PT938575E - Composicoes e metodos para eliminar a toxicidade da zeralenona - Google Patents

Description

1

Descrição “Composições e métodos para eliminar a toxicidade da zearalenona”

Domínio técnico A presente invenção diz respeito genericamente à detecção e ao isolamento de bactérias que degradam a zearalenona e a composições e processos para eliminar a toxicidade ou para degradar a zearalenona. Estes processos têm uma grande aplicação na biotecnologia agrícola, na agricultura de searas e na melhoria da qualidade dos cereais alimentares.

Antecedentes da invenção

As doenças fúngicas são problemas vulgares na agricultura de searas. Foram dados passos largos no combate fitopatológico, conforme exemplificado pela utilização de plantas híbridas, pesticidas e práticas agrícolas empíricas. No entanto, conforme qualquer agricultor ou jardineiro pode atestar, os problemas das doenças fúngicas das plantas continuam a criar dificuldades na cultura de plantas. Assim, continua a ser necessário que haja novos métodos e materiais para a resolução dos problemas provocados pelas doenças fúngicas das plantas. Estes problemas podem ser resolvidos por diversas vias. Por exemplo, os organismos infecciosos podem ser combatidos mediante a utilização de agentes que sejam selectivamente biocidas para os organismos patogénicos. Outro método é a interferência com o mecanismo segundo o qual o agente patogénico invade as plantas produtivas hospedeiras. Um outro método, no caso dos agentes patogénicos que provocam perdas de colheitas, é a interferência com o mecanismo segundo o qual o agente patogénico provoca lesões à planta produtiva hospedeira. Há ainda um outro método, no caso dos agentes patogénicos que produzem toxinas que são indesejáveis para os mamíferos ou para os outros animais que se alimentam das plantas das culturas, que é a interferência com a produção, a armazenagem ou a actividade das toxinas.

Entre as espécies de Fusarium sp. há vários agentes patogénicos importantes que afectam o milho e outros cereais em vários países. No caso do milho sabe-se que os microrganismos Fusarium provocam o apodrecimento das raízes, dos caules e das espigas, daí resultando uma grave redução das colheitas. A etiologia do bolor Fusarium nas espigas ainda está mal compreendida, sabendo-se no entanto que as lesões físicas das espigas e determinadas condições ambientais podem contribuir para a sua ocorrência (Nelson PE (1992) “Taxonomy and Biology of Fusarium moniliforme”, Mycopathologia 117:29-36). O Fusarium pode ser isolado na maior parte das plantas de milho dos milheirais, quando ainda não é visível nenhum bolor. A relação entre a infecção das sementeiras e as doenças dos caules e das espigas provocadas por Fusarium não é óbvia. Foi já identificada resistência genética ao bolor visível nos grãos de cereais (Gendloff E., Rossman E., Casale W., Isleib T., Hart P., 1986, “Components of resistance to Fusarium ear rot in field com”, Phytopathology 76:684--688; Holley RN, Hamilton PB, Goodman MM, 1989, “Evaluation of tropical maize germplasm for resistance to kemel colonization by Fusarium moniliforme” Plant Dis 73:578-580). As micotoxinas produzidas pelas espécies de Fusarium que infectam as plantas podem acumular-se nas plantas infectadas ou nos cereais armazenados, o que representa consequências graves para a saúde do gado, seres humanos e outros consumidores de carne ou de outros produtos alimentares produzidos por esse gado. A infecção com Fusarium tem sido associada a mico-toxicoses crónicas ou agudas em animais de criação pecuária e nos seres humanos (Botallico et ai). Descobriu-se que a zearalenona, que é uma micotoxina importante, é produzida por determinadas espécies de Fusarium sp., tendo sido já identificada em colheitas infectadas com Fusarium. 3 A zearalenona, produzida principalmente por Fusarium graminearum (a forma perfeita é Gibberella zeaé) ocorre no milho infectado com Fusarium e com menor intensidade noutros grãos de cereais ricos em amido. A zearalenona foi já detectada no feno, alimentos, milho, sorgo, rações leiteiras e cevada, tendo provocado toxicose ao gado em diversos países (Ueno et ai, CRC Criticai Rev. Toxicol. 14:99, 1985). Quando consumida pelos suínos pode eventualmente suscitar uma resposta estrogénica, incluindo a infertilidade, ninhadas mais pequenas e leitões fracos (Mirocha, 1971). Também se demonstrou já que a zearalenona provoca abortos, vómitos e diarreias em animais que tenham consumido a micotoxina (Koilarczik, 1994, Nat. Toxins 2:105). Também é fisiologicamente activa no gado bovino, ratos, murganhos, cobaias, aves e plantas (Mirocha, 1971; Stob, 1992). Demonstrou-se que no rato é teratogénica (Ueno et al., Câncer Res. 36:445, 1976; Ueno et al., Câncer Res. 38:536, 1978). Também se comprovou já que a zearalenona induz a modulação dos tecidos uterinos nas fêmeas do murganho (Ueno et al, Jap. J. Exp. Med. 45:199, 1970). O documento WO96/20595 descreve a modulação dos níveis de micotoxinas em produtos consumíveis. Isso implica métodos de biocontrolo de organismos produtores da micotoxina em partes de plantas colhidas e métodos para induzir a resistência a fungos produtores da micotoxina, utilizando aldeído cinemaico, aldeído conferílico ou alguns dos seus derivados. Também estão previstas composições que incorporam quantidades desses compostos moduladores do crescimento. O documento DE 42 05 196 A1 proporciona métodos para evitar a contaminação de searas com micotoxinas, mediante a aplicação de uma bactéria de Bacillus subtilis à seara, ao ser efectuada a respectiva sementeira, ou a um campo onde as plantas venham a crescer. De preferência, o Bacillus em causa é um Bacillus produtor de ituramina A. 4

