PT97383B - Processo para a producao de uma cadeia de globina, de um seu fragmento de ligacao e de hemoglobina, e de composicoes de hemoglobina - Google Patents

Description

1« CAMPO.....DA.....IM.VEM0.AQ.

O presente invento refere-se a uma cadeia de globína substancialmente pura ou a um seu fragmento de ligação a heme, A cadeia de globína pode ser uma cadeia de globína do tipo alfa ou uma cadeia de globína do tipo beta ou uma sua variante- A invenção refere-se adicionalmente a um vector de expressão que, especificamente, compreende sequências de ADM codificando, pelo menos, uma cadeia de globina ou um seu derivado de ligação a heme, ligado operativamente a um promotor de levedura, A invenção descreve também o processo para a produção de uma cadeia de globina, ou de um seu fragmento de ligação a heme, em levedura, e processos para a produção de hemoglobina em levedura- A hemoglobina produzida pelos processos da presente invenção pode ser usada em aplicações que requerem transportadores de oxigénio fisiológico, tais como em soluções de substituição de sangue ou num expansor de plasma,

2, A.MTEC.EDE.MTE.S.....D A......1 NVEN£ê.Q.

-1, USO.....D A... HEMOGLOBINA ...COMO.....SUBST.I TUTO....PQ.....SANGUE

A transfusão de um paciente com sangue de dador tem um certo número de desvantagens. Em primeiro lugar, pode existir uma carência de um certo tipo de sangue do paciente. Em segundo lugar, existe o perigo de o sangue do dador poder estar contaminado com agentes irifecciosos tais como vírus da hepatite, citomegalovirus, vírus de Epstein-Barr, parvovírus do soro, sífilis, malária, filaríase, tripanossomíase, babsiose, bactérias, patogénicas e HIV (Bove, 1986, Progr, Hematol, 14:123-145), Em terceiro lugar, o sangue de dador tem um tempo de vida em prateleira limitado.

Uma alternativa à transfusão envolve o uso de um substituto de sangue. Um substituto de sangue é uma solução transportadora de oxigénio que proporciona também a pressão oncótica necessária para manter o volume do sangue. Recentemente, têm-se estudado dois tipos de substitutos, as emulsões de fluorocarboneto e as soluções de hemoglobina,

A hemoglobina, tal como existe nos glóbulos vermelhos.

composta por duas cadeias de globina do tipo alfa e por duas cadeias de globina do tipo beta, cada uma com um residuo heme. Uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta combinam-se para formar um dírnero que é muito estável. Os genes de globina do tipo alfa e do tipo beta são, cada um, uma família de genes de globina relacionados, que sao expressos em diferentes estados de desenvolvimento e que são regulados pela pressão de oxigénio, pelo pH e pelo desenvolvimento de embrião para feto para recém-nascido. Doí dímeros alinham-se, então, de uma forma ariti-paralela para formar tetrameros. A ligação dos dímeros para formar tetrameros não é tão forte como no caso da ligação dos monómeros que se associam para formar dímeros. Deste modo, os tetrameros têm uma tendência para se separarem para formar dímeros e existe sempre um equilíbrio entre tetrameros, dímeros e monómeros. Para concentrações elevadas de globina, a forma predominante é o tetramero; com a diluição, o dírnero torna-se a forma predominante. Este equilíbrio é também afectado pelo solvente, pelos sais, pelo pH e por outros factores, uma vez que as forças de ligação entre os monómeros são, principalmente, electrostáticas.

Os genes de globina do tipo alfa estão integrados, em conjunto, no cromossoma 1.6 e incluem genes codificando a cadeia de zeta-globina de embrião e a cadeia de alfa-globina de adulto, presentes tanto no feto como no recém-nascido. Os genes da globina do tipo beta residem no cromossoma 11 e incluem genes codificando a cadeia de epsilon-globina de embrião, a cadeia de gama™ -globina fetal e as cadeias de delta-globina de adulto e de beta-globina de adulto. Identíficaram-se dois tipos de cadeias de gama-globina, ^fâgama e ^Agama, que diferem pela presença de um único resíduo glicina ou alanina, respectivamente, no aminoácido 135 (Schroeder et al., 1968, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 60: 537-544)., Verificou-se que a cadeia gama contém um sítio polimórfioo na posição 75, que pode ser também ocupado quer por ísoleucina quer por treonina» Podem-se formar várias hemoglobinas (revisão bibliográfica em Kutlar et al., 1989, Hemoglobin 13:671-683 e Honig e Adams, Human Hemoglobin fâenetics, Springer Verlag, New York pp. 29-33). Exemplos incluem HbA (alfa₂beta₂), HbA₂ (alfa2~

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6666-008-118 delt^), HbF CalTa^^ama^·) t. HbBarts (gama₄), HbH (beta₄), e Hb Hb Portland e Hb Gower II (alPortland I * Hb Portland II (zeta2beta2)₃

III (zeta2delta2), Hb Gower I (zeta2®psilon2)» fa^epsilor^)»

Contudo, existem obstáculos à utilização de hemoglobina nativa como substituto do sangue» Em primeiro lugar, são necessárias grandes dosagens (Walder, 1988, Biotech ’88, San Francisco, Nov» 14-16, 1988)» Uma unidade simples (450 ml) de uma solução de hemoglobina a 10% contém 45 g de proteina» Estima-se que nos E»U»A», por ano, se visam pelo menos 12 milhões de unidades de sangue» Deste modo seria necessária uma produção de 450 000 kg de hemoglobina por ano» Em segundo lugar, é importante obter hemoglobina que esteja isenta de agentes infecciosos e de substâncias tóxicas» Em terceiro lugar, tal como anteriormente se referiu, ainda que a hemoglobina seja, normalmente, um tetramero com um peso molecular de 64 000, pode-se dissociar para formar dímeros alfa-beta» Os dímeros são rapidamente eliminados pelos rins e o tempo de residência é demasiado curto para que a hemoglobina isenta de células seja útil como substituto do sangue» Em quarto lugar, a hemoglobina isenta de células tem uma afinidade por oxigénio demasiado elevada para libertar eficazmente o oxigénio para os tecidos, devido à ausência do 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPfâ)„ Os esforços para restaurar o 2,3-DPO têm sido mal sucedidos uma vez que o 2,3-DPQ é rapidamente eliminado da circulação»

Têm sido tentadas várias abordagens para obviar estas dificuldades» Estas incluem a expressão da hemoglobina via sistemas de ADN recombinante, modificação química da hemoglobina e produção de variantes da hemoglobina»

2„1„1„ EXPRESSÃO.....DE HEMOGLOBINA RECOMBINANTE

Clonaram-se e sequenciaram~se a zeta-globina de embrião humano (Cohen-Sohal, 1982, DNA 1:355-363), a epsilon-globina de embrião humano (Baralle et al», 1980, Cell 21:621-630), a gamaglobina de feto humano (Slightom et al», 1980, Cell 21:627-630), a delta-globina de adulto humano (Spritz et al», 1980, Cell 21: :639-645), o ADN genómíco da alfa-globina de adulto humano (Lie72 499

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6,

...........

bhaber et al», 1980, Proc,, Natl» Acad» Sei» U„S»A» 77:7054-7058) e o ADNc da beta-globina de adulto humano (Marotta et al», 1977, J„ Biol» Chem» 252: 5040-5053)»

Exprimiram-se, em sistemas bacteríanos, as globinas alfa e beta de adulto humano» Nagai et al» (1986, Proc» Natl» Acad» Sci» U»S»A» 82:7252-7255 e 1984, Nature (London) 309:810-812) exprimiu a beta-globina de adulto em E.».........coli. na forma de uma proteína híbrida consistindo nos 31 resíduos anúno-terminais da proteína lambda dl, num ligador Ile-Glu-fâly-Arg e na cadeia completa de beta-globina de adulto humano» 0 híbrido foi clivado na única ar™ ginina com factor de coagulação do sangue Xa, resultando na libertação da cadeia de beta-globina» 0 Pedido PCT nQ» PCT/US88/ /01534 (Publicação nQ» WO 88/091799, publicada em 1 de Dezembro de 1988) descreve a expressão de uma sequência de ADN codificando o gene da alfa-globina de adulto e a sequência de 20 aminoácidos N-terminal da beta-globina, na qual as sequências da alfa-globina e de beta-globina estão separadas por um espaçador de ADN codificando um sitio de clivagem do factor Xa„

Têm sido desenvolvidos vários esforços para segregar beta™

-globina no periplasma de E..„.....coli.., no qual, o gene de beta-globina foi inseírido atrás de uma sequência de sinal de secreção OmpA (Brinigar et al», 1988, Symposium on Oxigen Binding Heme Proteins-Structure, Dynamics, Functiori and 0eneti.es)» Contudo, verifícou-se que ainda que a fusão tivesse sido correctamente processada, a beta-globina não era segregada»

Nagai et al» (1986, Proc» Natl» Acad» Sei» U„S»A» 82:7252-7255) descreveram também a reconstituição da beta-globina de adulto, expressa em E„,.....coli.., e da alfa-globina de adulto obtida a partir de fontes convencionais, conjuntamente com uma fonte de heme, para obter a hemoglobina» Contudo, não foi possível produzir, em E..,........coli., hemoglobina recombinante com as mesmas propriedades funcionais da hemoglobina humana normal, devido a incapacidade da E.».....coli. em remover a N-formilmetionina por processamento pós-tradução» É conhecido que o terminal amino é crítico na determinação das propriedades de ligação de oxigénio da hemoglo72 499

6666-008-.1.18 „ --'ff* —6— ** ......bina humana, tal como so tom mostrado no caso da Hb Raleigh (Moo-Penn, et al., 1977, Biochemistry, 16:4872-4879)„ Além disso, a hemoglobina produzida em bactérias pode conter endotoxinas de çoli Têm, também, sido feitas várias tentativas para exprimir a hemoglobina em levedura- Relatórios de dois grupos indicam que as células de levedura foram incapazes de excisar as sequências intervenientes em ambos os ARN-m precursores de alfa-globina e de beta-globina (Langford et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U-S..A- 80:1496-1500 e Beggs et al-, 1980, Nature (London) 283: :835-840)- Fez-se também uma tentativa para segregar beta-globina em íife.rep.tqmyces construindo um plasmídeo possuindo uma sequência Galk-FX-beta-globina atras de uma sequência de sinal de secreção de beta-galactosidase (Brinigar et al-, 1988, Symposium on Oxigen Bindirig Heme Proteins Structure, Dynamics, Function and fâeneties)„ Contudo, a Galk-FX-beta-globina permaneceu nas células sob condições nas quais a galactoquinase foi segregada.

Recentemente, descreveu-se a construção de dois plasmídeos de levedura contendo a beta-globina de adulto (Brinigar et al-, 1988, Symposium on Oxigen Binding Heme Proteins Structure, Dynamics, Function and Geneties)„ Um continha um promotor constitutivo, gliceraldeído-3-fosfato-desídrogenase e ubíquítina, fundidos directamente com beta-globina de adulto, e outro continha metalotioneína, um promotor indutível, e ubíquítina fundidos directamente com a beta-globina- Descreveu-se também que, em ambos os casos, se obtinham beta-globina de adulto intracelular, solúvel, e insolúvel- Não se descrevem mais detalhes relativos à. construção dos plasmídeos ou à quantidade de beta-globina de adulto obtida.

Foi também descrita a expressão de globina em células de mamíferos- Descreveu-se a construção de vectores recombinantes de vírus herpes simplex, adenovirus, SV-40 e retrovirus, contendo uma sequência de ADN codificando o gene da beta-globina de adulto humano (Dobson et al-, 1989, J. Virol- 63:3844-3851; Yanagi et al-, 1989, Gene 76:19-26; Miller et al-, 1988, 3. Virol. 62:43374345; e Karlsson et al-, 1985, EMBO J 5: 2377-2386),, Descreveu-se

499 ,7 .....

6666-008-118 ' (Α’” também a expressão de genes de alf a-globiria de adulto humano em células de ovário de hamster Chinês» que envolvia a introdução de uma molécula de ADN recombinante» contendo o gene de alfa-globina de adulto humano normal, e um gene híbrido contendo a região de promotor-regulador 5’ do gene de metalotioneína de ratinho, ligada a um gene de SV2-ADNc-di-hidrofolato-redutase (Lau et al-, 1984, Mol- Cell Biol- 4:1469-1475)- Contudo, verificou-se que a expressão dos genes de globina era muito baixa devido à baixa eficiência da transferência do gene2.1.2. MQ.0.I Ε10 AQftO.....QUÍMICA.....D A.... HEMOGLOBINA

Uma abordagem que foi adoptada para tornear o problema da dissociação do tetrarnero de hemoglobina para formar um dímero, tem sido modificar quimicamente a hemoglobina» por reticulaçâo, quer intramolecular quer intermolecular» Exemplos destas modificações incluem, reticulaçâo com polialquilenoglicol (Iwashita, Patentes dos E-U-A- nSs. 4 412 989 e 4 301 144), com poli (óxido de alquileno) (Iwasake, Patente dos E-U-A- nS- 4 670 417), com um polissacãrido (Nícolau, Patentes dos E-U-A- nQs. 4 321 259 e 4 473 563); com fosfato de ínositol (Wong, Patente dos E-U-AnQs- 4 710 488 e 4 650 786); com um agente de reticulaçâo bifuncional. (Morris et al-, Patente dos E-U-A- nS„ 4 061 736); com insulina (Ajisaka, Patente dos E-U-A- rió- 4 377 512); e com um agente de reticulaçâo, de modo â. composição de hemoglobina estar reticulada Iritramolecularmente entre a Lys 99-alfa·^ e a Lys 99-alfa2 (Walder, Patente dos E-U-A- nS. 4 598 064)Tambérn se modificou quimicamente a hemoglobina para diminuir a afinidade por oxigénio da hemoglobina isolada- Uma abordagem envolveu a polimerizaçao com peridoxal-fosfato (Sehgal et al-, 1984, Surgery, 95:433-438)- Outra abordagem envolveu o uso de reagentes que mimetizam, o 2,3-DPG (Bucci et al. , Patente dos E-U-A- nS 4 584 130)- Ainda que estes compostos diminuam a afinidade por oxigénio da hemoglobina, a afinidade é ainda relativamente elevada2 -1.3 - V ARI. ANTES.....DA HEMOGLOBINA

As categorias de variantes da hemoglobina de ocorrência na72 499

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-8tural incluem; variantes que auto-polimerizam; variantes que evitam a dissociação do tetramero, variantes com afinidade intrínseca por oxigénio diminuída e variantes que são estáveis em meio alcalino» Exemplos de variantes da hemoglobina que polimerizam incluem a Hb Porto Alegre, a Hb Mississippi e a Hb Ta-Li»

A Hb Porto Alegre é uma variante de cadeia beta, primeiramente descrita, por Tondo et al» (1974, Biochem» Biophys» Acta 342; 15-20; 1963, Am» J» Human Genet» 15:265-279). A serina beta-9 está substituída por cisteína, que é capaz de formar ligações dissulfureto com outros resíduos cisteína» Através destas ligações cruzadas, a Hb Porto Alegre forma poli-tetrameros» Contudo, estes polímeros não se formam no sangue dos portadores de Hb Poi— to Alegre» Mostrou-se que os portadores de Hb Porto Alegre possuem um nível duas vezes mais elevado de glutationa e um nível três vezes mais elevado de glutationa-redutase que evita a polimerização da Hb Porto Alegre nos glóbulos vermelhos (Tondo et al», 1982, Biochem» Biophys» Res» Commuri» 105:1381-1388)- A estrutura exacta destes polímeros não é conhecida»

A Hb Mississippi é uma variante de polimerização da hemoglobina, recentemente isolada» A nova variante foi primeiramente descrita por Adams et al» (1987, Hemoglobin 11:435-452)» A serina beta-44 está substituída por cisteína, nesta variante, resultando em ligações dissulfureto inter-tetramero» Crê-se que esta variante forma polímeros, contendo tanto quanto dez tetrameros»

A Hb Ta-Li & outra variante beta de polimerização, conhecida» A glicina beta™83 está substituída por cisteína» Esta variante foi primeiramente descrita em 1971 (Blackwell et al», 1971, Biochem» Biophys» Acta 243:467-474)» Esta variante forma também ligações cruzadas intei—tetramero»

Outro grupo de variantes inclui variantes possuindo tetrameros que não se dissociam» Um exemplo é a Hb Rainxer, uma variante bem caracterizada da cadeia beta (Greer e Perutz, 1971, Nature New Biology 230:261 e Statoyannopoulos et al», 1986, Science 159-741)» A tirosina beta-145 está substituída por cisteína» Esta

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~9 cisteína é capaz de formar ligações cruzadas dissulfureto com a cisteína beta-93, que estã presente na beta-globina natural» Esta ligação dissulfureto é intra-tetramero, i.»e.»., é formada entre as duas subunidades beta no tetramero» Esta ligação covalente de dissulfureto estabiliza a forma de tetramero e evita a dissociação do tetramero nos seus dímeros constituintes» Verificou-se, também, que a Hb Rainer possui uma afinidade elevada por oxigénio, um coeficiente de Hill reduzido e apenas metade do efeito de Bohr alcalino da hemoglobina normal»

Outro grupo de variantes inclui as que são estáveis em meios alcalinos» A Hb Motown/Hacettepe é uma variante descrita como sendo estável em meio alcalino (Gibb e Rucknagel, 1981, Clinicai Research 29;795A e Altay et al», 1976, Biochem» Bíophys» Acta 434:1-3)» A glutamina beta-127 estã substituída por ácido glutãmico nesta variante» Esta porção da cadeia beta estã envolvida na interface alfa^beta^ entre os moriómeros que formam o dímero» 0 ácido glutâmíco substituído forma uma ligação iónica com a arginina alfa-31» Esta é uma ligação mais forte do que a que se forma entre a argíriina alfa-31 e a glutamina normal beta-127 e crê-se que é responsável pela maior estabilidade da Hb Motown/Hacettepe» Neste grupo de variantes, estáveis em meio alcalino, incluem-se também a HbE (hemoglobina fetal) e a hemoglobina de bovino (Perutz, 1974, Nature 247:341)»

Existem, também, cerca de 30 variantes de hemoglobina de ocorrência natural que exibem uma afinidade por oxigénio diminuída» No Pedido PCT nS. PCT/US88/01534 (Publicação nQ» W0 88/091799, publicada em 1 de Dezembro de 1988), Bonaventura e Bonaventura, 1980, em; Abnormal Human Hemoglobiris and Red Cell Enzymes, Huisman, T„, Ed», Maroel. Dekker, NY, Henioglobin 4 (3 & 4): 275-289 e Bonaventura e Bonaventura, 1978, em Biochemical and Clinicai Aspects of Hemoglobin Abnormal.ities, Caughey, W»S», Ed», Academic Press, NY, pp» 647-663, descrevem-se vários exemplos destas variantes» Parece que, num grupo destes mutantes de baixa afinidade por oxigénio, existe uma relação generalizável entre a afinidade por oxigénio intrínseca de uma hemoglobina alfa^beta^. e o agregado de resíduos carregados positivamente que estão envol72 499

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10vidos na ligação do 2,3-DPG o do outros cofactores alostéricos anionicos da função hemoglobina (Bonaventura e Bonaventura, 1980, Amer. Zool. 20:131-138),.

Um exemplo de um mutante de baixa afinidade por oxigénio é a Hb Chico onde a Usina beta-66 está substituída por troonina (Shih ot al., 1987, Homoglobin 11: 453-464). A P50 dos glóbulos vermelhos de Hb Chico é de 38 mm Hg em comparação com os controlos de glóbulos vermelhos normais com P50 de 27 mm Hg. Todas as outras propriedades, i.».e,„ coeficiente de Hill e efeito de Bohr alcalino são normais.

Outra variante com uma baixa afinidade por oxigénio é a Hb Raleigh, uma variante de cadeia beta na qual a valina beta-1 está substituída por alariina (Moo-Penn et al., .1977, Bíochemistry 16:4873). Uma modificação pós-tradução da alariina amino-termirial resulta na formação de acetilalariina. Uma vez gue o grupo amino da valina, carregado positivamente, estã envolvido na ligação de 2,3-DPG, a acetilação resulta num agregado de menor carga no sítio de ligação de DPG. Esta diferença de carga actua para diminuir a afinidade por oxigénio da Hb Raleigh e para atenuar o efeito do DPG, o gue diminui a afinidade por oxigénio da HbA normal. 0 coeficiente de Hill (cooperação) e o efeito de Bohr alcalino (ligação de oxigénio dependente do pH) não são afectados por esta modificação.

A Hb Titusville (aspartato alfa-94 para asparagina) é uma de um grupo de variantes de hemoglobina, de baixa afinidade, com contactos alfa₁beta₂ alterados (Schneider et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta 400:365). A interface alfa^beta^· é estabilizada por dois conjuntos diferentes de ligações de hidrogénio entre as subunidades alfa e beta. Um dos conjuntos estabiliza a estrutura T que é a forma de baixa afinidade e o outro estabiliza o estado R gue é a forma de afinidade elevada. É a interconversão entre estes dois conjuntos de ligações e a alternância entre os estados T e R que é responsável pela cooperação positiva. A desoxí-hemoglobina está, principalmente, no estado T. Para a hemoglobina com um oxigénio ligado, a quantidade de moléculas no estado R aumenta

6666-008-118 .

