PT94030B - Processo de preparacao de antigenios protectores contra as infeccoes e efeitos toxidos de bordetella - Google Patents

Processo de preparacao de antigenios protectores contra as infeccoes e efeitos toxidos de bordetella Download PDF

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Description

MEMORIA DESCRITIVA invento refere-se ao processo de preparação de vacinas ca pazes de proteger o Homem ou um animal contra as infecções letais provocadas por Bordetella. Visa, em particular, a preparação de vacinas a partir de Bordetella ou, mais particularmente, de adenil-ciclase produzida por estas bactérias como antigénios protectores contra os efeitos tóxicos das infecções devidas às Bordetella .
Sabe-se qua as Bordetella, mais particularmente,a Bordetella pertussis, a Bordetella parapertussis e a Bordetella bronchiseptica, são responsáveis por patologias respiratórias dos vertebrados.
Assim, no Homem, a B. pertussis é responsável pela tosse cojn vulsa, doença infantil largamente distribuída por todo o mundo.
A vacinação contra a tosse convulsa é, no presente, geralmente realizada com o auxílio de bactérias inteiras inactivadas.
Contudo,estas vacinas não são sempre desprovidas de toxidade, dado que os factores de virulência são constituidos pelas proteínas segregadas pelas bactérias e não pelas próprias bactérias.
As proteínas, mesmo após a morte das bactérias, podem, portanto, exercer efeitos patológicos graves.
Entre os determinantes de virulência de B.pertussis citaremos as adesinas tais como os aglutinogénios (AGG), a hemaglutinina filamentosa (FHA) e a toxina de pertussis (PTx), uma toxina citotraqueal (TCT), uma toxina dermonecrótica (DNT) e uma adenil-c_i clase-hemolisina (AC). Esta óltima é sintetizada sob a forma de um precursor grande de 1706 resíduos. A parte do terminal amino, da molécula suporta a actividade de adenil-ciclase e a parte do terminal carboxi apresenta uma forte homologia com o produto do gene Hly de E. Coli (hemolisina). Esta adenil-ciclase tem a propr_i edade de ser activada pela calmodulina.
A pesquisa de métodos de prevenção melhor adaptados conduziu os inventores ao estudo do papel de cada um dos determinantes
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-3- 1 jP* da virulência e ao aperfeiçoamento de um modelo de infecção experimental imitando o processo da doença natural.
Estes trabalhos permitiram constatar o papel da adenil-ciclase como citotoxina e como antigénio protector e desenvolver uma nova utilização das preparações vacinantes à base de adenil-ciclase ou de preparações bacterianas produzindo adenil-ciclase.
invento refere-se, mais especialmente, à obtenção de um antigénio protector para o Homem ou um animal, contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por uma bactéria do género Bordetella, mas diferente daquela da preparação vacinante, carac terizado por se utilizar uma preparação vacinante bacteriana elja borada a partir de uma dada bactéria do género Bordetella.
De acordo com um outro aspecto, o invento também se refere ã elaboração de uma preparação vacinante a partir de uma adenil-ciclase de uma dada bactéria do género Bordetella, para proteger o Homem ou um animal contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por uma bactéria do género Bordetella diferente daquela donde provém a adenil-ciclase.
As bactérias do género Bordetella são escolhidas de entre B.pertussis, B.parapertussis e B.bronchiseptica.
Numa concretização preferida do invento, a preparação vaci nante é elaborada a partir de B.bronchiseptica ou de adenil-cicla se de B.bronchiseptica e é efectuada para proteger contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por B.pertussis ou B.parapertussis .
Note-se que esta protecção cruzada obtida a partir de variedades de B.bronchiseptica apresenta a vantagem de utiltzar variedades de crescimento mais rápido do que a B.pertussis ou B.parapertussis para elaborar vacinas contra as infecções provocadas por B.pertussis ou B.parapertussis.
De acordo com outra concretização do invento, a preparação vacinante é elaborada a partir de B.pertussis ou de adenil-cicl£ se de B.pertussis e é afectuada para proteger contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por B.bronchiseptica ou B.parapertussis.
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De acordo com ainda outra concretização do invento, a prep£ ração vacinante utilizada é elaborada a partir de B.parapertussis ou de adenil-ciclase de B.parapertussis e é efectuada para proteger contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por B. pertussis ou B.bronchiséptica.
A adenil-ciclase das Bordetella, h qual é feita referência acima, é uma adenil-ciclase tal como obtida por contacto de um s£ brenadante de uma cultura bacteriana de Bordetella com um gel p
Affigel-calmoduline
Trata-se, mais especialmente, de uma preparação de adenil-ciclase tal como as descritas no pedido FR 2606789, depos^ tado em 17.11.86.
Recorde-se que estas preparações são caracterizadas por po_s suirem uma pureza elavada e serem praticamente totalmente desprovidas de produtos contaminantes bacterianos, nomeadamente de tox£ nas de pertussis, de 1ipopolissacárido (ou LPS) e de hemaglutinina filamentosa (ou FHA).
A adenil-ciclase destas preparações apresenta-se sob uma forma homogénea, sedimentando sob um gradiente de densidade em sacarose com um coeficiente S igual a 3,6. Existe sob duas formas moleculares de 45 e 43 kDa respectivamente, aparentadas estruturalmente .
Tais preparações de adenil-ciclase possuem uma actividade que pode atingir e mesmo ultrapassar 1600 Atmole de AMPc min mg
Estas preparações podem ser elaboradas a partir de culturas de bactérias que expressem a AC (adenil-ciclase), mais especialmente de bactérias patogénicas cuja AC é capaz de interferir com a AC das células encariótas, por contacto de um sobrenadante previamente concentrado de culturas de bactérias que expressem a adenilato-ciclase, ou de um extracto destes bactérias com calmodul ina .
