JPH0284183A - ボルデテラ・ペルタシスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、２６位のアミノ酸位置にてトリプトファン残
基の修飾を含む完全または切形ボルデテラ・ペルタシス
（Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素
Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配列を有するボ
ルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列によりコー
ドされたタンパク質からなる百日咳に対する保護用ワク
チンに関する。

発明の背景 百日咳またはベルタシスは、主に子供がかかる非常に感
染しやすい疾患である。呼吸合併症を引き起こすことに
加えて、百日咳は、特に低社会経済群の子供および母系
抗−ペルタシス抗体のない新生幼児にて神経損傷および
高死亡率をもたらしうる。ペルタシスの病因剤は、ボル
デテラ・ペルタシスとして知られているダラム陰性球杆
菌である。該細菌は気道を侵し、該細菌の消失後であっ
ても残る毒性状態を誘発すると考えられている。

ボルデテラ・ペルタシスにより引き起こされる感染に対
して効果的かつ安全なワクチンについての継続的要求が
ある。

発明の要約 本発明は、 （ａ）Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配列が２
６位のアミノ酸位置のトリプトファン残基（以下、Ｔｒ
ｐ−２６という）の修飾と有し、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６
の修飾がボルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列
によりコードされたタンパク質において、実質的に、不
活性なＳｌ酵素活性をもたらすが、該タンパク質が抗−
ベルタシス毒素抗体により認識される能力を保持してい
る、完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサ
ブユニットアミノ酸コーディング配列を有するボルデテ
ラ・ペルタシス毒素コーディング配列に関する。本発明
はまた、本発明のコーディング配列を有する組換えＤＮ
Ａ分子に関する。

本発明のさらなる具体例として、本発明のコーディング
配列を含む組換えＤＮＡプラスミドが提供される。この
プラスミドは、適当な発現制御配列と作動可能につなが
った前記コーディング配列を有することが好ましい。「
適当な発現制御配列」とは、本発明のプラスミドが導入
される適当な宿主細胞により、本発明のコーディング配
列を発現させるのに要するそれらの配列を意味する。か
かる発現制御配列は当業者によく知られている。

本発明のさらにもう一つの態様は、所望の宿主細胞を本
発明のプラスミドで形質転換することからなる形質転換
宿主細胞を製造する方法である。

本発明のさらなる態様は、本発明のプラスミドで形質転
換された宿主細胞である。かかる宿主細胞は適当な培地
中にて増殖し、本発明のコーディング配列を発現するこ
とができる。

本発明のさらにまたもう一つの態様は、適当な培地中に
て本発明の形質転換宿主を培養し、生成されたタンパク
質を単離することからなる本発明のタンパク質を製造す
る方法を包含する。本発明はまた、本発明のコーディン
グ配列によりコードされるタンパク質に関する。

本発明のもう一つの具体例は、免疫保護有効および非毒
性量の本発明のタンパク質からなり、百日咳に対する保
護を刺激するワクチンにある。かかるワクチンは、該タ
ンパク質単独にて、または他の抗原および／またはアジ
ュバントと共に構成してもよい。「免疫保護有効量」な
る語は、かかる量のタンパク質をヒト宿主に投与した場
合、ペルタシスに対して十分な保護免疫応答を誘発する
い、ずれのタンパク質の量をも意味する。

加えて、本発明はまた、本発明のワクチンをかかるヒト
に投与することからなる、百日咳に対してヒトを接種す
る方法を提供する。

本発明のもう一つの具体例は、（ｉ）天然のボルデテラ
・ペルタシスＤＮＡからの単離または合成もしくは組換
えＤＮＡ技法により得られる、２６位のアミノ酸位置の
トリプトファン残基に未だ修飾のない完全または切形ボ
ルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コ
ーディング配列を含むボルデテラ・ペルタシス毒素アミ
ノ酸コーディング配列を、部位定方向突然変異、トリプ
トファンを修飾する化学試薬または光酸化で処理し、２
６位のアミノ酸位置のトリプトファン残基の修飾または
欠失を得、所望の宿主細胞を得られたかかるコーディン
グ配列を有するプラスミドで形質転換し、かかる宿主を
適当な培地中にて培養し、生成したタンパク質を単離す
るか、（■）天然のボルデテラ・ペルタシスＤＮＡから
の単離または合成もしくは組換えＤＮＡ技法により得ら
れる、完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌ
サブユニットアミノ酸コーディング配列を含むボルデテ
ラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーディング配列の５１サ
ブユニツトの２６位のトリプトファン残基を、別のアミ
ノ酸で置換または欠失し、所望の宿主細胞を得られたか
かるコーディング配列を有するプラスミドで形質転換し
、かかる宿主を適当な培地にて培養し、生成したタンパ
ク質を単離するか、または（ｉｉ）かかるコーディング
配列を合成方法により得、所望の宿主細胞を得られたか
かるコーディング配列を有するプラスミドで形質転換し
、かかる宿主を適当な培地にて培養し、生成したタンパ
ク質を単離することからなる（ａ）Ｓｌサブユニットコ
ーディング配列が２６位のアミノ酸位置のトリプトファ
ン残基（以下、「Ｔｒｐ−２６」という）の修飾を有し
、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６の修飾が、ボルデテラ・ペルタ
シス毒素オペロン・アミノ酸コーディング配列によりコ
ードされたタンパク質において、実質的に、不活性なＳ
ｌ酵素活性をもたらすが、該タンパク質が抗−ペルタシ
ス毒素抗体により認識される能力を保持している、完全
または切形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニッ
トアミノ酸コーディング配列を有するボルデテラ・ペル
タシス毒素アミノ酸コーディング配列によりコードされ
るタンパク質を製造する方法である。

本発明のさらなる態様は、染色体ベルタシス毒素遺伝子
を不活性化するボルデテラ・ペルタシス株であり、かか
る株は本発明の組換えＤＮＡ分子を含む。本発明のもう
一つの具体例は、免疫保護有効かつ非毒性量の本発明の
株を含み、百日咳に対する保護を刺激する全細胞ワクチ
ンである。かかるワクチンは該株単独にて、または他の
抗原および／またはアジュバントと共に構成してもよい
。

本発明のさらに別の態様は、該ワクチンをヒトに投与す
ることからなる、その後の百日咳に対してヒトを接種す
る方法に関する。

本発明の他の態様および利点を、その好ましい具体例の
以下の発明の詳細な記載にて開示する。

本発明は、ペルタシス毒素コーディング配列のＳｌサブ
ユニットの２６位の天然に存在するトリプト７アンアミ
ノ酸残基の修飾が、保護免疫原応答を誘発する能力を保
持しながら、ペルタシス毒素の毒性を大いに減少させる
という知見に基づいている。

ベルタシス毒素は百日咳の病因において主たる役割を果
たすボルデテラ・ペルタシスのタンパク質菌体外毒素で
あり、ボルデテラ・ペルタシスの主な保護抗原であると
考えられる［エイ・エイ・ワイスも（Ａ、Ａ、Ｗｅｉｓ
ｓ　ｅＬ　ａｌ、）　、アン・レブ・マイクロパイオー
ル（Ａ　ｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．）、
４０：６６１　（１９８６）参照］。ペルタシス毒素は
、その減少する分子量により、ＳｌないしＳ５と称され
る５つの異なるサブユニットからなるヘキサメリックな
（ｈｅｘａｍｅｒｉｃ）タンパク質である［エム・タム
ラら（Ｍ、Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、）　、バイオケ
ミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、２１：５５１６（
１９８２）参照］。ペルタシス毒素は、Ｂ−オリゴマー
（サブユニットＳ２ないしＳ５）が毒素の標的細胞膜に
おける受容体への結合に関与し、Ａ−プロトマー（ｐｒ
ｏｔｏｍｅｒＸ　Ｓ　ｌサブユニット）が酵素活性を有
するＡ−Ｂモデルにて組み立てられている。

今回、本発明のコーディング配列により得られたＳｌサ
ブユニットのＴｒｐ−２６の修飾により、該コーディン
グ配列が、Ｓｌサブユニット酵素活性を、実質上、不活
性化するタンパク質をコードすることを見いだした。正
常なＳｌサブユニット酵素活性は、ペルタシス毒素また
は３１サブユニツトタンパク質を有する種々のボルデテ
ラ・ペルタシスワクチンの毒性に寄与する。かかる酵素
活性ｆ；ｉ、ＮＡＤ−糖加水分解またはＡＤＰ−リボシ
ルトランスファー　（ｒｉｂｏｓｙｌＬｒａｎｓｆｅｒ
）を包含する。

したがって、本発明のワクチンはかかる毒性問題がまっ
Ｉ；＜ない。加えて、それにもかかわらず、Ｓｌサブユ
ニット酵素活性のかかる不活性化は、本発明のコーディ
ング配列から誘導されたタンパク質に、抗−ペルタシス
毒素抗体による認識を保持させている。

したがって、本発明は、（ａ）Ｓ　１サブユニツトコ一
デイング配列が２６位のアミノ酸位置のトリプトファン
残基（以下、Ｔｒｐ−２６という）の修飾と有し、（ｂ
）該Ｔｒｐ−２６の修飾がボルデテラ・ペルタシス毒素
コーディング配列によりコードされｊ；タンパク質にお
いて、実質的に、不活性なＳｌサブユニツト酵素活性を
もたらすが、該タンパク質が抗−ペルタシス毒素抗体に
より認識される能力を保持している、完全または切形ボ
ルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｔサブユニットアミノ酸コ
ーディング配列を有するボルデテラ・ペルタシス毒素ア
ミノ酸コーディング配列を記載する。

本発明はまた、本発明のボルデテラ・ペルタシス毒素ア
ミノ酸コーディング配列に加えて、本発明のコーディン
グ配列を含む組換えＤＮＡ分子を記載しており、本発明
の組換えＤＮＡ分子は、例えば、調節因子、１つまたは
それ以上の選択マーカーならびに複製および維持機能を
包含する付加的ＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

本発明のコーディング配列の記載において用いられる「
ボルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列」なる語
は、（ａ）Ｓ　１サブユニツトコ一デイング配列がＴｒ
ｐ−２６での修飾を有し、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６の修飾
が、ボルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列によ
りコードされたタンパク質において、実質的に、不活性
なＳｌサブユニット酵素活性をもたらすが、該タンパク
質が抗−ペルタシス毒素抗体により認識される能力を保
持している、完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒
素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配列を有する
完全なボルデテラ・ペルタシス毒素オペロンまたはその
いずれか機能的な切形フラグメントを意味する。本発明
のコーディング配列の記載において用いられる「ボルデ
テラ・ペルタシス毒素コーディング配列」なる語はまた
、（ａ）Ｓｌサブユニットコーディング配列がＴｒｐ−
２６の修飾を有し、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６の修飾が、ボ
ルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列によりコー
ドされたタンパク質において、実質的に、不活性なＳｌ
サブユニット酵素活性をもたらすが、該タンパク質が抗
−ペルタシス毒素抗体により認識される能力を保持して
いる、（ｉ）完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒
素Ｓｌサブユニットコーディング配列を有する完全ボル
デテラ・ペルタジス毒素コーディング配列またはそのい
ずれ・か機能的に切形な７ラグメント、および（■）他
のいずれかのタンパク質コーディング配列を有するいず
れの機能的融合タンパク質コーディング配列をも意味す
る。「機能的」なる語は、ボルデテラ・ペルタシスの診
断検定において有用な抗−ベルタシス毒素抗体により十
分に認識できる、および／または免疫保護有効量のかか
るタンパク質をヒト宿主に投与した場合に、ペルタシス
に対して十分な保護免疫応答を誘発するタンパク質をコ
ード化するいずれのボルデテラ・ペルタシス毒素コーデ
ィング配列をも意味する。