X e, deste modo, liga-se ao oxigénio com uma afinidade mais elevada» Na hemoglobina com dois oxigénios ligados, existe uma proporção ainda maior de moléculas no estado R„ Na Hb Títusville, as ligações no estado R são quebradas» 0 aspartato aIfa-94 formaria, normalmente, uma ligação não covalente com a asparagína beta-102» Devido ao facto de esta ligação ser quebrada, o equilíbrio é empurrado na direcção do estado Tea afinidade por oxigénio da Hb Titusville é muito baixa»

A Hb Beth Israel é outra variante que afecta a interface alfa-Lbeta£, o que desestabiliza o estado R de elevada afinidade por oxigénio (Nagel et al», 1976, New Eng» 3. Med» 295:125-130)» A asparagína beta -102 estã substituída por serina. 0 sangue completo de um paciente com Hb Beth Israel tem uma P50 de 88 mm Hg em comparação com o valor normal de 27» 0 coeficiente de Hill é bifásico com um valor de 1,0 na extremidade elevada e de 1,8 na extremidade baixa» 0 efeito de Bohr é normal» Um hemolisado de Hb Beth Israel tem uma P50 de 17 mm Hg e um coeficiente de Hill de 1,65 no fundo e de 1,29 no topo da curva, em comparação com uma P50 de 5,6 e com um coeficiente de Hill de 2,72 para a hemoglobina normal»

Outro exemplo de um mutante de hemoglobina humana de baixa afinidade é a Hb Kansas (Pedido PCT nQ. PCT/US88/01534, Publicação nQ, WO 88/091799, publicada em 1 de Dezembro de 1988 e Bonaventura e Riggs, 1968, 3» Biol» Chem» 243: 980-991)» A asparagina beta-102 está substituída por treonina» Mostrou-se que as cadeias de beta-globina contendo heme da Hb Kansas isolada têm uma afinidade por oxigénio diminuída (Riggs e Gibson, 1973, Proc» Natl» Acad» Scí» U»S»A» 70:1718-1720)»

2»2» EXPRESSÃO.....DE.,.ADN.,,HETERÓ,LOGO.....EM„LEVEDURA

Com o advento da tecnologia do ADN recombinante, têm sido desenvolvidos esforços para exprimir ADN heterelego numa variedade de sistemas procarióticos e eucariõticos» A levedura é um destes sistemas»

A levedura tem um certo número de vantagens, em relação a

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bactérias e a outros eucariotas, como sistema para a produção de polipéptidos ou de proteínas codificadas por ADN recombinante. A levedura tem sido usada em fermentações em grande escala durante séculos, de modo que a tecnologia de fermentação da levedura é bem conhecida e estã disponível, comercialmente, um grande número de hospedeiros de levedura. Adicionalmente, a levedura pode ser cultivada até densidades mais elevadas do que as bactérias e do que muitos outros tipos de células eucarióticas, e é facilmente adaptável ao processamento de fermentação contínua. Uma vez que a levedura é um organismo eucariótico, a levedura pode ser capaz de glicosilar produtos de expressão, pode exibir as mesmas preferências de codão do que organismos superiores e pode remover a metionina do terminal amino durante o processamento pós-traduçâo.

Têm sido expressas em levedura numerosas proteínas heterólogas. Exemplos incluem o interferão (Hitzeman e Leung, Patente dos E.U.A. nQ. 4 775 622, publicada em 4 de Outubro de 1988; Hitzman et al., Patente Canadiana nQ. 1 205 026, publicada em 27 de Maio de 1986; Hitzeman et al., 1981, Nature (London) 293: 717); o factor de crescimento derivado de plaquetas (Murray et al., Patente dos E.U.A. nQ. 4 801 542, publicada em 31 de Janeiro de 1989); o glucagon (Norris et al., Patente dos E.U.A. nQ. 4 826 763, publicada em 2 de Maio de 1989).

As proteínas heterólogas expressas em levedura têm sido ligadas a uma grande variedade de promotores. Exemplos incluem a ligação operativa de proteínas heterólogas a promotores 8V40 e RSV (Selfand et al., Patente dos E.U.A. nQ. 4 8710 013, publicada em 26 de Setembro de 1989). Adicionalmente, têm-se ligado sequências de ADN, codificando proteínas heterólogas, a promotores de levedura que são indutíveis, A Publicação do Pedido de Patente Europeia nQ. 132 309, publicada em 30 de Janeiro de 1985, descreve a construção de um plasmídeo contendo os promotores de levedura, induzidos por galactose, para a galactoquinase (CALl) e para a UDP-galactose-epimerase (fâAL.10), aqui depois designado por promotor GAL.1-10, que © bidireccional. Outro exemplo de um promotor de levedura bi-direccional é a sequência iritergenes YPT.l/TyB2 que contem sítios de ligação sobrepostos para o factor de transcrição (7

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6666-008-118 ^’^ΙΒΒΜΒ¹'

Ifor

BAF.1 (Halfter et al., 1989, EMBO J

8113029-3037)» Broach et al. (Manipulation of Gene Expression, ed» Inouye, 1983) descrevem um plasmídeo contendo uma sequência de aotivador a montante do GAE10, que promove a transcrição e uma sequência de terminador da transcrição da álcool-desidrogenase (ΑΡΗ 1) , para evitar a continuação da transcrição, derivada de YEpSl. Kingsmari et ah, Patente dos E.U.A» n£>» 4 615 974, publicada em 7 de Outubro de 1986, descrevem o uso das regiões 5’ dos genes da fosfoglicerato-quinase de levedura como promotor da transcrição de iriterf erão» Hintzeman et al», Patente Canadiana nQ» i 205 026, publicada em 27 de Maio de 1986 descreve o uso da sequência de flanqueamento 5’ do gene estrutural da AQH1 para promover a transcrição do ín— terferão. Burke et al», Patente dos E.U.A. nô. 4 876 197, publicada em 24 de Outubro de 1989, descrevem uma construção de AON compreendendo uma primeira região reguladora de transcrição, obtida a partir do gene da álcool-desidrogenase II (ADH2) de levedura, a região reguladora de ácido-fosfatase (PKQ.5) ou as regiões reguladas por GA.L.4, que proporciona uma regulação transcricional indutível, e uma segunda região de iniciação transcricional do gene da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (TDH3) de levedura e uma região de terminador»

3» SOM AP 10.....DA.....INVENÇÃO.

A invenção refere-se a uma cadeia de globina de mamífero, substancíalmente pura, ou a um seu fragmento de ligação a heme» Substancíalmente pura tal como é aqui definida refere-se a uma cadeia de globina que estã isenta de componentes de membrana de eritrocitos e de endotoxinas de E».....çqli.» A cadeia de globina pode ser uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma sua variante, ou uma cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante» A cadeia do tipo alfa pode ser seleccionada de entre o grupo que inclui, mas não está .limitado a, uma cadeia de zeta-globina de embrião e uma cadeia de alfa-globina de adulto» A cadeia do tipo beta pode ser seleccionada de entre o grupo que inclui, mas que não estã limitado a, uma cadeia de epsí lon-globiria de embrião, uma cadeia de gama-globiria fetal, uma cadeia de delta-globiria de adulto e uma cadeia de beta-globina de adulto» A hemoglobina consistindo essencialmente de uma cadeia de globina do tipo alfa e de uma ca72 499

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dela de globina do tipo beta pode ser obtida por mistura de uma globina do tipo alfa e de uma globina do tipo beta, ou das suas variantes, com uma fonte de heme., A hemoglobina consistindo essencialmente de cadeias de gama-globína, ou das suas variantes, pode ser obtida por mistura das cadeias de gama-globina, ou das suas variantes, com uma fonte de heme» A hemoglobina consistindo esseneialmente de uma cadela de globina de tipo alfa e de uma cadeia de globina do tipo beta, e a hemoglobina consistindo essencialmente de um cadeia de gama-globiria, ou de uma sua variante, pode ser usada em aplicações que requerem transportadores de oxigénio fisiológico, tais como em soluções de substituição de sangue, ou em expansores de plasma»

As cadeias de globina ou os seus fragmentos de ligação a heme da presente invenção, podem ser obtidas por expressão de um vector de ADN recombinante compreendendo uma sequência de ADN codificando pelo menos uma cadeia de globina, ou um seu fragmento de ligação a heme, em levedura» Deste modo, a invenção refere-se a um vector de ADN recombinante, capaz de exprimir uma cadeia de globina, ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura compreendendo:

(a) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina ou um seu fragmento de ligação a heme;

(b) um promotor transcriciorial de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina ou o seu fragmento de ligação a heme;

(c) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccionãvel de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (d) uma origem de replicação de levedura»

Um promotor transcricional. de levedura pode ser seleccionado de entre o grupo que inclui, mas que não está limitado a, um promotor transcricional indutivel de levedura, um promotor transcricional constitutivo de levedura, um promotor híbrido de levedura, e um promotor bi-direccional de levedura» vector de ADN recombinante pode ser capaz de exprimir uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma cadeia de globina do tipo

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beta ou uma sua variante,. Noutra concretização, o vector pode ser capaz de exprimir duas cadeias de globina. Numa concretização, o vector pode ser capaz de exprimir uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globína do tipo beta, ou as suas variantes. Em concretizações específicas, o vector pode ser capaz de exprimir uma cadeia de globiria do tipo alfa não variante e uma cadeia de globina do tipo beta variante; alternativamerite, o vector recombinante pode ser capaz de exprimir uma cadeia de globina do tipo alfa variante e uma cadeia de globina do tipo beta não variante; ou o vector recombinante pode ser capaz de exprimir uma cadeia de globina do tipo alfa variante e uma cadeia de globina do tipo beta variante. Numa concretização muito específica, o vector recombinante pode ser capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globina de adulto e uma cadeia de beta-globina de adulto»

A invenção refere-se a um processo para a produção de pelo menos uma cadeia de globina, ou um seu fragmento de ligação a heme, riuma célula de levedura compreendendo:

(a) a introdução numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante compreendendo: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcrícional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globína ou uma sua porção f uriciorialmente activa; (iii) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicaçao de levedura; e (b) a cultura da célula de levedura num meio apropriado, de modo a que a cadeia de globina ou um seu fragmento de ligação a heme seja expressa.

A invenção refere-se também a um processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta, compreendendo os passos de:

(a) a introdução numa célula de levedura de um vector de ADN recombinante compreendendo: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma sua variante; (ii) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo beta

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-. - -ÇS··'” —16—

ou uma sua variante; (iii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina do tipo alfa e a cadeia de globina do tipo beta; (iv) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma origem de replicação de levedura;

(b) a cultura da célula de levedura num meio apropriado de modo a que a cadeia de globina do tipo alfa ou o seu fragmento de ligação a heme e a cadeia de globina do tipo beta ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressas;

(c) o isolamento da cadeia de globina do tipo alfa e da cadeia de globina do tipo beta da célula de levedura; e (d) a mistura da cadeia de globina do tipo alfa e da cadeia de globina do tipo beta com uma fonte de heme»

A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta numa célula de levedura produzindo heme, compreendendo:

(a) a introdução numa célula de levedura de um vector de ADN recombinante, compreendendo: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma sua variante; (ii) uma sequência de AON codificando uma cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante; (iii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequênciade ADN codificando a cadeia de globina do tipo alfa e a cadeia de globina do tipo beta; (iv) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma origem de replicação de levedura; e (b) a cultura da célula de levedura num meio apropriado de modo a que a cadeia de globina do tipo alfa, ou a sua variante, e a cadeia de globina do tipo beta, ou a sua variante, sejam expressas e reunidas conjuntamente com heme numa célula de levedura produzindo heme, para formar hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta»

A invenção refere-se também a um processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina do tipo alfa, ou λ, ,χΡ

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uma sua variante, uma cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante, compreendendo os passos dex (a) a introdução numa célula de levedura de dois véctorés de ADN recombinante onde o primeiro vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma sua variante; (ii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina do tipo alfa, ou uma sua variante; (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção f uricionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura, e onde o segundo vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante; (ii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante; (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura;

(b) a cultura da célula de levedura de modo a que as cadeias de globina do tipo beta e do tipo alfa ou os seus fragmentos de ligaçao a heme sejam expressas;

(c) o isolamento das cadeias de globina do tipo alfa e do tipo beta da célula de levedura; e (d) a combinação das cadeias de globina do tipo alfa e do tipo beta com uma fonte de heme.

A invenção refere-se também a um processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina do tipo alfa, ou uma sua variante e uma cadeia de globina do tipo beta, ou uma sua variante, numa célula de levedura produzindo heme, compreendendo os passos dex (a) a introdução numa célula de levedura de dois véctorés de ADN recombinante, onde o primeiro vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo alfa ou uma sua variante; (ii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina do tipo alfa, ou uma sua variante;

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-π

18(iii) uma sequência de AON codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção f uneiorialmerite activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura, e onde o segundo vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante; (ii) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina do tipo beta ou uma sua variante; (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura;

(b) a cultura da célula de levedura em meio apropriado de modo a que as cadeias de globina do tipo alfa e do tipo beta, ou as suas variantes, sejam expressas e reunidas corijuntamente com heme na célula de levedura para formar hemoglobina»

4» BREVE.....DESCRIÇÃO.....DAS.....FIGURAS

A Figura 1 mostra as sequências de nucleótidos das cadeias zeta de embrião (IA), epsilon de embrião (IB), gama fetal (IC), delta de adulto (1D), alfa de adulto (1E), e beta de adulto (IF) da hemoglobina humana» Mostram-se por baixo as sequências de aminoácidos deduzidas» 0 codão de inicio AUG e a metioniria amino-terminal correspondente, que é removida por metionina-amino-peptidase numa modificação pós tradução não se mostram nas figuras»

A Figura 2 mostra um mapa de restrição parcial do plasmídeo pSPBC» Mostra-se a inserção completa do gene da beta-globina pela linha dupla e as sequências de plasmídeo são indicadas por uma linha simples» Os sítios de restrição que se mostram sobre a linha são A~AçcI; E^EçoRI; F^SfaNI; H-Hindl 11; N~Nç.oI; e B^BamHT. A linha sobre os sítios de restrição representa a região de codificação do gene da beta-globina» Os números sob as linhas representam o comprimento em pares de bases a partir do sítio EcoRI presente no vector»

A Figura 3A mostra a estratégia usada para cloriar o gene da beta-globina Porto Alegre na YEpSl» A Figura 38 mostra a estratégia usada para clonar o gene da beta-globina de adulto na YEpSl»

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A Figura 4 mostra o mapa d© restrição do plasmídeo YEpWBSl/Port„

A Figura 5 mostra uma auto-radiografia do ARN total extraído da estirpe de levedura Sc340 transformada com YFpSl (340g2C)„ YFpSIT/Nat (340g2B) & YEpWBSl/Port (340g2P), Submeteu-se o ARN total a electroforese num gel de agarose a 1,1%, transferiu-se para papel Hybond e sondou-se oom um fragmento Apa.LI-H.in.dIII (600 pb) do gene da beta globina do plasmídeo mplSbHS. Determinou-se o nível, de um ARN de controlo (C.YH.2) com o plasmídeo mpl9CYH22 (9,0kb) que transporta a região de codificação do gene (CY.H.2), Carregaram-se em cada faixa 20 pg do ARN total, A amostra em cada faixa é a seguinte: faixa 1: 340g2Cs faixa 2: 340g2B e faixa 3: 340g2P„ β marca o ARN-m da beta-globíria, 0 ARN-m de C.YH.2 está marcado com Cl (forma percursora) e C2 (ARN-m maduro). Os números de lado indicam o comprimento em nucleotidos,

A Figura 6A mostra os resultados da pesquisa de uma auto-radiografia contendo o ARN-m de beta-globina e de C.YH.2 obtida de uma mancha Northern usando um analisador de gel LKB, 0 pico largo em A (340g2B) representa o ARN de beta-globina e os dois picos pequenos de ambos os lados do pico grande representam o ARN-m de ÇY.H2, A Figura 6B mostra os resultados da pesquisa de uma auto-radiografia contendo o ARN-m de beta-globina de Porto Alegre e o ARN-m de ÇY.H2, obtida de uma mancha Northern usando um analisador de gel LKB, 0 pico grande em B (340g2P) representa o ARN-m de beta-globina Porto Alegre e os dois picos pequenos em ambos os lados do pico grande representam o ARN-m de CY.H2A Figura 7 mostra um mapa do mplBBHS,

A Figura 8 mostra um mapa do AAH5,

A Figura 9 mostra um mapa do L.19BAt,

A Figura 10 mostra um mapa de restrição do plasmídeo pUC19-HISAt,

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A Figura

Α Figura -GHBAt.

A Figura

mostra parto da sequência do promotor GAL.1-10, mostra o mapa de restrição do plasmídeo pUC1913 mostra o mapa de restrição do plasmídeo pNML-VGA Figura 14 mostra o mapa d© restrição do plasmídeo YEpWB51/Nat,

A Figura 15 mostra a estratégia para a clonação do termínador ADH.1 no YEpWSl/Nat.

A Figura 16 mostra o mapa de restrição do plasmídeo YEp51T/Nat,

A Figura 17 mostra a construção do YEp51T/G»

A Figura 18 mostra a sequência de ADN do gene da gama-globina.

A Figura 19 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes em GAN-5-8 (iniciador da extremidade 5’), GAM-3H (iniciador da extremidade 3’). Estes iniciadores foram usados para sintetizar o ADN da gama-globina.,

A Figura 20 ostra o mapa de restrição do plasmídeo YEp51T/GA Figura 21 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes no iniciador 5”, 5TG-ApaL e no iniciador 3’, ADHSBS-3⁹ usados para sintetizar o ADN da gama(val)-globina„

A Figura 22 mostra o mapa de restrição do plasmídeo ρΝΝ-5-G-gama_vall.

A Figura 23 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes nos iniciadores 51-A-l e 519-A-3„

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Α Figura presentes nos mostra as sequências e os sítios de restrição, iniciadores G10T-5B e G10T3FSS»

A Figura 25 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes nos iniciadores 5’ e 3⁹, usados para sintetizar as primeiras 36 bases do promotor híbrido da alfa-globina.

A Figura 2.6 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes nos iniciadores 5’ e 3⁹, usados para sintetizar o fragmento 3⁹ do gene da alfa-globína»

A	Figura	27	mostra	o mapa de	restrição	do plasmídeo	pUC19-
GHA..
A GHaGt,	Figura	28	mostra	o mapa de	restrição	do plasmídeo	PUC19-
A	Figura	29	mostra	as sequências e os	sítios de restrição

dos iniciadores usados para sintetizar o fragmento de ADN HaGt»

A Figura 30 mostra o mapa de

A Figura 31 mostra o mapa de

A Figura 32 mostra o mapa de

A Figura 33 mostra o mapa de restrição restrição restrição restrição do pUC19-AHa.Gt» do pPM40» do pNM-R-A-al» do plasmídeo pNM-R-G-al

A Figura 34 mostra a estratégia usada para a clonação da cassette GHaGt no vector de levedura contendo a oassette de expressão GHBAt»

A Figura 35 mostra as sequências e os sítios de restrição presentes nos iniciadores 5’ e 3’ usados para sintetizar a sequência de terminador de ADH1 no plasmídeo pUC19-ADHt»

A Figura 36 mostra a estratégia usada para a clonação de

6666-008-118 ^AH^val^{At ηο} pNM-R-A-al»

A Figura 37 mostra as sequências e os sítios de restrição, presentes nos iniciadores 5* e 3’ usados para sintetizar o fragmento de ADN ADH2-UASA Figura 38 mostra o mapa do plasmídeo pUC19“ADH2-UA$A Figura 39 mostra as sequências e os sítios de restrição presentes nos iniciadores 5’, 5TDH3-3X e o iniciador 3³,, ADH-t-SBA Figura 40 mostra o mapa do plasmídeo pUC1.9-AH3'_va|At„

A Figura 41 mostra as sequências de Mu-145Cy, Mu-66Th e Mu-9Cy»

A Figura 42 mostra o mapa de restrição de YEp51NTl„

A Figura 43 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5’, ΒΝ-5-Sal e do iniciador da extremidade 3\ B-B3-Tal»

A Figura 44 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5', I3-G127-5 e do iniciador da extremidade 3^b, Beta-3-ΗA Figura 45 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5’, A104S-5 e do iniciador da extremidade 3’, Θ10Τ3ΗA Figura 46 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5\ Q-5-9CY e do iniciador da extremidade 3’, ΘΑΜ-3-Η.

