PT96540A - Processo para a obtencao de uma preparacao farmaceutica para a maturacao de protimocitos, contendo factor de ligacao a ige de 25k e interleuquina-1 - Google Patents

Description

-V, ^ ____-'-ν'4' ' Ο invento diz respeita a uma preparação farmacêutica compreendendo o factor de ligação a XgE de 25K (IgE-bí 25K) e interleuquina-l (IL.-1) e à utilização da referida preparação farmacêutica para a estimulação da maturação de protimécitos, e»g. para o tratamento de imunodeficiências de células T e leucemias de protimécitos,.

Fundamento, do invento

Durante o desenvolvimento das células T* as células linfóides mãe migram para o timo rudimentar onde proliferam r©arranjam os seus genes para receptores de antigénios5 são ssleccionatias tendo e® consideração o seu reportório de especificidade MHC e diferenciam-se para células T funcionalmente maduras (Refs. 1.-6)= Os protisBócitos tendo o fenótipo CD7‘CD2 CD3 dos marcadores de superfície celular representam d primeiro passo identificável na diferenciação de células T CRefs„ 7-1.Φ) « Resultados recentes de estudas in vitro CRefs= 8-11) apontam para a capacidade destes protirnócitos em adquirirem marcadores de superfície de células T maduras após condicionamento adequado., As interseções celulares e mediadas por factores para este processo são mal compreendidas,, Foi sugerido um papel para as citocinas tais como Π...-1 ÍRsf„ 125 & IL-2 CRef* 115« A capacidade de IL-l para funcionar como hemopaietina-;i e para induzir o desenvolvimento de células hemopoiéticas muitipoientes caso se combine com os factores estimuladores de colónias,, tais como 6M-CSF? S-CSF5 CSF-l, XL-3? eritopoietina ou actividade potenciadora de eritró-citos,, está descrito no pedido PCI WO88/0®969 =

As células B estão implicadas na produção de várias linfoquinas que podem intervir na diferenciação de células T (Rsfs·:.· 15, 16) π Foi descrita a capacidade dos sobrenadantes derivados de células "B-mulas" induzidas com PHA (linfócitos da sangue periférico -a que foram retiradas células aderentes e células T maduras) para promover a geração in vitro de clones de células Ϊ maduras a partir de protimócitos indepsndentemente das suas origens anatómicas (Refs= Bs 13? 14)* Esta actividade de diferenciação de protimócitos (PTDA) derivou de células B CRef» 14)» IL-1 sósinha não tem efeito neste aspecto» No sntantOj os sobrenadantes derivados de células "EH-nulas" com PTDA contêm sempre níveis baiKos de IL-i 5 enquanto nem IL~2? XL-3S 'ÍL-4, IL-5·, IL~6p BM"~CSF? TNF nem IFM-gama foram detectados nestas sobrenadantes CRsfs» 8S 14), As actividades biológicas dos sobrenadantes derivados de células HEM-nulasH são e»g» a capacidade para promover a formação de células capazes de gerar colónias I a partir de medula óssea sem células T ffladurass timus e PBL, a capacidade para aumentar respostas derivadas de células CD#-1 » a capacidade para aumentar os números de CFU-BN» CFU-BEMM e BFU-E em culturas Desiter» a capacidade para aumentar a formação de colónias mieióities em culturas de células de medula óssea de doentes com anemia refraetária e a capacidade para induzir as marcas ds células T maduras asm células derivadas de algumas leucemias 1imfoblásticas agudas com características de protimóci-tos» IJsTs ersmplo de tais leucemias iinfohlásticss agudas com caracteristicas de protimócitos nas quais as células tumorais t@m um fsnétipo CD7’CD4 CD8 foi descrito por Kurtzherg st aX CRef» 10) .

Qs compostos com PlDA podem ser úteis no tratamento de tais leucemias5 pois as células T maduras derivadas das células de leucemia com caracteristicas de protimócitos poderão ter perdido a tumoreginicidade»

As imunodeficitncias de células T podem ser causadas pela incapacidade do organismo para produzir células T maduras ou pela parda de células T maduras» As imunodeficifncias de células T ocorrera e.g» nas doentes cara perturbações do funcionamento do timo, nos idosos e nos doentes cora SIDA,

Os compostos cora PTDA podem ser úteis no tratamento de tais células imuncdeficlentes,.·

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar uma composição exercendo PTDh= 3urpreendent.ementes uma preparação compreendendo o factor de ligação a IgE de 25 Kb (IgE-bf 2510 5 tarabéra designado CD23 solúvel <sCD23) e interleuquina-I ÍIL-l) tem PTDA,.

Outros objectivos do invento são a utilização da referida preparação para estimular a maturação de protimócifcos.

Descrição detalhada do invento 0 invento diz respeito a uma preparação farmacêutica compreendendo quantidades eficazes do IgE-bf 2SK tendo a sequência de aminoácidGS com a IdentificaçSo de Sequência (SEO ID) N2 1 mostrada na Lista de Sequências ou de uma sua variante» fragmento ou derivado farmacológicaments activos © de IL-l ou de uma sua variante, fragmento ou derivado como uma mistura para usar conjuntamente ou. em separado para uso sequsnciado, A referida preparação farmacêutica é daqui em diante também referido como preparação farmacêutica de acordo cora o invento, 0 IgE 25K ou uma sua variante, fragmente? ou derivado e ÍL-i ou uma sua variante, fragmento ou derivado slo conhecidos ou podem ser preparados da acordo com processos conhecidos, D IqE—bf 25K, suas variantes, fragmentos e derivados s métodos para a sua

, -¾ / ,-λ' produção os tão descritos s -„· g ,· em EP-A-€*254249e EP—A-0205405« 11--1. e métodos para a produção da mesma estão descritos s„g„ em E'P-A-®Íéí90Í s EP-A--0165654 =

Uma variante do IgE-faf 25K é uma proteína com uma sequfncia de aminoácidos alterada relativainente â sequência à sequineia de aminoácidos com a BEQ IX> NS 1= Uma variante inclui variantes naiurais3 e„g„ variantes alélicas humanas ou variantes isoladas a partir de espécies de mamífero não humanas,, e„g„ derivadas de murganho ou de macaco» Uma variante também inclui uma variante feita artif icialsnente»

IgE-bf 25K ou uma sua variante é preferencialmente feita por meio ds tecnologia de DMA recombinante* s»g« produsida pela expressão numa célula hospedeira heteréloga. Um ou mais aminoácidos podem ser ligados ao extremo M ou C» Ao extremo M pode ser ligado e = g= mationina, M-formil-mefcionina ou N-acetil--metionina,, especialmente quando o produto de expressão è obtido a partir da Escherichia co1i„ Uma variante feita artificialmente do IgE-bf do invento ou da uma sua variante inclui proteínas caractericadas pela troca de um ou mais5 até cerca de 1θ5 dos aminoácidos do IgE-bf 25K do invento ou da uma sua variante natural por um au nssis ds outros aminoácidos,.