本発明のボルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列
は、ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミ
ノ酸コーディング配列またはその切形部のみからなるボ
ルデテラ・ペルタシス毒素オペロンの切形バージ３ンで
あることが好ましい。

本発明のボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーディ
ング配列の他の好ましい具体例は、完全なボルデテラ・
ペルタシスオペロン、または単独あるいは１または数個
の他のサブユニットと共に、そのいずれのサブユニット
のコーディング配列も包含する。本発明のコーディング
配列のもう一つ別の好ましい具体例は、Ｓｌサブユニツ
トコ一デイング配列の１２９位のアミノ酸位置のグルタ
ミン酸残基の修飾をもまた有するものである。

完全なペルタシス毒素オペロンのヌクレオチドコーディ
ング配列が決定されている。例えば、１９８６年３月２
６日出願のケイスら（Ｋｅｉｔｈ　ｅｔａｌ、）、米国
特許出願番号（Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、）８４３７２７号参照
。さらには、ベルタシス毒素コーディング配列を有する
ＤＮＡは、いずれの公的に入手可能なボルデテラ・ペル
タシス株から単離することもできる。例えば、種々のボ
ルデテラ・ペルタシス株は、商業上の供託機関、例えば
、米国、メリーランド州、ロックヴイル、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｉｃａｎ　
ＴｙｐｅＣｕｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から公
的に入手可能である。かかる単離は、ケイスら、Ｕ、Ｓ
、Ｓ、Ｎ、８４３７２７号、前掲の方法または他のいず
れの常法により実施してもよい。

本発明のＳｌサブユニット部のコーディング配列のＴｒ
ｐ−２６残基の修飾は、従来の技法を利用する種々の方
法にて行なうことができる。

例えば、Ｔｒｐ−２６残基の１つの変形方法は、臭化２
−ヒドロキシ−５−二トロベンジル（ＨＮＢＢ）のよう
なトリプトファン（Ｔｒｐ）修飾化学試薬の使用による
ものである。本発明の１具体例において、ペルタシス毒
素ＳｌサブユニットのＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ（Ｎ
　Ａ　Ｄ　−ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）およびＡ
ＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（Ａ　Ｄ　Ｐ−ｒｉ
ｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性の触媒領域、
例えば、Ｓｌサブユニットの２〜１８７位のアミノ酸残
基を、この触媒領域をコードする遺伝子を発現するイー
・コリー（Ｅ、ｃｃｌｉ）株から精製した。

この精製したポリペプチドをトリプトファン修飾化学試
薬（ＨＮＢＢ）で処理し、Ｔｒｐ−２６残基の修飾を得
た。その後、ＨＮＢＢ処理により得られたポリペプチド
をその８１酵素活性について検定した場合、それはかか
る活性を有さない、すなわち、標準的検定操作により測
定した場合、ＮＡＤ−グリコヒドロラーゼおよびＡＤＰ
−リボシルトランスフェラーゼ活性の両方が破壊されて
いることが測定された。

Ｔｒｐ−２６残基の修飾を行なうのに用いることができ
る他のトリプトファン修飾化学試薬は、限定されるもの
ではないが、Ｎ−ブロモスクシンイミド（例えば、スパ
ント・ティ・エフ＆ウィツトホップ・ビー（Ｓｐａｎｄ
ｅ、Ｔ、Ｆ　、＆Ｗｉｔｈｏｐ、Ｂ、）、１９６７、メ
ッソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎ
ｚｙｍｏｌ、）、上上：５２２参照）、Ｈ，０２、過ギ
酸、スルフェニルハライド（例えば、セオルフオン・イ
ー、７オンタナ・エイ＆ロッキー・アール（Ｓ　ｅｏｌ
ｆｏｎｅ、　Ｅ　、、Ｆｏｎｔａｎａ、Ａ、＆Ｒｏｃｃ
ｋｉ、Ｒ，）、１９６８、バイオケミストリー（Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、７　：　９７１照）　、塩化
２−二トロフェニルスルフエー’−ル、ｍ化２　、４−
　’；ニトロフェニルスル７エ二ルおよび塩化２−アセ
トキシ−５−ニトロベンジルを包含する。

光酸化もまた、ＳｌサブユニットのＴｒｌ）−２６残基
を修飾する方法として用いてもよい（例えば、スパイク
ス・ジェイ・デイ＆ストレイト・アール（Ｓ　ｐｉｋｅ
ｓ、　Ｊ　、Ｄ　、＆　Ｓ　ｔｒａｉｇｔｈ、　Ｒ、）
、１９６７、アニュアル・レビュー・フィジカル・ケミ
ストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓ、Ｃｈｅｍ、）、
１８：４０９参照）。

ＳｌサブユニツトのＴｒｐ−２６残基を修飾するさらに
別の手段は、従来の部位定方向突然変異によるＳｌサブ
ユニットをコード化する遺伝子におけるその残基のコド
ンの欠失または置換を包含する。Ｓｌサブユニツト遺伝
子形における本発明のコーディング配列の典型的な組立
てについての部位定方向突然変異を実施する１つの例が
、実施例５に記載されている。例えば、この配列の発現
が組換えＭ１３ベクターによって形質転換されたイー・
コリーにて産生されうるように、Ｓｌサブユニットコー
ディング配列をＭ１３ベクターにサブクローン化した。

ついで、Ｔｒｐ−２６残基を、部位定方向突然変異によ
り欠失させるか、またはトレオニン（Ｔｈｒ）に変えた
。本発明の他のベクター組立ては、Ｔｒｐ−２６部位に
てかかる部位定方向突然変異がなされるように、当業者
により通常通りにデザインされてもよい。

本発明のコーディング配列をクリエートし、Ｓｌサブユ
ニットコーディング配列の２６位でのトリプトファン残
基を修飾する別法は、従来の遺伝子工学技法によるＴｒ
ｐ−２６残基の欠失およびトレオニン（Ｔｈｒ）での置
換、まＩ；は他の適当なアミノ酸残基によるその部位で
の置換を包含する。他の適当な置換アミノ酸は、限定す
るものではないが、グルタミン（Ｇ　ｌ　ｎ）　、チロ
シン（Ｔｙｒ）およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を包
含する。Ｔｒｐ−２６のＧｌｎへの変形は、２次構造特
性の点から見ると、より保存力のある置換である。Ｔｒ
ｐのＰｈｅへの変形は芳香族環を維持するが、Ｔｒｐの
Ｔｙｒへの変形は中間の極性特徴を維持する。修飾分子
はできる限り天然分子に似ていなければならなず、した
がって、非常に類似する２次構造、疎水特徴および芳香
族アミノ酸比率であることが望ましい。置換が、実質的
に不活性なｓｔ酵素活性および抗−ボルデテラ・ベルタ
ジス毒素抗体認識の保持力を有するタンパク質をコード
化するコーディング配列のクリエーションをもたらすと
いう条件下、他のアミノ酸置換を考慮することができる
。

本発明のアミノ酸コーディング配列はまた、（ａ）通常
のＤＮＡ合成技法を用い、合成的に、または（ｂ）通常
の化学変形技法を用いる他の化学変法により生成しても
よい。

加えて、通常の遺伝子工学技法を用いることにより、本
発明のコーディング配列は、Ｔｒｐ−２６修飾を有する
ペルタシス毒素オペロンのいずれの切形バージョン形、
またはＴ　ｒ　ｐ−２６修飾を含むＳｌサブユニツトコ
一デイング配列のアミノ酸２〜１８７についてのコドン
のみを有するＳｌサブユニットコーディング配列の切形
バージョン形であってもよく、あるいはまた、本発明の
コーディング配列はＴｒｐ−２６の修飾を含むＳｌサブ
ユニットコーディング配列のいずれの切形部を有してい
てもよい。

さらにまた、本発明のコーディング配列は、ダブル突然
変異体（ｄｏｕｂｌｅ　ｍｕｔａｎｔ）形、すなわち、
コーディング配列によりコードされたタンパク質が抗−
ペルタシス毒素抗体により認識される能力を保持してい
る、ＳｌサブユニットにおけるＴｒｐ−２６の修飾なら
びに他のアミノ酸残基の修飾の両方を有するコーディン
グ配列形であってもよい。かかるコーディング配列によ
りコードされるタンパク質はまた、Ｓｌサブユニット酵
素活性の減少を示すことが好ましい。かかる用いてもよ
い追加の修飾の例は、限定されるのではなく、Ｓｌサブ
ユニットコーディング配列の１２９位のアミノ酸位置の
グルタミン酸残基（Ｇｌｕ−１２９）の修飾；Ｓｌサブ
ユニットコーディング配列の３５位のアミノ酸位置のヒ
スデシン残基（Ｈｉｓ−３５）の修飾；Ｓｌサブユニツ
トコ一デイング配列の９位のアミノ酸位置のアルギニン
残基（Ａｒｇ−９）の修飾およびＳｌサブユニットコー
ディング配列の４０位のアミノ酸位置のセリン残基（Ｓ
ｅｒ−４０）の修飾を包含する。グルタミン酸残基の修
飾は、前掲に示したような通常の技法により実施しても
よい。また、下記の実施例１３、およびビッザら（Ｐ　
１ｚｚａ　ｅｔ　ａｌ、）　、プロンーデインダメ・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス、Ｕ
ＳＡ：８５．７５２１〜７５２５　（１９８８）参照。

さらには、本発明のコーディング配列は、限定するもの
ではないが、ベルタシス毒素誘導コーディング配列およ
び／または非ペルタシス毒素誘導コーディング配列のよ
うな少なくとも１つの他のコーディング配列に融合した
ボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーディング配列
を有する融合タンパク質コーディング配列形であっても
よい。例えば、かかる融合タンパク質は、Ｓ２サブユニ
ツトコ一デイング配列および／またはＳ３サブユニツト
コ一デイング配列および／またはＳ４サブユニツトコ一
デイング配列および／またはＳ５サブユニツトコ一デイ
ング配列のすべてまたは一部に融合したＴｒｐ−２６修
飾を有するＳｌサブユニツトコ一デイング配列のすべて
または部分を有していてもよい。かかる融合タンパク質
はまた、ボルデテラ・ペルタシスの他の抗原または、限
定するものではないが、ジフテリア（Ｄ　１ｐｈｔｈｅ
ｒｉａ）抗原および／まｔ；はテタヌス（Ｔ　ｅｔａｎ
ｕｓ）抗原および／またはへモフィルス・インフルエン
ザ（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　１ｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
）抗原のような他の抗原に融合したＴｒｐ−２６修飾を
含むＳｌサブユニ７トコーデイング配列のすべてまたは
部分を有していてもよい。

