o* α concentração do campos to çue iaióo a ligação do anticorpo monocloaai ao enti-génio em faaa sólida na gama de 50$. Os resultados para o anticorpo monoclonal :2&b 1226S31.3 estão apresentados na Tabela 1. 1 %

Tabela 1 Inibição da ligação do Mab 1226S31.3 ao conjugado R-(-)-oxaprotilina-mucina ligado à superfície por drogas terapêuticas e por aminas biogénicas

(continuação ) Η Π3 Η Φ ϋ (0

-36- 5 i

( continuação )

,c d (L) C •H W

oiroo H a c •H

m CM (Ds M 0)_>sd r-co rO d Ή H Ή -P O & (0 X 0 1 I *

Ivc Q)τίo LOu H mo i*

As drogas triciclicas com uma cadeia lateral alguilamino mostram actividade inibidora fraca enquanto nentmrn dos outros compostos testados inibem em qualquer concentração testada. 3-3- Inibição da ligação do anticorpo monoclonal a R-(-)-oxa-protilina por -R-(-)-oxaprotilina libre e por análogos estruturais A capacidade da R-(-)-oxaproti lina livre e de uma série de compostos que são estruturalmen te análogos à R-(-)-oxaprotilina para inibir a ligação dos anticorpos monoclonais do invento ao antigénio foi determina_ da num imunoensaio de inibição com enzimas essencialmente co mo descrito no exemplo 3-2. Os MAbs são pré-incubados com R--(-)-oxaprotilina livre e com vários análogos estruturais, respectivamente, em vez de com os compostos testados do exein pio 3-2. Os análogos estruturais e testados estão apresentados na Tabela 2A. A pré-incubação com R-(-)-oxa-protilina livre foi efectuada para investigar possíveis alte rações conformacionais de R-(-)-oxaprotilina quando da ligação a uma superfície sólida e dá um índice geral da afinida de de ligação dos anticorpos monoclonais do antigénio.

Os valores de IC50 e as afinidades relativas derivadas deles para os anticorpos monoclonais MAb 1219S59.il, MAb 1219S78.6, MAb 1225S93.2, MAb 1226S31.3 e MAb 1228P63.1 estão apresentados na Tabela 2B. -38

Tabela 2A Compostos/análogos estruturais testados no tes de inibição

Compostp N2. Nome sistemático /nome genérico7 Fórmula estrutural 1 R-(-)-1-(2-hidroxi-3-metilamino-propil-dibenzo/b,e/biciclo-/2.2.27octadieno-hidrocloreto /R-(-)-oxaprotilina7 /\ /\\ /\ i II i 1 II HC1 \ /\i/\ /' HO · • 1 li/' 2 S-(+)-1-(2-hidroxi-3- metilamino-propil)- dibenzo/b,e7biciclo- /2.2.27octadieno- hidrocloreto /S-(+)-oxaprotilina7 » /\ /K /\ i ii i i 1*1 HC1 \ /\i/\ / H\ / • 1 3 1-(2-hidroxi-3-metil-amino-propil)-dibenzo-/5,e7biciclo/2.2.27-õctãdieno-hidroclõreto /oxaprotilina racémico/ Nn /\ /K • · · · 1 II 1 1 II HC1 % /\í/\ /* • 1 Ijííi • 4 R-(-)-1-(2-glucuronil-3-metilamino-propil)-dibenzo/b,e7biciclo-/2.2.27õctãdieno 7r-(-7-oxaprotilina-~(ò -glucuroneto7 /\ /\\ /\ • 1 · · · 1 II 1 1 II ?H V1 / «K41 hÍM°°h / f •-o 5 S-(+)-1-(2-glucuronil-3-metilamino-propil)-dibenzo/b,e7biciclo-/2.2.27octadieno 7S-(+T-oxaprotilina-β-glucuroneto7 /\ /i\ /\ • · · · · 1 II 1 1 II (j)H / iíK /°\ /’ hí\5ooh /* ip • 39-

Tabela 2A (continuação)

