PT96104A - Processo para a preparacao de proteinas de fusao - Google Patents

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Michael George Hunter
Lloyd George Czaplewski
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Description

Este invente está relacionado com compostos proteicos que podem ser clivados para libertar actividatíe fibrinolítica ou actividade anti-trombóties» Ele também está relacionado com ácido nucleico (DMA ou RNA) codificador de todos ou parte de tais compostos» Em realizações preferidas, o invento está relacionado com proteínas de fusão produzidas pela ligação de proteínas fihrinoliticas e/ou anti-trombaticas com um adaptador clivável, a sua preparação, composições farmacêuticas contendo as mesmas e sua utilização no tratamento de doenças trombéticas» 0 sistema fibrinolítico que é a contrapsrts natural do sistema de coagulação no sangue» Mo processo da coagulação de sangue, uma cascada de actividades enzimáticas estão envolvidas na geração de uma rede de fibrina que forma a estrutura de um coágulo ou trambus» A degradação da rede de fibrina (fihrinoliss) é conseguida pela acção da enzima plasmina» 0 plasminogénio é a precursor inactivo da plasmina e a conversão do plasminogénio em plasmina é conseguido pela clivagem da ligação pepetídica entre arginina 561 e valina 562 do plasminogénio» Em condições fisiológicas esta clivagem é catalisada pelo activador do plasminogénio tipo tecido CtPA} ou pelo activador do plasminogénio tipo uroci-nase CuPA)=
Se o equilíbrio entre os sistemas de coagulação e fibrinolítica ficar localmente perturbado, podem formar-se coágulos intravasculares em locais inadequados conduzindo a estados tais coma trombose das coronárias e enfarte do miocárdio, trombose das veias profundas, choque, oclusão das artérias periféricas e embolias» Em tais casos, a administração da agentes fibrinolíticos e anti-trombóticos mostrou-se ser uma terapia benéfica para promover a dissolução da coágulos» A terapia fihrinolítica tornou-se reiátivainente comum com a disponibilidade de uma série de activadores do pissminogê-nio tais como tPA? uPA? estreptoquinasa a completo anisolado activsdor do plasminogénio e estreptoquinasa5 APSftC.
Mcstrou-ss que cada um destes agentes promove a lise de coágulos.; mas todos têm deficiências no seu perfil de actividade que os torna menos ideais como agentes terapêuticos para o tratamento ds trombose Crevisto por Marder e Bherrys Msw Enqland Journal__of
Medicine 1?895 318s 1513-1528)=
Um problema importante partilhado por todos estes agentes s que em doses cUnicamente úteiss eles nlo são específicos de tromhus uma vez que activam o plasminogénio na circulação em geral= A principal consequência disto é que proteínas tais como fibrinogénio envolvidas na coagulação do sangue são destruídas e pode ocorrer hsmorregias perigosas» Isto também ocorre com tPA apesar do facto de em concentrações fisiológicas ele se ligar ã fibrina e apresentar activaç'So do plasminogénio selectiva da fibrina.
Uma outra desvantagem importante da aetuação dos activadoes do plasminogénio existentes é que a reoclusão dos vasos sanguíneos reperfundidos normalmente ocorre após cessação d® administração do agente trombalítico= Pensa-se que isto seja devido à persistência de material trombogénico no local da dissolução do trombus.
As proteínas anti-trombóticas podem ser usadas no tratamento ou profilàxia de trombose sózinhos ou juntamente com agentes f ibrinoliticos» Proteínas arsti-trombóticas adequadas incluem hírudina? proteína C activsda e anti-trombina í 11
Colocau-ss agora uma abordagem alternativa para aumentar a íiforinéíiss e inibição da coagulação do sangue que ss baseia na utilização ds proteínas cie fuslo cliváveis para se conseguir a libertação ds actividads íibrinolitica e/ou anti-trombática no sítio da coagulação do sangue» Para se conseguir isto, proteínas envolvidas na fibrinóliss du na ínibiçlo da coagulação são ligadas por uma região de ligação que é clivável por uma enzima envolvida na coagulação do sangue» Exemplos de proteínas que podam ser incorporadas em tal proteína clivável incluem tPA, urft5 estreptoquinase» plasminogénio» proteína C activada=, hirudina e anti-trombina 13E J. = A fuslo de tais proteínas para dar uma proteína com uma propriedade favorável nao riirecta-msnts relacionada com a dissolução dos coágulos de sangue, por exemplo albumina que possui uma maior ssmi-vida no plasma, podem também ser benéficas» Uma vantagem desta abordagem é que a sslsctividads do trombus de actividads fibrinolitica ou de inibição da formação ds coágulos é conseguida através da localização específica do trombas das enzimas de clivagem»
De acordes com um primeiro aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de fusão compreendendo uma primeira sequência e uma segunda sequência, a proteína de fusão sendo clivável entre as primeira s segunda sequências por uma enzima envolvida na coagulação do sangue» em que após a proteína tíe fusão ser deste modo clivada a primeira s segunda sequências ou uma das duas possuir maior actividade fibrinolitica e/ou actividads anti-trombética da que a proteína ds fusão nao clivada» A proteína ds fusão pode ser um dímera clivável de duas proteínas fibrinolíticas s/ou ânti-tronsbóticas,, tais coma hirudi-na ou estrsptoquinase» Pode ser um homodimsro ou um hstsrodimero» A proteína de fuslo pode ter actividade fibrinolitica e/ou anti-trofflbáties substancialmsnte reduzida ou mesmo não ter k —- i
qualquer actividade comparada com os produtos de clivagem» mas uma certa quantidade ds actividade na proteína da fusão pode ser tolerada» Não é necessário que ambas os produtos de clivagem tenham actividade fibrínolítics e/ou anti-trombótica5 mas pretere-se que ambos tenham» A proteína de fusão pode não ser só um dimerp pode ter qualquer número Cpor exemplo três:i quatro ou maisí sequências qua sejam cliváveis umas das outras» compatível com a utilidade terapêutica da proteína» Pelo menos» e de preferência mais do que uma ou mesmo todas as sequências resultantes da clivagem terão maior actividade do que a proteína de fusão ou uma combinação de alguns ou de todos os produtos de clivagem terão colectivamente maior actividade» De qualquer mado5 a clivagem resultará num aumento global na libertação da actividade»
Os compostos proteicos de acordo com a primeiro aspecto do invento? são portanto clivados para libertarem actividade em pelo menos uma de duas maneiras» Primeiro? uai composto pode ser clivado para libertar actividade fibrinolítica» Segundo5 um cofiiposto pode ser clivado para libertar actividade anti-trombóti-ca» Igualmente um cooiposto pode ser clivado para libertar ambas as funções. Dsve-ss notar que um fragmento libertado da proteína ds fusão pode ter actividade fibrinolítica dirsctamsnis ípor lisar fibrina) ou indirectamente (par causar aetivação de uma molécula que conduz à liss da fibrina)»
Um composto proteico preferido que é clivável para ter actividade anti-trombótica aumentada é uma proteína de fusão de duas íiioléculas de hirudina ligadas (por exemplo extremo carbonilo com extremo assina) por uma sequência de aminoácidos de ligação civável por exemplo pelo Factor Xa» S,
As hirudinas sSo polipeptídeos naturais cie 65 ou 66 amirioácidos de comprimento que são produzidos peia sanguessuga Hirudo medicinal is , A hirudina é uni agente anti-coagulanis que se liga à trombina s evita a coagulação do sangue ao inibir que a trombina catalise a conversão do fibrinogénio em fibrína5 evitando assim a formação da estrutura de fibrina dos coágulos sanguíneos, A ligação da hirudina também inibe outras activitíades protrombicas da trombina incluindo activaçlo das fsetores v5 VIIM XIΪΙ e plaquetas. Existem tr@s variantes principais da hirudina (designadas Ην--·1, HV--2 e HV-3)=
Uma outra proteína de fusão preferida compreende duas moléculas de estrsptoquinase ligadas (por exemplo extremo carbo-nilo com extremo amina) por uma sequência de aminoácidos clivá-vBisf por exemplOj por trombina, A estreptoquinase é uma proteína de 414 aminoàcidos,, 47 KDa secretaria por muitos estreptococus patogènicos de diferentes serognupos, é um activador do plasminogénio mas, ao contrária dos activadores do plasminogénio de mamíferoP ríao é uma protease s activa o plasminogénio através da formação de um complexo binário com plasminogénio CSK-ρ1asminoqénio) que funciona como um activador do plasminogénio livre, A estreptoquinase é eficaz na indução da lise de coágulos no tratamento de enfarte do miocárdio s é largaaiente usada para esta indicação.
As proteínas de fusão cliváveis dentro do Snsbito oeste invento podem ter actividade fibrinolítica e/ou anti-irombática reduzida comparado com as suas moléculas componentes? a clivagem liberta as moléculas componentes que possuem num qrau adequado a actividade das suas moléculas parentais tipo selvagem.
ν > 0 mecanismo ds coagulação do sangue compreende uma série ds recçSes snsimâticas que culminam na produção ds fibrina insolúvel5 a qual forma a estrutura tipo rede de proteína dos coágulos sanguíneos* A trombina é a encima responsável pela conversão do fibrinogénio solúvel em fibrina* A conversão da proirombina* o precursor inactivo cia trombina ? para trombina é catalisado pelo Fautor X activad (Factor Xa)* <A trombina é também conhecida como Factor lia e a protrombina como Factor 11=) 0 Factor Xa é gerado a partir do Factor X extrínseca-mente ou intrinsecaments= Na via ssítrinseca, o Factor VII é activado pelo Factor VIIa* o que gera o Factor Xa a partir do Factor X = Na via intrinseca? a activação do factor X para Factor Xa é catalisada pelo Factor IXa* 0 Factor XIas que por sua vec é gerado pela acção do Factor XIIa sobre o Factor XI= D Facotr XIIa é gerado a partir do Factor XII pela acção dacalicreina= Pensa-se que os Faciorss VUla e Va aciusm como cofactores na activação dos factores X e II? respectivam-ents = A fibrina tal como primeiro formada a partir do fibri— nogénia está na forma relaxada* A fibrina relaxada á convertida em fibrina apertada pela seção do Factor XIIIas o qual liga de forma crucada as moléculas de fibrina* A proteína C activada é uma proiease serina aniicoagu-lante gerada na área da formação do coágulo pela acção da trombi-na, em combinação com trombomodu1ina5 sobre a proteína C= A proteína C activada regula a formação de coágulos através da clivagem e inaetivação dos cofactores pro-coagulantes Va e VUla. 0 termo "snxima envolvida na coagulação do sanguea como usado nesta especificação inclui portanto calicreina Factorss Kl.Ia5 XIa5 IXa5 VIla? Xa e trombina (Factor I!a>= que estão diractamente envolvidos na formação ds fibrina s protsina C aetivada, a qual está envolvida no controle da coagulação do sangue. As enzimas ma is preferidas são a Factor Xa e a trombina pois estão mais imediatamente envolvidos na formação ds fibrina. A geração e actividada da pala menos Factor Xa a trombina estio estreitamente regulados para assegurar que a formação ds tromhus seja restringida ao sitio do estimulo trombo-génico. Esta localização ê conseguida peia operação combinada de pelo manos dois mecanismos de controles as encimas de coagulação do sangue funcionam como complexos intimsmsnte associados às membranas fosfolipidicas celulares das plaquetas a células endoteliais no sitio da perturbação vascular CMann, K= E«, 1984, erns "Progress in Hemostasis and Thrombosis5' , i-24, ed„ Spast, T.H. Bruns and Stratton) s ©, a trombina livre ou Factor Xa libertado do sitio da trombus para a circulação é rápidamente inactivada pela acção de inihidores tais como anti-trombina 111.
Assim, a actividada da penúltima (Factor Xa) a última (trombina) enzimas na cascada de coagulação está particularmente bem localizada no sitio da geração da trombus a por este motivo estas são as preferidas. Encontrou-se que a trombina permanece associada aos trombus a liga-se não cavalentemente à fibrina. Na digestão dos trombus com plasmina, a trombina activa é libertada a pensa-se que vá contribuir para a reformação dos trombus e rs—oclusão dos vasos sanguíneos que normalmente acontece após tratamento trombo!itico com activadores do plasminogénio íBloom A. L., 1962, Br„ J. Haematol. 82, 129p Francis et 1983, 3. Lab.Clin. Med.. 1Ô2, 22€ss Hirashahi et ai » 19Q9, B1 ood 74, 1Θ25).
Por estes motivos, prefere-se em certas realizações do invento produzir proteínas de fusão activáveis pela trombina ou Factor Xa para assim criar uma classe preferida de proteínas X. fibrinolíticas sslsctivss para trombus» A roais preferida destas proteínas c!s fusão possui as propriedades favoráveis das moléculas parentais quando da clivagem e apresentam selectividads para trombus através da nova propriedade de serem clivadas para libertar as proteínas componentes da proteína de fusão no sitio de formação do novo trombus pela acção de uma das encimas envolvidas na geração do trombus e preferencialmente ali localizadas» 0 Factor Xa CE»C,= 3 = 4==21= 6) é uma protease serina que converte a profcrombina humana em tra/nbina por clivagem especifica das ligações específicas ArgC273)-Trs(274) e Arg(322)-1ie<323> (Marsn st ai 1981, Methods in Enzymoloqy 8Θ* 28é--3@2>» Na prctrom-bina humana* o sitio Arg¢273)-Tre(274) é precedido pelo tripeptí-deo Ile-Olu-Gli s o sítio Arg(32Ξ9-ΙIe<323> é precedido pelo tripeptideo I le—Asp-Gl i ,= A estrutura necessária para o reconhecimento pelo Factor Xa parece ser determinado pela sequência de aminoácidos local que precede o sitio de clivagem (nagnusson et al_? 1975== eras 5íProteases and Biological Conirol% 123-149== eds» =, Eeich et al ,= Cold Spring Harbor Laboratoryg New York)» A especificidade para as sequências Ile-Glu-Gli-Arg s Ile-Asp-81i-Arg não é absoluta uma vez que se encontrou que o Factor Xa cliva outras proteínas* por exemplo o Factor VII nas posições 336* 372.= 1989 e 1721* onde a sequência de aminoácidos precedente difere significativamente deste formato (Eaton et a 1 =, 198é Biachemistry 25 5Θ5-512)= Como o substrscto natural principal para o Factor Xa é a protrombina* as sequências de reconhecimento preferidas são aquelas em que arginina e glicina ocupam as posições Pí e P2.= respaotivamsnte* um resíduo aeídieo (ácido aspàrtico ou glutSmi.-·· co> ocupa a posição P3 e isoleueina ou um outro resíduo hidrófobo pequeno (coroo seja alanina* vaiina* leucina ou metionina) ocupa a posição P4,= No entanto* como o Factor Xa pode clivar sequências que diferem deste formato* outras sequências cliváveis pelo
Λ,
Factor Xa podem ser usadas no invento, tal como podem outras sequências cliváveis por outras encimas da cascada tís coagulação.
Para sa fazer proteinas de fusão que sejam cliváveis por estas enzimas preferidas., a sequência de aíifinoáciuos ligando os componentes da proteína de fusão deve ser reconhecida como um sitio de clivagem para estas enzimas preferidas. Para fazer proteinas de fusão que sejam cliváveis por exemplo por Factor XaH uma sequência de aminoácidos clivâvel pelo Factor Xa pode ser usado para ligar os dais componentes (ou seja., & primeira e segundas e possivelmente outras, sequências) da proteína de fusão. A sequência Ile-Slu-Gli-Arg que está em pelo menos um dos sítios na protrosbina clivada pslc$ factor Xa pode ser tal sequência. Outras possibilidades seriam sequências ou simulacros de sequências clivadas pelo Factor Xa noutras proteinas ou pepti-deos. DMA codificador da sequfncia Ile-Blu-Gli-Arg como a parte carboxi-terminal de um adaptador de ligação clivâvel como auxiliar da produção de proteína está descrito na Pedido de Patente UK SB-A-2i6020è mas a utilização de uma sequência Ile-Glu-Sli-Arg para fins deste invento não está descrita naquela especlíicação. A clivagem das proteinas de fusão por uma enzima da cascada de coagulação como seja trombina ou Factor Xa pode ser medido através de uma série de modos, por exemplo por análise de SDS-PASE e testando relativamente às funções de um ou mais produtos cliváveis da proteína de fusão. A trambina (E.C. 3.4.21.5) é uma protease serina que catalisa a proteólise de uma série de proteinas incluindo fibri-nogénio (cadeias alfa A e beta B>y Factor XIIIs Factor Vs Factor vIX5 Factor VIII. proteína C e arsti-trombina III. A estrutura necessária para o reconhecimento pela trombina parece ser par™ cialmente determinada pela sequência de aminoácidos local è volta
da sitia de clivagem mas é também determinado num grau variável por sequêncisls) longe do sítio de clivagem. Por eKemplo3 na cadeia alfa A do fibrinogénio5 os resíduos P2 CVal), P9 (Fen) e Pl® (Asp) são cruciais para a clivagem catalisada pela s-tromhina na ligaçao paptídica ArgC16>~Gli<17> CNi= F» et_al 1989.
Biochemistry 28:i 3Θ82-3094). Estudos comparativos de várias proteínas e peptídeos que são cliváveis pela trombina levou à proposta de que os sítios de clivagem óptimos para a cc-irombina podam ter a estructura de (i) P4--P3-Pro~Arg--Pl 5~P25 s onda P3 s P4 são indepsndentemente um do outro um aminoácido hidrófobo ícomo seja valina) e Pl? e P2? são índspendentemante um do outro aminoácidos não acídicos ou íii) P2-Arg-Pl5 onde P2 ou Pl3 é glicina (Chanq, J = 1985« Eur. 3, Biochem. 151 217-224)= Existem,, no entanto excepçSes s estas estruturas gerais que sao clivadas pela trombina e que podem ser usadas no invento.
Para produzir uma proteína de fusão que possa ser clivada pela trombina3 pode ser usada uma sequência de ligação contendo um sítio reconhecido e clivado pela trombina. Pode ser usada uma sequência de aminoácidos como a que é clivada pela trombina na cadeia alfa A do fibrlnogénio. Outras sequências pc?ssíveis incluiriam as envolvidas na clivagem pela trombina ou fihrinoqénio beta B5 Factor XIII5 Factor v« Factor VIIFactor VIII? proteína C? anti-trombina III e outras proteínas cuja clivagem é catalisada pela trombina. Um exemplo de um adaptador cliváve pel trombina poda ser a sequência 81i—Pro-Arg que é idêntica à encontrada nas posições 17-2® no fibrinogénío alfa A. Este não è o principal sítio de clivagem pela trombina no fibri-nogenio alfa A pois a trombina pode clivar a ligação peptídica Arg i 19)-Vai í2#). lima outra sequência de ligaçao adequada clivável pela trombina è vsl—Glu—Leu—Gln—Gli—vai—Vai—Pro—Arg que é idêntica à encontrada no Factor XIII„ 4 ' >
Munia realização preferida o invento está relacionado com com proteínas de fusão da estreptoquinase e/ou hirudina ligadas por sequências peptitíícas que sejam clivadas pela iramhi-na, Factor Xa ou outras enzimas envolvidas na coagulação do sangue para libertar produtos com actividade fibrinalitico e/ou an ti-trombotica.
Proteínas de fusão de acordo com o invento podem conter outras modificações (comparado com as confcra-partes tipo selvagem dos seus componentes tais como estreptoquinase e hirudina) as quais podem ser uma ou mais adições, deleçSes ou substituições» Um exemplo de tal modificação seriam variantes de estreptoquinase em que glicosilação inadequada durante a expressão em levedura foi evitada por substituição das sequências reconhecidas como sinais de glicosilação pela levedura» Um outro exemplo seria a adição de uma sequência Arg-Bli-Asp-Xaa, onde Xsa representa um aminoácida variável como seja Ser, para ser o extremo carbonilo da fusão para aumentar a sua vida no plasma»
As caracteristicas preferidas das proteínas de fusão dentro do Imbito do invento também se aplicam, sempre que adequado, a outros compostos do invento» mutatis mutandis,
As proteínas de fusão de acordo com o primeiro aspecto do invento podem ser sintetizadas por qualquer via conveniente» De acordo com um segundo aspecto do invento é proporcionado um processo para a preparação de um composo proteico como descrito atrás, o processo carac terizando—se pelai ac Dpi agem sucessiva de resíduos de aininoácidos uns aos outros a/ou. ligação de oligopeptí-risos. Be bem que as proteínas possam em princípio ser sintetizadas total ou parcialmente por meios químicos, a via escolhida será a tradução ribossoma1, de preferência in_vivo, de uma 13 ~ * ' ϊ - - - - -
sequência de ácido nucleico correspondente* A proteína pode ser adequadamente giicosilada»
Prefere—se produzir proteínas de acordo coo o invento usando tecnologia de DMA rscoíiibinanta* 0 DMA codificador da primeira e segunda sequências da proteína de fusSo pode derivar de um clone de cDNA ou genómico ou pode ser sintetizado* As substituições? adições ou deleçSes de aminoàcidos podem ser preferencialmsnte introduzidas por mutagénese dirigida* Sequências de DMA adequadas codificadoras de estreptoquinase e de hirudina s outras sequências polipeptídicas úteis no âmbito do invento podem ser obtidas por processo conhecidos dos familiarizados com a área da engenharia genética* Para várias proteínas,, constitui um processo de rotina obter proteínas reeomhinantes através da inserção da sequência codificadora num vector de eKpírsssão e transfectantío ou transformando uma célula hospedeira adequada com o vector* Um hospedeiro adequado pode ser uma bactéria tal como E* coli* um microorganismo eucariótico tal como a levedura ou um célula eucariótica*
De acordo com um terceiro aspecto do invento, é proporcionado um ácido nucleico sintético ou recombinante codificador de um composto proteico cofíio descrito atrás* 0 ácido nucleico pode ser RNA ou DMA* As características preferidas deste aspecto do invento são como para o prinjeiro aspecto do invento*
De acordo com um quarto aspecto do invento* é proporcionado um processo para a preparação de ácido nucleico de acordo com o terceiro aspecto* o processo compreendendo a scopiagem sucessiva ds nuclsátidos uns aos outros e/ou ligação de oligo— e/ou polinucleótidos* 14
0 ácido nuclaico recocnfainante da acordo com o terceiro aspecto do invento pode ser na forma de um vector, o qual pode ser por exemplo uai plasmídea, cosmídeo ou faga. 0 vector pode ser adaptado para transfectar ou transformar células procarióticas Cpor exemplo bactérias) e/ou eucsrióiicss (por exemplo leveduras ou de mamífero) * Um vector compreenderá um sítio cie clonagem e gsralments pela menos um gene de marca. Um vector de expressão terá um promotor operacionalmente ligado à sequência a ser inserida no sítio de clonagem e? de preferencias uma sequfncia que permita a secreção do produto proteico. Os vectores de expressão e os vectores de clonagem <os quais não necessitam de terem capacidade de expressão) estão incluídos no âmbito do invento.