本発明の融合タンパク質のコーディング配列の例は、以
下の配列を有する実施例にて記載されているものである
： 配列： 融合タンパク質屋における本発明の他のコーディング配
列は、通常、当業者によりデザインされ、得ることがで
きる。

さらには、前記のＴｒｐ−２６修１１！ＩｊＳｌ切形７
ラグメントを、いずれか他の５２〜ｓ５サブユニツトコ
一デイング配列単独のような野性型ベルタシス毒素オペ
ロンの他の配列または１またはそれ以上の５２ないしＳ
５サブユニツトコ一デイング配列と連合させることがで
きる。また、完全ボルデテラ・ペルタシス毒素コーディ
ング配列は、（ａ）天然に存在するＳｌシストロンの代
わりに前記のＴｒｐ−２６修飾Ｓｌ切形フラグメント、
または（ｂ）Ｔｒｐ２６の修飾のみを有する完全Ｓｌサ
ブユニットシストロンまたは他の成分と連合したかかる
Ｔｒｐ−２６の修飾を有する他の７ラグメントを有して
生じてもよい。

本発明のさらなる態様は、本発明のプラスミドで形質転
換された宿主細胞である。ががる宿主細胞は、適当な培
地中にて増殖し、本発明のコーディング配列を発現する
ことができる。かかる宿主細胞は、本発明の方法、すな
わち、所望の宿主細胞を本発明のプラスミドで形質転換
することにより調製される。かかる形質転換は、通常の
形質転換技法を用いることにより行なうことができる。

最も好ましい宿主細胞として、種イー・コリー、属ボル
デテラに属する細胞が挙げられる。適当な他の宿主細胞
は、限定するものではないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞
、他の細菌細胞および酵母細胞を包含する。したがって
、本発明はいずれの特定の宿主細胞に限定されるもので
はない。

本発明はまた、本発明の形質転換宿主を適当な培地中に
て培養し、かかるタンパク質を単離することからなる、
本発明のコーディング配列によりコードされるタンパク
質を生成する方法に関する。

「適当な培地」なる語は、形質転換宿主を増殖させ、ま
たかかる宿主に回収可能な量の本発明のコーディング配
列を発現させる培地を意味する。使用に適する培地が用
いる宿主細胞に依存することは、当業者にとっては明ら
かである。生成したタンパク質の単離は、宿主の培養溶
解産物から、または適すれば、宿主の培地から直接的に
行ない、通常のタンパク質単離技法により実施する。

したがって、前記の記載を考慮して、本発明のもう一つ
の具体例は、（ｉ）天然のボルデテラ・ペルタシスＤＮ
Ａからの単離または合成もしくは組換えＤＮＡ技法によ
り得られる、２６位のアミノ酸位置のトリプトファン残
基に未だ修飾のない完全または切形ボルデテラ・ペルタ
シス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配列を
含むボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーディング
配列を、部位定方向突然変異、トリプトファンを修飾す
る化学試薬または光酸化で処理し、２６位のアミノ酸位
置のトリプトファン残基の修飾または欠失を得、所望の
宿主細胞を該得られたコーディング配列を有するプラス
ミドで形質転換し、かかる宿主を適当な培地にて培養し
、生成したタンパク質を単離するか、（■）天然のボル
デテラ・ペルタシスＤＮＡからの単離または合成もしく
は組換えＤＮＡ技法により得られる、完全または切形ボ
ルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コ
ーディング配列を含むボルデテラ・ペルタシス毒素アミ
ノ酸コーディング配列の３１サブユニツトの２６位のト
リプトファン残基を、別のアミノ酸で置換または欠失し
、所望の宿主細胞を該得もれたコーディング配列を有す
るプラスミドで形質転換し、かかる宿主を適当な培地に
て培養し、生成したタンパク質を単離するか、または（
ｉｉ）かかるコーディング配列を合成方法により得、所
望の宿主細胞を該得られたコーディング配列を有するプ
ラスミドで形質転換し、かかる宿主を適当な培地にて培
養し、生成したタンパク質を単離することを特徴とする
（ａ）Ｓｔサブユニットコーディング配列が２６位のア
ミノ酸位置のトリプトファン残基（以下、「Ｔｒｐ−２
６４という）の修飾を有し、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６の修
飾が、ボ・レゾテラ・ペルタシス毒素オペロン・アミノ
酸コーディング配列によりコードされたタンパク質にお
いて、実質的に、不活性なＳｌ酵素活性をもたらすが、
該タンパク質が抗−ペルタシス毒素抗体により認識され
る能力を保持している、完全または切形ボルデテラ・ペ
ルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配
列を有するボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーデ
ィング配列によりコードされるタンパク質の製造法であ
る。

本発明はまた、かかる方法により製造されたタンパク質
、免疫保護有効および非毒性量の該タンパク質からなる
ワクチンであって、百日咳に対する保護を刺激するワク
チン、および該ワクチンを投与することからなるその後
の百日咳に対してヒトを接種する方法に関する。

本発明はまた、ペルタシスに対して免疫性を誘発するこ
とのできるワクチンを包含する。かかるワクチンは、該
タンパク質の製造方法にかかわらず、免疫保護有効量お
よび非毒性量の本発明のタンパク質からなる。該ワクチ
ンは、本発明のタンパク質５〜２５μＧを含有すること
が好ましいが、これらの量に限定されるものではない。

ペルタシス毒素と共同して投与することが望ましいこと
が知られている他の抗原もまた、該ワクチンに含めても
よい。かかる付加成分は当業者に公知である。好ましい
付加成分は、テタヌス・トキソイド（ｔｏｘｏｉｄ）お
よび／まｌ；はジフテリア・トキソイドならびに糸状赤
血球凝集素（ＦＨＡ）および／またはボルデテラ・ペル
タシスのいずれか他の保護抗原を包含する。

したがって、該ワクチンは、本発明のもう一つ別の態様
、すなわち、本発明のワクチンをヒトに投与することか
らなる、ペルタシスに対してヒトを接種する方法を提供
する。

本発明のワクチンの投与経路は、本発明の免疫保護有効
量のタンパク質を宿主に供給するに適するいずれの経路
であってもよい。しかしながら、ワクチンは、筋肉内ま
たは深部皮下経路を介して非経口投与することが好まし
い。所望により、経口投与または他の非経口経路、すな
わち、皮肉、鼻腔内または静脈内を介するような他の投
与方法もまた用いてもよい。

本発明のワクチンは、非毒性および滅菌医薬上許容され
る担体中、免疫保護有効、非毒性量の本発明のタンパク
質を有する医薬組成物として調製することができる。ワ
クチンを非経口投与する場合、所望により、免疫応答を
誘発し、または強化するのに、非特異的刺激物として使
用する従来のアジュバントと一緒に混合し、または吸着
させることができる。かかるアジュバントは、とりわけ
、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ムラミル
・ジペプチド（ｍｕｒａｍｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）
およびクライルＡ　（Ｑｕｉｌ　Ａ）のようなサポニン
を包含する。本発明のワクチンのさらに典型的な別の製
法として、本発明のタンパク質は、リポソームのような
微粒子内にカプセル化することができる。本発明のワク
チンのさらに別の典型的製法において、本発明のタンパ
ク質は、免疫刺激巨大分子、または破傷風トキソイドと
共に投与することができる。

また、本発明のタンパク質を有し、好ましくは、生理的
ｐＨにて緩衝させた水性懸濁液または水溶液を、経口食
物摂取用にデザインしてもよい。

医薬調製物である場合、本発明のワクチンは、単位投与
形にて存することが好ましい。適当な治療上有効な用量
は、当業者により容易に決定することができる。本発明
のワクチンにて含まれるタンパク質の有効量は、従来の
ボルデテラ・ペルタシス無細胞または成分ワクチンにお
ける抗原の有効量の範囲内、すなわち、タンパク質５〜
２５μｇであればよい。この用量を、所望により、種々
の量の糸状赤血球凝集素（ＦＨＡＸ約１０μｇ〜２５μ
ｇ）および／または凝集原または他の抗原と共に供給し
てもよい。しかしながら、個々の患者についての特異的
用量レベルは、患者の年齢、総合的健康状態、性別およ
び日常の飲食物；投与期間；投与経路；いずれか他の薬
剤を投与したことに付随する共働作用的効果；および要
求される保護の程度を包含する種々の因子に依存してい
ることが解るであろう。もちろん、該投与は、要すれば
、適当な間隔を置いて繰り返すことができる。

好ましくは、３回の投与を、各投与間に３〜１２ケ月の
間隔を置いて、後の期間における所望のブースター投与
量と共に投与する。

本発明のさらなる態様は、本発明の組換えＤＮＡ分子を
有する、染色体ペルタシス毒素遺伝子が不活性化される
ボルデテラ・ペルタシス株である。

本発明のもう一つの具体例は、免疫保護有効および非毒
性量の本発明の株を有する、百日咳に対する保護を刺激
する全細胞ワクチンである。かかるワクチンは、該株単
独、または他の抗原および／またはアジュバントと一緒
に構成されていてもよい。本発明のさらにもう一つの態
様は、該ワクチアンをヒトに投与することからなる、そ
の後の百日咳に対してヒトに接種する方法に関する。染
色体ペルタシス遺伝子を有するいずれのボルデテラ・ペ
ルタシス株も、本発明の株を得るための出発物質として
用いてもよい。多数の適当なボルデテラ・ペルタシス株
は、ＵＳＡ、メリーランド州、ロックヴイル、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのような種々の
保管機関から公的に入手可能である。数珠の調製は、従
来の技法により行なうことができる。例えば、本発明の
株を調製するには、染色体ベルタシス毒素遺伝子を、欠
失、点または挿入突然変異のような従来の技法により不
活性化し、本発明の組換えＤＮＡ分子を従来法によりか
かる株に形質転換させる。染色体毒素遺伝子を点または
挿入突然変異により不活性化させるよりもむしろ、欠失
させるボルデテラ・ペルタシス株を用いることが好まし
い。点または挿入突然変異を介する遺伝子の不活性化は
、自発的に複製するプラスミドにおいて、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏにて突然変異したベルタジス毒素のコード化ＤＮＡと
の組換え能力を有するＤＮＡ配列を排除していない。他
方、ペルタシス毒素遺伝子欠失突然変異体においては、
かかる組み換えが起こりえない。ついで、得られたボル
デテラ・ペルタシス株を、本発明の組換えＤＮＡ分子で
形質転換し、本発明の株を得る。かかる組換えＤＮＡ分
子は本発明のプラスミドにより構成されていることが好
ましい。かかる組換えＤＮＡ分子を宿主細胞の染色体中
に組み込ませるか、またはプラスミドの形態においては
、エピゾームを維持させてもよい。かかる組換えＤＮＡ
分子を導入した後、得られたボルデテラ・ペルタシス株
を用い、本発明の突然変異ペルタシス毒素タンパク質を
製造してもよい。また、かかる組換えＤＮＡ分子を導入
した後、数珠を用い、ペルタシスに対する全細胞ワクチ
ンを得てもよい。