A Figura 47 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5’, GAM-5-S e do iniciador da extremidade 3’, G66T-3Ο

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3· ή Figura 48 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5”, G-5-9CY e do iniciador da extremidade S\ G66T-3»

A Figura 49 mostra as sequências e os sítios de restrição do Iniciador da extremidade 5’, Z-5-SAL e do iniciador da extremidade 3\ Z-A95-3»

A Figura 50 mostra as sequências e os sítios de restrição do iniciador da extremidade 5’, Z-B3T-5 e do iniciador da extremidade 3\ Z-3-H»

A Figura 51 mostra as sequências e os sítios de restrição dos iniciadores 5’ e 3’ usados para sintetizar, por PCP, o gene da beta-globina Mississippi„

5. DESCRIÇÃO.....DETALHADA.....DA.....INVENÇÃO.

presente invento refere-se a uma cadeia de globina de mamífero substancialmente pura ou a um seu fragmento de ligação a heme» Num aspecto preferido, a invenção refere-se a uma cadeia de globina humana substancialmente pura ou a um seu fragmento de ligação a heme» A cadeia de globina pode ser uma cadeia de globina do tipo alfa, ou uma sua variante, ou uma cadeia de globina do tipo beta, ou uma sua variante» A cadeia de globina do tipo alfa pode ser seleccionada de entre o grupo incluindo, mas não limitado a, uma cadeia de zeta-globina de embrião e uma cadeia de alfa-globina de adulto» A cadeia de globina do tipo beta pode ser seleccionada de entre o grupo incluindo, mas não limitado a, uma cadeia de epsilon-globína de embrião, uma cadeia de gama-globina fetal, uma cadeia de delta-globina de adulto & uma cadeia de beta-globina de adulto» Podem-se misturar a globina do tipo alfa e a globina do tipo beta com uma fonte de heme, para obter hemoglobina compreendendo a globina do tipo alfa e a globina do tipo beta» A gama-globina pode ser misturada com uma fonte de heme para se obter hemoglobina compreendendo gama-globina» A hemoglobina produzida pelos processos do presente invento pode ser usada em aplicações requerendo transportadores de oxigénio fisiológico, tais como em soluções de substituição de sangue ou em expansores

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de plasma»

A invenção refere-se também a vectores recombiriantes capazes de exprimir uma cadeia de globina ou um seu fragmento de ligação a heme, em levedura» 0 vector recombiriante pode ser capaz de exprimir duas cadeias de globina ou os seus fragmentos de ligação a herne» As cadeias de globina, numa concretização específica, compreendem uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta, ou as suas variantes» A invenção refere-se também a processos para a expressão em levedura de, pelo menos, uma cadeia de globina» As cadeias de alfa-globina e de beta-globina expressas, ou as suas variantes, podem ser combinadas com uma fonte de heme para produzir hemoglobina ou uma sua variante» A invenção refere-se, também, a processos para a expressão de hemoglobina em levedura nos quais o heme, que é produzido pela levedura ou que é obtido a partir de uma fonte exógena, estã ligado â globina para formar hemoglobinas funcionais in.....vivo»

5»1» ISOLA.MENTO....E....CEONAQAO.....DA...SLOBINA

Nas Figuras 1A-F ilustram-se, respectivamente, a sequência de nucleótidos dos genes codificando as cadeias de zeta-globina de embrião humano, de epsilon-globina de embrião humano, de gama-globina de feto humano, de delta-glofoina de adulto humano, de alfa-globina de adulto humano e de beta-globina de adulto humano, e as suas sequências de aminoácidos derivadas» Estas incluem, mas não estão limitadas a, sequências de nucleótidos compreendendo toda ou porções da sequência de nucleótidos, ilustrada nas Figuras 1A-F, que são alteradas pela substituição de diferentes codões, que codificam o mesmo resíduo aminoácido ou um resíduo aminoãcido funcionalmente equivalente, produzindo assim uma modificação muda, bem como sequências de aminoácidos compreendendo toda ou porções das sequências de aminoácidos ilustradas nas Figuras IA, 18, IC, 10, IE ou 1F que são alteradas pela substituição de resíduos aminoácidos, funcionalmente equivalentes na sequência, produzindo assim uma modificação muda, e seus derivados que são modificados ou processados»

Os genes codificando as cadeias de globina do tipo alfa e de

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gl.obi.na do tipo beta podem ser isolados a partir de células contendo hemoglobina usando procedimentos conhecidos na arte» 0 ADN codificando globina do tipo alfa e/ou globina do tipo beta pode ser obtido por procedimentos convencionais conhecidos na arte, a partir de ADN clonado (p,e« uma biblioteca de ADN), por síntese química, por clonação de ADN-c ou por clonação de ADN genómico, ou dos seus fragmentos, purificado, por exemplo, a partir de re~ ticulõcitos humanos (ver, por exemplo, Maniatis et al», 1989, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Vork)» 0 ADN codificando globina do tipo alfa ou do tipo beta pode ser também obtido usando a tecnologia de reacção em cadeia com polimerase (PCR) (ver, por exemplo, MULLIS et al», Patente dos E„U»A» nQ» 4 800 159, 1989)» Os clones derivados do ADN genómico podem conter regiões reguladoras e regiões de ADN de intrao, para além das regiões de codificação; os clones derivados de AON-c conterão apenas sequências de exão» Seja qual for a fonte, o gene de globina deverá ser clonado molecu la rmen te num vector adequado para a propagação do gene»

Na cloriação molecular do gene a partir de ADN genómico, geram-se fragmentos de ADN, alguns dos quais codificarão o gene de globina desejado» 0 ADN pode ser clivado em sítios específicos usando várias enzimas de restrição» Alternativamente, pode-se usar ADN-ase na presença de manganês, para fragmentar o ADN, ou o ADN pode ser fisicamente quebrado, por exemplo, por sonícação» Os fragmentos de ADN lineares podem depois ser separados de acordo com o tamanho, por técnicas convencionais, que incluem, mas que não estão limitadas a, electroforese em agarose e gel de poliaorilamida e cromatografia em coluna»

Após se terem gerado os fragmentos de ADN, a identificação do fragmento de ADN específico contendo a globina, pode ser realizada de um certo número de formas. Por exemplo, se está disponível e se se puder purificar e marcar uma quantidade de um gene de globina ou o seu ARN específico, ou um seu fragmento, os fragmentos de ADN gerados podem ser pesquisados por hibridação de ácido nucleico com a sonda marcada (Bentori e Davis, 1977, Science 196:180 e Grunstein e Hogness, 1975, Proc» Natl. Acad» Sei» φ

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U»3„A» 72:3961)» Os fragmentos de AON com homología substancial com a sonda, hibridar-se-ão» Se não está disponível uma sonda, específica de globina, purificada, podem-se usar como sonda fracções de ãcido nucleico enriquecidas em sequências de globina, como procedimento de selecção inicial» É também possível identificar o fragmento apropriado por digestão com enzimas de restrição e comparação dos tamanhos dos fragmentos com os tamanhos esperados de acordo com o mapa de restrição conhecido, se este estiver disponível» Após a selecção inicial pode-se proceder a uma selecção adicional com base nas propriedades do gerie ou com base nas propriedades físicas ou químicas do seu produto de expressão, como se descreve infra.» gene da globina pode ser também identificado por selecção de ARN-m por hibridação de ãcido nucleico, seguida de uma tradução in.......vit.ro.» Neste procedimento usam-se os fragmentos para isolar os ARN-m complementares, por hibridação» Os produtos de tradução in.....vitro dos ARN-m isolados identificam o ARN-m e, deste modo, os fragmentos de ADN complementares que contêm as sequências de globina»

Alternativas ao isolamento do ADN genómíco da globina incluem, mas não estão limitadas a, síntese química da própria sequência do gene a partir da sequência conhecida ou preparação de AON-c do ARN-m que codifica o gene da globina» gene ou o ADN-c identificados ou isolados podem ser depois inseridos num vector de cloriação apropriado» Podem-se usar um grande numero de sistemas vector—hospedeiro conhecidos na arte» Vectores possíveis incluem, mas não estão limitados a cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vector tem de ser compatível com a célula do hospedeiro usado» Estes vectores incluem, mas não estão limitados a bacteríófagos, tais como derivados lambda, ou plasmídeos, tais como pBR322, pUC ou pGEMl ® ou derivados de plasmídeo Bluescript ® » As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células de hospedeiro via. transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc»»

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27Numa concretização alternativa, o gene pode ser identificado e isolado após inserção num vector de cloriação adequado, de um mo do do tipo shot gun» 0 enriquecimento no gene de globina, por exemplo, por fraecioriamento ou sub-f raccioriamento de tamanhos do ADN-c, pode ser realizado antes da inserção no vector de clonaçâo

gene de globina é inserido num vector de clonaçâo que pode ser usado para transformar ou infectar as células do hospedeiro apropriado de modo que se geram muitas cópias das sequências do gene» Isto pode ser realizado ligando o fragmento de ADN num vector de clonaçâo que possuí terminais coesos complementares» Contudo, se os sítios de restrição complementares usados para fragmentar o ADN, não estão presentes no vector de clonaçâo, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente» Alternativamente, pode-se produzir qualquer sítio desejado, ligando sequências de nucleótídos (ligadores) nas extremidades do ADN; estes ligadores ligados podem compreender oligonucleótidos, sintetizados quimicamente, específicos, codificando sequências de reconhecimento de eridonuclease de restrição» Num processo alternativo, o vector clivado e o gene de globina podem ser modificados por propagação homopolímérica»

Em concretizações específicas, a transformação das células de hospedeiro com moléculas de ADN recombinante, que incorporam um gene de globina isolado, ADN-c ou uma sequência de ADN sintetizado, permite a geração de múltiplas cópias do gene» Assim, pode-se obter o gene em grandes quantidades, por cultura de transformantes, isolamento das moléculas de ADN recombinante dos transformantes e, quando necessário, recuperação do gene inserido a partir do ADN recombinante isolado»

Depois do clone contendo globina ter sido identificado, cultivado e colhido, a sua inserção de AON pode ser caracterizada usando procedimentos conhecidos na arte» 0 ADN cionado ou o ADN-c correspondente ao gene de globina podem ser analisados por métodos que incluem mas rião estão limitados a, hibridaçáo Southern (Southern, 1975,, J» Mol» Biol» 98:503-517), estabelecimento de mapas de endonucleases de restrição (Maniatis et al», 1989, Mole-

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cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spririg Harbor Laboratory, Cold Spríng Harbor, New York), e análise da sequência de ADN. A análise da sequência de ADN pode ser realizada por qualquer das técnicas conhecidas na arte, que incluem, mas nao estão limitadas a, métodos químicos (Maxam e fâilbert, 1980, Meth. Enzymol.. 65:499-560), métodos enzimáticos (ver, p.e. Innes, 1988,

Proc. Natl. Acad, Proc, Natl, Acad, P roc - Nat 1., Acad „ de ADN automático

Sei, U.S.A. 85:9436, Tabor e Richardsori, 1987, Sei, U.S.A. 84:4767; e Sariger et al., 1977,

Sei, U..S„A. 74:5463), ou usando um sequenciador (ver, por exemplo Martin et al., 1985, Biotechnology 3:911-915),

5.2. VARIANTES.....0A....GLOBINA

A produção e o uso de variantes de globina estão também previstas e incluídas no âmbito do presente invento. 0 termo variante de globína, tal como é aqui definido, refere-se a uma globina cuja sequência de nucleótidos foi alterada, resultando deste modo numa alteração da estrutura ou da função da globína, mas de modo a que a globina permaneça ainda funcionalmente activa tal como é definido pela capacidade de ligar o oxigénio de um modo reversível» A variante pode ser de ocorrência natural, ou de ocorrência não natural» A invenção refere-se às categorias de variantes de hemoglobina seguintes: variantes que autopolímerizam; variantes nas quais o tetramero nao se dissocia sob condições fisiológicas in.........vivo: variantes com uma afinidade por oxigénio intrínseca diminuída i.e» uma afinidade por oxigénio possuindo uma P50 de, pelo menos, cerca de 10 mm Hg sob condições fisiológicas; e variantes que são estáveis em meio alcalino» Numa concretização específica podem resultar poli-globína do tipo alfa ou poli-globina do tipo beta.

Tal como se discutiu na secção 2,1,3» supra, as variantes de globina que autopolímerizam incluem, mas não estão limitados a, beta-globina Porto Alegre ou Hb Porto Alegre (a serina beta-9 estão substituída por cisteína), Hb Míssissippí (a serina beta-44 está substituída por cisteína), ou Hb Ta-Li (a glicina beta-83 está substituída por cisteína).

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-29Tal como também se descreve na secção 2.1.3, supra, um exemplo de variante na qual o tetramero não se dissocia inclui, mas não está limitado a, Hb Rainier (a tirosina beta-145 está substituída por cisteína) e a HbF_va| (a glicina gama-1 esta substituída por valina).

As variantes de hemoglobina estáveis em meio alcalino são aquelas em que o dímero não se dissocia em monõmeros, em meio alcalino. 0 exemplo é a Motown/Hacettepe (a glutamina beta~1.27 está substituída por ãcido glutâmico). Outro exemplo é uma variante na qual a serina substitui a cisteína alfa-104 (Perutz, 1974, Nature 247:371).

Exemplos de variantes com uma afinidade por oxigénio diminuída incluem, mas não estão limitados a, HbA Chíco (a lisina beta-66 está substituída por treonina); HbF Chíco (a lisina gama-66 está substituída por treonina); HbA Titusvílle (o asparpato alfa-94 está substituído por asparagina); a HB Portlarid Titusvílle (o aspartato zeta-94 está substituído por asparagina) HbF Beth Israel (a asparagina gama-102 está substituída por serina); e a HbF Kansas (a asparagina gama-102 está substituída por treonina).

Numa concretização específica, a variante de globina é substancialmente homóloga com uma cadeia de beta-globina de adulto e a variante compreende uma cisteína na posição beta-9. Numa concretização muito específica, a variante de globina é substancialmente homóloga com a beta-globina Porto Alegre e a variante compreende uma cisteína na posição beta-9. 0 termo substancialmente homóloga, tal como é aqui utilizado, refere-se à capacidade de uma sequência de ADN codificando uma primeira cadeia de globina em se hibridar com uma sequência de ADN codificando uma segunda cadeia de globina sob condições rigorosas, por exemplo, a cerca de O,1X SSC a uma temperatura de cerca de 65^eC. Por exemplo, se uma variante de globina é substancialmente homóloga com uma cadeia de beta-globina de adulto, a sequência de ADN, codificando a variante de globina, é capaz de se hibridar com uma sequência de ADN, codificando a cadeia de beta-globina de adulto, sob condições rigorosas.

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6666-008-118 —30

As variantes de globína podem ser produzidas por vários processos conhecidos na arte. As manipulações gue resultam na sua produção podem ocorrer quer ao nível do gene quer ao nivel da proteína. A globína pode ser alterada a nível do gene, por mutagénese específica de sítios, usando procedimentos conhecidos na arte. Uma abordagem que pode ser usada envolve o uso de olígonucleótidos sintéticos, para construir globinas variantes com substituições de bases. Numa concretização, sintetiza-se um olígonucleõtido curto, contendo a mutação, e “tempera-se (anneal) com a forma de cadeia simples do gene de globiria do tipo selvagem (Zoller e Smith, .1.984, DNA 3:479-488). 0 heteroduplex curto, re-

sultante, pode servir como iniciador para a sintese da segunda cadeia, por ADN polímeras®. Na extremidade 5’ forma-se um pequeno fragmento de cadeia simples que é fechado com ADN-ligase. Noutra

concretização, sintetizam-se dois oligonucleótidos complementares contendo, cada um, a sequência mutante. 0 duplex, que se forma apõs a têmpera destes oligonucleótidos complementares, pode ser unido a uma molécula de ADN maior, usando ADN-ligase, desde que as extremidades de ambas as moléculas possuam extremidades de cadeia simples complementares pegajosas. Outra abordagem, que pode ser adoptada, envolve a introdução de um pequeno intervalo de cadeia simples na molécula de ADN, seguida da sintese de ADN mal reparada, i.e. incorporação mal efectuada. de utri nucleótido não complementar no intervalo (Botstein e Shortle, 1985, Science 229:1193). A incorporação de um nucleótido de tiol no intervalo pode minimizar a excísão do nucleótido não complementar. Alternativamente, pode-se preparar uma variante de globiria por sintese química do ADN, codificando a variante de giobina, usando procedimentos conhecidos na arte (ver, por exemplo, Froehler, 1986, Nucl, Acids Res. 14:5399-5407 e Caruthers et al., 1982, fâenetic Engineering, J.K. Setlow e A. Hollaerider eds., Plenum Press, New York, vol. 4, pp. 1-17). Numa concretização preferida, sintetizam-se, quimicamente, os fragmentos da giobina variante e ligam-se, subsequentemente, estes fragmentos. As cadeias de globína variante, resultantes, podem ser amplificadas, usando procedimentos conhecidos na arte, p.e., tecnologia PCR, e subsequentemente inseridas num vector de clonação como se descreve na secção 5.1., supra, Numa concretização específica φ

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Λ» .,Α·„

-31“ podem criar-se mutantes específicos de sítios, por introdução de erros nos oligonucleótidos usados para iniciar a amplificação por PCR (Jones e Howard, 1990, Biotechniques 8:178-180)»

As manipulações da sequência de globina podem ser realizadas ao nível da proteína» Podem-se realizar quaisquer modificações químicas por técnicas conhecidas, que incluem, mas não estão limitadas a, clivagem química específica por brometo de cianogénio, tripsina, quimotrípsina, papaína, protease V8, NaBH^? acetilaçâo, formílação, oxidação, redução? etc»„ Alternativamente, a proteína de globina variante pode ser sintetizada quimicamente, usando procedimentos conhecidos na arte, tais como sintetizadores de péptido, comercialmerite disponíveis, e similares» Estas técnicas convencionais de síntese de polipéptidos estão descritas em publicações tais como Merrifield, 1963, 3» Chem» Soc» 85:2149-2154 e Hunkapillar et al», 1984, Nature (London) 310:105-111)»

5»3» EXPRESSÃO.....D A.. HEMGfâLGB IN A

A sequência de nucleótidos codificando uma cadeia de globina é inserida num vector de expressão apropriado, i»e», um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência inserida, codificando a proteína» Pode-se utilizar uma variedade de sistemas de hospedeiro-vector, para exprimir a sequencia de AON codificando a cadeia de globina» Estes incluem, mas não estão limitados a, sistemas de células de mamífero infectadas com vírus (p„e» vírus da vacina, adenovirus, etc»)? sistemas de células de insecto infectadas com virus (p»e„, baculovirus)? levedura contendo vectores de levedura e bactérias transformadas com AON de plasmídeo, ADN de cosmídeo ou ADN de bacteriófago» Num aspecto preferido, a célula de hospedeiro é uma célula de levedura»

5»3»1» EXPRESSÃO.....DA ...HEMOfâLOBINA EN.....LEVEDURA

Quando se exprimem cadeias de globina em levedura, têm porém de ser tidas em conta considerações especiais» São necessários sinais de regulação da expressão de sequências codificando cadeias de globina, em levedura, diferentes dos que se usam quando se exprimem estas sequências em sistemas procarióticos ou em sis72 499

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32temas de mamífero» Por exemplo, é necessária uma origem de replicação de levedura, num vector de AON recombinante, capaz de exprimir uma sequência de globina de modo a verificai—se a replicação deste vector e, assim, uma expressão significativa» A sequência de nucleótidos codificando a cadeia do tipo alfa e/ou do tipo beta de globina, é inserida num vector que pode ser expresso em levedura» Numa concretização, uma sequência de AON codificando uma cadeia de globina, ou uma sua variante, é Inserida no vector de ADN recombinante» Noutra concretização, uma sequência de ADN codificando duas cadeias de globina, ou as suas variantes, pode ser inserida no vector de ADN recombinante» Ainda numa outra concretização, as duas sequências de ADN, codificando, cada uma, uma cadeia de globina, ou uma sua variante, são inseridas no vector de ADN recombinante» Numa concretização específica, uma sequência de ADN codifica uma cadeia de globina do tipo alfa, ou uma sua variante, e a segunda sequência de ADN codifica uma cadeia de globina do tipo beta, ou uma sua variante»

Numa concretização adicional, a célula de levedura é um membro da espécie Saççharomy^ Este vector compreende, para além da sequência de ADN codificando a globina: (a) um promotor transcricional de levedura que promove a transcrição da sequência de ADN codificando a cadeia de globina; (b) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura, ou uma sua porção funcionalmente activa; e (c) uma origem de replicação de levedura» primeiro componente do vector, um promotor transcricional de levedura, compreende dois componentes: (a) uma região reguladora transcricional. que contém uma região distai do gene estrutural, ou sequência activadora, que proporciona a transcrição regulada (Indutível) ou constitutiva; e (b) a região de iniciação transcricional, que inclui o sitio de iniciação da transcrição, a sequência TATA, a sequência de invólucro, conforme apropriado, e uma sequência de ligação a ARN-polímerase, que incluí nucleótidos a montante do sítio de iniciação, para dirigir o início da síntese do ARN mensageiro» Numa concretização preferida, a sequência activadora é uma sequência activadora a montante, A

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6666—008—118 ί** região reguladora transcrícíonal terá, preferivelmente, pelo menos, 100 pares de bases (pb) e não excederá 3000 pares de bases A região reguladora pode começar a uma distância de, pelo menos, cerca de 200 pb do codão de iniciação, usualmerite, a uma distância de, pelo menos, cerca de 300 pb e pode iniciar-se a 400 pb, ou mais, a montante do codão de iniciação- A região de iniciação transcriciorial conterá, pelo menos, cerca de 150 pb, mais usualmente, pelo menos cerca de 200 pb, usualmente, não mais do que cerca de 600 pb, e, preferivelmente, cerca de 400 pb- A sequência pode estender-se na direcção a jusante da transcrição, com cerca de -10 pb a cerca de -25 pb (em relação â iniciação da transcrição a -t-1) -

Numa concretização, o promotor trariscricional de levedura é um promotor indutível- Os promotores indutíveis podem ser unidireccionais ou bidireccionaís- Numa concretização preferida, os promotores indutíveis unidireccionais estão localizados a montante da sequência de ADN codificando a cadeia de globina- Os promotores indutíveis unidireccionais podem incluir, mas não estão limitados a, promotores que são regulados pela galactose (p.e-, UDP-galactose-epimerase (GALIO), galactoquinase (QALl)), glucose (p.e., álcool desidrogeriase II (A.DH.2)), e fosfato (p.e. ãcido fosfatase (PH05))- Noutra concretização, o promotor indutível pode ser um promotor bidireccional. LJm promotor bidireccional pode estar localizado a montante (5’ do codão de inicio ATS) da sequência de ADN codificando uma cadeia de globina, na cadeia mais, numa das suas extremidades, e a montante da sequência de ADN codificando uma cadeia de globina, na cadeia menos, na sua outra extremidade; e deste modo controla a transcrição de ambas. Numa concretização específica, este promotor bidireccional é o GAL.1-100 promotor pode também ser um promotor constitutivo- Numa concretização especifica, o promotor constitutivo é um promotor da transcrição de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase III (T.DH.3) e é aqui depois designado por promotor TDH5- Outros promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase II (TDH2), gliceraldeído-3-fosfato•sf / φ

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6666-008-1,18 <34

-desidrogenase I (TDH1), ãloool-desidrogenase I (ADH1) „ fosfoglicerato-quinase (RSK), piruvato-quinase (RYK), enolase (ENO.) e triose-fosfato-isomerase (TRI.) . Estas sequências promotoras conterão, pelo menos, cerca de 200 pb e não excederão cerca de 5 000 pares de bases.

Numa outra concretização, o promotor pode ser um promotor híbrido, no qual a sequência contendo a região reguladora transoricional é obtida de uma fonte, e a sequência contendo a região de iniciação da transcrição é obtida de uma segunda fonte. Numa concretização, a sequência contendo a região reguladora transcricional é uma sequência activante, a montante de um promotor indutível de levedura. 0 promotor indutível pode ser um promotor unidireocional ou um promotor bidireccional. A sequência contendo a região de iniciação transoricional pode ser obtida a partir da região de iniciação transoricional de um promotor constitutivo. Numa concretização específica, o promotor híbrido compreende uma região reguladora transoricional que é a sequência de activação a montante do promotor 6ALIO e uma região de iniciação de transcrição que contém a região de iniciação de transcrição do promotor T0H3. Noutra concretização especifica, o promotor híbrido pode regular a expressão de duas sequências de ADN separadas, em orientações opostas, se o promotor híbrido compreender uma sequência activante, a montante, com sítios de iniciação da transcrição localizados em ambos os lados, formando deste modo um promotor bidireccional. Numa concretização muito específica, uma sequência activante a montante, OAL-IO pode estar flanqueada em ambos os lados pela região de iniciação do promotor TDH3. 0 ADN codificando uma cadeia de globina estã localizado a jusante de cada sequência TDH3. Noutra concretização, a UAS de ADH2 pode ser usada em vez da UAS de GAL1-10. Airida noutras concretizações, a região de iniciação transoricional do promotor TDH.3 pode ser substituída por TDH.1, TD.H2, RQK, ENO, TRI, CYC.1, ou RYK.