Composto NQ. Nome sistemático /nome genérico7 Fórmula estrutural 6 l-(3-metilamino-propil) -dibenzo/b,e7biciclo-/2.2.27octadieno-hidro- yX/Nyx. i II i í II • · · · · 7 cloreto /maprotilina7 HC1 ^ / \l/ ^ / • · · 1 /’ • 1 • ]jííí • /\ A\ /\ i II i i II 1-(3-amino-2-hidroxi-propil)-dibenzo/b,e7-biciclo/2.2.27-octadieno-hidrocloreto hci \y'Ay\y' H0\/ • 1 • /des-N-metil-oxaprotili NÍJ2 8 l-(3-dimetilamino-2-hidroxi-l-propil)-dibenzo/b,e7biciclo- /\ /i\ /\ • · · · · 1 II 1 1 II • · · · · \ / \l/ ^ / • · · · /2.2.27octadieno metanosulfonato /N,N-dimetil-oxa- protilina7 H0-j!j=0 Η0χ · 0 · 1 • · Y • 9 1-(2-metoxi-3-metil-amino-propil)dibenzo- /b,e7biciclo/2.2.27- A\ /K /\ * · « 1 · 1 II 1 1 II • · * · · octadieno-metano- ^ / \l/ ^ / • · · · sulfonato /2-0-metiloxaprotilina7 “f0 Λ.7 Nrfi* 10 1-(2-hidroxi-3-metil-amino-2-metil-propil)-dibenzo/b,e7biciclo- /\ /i\ /\ • · · · · 1 II 1 1 II HCI H\7 yi Ijlfí • /2.2.27octadieno- hidrocloreto /2-metil-oxaprotilina7 40-

Tabela 2A (continuação)

Composto N2. Nome sistemático /nome genérico7 Fórmula estrutural 11 1-(2-acetoxi-3-metíl-amino-propil)-dibenzo/b,e/biciclo-/2.2.27õctãdieno-hidrocloreto-semi-hidrato /2-acetoxi-oxa- protilina /\ /K /\ , · · · *r · 1h20 1 II 1 1 II HC1 \ /\‘/\ /* 0K 0 · S / \ / • · 1 1 • ê Ijrfi 12 2-(dibenzo/b,e7biciclo /2.2.27octadienil-l-metilT-morfolino-hidrocloreto /morfolinomaprotilina7 /\ /‘\ /\ • · * ·' · 1 II 1 1 IJ HC1 \ /\í/\ / • · · 0 * /\ / • Φ r i 13 3-metil-5-(dibenzo-/5,e7biciclo/2.2.27-õctadienil-l-metil)-oxazolidina-metano-sulfonato /õxazolidinomapro- tilina7 \íí* /\\ • · · »' · 1 II 1 1 II • # · · · V sl/ V mf° A/ 14 1-(2-hidroxi-3-metil-amino-propil)-10-cloro-dibenzo/b,ej-biciclo-/2.2.2]-octadienõ-hidrocloreto /10-cloro-oxaprotilina /\ A\ /\ • · · · · 1 II 1 1 Ij HC1 . i ’ 7 "V • íjiíí 15 1-(2-hidroxi-3-di-metilamino-propil7- 10-clorodibenzo/b,e7- biciclo/2.2.27- , octadieno-ciclamato /10-cloro-N,N-dimetil-õxaprotilina • i í /\ /\\ /\ \ / 1 II 1 1 II • · · · · · HÍÍ V V \i H0-s=0 H0S ' 0 · 1 • · Y •

Tabela 2A (continuação) composto N2. nome sistemático /nome genérico7 fórmula estrutural 16 1-(2-hidroxi-3-metil- „ λ /\ /K HzO ·' · · · · amino-propil)-10-tri- fluorometil-dibenzo-/5,e7biciclo/2.2.27-õctãdieno-hidrocloreto hidrato HC1 í i ! '·' ^ / \l/ ^ / \ p Η0χ · V T • 1 17 1- (2-.hidroxi-3-dimetil-amino-propil)-10-tri-fluorometil)dibenzo- /\ /K /\ I II 1 1 II • · · · 1 /b,e7biciclo/2.2.2]-õctadienohidrocloreto /10-trifluorometil-N,N-dimetil-oxapro- : tilina7 HC1 ^ / \\/ ^ / \ _ · · · · —J Η0χ i ^ T ê 1 • · Y • 42-