かかる全細胞ワクチンの製造は、従来法により行なう。

したがって、該ワクチンの提供は、本発明のもう一つの
態様、すなわち、本発明のワクチンをヒトに投与するこ
とからなるペルタシスに対してヒトを免疫化する方法を
付与する。

本発明のワクチンの投与方法は、免疫保護有効量の本発
明の株を宿主に供給するいずれの適当な経路とすること
もできる。しかしながら、該ワクチンは、筋肉内または
深部皮下経路を介して非経口投与することが好ましい。

所望により、経口投与または他の非経口経路、すなわち
、皮肉、鼻腔内または静脈内の経路を介する他の投与方
法もまた用いることができる。

かかるワクチンの適当な免疫保護有効および非毒性用量
は、当業者により容易に決定することができ、すなわち
、本発明のワクチンに含まれる本発明の株の適当な免疫
保護有効かつ非毒性量は、通常のボルデテラ・ペルタシ
ス全細胞ワクチンにおける抗原の有効量の範囲内とする
ことができる。

この用量は、所望により、種々の量の糸状赤血球凝集素
（ＦＨＡＸ約１０μｇ〜２５μｇ）および／または凝集
原または他の抗原と共に供給してもよい。しかしながら
、個々の患者についての特異的用量レベルは、患者の年
齢、総合的健康状態、性別および日常の飲食物；投与期
間；投与経路；いずれか他の薬剤を投与したことに付随
する共働作用的効果；および要求される保護の程度を包
含する種々の因子に依存していることが解るであろう。

もちろん、該投与は、要すれば、適当な間隔を置いて繰
り返すことができる。好ましくは、３回の投与を、各投
与間に３〜１２ケ月の間隔を置いて、後の期間における
所望のブースター投与量と共に投与することである。

衷攬町 以下の実施例は、本発明のコーディング配列、ベクター
、形質転換された宿主およびタンパク質の製造；該タン
パク質の抗原活性；および本発明のワクチンの製造を示
している。これらの実施例は、実質的に例示であり、本
発明の範囲を限定する意図ではない。

以下の実質的において、温度はすべて、摂氏（Ｃｅｌｓ
ｉｕｓ）度である。ＤＮＡ操作において用いた酵素は、
ボエリンガ＝（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　（？ンハイ
ム、西ドイツ）およびアメルシャム（Ａ、　ｍｅｒｓｈ
ａｍ）（アメルシャム、イングランド）から入手し、供
給人の指示に従って用いた。

以下の実施例において、次の省略形を用いる：ＹＴ培地
ニドリプトン（Ｔ　ｒｙｐｔｏｎｅ）　８グラム／リツ
ター（ｇ／ｆｆ）　、ＮａＣｌ２５ｇ／Ｑ、酵母抽出物
５ｇ／Ｉ２、 トリス−ＨＣＱの１Ｍストック溶液：トリズマ塩基（Ｔ
ｒｉｚｍａ　ｂａｓｅ）　ｌ　２１−１　ｇ／　Ｑ　＋
ｐＨが所望の値（例えば、７．５）に達するまでのＨＣ
Ｑ。

ＬＢ培地（ｐＨ７，５）：　トリプトンｌｏｇ／Ｑ。

酵母抽出物５ｇ／（２，ＮａＣ（２１０ｇ／Ｉ２実施例
１ 発現ベクターｐＲＩＴ２０００１コード化Ｓｌサブユニ
ット−関連タンパク質の組立てロビト・シーら（Ｌｏｃ
ｈｔ、Ｃ、ｅｔ　ａｌ、）がヌクレイツク・アシッズ・
レサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅａ、）、１
４：３２５１　（１９８６）において記載しているドブ
ラスミドｐＰＴＸ４２を、５ａｕ３ａで７ラグメントに
消化した。該フラグメントを、マニアナイスら（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、モレキュラー・クロー
ニング、エイ・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ）　、コールド舎スプリングφハーバ
−（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉｎｚ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ＮＹ
％　　（１９８２）の方法に従い、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離しｔ；。５６０塩
基対（ｂ　ｐ）フラグメントを精製し、予めＢａｍＨＩ
で消化した複製型のＭ１３ｍｐ１８に挿入した。Ｍ１３
ｍｐ１８は、メッシ／グ（Ｍｅｓｓｉｎｇ）のジェイ・
メッソズ・エンサイモール（Ｊ　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ
　ｎｚｙｍｏｌ、）、１０１．２０〜７８　（１９８３
）に記載されており、メリーランド州、ベテスダ、ベテ
スダ・リサーチ・ラボラドリース（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ
　ＲｅｓｅａｒｃｈＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から
入手した。英国、アメルシャム、アメルシャム・インタ
ーナショナルＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ｒ　ｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）から入手したイー・
コリー（Ｅ、Ｃｏ１１）のＴＧＩ細胞を、マニアナイス
ら、前掲の技法に従い、複製型の組換えファージで形質
転換した。形質転換を行ない、−夜インキユベーション
した後、該ファージを、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、）　、プロシーデインダメ・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７４．５４６
３〜５４６７　（１９７７）の方法に従い、ＤＮＡ塩基
配列決定により、５６０ｂｐインサートの存在について
分析した。

５６０ｂｐインサートを有するｌファージを精製し、ｐ
ＲＩＴ２０００１と命名した。ｐＲＩＴ２０００１によ
りコードされｆ−８１サブユニット−関連タンパク質が
、ロビトらのインフエクション・アントイムニティ−（
Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　Ｉ　ｍｍｕｎ、）、５５：２５４６
　（１９８７）に記載されているｐＴＸＳＩＩによりコ
ードされたＳｌサブユニット−関連タンパク質１．ｒＳ
ｌｄと同じであることが測定された。この構成物、すな
わち、ｐＲＩＴ２０００１おいて、６アミノー末端アミ
ノ酸は、β−ガラクトシダーゼからの最初の６アミノ酸
である。つづい゛〔、Ｍ１３ｍｐ１８クローニングベク
ターにおけるポリリンカー配列によりコードされる５ア
ミノ酸であり、その後に、ペルタシス毒素Ｓｌサブユニ
ットコーディング配列の２〜１８７の残基が存在する。

最終的には、Ｌｅｕ残基がポリリンカーによりコードさ
れ、停止コドンが供給される。これにより、Ｓｌサブユ
ニット−関連タンパク質についての以下の配列が得られ
る：ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＧＧＣ ＣＧ ＧＴＡ　ＣＣＣ ＧＧ 実施例２ ｐＲＩＴ２０００１を用いるイー・コリーにおける５１
関連タンパク質の合成 イー・コリーＴＧＩ細胞の一夜培養物１．５ｍ１２を、
ＹＴ培地１００−にて接種し、その後、実施例１にて記
載したように調製したｐＲＩＴ２０００１またはＭ　ｌ
　３　ｍ　ｐ　ｌ　８フアージストツク１０μαで感染
させた。該感染細胞を、光学密度（○Ｄ）が０．３に達
するまで、一定振盪下、３７°Ｃにて増殖させた。つい
で、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を、最終濃度１ｍＭまで該細胞に加え、増殖を４
〜５時間続けた。ついで、該細胞を遠心分離により採集
し、細胞溶解緩衝液３−（トリス−ＨＣ（２（ｐＨ７，
５）２５ｍＭ。

ＡＴ ＮａＣＱ　２５　ｍＭ）に再懸濁させ、フレンチ・圧力
細胞（Ｆ　ｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ）
を介する２パツセージ（ｐａｓｓａｇｅ）により溶解さ
せた。該溶解産物を１２０００ＸＧにて４０分間遠心分
離することにより分別した。

ついで、上澄フラクションを、トウビンら（Ｔｏｖｂｉ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、プロシーデインダメ・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス、ＵＳＡ％
ユニ４３５０〜４３５４（１９７９）の方法によるウェ
スタンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）によりＳ
ｌ関連タンパク質の存在について分析し、モンタナ州、
ハミルトン、ロッキー・マウンテン研究所、ＮＩＡＩＤ
、　　ドクター・ジエイ・エム・ケイス（Ｄｒ、　Ｊ　
、Ｍ、Ｋａｉｔｈ）の病理生物学実験室がら提供される
抗−５ｌモノクロ一ナル抗体８２Ｆ８で検出した［マー
キット・ケイ・ニスら（Ｍａｒｃｈｉｔｔｏ、に、Ｓ　
、ｅｔ　ａｌ、）　、インフエクシＢ　ンａアンド・イ
ムニティー、５５　：１３０９　（１９８７）参照］。

Ｍ１３ｍｐ１８で感染した細胞からの上澄クラクション
は、モノクローナル抗体Ｂ２Ｆ８により、特に認識され
るタンパク質を含有しなかった。しかしながら、ｐＲＩ
Ｔ２０００１で感染した細胞からの上澄フラクションは
、ウェスタンプロットにおけるモノクローナル抗体８２
Ｆ８と反応する約２２０００ダルトンのタンパク質を含
有した。このタンパク質は、ｐＴＸｓｌｌによりコード
されるＳｌサブユニット−関連タンパク質、ｒｓｌｄと
同様のウェスタンプロットにおけるモノクローナル抗体
８２Ｆ８との行動を示した［ロビトら、インフエクショ
ン・アンド・イムニティー（１９８７）、前掲参照］。

実施例３ ｐＲＩＴ２０００ｉにより感染されたイー・コリーにお
いて合成されたＳｌサブユニット関連タンパク質の酵素
活性 実施例２において記載された上澄７ラクジコンを、Ｓｌ
ｌサブユニット連タンパク質特異酵素活性の存在につい
て検定した。これらの活性レベルを、ｐＴＸｓｌｌを有
するイー・コリー細胞から部分的に精製されたｒｓｌｄ
の活性と比較した。

ロヒトら、インフエクション・アンド・イムニティ−（
１９８７）、前掲に記載されているニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（Ｎ　Ａ　Ｄ）−グリコヒドロ
ラーゼ検定において、かかる部分的に精製されたｒｓｌ
ｄにより触媒化されたＮＡＤからのニコチンアミドの放
出を測定した。かかる部分精製ｒｓ１ｄｌμｇは、ロビ
トら、インフェクション・アンド・イムニティー（１９
８７）、前掲において記載されている検定条件下、３０
°Ｃにて３時間反応させた場合、１２００ピコモルのニ
コチンアミドの放出を触媒化した。Ｍｌ、３ｍｐ１８で
感染したＴＧＩ細胞の上澄フラクションは、有意なＮＡ
Ｄ−グリコヒドロラーゼ活性を有しておらず、測定され
たニコチンアミド放出値はバックグラウンドレベルと差
異がなかった。しかしながら、ｐＲＩＴ２０００１で感
染したイー・コリーＴＧＩ細胞の上澄フラクション２５
μＱは、同一条件下、３時間のインキュベーション後、
ＮＡＤから３００ピコモルのニコチンアミドの放出を触
媒化した。ｐＲＩＴ２０００１感染イー・コリー細胞の
上澄みによる酵素活性の実質的減少は、天然（ｃｒｕｄ
ｅ）イー・コリー細胞抽出物における阻害因子の存在に
よるものである（シー・ロビト、公にされなかった観察
）。