Outro componente do vector de ADN recombinante é uma sequência codificando um marcador seleccionável de levedura. Numa concretização, o vector de ADN recombinante pode conter mais do que uma destas sequências. 0 marcador seleccionável de levedura

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' ób' ... ......

proporciona a pressão selectiva para a sobrevivência das células de levedura que exprimem o marcador. Num aspecto preferido, o marcador seleccionável complementa um defeito genético na estirpe hospedeira- Por exemplo, pode-se usar o URA,3 como marcador seleccionável numa estirpe de levedura que é deficiente no produto do gene URA3,. Estas sequências podem incluir, mas não estão limitadas a gene LEU2, gene URAS, gene H1S.3, gene LY§2, gene Hl 84, gene ADE.8, gene CUP1, e gene TR£1. Outro exemplo, de uma tal sequência, incluí o gene Ieu2d que é um gene LEU2 deficiente em promotor. Numa concretização preferida, o gene leu2d é inserido num vector de ADN recombinante de cópias múltiplas. Uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gene L.EU.2 ou leu.2d pode ser cultivada em meio isento de leucina; uma célula transformada por um vector compreendendo o gene URA3 pode ser cultivada em meio isento de uracilo; uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gene LYS3, pode ser cultivado em meio isento de lisina; uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gene H.IS.3 pode ser cultivada em meio isento de histidinas uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gene ADE8 pode ser cultivada em meio isento de adenina; uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gerie HI84 pode ser cultivada em meio isento de histidinas uma célula de levedura transformada por urn vector compreendendo o gerie ÇUP.1 pode ser cultivada em meio, contendo níveis de cobre inibidores da estirpe hospedeira sem o plasmídeo; e uma célula de levedura transformada por um vector compreendendo o gene T.RP.X pode ser cultivada em meio isento tríptofano- 0 vector de ADN recombinante pode também compreender uma sequência de AON codificando uma porção funcionalmente activa de um marcador seleccionável de levedura- 0 termo· porção funcionalmente activa, tal como é aqui definido, é uma porção da sequência que codifica uma porção do marcador, que proporciona uma quantidade eficaz de pressão selectiva para a sobrevivência de células de levedura, que exprimem a porção do marcador0 vector recombinante compreende, também, uma origem de replicação de levedura, ou uma porção funcionalmente activa da ✓ ' ,'·

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6666-008-118 ί'' · :Ζ .....

origem de replicação que efectua a replicação do vector., Pode ser usada qualquer origem de replicação útil em levedura, que propoi— cione a replicação e a manutenção eficientes (ver, por exemplo, Kingsman e Kingsman, Patente dos E.U.A. nS. 4 615 974, publicada em 7 de Outubro de 1986). Exemplos destas origens de replicação incluem, mas não estão limitados a um sistema de replicação de plasmídeo 2μ, ou uma sua porção funcionalmente activa, e sequências de replicação autónomas (ARS). Exemplos de APS incluem, mas não estão limitados a ARS1 ou ARS3. As origens de replicação podem ser de número de cópia elevado ou baixo, dependendo do efeito da construção na viabilidade do hospedeiro. 0 vector pode compreender ainda sequências centroméricas (CEN), que podem proporcionar estabilidade meiótica e mitótica. Exemplos de sequências CEN incluem, mas não estão limitadas a CEN3, CEN4 e CEN11.

vector de expressão pode compreender ainda, mas nem sempre requer, uma sequência de terminação da transcrição. Uma sequência de terminação da transcrição pode incluir os sinais de transcrição necessários para terminação e poliadenilação e pode ser obtida a partir de qualquer sequência de levedura. Numa concretização específica, a sequência de terminação da transcrição é a sequência de terminação da álcool-desidrogenase I (ADH1). Outras sequências de terminação, adequadas para uso na invenção, incluem, mas não estão limitadas a sequências de terminação do iso-1-citocromo c (CYC1), da UDP-glucose-4-epimerase (fâAL.10), da fosfoglicerato-quinase (PGK), ácido-fosfatase (PH0.5), da enolase (ENQ) e da triose-f osf ato-isomerase (I.P..I.). A sequência de terminação da transcrição tem, pelo menos, cerca de 100 pb e não deverá exceder cerca de 1 500 pb. Numa concretização preferida, a sequência de terminação da transcrição tem entre cerca de 150 pb e cerca de 1 200 pb.

Os vectores de expressão do presente invento podem ser construídos usando procedimentos de ADN recombinante, conhecidos na arte., Estes procedimentos estão descritos em detalhe na Secção 5„1„, supra. Na Secção 7 descrevem-se exemplos específicos de vectores de expressão em levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando a beta-globina de adulto, sob o con-

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37· trolo do promotor híbrido contendo o promotor GAL.1-10 o o promotor TDH3- Na Secção 6 descreve-se um exemplo específico de um vector de expressão em levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando a cadeia de beta-globina Porto Alegre, sob o controlo do promotor indutível GÁLIO» Nas Secções 10 e 11 des-

creve-se um exemplo específico de um vector de expressão em levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando a cadeia de alfa-globina de adulto sob o controlo de um promotor híbrido» Na Secção 8 desoreve-se o exemplo específico de um vector de expressão em levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando a cadeia de gama-globina sob o controlo do promotor indutível GAL10» Na Secção 9 descreve-se o exemplo especifico de um vector de levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando uma variante da cadeia de gama-globina. Na Secção 16 descrevem-se exemplos específicos de outras variantes de globina» Nas Secções 13 e 15 descrevem-se exemplos específicos de um vector de expressão em levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta» Na Secção 14, descreve-se um exemplo específico de um vector de expressão de levedura e a sua construção, compreendendo sequências codificando a cadeia de zeta-globina sob o controlo de um promotor híbrido» Nas Secções 12, 17, 18 e 19, descrevem-se exemplos específicos da expressão de hemoglobina por co-expressão de plasmídeos compreendendo sequências codificando globina do tipo alfa e do tipo beta»

Os vectores de expressão do presente invento podem ser propagados em levedura, usando procedimentos conhecidos na arte» Os vectores de expressão podem ser propagados em levedura que pode ser, ou não, capaz de produzir heme» A levedura pode ser transformada com um ou mais vectores de expressão, usando procedimentos conhecidos na arte (p„e», o método do esferoplasto, (Hinnen et al», 1978, Proc» Natl» Acad» Sei» U»S»A» 75:1929-1933) ou o método do acetato de lítio (Ito et al», 1983, J» Bact» 153:163-168))» Os transformantes podem ser seleccionados pela presença da função do gene marcador (seleccíonãvel) no transf ormari te» Por exemplo, uma célula de levedura leu2 transformada com um vector

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6666-008-118 — -¾.

-38- . .

de expressão compreendendo um gene marcador LEU2, é seleccionada em virtude da sua capacidade em ser cultivada em meios isentos de leucina. As células de levedura transformadas podem ser cultivadas em meios compreendendo uma fonte de azoto e uma fonte de carbono, bem como as vitaminas, os minerais e os elementos vestigiários, essenciais (Hinnen et al», 1978, Proc» Natl» Acad»

Sei» U.S.A. 75:1929-1933), Se o vector compreende um promotor indutível os meios deverão conter também o indutor»

Se o vector de expressão compreende sequências de ADN codificando uma cadeia de globina do tipo alfa e uma cadeia de globina do tipo beta, ou uma cadeia de globina do tipo beta (p.e», cadeia de gama-globiria), pode-se exprimir hemoglobina na célula de levedura transformada com o vector» Numa concretização, o heme é produzido pela levedura e ligado à globina para formar hemoglobinas funcionais ín......vivo» Noutra concretização, as células de levedura podem ser deficientes em componentes requeridos para a produção de heme, por exemplo, o ácido 5-aminolevulinico. A hemoglobina pode ainda ser expressa numa tal célula se se adicionar o componente requerido» produto de proteína do gene de globina expresso, pode ser isolado e purificado usando métodos convencionais que incluem, mas não estão limitados a cromatografia (p.e», cromatografia em coluna de permuta iónica, de afinidade e de exclusão de tamanhos), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica convencional para a purificação de proteínas» Se se exprime uma cadeia de globina, a cadeia de globina expressa pode ser combinada com outra cadeia de globina e com uma fonte de heme para formar hemoglobina» Se se exprime hemoglobina na célula de levedura não são necessários passos adicionais»

Podem-se analisar o gene expresso e o seu produto, a nível genómico ou ao nível da proteína, usando procedimentos conhecidos na arte» Por exemplo, a expressão do gene de hemoglobina pode ser analisada por hibridação Southern ou Northern» A proteína de hemoglobina expressa pode, por exemplo, ser analisada por procedimentos de mancha Western, conhecidos na arte, e que também aqui d

Z

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-.....’W^;

39’ se descrevem na Secção 6.6. infra.

5.4 - U.80.S....PARA.....A.S....HEMO.GLOBI.N AS.....RECOMB IMANTES.....EXPRESS AS

Usando os processos do presente invento pode-se obter hemoglobina em grande quantidade e com uma pureza elevada. Exemplos de hemoglobinas que podem ser obtidas incluem, mas nâo se limitam a HbA (alfa2beta2), HbA2 (alfa2delta₂), HbE (alfa2gama₂), HbBarts (gama₄), HbH (beta^) e Hb Portland I (zeta₂qama2), Hb Portland II (zeta₂beta₂), Hb Portland III (zeta₂delta₂) , Hb Gower I (zeta2©psilon2), e Hb Gower II (alfagepsilor^). A hemoglobina estará isenta de material celular e de outros coritaminarites. Estas hemoglobinas e, especialmente, variantes de hemoglobina que autopolimerizam, variantes que evitam a dissociação do tetramero, variantes com uma afinidade por oxigénio intrínseca diminuída, variantes que sao estáveis em meio alcalino, variantes que são estáveis em ãcido, variantes que não se auto-oxidam e/ou variantes que não se ligam a haptoglobiria pelo uso dos genes de alfa e/ou beta globina variantes, descritos na Secção 5.2., supra, sâo valiosos para uso em substitutos do sangue.

Noutra concretização, a globina do tipo alfa e/ou do tipo beta, pode ser modificada quimicamente usando procedimentos conhecidos na arte, para aumentar a estabilidade do tetramero e/ou diminuir a afinidade por oxigénio (ver Secção 2.1.2., supra, onde se descrevem exemplos destes procedimentos)» Pode-se modificar uma globina do tipo alfa ou do tipo beta, do tipo selvagem ou variante. Estas hemoglobinas modificadas quimicamente podem, também, ser usadas em substitutos de sangue.

As composições de hemoglobina, para além de serem usadas em substitutos de sangue, podem ser usadas num expansor de plasma sanguíneo, numa composição farmacêutica com um transportador aceitável e com outros expansores de plasma, ou em qualquer aplicação onde seja necessário um transportador de oxigénio fisiológico. Os transportadores farmacêuticos podem ser tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank ou Ririger, solução salina fisiológica, uma mistura consistindo em solução salina e glucose, e solução heparinizada de citrato de

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sódio-ácido cítrico-dextrose» A hemoglobina produzida pelos processos do presente invento pode ser misturada com substitutos de plasma do tipo coloidal e com expansores de plasma tais como polissacáridos lineares (p»e„, dextrano), hidroxietil-amido, gelatina fluida equilibrada e outras proteínas de plasma» Adicionalmente , a hemoglobina pode ser misturada com substitutos de plasma poliméricos, solúveis em ãgua, fisiologicamente aceitáveis, exemplos dos quais incluem poli(ãlcool vinílico), polifóxido de etileno), polivinilpirrolidona, e condensados de óx ido de etil en o-po 1 i p rop i 1 en og 1 i co 1» Em Rem i n.gton..’. s.....P.harmaceu t i cal.........Sciences, Meade Publishing Col», Easton, PA, última edição, podem-se encontrar técnicas e formulações para administração das composições compreendendo a hemoglobina»

Os exemplos seguintes são apresentados a título ilustrativo e não limitativo»

6.0» EXEMPLO.....1:......E.XP.R.ESSAO....DA.....BE.TA-.fâLOBl.NA....PORTO....ALEO.RE.....NUM.....VECTOR.

DE....EXPRESSÃP....DE.....LEVEDURA ...CONTENDO.....0.....PR0M0T0R.....CAL10

Como aqui se descreveu detalhadamerite, modificou-se a beta-globina natural, para obter um gene da beta-globina Porto Alegre, por substituição de um fragmento A.ççI.-Nço.I de 104 pb do gene da beta-globina natural, por um oligonucleótido sintético, contendo uma cisteína como aminoáoido 9 (em vez de uma serina)» Subsequentemerite, cloriou-se o gene da beta-globina Porto Alegre no vector de expressão de levedura YEpSl para obter o plasmídeo YEpWBSl/ /PORT» Usou-se o YEpWB51/P0RT para transformar a estirpe de levedura Sc340, uma estirpe heml» A quantificação do ARN por análise da auto-radiografia mostrou que o ARN-m para a beta-globina Porto Alegre era cerca de 6,0% do ARN total de levedura» A análise por mancha Western indicou que a beta-globina Porto Alegre foi expressa»

6.1» MATERIAIS.

As enzimas de restrição, a enzima Kleriow e a ADN-ligase T4, foram obtidas em New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Marmheím (BM)» Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores- 0 ,,^Τ^Ε-Βι:

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ADN de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de um litro das células de E» coli transformadas e purificado por centrifugação num gradiente de CsCl.

6.2» CLONA.ÇA.0...........DO......GENE......DA......BETA......GLOB1NA......PORTO......ALEGRE......NO......VECTOR......DE

EXPRESSÃO.....DE... LEVEDURA.....Y.Ep.5.1

Na Figura 3A mostra-se o procedimento geral usado para clonar o gene da beta-globina Porto Alegre no vector de expressão de levedura YEpSl» Dígeriu-se o plasmídeo pSPBC (ver Figura 2 onde se mostra o mapa de restrição parcial do pSPfiC) com A.ç.ç.1 e Hindlll» A digestão com esta combinação de enzimas gerou dois fragmentos; um ADN de 500 pares de bases (pb) contendo o gene da beta-globina e um fragmento de 2 800 pb do plasmídeo» 0 fragmento de 500 pb foi isolado num gel de agarose a 0,6%» Depois, a barida foi excisada do gel, electro-eluiu-se o ADN e precipitou-se com etanol, 0 ADN precipitado foi centrifugado numa Centrífuga Eppendorf, removeu-se o sobrenadante e secou-se o sedimento de ADN sob vácuo» fragmento de ADN de 500 pb, contendo o fragmento do gene da beta-globina natural, isolado a partir de pSPfôC era compatível com A.ç.ç.1 na extremidade 5’, enquanto que a extremidade 3’ era compatível com Hindlll, Para modificar a extremidade 5’ do fragmento isolado usou-se um oligonucleõtido sintético. Este oligonucleõtido de cadeia dupla (104 pb) continha um codâo para a cisteína como aminoácido 9, em vez de um codão para a serina, e possuía uma extremidade compatível com Açcl, na sua extremidade 3’, e uma extremidade compatível com S.al.1 na sua extremidade 5’ (ver Figura 3A). A extremidade 3” do fragmento isolado não recebeu qualquer adaptador, uma vez que o sítio Hindlll era compatível com o sitio Hindlll introduzido no YEp51»

Clivou-se o plasmídeo receptor YEpSl, com as enzimas de restrição S.a.1.1 e Hindlll» Para inserir o fragmento isolado contendo o gene da beta-globiria, preparou-se uma ligação de 3 vias (ver Figura 3A), A reacção de ligação foi realizada usando procedimentos de ligação convencionais (Maníatís et al», 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,

Φ

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Cold Spring Harbor, New York)» Usou-se a mistura de ligação para transformar as células E» coli HB101, usando o procedimento de transformação convencional» Espalharam-se as células sobre placas, contendo meio LB com 100 mg/I de ampicilina» Incubaram-se as placas de um dia para o outro a 37°C» Recolheram-se quarenta e oito colónias das placas de ampicilina e inoculou-se uma cultura de 5 ml com o transformante individual» Desenvolveram-se as culturas de um dia para o outro, a 37^0 com agitação vigorosa» Isolou-se o ADN de plasmídeo a partir de 1,5 ml da cultura, de um dia para o outro, usando um procedimento rápido de isolamento de plasmídeo em meio alcalino (Maniatis et al», 1982, Molecular Cloκ ning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, New York)» Digeriu-se o plasmídeo de cada transformante com EçoRI para confirmar a presença de um fragmento de ADN, contendo o gene da beta-globina Porto Alegre» 0 plasmídeo contendo o gene da beta-globina Porto Alegre foi designado por YEpWB51/Port. Na Figura 4 mostra-se o mapa do plasmídeo YEpWBSl/Port»

6»3» TRANSFORMAÇÃO.....DE... CÉLULAS.....Sç.340....COM....Y.EpWB51 /Port

A estirpe de levedura Sc340 foi cedida pelo Dr» J«E» Hopper do Hershey Medicai Center» 0 genotipo desta estirpe é:

MATa u.r.a.3-52, leu2, adel, h.is.3: :GAL10^uas”GAL4-URA³⁺, MEL⁺»

Transformaram-se as células Sc340 com os plasmídeos YEpWBSl/ /Port e YEp51 (controlo)» Realizou-se o método de transformação de esferoplasto, usando o procedimento publicado (Hinnen et al», 1978, Proc» Natl» Acad» Sei» U„S»A» 75:1929-1933)» Seleccionaram™se os transf ormarites, por deposição em placas num meio mínimo, contendo 0,67% de base de azoto de levedura Bacto sem aminoácidos, 2% de glucose, 20 mg/1 de sulfato de adenina, 20 mg/1 de histidina, e 20 mg/1 de uracilo» Incubaram-se as placas a 28'C durante três dias e examinaram-se guanto à formação de colónias»

Recolheram-se as colónias destas placas, após a incubação, e pré-cultivaram-se em meio mínimo de levedura (0,67% de base de azoto de levedura sem aminoácidos) contendo 0,5% de glucose mais 20 mg/1, de cada um, de adenina, uracilo e histidina» Depois

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6666-008-118 —43 usou-se a cultura, de um dia para o outro, para inoc<lT^r 1*^ρβΡ*ίη1 do meio mínimo de levedura, contendo 2% de ãcido láctico, 3% de glicerol e os aminoácidos apropriados. Inocularam-se as culturas até um valor de D.O.^qq de 0,02, Desenvolveram-se as culturas a 30°C até atingirem um valor de D,0,₆₀₀ de 0,20 (usualmente após 48 horas). A indução foi iniciada pela adição, ao meio, de galaotose até uma concentração final de 2%. Após quarenta e oito horas, colheram-se as culturas por ceritrífugação e lavou-se o sedimento com NaCl 150 mM. Dividiu-se o sedimento em duas partes. Usou-se uma parte para o isolamento do ARN e manteve-se a outra a -701;, para a análise por mancha Western,

6,4, QUANTIFICAQftO.....DO.....ARN....D(íS....CéLULAS....Sç34Ô.,......TRANSFORMADAS.....COM.....OS

PLASMÍOEOS YEp51 E YEp5.1.WB/Port

ARN foi isolado usando os procedimentos publicados (Meyhack et al-, 1982, The EMBO Journal 1:675-680 ou Carlsori e Botstein, 1982, Cell 28:145). Lavaram-se as células de levedura com NaCl 150 mM e ressuspendeu-se o sedimento em tampão de ARN (NaCl 0,5 M, Trís-HCl 0,2 M, pH 7,6, EDTA 0,1 M e 1% de SDS). Adicionaram-se, aproximadamente, 0,5 g de pérolas de vidro (0,45-0,5 mm) aos tubos, Adícionou~se um volume igual de uma mistura de fenol (fenol:clorofórmio:ãlcool isoamílico 25:24:1, equilibrada com tampão de ARN sem SDS). Quebraram-se as células de levedura, por agitação num agitador de vórtice, à velocidade máxima, durante 2,5 minutos e colocou-se a amostra em gelo durante 3 minutos- Repetiu-se o passo .anterior duas vezes mais. Adicionaram-se iguais volumes de tampão de ARN e de mistura de fenol às células e ceritrif ugaram-se os tubos. Transf eriu-se a fase aquosa para um tubo Corex limpo e adicionaram-se, a cada tubo, 2,5 volumes de etanol. Deixou-se o ARN precipitar a -20‘‘Ό, durante 4 a 6 horas. Sedimentou-se o ARN por centrifugação e secou-se sob vácuo. Suspendeu-se o sedimento de ARN em água esterilizada.

Desnaturou-se o ARN total usando o método de glíoxal (Tho™ mas, P„, 1983, em Methods in Enzymology, Colowhich, S. P. e Kaplan, N, 0. eds. Vol. 100: pp. 255-266, Academic Press, New York). Submeteu-se o ARN a electroforese num gel de agarose a 1,1% em NaP0₄ 10 mM durante, aproximadamente, 4 horas a 75 volts

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.....

(constante)„ Após a electroforese ARN para papel Amersham Hybond-N in Fnzymology Colowhich, S. P. e 255-266, Academic Press, New York) estar completa transferiu-se o (Thomas, P», 1983, em Methods Kaplan, N. 0. eds. Vol. 100: pp

Hibridou-se o ARN de levedura total, ligado ao papel de filtro, oom o ADN de beta-globina radíoactivamente marcado. As hibridações foram realizadas a 42*C, de um dia para o outro, em formamida a 50% (v/v) com 5x SSC (SSC: NaCl 3,0 M, citrato de sódio 0,3 N, pH 7,5); NaP0₄ 50 mM, pH 6,5; 250 pg/ml de ADN de esperma de salmão; e solução IX de Derihardt; (solução de Denhai— dt: 0,02% de Fíccol, 0,02% de poli(carbonato de vínilo) e 0,02% de B8A, fracção V). 0 ARN-m CYH2, que codifica a proteína ribossõmica de levedura L19, foi usado como controlo. A sonda foi o plasmídeo mpl0CYH22 que contem o gene CYH2 de levedura. Após as hibridações, lavaram-se os filtros três vezes, à temperatura ambiente, em SSC 2X e 0,1% de SOS, e quatro vezes a 50°C em SSC O,1X e 0,1% de SDS. Exposeram-se os filtros a películas de raios X, durante um período desde uma hora até ao dia seguinte, dependendo da radioactividade. Revelaram-se as películas de raios X num revelador de películas automático Koriica»

Nat Figura 5 mostraram-se os resultados destas hibridações de mancha de ARN, que mostram os resultados de ARN isolado a partir de levedura transformada com um plasmídeo de controlo, não contendo quaisquer sequências de globina (faixa 1), um plasmídeo contendo sequências codificando a beta-globina (faixa 2), e um plasmídeo contendo sequências codificando a beta-globina Porto Alegra (faixa 3). Os resultados indicam que as amostras de ARN-m de todas as fontes estavam íntactas e não se detectou qualquer degradação. Observou-se, também, que na faixa 1 não pôde ser detectado qualquer ARN-m de beta-globina, contendo esta faixa apenas o plasmídeo original. Estes resultados indicam que a hibridação, não específica, da sonda de beta-globina é mínima.

