AT513472A1 - Enzympräparation zur Transformation von Ergopeptinen, Verfahren hierfür und Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silagezusatz enthaltend dieselbe - Google Patents

Abstract

Bei einer Enzympräparation zur Transformation von Ergopeptinen ist wenigstens eine Ergopeptine aus Cyclolring hydrolytisch spaltende alß Hydrolase und wenigstens eie Abbau- produktion der hydrolytischen Spaltung transformierende Amidase enthalten, sowie erfahrenzur .Herstellung derselben und ein Futtermittel- und Silagezusatz.

Description

09 Okt 2012 13:14 CUNOUI PATENTANWALTS KG +431406372510 Seite 4 09 Okt 2012 13:14 CUNOUI PATENTANWALTS KG +431406372510 Seite 4 ·· ·· ···· • · · · • · · ··· • ··· c • · · ·· ·· ··«

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Enzympräparation zur Transformation von Ergopeptinen, auf ein Verfahren zur enzymatischen Transformation von Ergopeptinen in einen wenig-vasokonstriktiven Metaboliten, insbesondere in Lysergsäure sowie auf ein Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silagezusatz. däre Stoff-:, welche Gattung ist Gerste und rse zu fin-tiyten der id diverse harakteristi-P »sition C-8 rjdenErgot-ime.

Ergopeptine sind eine Gruppe der Ergotalkaloide und sind überdies sekurn Wechselprodukte, welche von mit Pflanzen assoziierten Pilzen der Gattung C/av/cej zur Familie der Clavicipitaceae gehören, gebildet werden. Hauptvertreter dieser Claviceps purpurea, welches vor allem Getreide, wie Roggen, Weizen, Triticale,

Mais befällt Ein anderer Vertreter, nämlich Claviceps africana ist weit verbreitet in H den. Weitere Ergotalkaloide produzierende Pilze dieser Familie sind die Grasendopi Gattung Epichloö, Neotyphodium und Balansia, aber auch Aspergillus fümigatus u Penicillium spp. können Ergotalkaloide produzieren.

Allgemein haben die Ergotalkaloide einen tetrazyklischen Ergoiinring als d sches Grundgerüst, welcher an Position 6 einen methylierten Stickstoff hat und an verschiedene Substituenten aufweisen kann. Basierend auf diesen Substituenten wei alkaloide unterteilt in Clavine, einfache Lysergsäureamide, Ergopeptine und Engopeptbi

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R1 R2 Eqpp«*n CH, Ot&Hfe Erawän CH, SrgotMln CH, CHjCMCCH* frCigoein CHtCHjfc Ct^DOWlirt CWCHJk CH£H* bgoeiyailn CH(CH* CH£H(CH* oaigaeriDtin

Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Neurotransmittern interagieren Er* lotalkaloide mit deren Rezeptoren und verursachen eine Vielzahl an Effekten, wie z.B. Vergifte ngen, aber auch positive Wirkungen im pharmazeutischen Bereich. Heute stellen Ergotalkaloit e aufgrund 09/10/2012 15:39

Nr 2/32*9 P.004/038 09 Okt 2012 13: 15 CUNOU PHTENTHNUIRLTS KG +43140G372510 Seite 5 -2- • · • * M ···· • · · · ·*· M « • · ·· ··· ··< • · verbesserter Reinigungsmethoden in Mühlen im Humanbereich kein Problem Allerdings stellen sie in der Tierzucht nach wie vor ein Problem dar und verurs Mehrzahl von nachteiligen Symptomen. Insbesondere zählen zu den bei Tieren alkaloide verursachten Symptomen Gängräne, Lahmheit, eine reduzierte Gewicht^; eine erhöhte Atemfrequenz, Reduktion des Gehalts an Serumprolaktin, reduzierte Mi tion und ein geringerer Reprpduktionserfolg (Strickland et al., 2011). Hierbei stellen Endophyten in Weidegräsern in Amerika, Neuseeland und Australien ein Problem zucht dar. So verursachte die Infektion von Rohrschwingel durch den Endophyten dium coenophialum hohe Verluste für die Nutztierproduzenten. Für einen Großteil der oben beschriebenen Effekte bzw. bewirkten Sympton| Ergopeptine, welche die formenreichste Gruppe der Mutterkomalkaloide darstellen, lieh, welche selbst wiederum nach der unmittelbar an D-Lysergsäure gebundenen fl unterteilt werden. Vertreter sind hierbei die Ergotamin-Gruppe, umfassend unter andi tamin, Ergovalin und Ergosin, bei welchen die erste Aminosäure L-Alanin ist Eine wett pe ist die Ergotoxin-Gruppe, bei welchen die erste an D-Lysergsäure gebundene Amip Valin ist. Vertreter hiervon sind Ergocristin, Ergocryptin oder Ergocornin. Schließlich terer Vertreter die Ergoxin-Gruppe, bei welcher die erste an de Lysergsäure gebund^i säure eine α-Aminobuttersäure ist. Vertreter hiervon sind Ergostin und Ergonin. Von diesen ist Ergovalin eines der Hauptalkaloide der endophytisch in Ws wachsenden Neotyphodium- und Ep/c/i/oö-Arten und ist von veterinär-toxikologiscfy tung, wie z.B. bei Fescue toxicosis. 9,10 Dihydroergopeptine kommen In der Natur vor und konnten bisher nur in Sphacelia sorghi nachgewiesen werden. Teilweise synthi wonnene Dihydroergopeptine, wie z.B. Dihydroergotamin und Dihydroergotoxin be ti therapeutische Bedeutung in der Behandlung von Migräne und von Herz-Kreislaiir < gen. Neben den beschriebenen positiven Wirkungen, insbesondere der therapeutisch n tung von Ergopeptinen ist jedoch ihre toxische Wirkung von nicht zu vernachlässigen^ tung, da insbesondere ihre Toxizität aufgrund von beispielsweise der Konsumation vi nierten Körnern oder toxischen Endophyten in der Zerstörung bzw. Beeinträchtigung digung von zahlreichen physiologischen Systemen, wie den Fortpflanzungsorganen, tumsorisntierten Systemen sowie dem kardiovaskulären Strukturen innerhalb des Kö Tieres oder Menschen resultieren. Weiterhin gibt es gegenwärtig kaum Zweifel, das s Aufnahme von mit Ergotaminen bzw. Ergopeptinen befallenen Körnern auch das System direkt nachteilig betroffen ist und somit nicht nur die Gesundheit der Tiere sop< ihre Leistungsfähigkeit stark beeinträchtigt ist. nehr dar. sichen eine ch Ergot-zunahme, fchproduk-allem die die Vieh-Neotypho- dLn vor für e sind die terantwort-minosäure enrem Ergo-:ere Grup-iosäure L-st ein weine Amino- idegräsern er Bedeu-sehr seiten etisch ge-itzen eine erkrankun-en Bedeu-er Bedeu-kontami-oder Schä-i len wachs-pers eines durch die gen-Darm-idem auch (in

Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, Enzympräparationen zur Verfügung zu i idere in Ly-ab, mit wei st ei len, welche in der Lage sind, Ergopeptine in wenig toxische Metaboliten, insbesoi sergsäure abzubauen. Weiterhin zielt die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren 09/10/2012 15:41 3/32 Nr.: R449 P.005/038 OS Okt 2012 13:16 CUNOU PRTENTflNUHLTS KG +431406372510 Seite -3 chem die enzymatische Transformation von Ergopeptinen in einen nicht-vasokonstrikt ven Metaboliten, nämlich insbesondere in Lysergsäüre gelingt, sowie schließlich auf einen Futt srmittelzu-satz, mit welchem einerseits der Abbau von Ergopeptinen zu wenig toxischen Meta sollten ermöglicht ist und somit eine Leistungssteigerung von Nutztieren zur Verfügung gestellt wird.