Dentro do âmbito ds um fragmento tío IqE-bf 25K do invento estão também fragmentos de variantes do referido IgE-bf

Um fragmento do IgE-bf 25K ou de uma sua variante ê uma cadeia tíe amxnaãcidas tendo pelo menos í& e até 173 aminoá.ci*dos sucessivos numa sequência correspondendo ao invento ou â sequência de uma sua variante,. Fragmentos diferentes ou. idênticos podem ser ligados covalentemente por ligações peptídicas.

Fragmentos do IgE-bf 25K slo em particular c?s do grupo constituído pelos polipeptideos começando com qualquer um dos aminoácidos 2, 3, 4, 5, é, 7, 8, 7, i®, 11, 12 ou 13 e terminando com qualquer um dos aminoácidos 135 a 174 da sequência de aminoá-eidos com a SEQ ID NS í = Um fragmento preferido é caracterisado por ele consistir nos aminoácidos 3 a 174,= Este fragmenta pode ser encontrado para além do IgE-bf 25K do invento nos sobrenadam-tes de células EPMISSéé e representa assim um fragmento natural»

Os derivados do IgE-bf 25K ou ds uma sua variante sSo aqueles em que os grupos funcionais tais como amina, hidroxilo, mercaptoou carbonilo, sSo derivaticados, e»g„ glicosilados, anilados, amidados ou estsrifiçados, respectivaments„ Nos derivados glicosilados um oligossacárido έ geralmente ligado a aspara-gina, ssrina, treonina e/ou lisina» Os derivados asilados sSo especialmente acilados por um ácido orgânico ou inorgânico natural, s = g» ácido acético, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico» fBeralmenis o grupo amina M-terminal ou grupos hidroxilo, especialmente ds tirosins ou de serina slo acilados» Os ésteres sã'o de alcoóis naturais, e = g» metanol ou etsnol»

Outros derivados sâo sais, especial mente sais farsnacêu-ticaments aceitáveis, por exemplo sais de metais, tais como metais alcalinos s matais alcalinos terrosos, e = g = sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio ou cinco, ou sais de amónio formados com amónia ou uma amina orgânica adequada, como seja uma alquil— amina inferior, e = q= trietila-raina, hidroxi—alquilasnina inferior, e*g* 2-hidroxietilamina e similares» 0 termo derivado de acordo com o presente invento inclui também derivados de uma variante ou ds um fragmento da IgE-bf 25K do invento» ' - -s ? ? ^

Uma variante farmacológicamente activa? fragmenta ou derivado do IgE-hf 25K tem uma influencia estimuladora mensurável na velocidade de ínaturaçSo dos protirnócitos em combinação com IL-i ou uma sua variantes fragmento ou derivada farmacDlégicamen-te b.c tivo» ú preferida uma preparação farisscSutica compreendendo a IgE-bf 25K humana tendo a sequência de aminoàeidos com SEO ID NS1* 0 termo IL~i compreende IL~i purificada a partir do sobrenadants cias células de mamífero que naturalmenis produzem 11.--i, e.g. a partir de monócitos, faculiativamente após estimulação da produção de IL~1 em tais células* IL-J. pode derivar de diferentes espéciess e.g» humana* macaco ou murganho3 preferencialmente humana* A IL~i também compreende IL-i recombinante* e.g. IL-ía recombinante ou IL-Ιβ recombinantes produzida em E* coli ou em células de mamífera* 0 significado de um derivado de IL-1 está de acordo com o significada de um derivado da IgE-bf 25K do inventa aqui referido anteriormente„ Incluidos no âmbito do presente invento estão também derivados de variantes ou. fragmentos de IL-i „

Uma variante5 fragmento ou derivado da IL~1 farmacoló-gicarnente activo tem u.ma influência estimuladora mensurável na velocidade de maturação de proiimócitos em combinação com o IgE-bf 25K ou. uma sua variante., fragmento ou derivado farmacoló-g i c amen te ac t i vo*

Uma preparação farmacêutica de acordo com o invento tem uma influência estimuladora na velocidade ds maturação dos protifisócitos* Ela compreenda quantidades eficazes do IgE-bf 25K

ou cie uma sua variante» fragmento ou derivado farmacológicamsnts activo adequado para estimular a maturação dos- protirnócitos»

Quantidades eficazes dos ingredientes activos de uma preparação farmac£yt.ica de acordo com o invento compreendem uma proporção de cerca de 5# unidades de II-l ou de uma quantidade equivalente de uma variantes fragmento ou derivado farmacológica-mente aofciva até cerca de -0,25 a 125 ngs prsfsrsncialmsnte 25 a 10© ng de um IgE-bf 25K ou de uma quantidade equivalente de uma variante3 fragmento ou derivado farmacológicamsnte activo» Qs ingredientes- activos podem estar misturados ou separados» 0 invento também diz respeito á utilização de uma preparação farmacêutica de acordo com o invento para a estimulação da maturação de protimócitos in vitro» e,g» em culturas celulares ou in vivo» I = e» num organismo»

Um protimócito é uma célula mas hematopoiética que é capaz de sofrer maturação após- estimulação com faciorss de diferenciação adequados para dar um linfócito T maduro» Um protimócito, pode ser por exemplo, um protimócito de mamífero* e»g» murganho, macaca ou prefersncia1mente humano»

Um protimócito caraoteciza-se, por εκεπιρίο, pela presença da marca de superfície celular CD7 e pela ausência de e*g» as marcas de superfície celular CD2, CD3, CD4 e CDB» Assim» um protimócito de acordo com o invento é em particular uma célula CD7+CD2"”CD3”CD4—CD8—» A maturação dos protimócitos conduz a uma célula T que se caracteriza pela presença de certas marcas de superfície celular que não foram detestadas nos protimócitos» Tais marcas são e»g» CD2S CD3., CD4, CDS e TCR. Assims a maturação de um ; r .

