PT965644E - Ligandos para modular a expressão de genes exógenos através de um complexo de receptor de ecdisona - Google Patents

Ligandos para modular a expressão de genes exógenos através de um complexo de receptor de ecdisona Download PDF

Info

Publication number
PT965644E
PT965644E PT99304444T PT99304444T PT965644E PT 965644 E PT965644 E PT 965644E PT 99304444 T PT99304444 T PT 99304444T PT 99304444 T PT99304444 T PT 99304444T PT 965644 E PT965644 E PT 965644E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
ome
combination
oet
phenyl
ring
Prior art date
Application number
PT99304444T
Other languages
English (en)
Inventor
Dat Phat Le
Robert Eugene Hormann
Glenn Richard Carlson
Dean Ervin Cress
Tarlochan Singh Dhadialla
Original Assignee
Intrexon Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intrexon Corp filed Critical Intrexon Corp
Publication of PT965644E publication Critical patent/PT965644E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/10—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes
    • C07D319/14—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D319/16—1,4-Dioxanes; Hydrogenated 1,4-dioxanes condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D319/18—Ethylenedioxybenzenes, not substituted on the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C243/00—Compounds containing chains of nitrogen atoms singly-bound to each other, e.g. hydrazines, triazanes
    • C07C243/24—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids
    • C07C243/38—Hydrazines having nitrogen atoms of hydrazine groups acylated by carboxylic acids with acylating carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

DESCRIÇÃO "LIGANDOS PARA MODULAR A EXPRESSÃO DE GENES EXÓGENOS ATRAVÉS DE UM COMPLEXO DE RECEPTOR DE ECDISONA"
Esta invenção refere-se à utilização de ligandos não-esteróides para induzir ou suprimir a expressão de um gene exógeno em células animais e de plantas.
No campo da engenharia genética, o controlo temporal preciso da expressão dos genes, isto é, a habilidade para activar ou suprimir um gene, é uma ferramenta valiosa no estudo, manipulação e controlo do desenvolvimento e de outros processos fisiológicos (ver, por exemplo, Evans e No, Publicação
Internacional PCT N° WO97/038117 e as referências aí citadas). Em sistemas mamíferos, as aplicações incluem direccionamento genético indutível, sobrexpressão de genes tóxicos e teratogénicos, expressão de ARN anti-sentido e terapia génica. Em sistemas de plantas, as aplicações incluem o controlo de ameaças de plantas, fertilidade de fêmeas e machos; sobrexpressão de agentes protectores de plantas; e produção ou modificação de produtos de plantas desejados incluindo materiais nativos e não nativos. Para animais e plantas, a indutibilidade pode ser valiosa para a produção de proteínas estranhas, por exemplo, proteínas terapêuticas, enzimas industriais, polímeros e semelhantes. É importante que o agente utilizado para controlar a expressão génica, que é frequentemente referido como "interruptor génico" seja um que esteja normalmente ausente do 1 organismo no qual o gene a ser controlado reside. Isto destina-se a evitar a expressão ou supressão inesperada do gene. Por exemplo, um sistema indutivel regulado pela tetraciclina foi concebido e utilizado em ratinhos transgénicos, por meio do que a actividade génica é induzida na ausência do antibiótico e suprimida na sua presença. infelizmente, neste caso, a farmacocinética da tetraciclina pode interferir com a sua utilização como um interruptor génico de "on-off" eficiente. A Publicação da Patente Internacional N° WO 96/037609 descreve um receptor esteróide de insecto isolado de Heliothis virescens ("HEcR") que é capaz de actuar como um interruptor génico que responde a indutores esteróides (e. g., 20-hidroxiecdisona e Muristerona A) e a certos indutores não esteróides. Os indutores não esteróides têm uma vantagem evidente sobre os esteróides, neste e em muitos outros sistemas que respondem a indutores esteróides e não esteróides, por uma série de razões incluindo, por exemplo, menor custo de manufactura, estabilidade metabólica, ausência de insectos, plantas ou mamíferos e aceitabilidade ambiental. O pedido PCT descreve a utilidade de duas dibenzoil-hidrazinas, 1,2-dibenzoil-l-terc-butil-hidrazina e tebufenozida (N—(4 — etilbenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-terc-butil-hidrazina) como interruptores génicos para o sistema HEcR e sugere que outras dibenzoil-hidrazinas, tais como as reveladas na Patente U.S. No 5117057, podem também funcionar como interruptores génicos no sistema. Apesar disto poder ser verdade, a actividade destas dibenzoil-hidrazinas é incerta. Especificamente, o documento 5117057 mostra uma classe muito vasta de dibenzoil-hidrazinas, muitas das quais parecem ser ineficazes como interruptores génicos. O documento WO 96/031609 indica que 2 quando 20 dessas dibenzoil-hidrazinas foram testadas, apenas 7 apresentaram alguma actividade. A Publicação de Patente Internacional N° WO 96/027673 revela a utilização de tebufenozida como ligante químico para o receptor de ecdisona de Drosophila melanogaster. Este receptor é utilizado para controlar a expressão de genes em plantas transgénicas, resultando no controlo de várias ameaças de importância agronómica.
Infelizmente, mesmo que os ligandos descritos nas referências acima identificadas mostram actividade de indução de genes repórter em células isoladas, não foi feita nenhuma consideração quanto à sua utilização em organismos completos, tais como plantas e animais intactos.
Deste modo, persiste uma necessidade continuada para o desenvolvimento de ligandos não esteróides, com actividade aumentada ou consistente, em comparação com ligandos conhecidos e que demonstrem essa actividade em plantas e animais intactos. A requerente verificou a existência de um grupo limitado de derivados de dibenzoil-hidrazina que, não só apresentam actividade de indução de gene repórter em células isoladas, como também têm vantagens sobre as diacil-hidrazinas conhecidas, 1,2-dibenzoil-l-terc-butil-hidrazina e tebufenozida, quando utilizadas em plantas e animais intactos, devido ao seu transporte melhorado e propriedades de distribuição, estabilidade metabólica, actividade residual, afinidade para o receptor e ausência de efeitos adversos.
Num aspecto da presente invenção, é proporcionado um método in vitro para a modulação da expressão de um gene exógeno, 3 compreendendo o contacto de um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um domínio de ligação de ADN; b) um domínio de ligação de ligando; c) um dominio de transactivação; e d) um ligando de fórmula; R4
E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F, ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo; 4
Cl, ch2oh R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, CN, OMe, ou OEt; desde que: -di-Me, a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,í 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; -di-Me, 5-di-F, então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,í 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2, 2.4- ou 2,5-di-Cl; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: 5-di-F, -Br, ou OMe ou i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, 2 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OEt; d) quando R1 é i-Pr; R5, e R6 então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; e R6 é então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, 3.5- di-Me; 5 f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Me ou Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; com uma construção de DNA compreendendo: a) o gene exógeno; e b) um elemento de resposta; em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do dominio de ligação do DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para modular a expressão de um ou mais genes exógenos numa planta, compreendendo a administração à planta de uma quantidade eficaz de um ligando de fórmula: 6 ο ο R4
em que : Ε é um (C4-C6)alquilo contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e com os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo a que R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe OU OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 7 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F or Cl, e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; 8 em que as células da planta contêm a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; e em que a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene. É proporcionado, num outro aspecto da presente invenção, um método para a produção de um polipéptido compreendendo os passos de: a) selecção de uma célula que seja insensível a exposição a um ligando de fórmula: 9 ο ο
R
Rd \ / Η-Ν—Ν- πΚ
R Ε \ ^ W >R6
R R1 em que : Ε é um (C4—C6)alquilo contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e com os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo a que R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 10 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo ; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então Rl é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; 11 b) introduzindo na célula: 1) uma construção de DNA compreendendo: a) um gene exógeno codificando o polipéptido; e b) um elemento de resposta; em que o gene se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e 2) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um dominio de ligação de DNA; b) um dominio de ligação para o ligando; e c) um dominio de transactivação; e c) expondo a célula ao ligando do passo (a).
Noutro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a regulação da expressão de genes endógenos e heterólogos numa planta transgénica, compreendendo o contacto de um ligando de fórmula: R4
em que: E é um (C4—C6)alquilo contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; 12 R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e com os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo a que R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; 13 d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; com um complexo receptor de ecdisona no seio das células da planta, em que as células contêm ainda uma sequência de ligação de DNA para o complexo receptor de ecdisona, quando em combinação com o ligando, e em que a formação de um complexo de complexo receptor de ecdisona-ligando-sequência de ligação de DNA induz a expressão do gene.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de um ligando de fórmula (I): 14 ο ο R4
em que : Ε é um (C4-C6)alquilo contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e com os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo a que R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 15 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; para a modulação in vitro da expressão de um ou mais genes exógenos numa célula animal, em que a célula contém: 16 a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; e em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene.