No domínio técnico é necessário que haja novos métodos que permitam eliminar a zearalenona de uma planta ou dos cereais colhidos. Os especialistas na matéria consideram que é importante que prossiga o desenvolvimento inventivo com a finalidade de se proteger o consumidor final de uma planta ou de um cereal colhido. A presente invenção proporciona os reagentes e as metodologias necessários para melhorar as plantas e os cereais colhidos, face à zearalenona.

Descrição abreviada da invenção

No caso descrito, a presente invenção proporciona uma bactéria das espécies Rhodococcus ou Nocardia com capacidade para degradar ou para eliminar a toxicidade da zearalenona ou das micotoxinas estruturalomente afins. A presente invenção também pode compreender um mutante de uma dessas bactérias com capacidade para degradar ou para eliminar a toxicidade da zearalenona. A presente invenção também proporciona um método para eliminar a toxicidade de uma planta antes ou após a colheita, utilizando para tal um micróbio para degradar ou para eliminar a toxicidade da zearalenona.

Descrição da invenção A presente invenção baseia-se na descoberta de bactérias das espécies Rhodococcus e Nocardia com capacidade para degradarem a micotoxina zearalenona. A presente invenção resultou de uma investigação para pesquisar um sistema biológico para eliminar a toxicidade da zearalenona e compreende diversas bactérias das espécies de Rhodococcus e Nocardia isoladas a partir de grãos de milho que cresceram no campo, as quais são capazes de crescer em meio que contenha zearalenona enquanto única fonte de carbono, degradando-a parcial ou totalmente no processo. 5

Na prática da presente invenção irão ser utilizadas, salvo quando especificado de outro modo, técnicas convencionais de botânica, microbiologia, química e bioquímica perfeitamente conhecidas pelos especialistas na matéria. Tais técnicas estão minuciosamente descritas na literatura. Ver, v.g., J.H. Langenheim e K.V. Thimann, ‘Botany: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs’ (1982) John Wiley; ‘Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants’, Vol. 1 (I.K. Vasil, ed., 1984); R.V. Stanier, J.L. Ingraham, M.L. Wheelis e P.R. painter, ‘The Microbial World’, (1986) 5a ed., Prentice-Hall; O.D. Dhringra e J.B. Sinclair, ‘Basic Plant Pathology Methods’, (1985) CRC Press; Maniatis, Fritsch & Sambrook, ‘Molecular Cloning: A Laboratory Manual’ (1982); DNA Cloning, Vols. I e Π (D.N. Glover ed, 1985); Oligonucleotide Synthesis’ (M.J. Gait ed., 1984); ‘Nucleic Acid Hybridization’ (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); o conjunto de artigos publicados em ‘Methods in Enzimology’ (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.) e ‘Current Protocols in Molecular Biology’ (John Wiley & Sons, Inc., 1996).