Para obter o enzima na forma livre, utiliza-se calmodulina fixada a um suporte; em seguida, recupera-se o enzima adsorvido com o auxilio de um agente desnaturante, o qual é, por sua vez,
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eliminado, e recolhe-se a preparação com o enzima livre.
suporte ê mais particularmente constituido por um material inerte em face da preparação contendo o enzima, e capaz de reter as moléculas de massa molecular elevada, tal como um gel ou um material filtrante.
material filtrante é, vantajosamente, em nitrocelulose ou numa matéria plástica e apresenta uma porosidade de 0,45-022 xm.
agente desnaturante é, de preferência, a ureia, de preferência de 4 a 8,8 M.
sobrenadante concentrado da cultura bacteriana é obtido submetendo um sobrenadante de culturas bacterianas que expressem a AC, a uma ou várias operações de filtração, com o auxilio de filtros de nitrocelulose ou de matéria plástica de porosidade, vantajosamente, de 0,45 a 0,22 /im, seguida de incubação dos filtros com um agente detergente a fim de libertar a AC e eliminação dos materiais insolúveis presentes da preparação de AC.
R R agente detergente é, por exemplo, Triton ou NP40 extracto bacteriano é obtido por tratamento das células bacterianas que expressem a adenilato-ciclase com ureia e recuperação do sobrenadante.
Como variante, utiliza-se uma adenil-ciclase tal como aqu£ la expressa pela sequência nucleotídica dada na figura única com, em correspondência, a sequência de aminoácidos.
Daqui resulta que as bases da sequência nucleotídica considerada podem-se encontrar numa ordem diferente daquela encontrada nos genes e/ou que estas bases podem ser, sendo caso disso, substituídas, desde que um vector elaborado a partir duma tal sequência forneça uma resposta característica e não equivoca quanto ã capacidade de reconhecer a presença de um gene codificando para uma proteina com actividade de adenilato-ciclase.
Toda a sequência nucleotídica capaz de hibridar com aquela do encadeamento desta sequência, tal como obtida por transcrição enzimática inversa do ARN correspondente ou ainda por sintese qui mica, encontra-se igualmente dentro do âmbito do invento.
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As preparações vacinantes utilizadas anteriormente podem e_s tar associadas com a FHA e/ou a PTx no mesmo inóculo ou não.
Neste último caso, a FHA é administrada ao mesmo tempo que a preparação vacinante ou numa altura diferente. As preparações de FHA são vantajosamente obtidas de acordo, por exemplo, com o método de SATO et al. em Infect. Immun, 1983, 41, 310-320 ou aque le de IMAIZUMI et al. em Journal of Microbiol. Methods, 2, 334-347 (1984).
De acordo com um outro aspecto, o invento refere-se à prepai ração de vacinas capazes de induzirem uma protecçâo contra os efeitos tóxicos e as infecções causadas por Bordetella, caracterizada por se utilizarem vacinas moleculares contendo, pelo menos, a parte activa da sequência de aminoácidos representada na figura única, associada, sendo caso disso, no mesmo inóculo ou não, ã FHA e/ou à PTx.
Estas vacinas são vantajosamente utilizadas de acordo com o invento para efectuar protecções cruzadas.
Na concretização do invento, as preparações vacinantes ã ba_ se de bactérias ou de adenil-ciclase produzida por essas bactérias, vantajosamente purificada, assim como as vacinas elaboradas a partir de adenil-ciclase recombinante, são utilizadas nas doses e nas formas de administração habituais, em particular nas formas clássicas administráveis por via intranasal, oral ou parentérica.
Outras características e vantagens do invento surgirão na descrição dos exemplos que se seguem e reportando-se à figura ún_i ca que representa a sequência de nucleótidos da parte activa do gene de B. pertussis que codifica para a adenil-ciclase e a sequêjn cia de aminoácidos correspondente.
modelo de infecção respiratória utilizado nos ensaios dejs critos nos exemplos é um modelo de infecção por via intranasal. A selecção in vivo, a partir de um pulmão de ratinho infectado por B.pertussis, de um derivado hiperpatogénico da estirpe virulenta de B.pertussis 18323S (estirpe de referência internacional para as provas de avaliação das vacinas), permitiu observar no r.a tinho adulto, após injecção das bactérias, por via intranasal,uma
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alveolite edematosa hemorrágica aguda (AEHA), letal em 48-72 h.
As análises dos produtos dos exemplos são efectuadas como se segue.
A actividade da AC é medida de acordo com o método de White, A.A. em Methods Enzymol, 38C, 41-46, 1974, tal como modificado por Hanoune et al. (0. Biol. Chem., 252, 2039-2046, 1977).
As actividades da PTx e da FHA são medidas de acordo com o método de TUOMANON, S. e WEISS, A. em J. Inf. Dis., 152, 118-125, 1985.
EXEMPLO 1 ; CULTURA DE B. BRONCHI SEPTICA E OBTENÇÃO DE UM SOBRENADANTE COM CONCENTRAÇÃO ELEVADA EM ADENILATO-CICLASE
Efectuou-se uma précultura de B.bronchiseptica 9.73, fase I e de uma variante avirulenta, fase IV, espontâneamente estável, desta estirpe , durante 48 horas a 36°C, num meio de ágar modif_i cado de Stainer-Scholte suplementado com a ciclodextrina (de acor do com IMAIZUIMI et al. em J. Chim. Microbiol., 17, 781-786,1983). Em seguida, transferiu-se a précultura para um meio liquido modificado de Stainer-Scholte sem ciclodextrina. A estirpe de B. bronchiseptica 9.73 foi isolada a partir das fossas nasais de uma lebre.
As culturas líquidas são submetidas a agitação a 150 r/min., durante 15 horas a 36°C, num Erlenmeyer de 1 litro contendo 250 ml de meio. Prossegue-se a cultura até à obtenção de uma densidade óptica D0,cn = 1,2 - 0,2. As bactérias são então eliminadas por
65U centrifugação a 5000 x g durante 25 minutos.
Os sobrenadantes de cultura são conservados a -30°C até ã u. tilização ou concentrados directamente.
Para a concentração, filtram-se, por filtros do tipo p
Millipore HAWP de 0,45 ,μπί, 3 litros de sobrenadante de cultura contendo cerca de 10 jxg de proteinas e 0,1 unidades de enzimas por ml. Retém-se, deste modo, mais de 90% da actividade enzimática nos filtros. Cerca de 80% desta actividade pode ser recuperada por incubação dos filtros em 40 ml de um tampão A constituído por Tris HCL, 50 mM, pH 8, contendo 6 mM de MgClg e 0,1% de Triton X. 100^.