Zur Lösung der Aufgabe ist die Erfindung Im Wesentlichen dadurch geker nzeichnet, dass wenigstens eine Ergopeptine am Cyclolring hydrolytisch spaltende <x/ß Hydrolase und wenigstens eine Abbauprodukte der hydrolytischen Spaltung transformierende Amidase enthalten ist. Indem durch die in der Enzympräparation enthaltenen α/ß Hydrolasen Ergopepti le am Cyclolring enzymatisch gespalten werden, gelingt es, Ergopeptine in gesundheitlich wen g bedenkliches Ergin abzubauen und in einem weiteren Schritt wird dieses Ergin mit einer Amklase in gesundheitlich wenig bedenkliche Lysergsäüre abgebaut. α/ß Hydrolasen sind Mitglieder einer Enyzmklasse mit verschiedensten ka alytischen Funktionen, welchen unter anderem am Cyclolring native Ergopeptine angreifen können und diese über ein sekundäres LysergsäureamkJ (Ergohydroxysäure)zu Ergin abbauen k innen. Mit den weiterhin in der Enzymzubereitung enthaltenen Amidasen gelingt es, die Amid{ ruppe von Ergin zu katalysieren bzw. abzuspalten und Ergin vollständig in Lysergsäüre und Amr noniak abzubauen.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung sind die Enzympräparaäonen hielt >ei im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eins Ergopeptine am Cyckilring spaltende α/ß Hydrolase eine katalytische Triade, bestehend aus einer nukleophilen Aminosäure, aus Histidin und aus einer sauren Aminosäure aufvveisen. Eine besonders vollständige enzymatische Spaltung des Ergopeptins wird dadurch erreicht, dass die katalytische Triac e aus der nukleophilen Aminosäure Serin, aus Histidin und aus einer der sauren Aminosäuren Aspartat oder Glutamat besteht und dass die Triade in einer Peptidkette mit der Faltung einer a/ß Hydrolase enthalten ist. Mit einer Enzympräparation enthaltend ein Enzym, welches die ob* n genannte katalytische Triade aufweist, Ist es überraschenderweise gelungen, Ergopeptine enzymatisch vollständig in Ergin abzubauen. Die enzymatische Spaltung findet hierbei an der Stelle:3* des Cyclolrings der Ergopeptine statt, bei welchem hydrolytischen Spalten die Gruppe au s drei Ringen, nämlich dem Cyclolring, Lactamring und Pyrrolidinring in mehreren Schritten a »gespalten wird und schließlich Ergin gebildet wird, wie dies dem nachfolgenden Reaktionssqhema entnehmbar ist 09/10/2012 15:41

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Seite 7 -4- ·· ♦· 9 · · • · · 9 « · » ♦ ♦ * ·♦ ·♦ ·· ···♦ • t · · • · ♦ ···

ErgohydroxysSure M -RJ- träum*. Ob ertem* Etgmlii Ob ciyc*» tffoltnfn CH, CWCNCCH* »Eigmn CHÜCH* CHpHi, Sigocw*i CWH* CH**» GWH* CHSHtCHVfc

Ergin

Ergoprolin- cydo-dipeptld

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist die Enzympräparation im Wesen liehen dadurch gekennzeichnet, dass die a/ß Hydrolase einen nukleophilen Ellbogen mit eine Sequenz Gly-Gln-Ser-Aig.Asn-Gly aufweist. Wenn die a/ß Hydrolase einen nukleophilen Ellbog an mit der Sequenz Gly-Gln-Ser-Arg-Asn-Gly aufweist, gelingt eine besondere rascher enzymat scher Abbau von Ergopeptin zu Ergohydroxysäure, welche spontan in Ergin umgewandelt wird. Der nukleophile Ellbogen ist hierbei ein zentrales Element der a/ß Hydrolaseh. In diesem befindet sich die katalytisch aktive Aminosäure mit der nukleophilen Seitenkette in einer Struk ur mit unüblichen Bindungswinkeln, die in ungünstigen Bereichen des Ramachandran-Plots B< gen (Ollis et al., 1992). Die Aminosäuresequenz des nukleophilen Ellenbogens, im vorliegende i Fall Gly-Gln-Ser-Arg-Asn-Gly, ist konserviert und kann z. B. auch zur Klassifizierung von a/ß hjydröläsen herangezogen werden (Kourist et al., 2010).

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung gelingt ein vollständiger Abbau dadurch, dass die a/ß Hydrolase die Sequenz ID Nr. 1 aufweist Die a/ß Hydrolase mit der Sequenz ID Nr. 1 hat sich als für die katalytische Spaltung von Ergopeptinen in Ergin ils besonders wirkungsvoll erwiesen. Die nukleophile Aminosäure Serin nimmt hierbei eine zentrale Rolle in einer konservierten Struktur, den nukleophilen Ellbogen ein. Der nukleophile Ellbogen ist zwischen dem ß5-Strang und der darauffolgenden α-Helix lokalisiert und weist die Consenus-Se-quenz Sm-X-Nu-X-Sm auf, wobei Sm eine kleine Aminosäure ist, X eine beliebige A ninosäure ist und Nu eine nukleophile Aminosäure bedeutet. Die Sequenz ID Nr. 1 lautet G-Q-ί l-R-N. Die a/ß Hydrolase der Sequenz ID Nr. 1 gehört hierbei zu den Enzymen, welche für ihre |Wirkungs-weise keinerlei Cofaktoren benötigen. 09/10/2012 15:42 5/32 Ir. : K449 P.007/038 09 Okt 2012 13:18 CUNOW PRTENTRNURLTS KG +431406372510 Seite 8 5- ·· *· ·· ··#· » · · · · · · * · · · · · ··· » · · · · · · « » · · · · « ·· ·· ·· ···