ＣＨＯ細胞膜における４１０００ダルトン・シグナル形
質導入ＧＴＰ結合タンパク質ＧｉのＳｔ−特異的アデノ
シン・ジホスフェート（ＡＤＰ）−リポシレーションを
触媒化する部分精製ｒｓｌｄならびにｐＲＩＴ２０００
１感染イー・コリー細胞およびＭ１３ｍｐ１８感染ＴＧ
Ｉ細胞の上澄フラクションの能力をまた調査した。この
検定もまた、ロビトら、インフェクシコン・アンド・イ
ムニティ−（１９８７）、前掲にて記載されている。

部分的に精製されたｒｓｌｄまたはペルタシス毒素を、
ロヒトらにおいて記載されている条件下、放射性標識Ｎ
ＡＤおよびチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨ
Ｏ）細胞膜の存在下にてインキュベーションし、反応生
成物をナトリウム・ドデシル・サル７エートーＰＡＧＥ
　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および放射能写真術により分析
した場合、４１０００ダルトンＧｉタンパク質の特異的
標識化が検出された。ｒｓｌｄまたはペルタシス毒素を
、細胞溶解緩衝液（２５ｍＭ）リス−ＨｃＱ（ｐＨ７，
５）、２５ｍＭ　ＮａＣＱ）またはＭ１３ｍｐ１８で感
染したイー・コリー細胞の上澄フラクションで置き換え
た場合、Ｇｉタンパク質の標識化は認められなかった。

対比的に、ｐＲＩＴ２０００１で感染した細胞の上澄フ
ラクション（切形Ｓｔサブユニットコーディング配列に
よりコードされたタンパク質を有する）は、４１０００
ダルトンＧｉタンパク質における放射性標識ＡＤＰ−リ
ボースの組み入れの触媒化を可能にした。

実施例４ ｐＲＩＴ２０００１によりコードされるＳｌサブユニッ
ト関連タンパク質におけるＴｒｐ−２６残基の化学修飾 ｐＲＩＴ２０００１によりコードされ、実施例２に従っ
て調製される酵素的に活性なＳｌ関連タンパク質は、成
熟Ｓｌタンパク質の２６位、すなわち、４１位のシステ
ィン残基から１５残基上流に位置する単一Ｔｒｐ−２６
残基のみを有する。

実施例２に従って調製したＳｌサブユニット関連タンパ
ク質を部分的に精製し、１０００倍モル過剰の乾燥アセ
トンに溶かした臭化２−ヒドロキシ−５−二トロベンジ
ル（ＨＮＢＢ）と共にインキュベーションした。ＨＮＢ
Ｂは誘導法によりトリプトファン残基を修飾する。該反
応は、２Ｍ尿素を含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４。

０）中、２５℃にて２時間行なった。ついで、該溶液を
４℃にて１５時間、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４
，０）に対して透析させた。同時に、実施例２に従って
調製したＳｌサブユニット関連タンパク質を、反応混合
物中、ＨＮＢＢを除去する以外、同様の方法で処理した
。

ついで、実施例２に従って調製したＳｌサブユニット関
連タンパク質ならびに前記にて調製した精製ＨＮＢＢ処
理およびＨＮＢＢ未処理Ｓｌサブユニット関連タンパク
質（以下、各々、「未処理Ｓｌサブユニット関連タンパ
ク質Ｊ　、ｒＨＮＢＢ処理Ｓｌサブユニット関連タンパ
ク質」およびｒＨＮＢＢ未処理Ｓｌサブユニット関連タ
ンパク質」という）を、ロビトら、インフェクション・
アンド・イムニティー（１９８７）、前掲において記載
されている検定条件を用い、ＮＡＤ−糖加水分解および
ＣＨＯ細胞膜におけるＧｉへのＡＤＰ−リボシルトラン
スファーを触媒化する能力について分析した。未処理Ｓ
ｌサブユニット関連タンパク質ならびにＨＮＢＢ未処理
Ｓｌサブユニット関連タンパク質は、濃度−関連型 （ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｆａ
ｓｈｉｏｎ）にてＮＡＤグリコヒドロラーゼ活性を発現
した。ＨＮ　Ｂ　Ｂ処理Ｓｌサブユニット関連タンパク
質を検定した場合、下限に近いＮＡＤ−グリコヒドロラ
ーゼ活性だけを検出することができ、より小さな濃度、
すなわち、ｌｌ１ｇのＨＮＢＢ処理Ｓｌサブユニット関
連タンパク質を検定した場合、活性は約５％に減少した
。０．５μｇおよび１．０ｇｇの未処理、ＨＮＢＢ処理
およびＨＮＢＢ未処理ｓｔサブユニット関連タンパク質
を、ＣＨＯ細胞膜におけるＧ１タンパク質のそのＡＤＰ
−リボシルトランスフエラーゼ活性について検定した場
合、未処理Ｓｌサブユニツト関連タンパク質およびＨＮ
ＢＢ未処理Ｓｌサブユニット関連タンパク質だけが、両
方の濃度にてＧｉ−特異的ＡＤＰ−リポシレージョン（
ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）活性を発現することが見い
だされた。Ｇｉ：ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ
活性は、ＨＮＢＢ処理Ｓｌサブユニット関連タンパク質
のいずれの濃度においても検出できなかっｔこ。

実施例５ 部位定方向突然変異を用いる本発明のコーディング配列
の組立て 実施例１に従って調製した一本鎖ＤＮＡのファージｐＲ
ＩＴ２０００１を精製し、英国、アメルシャム、アメル
シャム・インターナショナル・ＰＬＯにより市販されて
いる「オリゴヌクレオチド−・定方向ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
突然変異系」、フードＲＰＮ２３２２を、供給者が推奨
している条件下にて用い、オリゴヌクレオチド−ドライ
ブ（ｄｒｉｖｅｎ）部位一定方向突然変異に付託した。

特に、ｐＲＴＴ２０００１のｒｓｌｄ遺伝子の２６番目
のアミノ酸位置のトリプトファン残基をコードするコド
ンＴＧＧを欠失するのに用いられるオリゴヌクレオチド
は、配列： ５　’　ＣＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＡＴ　
３　’を有した。特に、ｐＲＩＴ２０００１のＳｔ遺伝
子の２６番目のアミノ酸位置のトリプトファン残基をコ
ードするコドンＴＧＧを変えるのに用いられるオリゴヌ
クレオチドは、配列： ５　’　ＣＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴにＡ
ＡＴ　３″を有した。

突然変異の候補者を、スガス（Ｓ　ｕｇｇｓ）　、精製
した遺伝子を用いる発達生物学、デイ・ブラウン（Ｄ　
、　Ｂ　ｒａｉｎ）編、Ｎ、Ｙ、、アカデミツク出版に
おけるウォーレンス技法により、突然変異誘発性オリゴ
ヌクレオチドと共に分化ハイブリダイゼーションに付す
ことによってスクリーンした。ついで、該突然変異をサ
ンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ａｔ　ａｌ、）、１９７７、
前掲の技法によるＤＮＡ塩基配列決定法により照合した
。ｐＲＩＴ２０００２と称され、Ｔｒｐ−２６欠失突然
変異を有する１つの候補者をクローンし、さらに）記の
実施例６に記載されているＴｒｐ−２６修飾Ｓｌ遺伝子
を発現するその能力について分析した。ｐＲＩＴ２００
０８と称され、Ｔｒｐ−２６からＴｈｒへの置換突然変
異を有する１つの候補者をクローンし、下記の実施例６
に記載されているＴｒｐ−２６修＃ｓｔ関連遺伝子を発
現する能力について分析した。

実施例６ イー−フリーにおけるＴｒｐ−２６修飾ｒｓｌｄ遺伝子
の発現およびその生成物の酵素活性の分析 イー・コリーＴＧＩ細胞を、実施例５の記載に従い調製
したｐＲＩＴ２０００２またはｐＲＩＴ２０００８で感
染させ、Ｔｒｐ−２６コドンＴＧＧの欠失またはトレオ
ニンのコドンＡＣＣにヨルその置換を有するＴｒｐ−２
６修飾Ｓｌサブユニツト関連遺伝子の発現を、実施例２
に記載のＩＰＴＧで誘発した。ついで、細胞を採集し、
溶解させ、細胞溶解産物を遠心分離により分離し、上澄
フラクションをウェスタン・プロットにより突然変異し
たｒｓｌｄの存在について分析し、抗−３１モノクロ一
ナル抗体８２Ｆ８との反応および前記のすべての方法を
実施例２の記載に従って実施した。

その結果を、実施例２にて得られた結果と比較した。Ｍ
１３ｍｐ１８で感染した細胞の上澄フラクションがかか
るタンパク質を有さないのに対して、ｐＲＩＴ２０００
１．ｐＲＩＴ２０００２またはｐＲＩｒ２０００８で感
染した細胞の上澄フラクションは、ウェスタン・プロッ
トにてモノクローナル抗体８２Ｆ８と反応するタンパク
質を有した。さらには、ｐＲＩＴ２０００１．ｐＲＩＴ
２０００２およびｐＲＴＴ２０００８におけるＢ２Ｆ８
反応性タンパク質は、実施例３において言及している部
分的に精製されたｒｓｌｄと同じ見掛けの分子量を示し
た。ウェスタン・プロットの視覚観察に基づき、ｐＲＩ
Ｔ２０００１．ｐＲＩＴ２０００２およびｐＲＩＴ２０
００８は、略同量のその各自のＳｌサブユニット関連タ
ンパク質を発現した。

ｐＲＩＴ２０００１．ｐＲＩＴ２０００２およびｐＲＩ
Ｔ２０００８の上澄フラクションを、実施例３において
記載した検定方法におけるＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ
およびＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性のレベ
ルについて比較した。

ｐＲＩＴ２０００１の上澄フラクション２５μＱハ、再
度、３時間の反応にて３００ピコモルのニコチンアミド
の放出を触媒化したのに対して、ｐＲＩＴ２０００２お
よびｐＲＩＴ２０００８の上澄フラクションは、Ｍ１３
ｍｐ１８で感染した細胞からの上澄フラクションと同様
のＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ活性、すなわち、ＮＡＤ
−グリコヒドロラーゼ活性がないことを示した。同様に
、ｐＲＩＴ２０００１の上澄フラクションはＧｉタンパ
ク質のＡＤＰ−リボシレージョンを触媒化する能力を有
するが、かかる活性はｐ　ＲＩ　Ｔ　２０００２上澄フ
ラクシチンまたはｐＲＩＴ２０００８上澄フラクション
で検出されなかった。したがって、ｐＲＩＴ２０００２
およびｐＲＩＴ２０００８によりコードされるｓｌサブ
ユニット関連タンパク質は、実質的に、不活性化された
Ｓｌサブユニツトタンパク質酵素活性を有した。