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material insolúvel é eliminado por centrifugação durante 30 minutos a 15000 x g, a 4°C. A actividade especifica do sobrenadante de cultura concentrado é de 115 unidades por miligrama de proteina .
Uma suspensão bacteriana da estirpe' 9.73 foi injectada, por via intranasal, num ratinho; passadas 48 horas, os pulmães foram retirados e macerados, e foi isolado um clone hemolítico, a saber o clone 9.73S. Este clone foi depositado em 12 de Maio de 1989 no CNCM sob ο ne 1-858. Este clone é hemolítico, e sintetiza grandes quantidades de adenil-ciclase. Uma suspensão bacteriana deste clone provoca um edema hemorrágico ao nivel do pulmão no ra tinho.
EXEMPLO 2 : PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ADENIL-CICLASE EXTRA-CITOPLAS MflTICA PURIFICADA NA FORMA LIVRE
Adicionam-se 40 ml de sobrenadante de cultura, concentrado, a R
0,8 a 1 ml de Affigel-calmoduline , e agita-se lentamente a mist£ ra a 4°C durante 18 horas. Mais de 2/3 da actividade enzimática são retidos no gel.
p
Provoca-se a sedimentação do Affigel-calmoduline por centrifugação a 300 x g durante 1 minuto, e lava-se por diversas vezes com NaCl 0,5 M no tampão A. Recupera-se a adenil-ciclase a partir do gel com o auxilio de 2,5 ml de ureia 8,8 M no tampão A. Elimina-se a ureia por filtração através de uma coluna de SephaD dex G-25 , equilibrada com o tampão A.
Esta preparação enzimática possui uma actividade especifica de 1100 unidades/mg de proteína.
Pode ser conservada a -80°C durante várias semanas sem perda de actividade.
EXEMPLO 3 : PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ADENIL-CICLASE PURIFICADA A PARTIR DE EXTRACTOS BACTERIANOS
Submete-se uma cultura de bactérias exprimindo AC activável pela calmodulina a um tratamento com ureia 8M, durante cerca de 2 horas à temperatura ambiente. Recupera-se o sobrenadante que con£ titui o extracto bacteriano e coloca-se em contacto com o gel
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-9- χΖ.....
Affigel-calmoduline nas condições anteriormente descritas.
Obtém-se uma preparação enzimática de pureza elavada apresentando, sensivelmente, a mesma actividade especifica.
EXEMPLO 4 : ESTUDO DA SECREÇÃO DE AC, de PTx e de FHA, E DA DL50 DE ESTIRPES DE BORDETELLA
No quadro 1, abaixo, indicam-se os resultados obtidos ao dosear os factores de virulência AC, PTx e FHA e ao medir a DL50 (dose letal para 50% dos ratinhos num lote) de diferentes estirpes de Bordetella.
Tratam-se de estirpes de B.pertussis (BP), B.parapertussis (BPP) e B. bronchiseptica (BB) correspondendo quer às estirpes hiperpatogénicas, que segregam grandes quantidades de adenil-ciclase (estas estirpes apresentam a referência 5 no quadro), quer às estirpes parentéricas das estirpes hiperpatogénicas.
QUADRO 1
AC PTx FHA DL50
BP 18323 20 1 2 3. 108
BP 18323S 180 4 2 io7
BP8144 2 ( + )
BP8144S 6 ( + )
BP8132 1 ( + ) 32 3,2-108
BP81325 3 ( + ) 32 <l,2.108
BPP632 8 - 64 2< 108
BPP632S 35 - 64 < 108
BB973S 110 - 16 4-106
Estes resultados colocam em evidência a produção elevada
de adenil-ciclase pelas estirpes hiperpatogénicas, mais especialmente pela B,bronchiseptica 973S e B.pertussis 18323S.
A secreção da PTx é igualmente aumentada nos derivados hi
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perpatogénicos, como o mostram os resultados relativos à B.pertussis, enquanto que a secreção da FHA permanece a mesma nas duas estirpes,'
A B.bronchiseptica e a B.parapertussis, que sintetizam os mesmos factores que a B.pertussis, à excepção da PTx, induzem no ratinho uma alveolite edematosa hemorrágica semelhante àquela in duzida pela B.pertussis. Em compensação, uma estirpe derivada da estirpe virulenta B.pertussis 8132, a estirpe B.P.348, e albergando um transposão Tn 5 no gene da estrutura da AC, inact_i vando-o, é incapaz de induzir uma AEHA no ratinho. Este mutante segrega, entretanto, todos os outros factores de virulência, em particular a PTx.
conjunto destes resultados designa a AC como factor responsável pela alveolite edematosa hemorrágica no ratinho.
EXEMPLO 5 :
1 · EXPERIENCIAS DE PROTECÇÃO ACTIVA A PARTIR DE VACINAS BACTERIANAS
Foram realizadas experiências de protecção (contra a B.pertussis) com o auxilio de diferentes vacinas bacterianas (geralmente 3 injecções subcutâneas de 250 /il de suspensão bacteriana, contendo 10 bactérias/ml, aquecidas a 56 C, com uma semana de intervalo).
No quadro 2, abaixo, estão descritos os resultados obtidos, utilizando para a elaboração das vacinas bacterianas estirpes de B.bronchiseptica 9.73S, assim como estirpes de B.pertussis 18323S, B.parapertussis 63.25 e B.avium (Blike Hewouet).
A estirpe de B.pertussis é administrada duas semanas após a última imunização : injectam-se 50 yd, por via intranasal, g de 10 bactérias da .estirpe de B.pertussis 18323S vivas.
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-11QUADRO 2
ESTIRPE INJECTADA
PROVA LETAL (B.pertussis )
10/10
B.bronchiseptica
0/10
B.pertussis
0/10
B. parapertussis
3/10
B. avium
9/10
Constata-se que os ratinhos vacinados com o auxílio de preparações de B.bronchiseptica estão totalmente protegidos contra uma prova letal de B.pertussis (protecção cruzada), tal como aqueles vacinados com B.pertussis.
Em compensação, os ratinhos vacinados com preparações de B.avium não estão protegidos, o que joga a favor do papel da AC na indução da alveolite edematosa hemorrágica.
2. EXPERIENCIAS DE PROTECÇÃO ACTIVA A PARTIR DE ANTIGÉNIOS
PURIFICADOS
Utilizam-se antigénios purificados.