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist die Enzympräps|ri durch gekennzeichnet, dass die α/ß Hydrolase eine von der Sequenz ID Nr. 1 verscl oder C-terminale Sequenz aufweist, insbesondere ein Enzym der Sequenz ID Nr. 1 is sie wenigstens 96 % Sequenzidentität mit der Sequenz ID Nr. 1 aufweist, insbesonck ] zym der Sequenz ID Nr. 5 oder 7 aufweist. Überraschenderweise konnte gezeigt we neben der Sequenz ID Nr. 1 auch eine Modifikationsbreite derselben möglich ist, w< sondere der N-Temninus verändert werden kann. Besonders gute Ergebnisse werden zielt, wenn das Enzym mit veränderter Startsequenz eine Sequenzidentität von wen % der Sequenz ID Nr. 1 aufweist. Enzyme mit einem von der Sequenz ID Nr. 1 abweichenden N-Terminus sind Weise befähigt, Ergotamin vollständig zu Eigin umzusetzen. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist die Enzympräparation im dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens ein Abbauprodukt der hydrolytischen transformierende Amidase ein Enzym der Sequenz ID Nr. 3 ist. Mit einem derartige gelingt es, dass Abbauprodukt von Ergotaminen, nämlich Ergin vollständig und nicht-vasokonstriktive Lysergsäure und Ammoniak abzubauen. Bei dem Enzym der Nr. 3 handelt es sich um eine Amidase mit der katalytischen Triade Ser-cisSer-Lys dase Signatur (AS) GGSS. im Vergleich zu bis dato bekannten mikrobiellen Umsetzjji Ergin zu Lysergsäure oder der Spontanreaktion, welche beispielsweise in nativer erfolgt, gilt es mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 3 Eigin besonders schnell, mit eii höheren Aktivität und insbesondere höherer Verdünnung abzubauen. Ein vollständiger Abbau, insbesondere ohne jegliche Ergopeptinrückstände durch eizielt werden, wenn, wie dies einer Weiterbildung der Erfindung entspricht, eines der Enzyme gewählt aus der α/ß Hydrolase oder der Amidase aus einer Rh erythropoiis, bevorzugt Rhodococcus erythropooty DSMZ 25948 Kultivierung stammt hat sich herausgestellt, dass eine nahezu quantitative Umwandlung von Ergopeptine i zielt werden kann, wenn die Enzympräparation so ausgebildet ist, dass wenigstens Enzyme, gewählt aus der α/ß Hydrolase oder der Amidase ein rekombinant in einer gewählt aus Pichia pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, ces, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, einer Pflanzenzelle und/oder Sporen subtilis, Trichoderma oder Aspergillus hergestelltes Enzym ist. Da üblicherweise kontaminierte Nahrungs- oder Futtermittel häufig nicht nur mination durch ein Mykotoxin aufweisen und um möglichst viele gegebenenfalls Futtermittel oder Nahrungsmittel enthaltene bzw. daran anhaftende Mykotoxine abbauen zu können und insbesondere, um auf der Oberfläche von Getreide Mykotoxine möglichst vollständig enzymatisch abbauen zu können, ist die Enzym] bevorzugt so weitergebildet, dass wenigstens ein weiteres Enzym oder wenigstens ation da-H edene N-und dass re ein Enden, dass insbe-hierbdi er-gstens 96 n gleicher

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VOI die Konta- in einem (leichzeitig vorliegende ipräparation weitere eine’ 09/10/2012 15:43

Nr 6/32^9 P.008/038 09 Okt 2012 13: 19 CUNOU PRTENTRNURLTS KG +431406372510 Seite 9 ·* ♦♦ ·· ···· | ······· ·« • · · · « « 999 9 • · · · 999 · 9 -6- • · · · · β f ·· 99 99 999 99 detoxifizierende Komponente, gewählt aus einem Mykotoxin abbauenden Enzym, einem Mykotoxin abbauenden Mikroorganismus oder einem Adsorptionsmittel zur Detoxifil :ation von von Ergopeptinen verschiedenen Mykotoxinen enthalten ist. Hierbei hat sich geznigt, dass, sofern ein weiteres Präparat von Proteinen beteiligtes Enzym enthalten ist, gute Erge Cnisse mit Futtermittelenzymen erreicht werden. Sollte ein weiteres Mykotoxine .abbauendes Enzym enthalten sein, ist dieses bevorzugt aus Alfatoxin Detoxizymen, Zearalenon Esterasen, 2 earalenon Lactonasen, Ochratoxin Amidasen, Fumonisin Carboxylesterasen, Fumönisin Aminotrahsfera-sen, Aminopolyol Aminoxidasen, Deoxynivalenol Epoxidhydrolasen gewählt. Besorders gute Ergebnisse werden hierbei dadurch erzielt, dass als Mykotoxin abbauende Mikroorganismus Bacillus subtilis eingesetzt wird.

Zur Vervollständigung der Umsetzung und insbesondere zum Binden von g< rgebenen-falls weiteren in dem Futtermittel bzw. Nahrungsmittel enthaltenen gefährlichen Subs tanzen ist die Enzympräparation dadurch weitergebildet, dass Adsorptionsmittel gewählt aus mikrobiellen Zellwänden oder anorganischen Materialien, wie Bentoniten enthalten sind.

Die Erfindung zielt weiters darauf ab, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem die Transformation von Ergopeptinen in wenig-vasokonstriktive Metaboliten schnell und vollständig gelingt.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird das Verfahren hierbei so geführt, - dass der Cyclolring der Ergopeptine mit einer α/ß Hydrolase zu einem er zymatisch transformierten Metaboliten gespalten wird, - dass der enzymatisch transformierte Metabolit spontan m Ergin umgewandelt wird, und - dass Ergin mit einer Amidase enzymatisch zu Lysergsäure umgesetzt wird.

Gemäß einer weiterhin bevorzugten Weiterbildung wird das Verfahren hierbei so geführt dass der Cyclolring mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 1 oder einem ein Enzym mit einer von der Sequenz ID Nr. 1 verschiedenen N- oder C-terminalen Sequenz, insbesondere :< »in Enzym der Sequenz ID Nr. 5 oder der Sequenz ID Nr. 7 gespalten wird. Für eine insbesondere vollständige Umsetzung in wenig-vasokonstriktive k etaboliten wird gemäß einer Weiterbildung das Verfahren so geführt, dass das spontan gebildete Ergin mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 3 weiter zu Lysergsäure umgesetzt wird.

Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird die Enzympräpi ration gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silage» usatz eingesetzt. Bei einem derartigen Einsatz gelingt es, folglich durch Beimischung vor geringen Mengen der Enzympräparation die auf den Futtermitteln bzw. Silagen vorhandenen Ergopeptine, insbesondere auf den darin enthaltenen Getreiden oder Gräsern quantitativ in w inig-vaso-konstriktive Metaboliten, insbesondere in Lysergsäure und Ammoniak abzubauen.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung wird der native Ursprung Organismus der Enzyme mit der Sequenz ID Nr. 1 und Nr. 3, der Stamm Rhodococcus erythropolis (MTl· t3) DSMZ 09/10/2012 15:44

Nr7/32*9 P.009/038 □9 Okt 2012 13:20 CUNGU PATENTANWALTS KG +43140G372510 Seite 10 ·· *· ·· ··«« · 1 · · · · · · ·· > · · · · · ··» φ > · · ··· · « -7 • * · · · · ·· ·· ·· ··· ··< novo-Se-Mr. 2, wel- 25948, als Futtermittel, Futtermittel- oder Silagezusatz eingesetzt. Der Stamm Rh( tdococcus erythropolis DSMZ 25948 mit der Fähigkeit Ergopeptine zu Ergin zu hydrolysieren un j Ergin zu Lysergsäure umzusetzen wurde unter Verwendung eines Minimalmediums mit Ergotamin als einzige Stickstoffquelle aus einer Bodenprobe isoliert. Anhand der 16S rRNA wurde« er Stamm der Spezies Rhodococcus erythropolis zugeordnet. Mitglieder der Gattung Rhodococcus sind weitverbreitet in der Natur und werden in verschiedenen Bereichen der Industriellen I Biotechnologie und Umweltbiotechnologie eingesetzt. Weiters sind Mitglieder der Gattung bekannt für die Fähigkeit organische Verbindungen abzubauen. Eine Reihe an Stoffwechselwegen wurde bereits beschrieben und eine Vielzahl der Gene, welche die metabolische Aktivität kodie an, ist auf Plasmiden lokalisiert (Warhurst and Fewson, 1994, Larkin et al., 2006, Martinkova et al., 2009). Das Enzym mit der Sequenz ID Nr. 1 wurde mittels lonenaustauschchromatographie i ind hydrophober Interaktionschromatographie aufgereinigt und Peptidsequenzen wurden bes immt. Die Gesamtgenomsequenz von Rhodococcus erythropolis MTHt3 wurde mittels 454 de quenzierung ermittelt. Die Peptidsequenzen passten zu dem Gen mit der Sequenz ID ches auf dem linearen Plasmid pMTHL.1 lokalisiert ist. Das Plasmid pMTHLI würde i nlttels bio-informatischer Analyse der Genomsequenz gefunden und mittels Pulsed-Field-Gek lektropho-rese bestätigt. Das Gen mit der Sequenz ID Nr. 4 konnte 'm der Nachbarschaft des G< ms mit der Sequenz ID Nr.2 lokalisiert werden.

Schließlich zielt die vorliegende Erfindung auf das Bereitstellen eines Futtermi tels sowie einesFuttermittel- oder Silagezusatzes ab, welcher entweder eine Enzympräparation j |emäß der vorliegenden Erfindung enthält oder einen Rhodococcus erythropolis Stamm, insbesondere Rhodococcus erythropolis DSMZ 25948 enthält. Derartige Futtermittel oder Futtermittel- oder Silagezusätze haben sich als besonders wirkungsvoll bei der Detoxifikation von Eq opeptinen erwiesen, indem sie die Fähigkeit zeigen, die in Futtermitteln enthaltenen Ergopeptine zu Wenig-vasokonstriktiven Metaboliten, insbesondere zu unbedenklichen Metaboliten abzut auen, wie beispielsweise Ergin und Lysergsäure.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist in dem Futtermittel- bzw. Silage :usatz wenigstens ein physiologisch unbedenkliches Trägermaterial, wie Mattrodextrin, Cyclod sxtrin, Kalziumcarbonat, Weizen, Weizenkleie, Reis, Reiskleie, Stärke, Dinatriumsulfat, Talkun i, Saccharose oder Mischungen davon enthält. Insbesondere durch Zusatz von speziell aus gewählten Trägem, wie Zeollte, Bentonite oder dgl. oder Maltodextrin oder auch Hefezellwärk en gelingt es, zusätzlich in bzw. auf dem Futtermittel und insbesondere dem Futtergetreiden od »r Gräsern vorhandene Mykotoxine physikalisch zu binden bzw. zu immobilisieren und somit unschädlich zu machen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Ausführungsbeispfciien näher erläutert. In diesen zeigen:

Fig. 1 die Kinetik der Umsetzung von Ergotamin mit Sequenz ID Nr. 1 zu Ergin, 09/10/2012 15:45

Nr .8 /.32.-9 P.010/038 09 Okt. 2012 13:21 CUNOU PATENTHMUHLTS KG +431406372510 Seite 11 ·· ·· ···· * · « · « • · · · · · -8

Fig. 2 die Umsetzung von Ergin mit Sequenz ID Nr. 3 zu Lysergsäure,

Fig. 3 die Umsetzung der Ergopeptine Ergocomin, Ergocryptin, Ergosin, Ergbvalin und Ergotamin durch das Enzym der Sequenz ID Nr. 1 mit den exemplarischen Negativkontrollen für Ergocryptin und Ergosin,

Fig. 4 die Darstellung des P.. pastoris Expressionsvektors pGAPZ alphaC nr it der Sequenz ID Nr. 2,

Fig. 5 die Darstellung von B. subtiJis Expressionsvektor pET43 mit der Sequerv: ID Nr. 2,

Fig. 6 die Darstellung des P. pastoris Expressionsvektors pGAPZ alphaC nr it der Sequenz ID Nr. 2,

Fig.7 die Umsetzung von Ergotamin und Ergin durch den Stamm Rhodococcvs erythro-polis DSMZ 25948 und

Fig. 8 die Umsetzung von Ergotamin und Ergin durch den Stamm Rhodoqoccus erythropolis DSMZ 25948 und dem Enzym mit der Sequenz ID Nr. 1 im Pansenmodell

Beispiel 1:

Bestimmung der katalytischen Aktivität von dem Enzym der Sequenz ID Nr. 1

Das Gen mit der Sequenz ID Nr. 2, welches eine eine katalytische Triade aus K94-D234-H270 aufweisende α/ß-Hydrolase codiert, wurde unter Anwendung von Standards rfahren in den Expressionsvektor pET28a(+-) Moniert, in E. coli transformiert und exprimiert Na :h der Expression in E. coli BL21{DE3) wurde das his-getaggte Enzym mittels Affinitätschrom itographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde mittels Pierce BSA Protein Assay Kit bestimmt und das Enzym in Aktivitätsversuchen eingesetzt. Die Versuche wurden in 50 mM Nati um-Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 25 °C durchgeführt.