Na descrição da presente invenção irão ser utilizados os termos adiante indicados com as significações correspondentes. O teimo ‘micróbio’ designa qualquer microrganismo (incluindo os organismos euca-rióticos e procarióticos), por exemplo, fungos, leveduras, bactérias, actinomicetes, algas e protozoários e bem assim quaisquer outras estruturas unicelulares capazes de se desenvolverem em cultura Os micróbios da invenção são as bactérias das espécies Rhodococcus e Nocardia. A expressão ‘micróbio produtor de zearalenona" designa qualquer micróbio capaz de produzir a micotoxina zearalenona e os seus análogos. Tais micróbios são geralmente membros do género fúngico Fusarium e também os oiganismos obtidos por via recombinante que tenham sido alterados geneticamente para lhes permitir produzir zearalenona ou os seus análogos. 7ϋ 6

As expressões ‘degradação da zearalenona ’, ‘degradar a zearalenona ’ ou com ‘capacidade para degradar a zearalenona’, designam quaisquer modificações ou a capacidade de realizar qualquer modificação na molécula de zearalenona ou numa molécula estruturalmente afim, que determine uma diminuição ou a perda da sua acdvidade tóxica. Uma tal modificação pode ser uma clivagem de qualquer das ligações, oxidação, redução, a adição ou supressão de um radical químico ou ainda qualquer outra modificação que afecte a actividade da molécula. Além disso, a zearalenona alterada quimicamente pode ser isolada a partir de culturas de micróbios que produzam uma enzima da presente invenção, por exemplo, criando em cultura os organismos em meios que contenham zearalenona marcada radioactivamente, acompanhando o rasto do marcador e isolando a toxina degradada para estudos subsequentes. A zearalenona degradada pode ser comparada com o composto activo para pesquisa da sua fitotoxicidade ou da sua toxicidade nos mamíferos, em espécies sensíveis conhecidas, por exemplo, os porcinos. A expressão ‘cereal colhido’ designa qualquer forma de cereal que tenha sido retirada do ambiente onde se desenvolveu. Por exemplo, um cereal colhido pode ser, por exemplo, o milho nas espigas ou os grãos de milho. Os cereais colhidos também podem ser aqueles que se encontram armazenados ou os que venham a ser transformados industrialmente. Os cereais transformados industrialmente são aqueles que experimentaram alguma forma de transformação industrial e que irão ser utilizados para a produção de alimentos para o consumo humano ou que irão ser utilizados como alimentos para animais (“cereais alimentares”).

No âmbito da presente memória descritiva, o termo ‘planta’ designa um organismo fotossintético, incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, algas, musgos, fetos, gimnospérmicas ou angiospérmicas. De preferência, a referida planta pertence ao conjunto daquelas a partir das quais é possível obter cereais (“cereais colhidos”), de preferência para o 7 consumo humano ou animal. Mais preferencialmente, as referidas plantas compreendem todas as variedades de milho, trigo, sorgo, arroz e cevada. A expressão ‘plcmía madura’ (ou plenamente desenvolvida) designa uma planta onde ocorreu já o desenvolvimento normal de todos os órgãos vegetativos e reprodutivos. A presente invenção tem por base uma metodologia para isolar um microrganismo com capacidade para degradar a zearalenona e uma metodologia para degradar a zearalenona ou uma micotoxina estruturalmente afim numa planta existente no campo ou após a colheita. Tal metodologia foi utilizada para identificar bactérias das espécies Rhodococcus e Nocardia capazes de degradar a zearalenona.