As preparações de AC são purificadas, quer a partir do sobrenadante de cultura (70% do enzima são segregados pela bactéria) quer a partir de bactérias, operando vantajosamente de acordo com o processo do pedido de patente FR 2606789 de 17/11/86.
Os ratinhos foram imunizados com diferentes doses de antigjS nio (3 injecções sub-cutâneas com uma semana de intervalo-, de 250 1 de antigénio num tampão de Tris 10 mM,pH7, contendo 1 mg/ /ml de Am+++) antes de efectuar a prova letal de B.pertussis.
Para a prova letal, injectam-se, por via intranasal, 50 /il de suspensão bacteriana da estirpe virulenta e hiperpatogénica
18323S, 2 semanas após a última imunização. A concentração em ba_c 8 8 térias da suspensão é de 10 no ensaio £, 2x10 no ensaio _b, e
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-ΙΣ-
ΙΟ no ensaio c.
No quadro 3, abaixo, descreveram-se os resultados de protecção obtidos contra uma estirpe de B.pertussis (BP 18323S) com diferentes concentrações, após injecção de AC, de AC recombinante de uma vacina, de PTx e de FHA.
A AC recombinante é vantajosamente tal como descrita no pedido de patente FR 2621597 de 24/7.87. Trata-se de um fragmento correspondente ao gene da estrutura da AC que pode ser expresso na E.coli. Este fragmento, que suporta a actividade de ad.e nil-ciclase e o sítio c
AC
3/0,9)jg 9/12
3/1,5pg 1/10
ACrec
fixação da calmodulina figura única). , foi purificado
QUADRO 3
VACINA PTx FHA 0
letal de B.P .18323S 10/DL50
3/109b 2/2jug 2/10jug
0/40 9/22 20/22 20/22
letal de B.P.18323S 20/DL50
3/2yjg
5/10
3/109b
3/10 c : prova letal de B.P.18323S 1/DL50 3/6^ig 3/6^g 3/18yug 3/2/jg 3/10/jg 0/10 0/10 0/10 0/10 5/10
10/10
5/10
Os resultados de letalidade são expressos em número de rati^ nhos mortos sobre o número de ratinhos totais.
Os resultados obtidos demonstram a obtenção de uma síntese de anticorpos anti-AC e uma protecção dos ratinhos, após imunização com a AC (três imunizações de 1,5 Xl de AC). Esta protecção é
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quase total quando a prova letal ê realizada com uma quantidade de bactérias igual (10? bactérias vivas) ou 10 vezes superior à dose letal 50 (10 bactérias vivas); ela é de 60% quando a prova letal é realizada com uma quantidade de bactérias igual a 20 veg zes a dose letal 50 (2x10 bactérias letais).
Foi obtida uma protecção total apõs imunização de ratinhos com a AC recombinante, quando a prova letal é realizada com uma quantidade de bactérias igual à dose letal 50. As imunizações realizadas com a FHA não demonstraram possuir o efeito protector desta toxina apesar da presença de anticorpos nos ratinhos imunizados, e isto mesmo quando a prova letal é realizada com uma qua_n tidade fraca de bactérias.
As experiências realizadas comaPTx mostram uma protecção parcial após duas imunizações com 2 /jq de PTx quando a prova letal é 10 vezes superior à dose letal 50, mas é necessário precisar que, neste caso, a sintese de anticorpos anti-PTx é muito frai ca. Quando os ratinhos são imunizados com 3 vezes 2 ^ug de PTx, a sintese de anticorpos é mais importante e obtém-se uma protecção total quando a prova letal é realizada com uma quantidade de ba£ térias igual à dose letal 50.
Do conjunto destes resultados, a adenil-ciclase constitui a citotoxina responsável pela alveolite edematosa hemorrágica obsej? vada no ratinho infectado pela B.pertussis e constitui um antigénio protector contra estas lesões. A PTx e a FHA não desempenharei am qualquer papel na indução desta AEHA mas poderiam ser antigénios protectores destas lesões ao inibir a adesão de bactérias s_o bre o epitélio respiratório.

Claims (9)

  1. R Ε I V I N D I C A Ç 0 E S
    1 - Processo de preparação de um antigénio protector para o Homem ou o animal, contra as infecções e os efeitos tóxicos causa dos por uma dada bactéria do género Bordetella, caracterizado por se suspenderem bactérias do género Bordetella, mas diferentes das que provocaram a infecção no Homem ou no animal a tratar, com o antigénio protector, e se submeter a suspensão a uma etapa de aquecimento, antes de a utilizar para fins de tratamento.
  2. 2 - Processo de preparação de um antigénio protector para o Homem ou o animal contra as infecções e os efeitos tóxicos causados por uma dada bactéria do género Bordetella, caracterizado por se elaborar uma preparação de adenil-ciclase colocando em contacto, com a calmodulina, um sobrenadante de uma cultura bacteriana de Bordetella exprimindo a adenil-ciclase ou de um extracto destas bactérias, sendo estas bactérias diferentes das que provocaram a infecção no Homem ou no animal a tratar com o antigénio protector.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o sobrenadante da cultura bacteriana ser um sobrenadante concentrado, obtido submetendo um sobrenadante de cultura bacteriana exprimindo a adenil-ciclase, a uma ou várias operações de filtração, e em seguida, incubando os filtros com um agente detergente, a fim de libertar a adenil-ciclase, e eliminando os materiais insolúveis presentes.
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o extracto bacteriano ser obtido por tratamento de células bacterianas, exprimindo a adenil-ciclase, com ureia e, recuperação do sobrenadante.
  5. 5 - Processo de preparação de um antigénio protector para o Homem ou o animal, contra os efeitos tóxicos causados por uma dada bactéria do género Bordetella, caracterizado por se utilizar uma adenil-ciclase tal como expressa pela sequência nucleotidica que se apresenta
    71 032
    1039Β
    GAAGCCTTGTTCTTCTTTTCATTAGAAAGAAATATGCGCTTTGTGTTTAGGATGATTTTC
    -200
    CTGTCCGAGTAGGGTGGATCCAAATTTTCCGGATTGGTGGGAATTTGTGCATTTTCACTG • · · · · ·
    CGAATGTTGGAATAATTTCGCCCATCGTCATACGACATGCTGGATGTTTGGTTCTTGCAG • · · —100 · .