Tabela 233 Inibição da ligação do anticorpo monoclonal ao w Ή (0 l-i d +> d μ -μ w <ΰ <u Ti w O 0 b çi (ti o Çi H g '(0 -n c C (ti o α μ o α 0) H U Ή μ <u α d w '(0

o b (ti Dl •H

(ti C -H 0 d ε 1

(0 d •H

i—I

•H

+J O μ a

(C 0 1 i P5

-43- MAb 1219359.11 ê o anticorpo que apresenta o grau mais elevado de selectividade e sensibilidade para R-(-)-oxaprotilina. Sle expressa estero-especificidade e dá reacção cruzada apenas moderadamente com a maior parte dos -análogos. 0 MAb 1219S78.6 reage de um modo semelhante se bem que menos distintamente. Os MAbs 1225S93.2, 1226S31.3 e 1228P6.3 dificilmente descriminam entre os dois enantiómeros de oxaprotilina. Mesmo algumas modificações da estrutura do anel tetraciclico comum são reconhecidas. A glucuronidação do grupo hidroxilo descresce a capacidade de ligação de todos os anticorpos testados em vários graus. Considerando as elevadas concentrações destes metabolitos na urina, apesar de tudo, a sensibilidade dos MAbs I ainda suficiente para determinar o com posto e.g. no que respeita à colaboração do doente.

Exemplo 4

Imunoensaio competitivo de quimioluminescência para a determinação de R-(-)-oxaprotilina em soro ou de beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina na urina.

Os anticorpos monoclonais do invento podem ser usados para a determinação qualitativa e/ou quantitativa de R-(-)-oxaprotilina em soro humano ou de beta--glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina em urina num imunoensaio competitivo de quimioluminescência descrita a seguir. 4-1 Preparação de um conjugado de succinato de R-(-)-oxaproti-lina com éster de acridinio -4<4-

Num primeiro passo, o succinato de R-(-)-oxaprotilina é preparado como a seguir se descreve 204 mg de R-(-)-oxaprotilina HC1 são dissolvidos em 3 ml de metanol e 1 ml de água. Adiciona-se 110 mg de anidrido succi-nico com agitação e ajustando o pH a neutro com 1M NaOH. Após 1 hora, a solução é acidificada até ph3 com HC1 e diluído com água para um volume total de 25 ml. Após arrefecimentoi em gelo o precipitado é removido por filtração e seco (rendimento 95%)

Em seguida, 79 mg de succineto de R-(-)-oxaprotilina são dissolvidos em 0,5 ml de dioxana, 23 ml de N-hidroxi-succinimida em 0,3 ml de dioxana e 42 mg de diciclo-hexilcarbodiimida em 0,3 ml de dioxana. A solução reagiu durante 2 horas à temperatura ambiente. Adicionou-se 4 ml \ de acetato de etilo, o precipitado foi removido por filtração e a solução extraída com 2 ml de uma solução de 10% NaHCOg arre. fecida em gelo e 2 mil de água, A fase orgânica é seca com sul. fato de sódio e removida por filtração em atmosfera de azoto. 0 éster N-hidroxi-succinimida de succinato de R-(-)-oxaprotilina é conjugado com lisozima num terceiro passo. Um volume de uma solução 2mM de éster activa-do e um volume de uma solução 2mM de éster de acridínio em DHF foram incubados com 5 volumes de uma solução 0,2 mM de ljL sozima em tampão de fosfato 0,1M e cloreto de sódio 0,15 pH 8 durante duas horas. O conjugado é purificado por cromatografii em Biogel P-6. 4-2 Imunoensaio com anticorpo monoclonal ligado. -45-

100 ml de um anticorpo monoclo^ nal anti-R-(-)-oxaprotilina (10 ug/ml) são incubados em tubos de polistireno durante 1 h à temperatura ambiente . Após lavct gem três vezes com PBS, os sitios de adsorção residuais são