Para se isolar o referido microrganismo com capacidade para degradar a zearalenona ou uma micotoxina estruturalmente afim, engendrou-se um ensaio em que se isola inicialmente um microrganismo a partir de um material que é a sua fonte. O referido material, que é a sua fonte, pode ser qualquer material de uma planta ou associado a uma planta, incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, todos os tecidos verdes, tais como talos, folhas, espigas ou grãos. O material associado à planta pode ser, sem que isso constitua qualquer limitação, o solo das proximidades mais chegadas da planta. Para se identificar um microrganismo com capacidade para degradar a zearalenona, é possível criar esse microrganismo em cultura num meio que contenha zearalenona como única fonte de carbono. A seguir à adição ao meio, a zearalenona encontra-se geralmente numa forma cristalina. À medida que a zearalenona vai sendo degradada pelo referido microrganismo, os cristais de zearalenona desaparecem do referido meio. Este ensaio recebe a designação de ensaio de “desaparecimento dos cristais”. O desaparecimento da zearalenona pode ser confirmado recorrendo a técnicas que compreendem, sem que isso constitua qualquer limitação, a cromatografia de camada fina. 8

Uma utilidade importante para a presente invenção é a eliminação da toxicidade da zearalenona presente sobre uma planta ou dentro de uma planta ou nos grãos de cereais a seguir à colheita. Inocula-se um material alimentar adequado ou “amostra”, seleccionado entre milho fragmentado, ração para galinhas ou farinha de milho, mas sem que isso constitua qualquer limitação, com uma quantidade conhecida de micotoxina fornecida num solvente adequado, de preferência o etanol, com uma concentração conveniente, de preferência 1 mL de solvente por cada grama, seguindo-se uma operação de mistura suficiente para distribuir a referida micotoxina uniformemente pelo referido material. A amostra de contraprova recebe preferencialmente apenas o solvente. A concentração final da referida micotoxina está compreendida entre 0,1 mg e 1,0 mg por cada grama de material alimentar. A amostra pode ser então seca ao ar para se lhe remover o excesso de solvente. A seguir inocula-se a amostra com 105 - 107 unidades formadoras de colónias (u.f.c.)/g de células em fase logarítmica pertencentes a um microrganismo com capacidade para degradar a referida micotoxina, com uma concentração suficiente, de preferência 1 mL de células por cada grama, seguindo-se uma operação de mistura suficiente para distribuir as referidas células uniformemente por essa amostra. Uma amostra de contraprova pode compreender células que tenham sido aniquiladas por acção térmica, de preferência por aquecimento até à temperatura aproximada de 80°C. Uma amostra de contraprova também pode compreender células de um microrganismo que não seja capaz de degradar a referida micotoxina. Essas amostras são depois colocadas num recipiente, sendo esse recipiente fechado e mantido a incubar durante um intervalo de tempo suficiente a uma temperatura adequada. O referido intervalo de tempo varia preferencialmente entre 1 dia e 2 semanas e a referida temperatura é preferencialmente a temperatura ambiente ou cerca de 28°C. A seguir à incubação extrai-se o conteúdo do referido recipiente 9 utilizando para tal um solvente orgânico adequado (ou uma mistura aquosa orgânica) para a recuperação da referida micotoxina. A seguir concentra-se o extracto resultante e submete-se a análises de tipo qualitativo e quantitativo para se pesquisar a presença da referida micotoxina. Depois efectua-se a comparação da quantidade da referida micotoxina detectada no referido extracto com a quantidade da referida micotoxina detectada na referida amostra de contraprova e exprime-se a eficácia da remoção da referida micotoxina em termos da redução percentual do nível da referida micotoxina nesse extracto experimental, comparativamente com o nível da referida micotoxina nessa amostra de contraprova. Na presente invenção, a referida micotoxina é preferencialmente a zearalenona. Esta metodologia propicia a degradação da zearalenona sobre a referida planta ou dentro dela ou nos cereais colhidos, proporcionando pois uma melhor qualidade dos cereais alimentares e uma melhor segurança alimentar.