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    MetGlnGlnSerHisGlnAlaGlyTyrAlaAsnAlaAlaAsp
    ACTTATCGACAGATCCACATGCAGCAATCGCATCAGGCTGGTTACGCAAACGCCGCCGAC • 0 · · · ·
    ArgGluSerGlylleProAlaAlaValLeuAspGlylleLysAlaValAlaLysGluLys
    CGGGAGTCTGGCATCCCCGCAGCCGTACTCGATGGCATCAAGGCCGTGGCGAAGGAAAAA • · · · · 100
    AsnAlaThrLeuMetPheArgLeuValAsnProHisSerThrSerLeuIleAlaGluGly
    AACGCCACATTGATGTTCCGCCTGGTCAACCCCCATTCCACCAGCCTGATTGCCGAAGGG
    ValAlaThrLysGlyLeuGlyValHisAlaLysSerSerAspTrpGlyLeuGlnAlaGly
    GTGGCCACCAAAGGATTGGGCGTGCACGCCAAGTCGTCCGATTGGGGGTTGCAGGCGGGC
    200
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    TACATTCCCGTCAACCCGAATCTTTCCAAACTGTTCGGCCGTGCGCCCGAGGTGATCGCG
    71 032
    1039Β
    -16AxgAlaAspAsnAspValAsnSerSerLeuAlaHisGlyHisThrAlaValAspLeuThr
    CGGGCCGACAACGACGTCAACAGCAGCCTGGCGCATGGCCATACCGCGGTCGACCTGACG • 300 · · · ·
    LeuSerLysGluArgLeuAspTyrLeuArgGlnAlaGlyLeuValThrGlyMetAlaAsp
    CTGTCGAAAGAGCGGCTTGACTATCTGCGGCAAGCGGGCCTGGTCACCGGCATGGCCGAT • · · · · 400
    GlyValValAlaSerAsnHisAlaGlyTyrGluGlnPheGluPheArgValLysGluThr
    GGCGTGGTCGCGAGCAACCACGCAGGCTACGAGCAGTTCGAGTTTCGCGTGAAGGAAACC • · · · · ·
    SerAspGlyArgTyrAlaValGlnTyrArgArgLysGlyGlyAspAspPheGluAlaVal
    TCGGACGGGCGCTATGCCGTGCAGTATCGCCGCAAGGGCGGCGACGATTTCGAGGCGGTC
    500
    LysValIleGlyAsnAlaAlaGlylleProLeuThrAlaAspIleAspMetPheAlalle
    AAGGTGATCGGCAATGCCGCCGGTATTCCACTGACGGCGGATATCGACATGTTCGCCATT
    MetProHisLeuSerAsnPheArgAspSerAlaArgSerSerValThrSerGlyAspSer
    ATGCCGCATCTGTCCAACTTCCGCGACTCGGCGCGCAGTTCGGTGAÇCAGCGGCGATTCG • 600 * · · . · ValThrAspTyrLeuAlaArgThrArgArgAlaAlaSerGluAlaThrGlyGlyLeuAsp GTGACCGATTACCTGGCGCGCACGCGGCGGGCCGCCAGCGAGGCCACGGGCGGCCTGGAT
    700
    ArgGluArglleAspLeuLeuTrpLysIleAlaArgAlaGlyAlaArgSerAlaValGly
    CGCGAACGCATCGACTTGTTGTGGAAAATCGCTCGCGCCGGCGCCCGTTCCGCAGTGGGC • · · · · ·
    71 032
    1039Β
    ThrGluAlaArgArgGlnPheArgTyrAspGlyAspMetAsnlleGlyValIleThrAsp
    ACCGAGGCGCGTCGCCAGTTCCGCTACGACGGCGACATGAATATCGGCGTGATCACCGAT
    800
    PheGluLeuGluValArgAsnAlaLeuAsnArgArgAlaHisAlaValGlyAlaGlnAsp
    TTCGAGCTGGAAGTGCGCAATGCGCTGAACAGGCGGGCGCACGCCGTCGGCGCGCAGGAC
    ValValGlnHIsGlyThrGluGlnAsnAsnProPheProGluAlaAspGluLysIlePhe
    GTGGTCCAGCATGGCACTGAGCAGAACAATCCTTTCCCGGAGGCAGATGAGAAGATTTTC
    900 . · · · ·
    ValValSerAlaThrGlyGluSerGlnMetLeuThrARgGlyGlnLeuLysGluTyrlle
    GTCGTATCGGCCACCGGTGAAAGCCAGATGCTCACGCGCGGGCAACTGAAGGAATACATT • * · · · 1000 GlyGlnGlnArgGlyGluGlyTyrValPheTyrGluAsnArgAlaTyrGlyValAlaGly GGCCAGCAGCGCGGCGAGGGCTATGTCTTCTACGAGAACCGTGCATACGGCGTGGCGGGG lysSerLeuPheAspAsfGlyLeuGlyAlaAlaProGlyValProSerGlyArgSerliys
    AAAAGCCTGTTCGACGA1GGGCTGGGAGCCGCGCCCGGCGTGCCGAGCGGACGTTCGAAG
    -:-r .· íioo
    PheSerProAspValLeuGluThrValProAlaSerProGlyLeuArgArgProSerLeú
    TTCTCGCCGGATGTACTGGAAACGGTGCCGGCGTCACCCGGATTGCGGCGGCCGTÇGCTG
    GlyAlaValGluArgGlnAspSerGlyTyrAspSerLeuAspGlyValGlySerArgSer
    GGCGCAGTGGAACGCCAGGATTCCGGCTATGACAGCCTTGATGGGGTGGGATCGCGATCG
    1200
    71 032
    1039Β
    -18PheSerLeuGlyGluValSerAspMetAlaAlaValGluAlaAlaGluLeuGluMetThr
    TTCTCGTTGGGCGAGGTGTCCGACATGGCCGCCGTGGAAGCGGCGGAACTGGAAATGACC » · · · · 1300
    ArgGlnValLeuHisAlaGlyAlaArgGlnAspAspAlaGluProGlyValSerGlyAla CGGCAAGTCTTGCACGCCGGGGCGCGGCAGGACGATGCCGAGCCGGGCGTGAGCGGTGCG