Analisaram-se as auto-radiografias, contendo bandas correspondentes ao ARN-m de beta-globina e de C.YH2, usando o analisador de gel LKB. Na Figura 6 mostram-se os resultados obtidos no ana-

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lisador» Pode observar-se claramente que a abundância de ARN-m de ÇY.H2 em todas as três faixas é aproximadamente a mesma, enquanto que a abundância do ARN-m de beta-globina Porto Alegre no 340g2P é elevada»

6»5» ANALISE............DE......MANCHA......WESTERN.......DA......BETA-GLOBINA.......PORTO.......ALEGRE.......EXPRESSA

Na análise da beta-globina Porto Alegre expressa estiveram envolvidos quatro passos principais:

(1) preparação da amostra via disrupção das células de levedura, usando pérolas de vidro, seguida da solubilização da proteína usando tampão contendo SOS.

(2) Separação da proteína extraída via electroforese em gel de poliacrilamida» (3) Transferência da proteína para papel de nítrocelulose por aplicação de um campo eléctrico transversal» (4) Detecção da proteína de globina usando um procedimento de anticorpos em duas fases» 0 anticorpo primário é específico da hemoglobina» 0 anticorpo secundário é um conjugado de -¹²¾ e de um anticorpo contra IgG do animal no qual o primeiro anticorpo foi criado» 0 125j depois detectado por auto-radiografia»

As amostras de levedura descongeladas (0,02 g de peso húmido) adicionou-se solução salina, tamponada com fosfato (PBS, NaCI 0,9 M, fosfato 0,01 M, pH 7,6) (2 ml)» Centrifugaram-se as amostras a 4°C, durante 10 minutos, e decantaram-se» Adicionou-se tampão de disrupção frio (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, PMSF 0,5 mM, pH 8,0) preparado imediatamente antes do uso (0,2 ml), a que se seguiu a adição de pérolas de vidro arrefecidas em gelo, em quantidade suficiente para atingir apenas a superfície superior do líquido» Apõs agitação num agitador de vórtice, durante 30 segundos à velocidade máxima, colocaram-se as amostras em gelo durante 5 minutos; repetiu-se este passo mais duas vezes» A cada amostra adicionou-se tampão de disrupção arrefecido em gelo (1 ml) e transferiu-se o homogeneizado para um tubo Eppendorf» Noutro tubo Eppendorf, combinaram-se 200 μϊ de homogeneizado com 200 μϊ de tampão de amostra 2X, descontínuo, convencional, recentemente preparado (Laemli, 1970, Nature 227:680-685) e

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-46ferveu-se a amostra durante 10 minutos»

Após centrifugação durante 10 minutos, carregaram-se as amostras num gel desnaturante, descontinuo, no gual o gel de empacotamento era acrilamida a 3,75% e o gel de separação era acrilamida a 12%» Aplicou-se ao gel de empacotamento uma corrente constante de 25 mA/cm^z· e ao gel de separação uma corrente de 33 rnA/cm²»

Após a electroforese estar completa e a banda de corante ter atingido o fundo do gel de separação, removeram-se os geles da unidade de electroforese e cobriram-se as placas, em separado, com água desionizada corrente» Descarregou-se o gel de empacotamento e separou-se o gel inferior da placa» Encheu-se a unidade de transferência com tampão de transferência (2 1 de metanol, 30,3 g de base tris, 144 g de glicina, pH 8,30, em 10 1 de água destilada)» Colocaram-se 2 1 do tampão de transferência num recipiente pouco profundo» A sanduíche de transferência, consistindo numa sequência de gase de poros largos, papel de mancha (blotting paper) 3 M, gel, uma porção de papel de nitrocelulose pré-cortada para cobrir apenas o gel, papel de mancha 3 M, e outra porção de gase de poros largos, foi montada sob o tampão no recipiente pouco profundo»

A proteina foi depois transferida do gel para o papel de nitrocelulose, por aplicação de uma voltagem de 40 V durante 1,5 horas» Após a transferência estar completa, removeu-se a folha de nitrocelulose e colocou-se num pequeno recipiente, pouco profundo, coberto, com 50 ml. de solução bloqueante (20 g de leite seco, 0,5 ml de Nonidet-P4O (Sigma) em 1 1. de PBS)» Agitou-se o filtro a 70 rpm durante 45 minutos» Substituiu-se a solução por 50 ml. de solução bloqueante fresca e agitou-se durante mais 45 minutos» Descarregou-se a solução bloqueante e adicionaram-se 25 ml de solução bloqueante fresca» Após a adição de 25 ml de anticorpo primário, agitou-se a amostra durante 1,5 horas» Descarregou-se a solução e lavou-se o filtro com 50 μΐ de solução bloqueante fresca (4 x 15 minutos)» Depois adicionaram-se 25 ml de solução bloqueante e 25 μΐ de anticorpo secundário» Agitou-se a solução e φ

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lavou-se, subsequentemente, com 50 ml de solução bloqueante fresca (6 x 10 minutos)»

Para quantificar a quantidade de beta-globina presente, usou-se o procedimento seguinte» Primeiramente a globina presente foi detectada por auto-radiografia» Analisou-se a auto-radiografia usando um densitometro laser e estimou-se a quantidade contida em cada amostra usando uma curva de regressão com padrões de hemoglobina» 0 padrão usado era uma apo-beta-globina, purificada por HPLC de fase inversa a partir de lisado de glóbulos vermelhos» 0 limite de detecção para a auto-radiografia é de oeroa de 2 ng. Detectaram-se aproximadamente, 0,09 mg de beta-globina Porto Alegre por 100 mg de proteína de levedura (0,09%)«

7«0„ EXEMPLO.....2;.....EXPRESSÃO...DA.....BETA-eL.pB.INA..,.NU.M,.,,y.ECT.OR.....P,E,...EXPRESSÃp pE....LE.y.EpyRA.....CONTENDO......UM.....PR0M0T0R......HÍBRIDO.......E.....UMA........SEQUENCIA......DE.

TKRM..INA.ÇA.O.....P.A.....TRANSCRIpAO.....AD.H.1

Construiu-se um promotor híbrido pela fusão da sequência activadora, a montante, do promotor GALl-lQ com os elementos de promotor, a jusante, do promotor TDH3 (aqui depois designadas por extremidade 3’ do promotor T.DH3 ou Τ.Ρ.Η3-3’)» Excisou-se a cassette contendo o promotor híbrido + o gene da beta-globina + o terminador A.pHl, e clonou~se no vector de vaivém de levedura, YEpl3» Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo resultante, pNML-Yfâ-1, e analísaram-se as proteínas expressas, por análise de mancha Western»

-1 ~ MATERIAIS.

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a ADN-ligase T4, foram obtidas em New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (BM)» Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores» 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de 1 litro de células transformadas e purificado por centrifugação em gradiente de CsCl» φ Λ

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-48- Γ

7»2» CONSTRUÇÃO........DO..............PLASMÍDEO..............L1.9 Bt.......CONTENDO........0.........GENE........DA.........B.ETA-GLOBINA E Q TERMINADOR.....ADH1.

gene da beta-globina foi obtido por digestão do plasmídeo mplSBHs com Sa.ll e HindIIl (ver Figura 7 onde se mostra o mapa de mplSBHs)» 0 fragmento de 600 pb foi isolado por electroeluição»

Digeriu-se o plasmídeo AAH5 com HindIIl e oom BamHI (Ammerer, G», Methods in Enzymology, 101, pp» 192-201, 1983). 0 AAHS foi cedido pelo Dr» Ben Hall da University of Washington, Seattle (ver Figura 8)» 0 fragmento resultante de 450 pb foi isolado por electroforese em gel» Subsequentemente, precípitou-se a banda contendo o fragmento de 450 pb com etanol e digeriu-se com Sph. I. 0 fragmento de 320 pb (Hindi II-Sp. hl) contenda as sequências de terminação de transcrição AD.Hl, foi isolado por electroeluição» plasmídeo pUC19 foi cortado com Sal.I e Sp.hl „ Preparou-se uma mistura reaccional de ligação de três vias entre o fragmento PUC19, o fragmento de beta-globina Sal.I-Hin.dIII e o fragmento terminador de HindiII-Sph.I de ADH.l» Usou-se a mistura de ligação para transformar células de E.».....coli. competentes (DH5a)» Seleccionaram-se os transformantes em placas de ampicilina (100 mg/1)» 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de vinte transformantes (clones) e analisado por digestão de restrição com Sal.I-Hindi11» 0 plasmídeo resultante, contendo os dois inseridos anteriores no pUC19, foi designado por L195AT, e é mostrado na Figura 9» Digeriu-se o ADN com Sphl e com Apa.LI e isolou-se por electroeluição um fragmento de 920 pb contendo o gene de beta-globina e o termiriador ADH1, e usou-se para a construção do plasmídeo contendo o promotor TDH.3, o gene de beta-globina e o terminador AD.Hl»

7»3» CONSTRUÇÃO ...00.....PLASMÍDEO.....pUÇ19-H.B_;At fragmento promotor TDH.3-3’ foi sintetizado, por PCR usando os iniciadores apropriados e ADN molde a partir do plasmídeo gp491» Como iniciadores foram usadas as sequências seguintes:

-141 -121

ΪΒΗ3-3’ iniciador 5’: 5’——ATcccgggAAGGTTGAAACCAGTTCCCTG-—3’;

Smal

ζ)

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7.5. GL0NAÇ.ÃQ....DA.....'.'.CASSETTE.''.....PROMOTOR.........HÍBRIDO-GENE.....D.A....BE.TA-GLO.BI-.

NA....NO.....VECTOR... DE.....VAiyÉM....YEp.l.3

Digeriu-se o pUC19~QHl3At com Saci-Sp.hI para excísar a cas™ sette GAL10-UAS + LP.H-3’ + gene da beta-globina + terminador

A0H1, do pUC19, que foi subsequeritemente preenchido nas suas extremidades» Isolou-se o fragmento de 1,43 kb resultante, por electroeluição.

Digeriu-se o plasmídeo YEpl3 (cedido por Fred Winston, Har— vard Medicai School), que contém os marcadores L.EU2 (levedura) e Amp^R (E-Colí.), com BamHI e preencheram-se as suas extremidades; o AON linear resultante foi isolado por electroeluição.

Estabeleceu-se uma ligação entre o inserido e o vector, e usou-se a mistura de ligação para transformar células de E.........coli.

competentes (DH5a). Os transformantes foram seleccionados em placas de ampicilina (100 mg/1). Isolou-se o ADN de plasmídeo de 24 transformantes e analisou-se por digestão de restrição com HindIIl, Eço.RI, EçoRI-Sal.I. Na Figura 13 mostra-se o mapa do plasmídeo resultante, pNML-V-G-1»

7-6. TRANSFORMACâC............DE.......CÉLULAS.......DE^LEVEDURA.......DA.......ESTIRPE.......Sç.34.0........COM

P.NML-.V.-.G-1

A estirpe Sc340 tem o genotipo seguinte: MATa, u.ra3-52, le.u2, adel, ME.L.+ , [his.3::GALIO (UAS+P) + G.AL.4 + U.RA.3). Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo pNML-V-G-1 usando o procedimento de esferoplasto (Rose, M. et al.., 1989, Methods in Yeast Genetics, Cold Spríng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., pp 112-115). Para minimizar o fundo nas placas de controlo e aumentar a eficiência da transformação, o meio de regeneração continha sorbitol, 1 M, CaCl.^ 10 mM, 0,1% de base de azoto de levedura e 2% de glucose. 0 meio foi esterilizado por filtração. 0 meio de cultura em placas foi preparado misturando 182 g de sorbitol, 20g de ágar, 6,7 g de YNB Difco sem aminoãcidos, glucose, os amirioãcidos requeridos com excepção da leucina, em 1 1 de ãgua destilada. 0 ágar do topo foi preparado por mistura de 18,2 g de sorbitol, 2 g de ágar, 0,67 g de YNB Difco sem aminoãcidos, 2 g de glucose e os aminoãcidos requeridos, ο

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6666-008-118 em 100 ml de água destilada»

Para a cultura de partida, as células foram cultivadas, de um dia para o outro, em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 0,5% de glucose e suplementado com uracílo, adenina, e histidina» Inocularam-se 500 ml de meio 30, suplementado com citrato férrico 200 μΜ e com 20 mg/1 de cada um de adenina, uracílo e histidina, com a cultura de partida até um valor de O»O»^qq de 0,02» A cultura foi incubada com agitação (300 rpm) a 30^oC e foi induzida com 2% de galactose, durante um período de 4 horas, antes da recolha das amostras para análise»

7»7 - ANALISE.....POR.....MANCHA.... WESTERN.... D A.....BETA-GLOBINA EXPRESSA

A beta-globina expressa foi quantificada por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6»6» supra.» Os resultados indicam que até 5,4% da proteína de levedura total, expressa nas células Sc340 transformadas, era beta-globína»

8» EXEMPLO.......3:............EXPRESSÃO.......POR......GAMA-GLOBINA.......NATURAL.......NUM.......VECTOR.......DE

EXPRESSÃO.....DE....LEyEOURA.....CONTENDO... 0... .PROMOTOR.....G.AL.10.....E.....0.....TERM.INADOR

A.D.H.1.

gene da gama-globina foi obtido a partir do plasmídeo pJWISl usando PCR» 0 gene da gama-globina foi modificado por POR de forma a ter um sítio Sall na extremidade 5’ e um sítio Hind.IIl na extremidade 3’» 0 gene da gama-globina modificado foi clonado no vector de expressão de levedura YEp51T'/NAT, que contém a sequência de terminação da transcrição A.DH.1, o promotor GA.L.10 e a sequência de ADN codificando o gene da beta-globina» 0 YEp51T/NAT tinha sido cortado com Sall e HindiII para remover o gene da beta-globina» 0 plasmídeo contendo o gene da gama-globina foi designado por YEp51T/G» A estirpe de levedura Sc340 foi transformada com YEpSIT/G e o transformante foi designado por 340g2G» Apõs o crescimento de 340g2G e indução, por galactose, analisaram-se as proteínas expressas, por análise de mancha Western. Os resultados da análise por mancha Western indicam que a gama-globina foi expressa»

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6666-008-118

-52- ' ^;;f

8.1. MATERIAIS

As enzimas de restrição e as enzimas de modificação do ADN foram obtidas em Boehringer-Mannheim, Bethesda Research Laboratories, Perkin-Elmer ou New England Bíolabs. Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores.

A estirpe de E.........çoli. usada para todas as transfarmações com bactérias foi a estirpe DHSa.

Os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador de ADN 380B da Applied Biosystem Inc. usando a química do cianoetilo. A reacção em cadeia com polimerase (PCR ou reacção PC) foi realizada num ciclizador térmico de ADN obtido na Cetus, Inc„.

8.2. CLONA.Ç.A.O,.._D.O.„... GENE.....DA... _BETA-.QLOB.1NA......NUM.......VECTOR......DE.......EXPRESSÃO........DE bE.yEpyRA„...YEp51

Na Figura 3B mostra-se o procedimento geral usado para clonar o gene de beta-globina no vector de expressão de levedura YEpSl. Digeriu-se o plasmídeo pSPIJC (ver Figura 2 onde se mostra o mapa de restrição de pSBBC) com Nç.o.1 e HindiII. A digestão com esta combinação de enzimas gerou dois fragmentos, um fragmento de ADN de 600 pares de bases contendo o gene da beta-globina e o fragmento de 2. 700 pb do plasmídeo. 0 fragmento de 600 pb foi isolado a partir de um gel de agarose a 0,6%. Após a banda ter sido excísada do gel, o ADN foi electroeluído e precipitado com etanol. 0 ADN precipitado foi centrífugado numa centrífuga Eppendorf, removeu-se o sobrenadante e secou-se o sedimento de ADN sob vácuo.

fragmento de 600 pb foi modificado por adição de adaptador, antes da clonação no plasmídeo YEpSl. 0 fragmento de ADN contendo o gene da beta-globina, isolado a partir de pSBBC era compatível com Nço.l na extremidade 5^?, enquanto gue a extremidade 3’ era compatível com HindlII. Estas extremidades tiveram de ser modificadas de modo a poderem ser compatíveis com os sítios de restrição presentes em YEpSl. Para modificar a extremidade 5’ do fragmento isolado, usou-se um adaptador sintético. Este adaptador tinha uma extremidade compatível com Ncol na sua extremidade 3* e

499

6666—008—118 uma. extremidade compatível com Sall na sua extremidade 5^S (ver Figura 2). A extremidade 3’ do fragmento isolado não recebeu qualquer adaptador, uma vez que o sítio HindIII era compatível com o sítio HindIII introduzido no YEpSl.

plasmideo receptor YEp51 foi clivado com as enzimas de restrição Sall e HindIII.. Para inserir o fragmento isolado contendo o gene da beta-globina, íntroduzíu-se uma ligação de três vias (ver Figura 3B)» A reacção de ligação foi realizada de acordo com os procedimentos de ligação convencionais (Maníatís et al-, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spríng Harbor Laboratory, Cold Spríng Harbor, New York), Usou-se a mistura de ligação para transformar células E»........çol.i. HB101, usando o procedimento de transformaçâo convencional» As células foram espalhadas em placas contendo meio LB com 100 mg/I de ampicílina» As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37^OC« Recolheram-se quarenta e oito colónias das placas de ampicílina e inoculou-se uma cultura de 5 ml com os transformantes individuais. As culturas foram desenvolvidas de um dia para o outro a 37com agitação vigorosa» 0 AON do plasmideo foi isolado a partir de 1,5 ml da cultura de um dia para o outro, usando um procedimento rápido de isolamento de plasmídeos» Um plasmideo de cada transformante foi digerido com EcoRl para confirmar a presença de um fragmento de ADN contendo o gene da beta-globina natural. 0 plasmideo contendo o gene da beta-globina natural foi designado por YEpWB51/Nat» Na Figura 14 mostra-se o mapa do plasmideo YEpWBSl/Nat»

8,3» CL0NA£Ã0....0A8....SEQUêNCIAS.....DO TERMINADOR.....ADH1....N0.....YEpWBSl/Nat

Na figura 15 mostra-se a estratégia usada para inserir as sequências do terminador A.DH..1 no YEpWBSl/Nat. 0 plasmideo YEpWB51/Natd- (d-~dam e dcm-, isto é, metilação menos) foi digerido com as enzimas de restrição Bell e HindIII» Após a digestão, isolou-se o fragmento de ADN de 6,8 kb, contendo o gene da betaglobina e o vector, a partir de um gel de agarose a 0,6% (em TBE IX, Tris 0,1 M, pH 8,0, ãcido bórico 0,09 M, EDTA 1 mM)» 0 ADN foi electroeluído a partir da fatia de gel e precipitado com etanol a -20°C„ 0 ADN precipitado foi centrifugada numa centrífuga (φ

499

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-ff*'

Eppendorf durante 15 minutos e o sedimento foi seco sob vácuo. Suspendeu-se o ADN em 20 ml de HoO.

,<í»

As sequências de terminação da transcrição de ADH1 foram isoladas a partir do plasmídeo AAH5 (Ammerer, fâ., 1983, Methods in Enzymology, .101, pp 192-201). 0 AAH5 foi cedido pelo Dr. Ben Hall da University of Washington, Seattle. 0 plasmídeo AAH5 foi digerido com BamHl e HindIII (ver Figura 8 onde se mostra o mapa do plasmídeo AAH5). A digestão com esta combinação de enzimas gerou três fragmentos. Um fragmento de ADN de 450 pares de base, contendo a sequência de terminação da transcrição de ADH1, foi isolado a partir do gel de agarose a 0,6%. 0 ADN foi electroeluí™ do a partir da fatia de gel e precipitado com etanol a -20°C. 0 ADN precipitado foi centrifugado numa centrífuga Eppendorf, durante 15 minutos, e o sedimento foi seco sob vácuo. 0 ADN foi suspenso em 20 μΐ de H^O.

fragmento de ADN contendo o terminador da transcrição ADH1, isolado a partir do AAH5, era compatível com BamHl na extremidade 3”, enquanto gue a extremidade 5” era compatível com HindIII. Estas extremidades eram compatíveis com os sítios de restrição presentes no YEpWB51/Nat.

plasmídeo receptor YEpWB51/Natd- foi clivado com as enzimas de restrição Bell e HindIII. Como se mostra na Figura 15, in™ troduziu~se uma ligação de duas vias para inserir o fragmento isolado. Usou-se a mistura de ligação para transformar células E, çol.í HB101 usando procedimentos de transformação convencionais. Espalharam-se as células sobre placas contendo meio LB com 100 mg/1 de ampicilina. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C. Recolheram-se vinte e quatro colónias das placas de ampicilina e inoculou-se uma cultura de 5 ml com os transformantes individuais. As culturas foram desenvolvidas de um dia para o outro a 37 °C com agitação vigorosa. 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de 1,5 ml da cultura de um dia para o outro, usando procedimentos mini-preparativos convencionais em meio alcalino (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New ο

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York)» Digeriu-se ο plasmídeo de cada transformante com as enzimas de restrição PstI e HindiII para confirmar a presença de um fragmento de ADN contendo o terminadcr de A.DH.1» 0 plasmídeo contendo o gene da beta-globina natural com o terminador AD.H.1 foi designado por YEp51T/NAT e mostra-se na Figura 16» „ 4» ÇL0NAÇ.A.0......DO......ΘΕΝ.Ε........DA......Θ.ΑΜA-CLOBINA......NUM.......VECTOR......DE.......EXPRESSÃO.......DE

CEVEDURA ..YEp51T/NAT

Na Figura 17 mostra-se o procedimento geral usado para clonar o gene da gama-globina no vector de expressão de levedura YEpSIT/NAT, resultando na construção do YEp51T/Q„ gene da gama-globina foi sintetizado por PCR usando os iniciadores apropriados (que a seguir se apresentam) e o ADN de plasmídeo p»JW151 (Wilson, J»T», et al», Nucleíc Acíd Research, 5:563-581, 1978) como molde» Na Figura 18 mostra-se a sequência do ADN da gama-globina» Na Figura 19 mostram-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para a síntese do gene» 0 produto de PCR foi analisado por electrof orese num gel de agarose a 1,5% (em TBE IX). 0 produto de PCR de 530 pb foi removido do gel por electroeluição e o ADN foi precipitado com etanol» 0 produto de PCR purificado foi depois digerido com as enzimas de restrição S.al.1 (extremidade 5”) e HindII (extremidade 3’)» 0 produto de PCR digerido foi extraído com fenol e precipitado com etanol» plasmídeo YEp51T/NAT, que contém o gene da beta-globina humana foi digerido com Sal.I e HindlII para remover o gene da beta-globina» 0 plasmídeo digerido foi submetido a electroforese num gel de agarose a 0,6% (em TBE 1 X)» Electroeluiu-se um fragmento de 7 000 pb e precipitou-se com etanol.»