Outra utilidade importante da presente invenção é a eliminação da toxicidade da zearalenona dentro de uma planta ou sobre uma planta existente no campo. A planta pode ser inoculada com um organismo produtor de zearalenona e pode ser depois tratada com uma quantidade adequada de bactérias da presente invenção. O tratamento pode consistir em aplicar à referida planta uma composição que incorpore uma quantidade eficaz de um organismo com capacidade para degradar a zearalenona, o que irá fazer com que a zearalenona presente seja degradada. De preferência, a referida aplicação a essa planta far-se-á mediante a aplicação tópica dessa composição sobre os tecidos da planta, de tal modo que a zearalenona existente sobre esses tecidos irá seja degradada.

EXEMPLO L ISOLAMENTO PE BACTÉRIAS QUE DEGRADAM A ZEARALENONA

Recolheu-se como material da fonte pesquisada diversas partes de material vegetativo onde certamente e de forma natural havia zearalenona. Os grãos de trigo (140 amostras independentes) infestados com Fusarium graminearum, o agente causador da sarna negra do trigo, foram obtidos numa seara de trigo de Indiana pertencente a ‘Pioneer Hi-Bred International, Inc.’ (“Pioneer”). As amostras de ensilagem foram obtidas na divisão ‘Microbial Genetics’ da “Pioneer Hi-Bred” e as amostras de adubo foram obtidas em residências locais (um total de 136 amostras independentes). Os grãos de milho infestados com Fusarium graminearum foram obtidos num viveiro infectado (Fusarium graminearum) de Gibberella zeae da “Pioneer” (121 amostras independentes).

Mediu-se o metabolismo da zearalenona utilizando um ensaio de ‘desaparecimento dos cristais’. Os micróbios foram obtidos por lavagem de um material que é a sua fonte, colocando uma pequena quantidade desse material num tubo ‘Falcon’ de 7 mL e juntando 1 mL ou 2 mL de água estéril destilada (que produz o “fluído de lavagem”). Os grãos de milho foram divididos com uma lâmina de barbear, tendo sido utilizados 1 ou 2 grãos. Os tubos foram tapados e agitados durante 1 a 3 horas à temperatura ambiente. Preparou-se a zearalenona (Sigma, n° de cat. Z0167) sob a forma de uma suspensão num meio com sais minerais, tendo sido utilizada como única fonte de carbono. A concentração de zearalenona utilizada, sem que isso constitua qualquer limitação, estava compreendida entre 0,75 e 1,0 mg/mL de meio de sais minerais. Preparou-se o meio com sais minerais combinando os reagentes entre os quais havia, sem que isso constitua qualquer limitação, sulfato de amónio na concentração de 1,0 g/L, cloreto de sódio na concentração de 1,0 g/L, fosfato de potássio dibásico na concentração de 1,0 g/L e sulfato de magnésio na concentração de 0,2 g/L. Efectuou-se a esterilização da solução por filtração através de um filtro de 0,2 pm, embora haja outros métodos de esterilização que podem ser utilizados pelos especialistas na matéria. Acrescentou-se a cada cavidade de uma placa de microtitulação (placa de 96 cavidades) uma quantidade de 100 pL de meio constituído pela suspensão de zearalenona/sais minerais. 11

Introduziu-se em cada cavidade 1 μι, de fluído de lavagem recente. As cavidades de contraprova receberam 1 pL de água. Decorridas 2 semanas transferiu-se 1 pL de cada cavidade para uma nova placa de microtitulação que continha 100 pL de meio constituído por zearalenona/sais minerais. Repetiu-se esta transferência 4 semanas mais tarde. Ao fim de 6 semanas efectuou-se uma avaliação das cavidades para as classificar em função do desaparecimento parcial dos cristais de zearalenona. De forma típica, o cristais pequenos haviam sido solubilizados e metabolizados e apenas restavam ainda os cristais muito grandes de zearalenona. Este efeito foi visualizado utilizando um microscópio invertido ou examinando a placa visualmente pela parte de baixo.