Noutro aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um ligando de fórmula (I): 0
E H N—N·
em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; 17 R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e com os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo a que R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; 18 d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; na preparação de um produto farmacêutico para modulação da expressão de um ou mais genes exógenos num animal, em que as células do animal contêm: a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um dominio de ligação de DNA; 2) um dominio de ligação para o ligando; e 3) um dominio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; 19 em que: a) o gene se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene. É aqui descrito um melhoramento, num método para modular a expressão de um gene exógeno, compreendendo o contacto de um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um domínio de ligação de DNA; b) um domínio de ligação para o ligando; e c) um domínio de transactivação; e d) um ligando; com uma construção de DNA compreendendo: a) o gene exógeno; e b) um elemento de resposta; em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta, na presença do ligando, resulta em activação ou supressão do gene; o melhoramento compreendendo: a selecção de um ligando de um composto de fórmula I: 20 ο ο R4
I em que E é um (C4-C6)alquilo contendo um carbono terciário ou um ciano(C3-C6)alquilo contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN, ou SCHF2; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, allyl, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, ou é unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; 21 R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, Br, formilo, CF3, chf2, chci2, CH2F, CH2C1, CH2OH, CN, C^CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe, ou SEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt;
e R6 é 3,5-di-Me 2,4- ou 2,5-di-F então R3 é H e a combinação R4, R5, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, 2-Br, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, Br, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe, ou SEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F ou Cl, e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; 22 f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados, formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Me ou Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo, aos quais estão ligados, formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; h) quando R1 é formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN, ou SCHF2; então R2 é OMe ou OEt, R3 é H, e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e i) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, ο-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, ou NH-CN; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me. É aqui mencionado um método para modular a expressão de um gene exógeno, compreendendo o contacto de um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um domínio de ligação de DNA; b) um domínio de ligação do ligando; 23 c) um domínio de transactivação; e d) um ligando consistindo num composto de fórmula I; com uma construção de DNA compreendendo: a) o gene exógeno; e b) um elemento de resposta; em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta, na presença do ligando, resulta em activação ou supressão do gene.
De modo a obter um balanço óptimo entre a) a ligação de ligando e a actividade do interruptor génico resultante e, b) transporte, sistemicidade, toxicidade e estabilidade metabólica em plantas e animais intactos, a posição e tamanho dos grupos substituintes do composto de fórmula I são importantes. 0 balanço óptimo de propriedades parece ocorrer quando E é t-butilo, R1 é etilo, R2 é etoxilo, R3 é hidrogénio, e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-dimetilo. A composição de cada um destes grupos "R" pode ser variada consideravelmente. No entanto, as variações que conduzam a mudanças significativas no tamanho, forma e polaridade global do composto de fórmula I terão tendência a reduzir o balanço óptimo e, consequentemente, as propriedades melhoradas do composto. Por esta razão, quando a composição de qualquer grupo R particular é alterada em relação à óptima, as variações na composição dos grupos R remanescentes deve ser limitada. 24
De um modo preferido, E é (C4-C5) alquilo. De um modo mais preferido, E é t-butilo.
De um modo preferido, R1 é Me, Et, i-Pr, F, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, or CF2CF3. De um modo mais preferido, R1 é Me, Et, i-Pr, F, CF3, CHF2, CH2F, CH2OMe, CH2CN, C=CH, ou CF2CF3. Ainda de um modo mais preferido, R1 é Me, Et, i-Pr, ou F. De um modo muito preferido, R1 é Me ou Et.
De um modo preferido, R2 é Et, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, CF2CF3, azido, OCF3, ou é unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo. De um modo mais preferido, R2 é Et, CF3, CHF2, CHC12, CH2F, CH2C1, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, OH, OMe, OEt, CF2CF3, OU é unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo ou anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo. Ainda de um modo mais preferido, R2 é OH, OMe, OEt, ou é unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo ou anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo. De um modo muito preferido, R2 é OMe ou OEt.
De um modo preferido, R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo. De um modo mais preferido, R3 é 25 H, Et ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo ou anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo. Ainda de um modo mais preferido, R3 é unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo ou anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo.
De um modo preferido, R4, R5, e R6 são, independentemente, Me, F, Cl, CH2OH, ou OMe. De um modo mais preferido, R4, R5, e R6 são, independentemente, Me, F, Cl, CH2OH, ou OMe. Ainda de um modo mais preferido, R4, R5, e R6 são, independentemente, Me, F, ou Cl. Ainda de um modo mais preferido, a combinação de R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F. De um modo muito preferido, a combinação de R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me.
Os termos "Me", "Et", "n-Pr", "i-Pr", e "Ac" significam metilo, etilo, propilo normal, isopropilo, e acetilo, respectivamente. Quando se faz referência a R4, R5, e R6, o termo "2,4", "2,5", "3,5", e semelhantes, refere-se às posições relativas sobre o anel fenilo, ao qual os grupos estão ligados. 0 termo "halogeno" significa fluoro, cloro, bromo, ou iodo. 0 termo "modular" significa a habilidade de um dado complexo ligando/receptor para induzir ou suprimir a transactivação de um gene exógeN0 0 termo "gene exógeno" significa um gene estranho ao sujeito, isto é, um gene que é introduzido no sujeito por meio de um processo de transformação ou uma versão não mutada de um gene endógeno mutado. 0 método de transformação não é crítico e 26 pode ser qualquer método adequado para o sujeito, conhecido dos que trabalham na técnica. Por exemplo, as plantas transgénicas são obtidas por regeneração a partir das células transformadas. Numerosos procedimentos de transformação são conhecidos da literatura, tal como agroinfecção utilizando Agrobacterium tumefaciens ou o seu plasmídeo li, electroporação, microinjecção de células de plantas e protoplastos e transformação por microprojécteis. São conhecidas técnicas complementares para transformação de células animais e regeneração dessas células transformadas em animais transgénicos. Os genes exógenos podem ser genes naturais ou sintéticos e genes terapêuticos que são introduzidos no sujeito na forma de DNA ou RNA que pode actuar através de um intermediário de DNA, tal como por transcriptase inversa. Esses genes podem ser introduzidos em células alvo, introduzidos directamente no sujeito ou introduzidos indirectamente pela transferência de células transformadas no sujeito. O termo "gene terapêutico", significa um gene que confere uma função benéfica à célula hospedeira na qual esse gene é expresso. Os genes terapêuticos não são encontrados naturalmente em células hospedeiras. 0 termo "complexo receptor de ecdisona" refere-se geralmente a um complexo de proteína heterodimérica, consistindo em dois membros da família de receptores de esteróides, receptor de ecdisona ("EcR") e proteínas ultraspiracle ("USP") (ver Yao, T.P., et. al., (1993) Nature 366, 476-479; Yao, T.-P., et. al., (1992) Cell 71, 63-72). 0 complexo receptor ecdisteróide funcional pode também incluir proteína(s) adicionais, tal como imunofilinas. Membros adicionais da família de receptores esteróides de proteínas, conhecidos como factores transcricionais (tais como DHR38, betaFTZ-1 ou outros homólogos de insectos), podem também ser ligando-dependentes ou parceiros 27 independentes para EcR e/ou USP. O complexo receptor de ecdisona pode também ser um heterodímero da proteína receptora de ecdisona e o homólogo vertebrado de proteína ultraspiracle, proteína receptora do ácido retinóico X ("RXR"). Os complexos homodímeros da proteína receptora de ecdisona, ou USP, podem também ser funcionais sob algumas circunstâncias.
Um complexo receptor de ecdisteróide pode ser activado por um ecdisteróide activo, ou ligando não esteróide, ligado a uma das proteínas do complexo, inclusive de EcR, mas não excluindo outras proteínas do complexo. 0 complexo receptor de ecdisona inclui proteínas que são membros da superfamília de receptores de esteróides, em que todos os membros são caracterizados pela presença de um domínio de transactivação amino-terminal, um domínio de ligação de DNA ("DBD") e um domínio de ligação de ligando ("LBD") separados por uma região de dobradiça. Alguns membros da família podem também ter outro domínio de transactivação sobre o lado carboxi-terminal do LBD. 0 DBD é caracterizado pela presença de dois dedos de zinco de cisteína, entre os quais estão dois motivos aminoácido, a caixa P e a caixa D, que conferem especificidade para elementos de resposta de ecdisona. Estes domínios podem ser nativos, modificados ou quimeras de diferentes domínios de proteínas receptoras heterólogas. 0 termo "elemento de resposta" ("RE"), significa um ou mais elementos de DNA de acção cis que conferem resposta sobre um promotor mediado por meio de interacção com os domínios de ligação de DNA, do complexo receptor de ecdisona. Este elemento de DNA pode ser palindrómico (perfeito ou imperfeito) na sua sequência, ou composto por motivos de sequência ou meio-sítios, 28 separados por um número variável de nucleótidos. Os meio-sítios podem ser similares ou idênticos e dispostos como repetições directas ou invertidas. 0 complexo receptor de ecdisona liga-se, na presença ou ausência de um ligando, à sequência de DNA de um RE para iniciar ou suprimir a transcrição de gene(s) a jusante, sob a regulação deste elemento de resposta. Exemplos de sequências de DNA para RE do receptor natural de ecdisona incluem: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (ver Cherbas L., et al., (1991), Genes Dev. 5, 120-131); AGGTCAN(n)AGGTCA, em que N(n) pode ser um ou mais nucleótidos espaçadores (ver ϋ'Ανίηο PP., et al., (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9); e GGGTTGAATGAATTT (ver Antoniewski C., et al., (1994). Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474).