Preparou-se uma mistura reaccional, de ligação entre a gama-globina, obtida por digestão do produto de PCR anteriormente descrito, e o YEp51T/NAT cortado com Sal.I e HindlII (7 000 pb)»

Usou-se a mistura de ligação para transformar células de E.»........coli.

DH5a usando o procedimento de transformação convencional, e colocaram-se as células em placas de LB contendo ampicilina (100 mg/1)» 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de 20 clones e diφ

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-56gerido com a enzima de restrição Pstl. 0 plasmídeo resultante foi designado por YEpSIT/G (Figura 20)»

8»5» TRANSFORMAÇÃO............E.......CRESCIMENTO......DAS.......CÉLULAS.......DE.......LEVEDURA.......DA.......ESTIRPE.....§0340.....COM.....0.....PLASMÍDEO.....YEp5.1T/0

Transformaram-se as células de levedura da estirpe Sc340 com o plasmídeo YE51T/G (Rose, et al», 1989, Methods in Yeast Genetios, Cold Spríng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N»Y», pp» 112-115)» A cultura de partida foi desenvolvida em meio SD suplementado com adenína e hístidina, e com 3% de glicerol e 2% de lactato, como fonte de carbono» Usou-se a pré-cultura para inocular 2 I do meio anterior no fermeritador Braun Biostat E» 0 pH foi mantido a 5,5 usando uma solução de hidróxido de amónio a 5%» A ρθ£ foi mantida a 80% até a cultura ter sido induzida com galactose, após o que este valor diminui para 10%„ A velocidade do agitador foi ajustada a 500 rpm e depois reduzida para 100 rpm na altura da indução com galactose» A cultura foi incubada a 30*0 e desenvolvida até um valor de DQ₆₀q de 30,4 após o que foi induzida com galactose adicionada a uma velocidade de 5 g/l/hora» As amostras foram recolhidas durante um período de 0 a 74 horas após a indução, para análise de globina»

8»6» ANALISE.....POR.....MANCHA.... WESTERN..... D A.....GAMAzG.L0BI.NA.....EX.PRES8A.

A gama-globina expressa foi quantificada por análise de mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6»6„, supra» Os resultados indicam que até 0,05% da proteina de levedura total, na linha de células de levedura 340g2G era gama-globina»

9.0. EXEMPLO.......4..:.......EXPRESSÃO......DA......VARIANTE......DE.......GAMA-GLOBINA.......NUM.......VECTOR

DE.........EXPRESSÃO......DE........LEVEDURA........CONTENDO.........UM.........PROMOTOR.........HÍBRIDO.........E........UMA.

SEQUÊNCIA.....DE....TE.RMINAÇA.0.....DA.....1RANSCRI.ÇA.0

Construiu-se um promotor híbrido por fusão da sequência activadora a montante do promotor GÁLIO, com os elementos de promotor a jusante do promotor T.D.H3 (aqui depois designado por extremidade 3’ do promotor TD.H.3 ou TDHS-S*)» Construiu-se o gene variante da gama-globina por modificação da sequência do iniciador da extremidade 5’ para PCR, e substituição do penúltimo codão de φ

499 Λ'

6666-008-118 ' · -57glicina por um codificando a valina, críarido-se deste modo um sítio ApaLI. A cassette contendo o promotor híbrido + gene da gama-globina + terminador A.DH.1 foi construída num pUC19 e depois excisada e clonada no vector de vaivém de levedura, YEp51. As células de levedura Sc340 foram transformadas com o plasmídeo resultante, pNM-5fâ^_va|l, e as proteínas expressas pelos transfor— rnantes, após a indução com galactose, foram analisadas por mancha Western»

9.1.. MATERIAIS.

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a ADN-lígase-T4, foram obtidas em New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehrínger Mannheim (BM). Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores. 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de 11 das células transformadas e purificado por centrifugação num gradiente de CsCl.

9.2. SÍNTESE.....DO.....SAMA..(.yal..).A.t

Usando os iniciadores apropriados e ADN do plasmídeo YEp51T/G (Secção 8.4. supra) como molde sintetizou-se, por PCR, um fragmento de ADN contendo ^-globina a montante do terminador ADH.1. Adicionou-se o sítio ApaLI ao gene da ^-globina por > alteração das sequências GGTCAT no gene para GTGCAC (sítio ApaLI). Na Figura 21 mostram-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para a síntese do gene. Usando o iniciador 5’ da globina e um iniciador complementar oom as sequências do terminador A.D.H. 3’, e ADN do plasmídeo YEp51T/fâ como molde, siritetizou-se por PCR um fragmento de 780 pb contendo o gene da y_vaj-globína e o terminador ADH1.

9.3. CONSTRUÇÃO....DO.....pyÇ19.“GH^..(ya.l...).At fragmento de PCR gama (vai) foi cortado com Apa.LI e Sph.I (fragmento #1). 0 ADN do plasmídeo pUC19 foi cortado com Saci/ /Sph.1 e isolou-se um fragmento de ADN linear (fragmento #2). 0 ADN do pUC19-GHBAt (Secção 8.3., supra) foi cortado coin ApaLI e Saci, e isolou-se, por electroeluiçâo, o fragmento de 510 pb contendo o promotor híbrido fâAL-UAS-TD.H.3-3’ (fragmento #3).

φ

499

6666-008-118

58”

Inseriu-se uma ligação de três vias entre os três fragmentos anteriores» Usaram-se células de E.».....coli. DH5a para transformação»

AON de 24 transformarites foi isolado por digestões alcalinas e analisado por digestões de restrição» 0 plasmídeo resultante, contendo todos os três fragmentos na orientação correcta, foi designado por pUCig-GH/y^-jAt» „ 4» CLONA.Ç A.O......D A..... 0 Α38ΕΪΤΕ.......GH^ _{va χ} At .....NO.....V EC.10R....DE.....V AI V M....DE.....LEVE-,

DURA ...YEp5.1.

A cassette de expressão fâHjá^At (1,29 kb) foi isolada por digestão de pUC19-GH^_va^At com Sacl/Sphl. Preencheram-se as extremidades da cassette e clonou-se no YEp51 cortado com BamHl por ligação das extremidades preenchidas» Analisaram-se as amostras de ADN a partir de quarenta e oito clones de cada transformação, por digestão com ApaLI» Os clones positivos mostraram quatro fragmentos e os clones negativos mostraram 3 fragmentos» Os clones positivos foram caracterizadas ainda por digestão com diferentes enzimas- 0 clone positivo foi designado por pNM-5~G~$vail“ Na Figura 22 mostra-se o mapa do plasmídeo pNM-5“^tfval¹

9_5» .....PA....ESTIRPE....DE.....LEVEDURA Sc340 ..CON

0.....PLASMÍDEO.....pNM-SG-.^_{va χ} 1.

Usou-se o ADN do plasmídeo ρΝΜ-5-G-^_va]l para transformar células de levedura Sc340 (Rose et al», 1989, Methods ín Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y», pp» 112-115)» 0 transformante foi designado por 340-5GgVAL» Desenvolveu-se a cultura de partida a 30°0, de um dia para o outro, em meio contendo 0,5% de rafinose, 0,67% de base de azoto de levedura sem aminoácidos (Difco), e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, uracilo, histidina e triptofano, e usou-se para inocular um meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura sem aminoácidos, 3% de glicerol, 2% de ácido láctico, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de uracilo, histidina, adenina, e triptofano» Após 24 horas de crescimento a 30^oC a cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%» Recolheram-se amostras, durante um período de 4 a 48 horas após a indução, para análise da globina por mancha Western» φ

499

6666-008-118 ρ

,. 6„ ANALISE.....P.E....MA.NÇHA...WESTERN.....pA....GAMAr GLOBINA.....EXPRESSA

A gama-globína expressa foi quantificada por análise de mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6-6. §.y.p.ra.- Os resultados indicam que até 1% da proteína de levedura total no 340~5GgVAL era gama(vai)-globina-

„ 0 „ EXEMPLO........5.x..............EXPRESSÃO........DE..............UM........MUTANTE........DE........D E L.EÇÇÃ.0........DE........A L EA-GLOBINA.........NUM.....VECTOR DE.....EXPRESSÃO.....D.E....LEVEDURA.....CONTENDO ...UM.

EHQMOIOR...HIBR.IDO....E...UMA....SEQUÊNC1A.. DE.....TERMINAÇÃO... DA.....TRANSCRIÇÃO.....DE....ADH1

Construiu-se um promotor híbrido pela fusão da sequência de activação a montante do promotor A.0H.2 com os elementos de promotor a jusante do promotor T.DH3 (aqui depois designado por extremidade 3’ do promotor T.DH.3 ou TDH.3-3’) - Especifícamente, clonaram-se no plasmídeo pUC19, o promotor híbrido ADH2-UAS-TDH-3’, o ADN da alfa-globina contendo uma delecçao de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanína, como se mostra na Figura IE e o terminador GAL1Q. □ plasmídeo resultante foi designado por pUC19-AHaGt. A cassette contendo o promotor híbrido + gene de alfa globina + o terminador G.A.L.10, foi excísada e clonada no vector de vaivém de levedura, pPM40- Transformou-se a estirpe de levedura Scl012 com o plasmídeo resultante, pNM-R-A-al e analisaram-se as proteínas expressas por análise de mancha Western 10„1,. MATERIAIS

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a ADN ligase T4 foram obtidas em New England Bíolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (BM). Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores- 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de 1 litro das células de E.,......coli. transformadas e purificado por centrifugação num gradiente de CsCl.

10.2 „ CONSTRUÇÃO ...0.0.....p.UÇ19-GHaGt

10-2-1 - C0NSTRUÇÃ0.....D.0.....PLASMÍDEO.....pl9Al.

Para construir o plasmídeo p!9Al, o gene da alfa-globina foi obtido por reacção em cadeia com polimerase (POR). 0 molde usado

499

6666—008—118

4' para a PCR foi o plasmídeo plWlOl (Wilson et al-, 1978, Nuol, Acide Res- 5: 563-580) e os iniciadores usados na reacção foram os iniciadores 51-A-l e 519-A-3 (ver Figura 23)-

produto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição Sa.ll e BamHI e o fragmento de 460 pb foi isolado a partir de um gel de agarose a 0,6% (TBE IX)- 0 ADN foi electroeluido a partir da fatia de gel e precipitado com etanol a -20°C» Centrifugou-se o ADN precipitado numa centrífuga Eppendorf durante 15 minutosSecou-se o sedimento sob vácuo» Suspendeu-se o ADN em água a 20°C» Ligou-se o produto de PCR purificado ao plasmídeo pUC19, digerido com enzimas de restrição Sal.l e Bam.Hl» A reacção de ligação foi realizada ά 15°C de acordo com os procedimentos de ligação convencionais (Maniatis et.......al.», 1982, Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)» Usou-se a mistura de ligação para transformar células E-........coli. DH5a usando procedimentos de transf ormação convencionais- Fspalharam-se as células sobre placas contendo meio LB com 100 mg/1 de ampicilina- Incubaram-se as placas de um dia para o outro a 37*C» Recolheram-se vinte e quatro colónias das placas de ampicilina e inoculou-se uma cultura de 5 ml com os transformantes individuais» Desenvolveram-se as culturas de um dia para o outro a 37⁰C, com agitação vigorosa» 0 ADN de plasmí— deo foi isolado a partir de uma cultura de 1,5 ml e digeriu-se o ADN com a enzima de restrição Hindlll, Oito ciones mostraram o comprimento esperado dos fragmentos (290 pb e 200 pb). 0 plasmídeo resultante foi designado por p!9Al»

-2.2- CONSTRUÇÃO....DO.....PLASMÍDEO.....P19A1GT

Para construir o plasmídeo p!9AlGT, obteve-se o termínador fâ.AL.10 por reacção em cadeia com polimerase (PCR)» 0 molde usado para PCR foi o plasmídeo pCLUI e na Figura 24 mostram-se os iniciadores usados na reacção glOT-5B e G10t3ES8Digeriu-se o produto de PCR com as enzimas de restrição Ba-, m.HI e Fço.RI e isolou-se um fragmento de 450 pb a partir de um gel de agarose a 0,6% (TBE IX)» 0 ADN foi electroeluido a partir da fatia de gel e precipitado corri etanol a -20^,:>C» Centrifugou-se o

Φ

499

6666—008—1X8

AON precipitado numa centrífuga Eppendorf durante 15 minutos» Secou-se o sedimento sob vácuo» Suspendeu-se o AON em água a 20 °C. Ligou-se o produto de PCR purificado ao plasmídeo p!9Al digerido com as enzimas de restrição BamHI © EçgRI» A reacção de ligação foi realizada a 15^,JC de acordo com os procedimentos de ligação convencionais (Maniatis et......al „1982,, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Usou-se a mistura de ligação para transformar as células E.,......col.!. OH5a usando procedimentos de transformação convencionais» Espalharam-se as células sobre placas contendo meio LB com 100 mg/1 de ampicilina. Incubaram-se as placas de um dia para o outro a 37'^?C„ Recolheram-se vinte e quatro colónias a partir das placas de ampicilina e inoculou-se uma cultura de 5 ml com os transformar tes individuais., As culturas foram desenvolvidas de um dia para o outro a 37°C, com agitação vigorosa. 0 ADN do plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de 1,5 ml e digeriu-se o ADN com a enzima de restrição Sa 1.1» Oito clones mostraram o comprimento esperado dos fragmentos (2 700 pb e 900 pb). 0 plasmídeo resultante foi designado por pl9A!GT»

10.2.3. CONSTRUÇÃO ....00.....PLASMÍDEO.....p U C19 -fâΗ α 6t

Usou-se PCR para sintetizar um fragmento promotor híbrido,

GHaGt, que contém o promotor híbrido GALi-lO-UAS/TDH.3-3” e as primeiras 36 bases do AON da alfa-globina contendo uma delecçâo de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina até, e incluindo, o sítio S.tu.I no gene. Clonou-se o fragmento de PCR de 570 pb resultante no plasmídeo pUC19 cortado com SmaI, por ligação das extremidades preenchidas. A transformação foi realizada usando a estirpe de E.».....çoli. 510a.

primeiro sitio de restrição na sequência de codificação da alfa-globina é S.tu.I que começa 31 bases a jusante do codão de iniciação ATO» Sintetizou-se o iniciador 3* de modo a conter sequências complementares com a extremidade 3’ do promotor T.DH-3’ e as primeiras 36 bases do ADN da alfa-globina contendo uma delecçâo de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina até ao sitio StuI» Na Figura 25 descrevem-se os iniciadores 5‘^J e 3’. 0 molde usado para a PCR foi φ 72 499

6666-008-118

-62™ ο AON do plasmídeo pUCX9-GHbAt, que contém o promotor híbrido GALl-lO-UAS/TD.H3-5⁵ fragmento de 570 pb, contendo o híbrido promotor—primeiras 36 bases do ADN da alfa-globina contendo uma delecção dos nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina, sintetizado usando os iniciadores anteriores, foi clonado no vector pUC1.9 por ligação das extremidades preenchidas. Este plasmídeo foi designado por pUC19-GHa⁵.

fragmento 3 do gene da alfa-globina, contendo os sítios t de clonação apropriados, foi preparado por PCR. Usou-se o plasmídeo pUC19-Al como molde. Na Figura 26 descrevem-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para sintetizar o gene.

Cortou-se o fragmento de 460 pb resultante com Sam.Hl e Sal.I e clonou-se no vector pUC19 cortado com BamHI-SalJ- Usou-se a estirpe 510a de E.........çoli para a transformação, uma vez que esta estirpe produz ADN não metilado. A enzima Stu.1 é ineficaz no corte de AON metilado. Analisaram-se os transformantes por digestão com PyuII β o plasmídeo resultante, contendo o fragmento apropriado, foi designado por pUC19-A2„

A ADN dos plasmídeo pUC19-A2 e pUC.19-GHa'‘ foi cortado com 3tul-8a.ll e os fragmentos resultantes, um fragmento A linear e um fragmento B de 580 pb, respectivamente, foram isolados por electroeluiçâo. Introduziu-se uma ligação entre os fragmentos A e B e usou-se a mistura de ligação para transformar células de E.........çoli.

510a. 0 plasmídeo resultante, contendo ambos os fragmentos na orientação correcta, foi designado por pUC19-GHA (ver Figura 27).

□ ADN do vector plasmídeo pUC19 foi cortado com Sph.I. Isolou-se o AON linear e desfosforilou-se (fragmento C). Cortou-se o AON do plasmídeo pUC19-GHA com S.p.h.1 e Híri.d.111 e isolou-se o fragmento resultante por electroeluição (fragmento D). 0 ADN do plasmídeo pl9A!GT foi cortado com 8ph.I e HindiII e isolou-se o fragmento resultante contendo parte do gene da alfa-globina e o terminador GA.L.10 (580 pb) (fragmento E). Introduziu-se uma

499

6666-008-118

ligação de três vias entre os fragmentos C, D e E. Usou-se a mistura de ligação para transformar células de E..........ooli DH5a. 0 plasmídeo contendo ambos os inseridos na orientação correcta foi designado por pUC19-GHaGt (ver Figura 28)„ „ 3„ CLONAÇÃO......DE......AD.H-2-UA8......E......TDH.3-3J',/......MUTANTE.......DE.......DELECÇÃO.......DE.......AL“

FA-GLOBI. NA.GALIO N0...pUÇ19

Cortou-se o ADN de plasmídeo pUC19-A.0H2-UAS com Xba.I/Sphl „ 0 fragmento de AON linear foi isolado (fragmento ttl). 0 fragmento de ADN contendo TDH3-3^!'/mutante de delecção de a-globina/termínador GAL.10 (HaGt), foi preparado por PCR usando o plasmídeo pUC19-GHaGt como molde. Na Figura 29 mostra-se a sequência dos iniciadores usados para sintetizar o fragmento de ADN por PCR.

Cortou-se o fragmento de 1,04 kb, resultante, contendo TDH3“3^s/mutarite de delecção de alfa-globiria/terminador GAL10 (HaGt) com Xbal/Sphl (fragmento #2). Introduziu-se uma ligação entre o fragmento #1 e #2. Transformaram-se células de E.ÇoIí DH5a e analisaram-se os digeridos de restrição do ADN obtido a partir dos transformantes. 0 plasmídeo contendo os fragmentos na orientação correcta foi designado por pUC19-AHaGt. Na Figura 30 mostra-se o mapa deste plasmídeo.

10.4. ÇLONA.ÇÃO.....DA.....CASOETTE... AHqgT....NO.....P.PM40.

A cassette de expressão, AHaGt, foi excisada por corte do

ADN de plasmídeo pUC19~AHaGt com Saç.I/Sphl„ Clonou-se o fragmento resultante de 1,3 kb no pPM40 de extremidades preenchidas, cortado com BamHI. Na Figura 31 mostra-se o mapa de pPM40„ 0 plasmídeo resultante foi designado por pNM-R-A-al. Na Figura 32 mostra-se o mapa deste plasmídeo.

10.5. TRANSFORMAÇÃO.....OA....ESTI RPE....DE.....LEVEDURA ...SçlQ12.....COM.....pNM.-R-A.-ql

A estirpe de levedura Scl012 é um mutante heml que está bloqueado em ácido S-amínolevulíníco-sintetase, a primeira enzima no percurso bio-sintético do heme. A Scl012 tem o genótipo seguintes adel, ade2, heml-1, his3, leu2-3, 112 ura3-l. Transformou-se a estirpe de levedura Scl012 com o plasmídeo pNM-R-A-al usando o procedimento de esféroplasto (Rose, M. et al., 1989, Methods in ν>

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if'

Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hat— bor, N.Y., pp 112-115). No protocolo anterior fizeram-se duas modificações,. A quantidade de YEP adicionado durante o passo de regeneração foi reduzida de 1% para 0,1%. Ao ágar de regeneração não se adicionou caldo de YEP.

Para a cultura de partida as células foram cultivadas em 500 ml de meio minimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de glucose e suplementado com 20 mg/1 de cada um de leucina, adenina e histidina, © com 4 mg/1 de ácido aminolevulínico a 30 ^C, num balão agitado até à fase logarítmica. As células foram depois colhidas, lavadas com meio sem uracilo e contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de glucose e suplementado com 40 mg/1 de cada um de leucina, adenína e histidina, e com 4 mg/1 de ácido aminolevulínico, e usaram-se para inocular 2 1 do meio sem uracilo num fermentador Braun Biostat E. 0 pH foi mantido a pH 5,5 com uma solução de hidróxido de amónio a 5%. A p0₂ f©i mantida a 80% de saturação, durante a fase de crescimento, e depois ajustada a 10% após a glucose ter sido consumida. A velocidade do agitador foi ajustada a 500 rpm e depois reduzida para 100 rpm, na altura da indução. Colheram-se amostras de 2 em 2 horas após a glucose ter sido consumida, durante um período de cinquenta horas.

„ 6. ANALISE.......DE.............MANCHA.......WESTERN.......DO.......MUT ANTE.........DE........DELECÇÃO........DE........AL.-.