TM saturados com PBS contendo gelatina (2,5 mg/ml/ e Tween 20 (Sigma, 0,1%) durante 1 h. As amostras de soro e urina a serem testadas são suplementadas com 0,8 ug/ml do conjugado de suc-cinato de R-(-)-oxaprotilina com éster de acridinio e lisozi-ma de exemplo 4-1. As amostras são incubadas nos tubos de po-listireno revestidos com o MAb durante 1 h à temperatura ambiente. Os tubos são levados com PBS e o conjugado ligado é d detectado pela adição de peróxido de hidrogénio/hidróxido de sódio, o gue capta a resposta de luminescência e medindo a emissão de luz num luminometro Ciba-Corraing Magic Lite II. 4-3 "Kit" de testes

Urn "Kit" de testes para o imu noensaio do exemplo 4.2 contem: tubos de polistireno

10 ml de conjugado de succinato de R-(-)-oxaprotilina com és ter de acridinio e lisozima, 20 mg/ml em PBS

10 ml de anticorpo monoclonal anti-Í-i-)-oxaprotilina, 70ug/ml em PBS

TM 100 ml de PBS contendo gelatina (2,5 mg/ml) e Tween 20 (0,1%) 10 mg de R-(-)-oxaprotilina folha de instruções -46-

Exemplo 5

Imunoensaio competitivo em imunotiras ou varetas para a de-tecção de beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina na urina.

Beta-glucuroneto de R-(-)-oxa-protilina pode ser detectado na urina num imunoensaio competi, tivo com enzimas numa imunotira ou dipstic.

Um anticorpo monoclonal do invento (2 mg/ml em PBS pH 7,4) e aplicado a tiras de 1 cm x 5 cm de nitrocelulose (8 um; Schleicher and Schuell) com a ajuda de uma micro-seringa numa zona de detecção restrita. Deixa-se secar o material aplicado durante 1 h à temperatura ambiente o excesso dos sítios de ligação na nitrocelulose são bloqueados com álcool polivinilico (1% p/p em 2®mM Tris HC1 pH 7,4) durante 30 min à temperatura ambiente, as folhas são bem lavadas com água destilada e deixadas secar durante 30 min a 30 °C.

Prepara-se ura conjugado de be ta-gluiuroneto de R-(-)-oxaprotilina com fosfatase alcalina e aplica-se as folhas de nitrocelulose numa zona distinta abaixo do anticarpo imobilizado no topo de uma subcamada de sacarose (60p/v em água destilada). As tiras são deixadas a secar. O ensaio é efectuada através da aplicação da urina fresca (100 ul) na zona de aplicação da imunotira. Deixa-se cada amostra migrar durante 5 min. na * *

tira. Em seguida, a solução de substrato ê adicionada e a cor gerada na zona de detecção é lida q olho ou com um reflectome tro de luz.

Como alternativa usa-se um con jugado de beta-glucuroneto de R-(-)-oxaprotilina com um dyes-tu£f ligado covalentemente em vez do conjugado de fosfatase al calina. Neste caso, não é necessário qualquer adição de substrato para a geração de cór na zona de detecção.

Exemplo 6

Preparação farmacêutica para uso parenteral 2,0 mg de um anticorpo monoclja nal do invento são dissolvidos em 50 ml de soro fisiológico. A solução é passada através de um filtro bacteriológico e o filtrado usado para encher 10 ampolas (5ml) em condições assé pticas. As ampolas são preferencialmente guardadas no frio, e.g. a -20°C.

Claims (4)