•j- ~|“ ·} ^ protlmécito conduz á formação de uma célula CD7 CD2 CD3 iCR s/ou CD8+.

Os métodos para a determinação das marcas as supsrficís celular são bem conhecidos, e = g„ técnicas ds imunafluorssctncia indirecta.

Um protimócito è também uma célula tendo marcas de superfície celular típicas de protimócitos derivados ds um doente com leucemia 1infoblástica aguda„

Um protimócito e a maturação ds protimócitos para células I pode também ser controlada num nivel funcional„ A proliferação de uma célula I mas não a de um protimècito pode ssr estimulada com uma combinação de anticorpos anti-CD2 ou de anti-CD3 e 1L~2., A proliferação ds células pode ser determinada com métodos convencionais„ uma realização preferida do invento é a utilização de uma. preparação farmacêutica de acordo com o invento para a estimulação da maturação de células CD7’CD2 CD3 CD4 CDS para células CD2hCD3'TCR'CD4' e/ou células CDB' in vitro, e.g» em culturas celulares ou in vivo, 1,= 0= num organismo, A estimulação da maturação dos protimócitos è por exemplo.·, realizada pala adição de uma preparação farmacêutica de acordo com o invento a uma cultura celular compreendendo protimócitos numa quantidade tal que seja conseguida uma concentração finai de cerca de 0,:25 ng/ml até cerca de 125 ng/ml, de preferencia entre cercai de 25 ng/ml s cerca de 1@?S ng/ml do IqE-bf 25K,, sua yariante, fragmento cu derivado e uma concentração final de cerca de 5ê? ϋ/ml ds IL—1 ou de uma sua variante., fragmento ou derivado farmacológicamente activo» 10 -

Uma cultura cie células compreendendo protimócitos é ohtids a partir de tecida compreendendo as referidas células,* e»ç = a partir de medula óssea, nódulos linfáticos,* tecido embrionário, sangue, timo ou amígdalas,, 0 referido tecido pode ser obtido por biópsia e a referida cultura de células pode ser obtida por homogeneização do tecido, isolamento das células linfáticas, e„q„ por centrifugação num gradiente de densidade e por cultura das células linfáticas num meio de cultura adequado» Os métodos para o isolamento a cultura de células linfáticas são oon hecidos,.

Os protimócitos podem ser ainda purificados a partir das referidas células linfáticas seguindo métodos convencionais e»g« por separação das células linfáticas num separador de células ou numa superfície de plástico a que a população de células aderentes se liga. A população de células aderentes pode ser então tratada com uma combinação especificamenta citotóxica de anticorpos nlo dirigidos contra proiimóciios mas contra marcas da superfície celular nas outras células da população aderente e com complemento» A estimulação da maturação de protimócitos pode conduzir ao alargamento de um conjunto de células T e/ou. à diminuição de um conjunto de protimócitos numa cultura de células ou num organismo, Após estimulação in vitro de protimócitos isolados a partir ds um organismo, as células podem ser novamente injectadas ou implantadas num organismo da mesma espécie ou da uma espécie estreitamente relacionada ou prsferencialmente no indivíduo ds onde foram isolados os protimócitos.

Assim, o presente invento diz respeito também à utilização de uma preparação farmacêutica do invento para a estimulação da maturação de protimócitos in vitro ou in vivo,, por exemplo

V ' para c alargamento de um conjunta de células T in vltra, aq, em cultura de células, ou in vlvs; i.e. num organismo e = g, para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficiência de células T.. Dentro do êmbifco de uma imunodeficiência de células T estio incluídas imunodeficiências congénitas e adquirida de células T'.= e.ç, SIDftn imunodeficiências de células T de pacientes idosos, de pacientes que sofreram irauno-supresslo terapêutica s da doentes com doenças auto-imunes ou com perturbações de funcionamento do timo., é preferida a utilização no tratamento de SIDA» u invento diz respeito também â utilização de uma preparação farmacêutica do invento para a estimulação da maturação de protimácitCíSn por exemplo, para a diminuição de um conjunto de protimócifcos in vibro. 0=.0=, em culturas da células ? ou in vivo, i=a= num organismo, e.g. para o tratamento ou prevenção de uma leucemia linfoblástica com caracfceristicas de protimócitos,, daqui em diante também referido como leucemia de protimócitos.

Uma leucemia os protimócitos é uma leucemia aguda que se caracteriza por as células tumor-ais serem protimócitos, e.g. com fenôtipo CD'/"’CD4 CDS ==

Uma preparação farmacêutica de acordo com o invento pode ser administrada a um organismo, de preferência um organismo mamífero, mais preferencialmente um humano, parenteralmente, por θκείπρίο, intramuscularmentej subcutêneamente» intravenosamente ou directamente no tecido em que se dá a formação de linfócitos T=, e.g,= no timo ou na medula èsse, geralmente em formas de dosagem unitárias tais como ampolas» As quantidades dos polipeptídeos a serem administrados depende das suas actividades específicas,,- da idade, do peso s estado geral do doente, do tipo e gravidade da doença, rio modo de administração e tem de se basear na apreciação do médico assistente.·. Em geral potíe ser administrada uma dose

entre cerca de 1© pg e cerca de 0©ô© pg de cada um dos Iqt-ffa 23f< do invento., ou de uma sua variante, fragmento ou derivado farma— cologicamente actíva s IL-1 ou uma variante, fragmento ou derivado farmacológicamente activo por Kg de peso do corpo e dia»

Numa preparação farmacêutica de acordo com q invento as ingredientes activos estão presentes na forma, de uma misturai ou em separada» Se os ingredientes activos estivarem numa preparação farmacêutica separadamente, eles poderio ser administrados por vias separadas»