実施例７ ｐＲＩＴ２０００２およびｐＲＩＴ２０００８によりコ
ードされるｓｔサブユニット関連タンパク質の抗原構造 実施例６において調製したｐＲＩＴ２０００２およびｐ
ＲＩＴ２０００８の上澄フラクションを、ウェスタン・
プロットにより、モノクローナルならびにポリクローナ
ル抗−ペルタシス毒素抗面清と反応する能力について分
析した。イー・シモン（Ｅ　、　Ｓ　ｉｍｏｅｎ）　、
スミスクライン−Ｒ，１，Ｔ。

（ＳｍｉＬｈｋｌｉｎｅ−Ｒ，Ｉ　、Ｔ　、）、ｓ、ａ
、、リキセンサート（Ｒ１ｘｅｎｓａｒｔ）、ベルギー
国、（Ｓ　Ｋ−ＲＩ　Ｔ）から得られるベルタシス毒素
に対するポリクローナル抗体、ならびにエム・フランコ
ント（Ｍ、ＦｒａｎｃｏｔｔｅＸＳ　Ｋ−ＲＩ　Ｔ）お
よびジエイ・ジー・ケニマー（Ｊ　、　Ｇ　、　Ｋ　ｅ
ｎｉｍｅｒ）（メリーランド州、ベセスダ、食品医薬品
局、細胞生理学研究所）から得られるいくつかのモノク
ローナル抗−ペルタシス毒素抗体は、ｐＲＩＴ２０００
２およびｐＲＩ７２０００８誘導の粗製イー・コリー細
胞上澄みにおけるＳｌサブユニツト関連タンパク質と特
異的に反応することが見いだされた。いくつかの反応ス
るモノクローナル抗体は、マウス攻撃系において、優れ
た毒素中和および保護活性を有した。

この結果は、少なくともいくつかの保護エピトープがな
おｐＲＩＴ２０００２およびｐ　ＲＩ　Ｔ　２０００８
誘導タンパク質にて保持されており、該タンパク質が百
日咳に対するワクチンにおいて有効性があることを示す
。

実施例８ Ｓｌサブユニット・シストロンにおいてＴｒｐ−２６欠
失を含む完全ベルタシス毒素オペロンの再構成 テ（’カベシフ　（Ｔ、Ｃａｂｅｚｏｎ）　　（Ｓ　Ｋ
−ＲＩ　Ｔ）から得られ、完全ベルタシス毒素オペロン
を有する４、７キロ塩基対（ｋｂ　ｐ）ＤＮＡフラグメ
ンＩ・を、ＥｃｏＲＩで予め消化されたｐＵＣ７に挿入
した。かかる挿入は、マニアナイスら、前掲の方法に従
って行なった。Ｉ）ＵＣ７は、ジエイ・ヴイエイラ＆ジ
ェイ・メッシング（Ｊ　、　Ｖ　１ｅｉｒａ＆Ｊ　、Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ）　、ジン（Ｇｅｎｅ）　、上９：２５９
−２６８　（１９８２）において記載されている。

得られた組換えプラスミドを、マニアナイスら、前掲の
方法に従い、イー・コリーＴＧＩコンピテント細胞に導
入した。形質転換細胞をマニアナイスら、前掲の方法に
よりクローン化し、該クローンを、マニアナイスら、前
掲の方法に従って、そのプラスミドの制限消化により分
析した。ｐＲＩＴ１３０７０と称され、完全ベルタシス
毒素オペロンを有するｌプラスミドを精製し、ついでマ
ニアナイスら、前掲の方法に従い、Ａｃｃｌで消化した
。得られた２つの７ラグメントを、ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、大きい方の
７ラグメントを精製し、次の連結工程に用いた。

複製型のｐＲＩＴ２０００２を精製し、またＡｃｃｌで
消化した。得られたフラグメントをＰＡＧＥにより分離
し、Ｔｒｐ−２６欠失を含む３００　ｂ　ｐＤＮＡフラ
グメントを精製した。ついで、ｐＲＩＴ２０００２から
の３００ｂｐＡｃｃＩフラグメントを、マニアナイスら
、前掲の方法に従って、ｐＲＩＴ１３０７０からの大き
いＡｃｃＩ７ラグメントに結び、得られた組換えプラス
ミドをマニアナイスら、前掲の方法により、イー・コリ
ーＴＧ　ｌコンピテント細胞に導入した。クローニング
後、完全ペルタシス毒素オペロンを有するプラスミドｐ
ＲＩＴ１３０７１を、マニアナイスら、前掲の方法によ
り単離した。ｐＲＩＴ１３０７１は、Ｓｌシストロンに
おいてＴｒｐ−２６コドンの欠失を有するが、他の点で
はｐＲＩＴ１３０７０と同じである。

今回、ｐＲＩＴ１３０７０により含まれるＴｒｐ−２６
修飾ペルタシス毒素オペロンを用い、内在する野性型オ
ペロンと修飾オペロンとの相同組換えによる交換により
、該修飾をボルデテラ・ペルタシスゲノムに導入する。

また、修飾オペロンをプラスミドに組み入れ、その後、
ボルデテラ細胞またはＴｒｐ−２６修飾オペロンにより
コードされるタンパク質の発現についての他のいずれが
適当な宿主細胞を形質転換することもできる。

ついで、かかる修飾ボルデテラ株を、本発明のコーディ
ング配列および／または他の保護抗原、例えば、ＦＨＡ
および／または凝集原に用いることができる。ついで、
これらの抗原を、アルミニウムアジュバントのような適
当なアジュバントと共に百日咳に対するワクチンとして
用いる。

実施例９ 非経口ワクチン調製物 ｐＲＩＴ２０００２またはｐＲ１Ｔ２０００８によりコ
ードされたタンパク質（実施例６）５〜２５μｇを、水
酸化アルミニウムのようなアルミニウムアジュバントと
混合し、非経口投与用量形に配合するのに適した形態の
ワクチンを生成する。

本発明が実施例における前記の特定の具体例に限定され
るものではないことは明らかである。したがって、本発
明のすべての具体例は、以下の特許請求の範囲内にある
と考えられる。

実施例ＩＯ ボルデテラ・ペルタシスにおける突然変異したペルタン
ス毒素の発現 実施例８の方法に従って調製したプラスミドｐＲ１Ｔ１
３０７１を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｓｌシスト
ロンにおけるＴｒｐ−２６コドンの欠失を有する完全ペ
ルタシス毒素オペロンを、マニアナイスら、前掲の方法
により、４．７キロ塩基対（ｋｂｐ）ＤＮＡ７ラグメン
トとして単離した。ついで、この４．７ｋ　ｂ　ｐＤＮ
Ａ７ラグメントを、低コピー数のプラスミドｐＬＡＦＲ
ＩＩの単一ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＲＩ
Ｔ１３２６８を得た。プラスミドｐＬＡＦＲ，Ｉ■はフ
リートマンら（Ｆ　ｒｉｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　
、ジン、上８：２８９〜２９６　（１９８２）に記載さ
れており、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、
バーバード医科大学（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ
　５ｃｈｏｏｌ）、ドクター・ジエイ・ジエイ・メカラ
ノス（Ｄｒ、Ｊ、Ｊ。

Ｍ　ｅｋａ　１ａｎｏｓ）により提供された。組換えプ
ラスミドで、米国、メリーランド州、ベセスダ、Ｕ、Ｓ
。

食品医薬凸周、ドクター・ニス・スチヴイッ（Ｄｒ、Ｓ
、５ｔｉｂｉｔｚ）により提供されたイー・コリー株５
Ｍｌ０を形質転換した。ｐＬＡＦＲＩＩはテトラサイク
リン耐性遺伝子を有し、したがって、５Ｍｌ０形質転換
体は、１２．５μｇ　／　ｍ１２テトラサイクリン（マ
ニアナイスら、前掲）を含有するＬＢ培地（マニアナイ
スら、前掲）において選択された。さらに、テトラサイ
クリン耐性形質転換体を、ＤＮＡ塩基配列決定法（サン
ガーら（Ｓ　ａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、）　、グロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエ
ンシス、ＵＳＡ　（１９７７）、前掲）により、突然変
異ペルタンス毒素遺伝子の存在について分析した。つい
で、修飾ペルタンス毒素遺伝子を有するテトラサイタリ
ン耐性５Ｍｌ０クローンを、ボルデテラ・ペルタシス株
５Ｋ３９と接合した。株５Ｋ３９は、クナノプおよびメ
カラノス（Ｋ　ｎａｐｐおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ）　
、ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊ　、　Ｂ　
ａｃｔｅｒｉｏｌ）、１７０．５０５９〜５０６６　（
１９８８）に記載されており、ドクター・ジェイ・ジエ
イ・メヵラノス、前掲により提供された。該５Ｋ３９株
は、クロモシームにおけるベルタシス毒素オペロンのＳ
ｌシストロンにてＴｎ５挿入を有する。毒素遺伝子のこ
の中断のため、数珠はペルタシス毒素を合成しない。テ
トラサイクリン耐性ボルデテラ・ペルタシス５Ｋ３９接
合完了体を、ＩＱ（ＢＧ培地）当たり脱線維素ヒツジ血
液２５０ｍ１２およびテトラサイクリン２０μｇ　／　
ｍ１２を補充したＢＣアガー（米国、ミシガン州、デト
ロイト、デイフコ研究所（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ））上にて同定した。ついで、テトラサイタ
リン耐性クローンを、クロースら（Ｋ　１ｏｏｓ、ａｔ
　ａｌ、）により、シー・アール・マンクラークおよび
ジエイ・シー・ヒル（Ｃ，Ｒ。

ＭａｎｃｌａｒｋおよびＪ　、Ｃ、Ｈ１ｌｌ）　（ｉｉ
）、ペルタシスについての国際シンポジウム、米国保健
省、文部省および厚生省、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，７０
〜８０頁（１９７９）にて記載されている修飾スタイナ
ーーショルテプロス（Ｓ　ｔａｉｎｅｒ　−Ｓ　ｃｈｏ
ｌｔｅ　ｂｒｏｔｈ）にて増殖させた。増殖後、細胞を
遠心分離により培地から分離した。ついで、細胞および
培地の両方を、ロビトら、イン７エクシヨン・アンド・
イムニティー（１９８７）、前掲に記載されているウェ
スタン・プロットにより、細胞連合形として、まｔ；は
培地におけるフリーのいずれかのベルタシス毒素の存在
について分析した。その結果は、組換えプラスミド含有
のボルデテラ・ペルタシス株５Ｋ３９はペルタシス毒素
を合成し２、有意な量のベルタシス毒素を細胞連合形に
て見いだすことができるが、該毒素は培養上澄みにて放
出されることを示している。組換えプラスミド不含ボル
デテラ・ペルタシス株５Ｋ３９は、培地または細菌細胞
に連合したいずれにおいても、検出可能量のベルタシス
毒素を有さなかった。組換えプラスミドを含有するボル
デテラ・ペルタシス株５Ｋ３９は、全細胞ワクチンにお
いて有用であることもまた注意すべきである。かかるワ
クチンは従来の技法に従い調製した。