As sequências de DNA que constituem o gene exógeno, o elemento de resposta e o complexo receptor de ecdisona podem ser incorporadas em células procarióticas, tais como Escherlchia coli, Bacillus subtilis, ou outras enterobactérias. No entanto, uma vez que muitas das proteínas expressas pelo gene são processadas incorrectamentre em bactérias, as células eucarióticas são preferidas. As sequências de nucleótidos para o gene exógeno, o elemento de resposta e o complexo receptor podem também ser incorporadas como moléculas de RNA, de um modo preferido na forma de RNAs virai funcional, tal como o vírus mosaico do tabaco. Das células eucarióticas, as células de vertebrados são preferidas uma vez que naturalmente não têm as moléculas que conferem respostas aos ligandos para o receptor de ecdisona. Como resultado, são insensíveis aos ligandos aqui descritos. Assim, os ligandos aqui descritos terão um efeito fisiológico ou outros efeitos negligíveis sobre células transformadas, ou o organismo total. Deste modo, as células podem crescer e expressar o produto desejado, substancialmente não afectadas pela presença do próprio ligando. 29 0 termo "sujeito" significa uma planta ou animal intacto, ou uma célula de uma planta ou animal. É também anticipado que os ligandos operarão igualmente bem quando o sujeito é um fungo ou levedura. Quando o sujeito é um animal intacto, de um modo preferido o animal é um vertebrado, de um modo muito preferido, um mamifero.
Os ligandos aqui descritos quando utilizados com o complexo receptor de ecdisona que, por sua vez, está ligado ao elemento de resposta ligado a um gene exógeno, proporcionam os meios para a regulação temporal externa da expressão do gene exógeN0 A ordem em que os vários componentes se ligam uns aos outros, isto é, ligando a complexo receptor e complexo receptor a elemento de resposta, não é critica. Tipicamente, a modulação da expressão do gene exógeno encontra-se na resposta à ligação do complexo receptor de ecdisona a um elemento de DNA de controlo, ou regulador, especifico. A proteína receptora de ecdisona, tal como outros membros da família de receptores de esteróides, possui pelo menos três domínios, um domínio de transactivação, um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligando. Este receptor, como um subconjunto da família de receptores de esteróides, possui também regiões menos bem definidas, responsáveis por propriedades de heterodimerização. A ligação do ligando ao domínio de ligação do ligando da proteína receptora de ecdisona, após heterodimerização com proteína USP ou RXR, permite aos domínios de ligação de DNA das proteínas heterodiméricas ligar-se ao elemento de resposta numa forma activada, resultando assim em expressão ou supressão do gene exógeN0 Este mecanismo não exclui o potencial para ligação de ligando nem a EcR, nem a USP, e a formação resultante de complexos homodímero activos (e. g., EcR+EcR ou USP+USP). De um 30 modo preferido, um ou mais dos domínios do receptor podem ser variados, produzindo um interruptor génico quimérico. Tipicamente, um ou mais dos três domínios podem ser escolhidos, de uma fonte diferente da fonte dos outros domínios, pelo que o receptor quimérico é optimizado na célula ou organismo hospedeiro escolhido para actividade de transactivação, ligação complementar do ligando e reconhecimento de um elemento de resposta específico. Adicionalmente, o elemento de resposta, ele próprio, pode ser modificado ou substituído com elementos de resposta para outros domínios de proteína de ligação de dna, tal como a proteína GAL-4 de leveduras (ver Sadowski, et. al. (1988) Nature, 335, 563-564), ou a proteína LexA de E. coli (ver Brent e Ptashne (1985), Cell, 43, 729-736), para acomodar complexos receptores de ecdisona quiméricos. Outra vantagem dos sistemas quiméricos é que possibilitam a escolha de um promotor utilizado para conduzir o gene exógeno, de acordo com um resultado final desejado. Esse controlo duplo pode ser particularmente importante em áreas de terapia genética, especialmente quando são produzidas proteínas citotóxicas, uma vez que, tanto a altura da expressão, como as células em que a expressão ocorre podem ser controladas. 0 termo "promotor" significa uma sequência de nucleótidos específica, reconhecida por DNA polimerase. A sequência é o sítio no qual a transcrição pode ser iniciada especificamente, sob condições adequadas. Quando genes exógenos, ligados operativamente a um promotor adequado são introduzidos nas células do sujeito, a expressão dos genes exógenos é controlada pela presença do ligando aqui descrito. Os promotores podem ser constitutivamente ou indutivelmente regulados, ou podem ser tecido-específicos (isto é, expressos apenas num tipo de células particular), ou específicos para certos estágios de desenvolvimento do organismo. 31
Outro aspecto aqui descrito é um método para modular a expressão de um ou mais genes exógenos num organismo, compreendendo a administração ao organismo de uma quantidade eficaz, isto é, a quantidade requerida para induzir a expressão ou supressão do gene desejado, de um ligando compreendendo um composto de fórmula I e em que as células do organismo contêm: a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: a) o gene exógeno; e b) um elemento de resposta; e em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta, na presença do ligando, resulta em activação ou supressão do gene.
Um aspecto relacionado aqui descrito é um método para regular a expressão de genes endógenos ou heterólogos num organismo transgénico, compreendendo o contacto de um ligando compreendendo um composto de fórmula I, com um receptor de ecdisona em células do organismo, em que as células contêm uma sequência de ligação de DNA para o receptor de ecdisona e em que 32 a formação de um complexo receptor de ecdisona-sequência de ligação de DNA, induz a expressão do gene.
Um quarto aspecto aqui descrito é um método para produção de um polipéptido compreendendo os passos de: a) selecção de uma célula que seja substancialmente insensível a exposição a um ligando compreendendo um composto de fórmula I: b) introdução na célula: 1) um construção de DNA compreendendo: a) um gene exógeno codificando o polipéptido; e b) um elemento de resposta; em que o gene se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e 2) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um dominio de ligação de DNA; b) um dominio de ligação para o ligando; e c) um dominio de transactivação; e c) exposição da célula ao ligando.
Assim como a vantagem de controlar temporalmente a produção de polipéptido pela célula, este aspecto proporciona uma outra vantagem, nos casos em que a acumulação desse polipéptido pode ser limitada a períodos curtos. Esse controlo é particularmente importante quando o gene exógeno é um gene terapêutico. Os genes terapêuticos podem ser designados para produzir polipéptidos que controlam funções necessárias, tal como a produção de insulina em pacientes diabéticos. Podem também ser utilizados para 33 produzir proteínas danificadoras ou mesmo letais, tais como aquelas que são letais para células cancerosas. Esse controlo pode também ser importante quando os níveis de proteína produzidos podem constituir um dreno metabólico sobre o crescimento ou reprodução, tal como em plantas transgénicas.
Numerosas sequências genómicas e do ácido nucleico de cDNA, que codificam para uma variedade de polipéptidos, são bem conhecidas na técnica. 0 material genético exógeno, útil com os ligandos aqui descritos, inclui genes que codificam proteínas de interesse, biologicamente activas, tais como, por exemplo, proteínas secretoras que podem ser libertadas de uma célula; enzimas que podem metabolizar um substrato a partir de uma substância tóxica para uma substância não tóxica, ou de uma substância inactiva para uma substância activa; proteínas reguladoras; receptores da superfície de células; e semelhantes. Os genes úteis incluem também genes que codificam factores de coagulação do sangue, hormonas tais como insulina, hormona paratiróide, factor de libertação da hormona luteinizante, inibinas alfa e beta seminais, e hormona de crescimento humano; genes que codificam proteínas, tais como enzimas cuja ausência conduz à ocorrência de um estado anormal; genes que codificam citoquinas ou linfoquinas, tais como interferões, factor estimulante de colónia granulocítica de macrófagos, factor 1 estimulante de colónias, factor de necrose de tumores, e eritropoietina; genes que codificam substâncias inibidoras tal como alfai-antitripsina, genes que codificam substâncias que funcionam como fármacos, tais como toxinas da difteria e da cólera; e semelhantes. Os genes úteis incluem também aqueles que são úteis para terapias de cancro e para tratar perturbações genéticas. Os especialistas na técnica têm acesso a informação de sequências de ácido nucleico para virtualmente todos os genes 34 conhecidos e podem obter a molécula de ácido nucleico directamente de um depósito público, da instituição que publicou a sequência ou empregar métodos de rotina para preparar a molécula.
Para utilização em terapia com genes, os ligandos aqui descritos podem ser tomados em veiculos farmaceuticamente aceitáveis, tais como, por exemplo, soluções, suspensões, comprimidos, unguentos, elixires e composições injectáveis. As preparações farmacêuticas podem conter desde 0,01% a 99%, em peso, do ligando. As preparações podem apresentar-se em formas de dose singular ou múltipla. A quantidade de ligando, em qualquer preparação farmacêutica particular, dependerá da dose efectiva, isto é da dose requerida para elicitar a expressão ou supressão de genes desejada.