Deve-se entender que o termo “vector” é usado nesta especificação num sentida funcional e não deve ser pensado como estando necessariamente limitado a uma única molécula de ácido nucleico.
Usando um vector, por exemplo como descrito atrás. as proteínas de fusão de acorda com o invento podem ser expressas s sscrstadas para o meio de cultura celular numa forma biológica-mente activa sem necessidade de outros processos biológicos ou químicos. Células ou linhas celulares adequadas para serem transformadas podem ser quaisquer células da mamífero que cresçam em cultura continua e que possam ser transfectadas ou de outra forma transformadas par técnicas convencionais. Exemplos de tais células incluem células de ovário de hamster chinas (CHD). linhas celulares de mieiorna de murganho tais como células P3Xà3-Ag8.à535 células COSj células HeLa, células BHK, linhas celulares de melanoma tais como a linha celular de Bowes, células L de murganho, limhas celulares de hepatoma tais como Hep B2, fibroblastos de murganho e células 3T3 MIH tíe murganho. Tais células podem ser i
particularmente adequadas para a expressão quando uma ou mais das sequências proteicas constituindo a proteína de fuslo deriva de um mamífero, como seja o activadar do ρ 1 asminogénio tipo tecido <t-PA).
Leveduras (por exemplo Piehia Pastoris ou Saccharomyces cerevisias? ou bactérias <por exemplo E» coli) podem ser preferidas para a expressão de muitas das proteínas de fusão do invento, bem como células de insectos tais como as que são infectadas por Baculovirus»
Os compostos do presente invento podem ser usados em composições farmacêuticas para a prevenção ou tratamento da trombose ou de outros estados em que se pretenda produsir activi-dade fitarinolítica e/ou antieoagulante local. Tais condições incluem enfarte do miocárdio e enfarte cerebral, trombose arterial e venosa3 tromboembolismo, adesões poós-cirúrgicas, trombo-flebite e vascalopatias diabéticas»
De acordo com um quinto aspecto do invento, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais compostos de acordo com α primeiro aspecto do invento e um veículo farmacêutica ou veterináriamente aceitável,, Tal composição pode ser adaptada para administração intravenosa s deve assim ser estéril. Exemplos de composições de acordo com o invento incluem preparações de proteínas de fusão estéreis em soro fisiológico isotónico e/ou tampão» A composição pode incluir um anestésica local para aleviar a dôr da injecção, Qs compostos do invento podem ser fornecidos na forma de dosagem unitária, por exe,mplo como um pó seco ou concentrado sem água num recipiente hermèticsmente fechadocomo seja uma ampola ou saqueis indicando a quantidade de proteína. Sempre que um composto se destine a ser administrado por infusão, ele pode ser introdusido num frasco para infusão contenda àgua estéril para injecçlo ou soro fisiológica ou um tampso adequado» Sempre que se destine a ser administrado por injecçSss, eis pods ser fornecido com uma ampola de água para injscção» soro fisiológico ou um tampão adequado» A composição para infusão ou injeciável pode ser reconstituída misturando os ingredientes antes da administração» Sempre que se destine a ser administrado como tratamento tópico ele pode ser misturado numa base adequada» A quantidade de material a ser administrado dependerá da quantidade de fibrinólise ou inibição da coagulação necessária, da velocidade de acção necessária, da gravidade da posição tromboembólica e do tamanho do coágulo* A dose precisa a ser administrada será, devido á naturesa do estado que os compostos do invento se destinam a tratar» determinada pelo médico» Como orientação, no entanto, um doente a ser tratado de um trombas maduro de um modo geral receberá uma dose diária de uma proteína de fusão entre ©,ΘΙ e 1.Θ mg/Kg de peso de coroo por injseção até 5 doses ou por infusão» O invento pode ser usado num método para o tratamento ou profilàKia de trombose, caracterisando-se pela administração de uma quantidade eficaz não tÓKica de um composto de acordo com o primeiro aspecto» De acordo com um outra aspecto da inventa é proporcionado a utilização de um composto como descrito atrás na preparação de um agente trombai!tico s/ou anii—coagulante» 0 invento diz respeito especialmente a BNAs, vsetores, estirpes hospedeiras transformadas» proteínas de fusão e processo para a sua preparação como descrito nos eKsmplos» 17
Os exemplos do inevnto que se seguem são oferecidos como ilustração e não devem ser pensados como limitantes» Os exemplos referem-se aos desenhos juntos em que5
Figura 1 mostra esquemétícamente o arranja de uma série de oligonucleótidos usados na montagem de usn gene da hirudina sintético (Preparação i)s
Figura 2 mostra um mapa do plasmídeo pSWé (Preparação 2);
Figura 3 mostra um mapa de um plasmideo puKl (Preparação 2)?
Figura 4 mostra um mapa do plasmideo p8C517 (Exemplo 4) 5
Figura 5 mostra um simogrsfo de estirpes de E» coli que expressam a actividade de estreptoquinase (Exemplo il)s e
Figura 6 mostra um zisnografo demonstrando a clivagem de uma proteína de fusão estreptoquinase-estreptoquinase pela trombina (Exemplo 13)=
Metodologia
As técnicas de engenharia genética e de manipulação genética usadas na produção dos genes descritos e na sua manipulação para a construção de vectores de expressão são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria» As descrições destas técnicas podem ser encontradas nos manuais de laboratório “Current Protocols in Molecular Biology” publicado pela Wiley 18
Inisrsciencs s em "íldecular Cloning. A Lahoratory Manual" (segunda adição) editado por SaiBbrooks Fritsch and naniatis publicada par Cald Spring Harbor Laboratoriess Hsm York. Os DNAs de M13mpi8, Mi3mpl9 e pUC19 foram adquiridos à Pharmacia Ltd«s Midsummsr BouIevard? Central Milton Keynes5 Bucks. M!<9 3HP5 Reines Unido. As endonuclesses ds restrição foram adquiridas á
Northumbria Bialogicals Limited. South Melson Industrial Estate, CramlingtonP Morthumberland3 NE23 9HL =;. Reino Unido ou à Nsví England Biolatas3 32 Tozer Roads Bevsriy5 Ma 01915-551® USA. PREPARAçaO.......1 - Construção de um gene da Hírudina HVi A. Programação de Genes
Um gene sintético da hirudina HV--1 foi programado com base na sequência de aminoácidos publicada. Sitias únicos para sndanucleasss ds restrição foram icorporadas para facilitar subsequente manipulação genética (ver SEQ. ID MOs1 na Listagem da Sequências imetíiatamente antes das reivindicações)= Ds codSes selecclanados foram os preferidos por S. carevisiae ou E. coli e são assim adequados para a expressão em ambos os organismos. B. Construção de Genes A sequência do gene foi dividida em 12 oligodesaxirri-honucleótidos (ver SEQ. ID N0s2) de forma a que após emparelha-mento de cada um dos pares de oligormclsótidos eles ficam coss extremos coesivos de 7 bases de comprimento. C« Sintsss de Oligonucleótidos
Os oligonucleótidos foram sintetizados por química automática de fosfDrsmidetcs num sintetisador ds DNA Applied
V
Bio-Systems 3SôB? usando fosforamidetos de ciano-etilo, fí metodologia ê agora largamente usada e jà foi descrita (Beaueage3 B = Ln e Caruthsrs, M«H» Tetrahedron L.sttars 249 245 (1981)), D» Montagem de Bsnss
Os oligonucleótidos foram fosforilados para lhes piroporcionar um fosfato 53 para permitir a sua subsequente ligação, Os oligonucleótidos foram montados como se mostra na Figura 1„
Fosforilação de Oligómeros ΪΘ® pmolss do oligémero foram secas s ressuspensas em 2® μΐ de tampão de fosforilase (7® íuM Tris? pH 7;às í€> mH ngCl„5 í mH AIR? espermidina ©52 mrlditiotreitol <DTT> ®55 mH). Polinu-cleótido-cinase de T4 (2 mci» 1® ®@θ U/mi foi adicionado s a mistura foi incubada a 37°C durante 3® minutos, A cinass foi então inactivada por aquecimento a 7®°C durante í® minutos,
Pares complementares de oligonucleótidos fosforilados foram emparelhados aos pares <9®°C, 5 minutos5 seguido de arrefecimento lento à temperatura ambiente), Os 6 oligómeros emparelha™ s dos foram então misturados uns com os outros? incubados a 5®uc durante 5 minutos e deixado arrefecer. Eles foram então ligados durante a noite a lé°C com DMA—ligase de T4» A estratégia está apresentada esquematicárneote na Figura 1 (nota P ™ fosfato 53), Para evitar possível muitimerizaçãos os oligómeros designados ΒΒ2Φ1Ι s BB202Q não foram fosforilados. As sequências dos oligó-meros mostradas na Figura 1 correspondem às dadas em SED, ID M0s2, \
Os produtos de ligação foram separados num gel de 2% de agaross de baixa temperatura de fusão e s banda correspondendo ao gene da hirudina HV-1 foi removido e extraído do gel, 0 fragmento purificado foi então ligado ao DMA do plasmldeo pUC19 tratado com Hindi II s EcoRI , A transformação ds estirpes hospedeiras de E. coli foi então conseguida usando processos convencionais« A estirpe usada como recipiente na transformação dos vsctoras plasmldeo foi HWS7 que tem o seguinte genéticos
araD159(ara-1eu)DELTA7697 (lacIPOZY)DELTA74 oalU qalK hsdR rpsL srl recASò A utilização tíe HW87 não é criticas pode ser usada qualquer estirpe recipiente adequada, Os produtos de ligação recomhinantes foram usados para transformar a estirpe hospedeira HW87 de E, coli KI2 e semeadas em placas de Luria-agar com ampicilina <1®® pg/ml). Doce colónias resistentes à ampicilina foram repicadas e usadas para preparar DMA de plasmldeo para análise da sequência, A análise da sequência didesoxi de cadeia dupla usando um iniciador de sequsnciaçâo universal BB22 (o5 ~CABGBTTTTCCCABTCãCB--3? ) 5 -í SEQ ID N0s3) complementar da região do iniciador universal do pUC19 foi usado para identificar um clone correcto de HV-í em pUCÍ9, 0 recombinante pUC19 foi usado para construir o vector de expressão, PREPARAÇÃO 2 - Construção.......de.......um. Vector de Expressão para a
HjnMÍQaJjyr.i_
Um vector de expressão foi projectado para permitir a secreção da hirudina para o meia sxtracslular após expressão ern S, cerevisiae, A secreção de hirudina é desejável uma vez que facilita a produção da proteina com um extremo N autãntico. Ela também facilita a purificação, limita a proieólise intracelular, redus cs potenciais efeitos tsKicos no hospedeiro levedura s permite o enrolamento corrscio da proteína s formação de ligações dissulfursto nativas, A secreção de hirudina através da membrana celular foi dirigida pela fusão de hirudina ao prs-pro-peptídeo do factor de conjugação tipo alfa Cum peptídeo de levedura naturalmente sscretado)» O vsctor de expressão em levedura pSWò (Figura 2> bassia-se na círculo 2 μ de 5. cerevisiae. (pSWò foi depositado em 5* csrevisias estirpe BJ216S na HThe National Collection of Industrial and ilarine Bactéria Limited* 23 St= Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY5 Escócia, Reino Unido em 23 de Outubro de 199€? com o MO ds Acesso MCIMB 4Θ326.) pSWò ê um vsctor vai-vem é capas ds se replicar em e« coli e em S. cerevisiae e contem uma origem de rsplicação da DMA para ambos os organismos, o gene leu2 (uma marca selectiva para a manutenção do plasmideo no hospedeiro levedura) s α Iccus ds resistência à ampicilina para sslecção da manutenção do plasmideo em E» coli. CA sequência de DMA do vsctor foi determinadas as sequências de E. coli derivam cio rsplicão pAT153 baseado em ColE-i de E- coli„) A sequência completa é dada como SEQc IDí;4. A capacidade de passagem deste vsctor através de E, coli facilita grandemente a sua manipulação genética e facilita. a purificação» pSWh contem um gene do pre-pro—peptídeo do factor a fundido na mesma grelha de leitura com o gene do factor de crescimento epidérmico CEGF)= A expressão desta fusão está sob o controle de um promotor regulado pela galactose que contem sequências de DNA híbrido derivadas do promotor 8AL i-iô de S. cersvisiae e o promotor da fosfoglicerato-cinase (PB!<) de 5. cersvisiae. A transcrição do gene EBF é determinada neste vsctor pelo terminador PBK natural de levedura» 0 gene EBF em pBWè pode ser removido por digestão com as sntíonuc1sases de restrição Hindi1I e BamHI„ Isto remove DNA codificador de EBF e os 5 aminoácidos do extremo C do pro-peptideo do factor as Os genes a serem inseridos no vector de expressão pSW6 deve ter portanto a composição gerais sitio Hindi 11 - adaptador do factor a - gene -sitio BamHX«
Para reconstruir o DMA codificador dos aminoácidos no extrema C do pra—pepiídea do factor α e para fundir este com o gene sintético da hirudina;i construiu-se um oligonucleótido adaptador (5ASCTTGBATAAAAGA-35 (cadeia de cima, SEÈ3 = lDs5)? 55~TCTTTTATCCA™3? (cadeia de baixo,, BED=IDsè)) contendo um sítio Hindi II e codSes codif icadores de Ser? Leu5 AspLis e Arg do extremo C do pro-peptitíeo do factor cu 0 adaptador do factor α foi ligada ao gene sintético de HV-i de tal forma que o gene recombínante codifica uma fusão na mesma grelha de leitura do pro-peptídeo do factor α com hirudina* 0 DMA do plasmideo pUC19 HV-1 da Preparação I foi primeiro clivado com Bsplil e os extremos protubsrantes foram preenchidos usando fragmento Klenow ds DNA—polimerase I para criar um fragmento ds DMA linear com extremos cersss* 0 fragmento linearizado foi separado do plasmí-deo não cortado num gel de 1% de aoarcee de baixa, temperatura de fusão5 removido e extraído da matrix do gel de agarose e tratado com HindiII. 0 fragmento foi então ligado ao adaptador do factor alfa descrito atrás s emparelhado entes da ligação* Os produtos recombinantes da ligação foram usados para transformar células competentes da E, coli estirpe HW87» Os transformantes resistentes á ampicilina foram analisados através da preparação de digestão do DMA de olasmídeo cora HlndXII s BamHI e electroforess em gel ds agarose* Um plssmídeo recombinante correcto foi designado pJC8(5* A ssqufncia do adaptador tío factor α-hirudina foi removida do pJCS® num fragmento HindiIl-BamHI com aproximadamenle 2Ξ3 pb (SEQ^IDs?)» 0 fragmento foi purificado num gel de agarose de baixa temperatura de fusão e ligado ao DMA do vector pSWé tratado com HindiII e BaraHla Os produtos recombinantes da ligação faram usados para transformar células competentes de E, coli estirpe HW87» Os transformantes resistentes à ampicilina foram despistados por preparação de DMA de plasmídeo, análise com as endonucleasss de restrição HinoIII e Bara-HI e electroforese em gel de agarose» Ura clone cora α padrão electroforético correcto pJKl (Figura 3) foi identificado» Este plssmídeo é o vector básico usado para expressão de hirudina Hv-x tipo selvagem e foi usado para derivar outros vectores de expressão de levedura conforme detalhado nas restantes preparações e exemplos, PREPARAÇÃO 3 "-Expressão do fâene Sintético da., Hirudina. G vector de expressão piasmídeo pJKl da Preparação 2 foi usado para transformar levedura (S, cerevisiae) estirpe BJ21Ò8 que tem o seguinte genótioos pcjç~i~4®7, orbí-1122 psd4-3 leu2 trpl ura3--52 cir* usando o método de Sherman F» et al Uisthods in Ysast Genetios, Cold Bpring Harbor Laboratory, (1986))» Todos os meios para leveduras forma como descrito por Sherman et al, Usando frascos de agitação de 2 litros, as culturas de levedura contendo puKi foram cultivadas em lotes de 1 litro de ©»é7% de maio completo sintético, base acatada para leveduras, com saiinoácidos sem leucina e 1% de glucose como fonte de carbono. Após crescimento durante a noite a 3Θ°0, as células foram colhidas por centrifugação a 3®®© rpm durante 1® minutos e ressuspensas em meio completo sintética excepto ter-se usada 1% de galactose e ©,2% de glucose como fonte de carbono, Isto induc a expressão da genes a partir do promotor PGí< híbrido» As células foram cultivadas no meio de indução durante 3 dias» Após este período, o sobrsnadants foi colhido e testada quanto à actividade de hirudina como descrito no Exemplo 2 abaixo, fc.XbMFLu λ- Construção da um Gene de mslo Hirudina-IEORdilrudioa g da um Vsctpr para a sua Expressao
Projectou-se uma molécula de proteína de fusão da hirudina clivávsl pelo faotor Xa em qus duas moléculas de hirudina ds tamanho completo foram ligadas pela sequência psptídica de ligação Xis Slu Gli Arg (Ver SEQnlD NO = S) == A molécula foi projec-tada para aumentar a duração da actividade anti-tromfaótica da hirudina devido ao seu peso molecular aumentado e ao facto de ser sctivável por clivagem pelo factor Xa» A estratégia para a construção do gene hirudina-IESR-hirudina está detalhada abaixo,:
Um gene codificador da molécula de hirudina-IESR-hiru-dina foi construído por mutagénese dirigida com oligonuclsótidos s clonaqem molecular» A mutagénese foi realizada de acordo com o método ds Kunkel st ah., Hethods in Enzymoloqy» 154? 367-382 Ϊ1987)» As estirpes hospedeiras estão descritas abaixo»
Ssiy£E§s_JteJLl_coli RZ1032 é um derivado de E» coli qus nlo possui as encimas de metabolismo ds DWAs (a) dUTPass <dut)» a ausência da qual resulta numa elevada concentração de dUTP intracelular e (b) uracilo-M-glicosilase Cung) que é responsável pela remoção de uracilos erradamsnte incorporados no DMA (Kunkel et al» » 1sc» £ÍÍa.>- Q pr incipal benefício é que estas mutações conduzam a urna frequência mais elevada de mutanies na mutagénese dirigida» RZ1032 tem o seguinte genétipos
Hf rKL16P0/45i: lvsA961-62) , dutí .. unci. thii , recH, Zbd-279sslnlflg supE44 C~>. ; - unlDã é uma estirpe recipiente convencional para manipulações que envolvamvectores baseados em M13* 0 genóiipo de JMÍ03 é DELTA (lac-pro), thi, supE, srtft, sndfl, sbcBIS» hspR4, F5 traS36prc-AB, laclq, lacZOELTANlS» u-âimÈiiMm.