    SErAlaHisTrpGlyGlnArgAlaLeuGlnGlyAlaGlnAlaValAlaAlaAlaGlnArg
    TCGGCGCACTGGGGGCAGCGGGCGCTGCAGGGCGCCCAGGCGGTGGCGGCGGCGCAGCGG
    1400
    LeuValHisAlalleAlaLeuMetThrGlnPheGlyArgAlaGlySerThrAsnThrPro
    CTGGTTCATGCCATTGCCCTGATGACGCAATTCGGCCGGGCCGGTTCCACCAACACGCCG ·«····
    GlnGluAlaAlaSerLeuSerAlaAlaValPheGlyLeuGlyGluAlaSerSerAlaVal
    CAGGAAGCGGCCTCGTTGTCGGCGGCCGTGTTCGGCTTGGGCGAGGCCAGCAGCGCCGTG • 1500 · · · ·
    AlaGluThrValSerGlyPhePheArgGlySerSerArgTrpAlaGlyGlyPheGlyVal GCCGAAACCGTGAGCGGTTTTTTCCGCGGGTCTTCGCGCTGGGCCGGCGGTTTCGGCGTG . ‘ ’ . . . ' . . 1600 AlaGlyGlyAlaMetAlaLeuGlyGly [lylleAlaAlaAlaValGlyAlaGlyMet Ser GCTGGCGGCGCGATGGCGCTGGGAGGCGGCATCGCCGCGGCCGTTGGCGCCGGGATGTCG
    LeuThrAspAspAlaProAlaGlyGlnLqsAlaAlaAlaGlyAlaGluIleAlaLeuGln
    TTGACCGATGACGCGCCGGCCGGACAGAAGGCCGCCGCCGGCGCCGAGATCGCGCTGCAG
    1700
    71 032
    1039Β
    -19«?·
    LeuThrGlyGlyThrValGluLEuAlaSerSerlleAlaLeuAlaLeuAlaAlaAlaArg
    TTGACAGGTGGAACGGTCGAGCTGGCTTCTTCCATCGCGTTGGCGCTGGCCGCGGCGCGC
    GlyValThrSerGlyLeuGlnValAlaGlyAlaSerAlaGlyAlaAlaAlaGlyAlaLeu
    GGCGTGACCAGCGGCTTGCAGGTGGCCGGGGCGTCGGCCGGGGCGGCTGCCGGCGCATTG * 1800 · · · · AlaAlaAlaLeuSerProMetGluIleTyrGlyLKuValGlnGlnSerHisTyrAlaAsp GCCGCGGCGCTCAGTCCCATGGAGATCTACGGCCTGGTGCAGCAATCGCACTATGCGGAT • · · · · 1900
    GlnLeuAspLysLeuAlaGlnGluSerSerAlaTyrGlyTyrGluGlyAspAlaLeuLeu CAGCTGGACAAGCTGGCGCAGGAATCGAGCGCATACGGTTACGAGGGCGACGCCTTGCTG
    AlaGlnLeuTyrArgAspLysThrAlaAlaGluGlyAlaValAlaGlyValSerAlaVal
    GCCCAGCTGTATCGCGACAAGACGGCCGCCGAGGGCGCCGTCGCCGGCGTCTCCGCCGTC . . . 2000 LeuSerThrValGlyAlaAlaValSerlleAlaAlaAlaAlaSex ValValGlyAlaPro CTGAGCACGGTGGGGGCGôCGGTGTCGATCGCCGCGGCGGCCAGC GTGGTAGGGGCCCCG
    ValAlaValValThrSerLeuLeuThrGlyAlaLeuAsnGlylleLeuArgGlyValGln
    GTGGCGGTGGTCACTTCCTTGCTGACCGGGGCTCTCAACGGCATCCTGCGCGGCGTGCAG • 2100 · · · ·
    GlnProIleIle[luLysLeuAlaAsnAspTyrAlaArgLysIleAspGluLeuGlyGly
    CAGCCCATCATCGAAAAGCTGGCCAACGATTACGCTCGCAAGATCGACGAGCTGGGCGGG
    2200
    71 032
    1039Β
    ProGlnAlaTyrPheGluLysAsnLeuGlnAlaArgHisGluGlnLeuAlaAsnSerAsp
    CCGCAAGCGTACTTCGAGAAAAACCTGCAGGCGCGTCACGAACAACTGGCCAATTCGGAC
    GlyLeuArgLysMetLeuAlaAspLeuGlnAlaGlyTrpAsnAlaSerSerValIleGly
    GGCCTACGGAAAATGCTGGCCGACCTGCAGGCCGGTTGGAACGCCAGCAGCGTGATCGGG
    2300
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    GTGCAGACGACAGAGATCTCCAAGTCGGCGCTCGAACTGGCCGCCATTACCGGCAACGCG
    AspAsnLeuLysSerValAspValPheValAspArgPheValGlnGlyGluArgValAla
    GACAACCTGAAATCCGTCGACGTGTTCGTGGACCGCTTCGTCCAGGGCGAGCGGGTGGCC • 2400 · · · ·
    GlyGlnProValValLeuAs-ValAlaAlaGlyGlylleAspIleAlaSerArgLysGly GGCCAGCCGGTGGTCCTCGACGTCGCCGCCGGCGGCATCGATATCGCCAGCCGCAAGGGC • · · · · 2500
    GluArgProAlaLeuThrPnelleThrProLeuAlaAlaProGlyGluGluGlnArgArg GAGCGGCCGGCGCTGACGTTCATCACGCCGCTGGCCGCGCCAGGAGAAGAGCAGCGCCGG
    ARgThrLysThrGlyLysSerGluPheThrThrPheValGluIleValGlyLysGlnAsp
    CGCACGAAAACGGGCAAGAGCGAATTCACCACATTCGTCGAGATCGTGGGCAAGCAGGAC
    2600
    ArgTrpArglleArgAspGlyAlaAlaAspThrThrlleAspLeuAlaLysValValSer
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    -2171 032
    1D39B
    GlnLeuValAspAlaAsnGlyValLeuLysHisSerlleLysLeuAspValXleGlyGly
    CAACTGGTCGACGCCAATGGCGTGCTCAAGCACAGCATCAAACTGGATGTGATCGGCGGA • 27 00 · · · ·
    AspGlyAspAspValValLeuAlaAsnAlaSerArglleHisTyrAspGlyGlyAlaGly