As vias adequadas de administração das preparações farmacêuticas incluem as vias oral, rectal, tópica (incluindo dérmica, bucal e sublingual), vaginal, parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural) e por tubo naso-gástrico. Será entendido pelos especialistas na técnica que a via de administração preferida dependerá da condição a ser tratada e pode variar com factores como a condição do receptor.
Os ligandos aqui descritos podem também ser administrados em conjunto com outros compostos farmaceuticamente activos. Será entendido pelos especialistas na técnica que os compostos farmaceuticamente activos a serem utilizados em combinação com os ligandos aqui descritos serão seleccionados de forma a evitar efeitos adversos sobre o recipiente ou interacções entre os compostos. Exemplos de outros compostos farmaceuticamente 35 activos que podem ser utilizados em combinação com os ligandos incluem, por exemplo, agentes quimioterapêuticos para a SIDA, derivados de aminoácidos, analgésicos, anestésicos, produtos anorectais, antiácidos e antiflatulentos, antibióticos, anticoagulantes, antídotos, agentes antifibrinolíticos, antihistaminas, agentes anti-inflamatórios, antineoplásicos, antiparasíticos, antiprotozoários, antipiréticos, antisépticos, antiespasmódicos e anticolinérgicos, antivirais, supressores de apetite, medicações para a artrite, modificadores da resposta biológica, reguladores do metabolismo ósseo, evacuantes do intestino, agentes cardiovasculares, estimulantes do sistema nervoso central, incrementadores metabólicos cerebrais, cerumenolíticos, inibidores da colinesterase, preparações para constipações e tosse, factores estimulantes de colónias, contraceptivos, agentes citoprotectores, preparações dentárias, desodorizantes, produtos dermatológicos, agentes desintoxicantes, agentes da diabetes, diagnósticos, medicações para a diarreia, agonistas do receptor da dopamina, electrólitos, enzimas e digestivos, preparações ergot, agentes de fertilidade, suplementos de fibras, agentes antifúngicos, inibidores de galactorreia, inibidores da secreção gástrica ácida, agentes procinéticos gastrointestinais, inibidores de gonadotropina, estimulantes do crescimento capilar, hematínicos, agentes hemorreológicos, hemostáticos, antagonistas do receptor de histamina H 2, hormonas, agentes hiperglicémicos, hipolipidémicos, imunosupressores, laxantes, leprostáticos, adjuntos de leucaferese, tensioactivos pulmonares, preparações para enxaquecas, mucolíticos, antagonistas de relaxantes musculares, antagonistas de narcóticos, pulverizações nasais, análogos de nucleósidos medicações para náuseas, suplementos nutricionais, preparações para osteoporose, oxitócicos, parassimpatolíticos, parassimpatomiméticos, fármacos para 36
Parkinsonismo, adjuvantes de penicilina, fosfolipidos, inibidores de plaquetas, agentes para a porfiria, análogos de prostaglandina, prostaglandinas, inibidores de bombas de protões, psicotrópicos medicações para prurido, quinolonas, estimulantes respiratórios, estimulantes de saliva, substitutos do sal, agentes esclerosantes, preparações para feridas da pele, auxiliares de cessação de tabagismo, sulfonamidas, simpatoliticos, tromboliticos, agentes para o sindrome de Tourette, preparações para o tremor, preparações para a tuberculose, agentes uricosúricos, agentes para o tracto urinário, contractantes uterinos, relaxantes uterinos, preparações vaginais, agentes para vertigens, análogos de vitamina D, vitaminas, e meios de contraste para imagiação médica. Nalguns casos, os ligandos podem ser úteis como um adjunto para a terapia com fármacos, por exemplo, para "desligar" um gene que produz uma enzima que metaboliza um fármaco particular.
Para aplicações na agricultura, em adição às aplicações descritas acima, os ligandos aqui descritos podem também ser utilizados para controlar a expressão de proteínas de pesticidas, tal como a toxina Bacillus thuringiensis (Bt). Essa expressão pode ser tecido- ou planta-específica. Adicionalmente, particularmente quando o controlo de pestes de plantas também é necessário, um ou mais pesticidas podem ser combinados com os ligandos aqui descritos, proporcionando deste modo vantagens e eficácia adicionais, incluindo menos aplicações totais do que se os pesticidas forem aplicados separadamente. Quando são empregues misturas com pesticidas, as proporções relativas de cada componente na composição dependerão da eficácia relativa e da velocidade de aplicação desejada de cada pesticida em relação às colheitas, pestes e/ou ervas a serem tratadas. Os 37 especialistas na técnica reconhecerão que as misturas de pesticidas podem proporcionar vantagens, tais como, um espectro mais largo de actividade do que um pesticida utilizado sozinho. Exemplos de pesticidas que podem ser combinados, em composições com os ligandos aqui descritos, incluem fungicidas, herbicidas, insecticidas, miticidas, e biocidas.
Os ligandos aqui descritos podem ser aplicados à folhagem de plantas como pulverizações aquosas por métodos comumente empregues, tal como pulverizações hidráulicas de muitos litros, pulverizações de poucos litros, pulverizações por jacto de ar ou aéreas. A diluição e velocidade de aplicação dependerão do tipo de equipamento empregue, do método e frequência da aplicação desejada e da velocidade de aplicação do ligando. Pode ser desejável incluir adjuvantes adicionais no tanque de pulverização. Esses adjuvantes incluem tensioactivos, dispersantes, espalhadores, colantes, agentes antiespuma, emulsionantes e outros materiais similares descritos em McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents/Functional Materials, e McCutcheon's Functional Materials, todos publicados anualmente por McCutcheon Division de MC Publishing Company (New Jersey). Os ligandos podem também ser misturados com fertilizantes ou materiais de fertilização, antes da sua aplicação. Os ligandos e o material de fertilização sólido podem também ser misturados em equipamento de mistura ou agitação, ou podem ser incorporados com fertilizantes em formulações granulares. Pode ser utilizada qualquer proporção relativa de fertilizante que seja adequada para as colheitas e ervas a serem tratadas. Os ligandos aqui descritos, compreenderão comumente de 5% a 50% da composição fertilizante. Estas composições porporcionam materiais 38 fertilizantes que promovem o crescimento rápido das plantas desejadas e, ao mesmo tempo, controlam a expressão de genes. OS ligandos aqui descritos são compostos conhecidos ou são facilmente preparados por um especialista na técnica, adaptando os processos descritos nas Patentes U.S. N°s 5117057, 5530028, e 5378726. Um processo em dois passos é, tipicamente, utilizado. No primeiro passo, um cloreto de ácido benzóico substituído de fórmula II, é combinado com uma hidrazina substituída de fórmula III, para dar uma monoacil-hidrazina de fórmula IV. A monoacil-hidrazina de fórmula IV é combinada, num segundo passo, com outro cloreto de ácido benzóico de fórmula V, resultando na formação de um composto de fórmula I.
III
II
IV V
Os exemplos que se seguem demonstram a actividade dos ligandos aqui descritos.
Os ligandos e ligandos comparativos que se seguem foram avaliados: 39
Ra V / Η-N—N- R4
Ra C(CH3)3 ^ ->Re R2 R1
Ligando Rl R2 R3 3-R4 5-R5 4-R6 CE-l H H Et Me Me CE-2 H H H H H CE-3 1 Et OMe H OMe H 2 Me -och2ch2o- Me Me 3 Me OMe H Me Me 4 Et OMe H F F 5 Et OMe H Me Me 6 Me OEt H Me Me 7 Et -och2ch2o- Me Me 8 Et -ch2ch2o- Me Me 9 Me OMe H Cl Cl 10 Et OMe H Cl Me 11 i-Pr OMe H Me Me 12 Et OEt H Me Me 13 Et OMe H Cl Cl 14 Me OH H Me Me 15 Me OH H Me CH20H 17 F H Et Me Me 18 Me OMe H OMe OMe Me CE-l = tebufenozido
CE-2 = 1,2-dibenzoil-l-terc-butil-hidrazina CE-3 = muristerona A 40
Construções de Gene pVgRXR (Invitrogen Corp., Carlsbad, Califórnia) é um plasmídeo de 8 728 kb que expressa VgEcR e RXR, para formar um receptor nuclear heterodimérico modificado (ver No, D., et. al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 3346-3351). 0 receptor de eedisona (VgEcR) é derivado do receptor natural de eedisona de Drosophila e modificado para conter o domínio de transactivação VP16 (ver Cress, W.D., e Triezenberg, S.J. (1991), Science 251, 87-90; Sadowski, I., et. al (1988) Nature 335, 563-564;
Triezenberg, S.J et. al., (1988), Genes Dev 2, 718-729;
Triezenberg, S.J., et. al., (1988), Genes Dev 2, 730-742). RXR é o homólogo mamífero de USP (ultraspiracle), o parceiro natural para o receptor de eedisona de Drosophila (ver Yao, T.-P., et. al., (1993), Nature 366, 476-479; Yao, T.-P., et. al., (1992),
Cell 71, 63-72) . A região de caixa P do domínio de ligação do DNA de VgEcR, foi modificada para reconhecer o elemento de resposta de eedisona híbrido que consiste num meio-sítio do elemento de resposta de gluccorticóide (ver Umesono, K., e Evans, R. M. (1989), Cell 57, 1139-1146) e num meio-sítio do elemento de resposta de eedisona natural. Este elemento de resposta híbrido reduz qualquer possível interaeção com o receptor farsenóide X que pode ligar o elemento de resposta a eedisona natural (EcRE). O promotor-incrementador de citomegalovírus conduz a expressão de VgEcR, e o promotor do vírus do sarcoma de Rous conduz a expressão de RXR. O vector pIND (Invitrogen Corp.) é um vector de 5024 bp com base em pcDNA3.1. Contém cinco hybridos E/GREs reconhecidos pelo receptor de eedisona modificado, expresso a partir de pVgRXR e um promotor de choque térmico mínimo (ver Yao, T. P., et. al., (1993), Nature, 366, 476-479). pIND/lacZ (Invitrogen Corp.) é um plasmídeo de 8170 bp que contém o gene β-galactosidase como uma 41 enzima repórter. A cotransfecção de pIND/lacZ e pVgRXR resulta na indução da expressão de β-galactosidase, por adição de agonistas de ecdisona, tal como muristerona A. 0 plasmideo repórter pIND/luc foi construído por subclonagem do gene de luciferase de pirilampo, a partir de pGL3 (Promega/E1741) como um fragmento Nhe I - BamHl para plND, também digerido com Nhe I e BamHl.