Verificou-se o desaparecimento dos cristais por cromatografia de camada fina (CCF). As placas de gel de sílica que continham o indicador fluorescente (Whatman 4410 222) foram tratadas com pingos de zearalenona, tipicamente de 1 pg (noimalmente 1 pL proveniente das placas de ensaio ou 1 pL de uma solução convencional na concentração de 1 mg/mL). As placas foram então submetidas à acção de um sistema solvente constituído por clorofórmio: :álcool etílico a 97:3. Foi possível observar a zearalenona sob a forma de uma mancha azul brilhante sob a acção de uma luz UV de onda curta. O metabolismo da zearalenona por acção microbiana originou o desaparecimento gradual das manchas dos pingos; as manchas com mobilidade alterada no sistema de CCF não foram detectadas por meio deste método. A presente invenção compreende uma cultura biologicamente pura de um microrganismo responsável pela degradação da zearalenona. Isolou-se esse microrganismo em conformidade com o procedimento a seguir descrito. De cada cavidade em que se observou a degradação da zearalenona retirou-se 1 pL e acrescentou-se a 1 mL de água estéril. Foram efectuadas diversas diluições à razão de 1 para 10 em água estéril e distribuiu-se pelas placas 12 100 μι de cada diluição, tendo sido espalhadas por placas de gelose de tipo ‘YDP’. As placas de gelose de tipo ‘YDP’ foram preparadas combinando 10 g de extracto de levedura (Difco), 20 g de peptona da ‘Bacto’, 0,5 g de dextrose, 15 g de gelose da ‘Bacto’ em água, seguindo-se a esterilização por tratamento em autoclave. A partir destas placas onde se espalhou a mistura de cultura, foram espalhadas faixas de colónias individuais para isolamento em novas placas de tipo ‘YDP’. Fez-se um esforço para se escolher pelo menos um de cada um dos tipos de bactérias representadas nas placas recobertas. Utilizou-se cada bactéria para se fazer uma suspensão diluída em água estéril e utilizou-se 1 }iL desta suspensão para inocular cavidades de microtitulação que continham zearalenona e os sais minerais, conforme descrito antes. A caracterização inicial das bactérias baseou-se nas amostras contrastadas pelo processo de Gram. Efectuou-se uma identificação mais definitiva utilizando uma combinação de técnicas. As placas onde haviam sido espalhadas as faixas de colónias bacterianas individuais foram enviadas para a instituição “Microbe Inotech Laboratories, Inc.” (St. Louis, MLO) para identificação experimental. A análise incluiu uma comparação dos ésteres metílicos dos ácidos gordos bacterianos com os dados obtidos nos bancos de dados ‘Aerobe’ e ‘Clinicai Aerobe’ e a utilização dos substrato ‘Biolog™’ por comparação com os dados de um banco de dados de bactérias Gram-positivas. Os resultados destes testes indicam que o isolado bacteriano pertence provavelmente às espécies Rhodococcus ou Nocardia. A partir de um total de 386 amostras efectuou-se o isolamento de bactérias que degradam a zearalenona, provenientes de quatro fontes independente de milho infestado com Fusarium graminearum. Os dados estão agrupados no quadro 1 subsequente. Cada uma das quatro amostras foi depositada a 15 de Outubro de 1996 (ATCC 55853, ATCC 55852, ATCC 55851) e a 22 de Outubro de 1996 13 (ATCC 55856) na Colecção Americana de culturas Tipo (ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 E.U.A.) ao abrigo do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional de Depósito de Microrganismos para Efeitos de Procedimentos de Patentes de Invenção. QUADRO 1. Isolados microbianos com capacidade para degradar a zearalenona N° ATCC Nome Identificação experimental Fonte 55856 2855.1 Rhodococcus globulerus ou Rhodococcus erythropolis Milho com fungos, Michigan 55853 ZEA(1)2906.C1 Nocárdia globulera ou Rhodococcus erythropolis Milho com fungos, Michigan 55852 ZEA(1)2906.C4 Nocardia globulera ou Rhodococcus erythropolis Milho com fungos, Michigan 55851 ZEA(1)2906. A8 Rhodococcus erythropolis Milho com fungos, Michigan EXEMPLO Π. TRATAMENTO PE MILHO CONTAMINADO COM ZEARALENONA A. Tratamento de milho contaminado com zearalenona