1. -48 REIVINDICAÇÕES li. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal dirigido contra R-(-)-oxapro-tilina e/ou beta-glucoronetos de R-(~)-oxaprotilina e um seu derivado que retenha a sua especificidade para os determinan tes antigénicos dos referidos compostos, caracterizados por as células de hibridoma secretoras dos referidos anticorpos monoclonais serem multiplicadas in vitro ou in vivo e, quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos serem isola dos e/ou convertidos em seus derivados. 2l. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal e um seu derivado dirigidos contra R-(-)-oxaproti lina. 3§. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal e um seu derivado que selectivamente se ligue a R-(-)-oxaprotilina na presença de outros compostos de dibenzobiciclo/2,2,2/octadieno que difiram de R-(-)-oxapro-tilina em modificações quimicas da estrutura do anel tetra-ciclico e/ou da cadeia lateral alifática. 4â. - Processo de acordo com qualguer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal e um seu derivado que selectivamente se ligue a R-t^-oxaprotilina na presença de -49- outras drogas terapêuticas potêncialmente usadas em combinação com R-(-)-oxaprotilina que não possuem o esqueleto diben zobiciclo /2,2,2 /octadieno. 5ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal e um seu derivado que selee tivamente se ligue a R-(-)-oxaprotilina na presença de S(+)-o xaprotilina. 6â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal seleccionado de entre os an ticorpos com a designação MAb 1219S59.il MAb 1219S78.6, MAb 1220S36.6, MAb 1225S93.2, Màb 122S31, MAb 1228P54.6 e MAb 1228P63.1 e um seu derivado. 7ã, - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar o anticorpo mo noclonal com a designação MAb 1219S59.il e um seu derivado. 8â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se praparar o anticorpo mo noclonal com a designação MAb 1219S78.6 e um seu derivado. -50- 9ã, - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar o anticorpo mo noclonal com a designação MAb 1226S31.3 e um seu derivado. 10 §. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se preparar o anticorpo mo noclonal com a designação MAb 1228P63.1 e um seu derivado. llã, - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal que é um conjugado com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca gui-mioluminescente, um quelato de metais, avidina, biotina ou si milares. 12ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal qué é marcado radioactivamente. 13ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal que é um fra£ mento. -51- 14§. - Processo para a preparação de uma linha celular de hibridoma que secreta anticorpos monoclonais dirigidos contra R-(-)-oxaprotilina e/ou foeta-glu curoneto de R-(-)-oxaprotilina, caracterizado por um mamífero adequado ser imunizado com um conjugado imunogénico de R-(-)--oxaprotilina, células produtoras de anticorpos destes mamíferos serem fundidas com células de uma linha celular contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas e os cloneíi secretados os anticorpos monoclonais pretendidos serem selec-cionados.
2. 151. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se preparar a linha celular de hibridoma que é híbrido de células de mieloma e linfo eitos B de um mamífero com um conjugado imunogénico de R-(-)--oxaprotilina. 16l. - Processo de acordo com a reivindicação^ 14, caracterizado por se preparar a linha celular de hibridoma que ê um híbrido de células de mieloma de ra tinho e linfócitos B de um ratinho singeneico imunieado com um conjugado imunogénico de R-(-)-oxaprotilina.
3. 171. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se preparar a linha celular de hibridoma seleccionada de entre as linhas celulares de hibridoma selecciònada de entre as linhas celulares de hibridoma com a designação 1219S59.il, 1299S78.6, 1220S36.6, 1225S93.3, 1226S31.1,, 1228P54.4 e 1228P63.1.

   18ã, - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se preparar a linha celular de hibridoma com a designação 1299S59,11. 19ã. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a linha celular de hibridoma com a designação 1219S78.6. 20â. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a linha celular de hibridoma com a designação S1226S31*3. 21i. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a linha celular de hibridoma com a designação 1228P63.1. 22ã. - Método para a determinação de R-(-)-oxaprotilina e/ou beta-glucuroneto de R-(-)-oxa-protilina, caracterizado por mm anticorpo monoclonal e/ou um meu derivado preparado por um processo de acordo com a reivin dicação 1 serem usados num imunoensaio. 23â. - Método de acordo com a reivindicação 22, aaracterizado por o imunoensaio ser um ra-dioimunoensaio. -53- “· J r«
4. 241. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o imunoensaio ser um imu-noensaio com enzima. 25§. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o imunoensaio ser um imunoensaio quimioluminescente. 25ã. - Método para a produção de preparações farmacêuticas compreendendo anticorpos monoclonais e/ou seus derivados por um processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados serem misturados com um veículo farmacêutico. 27ã. - Método para a utilização de um anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado preparado por um processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o mesmo ser administrado numa dose de 1 a 100 mg por kg de pe so de corpo para o tratamento de um animak de sangue quente in cluindo seres humanos que sofram de toxicose devido a uma dose excessiva de R-(-)-oxaprotilina. Lisboa, 6 de Abril de 1990.

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