Uma preparação farmacêutica de acordo com o invento, particularmente se usada no tratamento ou prevenção de imunodefi-ci'ê'ncias de células T ou de leucemias de protimócitos, compreende veiculas farmscluticamente aceitáveis convencionais que sejam adequados parai administração parenteral 5 e»g = intramuscular, subcutânea ou infcraperitoneal e que nlo intsractuam de forma prejudicial com os ingredientes activos» E>;istem ampolas adequadas contendo um pó sólido ou ampolas e similares contendo soluçBes para infusão, de preferência soluçSes aquosas ou suspensões, sendo possível preparar estas antes de usar, por esemplo a partir de preparações liofilizadas que contêm e, ingrediente activo sozinha ou juntamente com um veiculo, como seja manitol, lactose, glucose, deKtrose, albumina e similares» A preparação farmacêutica pode ser esterilizada e, caso se pretenda misturada com aditivos, por exemplo preservativos, estabilizadores, emulsionemtes, salubilisantes, tampões s/au saxs, tais como cloreto de sódio Θ,9%, para a regulação da pressla asmática» A esterilização pode ser conseguida através de filtros de poro pequeno (©,45 μη de diâmetro ou menos) após o que a preparação pode ser iiofilizada caso se pretenda» Pode—se adicionar também antibióticos para se assegurar a esterilidade»

Uma preparação farmac@ut.ica da acorda cam a presente invento é distribuída em formas de dosagem unitárias, por exemplo ampolas, compreendendo i a 2ΘΘ® mg de um veículo farmacêuticsmen-te aceitável por unidade de dosagem e cerca de Θ,ΦΘϊ a 1ΘΘ mg, de preferfncia cerca de Θ,Ι a 5@ mg, de cada um dos ingredientes activos por unidade de dosagem,. 0 invento também diz respeito a um processo para a produção de uma preparação farmacêutica do invento. 0 referido processo caracieriza-se por o IgE-bf 25K do invento ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacológica-mente activo e IL-i ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacDlógicamente activo serem misturadas com um veiculo farma-cfuticamente aceitável ou, se os ingredientes activos estiverem na forma separada na preparação farmacêutica, são administrados separatíamsnte com um veiculo farmacêuticamente aceitável»

Uma composição farmacêutica de acordo com o invento é produzida de acordo com métodos conhecidos per se, por exemplo por processos convencionais de mistura, dissolução, liofiiização e similares e contêm Θ,1% a 1©©%, especialmente entre cerca de í% e cerca de 5©% das substâncias activas» 0 invento diz ainda respeito a uma embalagem contendo uma preparação farmacêutica de acordo com o presente invento facultativamente juntemente com instruções para a sua utilização»

Mum organismo ou cultura de células que tenha IL-1 suficiente apenas α IgE-bf 25K ou uma sua variante, fragmenta ou. derivado ou uma preparação farmacêutica compreendendo o IgE—bf Ξ5Κ ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacológicamente activo como único ingrediente activo tem de ser administrado para estimular a maturação de protimécitos» Igualmente, num organismo ou cultura de células tendo suficiente IgE-bf 2SK, apenas IL-i ou tuna sua variante., fragmento ou derivado ou uma preparação farmacêutica compreendendo J.L-Í ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacolégicaments activo como único ingrediente activo tem de ser administrado para estimular a maturação de protimóci- t.C3S r.

Como já foi referido atrás, a estimulação da maturação de protimácitos pode levar ao alargamento de um conjunta de células T e/ou á diminuição de um conjunto de protimécitos in vit.ro, e.g. numa cultura de células ou in vivo, i«e= num organismo

Assim, o presente invento diz respeito também à utilização do IgE-bf ou de uma sua variante, fragmento ou derivado farmaco1ógicamente activo, preferencialmente do IgE-bf 25K, para a estimulação da maturação de pratirnócitos numa cultura de células ou num organismo, s=g» murganho, macaco ou preferencial-mente em humanos, tendo suficiente IL-i, por exemplo para o aumento de um conjunto de células T, s=g. para d tratamento ou prevenção de uma imunodeficifncia de células T, de preferência de SIDA ou para a diminuição de um conjunto de protimócitos, s.g,: para a tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimácitos.,

Igualmente, o invento diz respeito è utilização de IL-1 ou de uma sua variante, fragmento ou derivado farmacológicamente scsxtâvsl para a estimulação da maturação de protimácitos numa cultura de células ou num organismo, e=ga murganho, macaco ou prefersncialmente em humanos, compreendendo IgE-bf 25K suficiente, por exemplo para o alargamento de um conjunto de células T, s»9« para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficifncia de células Γ, prefersncialmente de SIDA ou para a diminuição de um

Ji

conjunto de protirnócitos, e.g. para o tratamersta ou prevenção de uma leucemia de protimócitos» 0 significado de IL~Í s das suas formas preferidas é o mesmo dado atrás.

Um outro objectivo do presente invento è a utilização do IgE--bf 25K ou de uma sua variante, fragmento ou derivado farmacológicamente activo para a obtenção de uma preparação farmacêutica para a estimulação da maturação de protimócitos in vitro„ e,.g« numa cultura de células ou in vivo,. i»s. num organismo, e,g« em murganho, macaco ou de preferência em humanos, por exemplo para o alargamento de um conjunto de células T, e.g» para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficitncia de células T, tais como as referidas atrás, preferencia1mente de SIDA, ou para a diminuição de um conjunto de protimócitos, e.g. para o tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimócitos* A preparação farmacêutica contem apenas IgE-bf 25K ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacilogicamente activo ou facultativa-mente também IL-Í ou uma sua variante, fragmento ou derivado farmacológicamente activo como ingradiente activo* 0 primeiro tipo de preparação farmacêutica é para usar numa cultura de células ou organismo tendo IL—1 suficiente.