Im Rahmen der Detoxifikationsversuche wurden eine Enzymkonzentration ron 0,079 pg/ml und eine Eigotaminkonzentration von 5 mg/kg eingesetzt. Für einen weiteren Versuch zur Umsetzung der 6 Ergopetine, nämlich Ergota nin, Ergo-valin, Ergocomin, Ergocristin, Ergocryptin oder Ergosin sowie deren jeweiligen ison leren Formen, nämlich Ergotaminin, Ergovalinin, Ergocominin, Ergocristinin, Eigocryptinin sov ie Ergosi-nin wurden 1,58 pg/ml des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 und 10 mg/kg Ergotamin bz\ /. von den restlichen Ergcpeptinen bzw. deren Epimeren die äquimolare (Summen)Konzentration eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt

Die Proben wurden mittels HPLC-FLD bzw. HPLC-MS/MS analysiert, wobei eweils die Konzentration der Summe der jeweiligen Epimere analytisch bestimmt wurde. Para! et zur Abnahme der Ergopeptinkonzentration im Laufe der enzymatischen Reaktion wurde die Bildung der Ergohydroxysäure (Metabolit 1) und des Ergoprolin-cycio-dipeptids (Metabolit 2) beobachtet, im weiteren Reaktionsverlauf wurde die Umsetzung von Metabolit 1 zu Ergin detektier 09/10/2012 15:46 , 9 / 32in Ir. . πη49 P. 011/038 □9 Okt 2012 13:22 CUNOU PHTENTHNUHLTS KG +431406372510 Seite 12 □9 Okt 2012 13:22 CUNOU PHTENTHNUHLTS KG +431406372510 Seite 12 El ji ID Nr. 1 ukts de-alb von 4 n erfolg-den lang-)er Reak-:in, Ergo-Ergocor- -9- in Fig. 1 ist exemplarisch die Kinetik der Umsetzung von Ergotamin mit Sequer z gezeigt. Im Laufe der Reaktion wurden geringe Mengen eines instabilen Zwischenprr d taktiert, das Endprodukt der Reaktion war Ergin. Aus Fig. 1 ist ersichtlich, dass innert i Stunden ein nahezu vollständiger Abbau von Ergotamin durch Sequenz ID Nr. 1 zu te. Es blieben etwa 5 % Restmenge an Ergotamin. Die restlichen 5 % Ergotamin we sam über einen Zeitraum von weiteren 16 Stunden vollständig zu Ergin abgebaut tionsverlauf sämtlicher anderer Ergopeptine, nämlich Ergovalin, Ergocomin, Ergocriiti cryptin oder Ergosin sowie deren jeweiligen isomeren Formen, nämlich, Ergovalinin ninin, Ergocristinin, Ergocryptinin sowie Ergosinin ist vergleichbar.

Beispiel 2: Identifizierung des N-Terminuses des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 Zur Identifizierung des N-Terminuses des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 wurden die der Sequenz ID Nr. 2 und der Sequenz ID Nr. 6 unter Anwendung von Standards pET28a(+) kloniert und E. coii transformiert. Nach Expression wurden die Bakterienzellen in 50 mM Natrium-Phosphatpuff* nommen und mittels French Press (20 000 psi) lysiert. Die Lysate wurden in Verdünn ii 1:10,1:100 und 1:1000 in Abbauansätzen von 5 mg/kg Ergotamin eingesetzt. Die Ans den bei 25 eC inkubiert und die Proben mittels HPLC-FLD analysiert. Die Ergebnisse des Abbauversuchs zeigten, dass beide Enzyme befähigt sii min umzusetzen. Jenes Enzym mit kürzeren Nukleotidsequenzen zeigte jedoch eil höhere Aktivität, so konnte diese Variante auch in der 1:1000 Verdünnung Ergotamin umsetzen, die längere Variante zeigte bereits in der 1:100 Verdünnung nur mehr gerif* tät.

Gene mit Erfahren in !er aufge-ngen von ätze wur- ind, , Ergota-deutlich vollständig ige Aktlvi- ir e des En- Sbquenz ID 3/kg Ergo-Dabeizeigte '5 geschwin den Tem-Enzymlö-7.0) mit das Erv

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Beispiel 3:

Ermittlung des Temperaturbereichs der Aktivität und die Temperaturstabilit^ zyms der Sequenz ID Nr. 1.

Zur Ermittlung der optimalen Temperatur für die Aktivität des Enzyms der Nr. 1 wurden 0.1 pg/ml Enzym in Teorell-Stenhagen-Universalpuffer (pH 9.0) mit 5 m tamin bei unterschiedlichen Temperaturen im Bereich von 10°C bis 50°C inkubiert, das Enzym in einem Bereich von 10°C bis 35eC Aktivität, mit einem auf die Anfang: digkeit bezogenen Optimum von 35°C.

Zur Bestimmung der Temperaturstabilität wurde das Enzym bei unterschiede peraturen im Bereich von 10°C bis 60°C für 1 h inkubiert Anschließend wurden die sungen in einer Konzentration von 0.1 pg/ml in Teorell-Stenhagen-Universalpuffer 0.1 mg/ml BSA und 5 mg/kg Ergotamin bei 25°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigen 09/10/2012 15:47 ΐΓ10/°329 P.012/038 □9 Okt 2012 13:22 CUNOU PRTENTANURLTS KG +431406372510 Seite 13 -10- (ch,

Aktivi-üsammen-n im Ver- zym bis zu einer Temperatur von 30°C stabil ist, es nach einer Inkubation bei 40*C n tat zeigte, es allerdings zwischen 35CC und 40°C zu einem Abfall der Aktivität kam. Zi fassend zeigte sich, dass des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 im Wesentlichen bei de dauungstrakt vorherrschenden Temperaturbedingungen das Temperaturoptimum hat.

Beispiel 4: Ermittlung des pH-Optimums der Aktivität und die pH-Stabilität des Enzyms der ID Nr. 1 Zur Ermittlung des optimalen pH-Bereichs für die Aktivität von ErgA wurden Enzym mit 5 mg/kg Ergotamin bei unterschiedlichen pH-Werten unter Verwendung d Stenhagen-Universalpuffers bei 25eC inkubiert. Dieser Puffer wurde ausgewählt da die Kombination von Citrat, Phosphat und Borat mittels Salzsäure in einem Bereich pH 12 die gleiche Pufferkapazität einstellen kann. Dabei zeigte das Enzym in einem pH 6 bis pH 11 Aktivität, mit einem kleinen Aktivitätsplateau bei pH 8 bis pH 9. Zur Bestimmung der pH-Stabilität wurde das Enzym bei unterschiedlichen pH Bereich von pH 2 bis pH 12 für 1 h bei 25eC inkubiert. Anschließend wurden die En; gen in einer Konzentration von 0.1 pg/ml in Teorell-Stenhagen-UniversalpufFer (pH 7 mg/ml BSA und 5 mg/kg Ergotamin bei 25°C inkubiert. Auch hier zeigte sich ein Akjti teau, diesmal im Bereich von pH 6 bis pH 9, mit stark abfallender Aktivität außerhalb reichs. Durch die Aktivität in diesem Bereich ist eine technologische Anwendung der Sequenz ID Nr. 1 als Futtemnittelzusatz gewährleistet

Sequenz 0.1 pg/ml Teorell-an durch pH 2 bis reich von

(S Π V01

Werten im pymlösun-0) mit 0.1 ivitätspla-dtesesBe-Enzyms des

Beispiel 5:

Expression des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 in Picha pastoris Das Gen der Sequenz ID Nr. 2 wurde in pGAPZ alphaC Moniert, in P. pastoris transformiert und unter Verwendung von Standardmethoden exprimiert. Der Expressionsveklor pGAPZ alphaC mit dem Gen der Sequenz ID Nr. 2 ist in Fig. 3 gezeigt Ein Abbauversuch w urde in 50 mM Natrium-Phosphatpuffer (pH 7.0) mit 5 mg/kg Ergotamin bei 25eC durchgeführt. Vom Kul· turüberstand wurde eine 1:100 Verdünnung eingesetzt. Die Proben wurden mittels HPLC-FLD analysiert. Anhand von Ergebnissen aus SDS-PAGE und Abbauversuchen konnte ejijie Expression des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 in den Kulturüberstand bestätigt werden.