Manutenção de Linhas de Células de Mamíferos e Transfecção Células CHO (ATCC no CCL-61) foram mantidas em mistura Nutriente F-12 (meio de Ham) (Gibco/BRL, 11765-054) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS, meio completo; Gibco/BRL, 16000-036). Estas células foram mantidas a 37 °C em 5% de C02 em 95% de ar atmosférico.
As células CHO foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 12 poços, a uma concentração de 0,5 X 105 células por mL, por poço. O lípido Pfx-8 (Invitrogen, T930-18) foi utilizado para transfectar transientemente o sistema de expressão indutível de ecdisona (Invitrogen número de catálogo K1000-01). O sistema de expressão indutível de ecdisona consiste de pVgRXR, codificando as subunidades de receptor, pIND/lacZ ou pIND/luc, contendo o elemento de resposta e um gene repórter codificando β-galactosidase ou luciferase, respectivamente. Vinte e quatro horas após a sementeira das células, a solução lípido/DNA foi preparada por DNA de 0,5 mg/mL de VgRXR e 0,5 mg/mL pIND/lacZ ou pIND/luc, em água estéril. Trinta e seis pL de Pfx-8 foram diluídos num tubo estéril de polistireno de 17 x 100 mm contendo 1,5 mL de meio Opti-MEM (Gibco/BRL, 31985). Seis pL da solução mãe de DNA de plasmideo foram misturados com 1,5 mL de meio 42
Opti-MEM, noutro tubo de polistireN0 As soluções de DNA e de lípido foram combinadas para perfazer 3 mL de solução de transfecção (suficiente para um conjunto de amostras em triplicado). As células foram lavadas com solução tamponada com fosfato (PBS; Gibco/BRL, 14190-144), três vezes, por aspiração de meio das células. Um mL de solução de transfecção foi adicionado por poço. As células foram incubadas durante quatro horas e o meio de transfecção substituído com o mesmo volume de meio completo. As células foram incubadas durante mais 20 horas.
Linha de Células Mamíferas Transformadas de Forma Estável Células CHO transformadas de forma estável com pVgRXR e pIND/LacZ(SPI) (Invitrogen Corp.) foram mantidas em meios Hams F-12 contendo 10% de FBS, glutamina 2 mM, 300 pg/mL de Zeocina (Invitrogen Corp.) e 300 pg/mL de Higromicina B. plND(SPl), uma alternativa ao vector pIND, pode ser induzido para níveis de expressão absolutos cinco vezes maiores do que o de pIND, devido à presença de 3 elementos de acção cis. Os níveis de expressão basal são correspondentemente maiores.
Tratamento com Ligandos
Soluções mãe (10~2 M) foram preparadas para muristerona A e para os ligandos não esteróides aqui descritos, em etanol e acetona, respectivamente, e armazenadas a -20 °C. Vinte e quatro horas após a transfecção, um composto de teste foi adicionado a uma concentração final de 10 pM (10~5 M) a cada poço de cultura de células de 1 mL. Muristerona A (Sigma, M7888), na 43 concentração de 10 μΜ, foi utilizada como controlo positivo. Acetona, sozinha foi adicionada como controlo negativo.
Análises do Gene Repórter A expressão do gene repórter foi analisada 24-48 horas após tratamento de células transfectadas de forma transiente, ou 24 horas após o tratamento da linha de células, transformada de forma estável com ligandos de teste. A β-galactosidase foi analisada quer por coloração de células fixadas, quer por análise em relação a actividade enzimática em lisados celulares. A β-galactosidase catalisa a hidrólise do β-galactósido, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-galactopiranósido), produzindo uma cor azul no seio das células fixadas (Invitrogen, K1465-01) que pode ser visualizada sob um microscópio. Em alternativa, foi utilizado o tampão de lise repórter (RLB; Promega/E397A) para lisar as células para a detecção de actividade de β-galactosidase, utilizando um substrato quimiluminescente, Galacto-Star (Tropix/BMIOOS). As células no seio de cada placa de 12 poços foram lisadas com 250 pL de RLB. Vinte pL de cada extracto foram analisados com 100 pL de substrato.
Para detecção de actividade de luciferase, as células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas com 250 pL de RLB por poço. Após 10 minutos, a placa foi congelada a -80 °C durante 10 minutos e retornada à temperatura ambiente. Uma amostra de 20 pL do lisado foi misturada com 100 pL de reagente de análise de luciferase (Promega, E1500) . Para ambas as análises de β-galactosidase e luciferase, foi detectada luminescência à temperatura ambiente utilizando um luminómetro de placa de 44 microtítulo DYNEX MLX, equipado com um autoinjector para o fornecimento do substrato.
Preparação de extracto de receptor de ecdisona citosólico a partir de células Kc de Drosophila A linha celular diptera Kcl67, derivada originalmente de embriões de Drosophila (ver Echalier, G. e Ohanessian, A. (1969) C. R. Acad. Sei., 268, 1771) foi obtida de Dr. Peter Cherbas (Universidade de Indiana) e mantida conforme descrito (Cherbas, L., et. al., (1994), Methods in Cell Biology, 44, 161-179). Uma cultura de 400 mL de células Kc (3 x 107 células por mL) foi centrifugada a 700 x g durante 10 minutos, à temperatura ambiente, para peletizar as células. O sobrenadante foi aspirado e o pelete foi ressuspenso em 70 mL de tampão TM frio (Tris 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, pH 7,2). Após uma incubação de 10 minutos em gelo, as células foram centrifugadas a 2300 x g. O sobrenadante foi rejeitado. O pelete de células foi congelado a -20 °C durante 1 hora. O pelete de células congelado foi descongelado lentamente, em gelo, e homogeneizado num homogeneizador Potter-Elvehjem frio, utilizando um pilão de teflon sobre um motor de homogeneização Caframo, regulado a 500 com 10 batimentos para cima e para baixo a 4 °C. Esta pasta foi centrifugada a 100000 x g num rotor de cesto basculante durante 60 minutos. O sobrenadante, contendo o extracto de proteína citosólica, foi diluído com tampão T (Tris 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,2) até uma concentração de proteína de 5 mg/mL. Este extracto foi utilizado imediatamente para análises de ligação de ligandos. 45
Preparação do receptor de ecdisona nuclear a partir de células de Plodia interpunctella A linha celular IAL-PID2, derivada de discos imaginais das asas da lepidoptera Plodia interpunctella, foi obtida de H. Oberlander e mantida conforme descrito (Lynn, E. E. e Oberlander, H., (1983), J. Insect Physiology, 29, 591-96). Uma cultura de 300 mL de fase estacionária de células P. interpunctella foi centrifugada a 700 x g durante 10 min, à temperatura ambiente, para peletizar as células. O sobrenadante foi aspirado e o pelete celular ressuspenso em 35 mL de TMT (tampão TM com 0,1% de Triton X-100) . A suspensão foi homogeneizada com vinte batimentos, para cima e para baixo, de um homogeneizador Dounce sobre gelo. O homogeneizado foi incubado sobre gelo durante 10 minutos e, em seguida, centrifugado durante 15 minutos a 900 x g. O pelete foi ressuspenso em 15 mL de tampão TM e centrifugado a 2300 x g. Este pelete foi extraído em tampão TMK (tampão TM com KC1 800 mM), utilizando uma barra de vidro para esmagar o pelete até estar formada uma pasta gelatinosa, e incubado sobre gelo durante 15 minutos. O extracto foi centrifugado a 100000 x g num rotor de cesto basculante, durante 60 minutos. O sobrenadante, que constituía o extracto nuclear, foi dessalinizado sobre uma coluna de dessalinização 10 DG (Bio-Rad, 732-2010) equilibrada com tampão T. A concentração total de proteína foi ajustada a 5 mg por mL com tampão T contendo DTT 1 mM. 46
Preparação da Proteína de Fusão Bacteriana Glutatião-S-transferase
Proteínas de fusão bacteriana glutatião-S-transferase (GST) da lagarta do abeto (Choristoneura fumiferana) EcR (CfEcR), contendo apenas domínios CDEF, e proteína ultraspiracle (CfUSP), foram também utilizadas em análises de deslocamento de radioligandos. cDNA codificando os domínios CDEF de CfEcR foram construídos após amplificação de PCR, utilizando prímeros que contêm sítios BamHl e EcoRl (Perera SC, M Sundaram, Krell PJ, Retnakaran A, Dhadialla TS, SR Palli, 1999 Arch. Insect Biochem. Physiol. 41, No Prelo). 0 produto PCR foi digerido com BamHl e EcoRl e clonado para o vector pGEX-3X, obtido de Pharmacia Biotech. A região que codifica CfUSP foi amplificada utilizando prímeros que contêm sítios BamHl e EcoRl e clonado para o vector pGEX-2T, obtido de Pharmacia Biotech. E. coli transformadas com cada um dos dois vectores foram crescidas e induzidas para produzir as proteínas de fusão, conforme detalhado no boletim técnico de Pharmacia Biotech GST.