Um objectivo do invento é também a utilização de IL-1 ou de uma sua variante, fragmento ou derivado farmacolòaicaments activo para a obtenção de uma preparação farmacêutica para a estimulação da maturação de protimócitos in vitro. e.g. numa cultura de células ou in vivo, i.e. num organismo, e.g. em murganho, macaco ou preferencialmente em humano, por exemplo para o alargamento de um conjunto de células T, e.g. para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficiência de células T, preferencial-mente de SIDA ou para a diminuição de conjunto de protimócitos, s„g„ para o tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimócitos» A preparação farmacêutica contem apenas XL-1 ou uma sua

vsrlants3 fragmenta ou derivado farmacológicainente activo ou facultativamente também o IgE-bf 25K ou uma sua varinate,, fragmento ou derivada íarmacalágicamente activo cama ingrediente activo,. 0 primeiro tipo de preparaçSo farmacêutica á para usar numa cultura da células ou organismo tendo suficiente IgE-bf 2õK =

Abreviaturas

As abreviaturas aqui usadas atrás e nos exemplas têm os seguintes signi.ficadoss 8 3 DA ALL BFU-E CFU-8EMM CFU-BM IL-i rIL-I IL-2 rIL-2 Mab-45-afigel

HHC PBL PHA PTDA TcR

Sindrome da ímunodeficiência Adquirida

Leucemia Linfoblàstica Aguda

Unidade Formadora de EelosBes-Eriirócitos

Unidade Formadora de Colónias-Granulócifcas5

Erí fcréc 1 tos3 Monócitos·., Meq-acariécitos

Unidade Formadora de Colóniss-Granulomonócitos I n te r 1 euq u. i n a— 1 !nterleuquina-~l rscombinante ϊnterIeuqui na-2

Interleuquina-2 recombinante

Gel de afinidade revestido com Anticorpo rtanoclanai 45

CosipleKo major de histocompatibi 1 idade Linfócito do sangue periférico F i to-hemag1ut inina

Actividade de diferenciação de protimócitos Rsceptor de células T

X

Farte experimental

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente inventos ainda» eles nSo devem ser encarados como uma sua limitação»

Antic.grdos jnangc..lonais_JjjAbs) mAb Antigénio OKTé CD1 OKTllft CD2 0KT3 CD3 QKT4 CD4 OKTS cm bJT3i CD-i/complexoTCRaB RFT2 CD7 I0H2 CD14 IGB4 CD19

CD23 3 Ige-bf 25K Ϊ0Τ14

ant.i--Ti.gama A TCKgama 5TCS-1 TCRS

Fonte? Referencia Ortho Pharmaceuticals Ortho Pharmaceuticais Ortho Pharmaceuticals Ortho Pharmaceuticals Ortho Pharmaceuticals Becton Dickinson? Brenobls,, Francs Ref. 2© jjníiiunotech I mmun o tec h s lia rse i 11 e 3 L i m i g n y ·.= France Immunotechj, Siarseille» Lumigny,, Francs lmmunatechs Marseille5 Lumigny5 Francs Ref» 21 T csll Sciences» Cambridgeg MA

Cultura, de linfócitos

Todos os linfócitos foram cultivadas de rotina numa densidade de cerca de 1Θ45 células/ml em meio HacCoy?s 5A (Flow

- 1B -

Laboratories) modificado como descrito em Notainson et sL <Ref» 18)» Todos os meios foram suplementados com soro humano CHS) AB» plasma humano íHP) AB ou soro fetal de vitela <FC8>» 0 soro AB s o plasma AB foram obtidos da dadores com o grupo sanguíneo AB » As culturas foram incubadas a 37 °C numa atmosfera saturada com água contando ò% CGç.,»

Estimulação da___maturação de. células__ÇD7*ppCCQ3lÇD4~,

rfiM_ oyri.íi^LâáiJL

Os timócitos foram obtidos de modo conhecido per se cardando fragmentos tímicos íRef» 17)» Células CD7'CD2 CD3 CD4 CD8 foram isoladas a partir de timócitos por aderência a superfícies de plásticosequido tie dois cicias de tratamento citotóxico como descrito por Mossalayi et ai» CRef» 8) com 0KTÍ1A5 QKT3s 0KT4 s 0KT8 (Ortho Pharmaceuticals5 Raritan5 Nd) e subsequente incubação com complemento» 0 complemento usado neste trabalho é uns sara de coelhos com 4 semanas de idade obtidopor punção intracardiaca directa» 0 complemento foi testado quanto à ausência ds toxicidade inespecífica em precursores de células T humanas» As células CD7' foram então sujeitas a selecçSo positiva por aplicação das células CD7^CD2~CD3""CD4~CD8~" em frascos revestidos com o anticorpo monocitunai RFT2A íígn5 anti--CD7> como descrito (Ref» 13)» fis células Cl)/ CD2 GD3 CD4 CD8 foram colhidas a centrifugadas a 125Θ g durante 25 min num gradiente de Ficai! para eliminar as células mortas» As células CD74-CD2~CD3~CD4~CD8~ de f-icoll eram cerca de Φ-37¾ dos recuperadas do gradiente timócitos totais» A maturação das células 007*002 CD3 CD4 CD8'” fí3i estimulada peia sua incubação durante 48 horas a 37°C numa atmosfera húmida saturada contendo 6%

Clt» numa densidade de ir - Ί Λ ·

cèlulas/ml em meio MacCoy5 s 5ft contenda 20% de saro AB descample-mentacla s filtrada obtida de humanas saudáveis e uma ou mais combinaçSes dos seguintes factaress

IqE-bf recombinante tendo a sequência de aminoácidos coni a SEQ 1D NS i numa concentração de 25 ng/mL rIL-ΙΒ (5© U/ml ?, Blaxc?,, Beneva)„ rIL-2 < 100 U/ml p Slaxo5 SsnsvaI,, I0B6 (25 pg/síl| anticorpo monacionai ,, ígSlK) , I0T14 (1© pg/ml% anticorpo monoclanai5 Ig82a> *

As células foram então colhidas a 45© g e o estado de maturação das células foi testado por análise das marcas de superfície das células pela técnica de imunafluarescincia indi··· recta descrito na Raf =,(8) = As células colhidas antes da incubação com os factares assim como as células incubadas em meio nutritivo sem fsetores foram usadas como testemunha,. As células foram marcadas com os seguintes anticorpos monoclonais Canfcigénio reconhecido entre parêntesis) ?: OKTá (001)= 0KT11A (CD2),, 0KT3 CCD3),, 0!<T4 ÍCD4) 5 QKT8ÍCD8) s WT31 íreconhecendo o complexo CD3/TCR«B)5 I0T14 (CD2S>? I0B4 (CD19), RFT2A CCD7), anti-TigamaA ou. t! Utí—1 ( FcKo) » Conjugado de fluaresceína anti—fraçimentos F(ab?> de murganho (Becktcn Dickinson) foi aplicado como segundo anticorpo (todos os anticorpos e fragmentos são usados numa oxiu.!ç;do final de 1/5©). Os resultados- estão paresentados na Tabela í. Ό·