FA-GL0B.1NA....EXPRESSA mutante de delecção de alfa-globína expresso foi quantificado por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6 supra. Os resultados indicaram que até 0,74% da proteína de levedura total, expressa nas células Scl012, transformadas, era o mutante de delecção de alf a-globina.,

11.0. EXEMPLO.....6. s.....Ε X.P R E S.S ÃO....DE.....U M.... M U T A N TE.... D E.....DELECÇÃO... DE.....ALFA -GLC-.

BINA NUM VECTOR	DE EXPRESSÃO DE LEVEDURA CONTENDO	UM PRO-
MOTOR HÍBRIDO E	UMA SEQUÊNCIA DE TERMINAÇÃO DA TRAN	SCRIÇÃO

G.A.L10

Construiu-se um promotor híbrido pela fusão da sequência activado ra a montante do promotor GAL10 com elementos do promotor a jusante do promotor TDH.3 (aqui depois designado por extremidade

-,. ..

φ

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-653” cio promotor TpH.3 ou T0H3-3''). Especificamente, clonaram-se o promotor híbrido GAL1Q-UAS-TDH5-5' , o ADN de alfa-globína contendo uma delecçâo de riucleõtído 34-37 que codifica alfa-12 aialína © o terminador GALID; no plasmídeo pUC19. o plasmídeo resultante foi designado por pUC19-GHaGt. Excisou-se a cassette contendo o promotor híbrido + ADN de alfa-globina contendo uma delecçâo de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina + terminador GAL10 e clonou-se no vector de vaivém de levedura, pPM40„ Transformaram-se células de levedura da estirpe Scl04i com o plasmídeo resultante, pNM-R-G-al e analisaram-se as proteínas expressas por análise de mancha Western,

11.1.. MATERIAIS.

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a AON lígase-T4 foram obtidas de New Erigland Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (BM). Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores, 0 AON de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de um litro das células de E......coli. transformadas e purificado por centrifugação em gradiente de CsCl.

11.2., CONSTRUÇÃO ...00.....pUC19-QHaGt.

pUC19~GH(xGt foi construído usando o procedimento que se descreve na Secção 10.2 supra.

„ 3. CLONAÇAP. DA.....CASSETTE... GHaGt ...η o.....pPM40

A cassette de expressão, GHaGt foi excísada por corte do

ADN de plasmídeo pUC19-GHaGt com SacI/Sph.I e preencheram-se as suas extremidades. 0 fragmento resultante de 1,3 kb foi clonado no pPM40, de extremidades preenchidas, cortado com BamHl (ver Figura 31 onde se mostra o mapa de pPM40) „ 0 plasmídeo resultante foi designado por pNM-R-G-al. Na Figura 33 mostra-se o mapa deste plasmídeo.

„ 4 TRANSFORMAR AO.....DA.....EST IRPE....DE.....LEVEDURA... Sel041.....com.....pNM;~R-G~íxl

A Scl041 tem o genótipo seguinte: MATa, leu2, ura3™52,, trp(d)63, prbl-112, pep4™3, prcl-407, GAL2+-. Transformou-se a levedura da estirpe Scl041 com o plasmídeo pNM-R-G-al usando o procedimento esferoplasto (Rose, M. et al., 1989, Methods in Yeast Geneties, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

- <5®

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N.Y., pp 112-115) —66— »* ϊ®·***·

Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em 500 ml de meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de ãcido láctico, 3% de glicerol, e suplementado com 20 mg/1 de, cada um, triptofano e leucina, a 30 “C, num balão agitado, até à fase logarítmica- As células foram depois colhidas, lavadas com meio sem uracilo contendo 0,67% de base de azoto e levedura, 2% de ácido láctico e 3% de glicerol e suplementado com 20 mg/1 de triptofano, e usaram-se para inocular 500 ml do meio desprovido de uracilo.. A cultura foi incubada com agitação (300 rpm) a 30⁰C, e desenvolvida até à fase semi-logarítmica antes da adição de galactose até uma concentração final de 1%» Quatro horas após a indução recolheram-se amostras para análise,.

i1 - 5 . ANALISE.....DE... .MANCHA.....WESTERN.....DA ....ALF Ar GLOBINA.....EXPRESSA

MUTANTE.....0E....DELECÇâS.

mutante de delecçao de alfa-globina expresso foi quantificado por análise de mancha Western usando procedimentos descritos na Secção 6.6 supra.» Observaram-se níveis detectáveis de mutante de delecçao de alfa-globina»

12.0. EXEMPLO..........7:...........CQ-EXPRESSAO................DE................MUTANTE..........DE.........DELECÇAO..........DL

ALFA-GLOBINA.........E.....DE....BETArGLOBINA.....NUMA.LEVEDURA.....POR.....CO-TRANSr

EôBMarAo .12 -1» TRANSFORMAÇftO.....D.A......ES.T.I.RPE....DE.....LEVEDURA... .Sçl.0.41.....COM... pNMrRr Gral

e.....p.NML-V.G“.l

A Scl04i tem o genótipo seguinte: MATa, leu2, ura3-52, trp(d)63, prbl-112, pep4-3, prcl-407, 6AL2+- A estirpe de levedura 8cl041 foi co-transformada com o plasmídeo pNM-R-fâ-al (supra, 11.3) e pNML-V-G-1 (supra. 7-5) usando 0 procedimento da esferop las to (Rose, M» et al», 1939, Methods in Yeast Gerietics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N»Y„, pp» 112-115)»

Para a cultura de partida as células foram desenvolvidas em 500 ml de mexo mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de ãcido láctico, 3% de glicerol, 1% de rafinose e suplementado com 20 mg/1 d© triptofano a 30°C, num balão agitado até à

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6666-008-,1.18 ”67 'tít7^· fase logarítmica. Colheram-se depois as células, lavaram-se com meio isento de leucina e uracilo, contendo 0,67% de base de azoto e levedura, 2% de ãcido láctico e 3% de glicerol, e suplementado com 40 mg/1 de triptofano e usaram-se para inocular 1700 ml do meio isento de leucina e de uracilo, num fermentador Braun Biostat E» 0 pH foi mantido a 5,0; a pG? foi mantida a 30%; a velocidade do agitador foi mantida a 300 rpm, A cultura foi induzida com galactose a uma velocidade de 0,05% por hora» Recolheram-se amostras em determinados intervalos para análise.

.12,2» ANALISE.....DE......M ANCHA.....WESTERN.....D A.... fâ LOB.I. NA .....EXPRESSA.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos da Secção 6,6, Observaram-se níveis detectáveís de globína (0,2% de proteína solúvel).

- 3ANALISE OE... NA NÇ ΗA WESTERN OAS GLOBINAS. ALFA E BETA ....EXPRESSAS.

As globinas alfa e beta expressas foram separadas e quantificadas usando um gel de SOS-poliacriamida a 18%,

As amostras de levedura descongeladas (0,2 g de peso húmido), adicionou-se solução salina tamponada com fosfato (PBS NaCl 0,9 M, fosfato 0,01 M, pH 7,6) (2 ml), Centrifugaram-se as amostras a 4°C durante 10 minutos a 2700 rpm, num equipamento Sorvall RT6000B e decantou-se o sobrenadante» Ao sedimento adicionou-se tampão de disrupção frio (tris 50 mH, EDTA 5 mM, 0,5 mM PMSF, pH 8,0) preparado imediatamente antes do uso (0,2 ml), seguindo-se a adição de pérolas de vidro arrefecidas em gelo, em quantidade suficiente para apenas atingir a superfície superior do liquido» Após a agitação, num sistema de vórtice durante 30 segundos à velocidade máxima, colocaram-se as amostras em gelo durante 5 minutos» Este passo foi repetido duas vezes» A cada amostra adicionou-se tampão de disrupção arrefecido em gelo (1 ml) e transferiu-se o homogeneizado para um tubo Eppendorf» Noutro tubo Eppendorf, combinaram-se 200 μΐ de homogeneizado com 200 μΐ de tampão de amostra 2 X, descontinuo, padrão, recentemente preparado (Laemli, 1970, Nature 227:680-685) e ferveu-se a amostra durante 10 minutos»

499 '5>ί

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--68

„.r

Após centrifugação das amostras durante 10 minutos, carregaram-se as amostras num gel desnaturante descontinuo, com 20 x 18 cm no qual o gel de empacotamento era a acrílamida a 3% e um gel de separação era acrílamida a 18% (Laemli, 1970, Nature 227: 680-685)„ Os geles foram usados a uma corrente constante de 15 mA por gel»

Após a electoforese estar completa e a banda corada ter atingido o fundo do gel de separação, removeram-se os geles da unidade -ue electroforese e colocaram-se as placas em separado sob água corrente desionizada» Descarregou-se o gel de empacotamento e separou-se o gel inferior da placa» Encheu-se a unidade de transferencia com tampão de transferêncía (2 1. de metanol, 30,3 g de base Tris, 144 g de glicina num volume final de 10 1, pH 8,3), e colocaram-se 2 1 do tampão de transferência num recipiente pouco profundo» A sanduíche de transferência, consistindo de gaze de poros largos, papel de mancha 3N, o gel, um pedaço de papel de nitrocelulose, pré-eortado para cobrir apenas o gel, papel de mancha 3M e outro bocado de gaze de poros largos, foi montada sob o tampão no recipiente pouco profundo»

A proteína foi transferida do gel para o papel de nitrocelulose, por aplicação de uma voltagem de 40 V durante 1,5 horas» Após a transferência estar completa, removeu-se a nitrocelulose e colocou-se num recipiente pouco profundo com 50 ml de solução bloqueante [5% (p/v) BSA em PBS]» A membrana de nitrocelulose foi incubada durante uma hora com agitação, após o que se substituiu a solução bloqueante com solução de lavagem C0,l% de Tween 20 (v/v) em PBS)» Realizaram-se três lavagens de 15,5 e 5 minutos» Descarregou-se a solução final de lavagem e adicionaram-se ao recipiente 25 μΐ de anticorpo primário em 25 ml de PBS» Após incubação durante duas horas com agitação, lavou-se a nitrocelulose três vezes (1 x 15 e 2 x 5 minutos)» Descarregou-se a solução de lavagem final e adicionaram-se 2,5 μΐ de anti-corpo secundário em 25 ml de P88, durante uma hora de incubação com agitação» Após 3 lavagens (1 x 15 e 2 x 5 minutos), adicíoriaram~se 5 μΐ de estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano) em 25 ml de PBS, contendo 0,1% de Tween 20 (v/v)» Após uma incubação de 20 minutos com agi-

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6666-008-118

-69i, tação, lavou-se a membrana 3 vezes (1 x 15 e 2 x 5 minutos)» Depois oolooou-se a nitrocelulose em solução de revelação ECL. (químíolumiriescência melhorada) que tinha sido preparada imediatamente antes do uso, por mistura de volumes iguais de reagente de detecção 1 e de reagente de detecção 2 (Amersham)» A membrana foi incubada durante 1 minuto com agitação, removida da solução de revelação, drenou-se o reagente em excesso e depois embrulhou-se a membrana em Saran Wrap» A nitrocelulose embrulhada foi depois exposta a película de raios X durante um período de tempo apropriado» Após a revelação analisou-se a película de raios X usando um densitometro laser e estimou-se ά quantidade de globina em cada amostra, por comparação de padrões de globina eluídos no mesmo gel»

Separaram-se as globirias alfa e beta neste gel por peso molecular» As globínas alfa e beta foram detectadas em extractos de proteína da levedura co-transformada»

12»4 „ ESPECTROS.....SORET.....DA....HENOGLOB.I NA....EM.....LEVEDURA anel porfirina que se encontra na hemoglobina funcional é responsável pela capacidade da molécula em ligar reversivelmente o oxigénio» Adieionaimente, as muitas ligações duplas do anel resultam em a hemoglobina ser capaz de absorver luz na gama de 200 a 600 nm (ultravioleta a visível)» Os comprimentos de onda exactos de absorvância mãxima (i»e» picos) são função de vários factores que incluem a estrutura exacta do anel, a proteína oom a qual o anel estã associado (p„e«, hemoglobina, mioglobina, citocrómos, etc»), diferenças no ambiente próximo do anel numa dada proteína (p»e» HbA_o versus HbAO»_?, etc) e de pequenas moléculas inorgânicas ligadas ao anel (p»e» oxigénio, monóxido de carbono, óxido nítrico, etc)» Os picos de absorvância da hemoglobina na gama dos 415 a 430 nm são particularmente intensos e podem ser usados para detectar a presença da hemoglobina» Esta região é designada por região Soret e as absorvânoías da hemoglobina nesta região são designadas por bandas Soret» A presença de HbA pode ser confirmada pelo desvio na Banda Soret observado quando o C0 elimina 0₂» Neste caso, a banda Soret desvia-se de 415 para 419 nm»

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6666 Ο Ο 81.18

Suspenderam-se as células de levedura em tampão Tris., pH 7,5 a 25'Ό 0 espectro Soret foi analisado inicialmente, seguindo-se a exposição a monoxido de carbono (3-4 minutos) e redução com solução de ditionito (20 mM em tampão saturado com azoto). 0 espectro Soret indicou a absorvãncia na região de 416-418 nM gue é característica da hemoglobina e gue não estã presente em levedura de controlo que não exprime globirias,.

13.0» EXEMPLO........8:...............CO-EXPRESSAO........B.E........UM........MUTANTE........DE.........PELECPAQ........DE.

ALFA~-GLgB.lNA....E.....BETA.-.GL.OB.INA.....USANDO...UM.....PLASMÍDEO.....DE.....CAS3ETTE2.....DUPLA

Construiram-se dois plasmídeos de co-expressão usando a estratégia da cassette dupla. Clonaram-se duas cassettes de expressão separadas, uma contendo o ADN de α-globina humana, contendo uma delecção de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alalina e a outra contendo ADN da β-blobina, em dois sítios únicos num único vector de levedura. Os plasmídeos resultantes pBM-V-Xl-G-αβ (orientação directa) e pBM-V-X2-G-aB (orientação oposta) contêm o ADN de α-globina contendo uma delecção de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina e β-globina sob o controlo de dois promotores separados (idênticos). Transfarmaram-se células de levedura SclllS com o plasmídeo ρ8Μ-ν-Χ2-Θ-αβ, cultivaram-se e induziram-se com galactose. A levedura transformada com esta cassette dupla produziu HbA funcional.

13.1. MATERIAIS

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a ADN-ligase T4 foram obtidas em New England Bíolabs (Biolabs, Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (BM), Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores. 0 ADN de plasmídeo foi isolado a partir de uma cultura de um .litro das células transformadas e purificado por centrifugação em gradiente de CsCl.

13.2. CLONA£ÃO....DE.....P.BM-.Y.-X1.-G-ftê.....e.....pBM-fcX^-Çíta β

A construção do plasmídeo pNML-V-G-l foi realizada como se descreveu na secção 7.5 supra. 0 plasmídeo pNML-V-G-1 contém a cassette” de expressão, o promotor híbrido GAL-10-UAâ-TDH3~3'^J, o gene da β-globina e o terminador ADH.1 (GHBAT) que foi clonado no sítio BamHI do vector de expressão de levedura, YEpl3. 0 plasmí-

499

6666-008-118 «st

-71deo pUC19-GHaGt (Secção 10 „2, supra) contém o mesmo promotor híbrido, o ADN de tx-globina contendo uma delecção de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanína e o terminador G.AL.10» Esta cassette de expressão foi designada por GHaGt»

ADN do plasmídeo pNML-V-G-1 foi digerido com Pyu.ll e o ADN linear foi isolado por electroeluíção e desfosforilado (fragmento .1)» Cortou-se o AON do plasmídeo pUC19-GHaGt com SacI/sp.h.I e isolou-se o fragmento de 1,3 kb resultante, contendo a cassette GHaGt, e preencheram-se as suas extremidades (fragmento 2). Introduziu-se uma ligação entre os fragmentos 1 e 2» Usaram-se células de E»Coli. Sure para transformação e isolaram-se os transformantes em placas de selecção de ampícilina»

Isolou-se o ADN de 48 transformantes por lise alcalina e analisou-se por digestão com enzima ApaLI»

Os clones positivos contendo todos os fragmentos foram ainda analisados por digestões com enzimas de restrição» Os plasmídeos contendo ambas as cassettes de expressão no vector de levedura YEpl3 foram designados por pBM-V-Xl-G-alJ e pBM-V-X2~G-a|J» 0 XI refere-se à orientação segundo a qual ambas as cassettes são transcritas na mesma direcção e X2 refere-se à orientação oposta,,

A Figura 34 descreve a estratégia usada para a clonação da cassette GHaGt num vector de levedura contendo a cassette de expressão GHBAt»

13»3» TPANSFO.RMAQ.ÃO.....DA....ESTIRPE....DE.....LEV.E.D.UR.A.....Sçlll5.....CON.....pBNr.YzXlzG.Z,

-α.β.....e.....pBN.-Y..r.X2rG'.afê.

A Sc.1115 tem o genotipo seguinte: NATa, leu2-3,112; his3-115, Can^R» Transformou-se a estirpe de levedura Sciii5 com o plasmídeo pBM-V-Xl-alJ (lllSXIGalbl) ou pBM-V-X2-a3 (1115X2VGalbl) usando o procedimento de eleotroporação»

Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em 500 ml de meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de ãcido láctico, 3% de glicerol, 1% de rafinose, e

6666-008-118 suplementado com 20 tn^/l de histidina a 30 ^C num balão agitado, até à fase logarítmica., Colheram-se depois as células, lavaram-se com meio isento de leucina contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de ácido láctico e 3% de glicerol, e suplementado com 40 mg/1 de histidina e usaram-se para inocular 1700 ml de meio isento de leucina num fermentador Braun Biostat E. 0 pH foi mantido a 5,0; a pO^ foi mantida a 30%; a velocidade do agitador foi mantida a 300 rpm. A cultura foi induzida com galactose a uma velocidade de 0,05% por hora. Recolheram-se amostras em determinados intervalos para análise.

13.4. ANALISE.....POR.....MANCHA...WESTERN DA.....GLOBINA.....EXPRESSA

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6. Observaram-se níveis detectáveis de globina (1% da proteína solúvel total).

13.5. ANALISE.....POR.....MANCHA....WESTERN....DAS... GLOBINAS.....ALF A... ,E.„ BETA.....EXPRESSAS.

Separaram-se as globinas alfa e beta expressas e quantificaram-®© usando um gel de SOS poliacrilamida a 18% (supra 12.4). Observaram-se níveis detectáveis de ambas as globinas alfa e beta.

ESPECTROS SORET DA HEMOGLOBINA EM LEVEDURA espectro Soret (12.5 supra) indicou absorvãncia na região de 418 nm, que é característica da hemoglobina, e que não está presente na levedura de controlo que não exprime globinas. Detectou-se uma concentração de heme de 5 μΜ.

14.0 „ EXEMPLO.....9:.....CO-EXPRESSÃO.....DE.....MU T AN T E. ...DE.....DELECÇÃO ...DE.....ALF A - GLO BIN.â„JE...G6.MA._va] ...USANDO.....UM PLASMÍDEO.....DE.....CASSETTE......DUPLA.

Construíram-se dois plasmídeos de co-expressão usando a estratégia da cassette dupla. Clonaram-se duas cassettes de expressão separadas, uma contendo o ADN de α-globina humana contendo uma delecção de nucleótidos 34-37 que codifica alfa-12 alanina e a outra contendo ADN da (val)globina em dois sítios únicos num único vector de levedura. Os plasmídeos resultantes pBM-R-X7~Α-α _val (orientação directa) e pBM-R-XS-A-α _va^

499 ....._;·

6666-008-118

-73(orientação oposta) contêm ambos os genes da a-globina e da (vai) globina sob o controlo de dois promotores separados.

14.1. MATERIAIS

As enzimas de restrição, a enzima Klenow e a ADN-ligase T4 foram obtidas em New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (BM). Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores. Isolou-se o ADN de plasmídeo a partir de uma cultura de um litro das células transformadas e purificou-se por centrifugação em gradiente de CsCl.

14.2. CL0NAÇA0...D0S....PLASMWE08.....pBbzBrXZlAza _val....e...pBM_rRcX8lAra _val plasmídeo pNM-R-A-al (Secção 10.4, supra) contém a cassette de expressão, o promotor híbrido ADH.2-UA3-TDH.3-3’, o AON de α-globina contendo uma. delecção de nucleótidos 34-37' que codifica alfa-12 alaninae o termínador G.AE.10 (AHaGt), que foi clonada no sitio Bam.Hl do vector de expressão de levedura, pPM40. A Figura 36 descreve a estratégia usada para a clonação da cassette AH _va|At no plasmídeo da expressão de levedura pNM-R-Α-αΐ. As cassettes duplas resultantes foram designadas por pBM-R-X7~A-a _vaj (orientação directa) e pBM-R-X8-A-a _va| (orientação oposta).

14.2.1. Ç.LÇ.NAÇ.A.O....DO.....PLASMÍDEO.....pUÇlgrAH _val At plasmídeo pl)C19~AH _vaiAt contem o promotopr híbrido A.D.H.2-UAS-TOH.3-3 e o gene da _val~globina e o termínador ADH.» Esta cassette de expressão foi designada por val^A^

14.2.1.1. CO.NS.TR.UÇAO....DO.....plJC19rAHBAt.

fragmento de ADN AD.H.-2-UAS foi gerado por PCR. 0 ADN genómico foi isolado a partir da estirpe de levedura 8173-68. Na Figura 37 mostram-se os iniciadores 5“ e 3’, usados para a sintese do fragmento de ADN ADH.2-UA8„

Isolou-se o fragmento ADH2-UAS resultante (200 pb), por electroeluição e cortou-se com §.aç.I (extremidade 5^a) e com Xbal (extremidade 3’) e clonou-se com pLJC19, cortado com Saci e Xbal. Usou-se a mistura de ligação para transformar células E.»çol.i. com-

6666-008-118 /4— potentes e isolou-se o ADN de 24 transformantes por digestão alcalina. As amostras de ADN dos clones foram analisadas usando as enzimas apropriadas e o plasmídeo resultante foi designado por pUC19-ADH2-UA3. Na Figura 38 mostra-se o mapa deste plasmídeo. 0 AON do plasmídeo pUC19-ADH2-UA8 foi cortado com X.b.a.1/Sph.I. Isolou-se o fragmento de ADN linear (fragmento #1).