Ensaio de ligação competitiva do receptor de Ecdisona 3H ponasterona A, um fitoecdisteróide potente, (66,000 dpm; actividade específica 170 Ci/mmole; NEN Life Science Products, Boston, Massachussetts) foi misturada com 100 pL de Kc citosólico ou com extractos do receptor de ecdisona nuclear de Plodia, em tubos de ensaio de vidro de 0,8 X 50 mm, na ausência de 20-hidroxiecdisona (20E) 10 μΜ não marcada, para obter uma estimativa da ligação total ou não específica, respectivamente, de ponasterona A tritiada. Os tubos foram submetidos a vórtex e incubados durante a noite a 4 °C, para extractos Kc citosólicos, 47 ou 1,5 horas, para extractos nucleares de Plodia, para as reacções de ligação atingirem o equilíbrio. No final dos tempos de ligação de equilíbrio, a ponasterona A tritiada ligada foi separada da não ligada por adição de 600 pL ou 300 pL de solução de carvão revestido com dextrano arrefecida em gelo (500 mg de carvão activado lavado com HC1 Sigma, 50 mg de Dextrano de Pharmacia T70, 50 ml de tampão T) para Kc ou extractos de
Plodia, respectivamente. Os tubos foram submetidos a vórtex brevemente e centrifugados a 7000 x g para peletizar o carvão. O sobrenadante, 600 pL ou 300 pL para as reacções de Kc ou extracto de Plodia, respectivamente, contendo ponasterona A tritiada ligada a proteínas, foi aspirado para frascos de cintilação líquida contendo 5 mL de cocktail de cintilação (ReadySafe®, Beckmann), cada. A mistura foi submetida a vórtex e a quantidade de radioactividade total ou ligada de forma não específica medida num contador de cintilação líquida Beckman LS500 com uma eficiência de contagem de 60% para trítio.
Determinação de valores de Kd para inibidores competitivos da ligação de 3H-ponasterona A a complexos receptores de ecdisona, em extractos de células Kc ou Plodia e proteínas de fusão bacterianas
As concentrações de competidores que inibem 50% da ligação de ponasterona A tritiada (IC50) / foi determinada por incubação de extractos nucleares de Kc ou Plodia, ou extractos de bactérias produtoras de proteínas de fusão CfEcR(CDEF)-GST e CfUSP-GST, com 3H-ponasterona A (66000 dpm por reacção), na presença de uma gama de concentrações (0,1 nM a 10 pM) de compostos de teste. No caso de reacções de ligação utilizando proteínas de fusão bacterianas, 20 ou um pL de extracto de 48 bactérias produtoras de proteínas de fusão CfEcR(CDEF)-GST ou CfUSP-GST, respectivamente, foram incluídos por reacção de ligação. As condições de ensaio e a determinação da ligação total e não específica foram como descrito acima. 0 volume de competidor em solvente, como aquele para 20E ou solvente apenas, foi mantido a 1% do volume total de reacção, por utilização de uma solução mãe de concentração 100 vezes superior (i. e., uma diluição de 100 vezes de soluções mãe). O remanescente do ensaio foi como descrito acima. Cada reacção foi realizada em duplicado por concentração por composto de teste. A ligação específica de 3H-ponasterona A foi determinada por subtracção da ligação não específica (a obtida na presença de 20E 10 μΜ) da total (sem competidor) ou radioactividade competida ligada. O resultado para cada composto de teste foi analisado utilizando um software IGOR Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) para calcular os valores IC50. A constante de ligação (Kd em μΜ) para os compostos de teste foi calculada por incorporação da equação de Cheng-Prusoff (ver Munson PJ. e Rodbard D. (1980) Anal. Biochem. 107, 220-239) no software IGOR Pro. 49
As Tabelas 1-3 sumarizam os resultados obtidos:
Tabela 1
Ligando Kc log(1/EC50) Plodia log(1/IC50) CfECR Bacteriano log(1/IC50) CE-1 6,55 8,7 CE-2 5,52 6,48 CE-3 7, 96 1 7,36 8,52 2 7,16 9,14 3 6,73 9,04 8,76 4 7, 41 8,51 5 7, 70 9,49 6 8,82 7 8,78 8 8,85 9 9,00 10 8,80 11 8,93 12 8,10 9,63 13 7, 44 9,06 14 8,61 15 8,49 17 9,24 18 8,82 50
Tabela 2
Activação do Gene de Luciferase em Células CHO Transfectadas de forma Transiente
Ligando 10 μΜ Actividade de Luciferase1 Razão de Indução2 Kd para células Kc (nM) nenhum 42 CE-1 89 2 110 CE-2 36 1 2000 CE-3 316 8 2,3 CE-4 418 10 0,7 1 275 7 39,5 2 204 5 60 3 324 8 124 4 251 6 47 5 313 8 13,3 12 305 7 5,3 13 226 5 65
CE-4 = ponasterona A 1 Em unidades relativas de luz (RLU) - Média de amostras em duplicado 2 Razão de RLU na presença e ausência de ligando 51
Tabela 3
Activação do Gene de β-Galactosidase em células CHO Transformadas Estáveis
Ligando 10 mM Actividade de β-Galactosidase1 Razão de Indução2 Kd para células Kc (nM) Nenhum 200 CE-1 323 2 192 CE-2 145 1 2000 CE-3 9830 49 2 CE-4 10386 52 0,7 1 1123 6 40 2 536 3 47 3 681 3 124 4 1963 10 26 5 11599 58 13 12 9830 49 5 13 6667 33 24 1 Em unidades relativas de luz (RLU) - Média de amostras em triplicado 2 Razão de RLU na presença e ausência de ligando
Estes resultados indicam que os ligandos aqui descritos são capazes de induzir a expressão de genes a concentrações comparáveis, ou inferiores, às dos compostos conhecidos CE-1 e CE-2.
Em adição às capacidades melhoradas de modulação da expressão de genes, espera-se que os ligandos tenham maior 52 utilidade em plantas e animais intactos, devido às suas propriedades superiores de transporte e metabólicas. 0 exemplo que se segue demonstra o transporte melhorado numa planta, de um ligando aqui descrito (Ligando 3), em comparação com um ligando conhecido (CE-1) em plantas.
Movimento Translaminar
Foi realizado um estudo para avaliar o movimento translaminar de dois compostos em folhas de algodão, utilizando larvas de lagartas do abeto neonatais, Spodoptera exígua, como sistema modelo.
Foram avaliados dois tratamentos: concentrados emulsionáveis de CE-1 e Ligando 3 (5% e 19%, respectivamente) a uma concentração de 100 pg/mL, para simular concentrações do tanque de pulverização. Estes tratamentos foram então comparados com plantas tratadas com um padrão químico conhecido por ter um movimento translaminar excelente (benzoato de emamectina, 0,16% de EC [20 pg/mL], Merck & Co.) e com plantas não tratadas.
Plantas de algodão com quatro semanas de idade, Gossypium hirsutum L. cv. Stoneville, foram tratadas com cada tratamento, por pintura da superfície do topo de uma réplica simples de folha/planta com um tratamento correspondente. As plantas foram mantidas numa estufa de ambiente controlado mantida a 27 °C, até serem necessárias. A eficácia residual foi avaliada por desafio de folhagem tratada e não tratada com larvas neonatais de lagartas do abeto, Spodoptera exígua (Hubner), em 3 datas: 1, 7, e 14 dias após o tratamento (DAT) . Em cada dia de amostragem, uma folha/planta simples tratada foi excisada de cada uma de 53 cinco plantas replicadas por tratamento. As folhas foram então amarradas à tampa superior de uma placa de Petri de plástico (100 x 20 mm) e em seguida infestadas com 10 larvas do primeiro instar. As larvas da lagarta dos abetos do primeiro instar comem comumente sob a superfície inferior das folhas e, geralmente, não comem até à superfície superior. Assim, seria necessário movimento translaminar do material para afectar as larvas uma vez que os compostos foram aplicados à superfície de topo da folha apenas. A mortalidade das larvas foi registada 4 dias após a infestação. Adicionalmente, quaisquer larvas vivas foram examinadas em relação a sintomas característicos de compostos aceleradores da muda (formação de nova cutícula e/ou libertação da cápsula de cabeça). Cada tratamento foi replicado cinco vezes.