Antes da mutagsnese foi necessário justapor dois genes de hirudina adjacentes nu® vector de mutagéness MÍ3= Isto foi conseguido como descrito atrás* Preparou-se DMA do vector pJKl da Preparação 2 a uma amostra foi tratada com as sndonuclsasss ds restrição ΒαIII e BamHI, um fragmento de DMA BaliI-BamHI com cerca de 466 produto desta digestão foi purificado em qel s ligado ao DNA do vector pdCS© da PreparaçSo 2 tratado com BamHI e com fosfatas©« Os produtos de ligação rscombinanies foram usados para transformar células competentes ds E. coli estirpe HMS7„ Os clonss resistentes à arapicilina foram analisados através da preparação de DMA de plasmideo* digestão com endonucleasss de restrição e electroforese em gel» Os cisnes com inserções na orientação pretendida foram identificados após digestão com kpnl que libertou um fragmento de DMA de aproKimadamente 4ó5pb ds comprimento» Cus produtos da digestão com konl foram analisados num gel ds agarass.) Um dos dones? pJK®©23 foi usado para as restantes construçõess este vector contem aproKimadamsnts 465 pb do fragmento de DMA kpnl que codifica uma fracção C-termirsal ds um gene da hirudina? uma sequência completa do prs-pro-peptideo do factor a e a fracção N-terminal do gene da hirudina» Para eliminar a sequência do pre-pro-peptideo do factor a e inserir DNA codificador ds uma sequência de aminoácidos para ligação clivável pelo factor Xa (IEGR)» o fragmento de DNA kpnl de aproKimadamente 465 pb foi transferido para um vector faacteriofâ-gico ds mutagénsse M13mpl8» Preparou-se DNA do plasmideo pJK©©2 e uma fracção foi digerida com kpnl» 0 fragmento de DNA kpnl com -< aproximatíamente 465 pb do pdl<©®2 foi purificado em gel e ligado ao H13mpl3 tratado com kpnl s fosfatase»Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transfsctar células competentes do E» coli estirpe JM103» DNAs de cadeia simpiles das placas fágicas recambioantes putativas foram preparadas e analisadas por sequenciação dioesoMi usando o iniciador de sequencialçSo universal M13= Foi identificado um clone pSC6©9 contendo o fragmento kpnl na orientação correcta. A sequência pre-pro-peptidica do factor s entre as duas sequfncias da hirudina do pBC6©9 foi eliminada s a ligaçSo de anvinoácidos clivâvel pela factor Xa ÍIE8R) inserido por mutagáne-· se dirigida» Preparou-se DMA de cadeia simples de pGC6ô9 a partir de £= coli estirpe RZi©32 e foi usado como molde para a mutagéns™ se com um oligonocleótido de 46meros BB2988s <5 5-CA8TCS8T8TAAbCAACTCTTCCTTC0hTCT8CA8ATATTCTTCT0“39) <8EQ»1D NQs9). Prepararam-se DNAs de cadeia simples a partir de placas de mu tantas putativos e forain anlisadas por sequenciaçSo didesoxi do DMA usando um iniciador de sequenciação universal M13 (United States Biochemical Corporation» P»0» Box 224®©» Cleveiand ? Ohio 44122» USA» Produto N9 70763 55"8TTTTCCCASTChC8AC-3p ), <SEQ= ID Mus 1Θ)» Identificou-se um clone corrseto pBC61©«= Para construir o gene hiradina-IEBR™ hirudina de tamanho completo o núcleo central da molécula de fusão codificado pelo fragmento Kpnl de aproximadaments 21Θ pb dp pGCél© foi clonado no sitio Kpnl do pJCS® da Preparação 2» G DMA forma replicativa de p8C610 foi preparado e digerido com kpnl» 0 fragmento Kpnl cam aproximadamente 210 pb codificador do núcleo central da proteína hirudina-IEBR-hirudina foi purificado em gel e ligada ao pJC8© da Preparação 2 tratado com Kpnl e com fosfa-tase» Os produtos de ligaçSo recombinantes foram usados para transformar células competentes de £, coli estirpe HW87» Trans-formantes resistentes à ampicilina foram analisados por 27 27
preparaçlo da DMA ds plasmídeo, digestão com a endonucleass ds restrição PstX s eiectroforese em gel de agarose* Foi identificado um clone com o padrão elctroforético correcto pDBl»
Para criar um vecior para a expressão da proteína de fusão hirudina-IESR-hirudina clivável pelo factor Xa o gane foi clonado no vector de expressão em leveduras pSWô da Preparação 2= 0 DMA do plasmídeo pDBl foi tratado com HinIII-BamHI e o fragmento HindiII-BamHl com aproximaeSamenfcs 42® ph contendo o gene da hirudina-IEOR-hirudina clivável pelo Factor Xa foi purificado em gel e ligado ao DMA de pSWê tratado com HindiII e BamHI da Preparação 2« Qs produtos de ligação rscomhinantes foram usados para transforínar células competentes de E. coli estirpe HW87» Os transforrnantss resistentes á ampicilina foram despistados através da preparação de DMA de plasmídeo» análise com entíonucleases de restrição HindiII e BamHI e eiectroforese em gel de agarose» Foi identificado um clone com o padrão electroforético correcto pDB2» pDB2 continha o gene da hirudian-IEGR-hirutíina fundido na mesma grelha de leitura com a sequfncia do pre-pro·-psptideo do factor a» 0 DMA do plasmideo pDB2 foi preparado e usado para transformar leveduras estirpe BJ21éS de acordo com o método de Sherman F = et al CMetliods in Yeast Senstics5 Cold Spring Harbor Laboratory5 New York (1938))= EXEMPLO 2- Purificação de Hirudina e Hirudina-IEBR-Hirudina 0 processo da Preparação 3 foi seguida na generalidade para a expressão das proteínas hirudina e hirudina-IEBR-hirudina» Hirudina e hirudina-IESR-hirudina foram purificadas a partir de caldo de cultura de levedura.» As células foram primeiro removidas por centrifugação a 3®Θ® rpm durante 1® minutos» 0 sobrenadanta foi então testado quanto à activitiade biológica usando um ensaio crofflogénico (ver abaixos secção D)» Os níveis de produção das culturas em frascas de agitação foram tipicamente entre Ιθ-ib mg/litro de cultura. A proteina hirudina foi purificada por HPLC preparativa CDYNAMrX (Trade Mark) Ci8s 3ΘΘ angstrons). A coluna foi primeiro equilibrada em 15% de acetonitrilo^ 0=1% de ácido trifluoroacético» Em seguida 2s5-3 mg de actividade de hirudina determinado pelo ensaio cromogénico (secção 5 D) foi aplicado na coluna, A proteina foi eluida usando usi gradiente da acetonitrilo de 15-4Θ% a 3 ml/minuto durante 25 min, A pureza da proteína isolada foi testada por HPLC analítico (fase reversa VYDAC C18 (Marca Registada)>* análise da sequfncia M-terminal e FPLC em mono Q como descrito abaiKo. A» Análise da pureza por HPLC analítica
As amostras foram analisadas numa coluna VYDAC (Marca Registada) 018 (15 χ &546 cms partículas com o tamanho de 5 ffiicrons) equilibraria com acetonitrilo a 1Φ%;! ®3I% de ácido trifluoroacético CTFA)= A proteína purificada (2Φ μο> foi aplicada em acetonitrilo a Ι©%? de TFA, A proteína foi eluida a um fluKo de 1 ml/minuto usando um gradiente de acetonitrilo a um Πάκο de 1 ml/minuto usando um gradiente de acetonitrilo de 10-40% em 05í% TFh durante 3Φ minutos. A amostra de proteina eluida foi controlada por ahsorvância a 2S& nm»
B, Análise da pureza por FPLC em liono Q
As amostras forais analisadas numa coluna de FPLC nono Q (5 ;< 0.5 cm=, Pharmacia) equilibrada ecn 2Θ mn Tris.HCl pH 7,5, AproKÍmadamente 15 pg de proteína liofilizada foi reconstituído srn 1 ml de 2Θ mli Tris.HCl pH 7.5 e aplicada à coluna, A proteina foi eluida usando um gradiente de Φ-25Θ mH NaCl em tampão 2Θ mM Tris.HCl (pH 7?5> num fluxo de 1 ml/minuto durante 3Θ minutos. C« Análise da sequência M-terminal fi análise da sequência N-terminal foi realizada por degradação automática de Edraan usando um Sequenciador de Proteínas Applied Biosystems, modelo 471 A {Applied Biosystems, Foster City, califórnia)» 0 material purificado que estava mais de 957 puro, foi seco num SPEEDIvAC (marca registada da Savant Instruments Irsc» Hicksville, N»Y» U»S»A») e reconstituído em ®»5 ml de β59 % Cp/v; de saro fisiológico para ensaio» D» Ensaio cromogénico de actividade anti-irombins para hirudina A capacidade da hirudina e moléculas contendo hirudina para inibir a hidrólise catalisada por trombina do substrato cromogénico tosil-Bli-Pro-Arg-p-nitroanilida CCHROMOZYH TH (marca registada da Boshringer-Mannheiro)) foi usada como um ensaio para determinar a sua actividade anti-trombina» As amostras de proteína (50 μΐ) diluídas em Θ»1 M Tris.HCl pH B5o5 ®,15 M NaCl, 0,1¾ <p/y) PE8 è®0® foram misturadas com 5® pg de trombina humana (Sigma, 8,8 U/ml no tampSo atrás referida) e 5® μΐ de CHRDHOZYIi TH C2»5 sTíM sst, água) em placas ds 96 cavidades (Gostar)» As placas fora® incubadas à temperatura ambiente durante 3® minutos» A reacçáo foi terminada pela adição de 5Θ μΐ de ácido acético Θ, 5 M e a absorvSncia lida a 4Θ5 nm usando um leitor de placas automática CDynatech)» A quantificação foi realizada por comparação com uma preparação padrão de hirudina (CLis—473—HV-2 recombinante adquirida à Sigmas Sigma Chemical Ca» Ltd» Fancy Road, Poole, Dorset ΒΗ11 7TB, Reino Unido)»
EXEMPLO 5- Clivagem e Activação da Proteína da ruslo Hirudina™ rlESRzHirudijia A proteína de fusão hirudina-lEGE-hirudina purificada foi incubada com o factor Xa* A reacção foi realizada a 37°C num volume total de 15© μϊ de tampão Tris*HCl ©5in pH 7S8 s continha 25Θ6 nuiol de proteína de fusão e Θ54 nmol da factor Xa = A análise da mistura de reacçlo por electroforese em gel de dodeciIsuXfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PABE) demonstrou a clivagem dando origem a produtos de um tamanho semelhante ao da hirudina nativa* A análise por S-íPLC em fase reversa da reacção de clivagem como no Exemplo 2? secção As demonstrou o aparecimento de duas espécies novas com tempos de retenção íET) de 17 e 2© minutos comparado com 22 minutos para a proteína de fusão intacta*
As mediçSes da actividade específica foram feitas nos produtos isolados a partir de uma reacção de clivagem* Usando um ensaio cromogénico de acordo com o método do Exemplo 2? secção DP para medir a actividade da hirudina em unidades anti-trombina* ubtivsraffi-ss os seguintes resultadoss produto ET 17 min=? 6125 U/mgj produto ET 2© min*, 5226 U/mgs hirudina-IEBE-"hirudins3 ET 22 min*? 2588 U/mg= A clivagem produz portanto um aumento aproximado de 2 vesss na actividade especifics? com os produtos apresentando valores semelhantes aos registados para a amostra de hirudina recombinants (66©© ll/mq) conforme medido de acordo com o Exemplo 2* secção D*
Os produtos de clivagem purificados e a proteína de fusão de fusão Intacta foram sujeitos a análide da sequência N-terminal= Em cada um dos casos a sequãncia obtida era idfntica á da hirudina nativa <HV1)S ÍWYTD)*
Foi assim demonstrado que a proteina de fuslo hirudina--“lEBR-hirudína pode ser clivada pslo Factor Xa para produsír dois produtos com actividads de hirudina,, A clivagem da proteina tís fusão é acompanhada pela activaçlo uma vez que os produtos de clivagem tfm aprQKimadamsnte actividade específica dupla da proteína de fuslo» PREPARAçKO 4,- .Isolamento do gene da estreptoquinase A estreptoquinase é secretada pelos estreptocccos de Lancfisld Srupo C e foi descrita a clonagem do gene da estrepio-quinase a partir do gene da estreptoquinase de Stretococcus equisifflilis estirpe H46A CMalke» H. e Ferretti, EJL&USL. 813557-3561 <1984))=, A sequência de nucleétidos do gene clonado foi determinada <Malke3 H=,3 Roe? B, e J=J= Ferretti, Sena 34 357-362 (1985)),, Um gene codificador da estreptoquinase foi também clonado a partir de S» sauisimilis CATCC 9542 ou ATCC 16009) para usar no presente invento» Os oétodos que podem ser usados para isolar genes estio bem documentados e o processo usado para isolar o gene da estreptoquinase está resumido no protocolo que se segue» i „ Preparou-se DMA a partir de Streptococcus eouisimilis (Brupo C de Lancefield) ATCC 100O9 ou a partir de ATCC 9542 cultivado em meio de infusão de cérebro-coração (Difco-Bacto Laboratories» PO Βακ 14B» Central Avenue» E= Hosely? Surrey !<T8 OSE5 Reino Unido) como culturas de rotina» 0 DMA cromossómico foi isolado a partir de apro>iimadamente 155 ml de células a urna densidade de 1 x 10a x células/ml» As células foram colhidas e lavadas em i ml de tamplo (fosfato de potássio 0=jlM pH ó?2> „ O sedimento foi ressuspsnso em 40ô ul do mesmo tamplo s adicionado 50® unidades de metanolisina (Sigma Chemical Company Ltd5 Fancy Road? Pooles Dorset BH17 7TG? UK) em 1©0 μΐ de volume,. Esta mistura foi incubada a 37°C durante * ϊ
1 hora, As células foram colhidas por centrifugação e novamente lavadas em tampão» As células foram ressuspensas sm 5€»θ μΐ de uma solução contendo 50 mH glucose» 10 mil EDTA e 25 mM Tris HC1 pH 8,© e incubado a 37 °C durante aproximadamente 1 hora com agitação suave da mistura para evitar a sedimentação de células» Uma amostra de 5Θ® μΐ de uma solução contendo €>,4% SDS e proteinase K (100 pg/ml) (Sigma Chemical Company Ltd) foi adicionada e a mistura incubada a 37°C durante 1 hora até se tornar viscosa e clara» A mistura foi então extraída três vezes com fenol equilibrado com tampão TE (1Θ mil Tris HC1, 1 míi EDTA ρΗ 8,0)* A fase aquosa foi removida para um tubo Eppandorf» adicionada NaOAc para uma concentração final de 8,3 M e adicionados 2,5 volumes de etanol» A mistura foi incubada a -7®°C durante 1 hora para precipitar o DMA» 0 DNA foi sedimentado por centrifugação» lavado com etanol a 70% e depois ressuspenso em 28Θ μΐ de tampão TE» 2» Usou-se a Rescção em Cadeia com Polimerase ÍPCR) para amplifi-car a sequência da estreptoquinase (Saiki R = et al Science» 239» 487-491 (1988))» Projectaram-se dois iniciadores com base nas sequências da estreptoquinase publicadas» 0 iniciador codificador da cadeia anticodSo no extremo 35 do gene foi um 40msros BB1888 <5?STTCAT6SATCCTTATTTSTC8TTAS86TTATCASSTATA35), <SEQ, ID NO s11) que também codifica um sitio BamHI, 0 iniciador codificador da cadeia codão no extremo 55 do gene codifica um sitio EcoRI além da sequência da estreptoquinase e foi um 4ô®eros BB1837 < 5* TC AAGT GA ATT CATG A A A A ATT ACTTAT CTTTT88G AT GT3 *)$ í SEQ ID NO s 12). Foram realizados quarenta ciclos de PCR com o passo de desnaturação a 95°C durante 2 minutas.·, seguido de emparelhamento dos iniciadores durante 3 minutosa 55°C e extensão a 7&°C durante 4 =,5 minutos» Uma amostra do produto de rscção foi analisada num gel de 0,8% de agarose» Observou-se uma banda isolada amplificada em aproximadamsnte 13Θ0 pares de bases, que corresponde ao tamanho esperado do gene da estreptoquinase» 3» Uma amestra de 3θμΙ do produto foi digerida com as endonuclesses EiioRIe BamHI? analisada num gel de agarose de baixa temperatura de fusSo e a banda com cerca de 1?3 Kb foi isolada do gel» A banda foi extraída do gel s ligada ao plasmideo pUCÍ9 qus tinha sido clivado com EcoRI e BamHI para formar o plasmideo pUCÍ9SK=
Todo o fragmento EcoRI-BamHI de 133B pb do pUC19SI< foi seuenciado por análise de sequência didesoxi* Para facilitar a sequenciaçSo,, o fragmento de DMA EcoRI-BamHI de pUCi9SK foi transferido para os vectores mpí8 e mpi9 de sequenciaçSo em M13 em duas metadss= Um fragmento de DNA EcoRI-HinoIII com cerca de 83© pb foi ssparadamente transferido para r113mpl8 © M'13íspl9 tratados com EcoRI s com Hindi11 „ Os produtos destes dois casos de ligaçSo foram separadamente usados para transfsetar células hospedeiras competentes de E, coli d 11103,= Preparou-ss DMA de cadeia simples e usou-se para análise de sequências didesoxi usando os iniciadores apresentados em SEQ ID NDsl3= Um fragmento HindIII-BamHI com aproxisadamente 490 pb foi purificado em gel após tratamento de p!JC193K com Hindi 11 e BamHI „ Este fragmento de DNA foi separadamente ligado a Mi3mplB e a fíl3mpl9 que tinha sido tratado com Hindi 11 e cosi BamHI „ Os produtos destas duas ligaçSes foram usados para transfsetar células competentes da hospedeiro El,= coli Jni03= DMA de cadeia simples foi preparado s usado para análise de sequências didesoxi com os iniciadores mostrados em SEQ ID N0si3= Toda a sequência do fragmento de DMA EcoRI-BamHI derivado de PCR está apresentado em SEQ ID Ν0=14= EXEMPLO 4 - Construolo de vectores de expressão da estreptoguina-
Construiu-se uma séria de vectores de exprasslo da estreptoquinase alternativos para a expressão na levedura S.·.·, LMliDdJãisiã ou em E-_.....coli Ki2„ 1) Vectores de secreção para o espaça periplasmático ds E, coli K12
Projsctaram-se dois vsctorss para permitir a secreção ds estreptoquinase para o espaço periplasmático após expressão em E» coli Ki2 = É desejável a expressão de estrsptoquinase para facilitar a produção da proteína com um extremo N autêntico3 para faclitar a purificação» para reduzir os potenciais efeitos tóxicos e para limitar a proteóliss intracelular» A secreção tía estreptoquinase através da membrana cltoplasmática de E* coli foi dirigida pelo peptídeo sinal da estreptoquinase ou pelo principal peptídeo sinal da proteína A da membrana externa (OmpA) de E» coli (OmpAL)» A» Secreção usando o líder de estrsptoquinase 0 gene da estreptoquinase da Prepapração 4 foi transferido para o vsctor de expressão em E» coli pGC517 CFigura 4>,= pSC517 contem o promotor regulável ptac3 um sítio de ligação ao ribossoma e um terminador da transcrição sintético» p8C517 foi depositado em E» coli K12 na National Collection af Industrial and ríarine Bactéria Limited» 23 St» liachar Drive» ftbsrdeen5 AB2 !EY5 Escócia3 Reino unida sm 5 de Dezembro 199Φ com a N5 de Acesso NCII1B 4D343» Os genss podem ser olonados no sitio de expressão do p8C517 sm fragmentos tie DMA Ndel-BainHI. Foi necessário colocar um sitio Mdel no extremo 5? do gene tía estreptoquins- se para permitir a subsequente clcoagem em pBC517„ 0 sítio Ndel foi introduzido por mutagénese dirigida» Para construir o vsctor para a mutagénese pretendidas o DMA de plasmideo do vector pUC19SK do exemplo 7 foi preparado e digerido com EcoRI e BarnHI e α fragmento de DMA EcoRI-BamHI com aproximadamente 13ΘΘ pb foi purificado soí qel e ligado a ?vií3mpl8 tratado coib EcoRI e BamHI» Os produtos de ligação recombinantes foram transfectados para 3¾
células competentes de E, coli estirpe drll©3 = G DMA de cadeia simples foi preparado a partir de placas recombinantes putativas e analisadas por sequenciação didesoxi usando o iniciador de sequenciação universal §113 = Um dos fagos recombinantes correctos foi designado pGCèll, O DMA tíe cadeia simples da fago pGCèll foi preparado a partir de E. coli estirpe RZi©32 e usado como molde para a ííiutagéness, Um sitio ds restrição Ndel foi introduzido por fliutagénese dirigida no extremo 55 do gene da estreptoquinase de tal forma o sitio Ndel se sobrepoe ao codão de iniciação da estreptoquinase, A mutagénese foi relacionada usando um 2á--msro BBS175 íS^-GATAhGTAATTTTTCATATGAATTCS-S5), CSEQ ID N0sl5>. Os DIMAs de cadeia simples foram preparados a partir de placas mutantes putativas e foram despistados por sequenciação didesoxi usando um iniciador de sequenciação 18 meros ΒΒ235Θ (55-“ChTBAGCAGB7CGTBATB—3? ) , (BEQ 1D NDslò) e um clone correcto pGC612 foi identificado,
Para construir um vector de expressão, o gene da estreptoquinase, portador do sito Ndel introduzido de novo, foi clonado no vector de expressão pBC517c Preparou-se SNA forma rsplicativaa partir de oGCéi2 e foi digerida com Ndel e BamHl e o fragmento de DNA Nrisl-Baml-il com aproximadamente 133© pb foi purificada sm gel. Este fragmento foi então ligado ao DMh de p6C517 tratado Ndel e BamHl, Os produtos tíe ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E= coli estripe uMÍ03„ Os transíormantes resistentes à arspicilina foram analisados preparando DNA de plasmideo, digerindo com as endonu™ clesses de restrição BqlI1 s BamHI e electroforese em gel de agarcse, Um dos clones correctos, pKJ2 foi verificado por análise de sequências didesoxi usando o iniciador de sequenciação BB2358, Este vector contem todo o gene da estreptoquinase incluindo a região líder do peptídeo sinal da estreptoquinase e foi usado para a expressão da estreptoquinase em E, coli. OS - B» Secreção usando o lidar Onipfi ds cg li
Como sinal cia secreção alternativo, uma sequência de DNA codificadora do principal paptídeo sinal da proteína A íOmpA) da membrana externa CumpAL) foi fundido com a sequência de DNA codificadora da proteína madura da estreptoquinase; ver SEQ ID NO; 17» Um fragmento de DNA codificador da estreptoquinase foi obtido por preparação da DNA do vectar pUC19SK, tratando o DNA com EcpRI e preenchendo os extremos de cadeia simples protuberan— tes com o fragmento KlenoH da DMA-palimsrase I para criar um fragmento de DNA linear ds extremos cerses- 0 fragmento foi em seguida digerido com BamHI e o fragmento de DNA extremo csrse--BamHI de 133o pb contendo o qene da estreptoquinase foi purificado em gel- A sequência de DMA codificadora ds OmpAL está disponível num vector de expressão pSD15= 0 vector pSD15 contem um gene codificador do gene do Factor de crscimsnto tipo insulina II ílBF-II) fundido com a sequência sinal de OmpAL- pBDlo foi depositado em E. coli K1.2 na National Collection of Industrial and Marins Bactéria Limited, 23 St» Machar Drive, Absrdeen5 AB2 1EY, Escócia, Reino Unido em 5 de Dezembro 199© com o NS de Acesso NCIMB 4®342» Para usar p8DÍ5 como vector para proporcionar a sequência de DNA OmpAL, o DNA da vector pSD15 foi tratado com Nhsl, os extremos de DNA ds cadeia simples proiubersntes foram preenchidos com o fragmento Klenow da DNA-polimsrase I para criar um fragmento de DNA linear com extremos cerses- 0 fragmento de dNA linear foi em seguida digerido com BamHI que removeu aproxi--madamente 123 pb do extremo 3? do gene IBF-IJ em pSD15 = Após digestão com sndonucleasss de restrição o fragmento ds DNA linear clivado foi tratado com fosfatase para evitar qualquer recircula— rização do DNA vector parcialmente cortado e foi purificado em gel, depcíis ligado ao fragmento de DNA extremo cerse-BamHI contendo o gene da estreptoquinase- A mistura liqada foi usada para transformar células competentes de E. coli estirpe i-We?» Os reeombinantes resistentes à ampicilina portadores do gene da estreptoquinase foram caraeterizados através da preparação do DMA de plasmideo5 análise com as sndonucleases ds restrição BaIII s HindiII s slactroforsse em gel de agarose. Uma construção do padrão electroforética carrecto foi designada pKul* 0 vector pi<Jl contem o DMA codificador de OmpAL e da estreptoquinase separados par uma região de DMA nlo necessária em construções posteriores„ A sequência da inserção de DMA em pJKl foi confirmada por análise de sequências didesoxi com um oligonucleótido de 44-meros BB5S C5? “hí3CTCGTA-ShCACTCTBC'AGTTC-STTT6T0GT6ACC6TS6CTT--"3? > SEQ ID NO 318o Para criar um DMA molde para a deleçlo da sequência de DMA indesejável através ds mutagénese por sscisão de ansas5 o fragmento de DMA Bq 111 a Hindi 11 do ps<Jl foi clonsdo num vector niSmpiYn 0 DMA do vector p!<Jl foi tratado com BqIII e Hindi11 para produzir um fragmento de DMA com sproK imadamente 1&2L· pbs o qual foi purificado em gel s ligado à região do poli “-adaptador da DMA forma replicativa de M13mpi9 tratado com BatnHI e HindiII= Os produtos de ligação foram usados para transfectar células competentes tíe És coli estirpe <311103·, Os DMAs de cadeia simples foram preparados a partir de placas recombinantes putativas e um clons correcto CpBCàOT) foi identificado por análise de sequências didssoKX usando α iniciador de sequenciação universal 1113 <SEQ ID ΝΟπΙΘ). A mutagénese no molde pGCá®® foi realizada usando um oligonucleótido iniciador de mutagénese 30-meros BB265B <5*~âCCSTA8CSCA8SCCATT6CTS8ACCTBAS-3s > SEQ ID N0si9. Os DMAs de cadeia simples foram preparados a partir de placas mutantes putativas e um clons, pSC6€>Ís contando a delação necessária foi identificado usando análise de sequenciação didesoKi com o iniciador ds sequenciação universal M13 CSEQ ID ΝΟ^ΙΘ). ρΒ06Θ1 contem parte da fusão OmpAL-estreptoquiriase necessária para a secreção ds estreptoquinase a partir deste peptidso sinal em E_=_ Λ X'.'