ο Ό (ΰ Ν •Η rH (d ω 5-, ο G

Exemplo,2g Estimulação.....mitogéniça das células derivadas das - estimuladas no sentido cálulas.....CD7ICP2......CD5.....CS4......CD8 da maturação Células CD7+CD2"CD3"CD4-CD8- foram Cubadas durante 24h na presença de vários factcres como descrito no fc.xemplo í

Elas foram então lavadas em Solução Equilibrada de Sais de Hank íRBSS, Institui Pasteur, Paris. França) e subsequentemente cultivadas em meia de ricCov 5b Cl(? célulss/ml, 37°C? CO^) na prssenca de ascistss diluídas a 1?4Φ0 contendo ínfib snti-CDS·.,,TT _ i - I A i íRef., 22)n Ho dia S? adicionou-se 1 mCi '"‘H-Timidina a 5 x 1Θη células num voluíne final de ®5i ml durante 24 horas. As células foram lavadas em HBSS? filtradas através de papel Bkatron CWQ 11731| Suffolk5 UKí5 dissolvidas em solução de cintilação (Pico-Fluor.. Packardp Broningens Netherlands) e contagens ra-tíioactivas foram determinadas usando um Contador de Cintilação ís iBeckman)„ Gs resultados médios s desvios padrSss de quatro séries independentes d© experiências estão apresentados na Tabela 2. Não foi obtida uma resposta significativa da proliferação celular se as soluções de IgE-bf 25í< forem pré-incubadas com esferas de ssfaross revestidas com I0B6 (resultados não apresentados) =,

Tabela 2¾ Resposta proiiferativa (incorporação ds H^-timidina) de apès condicionamento in vitro Células pré-incuhadas coms CPM (κίΘ°:)/5κΐ04 células 2? 6 + i,ít 2 5 4 + 1,2 2,8 + 1,4 12,9 + 3,3 3.1 + 1,5 3,7 + 1,8 16,2 + 4,® 3.2 4- ô,é Não

IgE~bf 23i< recombinante rIL-ÍS

IgE--bf 2SK recombinante ·* rlL-lB r ÍL-2 r I L~ 1 P> + rIL-2

IgE-bf 25K recombinante + rlL-iB a ríL-2 IgE-hf 25Κ: recombinante * rIL-2 t Média 4· desvio padrão de 4 experiências, cada uma feita em triplicado R.ágffi.al.£_.3,i. Estimulação mitoqénica dependente da......dose e maturação

<à£JÍÉÍMMã_iaZÍCjMlkS3lCD4l£SC Células CD7 CD2 CD3 CD4 ÇD8 48 horas em meio de McCoy 5ft (1®° céluls/ml, r foram cultivadas durante 37°C, 6% C0^> na presença cáe uma concentração constante de rILiB (5® U/ml) e ds várias concentraçSes ds IgE-bf 25K recombinante» As células foram então colhidas e lavadas» A percentagem ds orotirnócitos CD?-5" que adquiriram a eKprsssão de CD2 e de CD3 foi então determinada por tfe_nicas de imunofluorescência indirecta com QKiil <anti-CD2) s 0KT3 Canfci—CD3) s com saro de coelho anii~-F(ab? ds murganho coma segundo anticorpo (todos os anticorpos e fragmentos foram usados numa diluição final de 1s5®)= Numa experiência paralela a resposta proliferativa das células foi determinada de acordo com o Exemplo 2= Os resultados estão apresentadas na Tabela 3,

Tabala 5e Resposta prolifsraiiva (incorporação de ΗΓ -ti.midi.na 5 e SKprsssâo das oarcas de superfície celular CD2 e CD3 sít· células rrt^4-rp7-cm~r^4-rpR- após incubação na presença de várias concentrações ds IgE-hf 25K racoobinante

IgE-bf 25f< recombânante Células CD2^C"^ (%}% Respostas da c r esc i sien to (cpffl ;<Í©'^)ÍS D 7 1 v * 'J 0,05 7 X T. \.í 0,:2S 17 1.8 -T» ~ ··- 5 *-* 3® 2,6 25 65 6,8 5Θ 63 6 ? 6 75 59 ò52 10© 55 ND Í25 21 2,8 25© é 0,8 $ Média de 2 experiências,, desvio padrão <1# % tt nédia de 2 eKperiências, desvio padrão <25% ND = Nâo efectuado. Eámm*......il Efeito,sin^msUçc^. de__lQE-bf......2sK e r IL- 1B na £ãgã£idadfe_de_çj^^ ,de células derivadas da ?2âtyrag^o_JjTdugida.. da ...células CD7^CD2"‘CD3~CD4~'CDS' Células 007^002 CD3 CD4 CD8” fiJi am ~llCutk:lCÍas sm mei° de rlciJoy oA \ϊΦ" céluias/πΰ,, 37°C, 6% CD.-,) durante 48 horas na presença de 25 ng/ml de IgE-bf Ξ5Κ5 25pg/ml I0B6? m U/rol de rlL—líl ε/ou ΪΦΘ& U/ml de rIL—2= Ϊ0Β4 foi usado numa concentração V íCta 24

tía 2ΰ pg/ml como testemunha da mesma isotipo par I0S6 e n.Io influência inibidora no efeito de IgE-bf 25K==

As células foram entSo lavadas em HBSS e cultivadas em diluiçSas limites como descrito por Mossa1ayi st al „ ? (Rei, S) na presença de ant:L--CD2T_! T íascistes Ικ40Θ3 Ref» 22) s 50 U/ml de rTL.-2, 10 ^ células CD2 auto Iogas irradiadas (250# rads) foram também adicionadas à cultura» As frequências de clonagem foram avaliadas como descrito por Porter e Berry CRef= 23) por contagem das células positivas versus negativas no dia 1Θ apés cultura. Os resultados estio apresentados na Tabela 4»

Tabela 4¾ Efeito sinreoistico de IgE-faf 25i< recombinani© s rIL-ífl na capacidade de clonagem da células derivadas da maturação induzida em células CD7‘CD2 CD3 CD4 CD8