Os resultados de percentagem de mortalidade foram transformados no arco seno da raiz quadrada e em seguida analisados por ANOVA, utilizando JMP (Ver. 3.2.1). As médias foram separadas pelo teste de Tukey-Kramer (P = 0,05).
Os resultados mostraram que o Ligando 3 era significativamente mais eficaz do que CE-1 para matar larvas de S. exígua por movimento translaminar e, portanto, seria esperado que tivesse maior sistemicidade em plantas. 54
Tabela 4
Percentagem de Mortalidade
Tratamento Cone. Dia Após Aplic (pg/mL) 1 7 14 CE-1, 5% EC 100 2,5 0,0 22,7 3, 19% EC 100 100, 0 93, 8 100, 0 Benzoato de emamectina 0,16 20 100, 0 100, 0 100, 0 EC + AG-98 Controlo de verificação não 11,6 6,5 8,1 tratado AG-98 = 0,12% do tensioactivo não iónico tensioactivo Latron AG-98 (Rohm and Haas Company)
Lisboa, 21 de Novembro de 2007 55

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para modular a expressão de genes exógenos, compreendendo o contacto de um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um domínio de ligação de ADN; b) um domínio de ligação de ligando; c) um domínio de transactivação; e d) um ligando de fórmula; R4
    em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F, ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos do fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formam um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono do 1 fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono do fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) qu (C4-C6) ando R1 é Me e R2 é OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2.5- di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: 3,5-di-OMe-4-Me, 3 ,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou i—1 o 1 H 1 LO CN 3-OMe,
  2. 2-C1-5- -Me, 2-C1, 2-Br, ou 3-Me; ou R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; 2 f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados, formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Me ou Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; com uma construção de DNA compreendendo: a) o gene exógeno; e b) um elemento de resposta; em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação do DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene. Método para modular a expressão de um ou mais genes exógenos numa planta, compreendendo a administração à planta de uma quantidade eficaz de um ligando de fórmula: 3
    em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e com os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo, a que R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 4 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3, 5-di- -Me, 3,5-di- OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5- -di- -F, 2 ,4- ou 1 H 1 LO CN F, 2,4- ou i—1 0 1 •H 1 LO CN quando R1 é Et e R 2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R 5, e R6 é: i) 3,5-di- OMe- -4-Me, 3,5-di-Cl, 3,í >-di- F, 2,4- ou •H 1 LO CN -F, 2,4- ou 2,5-di- -Cl, 3- OMe, 2- Cl-5- -Me, 2-Br-5- -Me, 2-C1, ou 3-Me; : OU ii) R6 é H , Rz 1 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F or Cl, e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; 5 então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; em que as células da planta contêm a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; e em que a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene.
  3. 3. Método para a produção de um polipéptido compreendendo os passos de: a) selecção de uma célula que seja insensível a exposição a um ligando de fórmula: 6 ο ο R4
    em que : Ε é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e com os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 7 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Br-5-Me, 2-Cl, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; 8 b) introduzindo na célula: 1) uma construção de DNA compreendendo: a) um gene exógeno codificando o polipéptido; e b) um elemento de resposta; em que o gene se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e 2) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: a) um dominio de ligação de DNA; b) um dominio de ligação para o ligando; e c) um dominio de transactivação; e c) expondo a célula ao ligando do passo (a).
  4. 4. Método para regular a expressão de genes endógenos ou heterólogos numa planta transgénica, compreendendo o contacto de um ligando de fórmula:
    em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; 9 R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e com os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou é unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou 10 ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo, aos quais estão ligados, formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo, aos quais estão ligados, formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; com um complexo receptor de ecdisona nas células da planta, em que as células contêm, ainda, uma sequência de ligação de DNA para o complexo receptor de ecdisona quando em combinação com o ligando e em que a formação de um complexo de complexo receptor de ecdisona-ligando-sequência de ligação de DNA induz a expressão do gene. 11
  5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o ligando tem a fórmula especificada e E é t-butilo.
  6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o ligando tem a fórmula especificada e R1 é Me, Et, i-Pr ou F.
  7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o ligando tem a fórmula especificada e R2 é OH, OMe, OEt, ou unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um anel etilenodioxilo ou di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo.
  8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o ligando tem a fórmula especificada e R3 é H, Et, ou unido com R3 e os carbonos de fenilo aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um anel etilenodioxilo ou di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo.
  9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o ligando tem a fórmula especificada e E é t-butilo, R1 é Et, R2 é OEt, R3 é H e a combinação R4, R5 e R6 é 3,5-di-Me.
  10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o complexo receptor de ecdisona é um complexo receptor de ecdisona quimérico e a construção de DNA compreende ainda um promotor.
  11. 11. Utilização de um ligando de fórmula (I): 12
    em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou é unido com R3 e com os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; 13 então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2.4- ou 2,5-di-Cl; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-Cl, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo, aos quais estão ligados, formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo, aos quais estão ligados, formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; 14 para a modulação in vitro da expressão de um, ou mais, genes exógenos numa célula animal, em que a célula contém: a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; e em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta na presença do ligando resulta em activação ou supressão do gene.
  12. 12. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, em que o ligando tem a fórmula especificada e E é t-butilo.
  13. 13. Utilização, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o ligando tem a fórmula especificada e R1 é Me, Et, i-Pr ou F.
  14. 14. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que o ligando tem a fórmula especificada e R2 é OH, OMe, OEt, ou unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais 15 R2 e R3 estão ligados, formando um anel etilenodioxilo ou di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo.
  15. 15. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 14, em que o ligando tem a fórmula especificada e R3 é H, Et, ou unido com R3 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um anel etilenodioxilo ou di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo.
  16. 16. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, em que o ligando tem a fórmula especificada e E é t-butilo, R1 é Et, R2 é OEt, R3 é H e a combinação R4, R5 e R6 é 3,5-di-Me.
  17. 17. Utilização de um ligando de fórmula (I):
    em que: E é um alquilo(C4-C6) contendo um carbono terciário; R1 é H, Me, Et, i-Pr, F ou OMe; R2 é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, SOMe, ou unido com R3 e com os carbonos do fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel 16 di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R3 é H, Et, ou unido com R2 e os carbonos de fenilo, aos quais R2 e R3 estão ligados, formando um etilenodioxilo, um anel di-hidrofurilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo, ou um anel di-hidropirilo com o oxigénio adjacente a um carbono de fenilo; R4, R5, e R6 são, independentemente, H, Me, Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe ou OEt; desde que: a) quando R1 é Me e R2 é OMe; então R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, ou 3,5-di-F; b) quando R1 é Me e R2 é OEt; e R6 é 3,5-di-Me, 2,4- ou 2,5-di-F, então R3 é H e a combinação R4, R5, 3.5- di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl ; c) quando R1 é Et e R2 é OMe ou OEt; então R3 é H e a combinação R4, R5, e R6 é: i) 3,5-di-OMe-4-Me, 3,5-di-Cl, 3,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-F, 2,4- ou 2,5-di-Cl, 3-OMe, 2-Cl-5-Me, 2-C1, ou 3-Me; ou ii) R6 é H, R4 é Me, e R5 é Et, F, Cl, CH2OH, CN, OMe, ou OEt; d) quando R1 é i-Pr; 17 então R2 é OMe, ou OEt; R3 é H; e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e) quando R3 é Et; então R2 é H, R1 é F e a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; f) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel etilenodioxilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; g) quando R2 e R3, em conjunto com os carbonos de fenilo aos quais estão ligados formam um anel di-hidrofurilo ou di-hidropirilo; então R1 é Et e a combinação R4, R5, e R6 é 3,5-di-Me; e h) quando R2 é Me, Et, n-Pr, i-Pr, Ac, F, Cl, OH, ou SOMe; então R1 é Et, R3 é H, a combinação R4, R5, e R6 é 3.5- di-Me; na preparação de um produto farmacêutico para modulação da expressão de um ou mais genes exógenos num animal, em que as células do animal contêm: a) um complexo receptor de ecdisona compreendendo: 1) um domínio de ligação de DNA; 2) um domínio de ligação para o ligando; e 3) um domínio de transactivação; e b) uma construção de DNA compreendendo: 1) o gene exógeno; e 2) um elemento de resposta; 18 em que: a) o gene exógeno se encontra sob o controlo do elemento de resposta; e b) a ligação do domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta, na presença do ligando, resulta em activação ou supressão do gene. Lisboa, 21 de Novembro de 2007 19