coll, mas a fracção C-terminal do gene da estreptoquinase sstá ausenta» Para reconstruir o gene da estreptoquinase? o DMA forma replicativa do p8C6©l foi digerido com as enzimas de restrição lidei e Hindi 11 e d fragmento de DNA Mdel-HindII1 contendo as sequências da DMA codificadoras a sequência do peptidso lider OmpAL fundida cqis a fracção N-tsrminal da estreptoquinase foi purificada em gel, 0 vector pKJ2 foi tratado com as enzimas de restrição Ndel e HindiII seguido de tratamento com fosfatase e o fragmento de DNA vector Ndel-HindiII com aproximadaments 3620 pb contendo as sequências essenciais do vector s a fracção C-termí-nal do gene da estreptoquinase foi purificado em gel» Os fragmentos de DNA Ndel-Hindi II de 81® pb <pBC6Ôl> s Mae I-Hindi II \pu!<2> de 362© pb purificados em gel foram ligados um ao outro s os produtos de ligação rscombinantss foram usados para transformar células cofispetentes de E, coli estirpe HWlIi© (laclg)» Os trans-íormantes resistentes è ampicilina foram despistados através da preparação de DMA de plasmídeo seguido de análise com as entíonu-cleases de restrição usando Ndel e HindiII, A slectroforese em gel de agrosa dos produtos de digestão foi usado para identificar um clone correcto que foi designado pLSCi,. A construção pLSCl foi verificada por análise de sequências diodesoxi usando um oligonu-clsótido de 17-meros BB2753 (53-GACACCAACC8TATCAT-3?), (SEQ ID N0s2©> para sequenciar através do sitio BamHIs o iniciador BB352© (UJ—CACTfiTCAGTASCAAAT—33>» CSEG ID M0s21)para sequenciar através da sequência codificadora do lider OmpA, 2) Expressão Intracelular em E,coli
Uma vez que a estreptoquinase não contem ligações dissulfureto não se verifica a necessidade de secreção para -estimular α enrolamento da proteína nativa s se bem que a estreptoquinase seja naturaliífsnte secretaria,: a expressão intracelular oferece várias potenciais vantagens tais como rendimento elevada
X © formação d© corpos de inclusão que possam facilitar a purificação * Como uma via de produção alternativa? projectou-se um vector de expressão para a produção intracelular de estraptoquinase em E. coli» 0 DMA codificador dos aminDácidos 2 a 21 da sequência do peptítíeo sinal GmpAL que foi fundido com a estreptaquinase madura em pBCò©l foi eliminado por mutagénese dirigida por sxcisão de ansas usando DMA de cadeia simples do pGC601 com um aligonucleó-tido de mutagénese 31-meros ΒΒ38Θ2 (5 ?~0AAATACTTACATATBATTGCT6GACCIBA6~35)P CSEQ ID NQs22). Para além da delecçSo da sequência codificadora do peptideo sinal3 ΒΒ38Φ2 fundiu o codSo metionina (ATS) da sequência do peptítíeo sinal OíispAL com o primeiro codão da estreptoquiriase madura para criar o extremo 5? do gene codificador d© uma proteína de fusão Kationil--estrsptQqiÃÍnase (ver 3EQ ID NO?235 « 0 codão ΑΤΘ foi usado para permitir a iniciação da tradução na posição correcta* Preparou-se DMA de cadeia simples a partir das placas ©utentes putativas e um cions contendo a mutação pretendida» ρ-Β06Θ2 foi identificado usando análise ds sequências didesoxi cora o iniciador de sequenciaçlo universal M13 /(SEQ ID NOsí©)» A fracção C-terminal do gene da estreptoquinase está ausente e«i ρΒ06θ2=, Para reconstruir a sequência codificadora da estreptoquinase Intacta madura5 o DMA forma rsplicativa de p8Cò®2 foi digerido com as enzimas de restrição Ndsl e HindiI1 e o fragmento de DMA Nd©I-HindiII com aproximadamente 755 pb contendo a fracção N-terminal do gene Ketionil-estreptoquinase purificado em gel e ligado ao fragmento de DMA vector Mdel-HindiIl do pL8C2 de aproximadamente 362© pb descrito no Exemplo 6 abaixo» A mistura ds ligação recombinanta foi usada para transformar células competentes de E.= coli estirpe HMiíí© (laclg) » Os transformantes resistentes à -ampicilina foram despistados pala preparação de DMA de plasmideo5 digestão com sntíonucleases de restrição e lectrofo— rese em gel de agarose» Idsntificou-se um clone com o padrão elsctroforético correcto após digestão com Mdel. e Hindi11,
V ρΘ06©3„ Ο vector pSC6©3 foi asado para a expressão intracelular ds MetiDnil-estrBptDquinase em E» coli estirpe HW11Í0» 3) Construção dos vsctorss de expressão para secreção ds estrep-toquinase derivados da levedura S. cerevisiae
Projectaram-se vsctorss de expressão para permitir a secreção ds estreptoquinase para o meio sxtracslular apés expressão em S» csrsvislag» A secreção de sstrsptoqulnass é desejável para facilitar a produção de proteína com um extremo N aut£niicoP para facilitar a purificação^ para limitar a protsólise intracelular e para redusir os potenciais efeitos tóxicos no hospedeiro levedura» A secreção da estreptoquiriass através da membrana de levedura foi dirigida pelo psptideo sinal da estrsptoquinass natural ou pela fusão da sstreptoquinase madura com o factor da conjugação tipo alfa de levedura <um psptideo de levedura naturalmente secretado) ver SEQ ID NQ524» H) Secreção da estreptoquinase usando o psptideo sinal da estreptoquinase 0 gene da estreptoquinase com o seu peptideo sinal natural foram danados no vector de expressão ds levedura pSW6 para permitir a sua expressão na levedura S» cerevisiae» Prepararam—se DNAs vedores de pKJ2 e pSWó da Preparação 2= Ambos os DMAs farãffi tratados com as ensimas ds restrição Bg_i.ll e BamHS e o fragmento de DMA com aproximadamente 142© pb do pKJ2 e o fragmento ds DMA vector de aproximadamente 746© do p8W6 foram purificados efit gel e ligado um ao outro» Os produtos de ligação recombi-nantes foram usados para transformar células competentes de E» Saii sstirps DH5 ΐsupE44. hsdRl?» rscAl, endAl» gvrA9è5 thi-1. rslAí > . mas poderá ser usada qualquer outra boa estirpe transfor-mante» Qs transforcnantes resistentes è. ampieilina foram 41 -· i fc
analisados através da preparação de DNAde plasmldeo* digestão com as endonueleases de restrição BamHI e Hindi11 ε electrofaress em gel de aqarose» Uni clone com o padrão electroforético corrscic pSnDl/lil foi usado para a expressão de estreptoquinase a partir do seu próprio pepildeo sinal na levedura S. carevisias. 0 vsctor de expressão em plasmídeo pSHDi/lil foi transferido para a levedura (S„ cerevisiae? estirpe BJ2Í63 de acordo com o método da Preparação 3= B) Secreção da estreptoquinase usando o líder da secreção do
p re~ p r0._pac r ,-J
Uma fusão de genes para permitir que o gene da estreptoquinase da Preparação 4 seja expresso em levedura a secretado pelo pre-pro-peptídeo do Factor de conjugação tipo a de levedura foi. prajsetsds e construída usando muiagénese dirigida e clonagem molecular ver SEQ ID N0s24= A construção envolveu mutagénsse para criar um gene de fusão factor «-estreptoquinase e clonagem molecular para reconstruir as sequências de DNA codificadoras da sequência da proteína estreptoquinase madura» DMA de cadeia simples do pBCé@© preparado a partir de E, coli estirpe RZ1032 foi usado como molde de mutagénese com o aliganucleótido de 30-meros BB3Ó24 < 5?-GTCCAAGCTAA8CTTBSATAAAAGAATTGCTGSACC-35)SEQ ID NQs25» DHAs de cadeia simples das placas mutantas putativas foram analisados por análise de sequências diassoxi usando o iniciador de sequenciaçlo universal (SEQ ID NOsie) e um elone muianie,, p8Cái4? com a sequência pretendida foi identificado» Em p8Cèl4 o peptldeo sinal de OmpA—lBFII—Estreptoquinase codificando sequências de pGCáó© foi eliminado e a sequência de ligação do factor « codificando os- 5 aminoácidos C·—terminais do pro— peptid-eo do factor a descrito na Preparação 2 foi inserido» Para. reconstruir o gene da estreptoquinase num vector de expressão em levedura9 foram necessárias duas fases de manipulação genética»
Primeira a fraeção C-terminal do gene da estreptoquinass foi clonada num vector de expressão de levedura e esta nova consttru-çlo foi usada para clonar na extremo M-terminal a fraeção de fusão fsetor cc-estrepioquinase do gene, reconstruindo assim a região codificadora da estreptoquinass madura fundida com o gene do pro-pre-peptideo do factor «= Os DMAs vsetores do pKJ2 s pSWfe (Preparação 2) foram preparados e digeridos com HindiII e BamHí e o fragmento de DMA de sproximadament.© 4B5 pb do ρΚ32 e o fragmento de DMA vector de aproximadamente 7750 pb do p3W6 foram purificados em gel e ligados» Os produtos de ligação reeombinantes foram usados para transformar células competentes de £» coli estirpe DH5» Os transformantes resistentes à ampicilina foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo3 digestão com as endonucleases de restrição Hindi11 e SamHI e electroforese em gel de agarose» Isolou-se um clons com α padrão elec troforético correcto pSÍÍD.t/119» Ele contem a fraeção C-terminal de um gene da estreptoquinass clanado num vector de expressão em levedura» A fraeção N-terminal do gene da estreptoquinass e a sequência do adaptador do factor α foram em seguida clonados era pSoDi/i. Í9» A foram replioativa do DNA de p6C614 foi preparada e tratada com HindiII e ligado ao DNA do vector pSMDl/119 que tinha sido tratado com HindiII e com fosf ata.se» Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E» coli estirpe DH5* Os transformantes resistentes à ampicili-na foram despistados pela preparação de DNA de plasraideo» análise com a endonuclsase de restrição Dral e electroforsss em gel de sgarose» Um clons com o padrão electroforético correcto pSHDi/152 deu produtos de digestão Dral de aproximadsmente 475Θ, 194β5 152 e 70Ô pb tíe comprimento» pSMDl/152 foi usado para a expressão e secreção de estreptoquinass usando a pre-pro-sequência do factor α da levedura 5» csrevisiae» 0 vector de expressão plssmideo pSHDl/152 foi transferido para levedura CS» cerevisiae) estirpe BJ216S de acordo com o método da Preparação 5«
bXfeMPLQ 5..- Construção de um gene.....codificador_dejuma_......aroteiria, gsto£iia^Mâ^_tj::unc5^
Projectou-ss um gens codificador ds uma molécula truncada ds metionil-estreptoquínase (aa íò-383) s construiu-ss através de deleçSes dirigidas por excisão de ansas usando alago-nuclsétidos s clonagem molecularf ver SEQ ID !MCh26« DMA codificador dos aiuinoácidos Ξ a 21 da sequência sinal OmpAL? o DNfi codificador ds IGF-IIS o DMA codificador do peptídao sinal da estreptoquinase e os 15 primeiros aminoácidos da proteína estrep-toquinass madura em pGCé©© do Exemplo 4 foram eliminados por mutagéness através de excisSo de ansas usando um oligonuclsótido 33-meros BB38é2s 53-GAAATACTTACbTATGbSCCAATTA8TT6TTA8-3? i SEQ ID NO?27= Preparou-se DNA de cadeia simples a partir ds células E. coli RZI032 infectadas com pBCá©© e usou-se como molde para a mutagéness com iniciador BB3B&2» Preparou-se DMA ds cadeia simples a partir de placas mutantes putativas s um clone pGCò®4 contendo a deleçSo pretendida foi identificado por analise ds sequências didesoxi usando o iniciador de sequenciaçlo universal Μ13 íSEQ ÍD MOs Í0> *
Os aminoácidos 384 a 414 foram eliminados tía estrepto-quinass por mutagénese com remoção ds ansas usando um oligonu™ cleótido 28—meros ΒΒ39Θ4? 5?-0088688ΑΤ00ΤΤΑ880ΤΑΑηΤ8ΑΤη88-35p SEQ ID N0s28= 0 molde para a mutagénese foi DNA de cadeia simples ds H13uKi do Exemplo 1# contendo um fragmento ds DNA HindiII-BamW ds ca* 5Φ0 pb codificador do extremo 35 da sstreptoquinase do pUClvSKda Preparação 4= Preparou-se DNA de cadeia simples das colónias mutsntes putativas e um clone p8C6®5 contendo a deleçSo pretendida foi identificado por análise de sequências didesoxi usando o iniciador da sequenciaçSo universal Í1i3 (SEQ ID Nu?í©) = A malseula de estreptoquinase central Intacta fai reconstruída a partir das duas metades ®utagsniçadas através de uma ligação em dois passos incorporando o fragmento de DMA Ndel-HxndlII do pGC6®4 (contendo a fraeçao M-terminal da molécula central da estreptoquinase) e o fragmento de DNA Hindi I I-BamHI do pBCòôS (contendo a fraeçao C-terminai da molécula central da estreptoquinase) no DMA vsetor pLGC2 do Exemplo 6 abaixo» Primeiro o DMA de ρ606θ4 foi digerida com Ndel e HindiII» Um fragmenta de DMA com aproximadamente 71© pb foi purificado em gel» Preparou-se DMA vector a partir de pi_SC2 do Exemplo 6 e tratado com Ndel e Hindi11 e com fosfatase» 0 DNA vector linear foi purificado em gel s os dois fragmentos foram ligados um ao outro» Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E» coli estirpe HWiiiô» Os transformantss resistentes à ampicilina foram despistados quanto ao cone pretendido através da preparação de DNA de plasinideQj análise com as endonucleases de restrição Ndel e HindiII seguido de elactrofore-se em gel de agarose dos produtos de digestão» Foi identificada uma construção com o padrão electroforético correcta3 pOC617»
Para clonar a fraeção C-terminalP d mesmo DNA vector (pL.8C2> foi tratado com Hindi11 e Ba?nHI e com fosfatase» 0 DMA da p8Cé©5 foi tratado com HindiII e BamHI e um fragmento de DMA de aproxifísãdamente 4Θ2 pb foi purificado em gel e ligado ao DNA do vector pl_6C2 tratado com Hindi 11 e BamHI» Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E» coli estirpe HW1I1©» Os transformantes resistentes à ampicilina foram despistados relativamente ao clone pretendido através da preparção de DNA de plasmideo5 análise com as sndonu-clesses de restrição BamHI e HindiII e electroforese em gel de agarose dos produtos de digestão» Identificou-se uma construção com o padrão electroforético correcto pSCólS» Finalmsníea para reconstruir d gene da molécula central Intacta da estreptoquinase a partir das duas- metades5 DMA ds pb'C'èi7 foi tratada com Hindi II e BamHI e o fragmento Hindi11-BamHI de aproK imadamente 402 pb- do pBCoíS ligado a ele. OH-f\ de pGCèiS foi digerido com Hind111 e BamHI e um fragmento de DNA HindiII-BmHl de aproKimadamente 4Θ2 pb foi purificado em gel. DMA do vscior pSCéi? foi também tratado com HindiII e BamHI e um fragmento d© DMA HindiII-BamHI de aproMimadamente 4ô2 pb do pGCèiS foi ligado a ele. Os produtos de ligação foram usados par-a transformar células- competentes de E. coii estirpe ΗΜϊίΙΘ. Os transformar,tes resistentes à ampicilina foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo, análise com as encimas de restrição BamHI e HindiII e electrofa-rese em gel de agarose. Identificou—se uma construção correcta, p*.'iCÒ0Ó . EXEjIFLU.......6.....- Construção de. vectores.de ..©kpressão,,.contendo um ......gene de fusão estreptoquinase-estreptoguinase clivável pela tromhina í) Construção de um vecior de secreção para a expressão de uma fusão estreptoquinase-estreptoquinase clivável pela trombina
Projectou-se um gene codificador da fusão estreptoqui-nase-sstreptoquínase ligado pela sequtncia ds ligação clivável pela trombina VELQBVVPRB» itíãntica ao sitio de clivagem pela trombina no factor XIII a construiu-se por mutagéness dirigida e cionagem molecular SEG ID M0s29. Um fragmento de DNA Ecofil-BaroHI de aprοκxmadamenta 1335 pb contendo um gene da estreptoquinass foi purificado em gel após tratamento do DMA vector PUC19SK da Preparação 4 com EçoRI e BamHI. Um segundo segmento de DMA codificador de um gene da estreptoquinass foi purificado em gel após digestão com BqIII e SalI do DwA vector pKdi do Exemplo 4. Realisou-se uma ligação trimolecular sntre estes dois fragmentos e DMA do vector pGCol7 tratado com EcoRI e SalI descrito no
Exemplo 4secção ÍA= Os produtos ds ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E* coli estirpe HWiliô (1aqIq)* Os transformantes resistentes è smpicilina foram despistados através da preparação de DMA de pissmxdeo» análise com as snaonuúlaassã de restrição EcoRX e SalI e electroforsss em gel de agarosa* Foi identificado um clons com o padrão slecirofo-rètico correcto <pBD93>:= pSD93 contem duas cópias em tandem do gene da estreptoquinase separadas por uma ssqu/lncia contendo o sitio de ligação ao ribossoma do gene 01I do hacteriófago lambda e codificador da sequência do peptídeo sinal OmpAs a sequência do petideo sinal da estreptoquinase e a parte 5r' da sequência de ISF-II derivada de pKJl* Para remover esta sequência interveniente indesejável e substitui-la com a sequência de ligação pretendida ciivável pela trombina uma parte do p3D93 foi transferida para um vsetor de isutagénese H13 para mutagÉness* DMA do plasmí-deo pSD93 foi digerido com Hindi11 s um fragmento de DMA com cerca de 153Θ pb purificado em gel e ligado ao DMA forma rsplica-tiva fH3mpl8 tratado com HindiII e com fosfatase* Os produtos de ligação recoflíbinantes foram usados para transformar células competentes de E» coli estirpe JM103* Existem duas orientações possíveis dos fragmentos nesta construção* A orientação dos cionss foi determinada pela preparação de DMA forma replicstiva e análise dos fragmentos de DMA produzidas após digestão com Xinnl e purificados por electroforess em gel de agarose= Um dos clones pSD95 que continha o fragmento numa orientação invertida (evitando assim a tradução devido à fusão ao fragmento α da fs-galactosi— dase expressa a partir do vsetor de mutagénese M135 foi usada para mutagénese* 0 DMA molde ds cadeia simples foi preparado a partir de pSD95 s usado para mutagénese dirigida* 0 iniciador usado foi um oliqonucleõtido de 63—meros BB293Ss í 3 ?-6ATAACCCTAAC8ACAAAGTA6A6CTBCAG6GA8TAGTTCCTCGTBGAATT6CTG8ACCT-8AB“3?> CSEQ ID N0s3©> projectado de forma a remover por excisão de snsas o sitio de ligação aos ribossomas do gene CII= a sequência IBF-Ιϊ de QmpALj a sequência do peptídeo sinal da
estraptoquinase- em pSD95 s a inserir uma sequência de DNA codificadora de uma sequência de aminoácidos clivável pela trombina* Frapraram-ss DNAs de cadeia simples a partir de placas muiantss putativas e identificou-se um mutante correcto pGC6ô7 usando análise de sequências clidssoxi com Q iniciador BB2753 (SEO ID M0s2®) do Exemplo 4= Preparou-se DNA forma replicativa do pBC6®7 e digeriu-se com HindIII ε o fragmenta ds DNA HindiII de aproxi-madamente 1277 pb foi purificado em gel e ligado ao DNA vector de pLGC! do Exemplo 4 tratado com HindiII s com fosfatase, Os produtos de ligação recomhínantes foram usados para transformar células competentes de E» coli estirpe HWlll©» Os tr-ansformantes resistentes à ampicilina foram despistados através da preparação de DNA ds plasmídeo5 análise com a endonucleasa de restrição HindiII s electroforese em gel de agaross» Esta clonagem reconstitui o gene codificador ds ds uma fusão estreptoquinass-estrap-toquinase clivável pela trombina» Um clonae (pLBC2) portador da inserção na orientação corrscta foi identificado por análise de sequências tiidesoxi usando os iniciadores HB2754 < 59-BCTATC8BTSACACCAT-39) BEO ÍD NDs31 E BB3&39 C55-BCTBCfiBB6ABTA8TTC~35> SEO ID N0ê32» pLBC2 foi usado para a expressão da proteina de fusão sstreptoquinase—estreptoquinass clivável pela trombina em E, coli Htli 11Φ„ 2) Construção de um vector para a expressão intracelular de um gene de fusão estreptoquinase-estreptoquina.se clivável pela trombina
Projectou-se um gene de metionil-estreptoquinase—estrep— toquinase clivável pela trombina e construiu-se por clonagem molecular» O gene foi construído a partir do gene da metionil-es-trsptoquinase do Exempla 4 e do fragmento de DNA HindiII do pBC607 do Exemplo 6, que contem a fracção C-terminal de uma molécula de estrsptoquinaseuma. sequência de ligação clivável pela trombina © uma fracção N-terminsl de um gene da estreptoqui-nase.