CsL.UL.AS PRÉ-TPATADAS COM FREQUÊNCIA DE -CLGNABEH

MÉDIA GAMAS

Natía 1/184 1/95 - 1/264 ríL-lB 1/123 1/69 - 1/168 IgE-bf 25K rsosbinants 1/145 1/119 - 1/209 IgE-bf 2ΞΚ recombinante -i- r í 1 -1 is 1/2,6 1/1,8 - 1/3,6 IgE-bf 25K recombinante -i- rll-lfi + rIL-2 1/2S 1 1/1,6 - 1/3,2 IgE-bf 25K recombinante 4- rn-iB + rIL-2 + IQB6 1/98 1/65 - 1/112 t Média e gama das frequências de clonagem (cavidades positi-vas/cavidadss negativas) ds quatro dadores distintos=

1. Snodgrass, H.R., Kisíelow, P., Kiefler, M., Steinmetz, M. & von Boehmer, H. Nature 313, 592-595 (1985). 2. Raulet, D.H., Garman, R.D., Saito, H. & Tonegawa, S. Nature 314, 103-107 (1985). 3. Born, W., Yague, J., Palmer, E., Kappler, J. & Marrack, P. Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 82, 2925-2929 (1985). 4. Ceredig, R., Dialynas, D.P., Fitch, F.W. & MacDonald, H.R. J. Exp. Med. 158, 1654-1671 (1983) . 5. Marrack, P. et al. Cell 53, 627-634 (1988). 6. Sia Teh, H. et al. Nature 335, 229-233 (1988) . 7. Furley et al. Cell 46, 75-87 (1986). 8. Mossalayi, M.D. et al. Blood, 71, 1281-1287 (1988). 9. Haynes, B.F., Martin, M.E., Key, H. & Kurtzberg, J.J. Exp. Med. 168, 1061-1080 (1988). 10. Kurtzberg, J. et al. Blood 73, 381-390 (1989). 11. Toribio, M.L. et al. J. Exp. Med. 168, 2231-2249 (1988). 12. Rock, K.L. & Benacerraf, B.J. Immunol. 132, 1654-1662 (1984). * *

13. Mossalayi, M.D. et al. J. Immunol. 134, 2400-2404 (1985). 14. Lecron, J.C. et al. Exp. Hematol. 17, 785-790 (1989). 15. Jurgenson, C.H., Ambrus, J.L. & Fauci, A.S. J. Immunol. 136, 4542-4547 (1986). 16. Taira, S., Matsui, M., Hayakama, K., Yokoyama, T. & Nariuchi, H.J. Immunol. 139, 2957-2964 (1987). 17. Dallol, A.H. et al., Exp. Hematol. 17, 774-778 (1989) 18. Robinson, W.A. (1971) In vitro cell culture of hemopoietic cells. In: Dicke, K.A., and Beckum, V. (eds.) . Ri jkwijk. 19. Mossalayi et al., Tissue Antigen 33, 100 (1989) 20. Campana, D. et al., J. Immunol. 142, 57-66 (1989) 21 Faure, F. et al., J. Immunol. 141, 3357-60 (1988). 22. Huet, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 84, 7222-26 (1987) . 23. Porter, E.H. and Berry, R.J. Br. J. Câncer 17, 583-89 (1963). v.'

Listagem da sequências ssílislmjl TIPO Dt SESUêNulAs Polipeptídso COHPRIHEWTO 1>A SEBUôNCIfts 174 aminoécidos TOPOLOSIAϊ Linear FONTE ORIfôlNftLs células B humanas FONTE E3{PERII1ENTALs sobrsnadants? da célula CHO transformadas com pCALS-BF/ND ÍEP-A-Q 2S4 249) PROPRIEDADES s IqE -hf 25K solúvel 3 também designada CD23 solúvel Leu Arg Met Glu Leu Gin Vai Ser Ser Gly Phe Vai Cys Asn Thr 5 10 15 Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gin Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe 20 25 30 Gly Lys Gly Thr Lys Gin Trp Vai His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp 35 40 45 Asp Met Glu Gly Gin Leu Vai Ser Ile His Ser Pro. Glu Glu Gin 50 55 60 Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly 65 70 75 Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Vai Asp Gly • 80 85 90 Ser His Vai Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser 95 100 105 Arg Ser Gin Gly Glu Asp Cys Vai Met Met Arg Gly Ser Gly Arg 110 115 120 Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Vai Cys 125 130 135 Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala 140 145 150 Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu 155 160 165 Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser . 170

Claims (1)

1. REIVINDICACdES s iã. Processo psrs & obtenção de uma preparação fafins cêutica, especialmenta para aplicação parsntérica ou intravenosa compreendendo uma quantidade eficaz de 2gE-bf 25K, tendo a se qu§'nc.ia de amincâcitíiQS com a SEQ ID No.ls Leu Arg Met Glu Leu Gin Vai Ser Ser Gly Phe Vai Cys Asn Thr 5 10 15 Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gin Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe 20 25 30 Gly Lys Gly Thr Lys Gin Trp Vai His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp 35 40 45 Asp Met Glu Gly Gin Leu Vai Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gin 50 55 60 Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly 65 70 75 Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Vai Asp Gly 80 85 90 Ser His Vai Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser 95 100 105 Arg Ser Gin Gly Glu Asp Cys Vai Met Met Arg Gly Ser Gly Arg 110 115 120 Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Vai Cys 125 130 135 Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala 140 145 150 Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu 155 160 165 Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser 170

   ou uma sua variante, fraqmento ou derivado, farmacologicamente activos, b de IL-i du uma sua farmacoloaicamente ac ti vos , sol:? variante, fragmento ou derivado., a forma de uma mistura para usar conjuntamente ou na forma separada para usar sequenciadamente, caracterizado por os consponentes serem processados de acordo com métodos convencionais e por se utilizar no referido processo uma proporção de aproximadamente 5$ unidades de IL-i ou uma quantidade equivalente de uma sua variante, fragmento ou derivada, farmacologicamente aetivos, para cerca de 0,25 a 125 ng de IgE-bf 25K tendo a sequência de aminoácidos com a SEQ ID No.i ou uma quantidade equivalente de uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacoloqicamsnte aetivos» 2ã» - Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por ser usado o IgE-bf 25K humano tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID No.i» 3ã« - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser usada IL-i» 4ã« - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser usada IL-i recombinante» 5ã* - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser usada IL-ίβ recombinante» car oS.. PrQí„esiso dí terizade? por ser usada IL-i humana» 7a. Processo de acordo com a reivindicacS CÃU U « :arar- terizado por usada JL--01 humana recombinante.