ｐＲＩＴ２０００２の代わりにｐＲＩＴ２０００８を用
いるが、実施例８およびＩＯの方法に従い、プラスミド
ｐＲＩＴ１３２６９を得た。ｐＲＩＴ１３２６９は、Ｓ
ｌコーディング配列の２６位のアミノ酸位置でのトリプ
トファン突然変異の代わりにトレオニン（Ｔｈｒ）を用
いる以外は、完全なペルタシス毒素コーディング配列を
有する。

実施例」ｌ 突然変異ベルタシス毒素の生物学活性 米国、カリフォルニア州、キャンベル、リスト・バイオ
ロジカル（Ｌ　ｉｓｔ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）か
ら購入した精製ベルタシス毒素、ならびに毒素合成ボル
デテラ・ペルタシス株トハマＩ　（Ｔｏｈａｍａ　Ｉ　
ＸＳ　Ｋバイオロンカルス（Ｓ　Ｋ　−Ｂ　ｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ）により提供される）からの培養上澄みは、
ヒユーレットら（Ｈｅｖｌｅｔｔ　ａｔｅ　ａｔ、）　
、イン７エクシヨン・アンド・イムニティー、４０：１
１９８〜１２０３（１９８３）に記載されているように
、チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞
における形態的変化を誘発する。他方、組換えプラスミ
ドを含むボルデテラ・ペルタシス株５Ｋ３９の培養上澄
みと修飾ベルタシス毒素遺伝子は、ＣＨＯ細胞にて検出
可能な形態的変化を誘発せず、ベルタシス毒素遺伝子の
ＳｌサブユニットシストロンにおけるＴ　ｒ　ｐ　−２
６の欠失は、ベルタシス毒素の生物学活性を徹底的に減
少させることを示した。突然変異体毒素の活性をさらに
定量的に比較した場合、該突然変異体はこのＣＨＯ細胞
検定において少なくとも５００倍小さな毒性を示した。

実施例１２ ベルタシス毒素オペロンが欠失しているボルデテラ・ペ
ルタシス株の組立て ２６位のアミノ酸位置の）・リブトフェン残基の修飾を
有する完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌ
サブユニットアミノ酸コーディング配列を発現するには
、点または挿入突然変異により不活性化するよりもむし
ろ、染色体毒素遺伝子が欠失しているボルデテラ・ペル
タシス宿主株を用いることが好ましい。点または挿入突
然変異を介する遺伝子の不活性化は、自己複製プラスミ
ドにて、突然変異ペルタシス毒素をコードするＤＮＡと
　ｉｎ　ｖｉｖｏにて組み換えする能力を有するＤＮＡ
配列を排除しない。他方、ベルタシス毒素遺伝子欠失突
然変異体においては、かかる組換えは起こりえない。し
たがって、ビー・ロエランツ（Ｐ。

Ｒｏｅｌａｎｔｓ）　、前掲により提供されるボルデテ
ラ・ペルタシスＴｏｈａｍａＩ株のベルタシス毒素コー
ディング配列を、以下の方法により欠失させた。まず、
ボルデテラ・ペルタシスＴｏｈａｍａＩ株を、４００μ
ｇ／−のストレプトマイシンを含むＢＧ培地（前掲）に
プレートした。ついで、ストレプトマイシン耐性株を、
ナリジクス酸５０ｐｇ／−を含むＢＧ培地（前掲）にプ
レートした。該ボルデテラ・ペルタシスＴ　ｏｈａｍａ
　Ｉストレプトマイシンおよびナリジクス耐性株を、接
合実験用に用いた。ブラックおよびファルコー（Ｂｌａ
ｃｋおよびＦａｌｋｏｗ）がインフエクション・アンド
・イムニテイー、５５：２４６５〜２４７０（＋９８７
）において記載しており、米国、カリフォルニア州、ス
タンフォード、スタンフォード・ユニバーシティ・メデ
ィカル・スクール（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ）、ドクター・
ダブル・ジェイ・ブラック（Ｄｒ、Ｗ、Ｊ。

Ｂ　１ａｃｋ）により提供されるプラスミドｐＴＯＸ９
は、約１０ｋｂｐのボルデテラ・ペルタシスＤＮＡフラ
グメント上にペルタシス毒素遺伝子を有する。ｐＴＯＸ
９をＫｐｎＩおよびＢｇｌＩ［制限酵素、ついでＢａ１
３１エキソヌクレアーゼで消化した。連結後、欠失ベル
タシス毒素遺伝子を、Ｂａ１３１処理ｐＴＯＸ９から、
約７ｋｂｐのＣ１ａ　Ｉ／Ｃｌ　ａ　ｌＤＮＡフラグメ
ントにて単離した。

ｐＴＯＸ９の処理に用いた方法はすべて、マニアナイス
ら（１９８２）、前掲に記載されている。

ついで、該７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、スチビッ
ツら（Ｓｔｉｂｉｔｚ　ｅＬ　ａｌ、）　、ジン、５０
：１３３〜１４０　（１９８６）に記載されており、ド
クター・ニス・スチビッツ、前掲により提供されるプラ
スミドｐｓＯＲＴＰｌのユニークＨｉｎｄｌ１１部位に
挿入した。組換えプラスミドで、イー・コリー株５Ｍｌ
０（前掲）を形質転換し、ＤＮＡ塩基配列決定法により
分析し、欠失突然変異を同定した。ついで、所望の欠失
を有する組換えプラスミドを含むイー・コリー５Ｍｌ０
を、ストレプトマイシン、ナリジクス酸耐性ボルデテラ
・ペルタシスＴ　ｏｈａｍａ　Ｉに接合した。クロモシ
ームに挿入された組換えプラスミドを有する接合完了体
を、ゲンタマイシンに対するそれらの耐性およびＢＧア
ガープレート（前掲）上のストレプトマイシンに対する
それらの感受性により同定しＩ；。プラスミドｐｓＯＲ
ＴＰｌはゲンタマイシンに対し耐性の遺伝子およびスト
レプトマイシンに対し優性の感受性の遺伝子を有し、ボ
ルデテラ・ペルタシスにて自発的に複製しえない。した
がって、組換えプラスミドが相同組換えによりクロモシ
ームに挿入される場合、ゲンタマイシン耐性、ストレプ
トマイシン感受性のボルデテラ・ペルタシス株だけを生
成することができる。かかる相同組換えは、おそらくク
ロモシームにおいて毒素遺伝子フランキング領域および
組換えプラスミドを含む。ついで、ゲンタマイシン耐性
クローンを、ストレプトマイシン（前掲）　４００　ｐ
　ｇ／ｍＱを含有するＢＧプレート上にプレートし、ス
トレプトマイシン耐性ボルデテラ・ペルタシス復帰突然
変異体を選択した。クロモシームと挿入プラスミドの間
の別の相同組換えのため、これらいくつかの復帰突然変
異体が現れた。得られたストレプトマイシン耐性株を、
ゲンタマイシン耐性の喪失について分析した。ついで、
これらのクローンを、マニアナイスら、（１９８２）、
前掲に記載されているように、クロモシームにおけるペ
ルタシス毒素遺伝子の喪失について、サザーンプロット
・ハイブリダイゼーションにより分析した。ついで、得
られたボルデテラ・ペルタシス株（以下、ｒＢＰＲＡＪ
という）を、ｐＲＩＴ１３２６８のような実施例ＩＯに
記載されているｐＬＡＦＲＩ　Ｉ−誘導プラスミドのよ
うに、突然変異ペルタシス毒素遺伝子を有するプラスミ
ドの導入に用いる。かかるプラスミドを導入した後、得
られたボルデテラ・ペルタシス株ＢＰＲＡ　（ｐＲＩＴ
１３２６８）を用い、突然変異ペルタシス毒素を得る。

また、かかるプラスミドの導入後、得られたボルデテラ
・ペルクシス株は全細胞ワクチンにおいて有用である。

かかる全細胞ワクチンは、当業者によく知られた従来の
技法に従って調製される。

実施例１３ シングルまたはダブルの突然変異を含むベルタシス毒素
遺伝子のボルデテラ・ペルタシスにおける発現 ＢＰＲＡ、すなわち、実施例１２の記載に従って調製し
たベルタシス毒素構造遺伝子が欠失したボルデテラ・ペ
ルタシス株を、ｐＬＡＦＲＩ工から誘導したプラスミド
の宿主株として用いた。プラスミドｐＬＡＦＲＩＩは実
施例ＩＯに記載されている。ｐＬＡＦＲＩ　Ｉ誘導プラ
スミドは、シングルまたはダブルいずれかの突然変異を
伴うペルタシス毒素遺伝子を有した。シングル突然変異
体は、Ｔｒｐ−２６の欠失または置換、またはＧｌｕ−
１２９（すなわち、ペルタシス毒素コーディング配列の
Ｓｌサブユニットにおける１２９位のアミノ酸位置のグ
ルタミン酸残基）の欠失または置換のいずれかを有しｔ
；。Ｇｌｕ−１２９がまたペルタシス毒素の酵素活性に
関連することが以前に示されていることは興味のあるこ
とである［ビッツアら（Ｐ　１ｚｚａ　ａｔ　ａｌ、）
　、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシス、ＵＳＡ：８５．７５２１に７５
２５　（１９８８）参照］。ダブル突然変異体のｐＬＡ
ＦＲＩＩ誘導プラスミドは、Ｔｒｐ−２６の欠失とＧｌ
ｕ−１２９の欠失（プラスミドｐＲＩＴ１３２７０）ま
たはアスパラギン酸（Ａｓｐ）によるＧｌｕ−１２９の
置換（プラスミドｐＲＩＴ１３２７１）のいずれかを有
する。遺伝的操作は、マニアナイスら、（１９ｇ　２）
、前掲に記載されている古典的サブクローニング技法を
用いて実施した。部位一定方向突然変異は、実施例５に
おいて例示されているＴｒｐ−２６突然変異についての
記載のように、英国、アメルシャム、アメルシャム・イ
ンターナショナル・ｐｌｃ、により市販されている「オ
リゴヌクレオチド一定方向のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異
系」のコードＲＰＮ２３２２と用いて実施した。突然変
異生成後、すべての突然変異体を、サンガーら、プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシス、ＵＳＡ（１９７７）、前掲に記載されてい
るＤＮＡ塩基配列決定法を用いて完全に塩基配列を決定
した。種々の突然変異を有するペルタシス毒素遺伝子を
含むｐＬＡＦＲＩＩ誘導プラスミドでイー・コリー株５
Ｍｌ０を形質転換し、ついで、この場合のボルデテラ・
ペルタシス宿主株が、実施例１２の記載のように染色体
ペルタシス毒素構造遺伝子が欠失しているＢＰＲＡであ
る以外、実施例１０に記載の操作により宿主ボルデテラ
・ペルタシス株に接合した。ボルデテラ・ペルタシス接
合完了体を、実施例１Ｏに記載のように、ペルタシス毒
素の存在についてウェスタンプロットにより分析した。