Preparou—se DMA forma replicativa do pSC6®7 s digeriu— "se com Hindixτ q fragmento de DMA HindiII de aproximatíamente 1277 pb foi purificado em gel e ligado ao DMA vsctor de p6C603 do Exemplo 5 tratado com HindiII © com fosfatas©. Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E. coli estirpe Hwlii® (lado), Os transformantss resistentes á ampicilina foram despistados através da preparação de DMA de plasmídeo., análise com as sndonucleasss de restrição HindiII ;= BamHI s PstI e electroforese em gel de agaross dos produtos de digestão. Uma construção com o padrão electroforético correcto. pL6C3P foi usadci para a expressão intracelular de uma proteína da fusão metionil-estreptoquinase-estreptoquinase. EXEMPLO 7 - Construção de um gene de fusão_estreptoguinase PMltral.rj^.treptonuin^^_cgntral clivável pela .trombina
Um gene codificador tíe uma metianil—estreptoquinase csntral-estreptoquinase central ligados por uma sequfncia de ligação clivável pela trombina vELQGvVPR8P idêntica à do sítio de clivagem pala trombina no Factor XIII5 foi projectado e construído por mutagêness dirigida © clonsgem molecular ver SEQ ID N0n33„ 0 gana da fusão estreptoquinsse central-estreptaquinass central foi construído a partir do gene do monémsro da estreptoquinase cantral do Exemplo 5 e um fragmento tíe DMA fíindIII contendo a frasgão C-terminal de um gene da estreptoquinass centralP uma sequência de ligação clivável pela trombina e uma fracção M—terminal de um gene da estreptoquinass central,, Para construir o fragmento HindiII contendo as deleçSes adequadas e uma sequência de ligação clivável pela trombina. pGCò®7 do Exemplo 6 foi usado
como molde para a mutagénesa dirigida com oligonuclsótidos» Um oligonueleótido òl-iiieros BB3Bèls í 5 5 -~BCThTCATTabccbtabasctbcabbbabtabttcctcbtbbaabccaattabttbtt ab--35) SEQ 1D N0o34 foi usado para eliminar ce aminoáeidos 3B4 a 414 da estreptoquinase? para reconstruir a sequência de ligação J clivávei pela trombina VELQBVVPRB e para eliminar os 15 primeiros aminoácidos do extremo N da estreptoquinase» Preparou-se DMA de cadeia simples a partir de placas mutantes putativas e um clone carrecto5 pBCé®85 foi identificado por análise de sequfncias didesoxi usando o iniciador de sequenciaçlo BB2753 do exemplo 8= J Preparou-se DMA forma raplicativa a partir de pBC&GS e usou-se noutras construções»
Para construir uma íusSo de metionil-estreptoquinase central intacta-ssirepioquinasa5 DMA de p8Cé#8 foi tratado com Hindi11 e o fragmento de DMA HindiII de aproximatíamente 114# contendo a fracçlo C-terminal da molécula de sstreptoquinase central5 a sequência de lisaçao clivàvel pela trombina e a fracçlo N-terminal de uma molécula de sstreptoquinase central? foi purificado em gel e ligado ao DMA vector de ρΒοώθό do Exemplo 5 após tratamento com HindiII e com fosfatase» Os produtos de Igaçao rscomhinantes foram usados para transformar células competentes de E,, coli estirpe HWÍ1 íΘ (1 aqIo). Os transformantes ^ resistentes à ampicilina foram analisados por zisnograíia como descrito no Exemplo 11 abaixo» Identificou-se um clone correcto PLS04« J £*BIELP_g-^.....Cgnstruclo de um qene de fuslo Hirudina-IEBR-Estrep- toquinase çlivAveJLjjelo Façtor, Ka
Projectou—se uma fusão de hirudina—estreptoquinase em que uma molécula ds hirudina de tamanho completo é ligada a >-v
X srtrsptoquinase de tamanho completa via uma sequência de ligação XEBR clivável pelo factor Xa| ver SED ID H0s3S. 0 gene codifica-dar da proteína hirudina-astrepioquinase foi construído por mutagénese dirigida e clonage® molecular . Para justapor os genes da hirudina e estreptoquinase5 os fragmentos de DNA codificadores destes genes foram ligados uns aos outros. 0 gene da estreploqui-*· nase derivado do plasmideo pKJ2 do Exemplo 4 foi isolada por purificação em gel de um fragmento de DNA de aproximadamente 1.4 kpb após digestão do DNA vector p!<J2 com BqlII e BamHI. Este fragmento de DNA contem todo o gene da estreptoquinase juntamente com α DNA codificador da sequência os psptídeo sinal da estrepto-quinase. Este fragmento de DNA foi então ligado ao DNA de pJKl tratado com BamHI da Preparação 2 que contem a sequência de DNA codificadora da hirudina. Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E. coli estirpe Hklill® Claçlq). Os transformantes resistentes â ampici-lina foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo. análise com a endonuclease de restrição HindiII e eleclroforese em gel de aqsross dos produtos de digestão. Existem duas orientações possíveis para a inserção nesta clonagem e os clones correc-tos foram idsntifiçados como os que dão origem a um fragmento de DNA de aproKimadamente 1Θ8® pb após digestão com HindiII como analisado em géis tíe agarose. Um desses clones odi<35 que cantem a gene da hirudina separado do gene da estreptoquinase pela sequência sinal da estreptoquinase^ foi usado em manipulações subsequentes < Para criar um molde para mutagénese para eliminar as sequências intervinlentes e para inserir a sequência de ligação clivável pelo factor Xs, a fracçção hirudina—estreptoquinase cio pJK3 foi transferida para um vector tíe mutagénese Mi3mpi8. DNA do plasmideo puK3 foi digerido com Kon1 e BaaHI e o fragmento de DNA de aprawimadsínsnte 1490 pb purificado em gel s ligado ao DNA forma replicativa de nlSmplB tratado com Konl e BamHI. Os produtos de ligação recombinsntes foram usados para transformar
's.' células coííipstentes de E» coli JM1©3= Preparou-se DMA de cadeia simples a partir de placas recombinantes putativas e identificou-•ss um dons carrscto pSMDi/ΙΘΘ (l = i)« Para eliminar a sequência do peptideo sinal da estreptoquinase e para inserir a sequência de ligação do factor Xa usou-se DMA da cadeia simples do pBMDl/l©0 (1Λ) usou-se como molde para mutagénese com um oligo-nuclaótido de 46~meros BB3317s í 5?-CACTCASGTCChGChATTCTACCTTC8hTCTGCASATATTCTTCTS-3“) SEQ í D l\!0s36 = Preparou-se DMA de cadeia simples das placas mutantes putativas e um mutante pBCòíS foi identificado por análise da sequência de DNA usando o iniciador de sequenciacão BB3510 (5?-ChCTATCABTABCAAAT-35) 8EQ ID N0s37= pOCèlS contem a fracção C-terisinal do gsns da hirudina ligada à sequência codificadora da estreptoquinase madura* Para reconstruir o gene da hirudina, DMA foram rspiícativa do pSC615 foi tratado com Kpnl e BaffiHI B α fragmento de DMA de aproximadamenie 132© pb purificado em gel e ligado a puCO© tratado com Kpnl e Bamlil da Preparação 2* Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E* coli estirpe DH5» Os transformantes resistentes á ampicilina foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo, análise com as endonucleases de restrição Kpnl =, BamHI e Hindi II e electroforese em gel de agsrose» Identificou-se um clone com o padrao electroforético correcto, pStlD 1/137* Este plasmideo contem DNA codificador da molécula completa as fusão hirudina-estreptoquinass clivável pelo factor Xa * ÊMffiyLJE__=L--£gpstrucão ........de.....um............yectpr para a expressão de uma !Ii2ÍÉ£iLÍs„„ds._fusão hirudina_-lEBR-estreptocminase clivável,..........pelo
Factor Xa
Para construir um vector para a expressão do gene da hirudina-IEGR-estreptoquinase, DNA de p8MDl/í39 do Exemplo 8 foi
tratado cqííí Hindi11 e um fragmento de DNA de aproximadamante 963 pb codificador de parte do sinal de'secreção do factor alfa de levedura, toda a hirudina, a sequência de ligação da factor Xa e a parte 5? da estreptoquinase assim como o sitio interno Hindi11 na sequência da estreptoquinase foi purificado em gel. Este fragmento foi então ligado ao DMA de pSíiDl/119 do Exemplo 6 tratado com HindiΣI e com fosfatase. Os produtos de ligação reconibinantes foram usados para transformar células competentes de E- coli estirpe DH5= Os transformantes resistentes à ampicili-na foram despistados através da preparação de DMA de plasmideo, análise com as endonucleases de restrição Kpnl e BamHI e electro-forese em gel de agarose. ú possível obter duas orientações da inserção HindiII s identificou-se um cíone na orientação correcta pSHDl/146 coíbo dando origem a um fragmento de aproximadamenta 1311 pb apõs clivagem com Kpnl e BamHI. pSMDl/146 contem o qens de fusão de tamanho completo sob o controle do promotor PAL regulável descrito na Preparação 2 e foi projsctatío para a expressão regulada e secreção da proteína de fusão hiruaina-es-treptoquinase clivável pelo Factor Ka= Preparou-se DMA de plasmi-deo pSnDl/146 e usou-se para transformar a estirpe de levedura BJ2168 de acordo com o método de Sherman, F= et ai», (Methods in Yeast Genetics, Colo Spring Harbor (1986)>. ......de.......f usgq_ es t rsp toou i n ase-1EGR- ZΪÚrMâMm-J=JJúíÈmL·JiEly IjaztarJla_B_S8u. j^çtor_de__e>tpressão.
Uni gene codificador da proteína de fusão estrsptoquina-se-hirudina ligado via um sitio de clivagem pelo Factor Xa CIEBR) foi construído por muiagénese dirigida e clonagem molecular SEQ ID MOs38. Para justapor os genes da hirudina e estreptoquinase, fragmentos de DMA codificadores destes dois genes foram ligados uns aos outros. Preparou-se DMA vector pUC19SK da Preparação 4 e tratou-se com HindIII e BamHI e o fragmento de DMA com X'-'' aproximadamente 485 pb contendo o extremo 3? do gene da estrepto-quinase foi purificado em gsL Este fragmento foi ligado ao DNA forma replicativa de M13sspi9 tratado com Hindi 11 e BamHI» A mistura de ligação recombinante foi usada para transfectar células competentes de E» coli estirpe JH103» Preparou-se DNA de cadeia simples a partir de placas recombinantes putativas e o clone necessário M13JKÍ identificado por análise ds sequências didesoxi usando o iniciador de sequenciaçlo universal M13 C8EQ ID NO» 1Φ) » H13JK contam a fracçSo U—terminal do gene da estreptoqui— nass. 0 gene do factor a e hirudina foi então clonado em M13JK1 para justapor ambas as sequfncias» DNA do plasmideo pJKl da Preparação 2 foi digerido com Bq 111 s Bamf-II e um fragmento de DNA de aproKimadaments 465 pb codificador da fusão factor q-hirudina foi purificado em gel» Este fragmento de DNA foi então ligado à forma ao DNA forma replicativa do M13JK1 tratado com BamHI » Os produtos ds ligação recombinantss foram usados para transformar células competentes ds E. coli estirpe =3Η1Θ3» Preparou-ss DNA de cadeia simples a partir ds placas recombinantes putativas e idísntif icou-se um clone correcto SliDl/i@0,.3 por análise de sequências didesoxi usando um iniciador tíe sequenciaçao universal f!13 SEQ ID NOgiô» SMDl/lô0»3 contem a fracção C-terminai do gene da estreptoquinase e α gene completo da hirudina separado pela sequência codificadora descrita na Preparação 2» Para eliminar esta sequência e substitui-la com uma sequência de ligação clivávsl pelo factor Xas SiiD 1 /1ΦΘ»3 foi usado como molde para a mutaoâness dirigida» Preparou-se DNA de cadeia simples de BHDÍ/100=3 e usou-se para mutagénese usando um iniciador de mutagénese de 47-meros BB3318= (59-TCGGTSTAAACAftCTCTTCT ACCTTCSATTTTGTCGTT ASSGTT ATC-35) SEQ ID NQs40» Preparou-se DNA de cadeia simples a partir de placas mutantes e a mutação pretendida pSCàló identificada pela análise de sequências didesoxi usando o iniciador de sequenciação BB2®18s
(5 ?”BCBGCTTTBBBBTACCTTCfiCCASTBACACATTG8"3?) ÍSEQ ID N0s2). pSCélè contem uma mutação adicional introdueida inadverfcidamente paio processo ds mutagéness» Este DMA foi corrigido por um outro passo ds mutagénese. Preparou-se DMA da cadsia simples de 0GC6I6 a usQu-ss como molde para mutagénese com um oligonucleótido 2í—meros BB3623 (5 ?-6TBTAAACAACTCTACCTTCB~33 > SEQ ID NOs40» Preparou--se DMA ds cadsia simples a partir de placas mutantes putativas e identificada a mutação pretendida pBC620 por análise de sequências didesoxi com o iniciador de ssquenciaeão ΒΒ2Θ18 (3EB ID N0s2>. pBCé2® contem a fracção C~terminal do gene da estreptoqui— nass ε o gene completo da hirudina fundido através de um DMA codificador de uma sequência de ligação clivável pelo factor Xa. O gene de fusão Intacta de estreatoQuinase-hirudina clivável pelo factor Xa foi reconstituido em dois passos. A ssqutncis C—terminal tía estreptoquinas-hirudina do p8C616 foi clonado no vector de ewprssslo de levedura pBWè da Preparação 2 s depois a fracção N-terminal da estreptoquinass foi clonada no novo vector para criar o gene de fusão de tamanho completo esireptoquinase—hirudina. DMA forma replicativa do pGCò2ô foi tratado com HindixI e BamHI e um fragmento de DMA HlndllI-BamHI ds aproximadamente 71® pb codificador do extremo 35 da estreptoquinass^ a sequência de de DMA de Xifqaçlo clivável pelo factor Xa e todo o gene da Hirudina foi purificado em gel. Este fragmento de DNA de aproxi— madamenie 71Θ pb foi ligado a pSWé da Preparação 2 digerido com HindiIX e BamHI. Os produtos ds Ligação recombinantss foram usados para transformar células competentes ds E. coll estirpe DH5. Os transiormantss resistentes ã. ampicilina foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo? análise com as endonut— clsases de restrição HindiII e BamHI e electroforsse em gel ds agarose. Identificou—se um clone com o padrão electroforético correctOj pSMDl/143. 0 gene ds fusão intacto foi então construido
par clonagsm da fracçSo N-terminal ds factar a—estreptoquinase em pSnDl/143= DMA forma replicativa do p6C614 do Exemplo 4 foi tratada com Hindi IX s o fragmento ds DNA de aproximadamente 75Θ pb contendo a fracçSo M—terminai do factor s-estreptoquinase purificada em gel ε ligado ao DNA do vector p3MDl/143 tratado com HindiII e com fasfatase„ Os produtos de ligação recombinantes foram usados para transformar células competentes de E*_coli estirpe DH5 = Os transformantes resistentes á ampicilins foram despistados através da preparação de DNA de plasmideo. análise com a endonuclesse de restrição Dral e elsctroforese em gel de agarose., Identificou-se um clone na orientação correcta? pSHDl/159 que deu origem a 4 fragmentos de tamanhos aproximados 4750 pb5 2140 pbj 1526 pb e 692 pb apás digestão com Dral
Usou-se pSMB/159 para a expressão da proteína de fusão sstrepto-qainass-hirudina clivàvel pelo factar Xa= Preparou-se DNA de plasmídeo pSHDl/159 e usou-se para transformar leveduras da estirpe BJ2168 segundo o método de ShermanF= et al = ? Crlgthods in Yeast Benetics3 Coltí Spring Harbour Laboratory C19S6)>„ 36 36
EXEilrLU 11-- fcxpregsgo.....de........construções de monómeros......de__estr^Bto- guinase
Expressão Células competentes ds E. coli estirpe JH1®3 foram trarisformadas com DNA dos vsctores de expressão da sstreptoquina-se dos Exemplos 4s -5s 6 e 7= 0 gene laciq no hospedeiro de expressão dsstina~ss a reprimir a transcrição a partir do promotor tac usado em todas as construções de expressão em E. coli. Todos os meios para α crescimento de estirpes recomhinantss tíe E, coli foram como descrito em Maniatis et al„ Usando frascos de agitação ds i litro, culturas de E. coli recombinante contenda vsctorss de expressão da estrsptoquinase foram cultivadas em lotes de 25Θ ml ds meio 2TY contenda 1ΘΘ pg/ml ds carbenicilina a 37C‘C num agitador orbital. A densidade óptica das culturas foi controlada a 6&& nns= Quando a cultura atingiu uma DO a 6ΘΘ nm de ΰ?5 foi induzida a expressão a partir do promotor tac pela adíçSo ds isopropil-ii-D-tiogalactosida <IPTO) para uma concentração final ds I mii. Após crescimento durante 3Φ a 24® min as células foram colhidas por centrifugação.