    GATGGCGATGACGTCGTGCTTGCCAATGCTTCGCGCATCCATTATGACGGCGGCGCGGGC • · · « · 2800 ThrAsnThrValSerTyrAlaAlaLeuGlyArgGlnAspSerlleThrValSerAlaAsp ACCAACACGGTCAGCTATGCCGCCCTGGGTCGACAGGATTCCATTACCGTGTCCGCCGAC
    GlyGluArgPheAsnValArgLysGlnLeuAsnAsnAlaAsnValTyrArgGluGlyVal
    GGGGAACGTTTCAACGTGCGCAAGCAGTTGAACAACGCCAACGTGTATCGCGAAGGCGTG
    2900
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    GCTACCCAGACAACCGCCTACGGCAAGCGCACGGAGAATGTCCAATACCGCCATGTCGAG
    LeuAlaArgValGlyGlnValValGluValAspThrLeuGluHisValGlnHisIlelle
    CTGGCCCGTGTCGGGCAAGTGGTGGAGGTCGACACGCTCGAGCATGTGCAGCACATCATC • 3000 · · · ·
    GíyGlyalaGlyAsnAspSerlleThrGlyAsnAlaHisAspAsnPheLeuAlaGlyGly GGCGGGGCCGGCAACGATTCGATCACCGGCAATGCGCACGACAACTTCCTAGCCGGCGGG · · · · 3100
    SerGlyAspAspArgLeuAspGlyGlyAlaGlyAsnAspThrLeuValGlyGlyGluGly
    TCGGGCGACGACAGGCTGGATGGCGGCGCCGGCAACGACACCCTGGTTGGCGGCGAGGGC
    -2271 032
    1039Β
    GlnAsnThrValIleGlyGlyAlaGlyAspAspValPheLeuGlnAspLeuGlyValTrp
    CAAAACACGGTCATCGGCGGCGCCGGCGACGACGTATTCCTGCAGGACCTGGGGGTATGG
    3200
    SerAsnGlnLeuAspGlyGlyAlaGlyValAspThrValLysTyrAsnValHisGlnPro
    AGCAACCAGCTCGATGGCGGCGCGGGCGTCGATACCGTGAAGTACAACGTGCACCAGCCT
    SerGluGluArgLeuGluArgMetGlyAspThrGlylleHisAlaAspLeuGlnLysGly
    TCCGAGGAGCGCCTCGAACGCATGGGCGACACGGGCATCCATGCCGATCTTCAAAAGGGC • 3300 · · · ·
    ThrValGluLysTrpProAlaLeuAsnLeuPheSerValAspHisValLysAsnlleGlu
    ACGGTCGAGAAGTGGCCGGCCCTGAACCTGTTCAGCGTCGACCATGTCAAGAATATCGAG »
    . . . . . 3400
    AsnLeuHisGlySerArgLeuAsnAspArglleAlaGlyAspAspGlnAspAsnGluLeu AATCTGCACGGCTCCCGCCTAAACGACCGCATCGCCGGCGACGACCAGGACAACGAGCTC • · · · · · . t'
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    TGGGGCCACGATGGCAACGACACGATACGCGGCCGGGGCGGCGACGACATCCTGCGCGGC
    3500
    GlyLeuGlyLeuAspThrLeuTyrGlyGluAspGlyAsnAspIlePheLeuGlnAspAsp
    GGCCTGGGCCTGGACACGCTGTATGGCGAGGACGGCAACGACATGTTCCTGCAGGACGAC
    GluThrValSerAspAspIleAspGlyGlyAlsGlyLeuAspThrValAspTyrSerAla
    GAGACCGTCAGCGATGACATCGACGGCGGCGCGGGGCTGGACACCGTCGACTACTCCGCC
    3600
    71 032
    1039Β
    MetlleHisProGlyArglleValAlaProHisGluTyrGlyPheGlylleGluAlaAsp
    ATGATCCATCCAGGCAGGATCGTTGCGCCGCATGAATACGGCTTCGGGATCGAGGCGGAC • · · · · 3700
    LeuSerArgGluTrpValArgLysAlaSerAlaLeuGlyValAspTyrTyrAspAsnVal CTGTCCAGGGAATGGGTGCGCAAGGCGTCCGCGCTGGGCGTGGACTATTACGATAATGTC
    ArgAsnValGluAsnValIleGlyThrSerMetLysAspValLeuTleGlyAspAlaGln
    CGCAATGTCGAAAACGTCATCGGTACGAGCATGAAGGATGTGCTCATCGGCGACGCGCAA
    3800
    AlaAsnThrLeuMetGlyGlnGlyGlyAspAspThrValArgGlyGlyAspGlyAspAsp
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    CTGCTGTTCGGCGGCGACGGCAACGACATGCTGTATGGCGACGCCGGCAACGACACCCTC . 3900 ....
    TyrGlyGlyLeuGlyAspAspThrLeuGluGlyGlyAlaGlyAsnAspTrpPheGlyGly TACGGGGGGCTGGGCGACGATACCCTTGAAGGCGGCGCGGGCAACGATTGGTTCGGCCAG .·.··. . 4000
    ThrGlnAlaArgGluHisAspValLeuArgGlyGlyAspGlyValAspThrValAspTyr ACGCAGGCGCGCGAGCATGACGTGCTGCGCGGCGGAGATGGGGTGGATACCGTCGATTAC
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    4100
    71 032
    1039Β
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    GACCTGGGCGCCGGCCGCGTCGACAAGCTGGGCGAGGCCGGCAGCAGCGCCTACGATACG • · · · · ·
    ValSerGlylleGluAsnValValGlyThrGluLeuAlaAspArglleThrGlyAspAla
    GTTTCCGGTATCGAGAACGTGGTGGGCACGGAACTGGCCGACCGCATCACGGGCGATGCG . 4200 .