   8â» - Processa de acordo com a reivindicação i, carac-terizado por ser usada, uma proporção de aproximadamente 5Θ unidades de IL-1 ou uma quantidade equivalente da uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activo, até aproxi~ madamente 25 a 1Θ® nq de IgE-bf 25í< tendo a sequência de aminoá-eidos com SEQ IB No.i ou uma quantidade equivalente de uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activas, 9§„ - Processo de acordo com a reivindicação i, caracte-ricacto por a preparação farmacêutica estar na forma de dosagem unitária» 10iL - Método para a utilização de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação í, para a estimulação da maturação de protimócitos, in vitro ou in vivo, nomeadamente para a estimulação da maturação de profcimócitas de mamíferos, especialmente protimócitos humanos, em particular para a estimulação da maturação de células CD7‘CB2 CD3 CD4 CD8 para células CI)2+CD31TCR*CB4+ e/ou CD8f, caracterizado por o IgE-bf 25í< tendo a sequência de aminoácidos com SEQ IB NS l ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de aproximadamente Φ,25 ng/ml a cerca de 125 ng/ml, e a IL-1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, biologicamente aciivos, ser aplicada numa concentração final de aproKÍmadamente 50 U/ml, llâ» - Método de acordo com a reivindicação 1Θ, caracte-rizada par a IgE-bf 25K ou uma sua variante, fragmento ou. derivado, biologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de aproximadamente 25 ng/ml a cerca de ΊΘ0 ng/ml, e a IL-4 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de aproximadamente 5Θ U/ml»

   X2ã» " Método para a utilização de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação í, para a estimulação da maturação de protimócitos, in vitro ou in vivo., nomeadamente para o aumento de um conjunto de células T, especialmente para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficitncia de células T, em particular de uma imunodeficiãncia adquirida de células T, principalmente para o tratamento ou prevenção de AIDS, csracteri-sado por o IgE-bf 2SK tendo a sequência de aminoácidos com SES ID NS 1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacológica-mente activos, ser aplicado numa concentração final de aproxima-damente €>,25 ng/ml a cerca de 125 ng/ml, s a IL-1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, biologicamente activos, ser aplicada numa concentração final de aproximadamente 50 U/ml- 13ã» - Método de acordo com a reivindicação 12, caracte-rizado por o tçt-hí 25K ou uma sua variante, fragmento ou derivado, biologicamente activos, ser aplicada numa concentração final de aproximadamente 25 ng/ml a cerca de 1Θ0 ng/ml, e a IL-l ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, ser aplicado numa concentração final da aproximadamente 50 U/ml« 14ã» ~ Método para a utilização de uma preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação i, para a estimulação da maturação ds protimócitos, in vitro ou in vivo nomeadamente para a diminuição de um conjunto de protimócitos, especialmente para o tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimócitos, em particular uma leucémia de protimócitos em que as células de tumor têm um fenétipo CD7+GD4""’CD8"-, caracterizado por o IgE-bf 25K tendo a sequência de aminoácidos com SEQ ID MS 1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de aproximadamente 0,25 ng/ml a cerca de 125 ng/ml, e a IL-i ou uma sua variante, fragmento ou

   - V V

   derivado ? biologicamente a.c ti vos , ser aplicada, numa concentração final de aproximstíamenta 5€* U/ml» ri 2 do, 15â. - Método de acordo com a reivindicação 14, caracte-.do por o IgE-bf 25K ou uma sua variante, fragmenta ou deriva-biologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de apr oximadamente 25 ng/ml ® cerca de 100 ng/ml, e a IL—í ou uma sua variante, fragmento ou derivado, íarmacologicamente activos, ser aplicado numa concentração final de aproximadamente 50 U/mi» 16ã» - Método para a utilização do IqE~hf 25K tendo a sequência de aminoácidos com a oEB ID Md.> 1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farcnacologicamente activos, para a estimulação da maturação de protimócitos numa cultura celular ou num organismo compreendendo IL~í suficiente, nomeadamente para a aumento de um conjunto de células T, especialmenta para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficiência de células Ύ, caracte-rizarfo por o IgE-bf 25K tendo a sequência de aminoácidos com SEQ ID N9 1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologi-camente activos, ser aplicado numa concentração final de apraxi-madamente 0,25 ng/ml a cerca de 125 ng/ml* 17ã-» - Método para a utilização do IgE-bf 25i< tendo a sequência de aminoácidos com a SEQ ID No.i ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, para a estimulação da maturação de protimócitos numa cultura celular ou num organismo compreendendo IL-l suficiente, nomeadamente para a diminuição de um conjunto de protimócitos, especialmente para o tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimócitos, caracte-risado por o IgE-bf 25i< tendo a sequência de aminoácidos com SEQ ID NS 1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacologi-camente activos, ser aplicado numa concentração final tís aproxi-madamente 0,25 ng/ml a cerca de 125 ng/ml= 33

   sua na ou 18i, - Método para a utilização da IL-l ou de uma variante, fragmento ou derivado, farmacologicamente activos, estimulação da maturação de protimécitos numa cultura celular num organismo compreendendo IgE—bf 25K suficiente, nomeadamente para o aumento de um conjunto de células T, especialmente para o tratamento ou prevenção de uma imunodeficiência de células T, caracterizado por a IL-1 ou uma sua variante, fragmento ou derivado, biologicamente activos, ser aplicada numa concentração final de aproximadamente 5Θ U/ml = 19ã. - Método para a utilização da IL-í ou de uma sua variante, fragmento ou derivado, farmacalogicamente activos, na estimulação da maturação de protimócitos numa cultura celular ou num organismo compreendendo IgE-bf 25í< suficiente para a diminui— ção de um conjunto de protimócitos, especialmente para o tratamento ou prevenção de uma leucemia de protimócitos, caracterizado por a IL-i ou uma sua variante, fragmento ou derivado, biologicamente activos, ser aplicada numa concentração final de aproxima-damente 50 U/ml„ Lisboa, 22 de Janeiro de 1991 0 ADJUNTO