Para se testar a capacidade das bactérias isoladas pela metodologia anteriormente descrita para degradarem ou para eliminarem a toxicidade da zearalenona ou dos seus derivados ou análogos, no caso do milho, efectuou-se a inoculação de plantas maduras com Fusarium sp. produtor de zearalenona e depois efectuou-se o tratamento das plantas com uma quantidade adequada de bactérias com capacidade para degradarem ou para eliminarem a toxicidade da 7% 14 zearalenona ou dos seus derivados ou análogos. O tratamento consiste numa aplicação de uma composição que incorpora uma quantidade eficaz de bactérias sobre os tecidos da planta do milho, de tal modo que a zearalenona, eventualmente incluindo quaisquer derivados ou análogos da zearalenona, seja parcial ou totalmente degradada ou a sua toxicidade eliminada. B. Tratamento de milho contaminado depois da colheita

Combinou-se ou “polvilhou-se” uma amostra de 1 a 10 g de milho fragmentado com uma quantidade conhecida de zearalenona em etanol, segundo uma concentração de 1 g de zearalenona por cada mL de etanol, seguindo-se uma operação de mistura para distribuir a zearalenona homogeneamente por toda a mistura. Misturou-se apenas com solvente uma ou várias amostras de contraprova. Depois secou-se a amostra ao ar para se remover o excesso de solvente. A seguir inoculou-se as amostras com 106 u.f.c./g de células em fase logarítmica de um microrganismo com capacidade para degradar a zearalenona, designado por 2855.1 (depositado na instituição ATCC com o n° de admissão ATCC 55856) à razão de 1 mL de células por cada grama e misturou-se tudo muito bem para que as referidas células ficassem distribuídas no interior dessa amostra. Misturou-se as amostras de contraprova quer com células do referido organismo [designado por 2855.1, depositado na instituição ATCC com o n° de admissão ATCC 55856] que havia sido previamente aquecido a 80°C, de tal modo que as referidas células passaram a ser não viáveis, quer com células de um microrganismo sem capacidade para degradar a zearalenona. Colocou-se a referida mistura num recipiente que depois se fechou e ficou a incubar durante 2 semanas à temperatura ambiente. No final do período de incubação abriu-se o recipiente e extraiu-se todo o seu conteúdo com um solvente orgânico adequado para se recuperar a zearalenona. Concentrou-se o extracto e submeteu-se 15 a análises de tipo qualitativo e quantitativo para a detecção da zearalenona. Determinou-se a quantidade de zearalenona e comparou-se com as contraprovas. Determinou-se a eficácia da remoção da zearalenona por comparação com a redução percentual da quantidade de zearalenona na amostra que continha o microrganismo com capacidade para degradar a zearalenona e a redução (havendo alguma) da quantidade da zearalenona presente na referida amostra de contraprova. Os microrganismos designados por ZEA(1)2906.C1 (n° de admissão ATCC 55853), ZEA(1)2906.C4 (n° de admissão ATCC 55852) ou ZEA(1)2906.A8 (n° de admissão ATCC 55851) também são capazes de degradar a zearalenona e podem ser utilizados para o efeito anteriormente descrito.

Lisboa, 20 de Julho de 2001 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.I.

Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1269-063 LISBOA

Claims (7)

1. Reivindicações 1. Bactéria de uma espécie Rhodococcus ou de uma espécie Nocardia com capacidade para degradar a zearalenona.
2. 2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, a qual é Rhodococcus globerulus, Rhodococcus erythropolis ou Nocardia globerula.
3. 3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, a qual foi depositada com o n° 55856 de admissão na ATCC, com o n° 55853 de admissão na ATCC, com o n° 55852 de admissão na ATCC ou com o n° 55851 de admissão na ATCC.
4. 4. Método para degradar a zearalenona dentro de uma planta ou sobre uma planta, o qual consiste em aplicar topicamente a essa planta uma composição que incorpore uma bactéria de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida planta é o milho.
6. 6. Método para degradar a zearalenona em cereais colhidos, o qual consiste em aplicar topicamente a esses cereais colhidos uma composição que incorpore uma bactéria de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
7. 7. Método de acordo com a reivindicarão 6 em mie o cereal colhido é o milho. O Agente Oficial da PreprfedadeJndmHoi Lisboa, 20 de Julho de 2001

   JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.l. Rua do Salitre, 195. r/e-Drt. 1269-063 LISBOA