ついで、該突然変異体毒素を、精製したベルタシス毒！
（カリフォルニア州、キャンベル、リスト・バイオロジ
カル・ラボラドリースから購入）、ボルデテラ・ペルタ
シスＴｏｈａｍａＩ　（前掲）の上澄フラクションにお
ける野性型ペルタシス毒素、および染色体毒素遺伝子を
欠失させたボルデテラ・ペルタシス株の上澄フラクショ
ンと比較した。かかる比較は、実施例１１に記載されて
いるように、ＣＨＯ細胞における生物学活性に基づいて
行なった。精製ペルタシス毒素３ｎｇはＣＨＯ細胞の有
意な細胞毒性クラスター化を引き起こすことが観察され
た。ボルデテラ・ペルタシスＴ　ｏｈａｍａ　Ｉの培養
上澄みを検定した場合にもまた、これらの形態変化が観
察された。対比的に、培養上澄み形のすべての突然変異
体毒素は、バンクグラウンドＣＨＯ細胞の細胞毒性のみ
を誘発した。すべての突然変異体毒素は、野性型ベルタ
シス毒素よりも少なくとも５００倍小さな毒性であるこ
とが評価されｔこ。

特許出願人　スミスクライン・バイオロジカルスソシエ
テ・アノニム

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）Ｓｉサブユニットコーディング配列が２６
   位のアミノ酸位置のトリプトファン残基（以下、「Ｔｒ
   ｐ−２６」という）の修飾を有し、 （ｂ）該Ｔｒｐ−２６の修飾が、ボルデテラ・ペルタシ
   ス毒素コーディング配列によりコードされたタンパク質
   において、実質的に、不活性なＳｌ酵素活性をもたらす
   が、該タンパク質が抗−ペルタシス毒素抗体により認識
   される能力を保持している、完全または切形ボルデテラ
   ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディン
   グ配列を有するボルデテラ・ペルタシス毒素コーディン
   グ配列。
2. （２）コーディング配列が完全ボルデテラ・ペルタシス
   毒素オペロンからなる請求項（１）記載のボルデテラ・
   ペルタシス毒素コーディング配列。
3. （３）コーディング配列が切形ボルデテラ・ペルタシス
   毒素オペロンからなる請求項（１）記載のボルデテラ・
   ペルタシス毒素コーディング配列。
4. （４）コーディング配列がＳｌサブユニットアミノ酸コ
   ーディング配列のみからなる請求項（１）記載のボルデ
   テラ・ペルタシス毒素コーディング配列。
5. （５）コーディング配列が切形Ｓｌサブユニットアミノ
   酸コーディング配列のみからなる請求項（１）記載のボ
   ルデテラ・ペルタシス毒素コーディング配列。
6. （６）コーディング配列がアミノ酸２ないし１８７のＳ
   ｌサブユニットアミノ酸コーディング配列のみからなる
   請求項（５）記載のボルデテラ・ペルタシス毒素コーデ
   ィング配列。
7. （７）コーディング配列がさらに少なくとも１つ他のコ
   ーディング配列を含む請求項（１）記載のボルデテラ・
   ペルタシス毒素コーディング配列。
8. （８）次のコーディング配列： 【遺伝子配列があります】 を有する請求項（７）記載のボルデテラ・ペルタシス毒
   素コーディング配列。
9. （９）コーディング配列がさらに、Ｓｌサブユニット・
   コーディング配列にさらにアミノ酸残基の修飾を有し、
   かつ、そのボルデテラ・ペルタシス毒素によってコード
   されるタンパク質が抗ペルタシス毒素抗体によって認識
   される能力を保持する請求項（１）記載のボルデテラ・
   ペルタシス毒素コーディング配列。
10. （１０）該追加の修飾がＳｌサブユニット・コーディン
    グ配列の１２９位のアミノ酸位置におけるグルタミン酸
    残基（Ｇｌｕ−１２９）、Ｓｌサブユニット・コーディ
    ング配列の３５位のアミノ酸位置におけるヒスチジン残
    基（Ｈｉｓ−３５）、Ｓｌサブユニット・コーディング
    配列の９位のアミノ酸位置におけるアルギニン残基（Ａ
    ｒｇ−９）またはＳｌサブユニット・コーディング配列
    の４０位のアミノ酸位置におけるセリン（Ｓｅｒ−４０
    ）に起こる請求項（９）記載のボルデテラ・ペルタシス
    毒素コーディング配列。
11. （１１）該追加の修飾が１２９位のアミノ酸位置におけ
    るグルタミン酸残基に起こる請求項（１０）記載のボル
    デテラ・ペルタシス毒素コーディング配列。
12. （１２）請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５
    ）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）または
    （１１）記載のボルデテラ・ペルタシス毒素コーディン
    グ配列を含む組換えＤＮＡ分子。
13. （１３）適当な発現制御配列と作動可能につながった請
    求項（１２）記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換えＤＮ
    Ａプラスミド。
14. （１４）ｐＲＩＴ２０００２である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
15. （１５）ｐＲＩＴ２０００８である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
16. （１６）ｐＲＩＴ１３０７０である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
17. （１７）ｐＲＩＴ１３２６８である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
18. （１８）ｐＲＩＴ１３２６９である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
19. （１９）ｐＲＩＴ１３２７０である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
20. （２０）ｐＲＩＴ１３２７１である請求項（１３）記載
    の組換えＤＮＡプラスミド。
21. （２１）請求項（１３）記載のプラスミドで形質転換さ
    れた宿主細胞。
22. （２２）ＢＰＲＡである請求項（２１）記載の宿主細胞
    。
23. （２３）請求項（１）、（２）、（３）、（４）、（５
    ）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）または
    （１１）記載のコーディング配列でコードされたタンパ
    ク質。
24. （２４）請求項（１）記載のコーディング配列によりコ
    ードされるタンパク質の免疫保護有効かつ非毒性量から
    なることを特徴とする百日咳に対する保護を刺激するワ
    クチン。
25. （２５）ヒトに請求項（２４）記載のワクチンを投与す
    ることからなる後の百日咳に対してヒトに接種する方法
    。
26. （２６）所望の宿主細胞を、請求項（１）記載のコーデ
    ィング配列を含む組換えＤＮＡプラスミドで形質転換す
    ることを特徴とする形質転換宿生細胞の製造法。
27. （２７）請求項（１）の組換えＤＮＡコーディング配列
    を含む組換えＤＮＡプラスミドで形質転換した宿主細胞
    を適当な培地中で培養し、生成したタンパク質を単離す
    ることを特徴とする（ａ）Ｓｌサブユニットコーディン
    グ配列が２６位のアミノ酸位置のトリプトファン残基（
    以下、「Ｔｒｐ−２６」という）の修飾を有し、（ｂ）
    該Ｔｒｐ−２６の修飾が、ボルデテラ・ペルタシス毒素
    オペロン・アミノ酸コーディング配列によりコードされ
    たタンパク質において、実質的に、不活性なＳｌ酵素活
    性をもたらすが、該タンパク質が抗−ペルタシス毒素抗
    体により認識される能力を保持している、完全または切
    形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ
    酸コーディング配列を有するボルデテラ・ペルタシス毒
    素アミノ酸コーディング配列によりコードされるタンパ
    ク質の製造法。
28. （２８）請求項（２７）記載の方法で製造されたタンパ
    ク質。
29. （２９）免疫保護有効かつ非毒性量の請求項（２８）記
    載のタンパク質からなる百日咳に対する保護を刺激する
    ワクチン。
30. （３０）ヒトに対して請求項（２９）記載のワクチンを
    投与することからなるその後の百日咳に対するヒトの接
    種方法。
31. （３１）（ｉ）天然のボルデテラ・ペルタシスＤＮＡか
    らの単離または合成もしくは組換えＤＮＡ技法により得
    られる、２６位のアミノ酸位置のトリプトファン残基に
    未だ修飾のない完全または切形ボルデテラ・ペルタシス
    毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング配列を含む
    ボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コーディング配列
    を、部位定方向突然変異、トリプトファンを修飾する化
    学試薬または光酸化で処理し、２６位のアミノ酸位置の
    トリプトファン残基の修飾または欠失を得、所望の宿主
    細胞を該得られたコーディング配列を有するプラスミド
    で形質転換し、かかる宿主を適当な培地にて培養し、生
    成したタンパク質を単離するか、 （ｉｉ）天然のボルデテラ・ペルタシスＤＮＡからの単
    離または合成もしくは組換えＤＮＡ技法により得られる
    、完全または切形ボルデテラ・ペルタシス毒素Ｓｌサブ
    ユニットアミノ酸コーディング配列を含むボルデテラ・
    ペルタシス毒素アミノ酸コーディング配列のＳｌサブユ
    ニットの２６位のトリプトファン残基を、別のアミノ酸
    で置換または欠失し、所望の宿主細胞を該得られたコー
    ディング配列を有するプラスミドで形質転換し、かかる
    宿主を適当な培地にて培養し、生成したタンパク質を単
    離するか、または （ｉｉｉ）かかるコーディング配列を合成方法により得
    、所望の宿主細胞を該得られたコーディング配列を有す
    るプラスミドで形質転換し、かかる宿主を適当な培地に
    て培養し、生成したタンパク質を単離することを特徴と
    する（ａ）Ｓｌサブユニットコーディング配列が２６位
    のアミノ酸位置のトリプトファン残基（以下、「Ｔｒｐ
    −２６」という）の修飾を有し、（ｂ）該Ｔｒｐ−２６
    の修飾が、ボルデテラ・ペルタシス毒素オペロン・アミ
    ノ酸コーディング配列によりコードされたタンパク質に
    おいて、実質的に、不活性なＳｌ酵素活性をもたらすが
    、該タンパク質が抗−ペルタシス毒素抗体により認識さ
    れる能力を保持している、完全または切形ボルデテラ・
    ペルタシス毒素Ｓｌサブユニットアミノ酸コーディング
    配列を有するボルデテラ・ペルタシス毒素アミノ酸コー
    ディング配列によりコードされるタンパク質の製造法。
32. （３２）請求項（３１）記載の方法により製造されるタ
    ンパク質。
33. （３３）免疫保護有効かつ非毒性量の請求項（３２）記
    載のタンパク質からなることを特徴とする百日咳に対す
    る保護を刺激するワクチン。
34. （３４）ヒトに請求項（３３）記載のワクチンを投与す
    ることからなるその後の百日咳に対してヒトを接種する
    方法。
35. （３５）不活性な染色体ペルタシス毒素遺伝子を有し、
    加えて請求項（１）記載のコーディング配列からなるボ
    ルデテラ・ペルタシス株。
36. （３６）免疫保護有効かつ非毒性量の請求項（３５）記
    載の株からなることを特徴とする百日咳に対する保護を
    刺激するワクチン。
37. （３７）ヒトに請求項（３６）記載のワクチンを投与す
    ることからなるその後の百日咳に対してヒトを接種する
    方法。