Beispiel 6: iert und mit dem Nätrium-

Expression des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 in Bacillus subtHis Das Gen der Sequenz ID Nr. 2 wurde in pHT43 Moniert, in B. subtilis transfcjrm unter Verwendung von Standardmethoden exprimiert. Der Expressionsvektor pHT43 Gen der Sequenz ID Nr. 2 ist in Fig. 4 gezeigt. Ein Abbauversuch wurde in 50 mM 09/10/2012 15:48 11/32 Nr. : h++9 P.013/038 09 Okt 2012 13:23 CUNOU PHTEMTHNUHLTS KG +431406372510 Seite 14 »· ♦♦♦· • · -11 - • · · · ·· · • 0 »· · · ·

Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 5 mg/kg Ergotamin bei 25 °C durchgeführt. Vom Kulturtiberstand wurde eine 1:10 Verdünnung eingesetzt. Die Proben wurden mittels HPLC-FLD anal; rsiert. Anhand der Ergebnisse aus SDS-PAGE und Abbauversuchen konnte eine Express io ip des Enzyms der Sequenz ID Nr. 1 in den Kulturüberstand bestätigt werden.

Beispiel 7:

Katalytische Aktivität des Enzyms der Sequenz ID Nr. 3 394-D234-ähren in die Bak-ich Press rt und die von Ergin ufenzID Nr. % des Er-raum von

Das Gen der Sequenz ID Nr. 4, welches eine eine katalytische Triade aus H270 aufweisende Amidase codiert, wurde unter Anwendung von Standardveft pET28a(+) Moniert, in E. coli transformiert und exprimiert. Nach der Expression wurdep terienzellen in 50 mM Natrium-Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen und mittels (20 000 psi) lysiert. Das Lysat wurde mit 5 mg/kg Ergin versetzt und bei 25 *C inkubty Proben anschließend mittels HPLC-FLD analysiert. Abbildung 4 zeigt die Umsetzung zu Lysergsäure durch das Enzym der Sequenz ID Nr. 3.

Aus Fig. 2 ist die Umsetzung von Ergin zu Lysergsäure des Enzyms der Seqi 3 entnehmbar, wobei erkenntlich ist, dass in einem Zeitraum von etwa 5 Stunden 50 gins zu Lysergsäure umgesetzt sind und die restlichen 50 % Ober einen weiteren Ze^ti etwa 15 Stunden vollständig zu Lysergsäure abgebaut werden.

Beispiel 8:

Expression des Enzyms der Sequenz ID Nr. 3 in P. pastoris

Das Gen der Sequenz ID Nr. 4 wurde, wie bereits in Beispiel 5 für das Gen de|r Sequenz ID Nr. 2 beschrieben und in P. pastoris transformiert und exprimiert

Beispiel 9:

Anreicherung, Isolierung und Identifizierung des ergotalkaloid-abbauenden Stammes DSM 25948

lenproben )denprobe ueüe entern dritten der Anrei-! IO"5 wur-b$i 25eC

Zur Anreicherung von Mikroorganismen in natürlicher Umgebung wurde gemahlenes Mutterkorn auf Felder im Südburgenland vergraben. Nach drei Monaten wurden Boq< genommen, welche als Inokulum in Anreicherungskulturen verwendet wurden. 2 g B wurden in 18 ml Minimalmedium, welches 5 mg/kg Ergotamin als einzige Stickstoffe hielt, aufgenommen und für 14 Tage bei 25°C am Schüttler (200 rpm) inkubiert. An je<

Tag wurden weitere 5 mg/kg Ergotamin hinzugegeben. Im Anschluss wurden 100 μ! cherung in eine Verdünnungsreihe eingesetzt. Von den Verdünnungsstufen 10 2 den Aliquote auf Minimalmedium-Agarplatten mit 5 mg/kg Ergotamin ausplattiert und inkubiert Im Anschluss wurde eine Reinzucht der kultivierten Mikroorganismen durchdeführt. 09/10/2012 15:49 lr12/„??9 P.014/038

09 Okt 2012 13:24 CUMOUI PRTENTRNURLTS KG +43140G372510 Seite 15 ·· M -12-

Die 16S rRNA des ergotalkaloid-abbauenden Stammes DSM 25948 wurde mittels PCR unter Verwendung der Universalprimer 27F (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') und 1492R (5'- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3') (Weisburg et al., 1991) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mittels QIAquick PCR purification Kit nach Herstellerangaben aufgei einigt. Die amplif izierte 16S rRNA wurde extern sequenziert

Die anschließende BLAST Suche zeigte, dass der Stamm DSM 25948 zum Typstamm von Rhodococcus erythropolis (DSM 43066T) eine Sequenzidentität von 99.8% aufweist.

Beispiel 10: Umsetzung von Ergin und Ergotamin durch Rhodococcus erythrc oolis DSM 25948

Sowohl die Kultivierung der Mikroorganismen als auch die Inkubation der At bauversuche wurde am Schüttler (200 rpm) im Dunkeln bei 25*0 durchgeführt. Der Stamm Rh idococcus erythropolis DSM 25948 wurde über Nacht in TSB-Medium angezüchtet und die Z »lieh nach der Ernte (2 655 x g, 20°C, 5 min) im gleichen Volumen 50 mM Phosphatpuffer (pH 1.0) aufgenommen und mit 5 mg/kg Ergin bzw. Ergotamin versetzt. Als Negativkontrollen diente der Puffer versetzt mit 5 mg/kg Ergin bzw. Ergotamin. Im Verlauf der Versuche wurden Proben g »nommen, nach dem Zentrifugieren (2 655 x g, 20°C, 10 min) wurden 320 μΙ Überstand in ein I Iraunglas-vial überführt und die Proben bei -20°C bis zur Analyse mittels HPLC-FLD gelagert.

In Fig. 7 ist die Umsetzung von Ergin und Ergotamin durch den Stamm Rh* Klococcus i erythropolis DSM 25948 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass in beiden Fällen Lyserg säure das Endprodukt der Reaktion darstellt und Ergin als Zwischenprodukt der Umsetzung von Ergotamin detektiert werden konnte.