Separação por SDS-PASE A capacidade das células reeombinantss de E. coli para expressarem estreptoquinass foi testada usando simografia= A quantidade e peso molecular da sctividads da estrsptoquinase de uma cultura ds E. coli foi calculado pela protocolo que se segue. Retirou-se uma amostra de í ml da cultura, as células foram colhidas por centrifugação (14 ΘΘΘ xg) durante 5 mins e ressus-pensas em 2&& μΐ de tampão de aplicação (125 m"rt Tris.HCI pH ·&,S, 1Θ% de glicerol(p/y)? ®5Θ1% (ρ/ν) de azul de bromofeno!5 1% <v/v) de 2-mercaptoetanol, ureia éli) . Uma amostra desta mistura foi. aplicada num gel de SDS-PA8E e a proteína separada por slectrofo-rsss» A quantidade de proteína aplicada no gel variou alterando o tamanho da amostra de acorda com a densidade óptica da cultura quando da colheita» Seralmente* 1θ μΐ da mistura de uma cultura de DO a 6Θ& nm de i3® foi usado para cada fsisa,
Zimografia
Após electroforese o gel de poliacrilamida foi lavado sm 2¾ Cp/v) de Triton Χ-1ΘΘ <3x2® mins) seguida de lavagens com água í3 κ 2® mins) para remover o BD8 e permitir a renaturaçSo da molécula de ssireptoquinass» 0 gel de SDS-PABE lavado foi enteio coberto com uma mistura de sgarose como se segue» 2®® mg de agaross foi dissolvida em IS ml de água destilada e dssioniaada CdH^D) e deixada arrefecer até 55-è®°C» A isto adicionou-se 2Θ© mg da caseína MARVEL (marca registada) dissolvida em 2 ml de dH,.,0, 1 ml de 1M Tris»HCl oH 8,® s ò&& u 1 de 511 NaCl« Imediata- i ... mente antes de verter sobre o gsl de SDS-PABE lavadoP adieionou--se 7Θ® μΐ tíe plasminogénio a 3ΘΘ pg/ml (Sigma P--7397 1® mg/ml em 5Θ mW Tris = HCJ. pH 7a5> e misturou—se bem» A mistura foi vertida sobre α gel s depois incubada a 37°C durante 2 horas quando foi então observado» A actividade de activador do plasminogénio (actividade da estreptoquínase) foi detsetada através digestão pela plasmina da camada opaca contendo caseína CHARVELs marca registada de Premiar Brands, U = K= Ltd= P = 0» Box 171, Birminghain, Β3Θ 2MA, U»K») o que produsiu eonas claras» A posição das sonas no gsl foi dirsctamsnte relacionada com o tamanho das moléculas activas„
As estirpes rscorabir-antss de E» coli JM1®3 contendo vectores para a expressão de monómsros de estneptaquinase pl<J2 do Exemplo 4 e pLGCi do Exemplo 4 expressaram ambas a actividade de
,nC \ estreptoquinass com um peso molecular de apraximadamente 47 KDa (Figura 5)* EXfeMPLP 12..-.....Expressão.....da proteína de fusão esirsotoguínasg-es-" treptoguinase.cliyável pela trombina
Uma estirpe rseorabinante de E*_____coli BWlil© (laqlq) contenda pLSC2 do Exempla é5 o gene de fusão da estreptoquinâ--·· se-estreptoquinase clivável pela tromhina5 foi expressa e analisada de acordo com protocolos ds expressão s cimografia do Exemplo 6= A estirpe de E, coli uHl®3/pLBC2 expressou actividades de sstrsptoquinass ds vários pesos moleculares, predoiainantsmente de li® KDa e 47 KDa (Figura 5> = A análise por clivagem foi como decrito no Exemplo 13 abaixo* EXEnPLO 13 - Clivagem pela tomhina da proteina de fusão estrepto-q u i n ass-ss tre ρ toq u i nase,_c 1 ivával. pela trombina
Usando frascos de agitação de í litro;i uma cultura de 3 litros ds E* coli J11103 contendo pL8C2 do Exemplo 6 foi cultivada em lotes de 5ΦΘ ml em meio 2TY contendo 1ΘΘ mcg/ml de carbeni-cilina a 37°C com agitação vigorosa num agitador orbital* Quando a densidade éptica das culturas atingiu uma DnO = a 6ΘΘ nm de 0;i3 a expressão da proteína ds fusão estreptoquinase-estreptoquinase foi indusida pela adição de IPTB para uma concentração final ds 1 mil* As culturas foram incubadas a 37 °C cora agitação vigorosa durante mais 4 horas quando foram colhidas por centrifugação a 8 Θ0Θ rpm durante 1& mins* As células foram rsssuspensas em 1Θ ml de tampão TS arrefecido em gelo (1© mil Tris=HCl pH 7,55 2Θ% (p/v> sacarose)* Adicionou-se 348 μ! de 0P5M EDTA s a mistura foi incubada em gelo durante I® sins * As células foram colhidas por centrifugação a 8 ΘΘΘ rpm durante 5 min a 4°C e o sobrenadante foi rejeitado* As células foram ressupensas em ò*25 ml de H,,D
estéril arrefecido em gelo e incubado em gelo durante i© min= As células foram colhidas por centrifugação a 8 ®ΘΘ rpm durante 5 min a 15 ©ΘΘ q durante 3Θ min a 4°C e α sobrenadam te rejeitado., As células foram rsssuspensas em 48 ml de tampão AR6 <2@ mli TrisJ-JCl pH 7,,5,, 1Θ mH MqCl^5 1© mn 2~B-ffisrcâptastanol, 0 = 5 niM fluoreto de fenilmetilsulfonilo;, 12 meu N-tosí1-L-fenilalanina clorometilcetona) e sonicadas em gela C6 pulsas de 3® seg« na potência máxima,, MSE SQNIPREP 15Θ (marca registada)>„ As células sonicadas foram centrifugadas a 15@βθ g durante 3® min a 4°C. 0 sabrsnadante foi decantada s testado quanto à actividade de estrsptoquinase usando o ensaio cromogénico S2251 (KabiVitrum L.td? Kabivitruffi House? Rivsrside Way5 Uxbridge? Mitídlesex 3 UB8 2YF? UK) para a activação do plasminagénio pela estreptoquinase,, S2251 â um substracto cromo-génico tripeptidico especifico para a plssmina* Amostras de ©5i M TriSnliCl pH 8?© (25 ul) foram colocadas nas cavidades (2 a 12) de placa» oe ι7 o o av-iu-aoes-» Pequenas quancio-».oes o a. amoscrs (.-«o ul) foram colocadas nas cavidades 1 e 2 a feitas diluições de duas veses misturando e pipetando das cavidades 2 para 3? 3 para 4 e etc.-. até à cavidade 11= Uma amostra de 1Θ© μ1 de uma mistura de plasminoQénio/S225i (4Θ μΐ de plasminogénio a 3ΘΦ ug/mí5 22® μΐ de S2251 a í mg/ml? 1„©4 ml de ®5i M Tris=HCl pH 7.3'5) foi adicionado a cada uma das cavidades e a placa incubada a 37°C durante 3© min„ A reacção foi terminada pela adição de μΐ de ácido acético ©=5 ML Leu-se a absorvSncia a 4Θ5 nm usando um leitor de placas automático= A quantificação foi rsalisada por comparação com uma preparação padrão de estreptoquinase» A análise mostrou que o sobrenadaste continha aproximadamenta 2560 U/ml de actividade de estreptoquinase»
Ao sobrenadaste adicionou—se lentamente sulfato de a«=6nio sólido especifico até 15% de saturação C4S©3 g) s deixou--se dissolver durante 15 min à temperatura ambiente» 0 6®
sofarenadante foi decantado a adicionou-se ma is sulfato de amónio sólido para 4©% de saturação C7527 g) e deixado a dissolver» A mistura foi oentrifugada durante 3® rain a Í5 ΘΘΘ g â temperatura ambiente e o sobrenadante rejeitado» A proteína sedimentada (o corte 15-40¾)5 foi rsssuspensa em 1Φ ml de tampão ARB» Uma fracçlo do corte 15-40% foi testado usando o ensaio cromogénico com S2251 s observou-se conter ÍS 432 U/mi de actividacls de estreptoquinasa» A capacidade da trombina para clivar a proteína de fusão estreptoquinass-estreptoquinass na ssqufncis ds ligação clivável pela trombina foi avaliada num ensaio ds clivagem in vitro e zirnografia» Uma amostra de 5 μΐ do corte 15~4Θ% foi misturada com 45 μΐ do tampão ARB para diluir a proteína dez vezes» 10 pldesta mistura foi incubado com 5 U/ml de trombina num volume final de 5 Φ μΐ a 37°C durante 14 horas» Amostras (í® μΐ) das reacçSes de clivagem por trombina foram analisadas por zirnografia de acordo com o método do Exemplo 11» Os resultadois estão apresentados na Figura 6» A proteína de fusão sstreptoqui-nase-estreptoquinass (PM li® KDa>» foi quantitativamsnie clivada enquanto a actividatís da estreptoquinase de peso molecular inferior (PM 47 KDa) não foi clivada pela trombina» Assim a proteína de fusão estreptoquinase-estreptoquinase é clivável pela trombina» EXgHPLO......14 - Expressão ds um gene de fusão sstreptoquinass-IEBR- dl3JMdina_clivável......pelo Factor Xa 0 vscior de expressão plssmídso pSMDl/i59 do Exemplo i® foi transferido para levedura CS» cerevisiae) estirpe BJ2Í68 de acordo com o método da FTepa.raçSto 3= Usando frascos de agitação ds 50© ml» culturas de levedura contenda pSHDÍ/159 foram cultivadas e® lotes tíe 1Θ© ml de ©»67% de meio completo sintético de ái
base azotada para levedura,, com affiinoàcidos sscspto Isucina o i% glucose como fonte de carbono. Após crescimento durante a noite a 3®°C, as células foram colhidas por centrifugsção a 3 ΦΦΦ rpm durante lô min s ressuspensas no mesmo meio completo sintético excepto tendo 1% de galactose e @?2% de glucose como fonte as carbono e aciiçSo de fosfato de sódio (para 5® mli> pH 7,2, Isto induz a expressão do gene de fusão da sstreptoquinase-hirudina a partir do promotor PGK híbrido. As células foram cultivadas no meio de indução durante 3 dias, Após este período, o sobrenadants foi colhido por centrifugação, 0 caldo foi testado quanto è actividade de estreptoquinase de acordo com o processo do ensaio com S2251 do Exemplo 13 e actividade de hirudina ds acordo com o ensaia de inibição da trombina do Exemplo 2, Ambas as actividades foram detectadas e secretadas para o meio, EXEMPLO 15 Expressão, de.........um......gene de fusão de__MryMna^EeEzssr. treptoquinase clavável pelo Factor Xa 0 vsctor de expressão plasmídeo pSMDi/146 do Exemplo 9 foi transferido para levedura (S, cerevisiae) estirpe BJ2íè8 de acordo com o método da Preparação 3, A cultura foi incubada5 expressa5 colhida e as actividades de hirudina e estreptoquinass testadas de acordo com os métodos dos Exemplos 2 e 13, Ambas as actividades de estreptoquinass e hirudina foram detectadas s secretadas para meio. SEO =ID NOsi TIPO DE SEQUÊNCIAe rmeleétidos com a correspondente proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs2@i pares de bases TIPO DE CADEÍAs dupla TOPOLOeiAs linear TIPO DE MOLÉCULAS DNA sintética FONTE s sintética CARACTERfSTICASs gene da hirudiria tipo HV-l desde 195 até 2Θ1 ob codoes de paragem naa traduzidas
' τ Λ , GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACT GAA TCC GGA CAA AAC CTG TGT TTG CAA CAA ATG TGG CTG ACA TGA CTT AGG CCT GTT TTG GAC ACA AAC Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu 5 10 15 TGT GAG GGT TCT AAC GTC TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGC ATC CTG ACA CTC CCA AGA TTG CAG ACA CCA GTC CCA TTG TTT ACG TAG GAC Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30 GGT TCC GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTC ACT GGT GAA GGT ACC CCA AGG CTG CCA CTT TTC TTG GTT ACA CAG TGA CCA CTT CCA TGG Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 CCA AAG CCG CAG TCC CAC AAC GAT GGA GAT TTC GAA GAA ATC CCA GGT TTC GGC GTC AGG GTG TTG CTA CCT CTA AAG CTT CTT TAG GGT Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60 GAA GAA TAT CTG CAG TAATAG CTT CTT ATA GAC GTC ATTATC Glu Glu Tyr Leu Gin L>A SED ID MOs i 65 NO 12 TIPO DE SEQUÊNCIAs nuclsólidos COMPRIMENTO DA SEQUêMCIAs223 sares de bases PU DE CADE ϊ A s TOPOLOGIA; TIPO DE MOLÉCULAs FONTE 5 CARACTER i STICAS s SEQUÊNCIA; !»,Η dlipls 1idear DMA sintético sintética oligâmeros destinados à construcS; do qene sintético tipo HV--1 BB2011 BB2013 AGCTTACCTG CCATGGTTGT TTACACCGAC TGTACTGAAT C CGGACAAAAllllll llllllllll fIf1111III IIII111111 I II ATGGAC GGTACCAACA AATGTGGCTG ACATGACTTA GGCCTGTT TT BB2012
CCTGTGTTTG TGTGAGGGTT CTAACGTC
BB2015 TG TGGTCAGGGT AACAAATGCA GGACACAAAC ACACTCCCAA GATTGCAGACACC AG BB2014
TCCCA TTGTTTACGT
TCCTGGGTTC CGACGGTG
BB2017 AA AAGAACCAAT GTGTCACTGG TGAAGGTACC AGGACCCAAG GCTGCCACTTTTCT T BB2016 GGTTA CACAGTGACC ACTTCCATGG BB2018 BB2019
CCA AAGCCGC AGTCCCACAA CGATGGAGAT TTCGAAGAAA TC
GGTTTCGGCG
TCAGGGTGTT GCTACCTCTA AAGCTTCTTT AGGGTCTTC BB2020 BB2021
CCAGAAGAATATCTGCAG TAATAGGGAT CCG TTATAGACGTC ATTATCCCTA GGCTTAA BB2022
— é»5 ~ SEQ.ID MO§4 ! ,lF-!u DE SEOliéNdft ; núcleotidos COMPRIMENTO DA SEQUêNCIAs7859 pares de bases TIPO DE CADEIA? simples TOPOLOGIA^ circular FONTEs experimental pSWè C.ARACTER í ST Σ CAS s sequência do plasmídeo
SEQUÊNCIAS TTCCCATGTC TCTACTGGTG GTGGTGCTTC TTTGGAATTA TTGGAAGGTA 50 AGGAATTGCC AGGTGTTGCT TTCTTATCCG AAAAGAAATA AATTGAATTG 100 AATTGAAATC GATAGATCAA TTTTTTTCTT TTCTCTTTCC CCATCCTTTA 150 CGCTAAAATA ATAGTTTATT TTATTTTTTG AATATTTTTT ATTTATATAC 200 GTATATATAG ACTATTATTT ACTTTTAATA GATTATTAAG ATTTTTATTA 250 AAAAAAAATT CGTCCCTCTT TTTAATGCCT TTTATGCAGT TTTTTTTTCC 300 CATTCGATAT TTCTATGTTC GGGTTTCAGC GTATTTTAAG TTTAATAACT 350 CGAAAATTCT GCGTTTCGAA AAAGCTCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC 400 GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC 450 TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT 500 CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG 550 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC 600 GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA 650 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 700 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 750 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC 800 TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC 850 TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC 900 CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 950 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 1000 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG 1050 AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA 1100 AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT 1150 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA 1200 AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA 1250 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1300 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 1350 TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA 1400 TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC 1450 GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC 1500 AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA 1550 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 1600 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC 1650 GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG 1700 TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 1750 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC 1800 CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 1850 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 1900 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA 1950 GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAACA CGGGATAATA 2000 CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT 2050
TCGGGGCGAA ÀACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT 2100 GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 2150 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 2200 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA 2250 TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG 2300 AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 2350 AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA 2400 TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TCTTCAAGAA TTCTGAACCA 2450 GTCCTAAAAC GAGTAAATAG GACCGGCAAT TCTTCAAGCA ATAAACAGGA 2500 ATACCAATTA TTAAAAGATA ACTTAGTCAG ATCGTACAAT AAAGCTAGCT 2550 TTGAAGAAAA ATGCGCCTTA TTCAATCTTT GCTATAAAAA ATGGCCCAAA 2600 ATCTCACATT GGAAGACATT TGATGACCTC ATTTCTTTCA ATGAAGGGCC 2650 TAACGGAGTT GACTAATGTT GTGGGAAATT GGAGCGATAA GCGTGCTTCT 2700 GCCGTGGCCA GGACAACGTA TACTCATCAG ATAACAGCAA TACCTGATCA 2750 CTACTTCGCA CTAGTTTCTC GGTACTATGC ATATGATCCA ATATCAAAGG 2800 AAATGATAGC ATTGAAGGAT GAGACTAATC CAATTGAGGA GTGGCAGCAT 2850 ATAGAACAGC TAAAGGGTAG TGCTGAAGGA AGCATACGAT ACCCCGCATG 2900 GAATGGGATA ATATCACAGG AGGTACTAGA CTACCTTTCA TCCTACATAA 2950 ATAGACGCAT ATAAGTACGC ATTTAAGCAT AAACACGCAC TATGCCGTTC 3000 TTCTCATGTA TATATATATA CAGGCAACAC GCAGATATAG GTGCGACGTG 3050 AACAGTGAGC TGTATGTGCG CAGCTCGCGT TGCATTTTCG GAAGCGCTCG 3100 TTTTCGGAAA CGCTTTGAAG TTCCTATTCC GAAGTTCCTA TTCTCTAGAA 3150 AGTATAGGAA CTTCAGAGCG CTTTTGAAAA CCAAAAGCGC TCTGAAGACG 3200 CACTTTCAAA AAACCAAAAA CGCACCGGAC TGTAACGAGC TACTAAAATA 3250 TTGCGAATAC CGCTTCCACA AACATTGCTC AAAAGTATCT CTTTGCTATA 3300 TATCTCTGTG CTATATCCCT ATATAACCTA CCCATCCACC TTTCGCTCCT 3350 TGAACTTGCA TCTAAACTCG ACCTCTACAT TTTTTATGTT TATCTCTAGT 3400 ATTACTCTTT AGACAAAAAA ATTGTAGTAA GAACTATTCA TAGAGTGAAT 3450 CGAAAACAAT ACGAAAATGT AAACATTTCC TATACGTAGT ATATAGAGAC 3500 AAAATAGAAG AAACCGTTCA TAATTTTCTG ACCAATGAAG AATCATCAAC 3550 GCTATCACTT TCTGTTCACA AAGTATGCGC AATCCACATC GGTATAGAAT 3600 ATAATCGGGG ATGCCTTTAT CTTGAAAAAA TGCACCCGCA GCTTCGCTAG 3650 TAATCAGTAA ACGCGGGAAG TGGAGTCAGG CTTTTTTTAT GGAAGAGAAA 3700 ATAGACACCA AAGTAGCCTT CTTCTAACCT TAACGGACCT ACAGTGCAAA 3750 AAGTTATCAA GAGACTGCAT TATAGAGCGC ACAAAGGAGA AAAAAAGTAA 3800 TCTAAGATGC TTTGTTAGAA AAATAGCGCT CTCGGGATGC ATTTTTGTAG 3850 AACAAAAAAG AAGTATAGAT TCTTTGTTGG TAAAATAGCG CTCTCGCGTT 3900 GCATTTCTGT TCTGTAAAAA TGCAGCTCAG ATTCTTTGTT TGAAAAATTA 3950 GCGCTCTCGC GTTGCATTTT TGTTTTACAA AAATGAAGCA CAGATTCTTC 4000 GTTGGTAAAA TAGCGCTTTC GCGTTGCATT TCTGTTCTGT AAAAATGCAG 4050 CTCAGATTCT TTGTTTGAAA AATTAGCGCT CTCGCGTTGC ATTTTTGTTC 4100 TACAAAATGA AGCACAGATG CTTCGTTAAC AAAGATATGC TATTGAAGTG 4150 CAAGATGGAA ACGCAGAAAA TGAACCGGGG ATGCGACGTG CAAGATTACC 4200 TATGCAATAG ATGCAATAGT TTCTCCAGGA ACCGAAATAC ATACATTGTC 4250 TTCCGTAAAG CGCTAGACTA TATATTATTA TACAGGTTCA AATATACTAT 4300 CTGTTTCAGG GAAAACTCCC AGGTTCGGAT GTTCAAAATT CAATGATGGG 4350 TAACAAGTAC GATCGTAAAT CTGTAAAACA GTTTGTCGGA TATTAGGCTG 4400 TATCTCCTCA AAGCGTATTC GAATATCATT GAGAAGCTGC ATTTTTTTTT 4450 TTTTTTATAT ATATTTCAAG GATATACCAT TGTAATGCCT GCCCCTAAGA 4500 AGATCGTCGT TTTGCCAGGT GACCACGTTG GTCAAGAAAT CACAGCCGAA 4550 GCCATTAAGG TTCTTAAAGC TATTTCTGAT GTTCGTTCCA ATGTCAAGTT 4600
CGATTTCGAA AATCATTTAA TTGGTGGTGC TGCTATCGAT GCTACAGGTG 4650 TTCCACTTCC AGATGAGGCG CTGGAAGCCT CCAAGAAGGC TGATGCCGTT 4700 TTGTTAGGTG CTGTGGGTGG TCCTAAATGG GGTACCGGTA GTGTTAGACC 4750 TGAACAAGGT TTACTAAAAA TCCGTAAAGA ACTTCAATTG TACGCCAACT 4800 TAAGACCATG TAACTTTGCA TCCGACTCTC TTTTAGACTT ATCTCCAATC 4850 AAGCCACAAT TTGCTAAAGG TACTGACTTC GTTGTTGTTA GAGAATTAGT 4900 GGGAGGTATT TACTTTGGTA AGAGAAAGGA AGACGATGGT GATGGTGTCG 4950 CTTGGGATAG TGAACAATAC ACCGTTCCAG AAGTGCAAAG AATCACAAGA 5000 ATGGCCGCTT TCATGGCCCT ACAACATGAG CCACCATTGC CTATTTGGTC 5050 CTTGGATAAA GCTAATGTTT TGGCCTCTTC AAGATTATGG AGAAAAACTG 5100 TGGAGGAAAC CATCAAGAAC GAATTCCCTA CATTGAAAGT TCAACATCAA 5150 TTGATTGATT CTGCCGCCAT GATCCTAGTT AAGAACCCAA CCCACCTAAA 5200 TGGTATTATA ATCACCAGCA ACATGTTTGG TGATATCATC TCCGATGAAG 5250 CCTCCGTTAT CCCAGGCTCC TTGGGTTTGT TGCCATCTGC GTCCTTGGCC 5300 TCTTTGCCAG ACAAGAACAC CGCATTTGGT TTGTACGAAC CATGCCATGG 5350 TTCCGCTCCA GATTTGCCAA AGAATAAGGT CAACCCTATC GCCACTATCT 5400 TGTCTGCTGC AATGATGTTG AAATTGTCAT TGAACTTGCC TGAAGAAGGT 5450 AAAGCCATTG AAGATGCAGT TAAAAAGGTT TTGGATGCAG GTATCAGAAC 5500 TGGTGATTTA GGTGGTTCCA ACAGTACCAC CGAAGTCGGT GATGCTGTCG 5550 CCGAAGAAGT TAAGAAAATC CTTGCTTAAA AAGATTCTCT TTTTTTATGA 5600 TATTTGTACA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 5650 AAAAAAAAAA AAAATGCAGC GTCACATCGG ATAATAATGA TGGCAGCCAT 5700 TGTAGAAGTG CCTTTTGCAT TTCTAGTCTC TTTCTCGGTC TAGCTAGTTT 5750 TACTACATCG CGAAGATAGA ATCTTAGATC ACACTGCCTT TGCTGAGCTG 5800 GATCAATAGA GTAACAAAAG AGTGGTAAGG CCTCGTTAAA GGACAAGGAC 5850 CTGAGCGGAA GTGTATCGTA CAGTAGACGG AGTATACTAG TATAGTCTAT 5900 AGTCCGTGGA ATTCTCATGT TTGACAGCTT ATCATCGATA AGCTAGCTTT 5950 CTAACTGATC TATCCAAAAC TGAAAATTAC ATTCTTGATT AGGTTTATCA 6000 CAGGCAAATG TAATTTGTGG TATTTTGCCG TTCAAAATCT GTAGAATTTT 6050 CTCATTGGTC ACATTACAAC CTGAAAATAC TTTATCTACA ATCATACCAT 6100 TCTTAATAAC ATGTCCCCTT AATACTAGGA TCAGGCATGA ACGCATCACA 6150 GACAAAATCT TCTTGACAAA CGTCACAATT GATCCCTCCC CATCCGTTAT 6200 CACAATGACA GGTGTCATTT TGTGCTCTTA TGGGACGATC CTTATTACCG 6250 CTTTCATCCG GTGATTGACC GCCACAGAGG GGCAGAGAGC AATCATCACC 6300 TGCAAACCCT TCTATACACT CACATCTACC AGTGATCGAA TTGCATTCAG 6350 AAAACTGTTT GCATTCAAAA ATAGGTAGCA TACAATTAAA ACATGGCGGG 6400 CATGTATCAT TGCCCTTATC TTGTGCAGTT AGACGCGAAT TTTTCGAAGA 6450 AGTACCTTCA AAGAATGGGG TCTTATCTTG TTTTGCAAGT ACCACTGAGC 6500 AGGATAATAA TAGAAATGAT AATATACTAT AGTAGAGATA ACGTCGATGA 6550 CTTCCCATAC TGTAATTGCT TTTAGTTGTG TATTTTTAGT GTGCAAGTTT 6600 CTGTAAATCG ATTAATTTTT TTTTCTTTCC TCTTTTTATT AACCTTAATT 6650 TTTATTTTAG ATTCCTGACT TCAACTCAAG ACGCACAGAT ATTATAACAT 6700 CTGCATAATA GGCATTTGCA AGAATTACTC GTGAGTAAGG AAAGAGTGAG 6750 GAACTATCGC ATACCTGCAT TTAAAGATGC CGATTTGGGC GCGAATCCTT 6800 TATTTTGGCT TCACCCTCAT ACTATTATCA GGGCCAGAAA AAGGAAGTGT 6850 TTCCCTCCTT CTTGAATTGA TGTTACCCTC ATAAAGCACG TGGCCTCTTA 6900 TCGAGAAAGA AATTACCGTC GCTCGTGATT TGTTTGCAAA AAGAACAAAA 6950 CTGAAAAAAC CCAGACACGC TCGACTTCCT GTCTTCCTAT TGATTGCAGC 7000 TTCCAATTTC GTCACACAAC AAGGTCCTAG CGACGGCTCA CAGGTTTTGT 7050 AACAAGCAAT CGAAGGTTCT GGAATGGCGG GGAAAGGGTT TAGTACCACA 7100 TGCTATGATG CCCACTGTGA TCTCCAGAGC AAAGTTCGTT CGATCGTACT 7150
GTACTCTCTC TCTTTCAAAC AGAATTGTCC GAATCGTGTG ACÁÁCAACAG 7200 CCTGTTCTCA CACACTCTTT TCTTCTAACC AAGGGGGTGG TTTAGTTTAG 7250 TAGAACCTCG TGAAACTTAC ATTTACATAT ATATAAACTT GCATAAATTG 7300 GTCAATGGAA GAAATACATA TTTGGTCTTT TCTAATTCGT AGTTTTTCAA 7350 GTTCTTAGAT GCTTTCTTTT TCTCTTTTTT ACAGATCATC AAGGAAGTAA 7400 TTATCTACTT TTTACAACAA ATACAAAAGA TCTATGAGAT TTCCTTCAAT 7450 TTTTACTGCA GTTTTATTCG CAGCATCCTC CGCATTAGCT GCTCCAGTCA 7500 ACACTACAAC AGAAGATGAA ACGGCACAAA TTCCGGCTGA AGCTGTCATC 7550 GGTTACTTAG ATTTAGAAGG GGATTTCGAT GTTGCTGTTT TGCCATTTTC 7600 CAACAGCACA AATAACGGGT TATTGTTTAT AAATACTACT ATTGCCAGCA 7650 TTGCTGCTAA AGAAGAAGGG GTAAGCTTGG ATAAAAGAAA CAGCGACTCT 7700 GAATGCCCGC TGAGCCATGA TGGCTACTGC CTGCACGACG GTGTATGCAT 7750 GTATATCGAA GCTCTGGACA AATACGCATG CAACTGCGTA GTTGGTTACA 7800 TCGGCGAACG TTGCCAGTAC CGCGACCTGA AATGGTGGGA GCTCCGTTAA 7850 TAAGGATCC 7859 * ψ Φ •*£S ·!· ·/·