    GlnAlaAsnValLeuArgGlyAlaGlyGlyAlaAspValLeuAlaGlyGlyGluGlyAsp
    CAGGCCAACGTGCTGCGCGGCGCGGGTGGCGCCGACGTGCTTGCGGGCGGCGAGGGCGAC • · · · · 4300
    AspValLeuLeuGlyGlyAspGlyAspAspGlnLeuSerGlyAspAlaGlyArgAspArg GATGTGCTGCTGGGCGGCGACGGCGACGACCAGCTGTCGGGCGACGCCGGACGCGATCGC
    LeuTyrGlyGluAlaGlyAspAspTrpPhePheGlnAspAlaAlaAsnAlaGlyAsnLeu
    TTGTACGGCGAAGCCGGTGACGACTGGTTCTTCCAGGATGCCGCCAATGCCGGCAATCTG
    4400
    LeuAspGlyGlyAspGlyArgAspThrValAspPheSerGlyProGlyArgGlyLeuAsp
    CTCGACGGCGGCGACGGCCGCGATACCGTGGATTTCAGCGGCCCGGGCCGGGGCCTCGAC
    AlaGlyAlaLysGlyValPheLeuSerLeuGlyLysGlyPheAlaSerLeuMetAspGlu
    GCCGGCGCAAAGGGCGTATTCCTGAGCTTGGGCAAGGGGTTCGCCAGCCTGATGGACGAA • 4500 · · · ·
    ProGluThrSerAsnValLeuArgAsnlleGluAsnAlaValGlySerAlaArgAspAsp CCCGAAACCAGCAACGTGTTGCGCAATATCGAGAACGCCGTGGGCAGCGCGCGTGATGAC
    4600
    71 032
    1039Β
    ValLeuIleGlyAspAlaGlyAlaAsnValLeuAsnGlyLeuAlaGlyAsnAspValLeu
    GTGCTGATCGGCGACGCAGGCGCCAACGTCCTCAATGGCCTGGCGGGCAACGACGTGCTG
    SerGlyGlyAlaGlyAspAspValLeuLeuGlyAspGlullySerAspLeuLeuSerGly
    TCCGGCGGCGCTGGCGACGATGTGCTGCTGGGCGACGAGGGCTCGGACCTGCTCAGCGGC
    4700
    AspAlaGlyAsnAspAspLeuPheGlyglyGlnGlyAspA ^ThrTyrLeuPheGlyVal GATGCGGGCAACGACGATCTGTTCGGCGGGCAGGGCGATGATACTTATCTGTTCGGGGTC
    GlyTyrGlyH;sAspThrIleTyrGluSerGlyGlyGlyHisAspThrIleArglleAsn
    GGGTACGGGCACGACACGATCTACGAATCGGGCGGCGGCCATGACACCATCCGCATCAAC • 4800 · · ·
    AlaGlyAlaAspGlnLeuTrpPxeAlaArgGlnGlyAsnAspLeuGluIleArglleLeu GCGGGGGCGGACCAGCTGTGGTTCGCGCGCCAGGGCAACGACCTGGAGATCCGCATTCTC * · · · · · 4900
    GlyThrAspAspAlaLeuThrValHisAspTrpTyrArgAspAlaAspHisArgValGlu
    GGCACCGACGATGCACTTACCGTGCACGACTGGTATCGCGACGCCGATCACCGGGTGGAA • · · · · ·
    IlelleHisAlaAlaAsnGlnAlaValAspGlnAlaGlylleGluLysLeuValGluAla
    ATCATCCATGCCGCCAACCAGGCGGTAGACCAGGCAGGCATCGAAAAGCTGGTCGAGGCA
    5000
    MetAlaGlyTyrProAspProGlyAlaAlaAlaAlaAlaProProAlaAlaArgVaIPro
    ATGGCGCAGTATCCGGACCCCGGCGCGGCGGCGGCTGCCCCGCCGGCGGCGCGCGTGCCG • e · · · ·
    71 032
    1039Β
    -26AspThrLeuMetGlnSerLeuAlaValAsnTrpArg***
    GACACGCTGATGCAGTCCCTGGCTGTCAACTGGCGCTGAAGCGCCGTGAATCACGGCCCG
    5100 ....
    CCTGCCTCGCGCGGCGGCGCCGTCTCTTTGCGTTCTTCTCCGAGGTATTTCCCATCATGA • · · · · 5200
    CGTCGCCCGCGGCGCAATGCGCCAGCGTGCCCGATTCCGGGTTGCTCTGCCTGGTCATGC
    TGGCTCGCTATCACGGATTGGCAGCCGATCCCGAGCAGTTGCGGCATGAGTTCGCCGAGC
    5300
    AGGCATTCTGTAGCGAAACGATACAGCCTGGCGGCGCGCCGGGTCGGCCTGAAAGTGCGG
    CGGCACCGACCCGCGCCGGCGCGGCTGCCACGCGCGCCGCTGCCGGCCATCGCGCTGGAC
    5400 ....
    CGGCAGGGCGGCTACTTTGTT
    71 032
    1039Β
    -276 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por as bactérias do género Bordetella serem escolhidas de entre B. pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica.
  6. 7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, quando a infecção é provocada por uma bactéria do género B. pertussis ou B. parapertussis, o antigénio protector ser preparado a partir de bactérias ou de adenil-cicl_a se produzida por bactérias do género B. bronchiseptica.
    R - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, quando a infecção é provocada por uma bactéria do género B. bronchiseptica ou B. parapertussis, o anti génio protector ser preparado a partir de bactérias ou de adenil_ -ciclase produzida por bactérias do género B. pertussis.
  7. 9 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, quando a infecção é provocada por uma bactéria do género B. pertussis ou B. bronchiseptica, o antigénio protector ser preparado a partir de bactérias ou de adenil-ciclase produzida por bactérias do género B. parapertussis.
  8. 10 - Processo de preparação de vacinas capazes de induzirem uma protecção contra os efeitos tóxicos e as infecções causadas pelas Bordetella, caracterizado por se elaborar, sob uma forma administrável, uma vacina molecular contendo, pelo menos, a parte activa da sequência de aminoácidos apresentada na reiviri dicação 5, sendo caso disso, associada, no mesmo inóculo ou não à FHA e/ou à PTx.
  9. 11 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por as preparações vacinantes estarem associadas, no mesmo inóculo ou não, com a FHA e/ou a PTx.
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