Beispiel 11:

Abbauversuch im Pansenmodell

Die Aktivität des Stammes Rhodococcus erythropolis DSM 25948 und des Ensymes mit der Sequenz ID Nr. 1 wurde in einem in vitro Pansenmodell getestet. Dafür wurde fris eher Pansensaft 1:1 mit einer Lösung bestehend aus künstlichen Pansensaft, Heu und einer Getreidemi-schung aus Weizen, Mais und Soja verdünnt. Zur Darstellung der Umsetzung der Eigopeptine wurde ein Ansatz mit einer 5fach aufkonzentrierten Übemachtkultur des Stammes Rhodococcus erythropolis DSM 25948 und ein Ansatz mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 1 (10μ{ /ml) mit 5 mg/kg Ergotamin versetzt. Zur Darstellung der Umsetzung von Ergin wurde ein Ansatz mit einer 5-fach aufkonzentrierten Übemachtkultur des Stammes Rhodococcus erythropolis D >M 25948 mit 5 mg/kg Ergin versetzt.. Als Negativkontrollen dienten Ansätze mit Pansensaft ver setzt mit 5 mg/kg Ergotamin bzw. 5 mg/kg Ergin. Gärröhrchen wurden über Septen eingesetzt u ld die Ansätze im Wasserbad bei 39°C inkubiert. Die Analytik der genommen Proben erfolgte mittels HPLC-FLD. 09/10/2012 15:50 lr13/329 P. 015/038 03 Okt 2012 13:25 CUNOU PRTENTRHURLTS KG +43140G372510 Seite 16 03 Okt 2012 13:25 CUNOU PRTENTRHURLTS KG +43140G372510 Seite 16 • · • · * · -13 dococcus ieu darge-in zu Lyrisch, dass iz ID Nr. 1 Endprodukt eingesetzte teilweise isäürb de-

Eng in Fig. 8 ist die Umsetzung von Ergotamin und Ergin durch den Stamm Rhp erythropofis DSM 25948 und dem Enzym mit der Sequenz ID Nr. 1 im Pansensaftmil stellt. Es ist ersichtlich, dass der Stamm DSM 25948 sowohl Ergotamin als auch sergsäure umsetzen konnte. Im Ansatz mit Ergotamin erfolgte diese Umsetzung so Ergin nicht als Zwischenprodukt detektiert werden konnte. Das Enzym mit der Seque^; konnte Ergotamin im Reaktionsmillieu fast vollständig umsetzen, Ergin wurde als dieser Umsetzung detektiert. In der Negativkontrolle mit Ergotamin wurde nur das Ergotalkaloid detektiert, wobei anscheinend das Ergotalkaioid vom Reaktionsmillieili gebunden wurde. In der Negativkontrolle mit Ergin wurden geringe Spuren an Lysen I tektiert. Dies könnte auf die natürliche Aktivität in den Pansenflora zurückzuführen sein

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<212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400> 7

Met Gly Pro Leu val val Leu Ser Asp Gly Thr Arg ile His val Glu 15 10 15

Thr Ser Gly Asn Gly val pro Ala Leu val Pro Cys val Gly Ser ser 20 25 30 09/10/2012 15:55 21/32 Ir. : Π449 P.023/038 09 Okt 2012 13:30

CUNOld PRTENTRNURLTS KG +431406372510 -21 ....... ;··· • · · f · · * ......... • · · · ♦·; : • · · « ·· ·· »· ··« val Pro Phe Glu Arg Thr Phe Gly Glu Glu Leu Lys Thr Asp Ile Gin 35 40 45

Tyr Asn Phe val Glu val Arg Gly Thr Ser Arg Ser Asp Gly Glu Pro 50 55 60

Ser Glu val Ala Ser Leu Asp Arg ile Ser Asp Asp Leu Glu Glu val 65 70 75 8p

Ara Gin Leu Leu Gly Leu Asp Lys val Ile Ala Leu Gly Gin Ser Arg M 85 90 95

Asn Gly Met Met Ala Ala His Tyr Ala Gin Lys Tyr pro Asn ser val 100 105 HO

Leu His Leu Val Thr Ile Gly Thr pro Ala ser Leu ser Met ile Lys 115 120 125

Asn Glu Glu Tyr Trp Asn Ala Phe Ala Asp Asp Glu Arg Lys Arg Leu 130 135 140

Arq Ala Glu Asn Asp Ala Ala Met Glu Arg Glu Gly Leu Leu Asp Leu 145 150 155 160

Asp Asn Leu Asn Thr Ala Glu Lys Ile val Arg Leu Phe Asp Leu Glu 165 170 175

Gly Ala Val Tyr Phe Tyr Asp Pro Thr Thr Leu Met Asn Asp Trp Trp 180 185 190

Asp Ala Ser Leu Leu Ser Arg Thr Phe Glu Val Val Met Ala ser Asn 195 200 205

Met Gly Trp Ala asp Phe Asp Leu val Gin Thr Leu Gin Asn ser Asp 210 215 220 val Pro Ala Phe Val Thr Phe Gly Lys Tyr Asp Phe Met val ser pro 225 230 235 240

Leu Pro Lys Pro Gly Asn Pro Val Asp Gly Lys Ala Gly Leu Phe Glu 245 250 255

Asp Ile Pro Gly val Arg val Glu val Phe Glu Lys Ser Gly His Phe 260 265 270

Pro Tyr Trp Glu Gin Glu Gin Glu Phe Ala Arg Arg Tyr Arg Asp Trp 275 280 285 val Ala Thr Leu Pro Glu Ser Ala val Arg Ala Ala Glu Ala Met Thr 290 295 300

Pro Asn Gly ile Arg Gin His His His His His His 305 310 315 09/10/2012 15:55 Μ,22 / 32[q 09 Okt 2012 13:31

CUNOU PATENTANWALTS KG

Seite 25 -22- +43140G372510

951 DNA Rhodococcus erythropolis <210> 8 <211> <212> <213> <400> 8 atgggcccat tggtggttct ggcgtccctg cgcttgttcc gaggaattga agacggatat gacggcgaac cgagtgaggt cgtcagttgt tgggtttgga gccgctcact acgcgcagaa cctgcgtctt tgagtatgat cgtaaacgcc tccgcgctga gacaacctga atactgccga ttctacgatc caacgacact ttcgaagtcg tcatggcgtc cagaattctg atgtccccgc ctgccgaaac caggaaatcc gtccgggtag aggtcttcga tttgctcgcc gctatcgcga gaagctatga cgcccaatgg gagcgacggc acacgcattc atgcgtggga tcgagcgttc tcagtacaac ttcgtcgagg cgcctcactc gatcgtattt caaggtcatc gcactcggcc gtatccgaat tcggtcctac caagaacgaa gaatactgga aaacgacgcg gcgatggagc aaagatcgtt cgcctcttcg catgaatgat tggtgggacg gaatatgggt tgggcagact tttcgtaacg ttcggaaagt ggttgacgga aaagccggcc gaagagtggg cacttcccgt ttgggtcgca acccttccgg cattcggcag catcaccatc acgtcgaaac ttcaggcaac ; 60 cgttcgagcg gacgttcggt I 120 tccgcggtac ctccaggtcc j 180 ccgacgacct cgaagaggtc | 240 | agtcgcgtaa cggcatgatg j 300 acctggtaac catcggcacc 1 360 acgcgttcgc agacgacgag | 420 gcgagggtct cctcgacctt j 480 atcttgaagg cgcagtgtac ! 540 cttcacttct cagccggaca 1 600 tcgacctcgt tcaaacactg | 660 acgacttcat ggtctccccg 720 tcttcgaaga tattccgggt j 780 attgggagca ggaacaggaa | 840 aatccgctgt acgcgctgca j 900 accatcactg a ! 951 09/10/2012 15:56 23/32 Nr.: H449 P.025/038