PT99304444T 1998-06-17 1999-06-08 Ligandos para modular a expressão de genes exógenos através de um complexo de receptor de ecdisona PT965644E (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8954698P 1998-06-17 1998-06-17
US09/315,451 US6258603B1 (en) 1998-06-17 1999-05-02 Ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT965644E true PT965644E (pt) 2007-12-03

Family

ID=26780689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT99304444T PT965644E (pt) 1998-06-17 1999-06-08 Ligandos para modular a expressão de genes exógenos através de um complexo de receptor de ecdisona

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6258603B1 (pt)
EP (1) EP0965644B1 (pt)
JP (1) JP4537512B2 (pt)
KR (1) KR100563143B1 (pt)
CN (1) CN1296480C (pt)
AT (1) ATE378414T1 (pt)
AU (1) AU765306B2 (pt)
BR (1) BR9902283A (pt)
CY (1) CY1107083T1 (pt)
DE (1) DE69937519T2 (pt)
DK (1) DK0965644T3 (pt)
ES (1) ES2296370T3 (pt)
PT (1) PT965644E (pt)
TW (1) TWI224109B (pt)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6875727B2 (en) * 1997-12-23 2005-04-05 Syngenta Crop Protection, Inc. Use of macrolides in pest control
AUPP135698A0 (en) 1998-01-15 1998-02-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insectical modalities
AU2001241682A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 The Salk Institute For Biological Studies Gene expression system based on chimeric receptors
US20040033600A1 (en) * 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
JP5031967B2 (ja) 2000-03-22 2012-09-26 イントレキソン コーポレーション 新規エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系
US8105825B2 (en) * 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
US6576422B1 (en) 2000-10-17 2003-06-10 Rohm And Haas Company Method for identifying products employing gene expression
WO2002066613A2 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene Holdings, Inc Novel ecdysone receptor/invertebrate retinoid x receptor-based inducible gene expression system
CA2438133C (en) 2001-02-20 2015-01-27 Rheogene, Inc. Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP1373470B1 (en) * 2001-02-20 2013-04-24 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
ES2424812T3 (es) * 2001-02-20 2013-10-08 Intrexon Corporation Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso
WO2003027289A1 (en) 2001-09-26 2003-04-03 Rheo Gene Holdings, Inc. Leafhopper ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
GB2387599B (en) * 2002-04-17 2005-08-10 Jason Peter Brown Methods for producing antibodies
US20050228016A1 (en) * 2002-06-13 2005-10-13 Enrique Michelotti Tetrahydroquinolines for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US20040082618A1 (en) * 2002-07-03 2004-04-29 Rajneesh Taneja Liquid dosage forms of acid labile drugs
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US8076318B2 (en) * 2002-10-24 2011-12-13 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Caged ligands and uses thereof
AU2011202682B2 (en) * 2003-02-10 2013-11-28 Intrexon Corporation Diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304161B2 (en) * 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) * 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) * 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7425700B2 (en) * 2003-05-22 2008-09-16 Stults John T Systems and methods for discovery and analysis of markers
US20050164210A1 (en) * 2004-01-23 2005-07-28 Vivek Mittal Regulated polymerase III expression systems and related methods
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US8115059B1 (en) 2005-07-22 2012-02-14 University Of Kentucky Research Foundation Gene expression modulation system for use in plants and method for modulating gene expression in plants
CN104761466A (zh) 2007-05-29 2015-07-08 英特拉克森公司 通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体
WO2009025866A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Intrexon Corporation Methods and compositions for diagnosing disease
BRPI0817009A2 (pt) * 2007-09-17 2014-10-07 Rohm & Haas Sistema de expressão de gene para a expressão controlável de resposta ao etileno em uma célula de planta, composição, e, métodos para produzir uma planta transgênica, e para modular sensibilidade ao etileno em uma planta.
KR101666228B1 (ko) 2007-09-28 2016-10-13 인트렉손 코포레이션 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도
HUE035406T2 (en) 2007-10-08 2018-05-02 Intrexon Corp Engineered dendritic cells and uses for the treatment of cancer
EP2265116A4 (en) 2008-03-14 2013-02-06 Intrexon Corp STEROID LIGANDS AND THEIR USE IN GENE SWITCH MODULATION
MX2011009239A (es) 2009-03-05 2011-09-15 Rohm & Haas Control de rotacion apuntada de proteina de ruta de señalizacion de hormona de etileno clave para modular la sensibilidad a etileno en plantas.
CA2794196A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
SG10201600912SA (en) 2011-03-04 2016-03-30 Intrexon Corp Vectors conditionally expressing protein
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
ES2683329T3 (es) 2013-03-15 2018-09-26 Intrexon Corporation Diacilhidrazinas que contienen boro
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
WO2016044390A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Intrexon Corporation Boron-containing diacylhydrazine compounds
EA201792500A1 (ru) 2015-05-13 2018-04-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Aav-опосредованная экспрессия антител против гриппа и способы их использования
UY37343A (es) 2016-07-25 2018-02-28 Intrexon Corp Control del fenotipo en plantas
CN110139933B (zh) 2016-11-09 2024-03-08 英特瑞克斯顿股份有限公司 共济蛋白表达构建体
JP7455579B2 (ja) 2017-02-28 2024-03-26 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 新規アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）クレードｆベクター及びその用途
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
CA3052487A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza vaccines based on aav vectors
TW202237850A (zh) 2020-12-01 2022-10-01 賓州大學委員會 具有組織特異性靶向基序的新穎構成物及含有其之組成物
AR125406A1 (es) 2021-04-23 2023-07-12 Univ Pennsylvania Nuevas composiciones con motivos selectivos para el cerebro y composiciones que las contienen
EP4409010A1 (en) 2021-10-02 2024-08-07 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel aav capsids and compositions containing same
US20250144243A1 (en) 2022-01-25 2025-05-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver
KR20250135916A (ko) 2022-12-17 2025-09-15 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 심장 및 골격근 특이적 표적화 모티프를 갖는 재조합 aav 돌연변이체 벡터 및 이를 포함하는 조성물
WO2024130070A2 (en) 2022-12-17 2024-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof
AR133098A1 (es) 2023-06-29 2025-08-27 Univ Pennsylvania Aav mutante con motivos dirigidos al sistema nervioso central y composiciones que lo contienen
WO2025102034A1 (en) 2023-11-10 2025-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for barth syndrome
WO2025106661A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions with cardiac and skeletal musclespecific targeting motifs and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5117057A (en) * 1985-10-21 1992-05-26 Rohm And Haas Company Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines
US5530028A (en) * 1992-11-23 1996-06-25 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US5344958A (en) * 1992-11-23 1994-09-06 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
JP4004555B2 (ja) * 1993-09-29 2007-11-07 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 殺虫化合物
US5482962A (en) * 1994-07-22 1996-01-09 Rohm And Haas Company Insecticidal N,N'-disubstituted-N-N'-diacylhydrazines
ATE293699T1 (de) * 1995-03-03 2005-05-15 Syngenta Participations Ag Kontrolle der pflanzengenexpression durch rezeptor-vermittelte transaktivation in gegenwart von einem chemischen ligand
CA2219121A1 (en) * 1995-05-26 1996-11-28 Zeneca Limited A gene switch comprising an ecdysone receptor
AU734051B2 (en) * 1996-04-05 2001-05-31 Salk Institute For Biological Studies, The Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6333318B1 (en) * 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
AU5915999A (en) * 1998-09-10 2000-04-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ecdysone receptors and methods for their use

Also Published As

Publication number Publication date
EP0965644B1 (en) 2007-11-14
KR100563143B1 (ko) 2006-03-22
JP2000037189A (ja) 2000-02-08
EP0965644A3 (en) 2004-01-07
EP0965644A2 (en) 1999-12-22
JP4537512B2 (ja) 2010-09-01
US20010044151A1 (en) 2001-11-22
ES2296370T3 (es) 2008-04-16
CY1107083T1 (el) 2012-10-24
TWI224109B (en) 2004-11-21
BR9902283A (pt) 2000-05-02
DK0965644T3 (da) 2008-01-28
AU3390099A (en) 2000-02-10
DE69937519D1 (de) 2007-12-27
ATE378414T1 (de) 2007-11-15
KR20000006256A (ko) 2000-01-25
AU765306B2 (en) 2003-09-18
CN1296480C (zh) 2007-01-24
DE69937519T2 (de) 2008-09-04
US6258603B1 (en) 2001-07-10
CN1251389A (zh) 2000-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT965644E (pt) Ligandos para modular a expressão de genes exógenos através de um complexo de receptor de ecdisona
US9272986B2 (en) Diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
JP5642060B2 (ja) エクジソン受容体複合体を通して外因性遺伝子の発現を調節するための生物学的利用能のあるジアシルヒドラジン・リガンド
JP5650432B2 (ja) エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を調節するためのケトンリガンド
DK1601354T3 (en) OXADIAZOLINE AGENTS FOR MODULATING EXPRESSION OF EXOGENIC GENES FROM AN ECDYSON RECEPTOR COMPLEX
JP2006502977A (ja) エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を制御するためのテトラヒドロキノリン
MXPA99005570A (en) Links to modulate the expression of exogenous genes through an ecdis receptor complex