τ n JU LS
Nu i
SEGL1D NO; 7 TIPO DE SEQUÉNCIAs nucleótidos COMPRIMENTO DA SEQUêNCIAu223 paras de bases TIPO DE CADEIAs TOPOLOGIA; TIPO DE MOLÉCULA; FONTE; CARACTER i STICÃS; simples 1inear DNA sintético sintética gene da hirudina tipo HV-l com adaptador de 5 aminoácidos (correspondendo ao extremo C do factor alfa) no extrema amina, SEQUÊNCIA: AAGCTTGGAT AAAAGAGTTG TTTACACCGA CTGTACTGAA TCCGGACAAA 50 ACCTGTGTTT GTGTGAGGGT TCTAACGTCT GTGGTCAGGG TAACAAATGC 100 ATCCTGGGTT CCGACGGTGA AAAGAACCAA TGTGTCACTG GTGAAGGTAC 150 CCCAAAGCCG CAGTCCCACA ACGATGGAGA TTTCGAAGAA ATCCCAGAAG 200 AATATCTGCA GTAATAGGGA TCC 223 FIM DE SEQ ID NOs 7«$** I i \ NO; 8 TIPO DE SEQUÊNCIAs
nucleótidos coíb correspondentes arainaácidas COItPRIMENTU DA SEQUêNCIAs42© pares de bases CADfc.IA; dupla TOPOLOGIAg CARACTER f STICAS s SEQUÊNCIA s linear h i rud ina--i ESR~ h i rud i n a c 1 i váve 3. pelo Factor Xa
GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACT GAA TCC GGA CAA AAC CTG TGT Vai Vai Tyr Thr Asp 5 Cys Thr Glu Ser Gly 10 Gin Asn Leu Cys j TTG TGT GAG GGT TCT AAC GTC TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGC Leu 15 Cys Glu Gly Ser Asn 20 Vai Cys Gly Gin Gly Asn 25 Lys Cys ATC CTG GGT TCC GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTC ACT GGT Ile Leu 30 Gly Ser Asp Gly Glu 35 Lys Asn Gin Cys Vai 40 Thr Gly GAA GGT ACC CCA AAG CCG CAG TCC CAC AAC GAT GGA GAT TTC Glu Gly Thr 45 Pro Lys Pro Gin Ser 50 His Asn Asp Gly Asp 55 Phe GAA GAA ATC CCA GAA GAA TAT CTG CAG ATC GAA GGA AGA GTT Glu Glu Ile Pro Glu 60 Glu Tyr Leu Gin 65 Ile Glu Gly Arg Vai 70 GTT TAC ACC GAC TGT ACT GAA TCC GGA CAA AAC CTG TGT TTG Vai Tyr Thr Asp Cys 75 Thr Glu Ser Gly Gin 80 Asn Leu Cys Leu TGT GAG GGT TCT AAC GTC TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGC ATC Cys 35 Glu Gly Ser Asn Vai 90 Cys Gly Gin Gly Asn Lys 95 Cys Ile CTG GGT TCC GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTC ACT GGT GAA Leu Gly 100 Ser Asp Gly Glu Lys 105 Asn Gin Cys Vai Thr 110 Gly Glu GGT ACC CCA AAG CCG CAG TCC CAC AAC GAT GGA GAT TTC GAA Gly Thr Pro 115 Lys Pro Gin Ser His 120 Asn Asp Gly Asp Phe 125 Glu GAA Glu ATC Ile CCA Pro GAA GAA Glu Glu TAT Tyr CTG Leu CAG Gin TAATAGGGAT CCGAATTC 1-3.0.,.,. S. si s Ξ j- g 5ve BE SEQ ID fc. ({**. r<*U s s tm t
SEQ ID MU5 13 TIPO DE BEQUêNCIAs ÇQ{vfP|5TK|r|v|jn DA SEQ! L/APírtu ! EFí 2 ϊ3 i l íjt-Yo ϊ
J nucleétidos IAsl7 parss tís bases i nic i adorss para sequencial didssoxi do gsns ·áa estrep SEQUÊNCIA? 57-CACTATCAGTAGCAAAT-37 BB 3510 57-TGGTCTAACGCGCACAT-3' BB 2136 57-GAGTAAACTGTACAGTA-37 BB 3509 57-GATCTCATAAGCTTGTT-37 BB 3508 57-TTTAGCCTTATCACGAG-37 BB 2135 5 7-GACACCAACCGTATCAT-3 7 BB 2753 57-CGTTGATGTCAACACCA-3 7 BB 3718 57-GCTATCGGTGACACCAT-37 BB 2754 5 7-GACGACTACTTTGAGGT-3 7 BB 2755 5 7-CCCAACCTGTCCAAGAA-3 7 BB 2134 r iM DL b'fc.Q ID NO s 13 i
8EQ ID NOs Í4 TIPO DE BbuUÊNCIAs nucleétidos com correspondentes aminoácidos COHPRIHENTD DA SEQUêNCIAs 1335 pares de bases CARACTERíSTICAS: gene da estreptoquinase de S» sqaisimalis SEQUÊNCIAs
GAATTCATGAAAAATTACTTATCTTTTGGGATGTTTGCACTGCTGTTTGCACTAACATTT
MetLysAsnTyrLeuSerPheGlyMetPheAlaLeuLeuPheAlaLeuThrPhe
GGAACAGTCAATTCTGTCCAAGCTATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCT
GlyThrValAsnSerValGlnAlalleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSer
GTCAACAACAGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGAC
ValAsnAsnSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAsp
ATTAGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACA
IleSerLeuLysPhePheGluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThr
GAGCAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACAT
GluGlnGlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHis
AAACTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCAC
LysLeuGluLysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHis
AGTAACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGA
SerAsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArg
AACGGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTC
AsnGlyLysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProVal C AAG AATTTTTG CTAAG CGGACATGTG CG CGTT AG ACC AT AT AAAG AAAAACCAAT AC AA GlnGluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGln
AATCAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGAT
AsnGlnAlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAsp
GACGATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGAC
AspAspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAsp
ACCATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCA
ThrlleThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisPro
GGCTATACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGT
GlyTyrThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArg
ACGATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTAT
ThrlleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyr
GAGATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAG
GluIleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGlu
AAATATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTG
LysTyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeu
AAACTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAG
LysLeuPheThrlleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGln
CTCTTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAG
LeuLeuThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLys
GCTAAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGA
AlaLysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGly
AAAGTAGAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGA
LysValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArg
CCCGAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAA
ProGluGlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGlu
GAACGAGAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAAC
GluArgGluValTyrSerTyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsn GACAAATAAGGATCC*
AspLysEnd rí úfc i jj s\isj H 14 74
SEQ ID NO;i 17
TIPO DE SEQUÊNCIA
COMPRIMENTO DA SEQUÊMulAsldi7 pares de basss CARftCTER í ST ICAS s
OmpAL fundida com o qsne da sstreptoquinas-e madura
CATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCGACCGTAGCG
MKKTAIAIAVALAGFATVA
CAGGCCATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAACAACÀGCCAATTA
QAIAGPEWLLDRPSVNNSQL
GTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTTAAATTTTTT
VVSVAGTVEGTNQDISLKFF
GAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGCTTAAGTCCA E I DLTSRPAHGGKTEQGLS P
AAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAAAAAGCTGAC
KSKPFATDSGAMPHKLEKAD
TTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGACGACTACTTT
LLKAIQEQLIANVHSNDDYF
GAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGCAAGGTCTACTTT EVI DFASDATITDRNGKVYF
GCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAATTTTTGCTAAGC
ADKDGSVTLPTQPVQEFLLS
GGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAAGCGAAATCTGTT
GHVRVRPYKEKPIQNQAKSV
GATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGATTTCAGACCAGGT
DVEYTVQFTPLNPDDDFRPG
CTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCATCACATCTCAAGAA LKDTKLLKTLAIGDT ITSQE
TTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTATACGATTTATGAA
LLAQAQSILNKTHPGYTIYE
CGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATTTTACCAATGGAT
RDSSIVTHDNDIFRTILPMD
CAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAATAAAAAATCT
QEFTYHVKNREQAYEINKKS
GGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATATTACGTCCTTAAA
GLNEEINNTDLISEKYYVLK
AAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTGTTCACCATCAAA
KGEKPYDPFDRSHLKLFTIK
TACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACAGCTAGCGAA
YVDVNTNELLKSEQLLTASE
CGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTAAACTACTCTACAAC
RNLDFRDLYDPRDKAKLLYN
AATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAAGATAATCAC
NLDAFGIMDYTLTGKVEDNH
GATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGAGAGAATGCT DDTNRIITVYMGKRPEGE NA
AGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAACGAGAAGTTTACAGC
SYHLAYDKDRYTEEEREVYS TACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGACAAATAAGGATCC* YLRYTGTPIPDNPNDK*
3hQ ID Nus 2ó TIPO Ufc SEQUÊMiJ ϊ A s nucleétidos com torrespondent? a.rninoácidos
J COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAsí197 nucleétidos CARACTEK1' ST ICAS s proteína de fusão metionil-BstrsptDquinase
títQUÊNCIA
CATATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAACAACAGCCAATTA
MetlleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSerValAsnAsnSerGlnLeu
GTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTTAAATTTTTT
ValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIleSerLeuLysPhePhe
GAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGCTTAAGTCCA
GluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGluGlnGlyLeuSerPro
AAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAAAAAGCTGAC
LysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLysLeuGluLysAlaAsp
TTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGACGACTACTTT
LeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSerAsnAspAspTyrPhe GAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGCAAGGTCTACTTT G1 u Va 111 e AspPheAl aSerAspAl aThrl 1 eThrAspArgAsnGlyLy sValTy rPhe
GCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAATTTTTGCTAAGC
AlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGlnGluPheLeuLeuSer
GGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAAGCGAAATCTGTT
GlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsnGlnAlaLysSerVal
GATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGATTTCAGACCAGGT
AspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAspAspPheArgProGly
CTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCATCACATCTCAAGAA
LeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThrlleThrSerGlnGlu
TTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTATACGATTTATGAA
LeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGlyTyrThrlleTyrGlu
CGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATTTTACCAATGGAT
ArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThrlleLeuProMetAsp
CAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAATAAAAAATCT
GlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGluIleAsnLysLysSer
GGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATATTACGTCCTTAAA
GlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeulleSerGluLysTyrTyrValLeuLys
AAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTGTTCACCATCAAA
LysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLysLeuPheThrlleLys
TACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACAGCTAGCGAA
TyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeuLeuThrAlaSerGlu
CGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTAAACTACTCTACAAC
ArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAlaLysLeuLeuTyrAsn
AATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAAGATAATCAC
AsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLysValGluAspAsnHis
GATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGAGAGAATGCT
AspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgProGluGlyGluAsnAla
AGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAACGAGAAGTTTACAGC
SerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGluArgGluValTyrSer TACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGACAAATAAGGATCC*
TyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsnAspLysEnd
-rfcQ Νθ! TIPO DE SEQUÊNCIA: nuc1sólidos com correspondentes ami n oácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA:1513 nucleétidos CARACTERfSTICASs estreptoquinase fundida com o factor a SEQUÊNCIA:
AGATCTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTA
MetArgPheProSerllePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSerAlaLeu
GCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTC
AlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThrAlaGlnlleProAlaGluAlaVal
ATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGC
IleGlyTyrLeuAspLeuGluGlyAspPheAspValAlaValLeuProPheSerAsnSer
ACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAA
ThrAsnAsnGlyLeuLeuPhelleAsnThrThrlleAlaSerlleAlaAlaLysGluGlu
GGGGTAAGCTTGGATAAAAGAATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTC
GlyValSerLeuAspLysArglleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSerVal
AACAACAGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATT
AsnAsnSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIle
AGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAG
SerLeuLysPhePheGlulleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGlu
CAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAA
GlnGlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLys
CTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGT
LauGluLysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSer
AACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAAC
AsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsn
GGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAA
GlyLysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGln
GAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAAT
GluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsn
CAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGAC
GlnAlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAsp
GATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACC
AspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThr
ATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGC
IleThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGly tatacgatttatgaacgtgactcctcaatcgtcactcatgacaatgacAttttccgtacg
TyrThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThr
ATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAG
IleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGlU
ATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAA
IleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGluLys
TATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAA
TyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLys
CTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTC
LeuPheThrlleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeu
TTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCT
LeuThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAla
AAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAA
LysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLys
GTAGAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCC
ValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgPro
GAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAA
GluGlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGlu
CGAGAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGAC
ArgGluValTyrSerTyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsnAsp AAATAAGGATCC* DE SEQ ÍD NO s 24
LysEnd
SER
NO
TIPU DE SEQUÊNCIAs COMPRIMENTO DA SEQUtNt CARACTERíSTICASs nuclsétidos com corrsspQndsn aminoácidos sAh112Sí· nucleótidos
Ms t ~s?51 rsp toqu i í6-383) í~r uncaaa catatgagccaattagttgttãgcgttgctggtactgttgaggggacgaatcaagacatt
MetSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIle AGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAG S er LeuLy s PhePheGluI 1 e AspLeuThrS erArgProAlaH i sG ly Gly Ly sThrGlu
CAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAA
GlnGlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLys
CTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGT
LeuGluLysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSer
AACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAAC
AsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsn
GGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAA
GlyLysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGln
GAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAAT
GluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProlleGlnAsn
CAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGAC
GlnAlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAsp
GATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACC
AspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThr
ATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGC
IleThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGly
TATACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACG
TyrThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThr
ATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAG
IleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGlu
ATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAA
IleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGluLys
TATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAA
TyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLys
CTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTC
LeuPheThrlleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeu
TTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCT
LeuThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAla
AAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAA
LysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLys
GTAGAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCC
ValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgPro GAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTAAGGATCC*
GluGlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaEnd
Ν 3EQ ID NOs 29 TIFO DE SEQUÊNCIAS nucleotidos com correspondentes smiaaàcidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIAs259® rsucleótidos CARAC í'ER í ST ICA3 ã τ usâo
OmpAL-estreptaquinase-estreptoqui- nacs igada por VELQ6VvrR6 c1ivávsi peia trombina
I •QUÊNCIAs
CATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCGACCGTAGCG
MetLysLysThrAlalleAlalleAlaValAlaLeuAlaGlyPheAlaThrValAla
CAGGCCATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAACAACAGCCAATTA
GlnAlalleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSerValAsnAsnSerGlnLeu
GTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTTAAATTTTTT
ValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIleSerLeuLysPhePhe
GAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGCTTAAGTCCA
GlulleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGluGlnGlyLeuSerPro
AAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAAAAAGCTGAC
LysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLysLeuGluLysAlaAsp
TTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGACGACTACTTT
LeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSerAsnAspAspTyrPhe
GAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGCAAGGTCTACTTT
GluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsnGlyLysValTyrPhe
GCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAATTTTTGCTAAGC
AlaAspLvsAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGlnGluPheLeuLeuSer
GGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAAGCGAAATCTGTT
GlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsnGlnAlaLysSerVal
GATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGATTTCAGACCAGGT
AspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAspAspPheArgProGly
CTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCATCACATCTCAAGAA
LeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThrlleThrSerGlnGlu
TTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTATACGATTTATGAA
LeuLeuAlaGlnAIaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGlyTyrThrlleTyrGlu
CGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATTTTACCAATGGAT
ArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThrlleLeuProMetAsp
CAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAATAAAAAATCT
GlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGluIleAsnLysLysSer
GGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATATTACGTCCTTAAA
GlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGluLysTyrTyrValLeuLys
AAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTGTTCACCATCAAA
LysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLysLeuPheThrlleLys
TACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACAGCTAGCGAA
TyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeuLeuThrAlaSerGlu
CGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTAAACTACTCTACAAC
ArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAlaLysLeuLeuTyrAsn
AATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAAGATAATCAC
AsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLysValGluAspAsnHis
GATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGAGAGAATGCT
AspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgProGluGlyGluAsnAla AG CTAT CATTT AG C CTATG AT AAAG AT CGTT AT ACCGAAGAAG AACG AGAAGTTTACAGC SerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGluArgGluValTyrSer
TACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGACAAAGTAGAGCTGCAG
TyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsnAspLysValGluLeuGln
GGAGTAGTTCCTCGTGGAATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAAC
GlyValValProArgGlylleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSerValAsn
AACAGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGT
AsnSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIleSer
CTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAA
LeuLysPhePheGluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGluGln
GGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTT
GlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLysLeu
GAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAAC
GluLysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSerAsn
GACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGC
AspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsnGly
AAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAA
LysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGlnGlu
TTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAA
PheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsnGln
GCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGAT
AlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAspAsp
TTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGÇTATCGGTGACACCATC
PheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlálTeGlyAspThrlle
ACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTAT
ThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGlyTyr
ACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATT
ThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThrlle
TTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATC
LeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHiEValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGluIle
AATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATAT
AsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeulleSerGluLysTyr
TACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTG
TyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLysLeu TTCACCATCAAÃTACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTA PheThr11eLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLy sS erGluGlnLeuLeu AC AG CT AG CG AÀCGTAACTTAG ACTTCAG AG ATTTATACGATC CTCGTG ATAAGGCTAAA ThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAlaLys
CTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTA
LeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLysVal
GAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAA
GluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgProGlu
GGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAACGA
GlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGluArg
GAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGACAAA
GluValTyrSerTyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsnAspLys TAAGGATCC*
End
\ V SEQ ID NO;
TIPO DE SEQUÊNCIAS nucleótidoB com corrosponϋ^η L»
-Β,ΐΠΧΠ OâC Í0OS COHPRϊMENTO DA SEQUÊNCIA«225·η πΐΐϊ-Ι&οwiCiu~· CARACTERfSTICASs fusSo Het-núcleo~estreptoquinase- -núclso-estreptoquinsBe ligada por ír* f rnfflhi η.» uc*! Ω{3%Α.ά-*ι*Ω ri í vável tiUtir4 T Λ - 3£.U!L>S=.NUt i!-!: catatgagccaattagttgttagcgttgctggtactgttgaggggacgaatcaagacatt
MetSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIle
AGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAG
SerLeuLysPhePheGluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGlu
CAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAA
GlnGlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLys cttgaaaaagctgacttactaaaggctattcaagaacaattgatcgctaacgtccacagt
LeuGluLysAlaAspLeuLeuLysAlaXleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSer
AACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAAC
AsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsn
GGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAA
GlyLysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGln
GAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAAT
GluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsn
CAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGAC
GlnAlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAsp
GATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACC
AspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThr
ATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGC
IleThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGly
TATACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACG
TyrThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThr
ATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAG
IleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGlu
ATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAA
IleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGluLys
TATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAA
TyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLys
CTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTC
LeuPheThrlleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeu
TTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCT
LeuThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAla
AAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAA
LysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLys
GTAGAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCC
ValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgPro
GAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCGTAGAGCTGCAGGGAGTAGTTCCTCGTGGA
GluGlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaValGluLeuGlnGlyValValProArgGly
AGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTT
SerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAspIleSerLeu
AAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGC
LysPhePheGluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGluGlnGly
TTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAA
LeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLysLeuGlu
AAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGAC
LysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSerAsnAsp
GACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGCAAG
AspTyrPheGluVallleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsnGlyLys
GTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAATTT
ValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGlnGluPhe
TTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAAGCG
LeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsnGlnAla
AAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGATTTC
LysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAspAspPhe
AGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCATCACA
ArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThrlleThr
TCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTATACG
SerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGlyTyrThr
ATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATTTTA
IleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThrlleLeu
CCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAAT
ProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGluIleAsn TGQOQIATUTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAAC .uACCTGATCTCTGAGAAATATTAC LysLysSerGlyLeuAsriGluGlulleAsnAs-ι .irAspLeuIleSerGluLysTyrTyr gtccttaaaaaaggggaaaagccgtatgatcc :tttgatcgcagtcacttgaaactgttc ValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspP' oPheAspArgSerHisLeuLysLeuPhe ACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACf TGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACA ThrlleLysTyrValAspValAsnThr. 5' * j^euLeuLysSerGluGlnLeuLeuThr GCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAC \TT "!GATCCTCGTGATAAGGCTAAACTA AlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAjpLt -AspProArgAspLysAlaLysLeu CTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATC -CTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAA LeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleM ,t jipTyrThrLeuThrGlyLysValGlu
GATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGA
AspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgProGluGly
GAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTAAGGaTCC
GluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaEnd tmt FIM Dfc SEQ ID NOs 33 ***** >Ν SEQ ID NOs 3o n uc i eo l i a u >. 3.ÍII Í Π Oé.C i d QS : À. ; Γ'ίνΓ: CDrr^SDOndsn ttfb TIFO DE SEQUêNCIAs COMPRIMENTO DA SEQUÈNUIAs140¥ nucieótious CARACTER £ ST IC-AQ: fusão hirudina estreptoquinass ligada por IESR clivável pelo
SEQUÊNCIAS
GTTGTTTACACCGACTGTACTGAATCCGGACAAAACCTGTGTTTGTGTGAGGGTTCTAAC
ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsn
GTCTGTGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCCGACGGTGAAAAGAACCAATGTGTC
ValCysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysVal
ACTGGTGAAGGTACCCCAAAGCCGCAGTCCCACAACGATGGAGATTTCGAAGAAATCCCA
ThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIlePro
GAAGAATATCTGCAGATCGAAGGAAGAATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCA
GluGluTyrLeuGlnlleGluGlyArglleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgPro
TCTGTCAACAACAGCCAATTAGTTGTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAA
SerValAsnAsnSerGlnLeuValValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGln
GACATTAGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAG
AspIleSerLeuLysPhePheGluIleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLys
ACAGAGCAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCA
ThrGluGlnGlyLeuSerProLysSerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetPro
CATAAACTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTC
HisLvsLeuGluLysAlaAspLeuLeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnVal
CACAGTAACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGAT
HisSerAsnAspAspTyrPheGluValIleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAsp
CGAAACGGCAAGGTCTACTTTGCTGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCT
ArgAsnGlyLysValTyrPheAlaAspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnPro
GTCCAAGAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATA
ValGlnGluPheLeuLeuSerGlyHisValArgValArgProTyrLysGluLysProlle
CAAAATCAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCT
GlnAsnGlnAlaLysSerValAspValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnPro
GATGACGATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGT
AspAspAspPheArgProGlyLeuLysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGly
GACACCATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCAT
AspThrlleThrSerGlnGluLeuLeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHis
ccaggctatacgatttatgaacgtgactcctcaatcgtcactcatgacaAtgacattttc
ProGlyTyrThrlleTyrGluArgAspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePhe
CGTACGATTTTACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCT
ArgThrlleLeuProMetAspGlnGluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAla
TATGAGATCAATAAAAAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCT
TyrGluIleAsnLysLysSerGlyLeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSer
GAGAAATATTACGTCCTTAAAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCAC
GluLysTyrTyrValLeuLysLysGlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHis
TTGAAACTGTTCACCATCAAATACGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAG
LeuLysLeuPheThrlleLysTyrValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGlu
CAGCTCTTAACAGCTAGCGAACGTAACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGAT
GlnLeuLeuThrAlaSerGluArgAsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAsp
AAGGCTAAACTACTCTACAACAATCTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACT
LysAlaLysLeuLeuTyrAsnAsnLeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThr
GGAAAAGTAGAAGATAATCACGATGACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAG
GlyLysValGluAspAsnHisAspAspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLys
CGACCCGAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAA
ArgProGluGlyGluAsnAlaSerTyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGlu
GAAGAACGAGAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCT
GluGluArgGluValTyrSerTyrLeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnPro AACGACAAATAAGGATCC*
AsnAspLysEnd
SEQ ID MO= 38 TIPO DE BEOUêMC sucleótídos- com coff pandsn tes smxnoâciuos COMPRIMENTO DA SEQUêNCIAs1471 nucleótidos GARACTER f ST ICAS s f u.sSo as trep toq u i n ase- π i rud A n a ligada por 1EBR clivàvel pelo Factor Xa SEQUêNCIAs
ATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAACAACAGCCAATTAGTT
MetlleAlaGlyProGluTrpLeuLeuAspArgProSerValAsnAsnSerGlnLeuVal
GTTAGCGTTGCTGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTTAAATTTTTTGAA
ValSerValAlaGlyThrValGluGlyThrAsnGlnAsplleSerLeuLysPhePheGlu
ATTGACCTAACATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGCTTAAGTCCAAAA
IleAspLeuThrSerArgProAlaHisGlyGlyLysThrGluGlnGlyLeuSerProLys
TCAAAACCATTTGCTACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAAAAAGCTGACTTA
SerLysProPheAlaThrAspSerGlyAlaMetProHisLysLeuGluLysAlaAspLeu
CTAAAGGCTATTCAAGAACAATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGACGACTACTTTGAG
LeuLysAlalleGlnGluGlnLeuIleAlaAsnValHisSerAsnAspAspTyrPheGlu
GTCATTGATTTTGCAAGCGATGCAACCATTACTGATCGAAACGGCAAGGTCTACTTTGCT
VallleAspPheAlaSerAspAlaThrlleThrAspArgAsnGlyLysValTyrPheAla
GACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCGACCCAACCTGTCCAAGAATTTTTGCTAAGCGGA
AspLysAspGlySerValThrLeuProThrGlnProValGlnGluPheLeuLeuSerGly
CATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAAAAACCAATACAAAATCAAGCGAAATCTGTTGAT
HisValArgValArgProTyrLysGluLysProIleGlnAsnGlnAlaLysSerValAsp
GTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAAACCCTGATGACGATTTCAGACCAGGTCTC
ValGluTyrThrValGlnPheThrProLeuAsnProAspAspAspPheArgProGlyLeu
AAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGGTGACACCATCACATCTCAAGAATTA
LysAspThrLysLeuLeuLysThrLeuAlalleGlyAspThrlleThrSerGlnGluLeu
CTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCATCCAGGCTATACGATTTATGAACGT
LeuAlaGlnAlaGlnSerlleLeuAsnLysThrHisProGlyTyrThrlleTyrGluArg
GACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGATTTTACCAATGGATCAA
AspSerSerlleValThrHisAspAsnAspIlePheArgThrlleLeuProMetAspGln
GAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAATAAAAAATCTGGT
GluPheThrTyrHisValLysAsnArgGluGlnAlaTyrGluIleAsnLysLysSerGly
CTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATATTACGTCCTTAAAAAA
LeuAsnGluGluIleAsnAsnThrAspLeuIleSerGluLysTyrTyrValLeuLysLys
GGGG-AAAAGCCGTA.TGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTGTTÇACCATCAAÀTAC
GlyGluLysProTyrAspProPheAspArgSerHisLeuLysLeuPheThrlleLysTyr
GTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACAGCTAGCGAACGT
ValAspValAsnThrAsnGluLeuLeuLysSerGluGlnLeuLeuThrAlaSerGluArg
AACTTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTAAACTACTCTACAACAAT
AsnLeuAspPheArgAspLeuTyrAspProArgAspLysAlaLysLeuLeuTyrAsnAsn
I
CTCGATGCTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAAGATAATCACGAT
LeuAspAlaPheGlylleMetAspTyrThrLeuThrGlyLysValGluAspAsnHisAsp
GACACCAACCGTATCATAACCGTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGAGAGAATGCTAGC
AspThrAsnArgllelleThrValTyrMetGlyLysArgProGluGlyGluAsnAlaSer
TATCATTTAGCCTATGATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAACGAGAAGTTTACAGCTAC
TyrHisLeuAlaTyrAspLysAspArgTyrThrGluGluGluArgGluValTyrSerTyr
CTGCGTTATACAGGGACACCTATACCTGATAACCCTAACGACAAAATCGAAGGAAGAGTT
LeuArgTyrThrGlyThrProIleProAspAsnProAsnAspLysIleGluGlyArgVal
GTTTACACCGACTGTACTGAATCCGGACAAAACCTGTGTTTGTGTGAGGGTTCTAACGTC
ValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnVal
TGTGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCCGACGGTGAAAAGAACCAATGTGTCACT
CysGlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThr
GGTGAAGGTACCCCAAAGCCGCAGTCCCACAACGATGGAGATTTCGAAGAAATCCCAGAA
GlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGlu GAATATCTGCAGTAATAGGGATCCGAATTC*
GluTyrLeuGlnEndEnd

Claims (6)

  1. BMVIJafilkÊfiSiâ 11» - Processo para a preparação de uma proteína de fusão compreendendo uras primeira sequência e uma segunda sequência, sendo a proteína de fusão clivável entre as primeira s segunda sequências por uma enzima envolvida na coagulação do sangue5 em que após a proteína de fusão ser assim clivada a primeira e segunda sequências3 ou uma delas5 tem maior actividade fihrinoiiiics e/ou anti-trombótica do que a proteína de fusão não c:livadas caracterizado por compreender o acoplamento sucessivo de resíduos de sminoácido uns aos outros s/ou ligação de olígopepti-deos e/ou polipeptídeos,
  2. 21, - Processo de acordo com a reivindicação ig caracterizado por a proteína de fusão ser um dímero clivável de duas proteínas fibrinolíticas e/ou anti-trombóticss,
  3. 31, - Processo da acordo com a reivindicação i ou 2, caracterizado por a primeira sequência corresponder a uma hiru-dina ou a uma proteína tendo a actividade de hirudina,
  4. 41, - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a primeira sequência corresponder a estrepto-quinase ou a 001a proteína tendo a actividade de sstreptoquinase,
  5. 51, - Processo de acordo com qualquer uma das reivintíi- caçSes 1 a 4P caracterizado por a segunda sequência corresponder a uma hirudina ou a uma proteína tendo a actividade ds hirudina,
  6. 61, - Processo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4? caracterizado por a segunda sequência corresponder à estreptoquinsse ou a uma proteína tendo a actividade de sstreptoquinase. X' - 71* - Processa cama reivindicada em qualquer uma das reivindicações ia ò5 caracterizado por a enzima envolvida na coagulação do sangue ser calicreínas Factor XIIa? Xla, IXas VIIa5 Ka5 trombina (Factor lia) ou proteína C ac:tivada.= 81 = - Processo de acordo com qualquer uma das reivindi-caçSes 1 a ò5 caracterizado por a enzima envolvida na coaulaçSo dc? sangue ser o Factor Xa ou trombina* 91* - Processo de acordo com qualquer uma das reivindi-caçSes 1 a ò5 caracterizado por a enzima envolvida na coagulação tío sangue ser o Factor Xa=> 10â= - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a proteína ds fusão compreende a sequfncia do sitio de clivagem P4-P3-Gli~Args carac terizado por P4 representar um resíduo hidrofóbico e P3 representar um resíduo acidico* 111* - Processo de acordo com a reivindicação 1Θ, caracterizado por o resíduo hidrofóbico ser isolsueina* 121 = - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a hf caracterizado por a enzima envolvida na coagulação do sangue ser trombina* 131» - Processo ds acordo com a reivindicação 12* caracterxzatío por a proteína de fusão compreender a sequfncia do sítio de clivagem P4-P3—Pro—Arg-Pi * -P2* s em que P4 e P3 representara cada ura indspendenisrasnie um resíduo hidrofóbico e PS" s P2' representam cada um independentemente um resíduo não aeídico* 141* - Processo de acordes com a reivindicação 12, caracterizado por a proteína de fusão compreender a sequfncia do
    sítio ds clivagem P2-Arg··-·r1'= sm que um doe resíduos P2 s PiJ representa glieina e o outro é qualquer resíduo aminoácido* 15§ = - Processo de acorda com a reivindicação 12;i oaracterisado por a proteína de fusão compreender a ssqufncia do sítio ds clivagem Gli-Pro-Arg» lèã* - Processo para a preparação de ácido nucleico sintático ou recombinants codificador de uma proteína ds fusão prepsrável por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a Í5? caractarizatio por compreender o acoplamento sucessivo ds nucleotídeos uns aos outros e/ou liqaçlo ds oligonu-cieatidsos s/ou polinuclsGtidsos= 1/1= - Processo ds acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o ácido nucleico rscombinante ser um vsctor» IBS - Processo para a preparação ds uma célula ou linha celular transformada5 caracterizado por compreender a transformaçao de uma célula com um vector preparado por um processo de acordo com a reivindicação 17= 19S= - Processo de acordo com a reivindicação 18* caracterizado por ser um processo para a transformação de uma célula de levedura» 2£S= - Processo ds acordo com a reivindicação lv5 caractsrizado por ser é um processo para transforasação de uma célula bactsriana= 22â» - Processo de acordo com a reivindicação 2i= caracterizado por ser um processo para a transformação ds fcischs-richia coii= 231 = - Processo para a preparação ds uma composiçSo farmacêutica.! caracterizado por compreender a mistura de um ou mais compostos preparáveis por um processo ds acordo com qualquer uma das reivindicações la Ϊ5 e um veículo farmacêutica ou vetsrinariamsnte aceitável= Lisboas 5 de Dezembro de lv9®
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