Claims (21)

1. 09 Okt 2012 13:31 CUNOUI PRTENTRNURLTS KG +43140G372510 Seite 26 » ·Ι M ··♦· • · · · · · • · ·· · · · · • · · · · · · • · · · · -23- Patentansprüche : 1. Enzympräparation zur Transformation von Ergopeptinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Ergopeptine am Cyclolring hydrolytisch spaltende α/ß Hydrolase und wenigstens eine Abbauprodukte, der hydrolytischen Spaltung transformierende Amidase enthalten ist.
2. 2. Enzympräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Ergopeptine am Cyclolring spaltende α/ß Hydrolase eine katalytische Triade, gestehend aus einer nukleophilen Aminosäure, aus Histidin und aus einer sauren Aminosäure aulweiseh.
3. 3. Enzympräparation nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Ergopeptine aus Cyclolring spaltende α/ß Hydrolase eine katalytische Triade aus der nukleophilen Aminosäure Serin, aus Histidin und aus einer der sauren Aminosäurerji Aspartat oder Glutamat besteht.
4. 4. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, i dass die α/ß Hydrolase einen nukleophilen Ellbogen mit einer Sequenz Gly-Gln-Sei*-Aig.Asn-Gly aufweist. I
5. 5. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die α/ß Hydrolase insbesondere ein Enzym der Sequenz ID Nr. 1 ist. j
6. 6. Enzympräparation nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die α/ß ^Hydrolase eine von der Sequenz ID Nr. 1 verschiedene N- oder C-terminale Sequenz aufweist, linsbesondere ein Enzym der Sequenz ID Nr 5 oder 7 ist.
7. 7. Enzympräparation nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, da^s die a/ß Hydrolase wenigstens 96 % Sequenzidentität mit der Sequenz ID Nr 1 aufweist, insbesondere ein Enzym der Sequenz ID Nr. 5 ist. |
8. 8. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens ein Abbauprodukt der die hydrolytische Spaltung transformierenden Arjnidase ein Enzym der Sequenz ID Nr 3 ist.
9. 9. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Enzyme gewählt aus der α/ß Hydrolase und der Amidase jaus einer Rhodoooccus erythropolis, bevorzugt Rhodococcus erythropolis DSMZ 25948 Kultivierung stemmt.
10. 10. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Enzyme gewählt aus der α/ß Hydrolase und der Amidase ein rejkombinant in einer Wirtszelle gewählt aus Pichia pastoris, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomycek, Hansen- P.026/038 09/10/2012 15:57 G9 Okt 2012 13:32 CUNOUI PHTEMTHNUHLTS KG +431406372510 Seit^e 27 -24- ula, Saccharomyces, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, einer Pflanzenzelle und/pder Spo- I ren von Bacillus subtilis, Trichoderma oder Aspergillus hergestelltes Enzym ist.
11. 11. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein weiteres Enzym oder wenigstens eine weitere detoxifizierende Komponente, gewählt aus einem Mykotoxin abbauenden Enzym, einem Mykotoxin abbauenden Rjtikroorga- s nismus oder einem Adsorptionsmittel zur Detoxifikation von von Ergopeptinen verschiedenen Mykotoxinen enthalten ist.
12. 12. Enzympräparation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine beim Abbau von Proteinen beteiligte weitere Enzym ein Futtermittelenzym i$t.
13. 13. Enzympräparation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Mykotoxin i abbauende Enzym aus Alfatoxin Detoxizymen, Zearalenon Esterasen, Zearalenon Lajctonasen, Ochratoxin Amidasen, Fumonisin Carboxylesterasen, Fumonisin Aminotransferasen, iAminopo-lyol Aminoxidasen, Deoxynivalenol Epoxidhydrolasen gewählt ist.
14. 14. Enzympräparation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Mykotoxin abbauende Mikroorganismus Bacillus subtilis ist. j l
15. 15. Enzympräparation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass dajs Adsorptionsmittel aus mikrobiellen Zellwänden oder anorganischen Materialien, wie Bentonjit gewählt ist.
16. 16. Verfahren zur enzymatischen Transformation von Ergopeptinen in einen wenig-vasokonstriktivien Metaboliten, insbesondere in Lysergsäure, dadurch gekennzeichnet, dass der Cyclolring der Ergopeptine mit einer α/ß Hydrolase zu einem enzymatisch transformierten Metaboliten gespalten wird, i - dass der enzymatisch transformierte Metabolit spontan in Ergin umgewandeltjwird, und - dass Ergin mit einer Amidase enzymatisch zu Lysergsäure umgesetzt wird.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Cydolrinjg mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 1 oder einem ein Enzym mit einer von der Sequenz ID Nr. 1 verschiedenen N- oder C-tenminaien Sequenz, insbesondere ein Enzym der Sequenjz ID Nr. 5 oder der Sequenz ID Nr. 7 gespalten wird.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet dass dajs spontan ! gebildete Ergin mit dem Enzym der Sequenz ID Nr. 3 weiter zu Lysergsäure umgeset^t wird.
19. 19. Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silagezusatz enthaltend eine Enzympjräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
20. 20. Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silagezusatz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Rhodococcus erythropolis Stamm, insbesondere Rhodococct/s erythro-polis DSMZ 25948 enthalten ist.
21. 21. Futtermittel sowie Futtermittel- oder Silagezusatz nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich wenigstens ein physiologisch unbedenkliches frrägerma- 09/10/2012 15:58 Nr25i.?29 P. 027/038 09 Okt 2012 13:33 CUNOU PflTENTfiliURLTS KG +43140G372510 Seite 28 09 Okt 2012 13:33 CUNOU PflTENTfiliURLTS KG +43140G372510 Seite 28

    -25 - terial, wie Maitrodextrin, Cydodextrin, Kalziumcarbonat, Weizen, Weizenkleie, Reis, Reiskleie, Stärke, Dinatriumsulfat, Talkum, Saccharose oder Mischungen davon enthalten ist.

    Wien, 9. Oktober 2012 Erber Aktieng< durch: Cunow Patentanwalts KG * 09/10/2012 15:58 26/32 Nr.: H449 P.028/038