A PCR foi realizada usando ADN do plasmídeo piJC19-CíH[JAt, como molde. Na Figura 39 mostram-se os iniciadores 5'’ e 3’ usados paraa síntese da sequência. 0 fragmento de 1,1 kb resultante foi designado por HfcAt (fragmento #2). 0 fragmento de 1,1 kb resultante, contendo TDHS-S^-gene da beta-globina-terminador AOHI. (HfiAt) foi cortado com X.ba.I/Sp..h.I (fragmento #2).

Introduziu-se uma ligação entre os fragmentos #1 e #2. Transformaram-se células E-eoIi. DH5a e o ADN dos transformantes foi analisado usando as enzimas apropriadas. 0 plasmídeo contendo os fragmentos na orientação correcta foi designado por pUC19-AHBAt.

14.2.1.2. C.L.0.NAÇÃO ...DA.....fâAM.A.(,VA.L.).-gLOBINA.....N0.....P.U.Ç19-AHβA,t

Usando os iniciadores apropriados e ADN do plasmídeo YEp51TG, sintetizou-se gama(val)-globina, contendo o terminador ADH, por PCR,, Na Figura 21 mostram-se os iniciadores í/ e 3^S, usados para a síntese da sequência. Cortou-se o fragmento de PCR com ApaLI e Sphl (fragmento #1). Cortou-se o ADN do plasmídeo pUC19 com Saci/ /Spjhl e isolou-se o fragmento de AON linear (fragmento #2). Cortou-se o ADN do plasmídeo pUC19~AH|JAt (14.2.1.1 supra) com ApaLI e Saci, e o fragmento de 360 pb contendo o promotor híbrido AD.H2-UAS-T.D.H.3-3’ foi isolado por electroeluiçâo (fragmento #3).

Introduziu-se uma ligação de três vias entre os três fragmentos anteriores. Para a transformação usaram-se células de F.co.l,.i DHStx.. 0 ADN de 24 transf ormantes foi isolado por digestões alcalinas e analisado por digestões de restrição» 0 plasmídeo resultante, contendo todos os fragmentos na orientação correcta, foi designado por pUC19-AH^_va|At; Na Figura 40 mostra-se o mapa deste plasmídeo-

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6666—0 Ο 8—118

:.......&'

-7514.2.2. CLON AÇ&.Q.....0. A.....'' C A88ETTE.”.....AH. _val A t ... NO.....PLASMÍDEO.....OE... EXPRESSÃO

Pã...k£YEDURA.....RNMzBzAzal

A Figura 36 descreve a estratégia usada para a clonaçao da cassette AH _va]At no plasmídeo de expressão de levedura pNM-R-A-al„

Digeriu-se o ADN do plasmídeo pNM-R-A-al (ver Secção 10 supra) com Pvu.II e isolou-se o ADN linear por electroeluição e desfofo rilou-s© (fragmento 1). Cortou-se o ADN do plasmídeo PUC19-AH _va]At com SacI/8ph.I e isolou-se o fragmento de 1,3 kb resultante, contendo a cassette AH _vaiAt,e preencheram-se as suas extremidades (fragmento 2). Introduziu-se uma ligação entre os fragmentos 1 e 2. Usaram-se células E.coli Sure para transf armação e isolaram-se os transformantes em placas de selecção de ampicilina. Isolou-se o AON de 48 transformantes por li se alcalina e analisou-se por digestão com enzima ApaLI»

Os clones positivos contendo todos os fragmentos foram ainda analisados por digestões com enzimas de restrição. Os plasmídeos contendo ambas as cassettes de expressão no vector de levedura pPM40 (ver Figura 31) foram designados por pBM-R~X7~A-a _va| (orientação directa) e pBM-R-X8-a _vaj_ (orientação oposta).

Transformou-se levedura da. estirpe 8clll3 com plasmídeo pBM-R-X8-A-a _va| (1113x3VQalgVALl) usando o procedimento de esferoplasto. Para a cultura de partida desenvolveram-se as células em 500 ml de meio mínimo contendo 0,67% de base, de azoto de levedura, 2% de ácido láctico, 3% de glicerol, 1% rafinose, e suplementado com 20 mg/1 de histidina a 30X, nutri balão agitado até à fase logarítmica,. Colheram-se depois as células, lavaram-se com meio isento de leucína, contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 2% de ácido láctico e 3% de glicerol, e suplementado com 40 mg/1 de histidina, e usou-se para inocular 1700 ml do meio isento de leucína no fermentador Braun Biostat E, 0 pH foi ajustado a 6,93. Desenvolveu-se a cultura até à exaustão da glucose e recolheram-se amostras entre 1 © 30 horas após a exaustão, para análise» ® « s ?2 499 —38»

6666-008-.118 _β

..-.•gS-.í* .-76- * ⁴

As proteínas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6.6. Detectou-se globina a um nível de 0,03% de proteína solúvel.

15„0„ EXEMPLO.....10.:......EXPRESSÃO.....DE....G.LOB INAS.....VARIANTES.

Os genes da globina mutarite foram clonados no vector de expressão de levedura YEpSINTI. Este vector contem sequências de promotor G.AL.10 e de terminador ADM. Neste vector de expressão de levedura clonaram-se os genes mutantes seguintes:

i.	β-Chíco	(66 Lys->Thr)
í i	β-Rainier	(145 Tyr->Cys)
í i i.	β-Ta Lí	(83 fâly->Cys)
V.	β-Motown	(127 Gln->GIu)
vi.	a-Titusville	(94 Asp->Asn)
v i i	a-104 Ser	(104 Cys->Ser)
vií i»	)-Porto Alegre	(9 Ala->Cys)
ix.	áf-Chíco	(66 Lys->Thr)
X.	5 -Titusville	(94 Asp->Asn)
xi „	β-Mississippi	(44 Ser->Cys)

15.1» MATERIAIS E MÉTODOS

As enzimas de restrição e as enzimas de modificação de ADN foram obtidas em Boehringei—Mannheim, Bethesda Research Laboratories, Perkiri-Elmer ou New England Bíolabs. Todas as enzimas foram usadas de acordo com as especificações dos fornecedores.

Os oligonucleotidos usados na reacção em cadeia com polimerase (POR) foram obtidos por síntese química num síritetizador da ADN da Applied Biosystems 380B.

A estirpe de E.-Coli. usada para todas as transformações bac terianas foi a estirpe DH5a.

15.1.1. ISOLAMENTO... DO.....FRAGMENTO.....O.E......A.O.N

Todos os fragmentos de ADN foram separados num gel de agarose (TBE IX) e isolados por electroeluição usando um electroeluidor Pharmacia.

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6666-008-,11.8 a?

15»1»2. LIGAÇAO.....DE... .AON....E....TRANSEORM AÇ AO.....D.E.....E.,„COL 1.

Todas as ligações de AON foram realizadas usando procedimentos de ligação convencionais (Laboratory Cloriing; A Laboratory Manual; Sambrook, J», Fritsch, E„ F» e Maniatis, T_ eds» Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989, Second Edition pp; l»63i»7i) © a transformação de E»C.ql.í. foi realizada usando procedimentos de transformação convencionais (Laboratory Cloning; A Laboratory Manual; Sambrook, J», Fritsch, E. F» e Maniatis, T» ©ds»; Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989,Second Edition pp; 1„741»84)» Colocaram-se as células transformadas em placas de meio L8 com 100 mg/1 de ampicilina» As placas foram incubadas a 37°C de um dia para o outro» Usaram-se as colónias gue se formaram sobre estas placas para inocular 5,0 ml de meio LB com 100 mg/1 de ampicilina e desenvolveram-se as culturas a 37°C de um dia para o out ro» .15»1»3ANALISE.....DO.... ADN.... DE.....PLASM íDE0.

ADN foi isolado a partir de 1,5 ml da cultura de um dia para o outro, usando o procedimento de lise alcalina» 0 ADN de plasmídeo foi analisado por digestão com as enzimas de restrição apropriadas»

15»1»4» TRANSFORMARÃO.....0E.....LEVEDORA.

A transformação de levedura foi realizada usando os procedimentos publicados (Hinnen, A», Hicks, 3» B» e Eínk, fâ» R» (1978) Transformation in Yeast, Proc» Nat'1» acad» Scí» U»S»A» 75, 1929—1933)»

15„2» SÍNTESE.....DE ....OUGONUCLEÓTIDOS.

Sintetizaram-se vãrios oligonucleótidos como um passo preliminar na construção de várias variantes do gene da beta-globina» Os oligonucleótidos a ser usados no procedimento de mutagenese in vitro, com M13, foram sintetizados e purificados» A electroforese em gel de poliacrilamida, após a quinase, demonstrou que a síntese era eficaz e que os oligonucleótidos estavam prontos para ser usados no sistema M13R-Τ’ ,Α· ~ β* <

Φ

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6666—008”118

78Os olígonucleótidos seguintes Mu-14SCy, Mu-66Th_# & Mu-9Cy foram sintetizados num sintetizador de ADN da Applied Biosystems» As letras a cheio na sequência indicam uma modificação da sequência do gene da beta-globina do tipo selvagem (ver Figura 41)» Após a sintese e incubação a 65°C, os oligonucleótidos foram purificados usando colunas de purificação de oligonucleótidos (ABI)» Os olígonucleótidos purificados foram líofilizados e suspensos em 1Q0 μΐ de água e a concentração foi determinada pelo valor de DCL^q»

Usaram-se aproximadamente 100 ng do ADN sintético numa reacção de guinase para determinar a eficiência da síntese» Os olígonucleótidos de guinase Cíf-^Pj ATP foram analisados nutri gel de sequenciação de acrilamida a 6% contendo ureia 7M» 0 corante usado nesta electroforese era uma mistura de azul de bromofenol e de xino-cinol gue se separa durante o procedimento, possuindo cada corante uma velocidade de migração diferente» A auto-radiografia foi realizada após a secagem do gel»

Após a auto-radiografia do gel de sequenciação, os resultados indicaram que a sintese foi eficaz, uma vez que a maior parte da radioactividade tinha sido incorporada nas bandas mais largas que se moveram: entre as duas frentes de corante» Sob as condições de electroforese que anteriormente se descreveram, os fragmentos que têm aproximadamente 25 bases deverão migrar com a frente de corante azul de bromofenol, enquanto que os que possuem cerca de 90 bases deverão migrar com a frente de corante xino-cinol- Os olígonucleótidos tinham uma dimensão compreendida entre 30 e 45 bases gue deveriam evoluir entre as duas frentes de corante tal como se observou»

15»3„ MUTAGENESE.....IN.....VITRO.

conjunto de mutagenese in.......vitro da Bio Rad proporciona os componentes necessários para a mutagenese com o sistema M13» Neste conjunto incluem-se duas estirpes de E.».çolí. para usar no processo» A estirpe de E».c.o.l.í. CJ236 contém mutações gue resultam na incorporação de uracilo em vez de tímina no ADN» A estirpe de E.,..c.o.Ii. MV1190 é uma estirpe do tipo selvagem que é usada para

-79produzir ADN do cadeia simples após a mutagénese»

15»3»1» ESTIRPES

As estirpes de E.».coli. gue foram recebidas no conjunto de mutagénese foram sub-cultívadas num meio apropriado de acordo com os marcadores genéticos para selecçâo» Os constituintes de cada tipo de meio bem como um protocolo sugerido para a mutagénese podem ser encontrados com a brochura incluída no conjunto de mutagénese (New England BioLabs, M13 Cloníng and Sequencing System - A Laboratory Manual)»

„ 3»2» TRANSFECÇÃO.....0 E ...C J.2.36

As células CJ236 competentes, para uso na transfecção, foram preparadas inoculando 100 ml de caldo LB, contendo cloranfenicol, com 50 ml de uma cultura, de um dia para o outro, de CJ236» A cultura foi incubada a 37°C num agitador arejado até o valor de DO^qo atingir 0,8» As células foram centrífugadas a 3000 rpm durante 5 minutos, ressuspenderam-se em 20 ml de solução de CaC’^ 50 mM, fria, e mantiveram-se em gelo durante 30 minutos» Centrifugaram-se de novo as células e ressuspenderam-se em 4 ml de solução de CaCl₇ 50 mM»

As células CJ236 competentes foram transfectadas com M13mp19BH8 adicionando 1 μΐ ou 5 μΐ de ADN a 0,3 ml de células competentes» Mantiveram-se os tubos em gelo durante 40 minutos, submeteram-se a um choque térmico, a 42⁰C durante 3 minutos e adicionaram-se os conteúdos a 4 ml de ágar de topo (50°C) contendo clorariferiicol e 300 μΐ da cultura, de um dia para o outro, de CJ236» Este ágar de topo, foi vertido sobre placas de meio H contendo cloranfenicol e incubou-se de um dia para o outro a 37°C» 0 fago foi isolado (a partir das células infectadas) tocando a placa com um palito e suspendendo as células assim recolhidas em 0,5 ml de TE»

15»3»3» ISOLAMENTO... DO.....ADN.....CONTENDO. ...URACILO

ADN contendo uracilo foi isolado a partir de CÚ236 inoculando 5 ml de meio LB, contendo cloranfenicol, com 1,0 ml de uma cultura de um dia para o outro de CJ236» A cultura foi incubada a

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6666-008-118

37^0, com agitação, até atingir um valor de DQ&qq de 0,3. Nesta altura, infectou-se a cultura com 50 μΐ de uma cultura de reserva a -70^eC, que tinha sido previamente infectada com o fago, de modo a amplificar a produção de ADN de cadeia simples» Deixou-se a cultura infectada crescer, de um dia para o outro nestas condições» No dia seguinte, centrifugaram-se 30 ml. da cultura a 16 000 rpm durante 15 minutos» Transferiu-se o sobrenadante contendo as partículas de fago para um novo tubo e centrifugou-se uma segunda vez» Tratou-se o sobrenadante desta segunda centrifugação com 150 mg de RNase A, à temperatura ambiente durante 30 minutos» Precipitou-se o ADN de cadeia simples adicionando 7,5 ml de solução de PEG (acetato de amónio 3,5 M, 20% de PEfâ 8000) e manteve-se em gelo durante 30 minutos» Centrifugou-se o tubo e rejeitou-se o sobrenadante- Suspendeu-se o sedimento etn 200 μΐ de tampão de elevado teor em sais (NaCl 300 mM, Tris 100 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM), manteve-se em gelo durante 30 minutos e centrifugou-se numa centrifugadora durante 2 minutos» 0 sobrenadante foi transferido para um novo tubo» fago foi titulado sobre CJ236 e MV1190 para determinar se a infecçâo tinha ou não sido produtiva» Após confirmação da infecçâo produtiva, extraiu-se o ADN com um volume igual de fenol, um volume igual de fenol-clorofórmío e com um volume igual de éter» 0 ADN extraído foi precipitado com um volume 1/10 de acetato de amónio 7,8 M e com 2,5 volumes de etanol, a -20°C, de um dia para o outro» Centrifugou-se o tubo durante 15 minutos e ressuspendeu-se o sedimento em 20 μΐ de TE» Este ADN é o ADN contendo uracilo, de cadeia simples, que foi usado como molde para a síntese da cadeia mutagénica»

1.5»3»4„ QU I.NASE.....DE...OLIGONUCLEÓTXDOS.

Os oligonucleótidos purificados foram quinasados tratando 5 pg de cada um dos seis oligonucleótidos com polinucleótido-quinase T4 e ATP para assegurar a ligação eficiente das duas extremidades da cadeia de AON, recentemente sintetizada»

15.3.5. SÍNTESE.....DA...CADEIA.....MUTAGÉNICA

A síntese da cadeia mutagénica foi realizada adicionando

SrwrsrtSÇAt

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6666-008-118 ~81·'

0,25 pg (0,1 pM) do molde de AON, de cadeia simples, contendo uracilo, e 0,03 pg (3 pM) de cada um dos iniciadores de oligonucleõtido sintéticos» 0 iniciador foi temperado com o molde de cadeia simples (volume final da mistura reaccional, 10 mi) em tampão de têmpera IX (Tris-HCl 2 mN, pH 7,4, MgC^ 0,2 mM, NaCI 5 mM) num banho de água com uma temperatura inicial de 70°C que se deixou arrefecer ate 30*0. Depois, colocaram-se as misturas reaccíonais num banho de água-gelo e, a cada mistura, adicionaram-se os componentes seguintes: 1 pl de tampão de síntese 10X (concentração final 0,4 mM em cada um dos dNTP, ATP 0,75 mM, Tris-HCl 17,5 mM, pH 7,4, MgClg 3,75 mM, DTT 21,5 mM), 1 pl de ADN-ligase T4 (2-5 unidades) e 1 pl de ADN-polímerase T4 (1 unidade)» Incubaram-se as misturas reaccionais em gelo durante 5 minutos de modo a estabilizar o iniciador, por inicio da sintese de ADN sob condições que favorecem a ligação do iniciador ao molde» Depois, incubaram-se as misturas reaccionais a 25°C durante 5 minutos e, finalmente, a 37*0 durante 90 minutos» Após a incubação final, a cada mistura reaccional, adicionaram-se 90 pl de tampão de paragem (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM) e colocaram-se a -20°C até serem usadas na transfecção de MV1190»

15»3»6» TRANSFECÇÃO.....DE....CELULAS ...MV1190

As células MV1190 foram transfectadas com os produtos das reacções de síntese^, adicionando 3 pl e 9 pl de cada mistura reaccional a 0,3 ml de células competentes» Incubaram-se os tubos em gelo durante 90 minutos, submeteram-se a um choque térmico a 42⁰C durante 3 minutos e, depois, colocaram-se em gelo» Adicionararn-se 50 e 100 pl das células transfectadas a tubos, contendo 0,3 ml de uma cultura, de um dia para o outro, de MV1190, 50 pl de X-gal a 2%, 20 pl de IPTG 100 mM e 2,5 ml de ágar de topo (55⁰C)» Agitou-se a mistura num agitador de vórtice e verteu-se sobre placas de ágar H» Incubaram-se as placas, de um dia para o outro a 37^0, e observaram-se, quanto à formação de plaquetas na manhã seguinte» As plaquetas que apareceram azuis não continham o inserido, enquanto que as que apareceram ciaras eram plaquetas com interesse»

15»3»7„ ANALISE.....DE .TRANSF'OR.MANTES.....POR.....SEQUENCIA.ÇA.0

499

6666—Ο Ο8—118

-82'

As plaquetas claras foram recolhidas inserindo uma pipeta de Pasteur esterilizada no ágar e suspendendo a amostra recolhida em 3 μΐ de caldo L8 (de entre cada uma das placas contendo plaquetas escolheram-se 2.4 plaquetas). Adicionaram-se 100 ml de uma cultura, de um dia para o outro, de MV1190 e incubaram-se os tubos, com agitação, de um dia para o outro, a 37°C» Após o período de incubação, isolou-se AON de cadeia simples a partir das culturas e usou-se este ADN em reacçoes de sequenciação.

Realizou-se a sequenciação de didesoxílo para confirmar a presença de mutações, 0 conjunto de sequenciação usado neste caso foi obtido na New England Biolabs, Cada mistura reaccional de sequenciação foi preparada usando 8 μΐ do ADN de cadeia simples a ser sequenciado, 1 μΐ do iniciador apropriado e 1 μΐ de tampão de sequenciação 10X, 0 iniciador foi temperado com o molde de cadeia simples, colocando os tubos a 90°C e deixando-os arrefecer até 30 ^φ0» Em cada mistura reaccional de sequenciação individual, usaram-se 2 μΐ da mistura de ADN-iniciador, conjuntamente com 2 μΐ da mistura de determinação (50 μΐ dos dNTP apropriados e ddNTP mais 5 μΐ de [a~^ô2P]dATP) e com 2 μΐ da enzima Klenow diluída até 0,1 unídades/ml» Incubou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 15 minutos e adicionaram-se 2 μΐ de uma mistura de chase, que consistia de uma mistura de dNTP contendo dATP e enzima Klenow frios. Incubou-se de novo, esta mistura reaccional à temperatura ambiente durante 15 minutos e adicionaram-se 4 μΐ de mistura corante para parar a reacção. Desnaturaram-se as amostras, por ebulição durante 2,5 minutos, e colocaram-se num banho de água-gelo e carregaram-se num gel de sequenciação de políacrilamída a 6% contendo ureia 7 M» Processou-se o gel a 55 watt durante, aproximadamente, 4 horas antes de ser seco sob vácuo e colocado numa oassette de filme de raios-X para auto-radiografia.

Usaram-se outros conjuntos de sequenciação para obter os melhores resultados conjuntamente com Ca^Sj dATP, Um conjunto de sequenciação, especificamente, para uso com ADN de cadeia simples, foi obtido da 1B1 e usou-se um conjunto Pharmacia com ADN-polímeras© T7 em vez da enzima Klenow de modo a sequenciar os •'3®*

V

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6666—008—118

Χχ......

,7 mutantes para alem do ponto da têmpera oom o iniciador»

A transfecção de MV1190 com os produtos da reacção de síntese resultaram em plaquetas claras sobre as placas contendo AON Mu66Th, Mu66Th67I e Mul45Cy, Mu40Th, e Mu66Ty» 0 controlo que foi incluído consistia de uma transfecção com AON molde sem um iniciador para síntese da segunda cadeia» Este controlo revelou algumas plaquetas, mas em menor número do que quando se usou um iniciador para mutagénese»

15»4» CONSTPU.ÇÃO....DO.....PLASMÍDEO.....YEpSINTI

Modificou-se o vector de vaivém de levedura YEpSl de modo a ter sequências de terminador AON» 0 terminador AON foi inserido entre o promotor GAL10 e o 2 μ presentes neste vector» Especifícamente, digeriu-se o plasmídeo YEpSl com a enzima de restrição Bcl 1» A molécula de ADN linearizada foi tratada com enzima Klenow e com dNTP de modo a preencher as suas extremidades» Ao plasmídeo de extremidades preenchidas ligou-se um oligonucleótido de cadeia dupla» Este oligonucleótido foi obtido de BRL e continha sequências para a enzima de restrição Notl. A ligação foi realizada de um dia para o outro à temperatura ambiente» 0 ADN da mistura reaccional de ligação foi precipitado usando polietilenoglicol (PEG), Este procedimento remove todos os oligonucleótidos nao ligados, uma vez que apenas as grandes moléculas de ADN são precipitadas com PEG» Após a precipitação com PEG, limpou-se o ADN por extracção com feriol e precipitação com etanol» Digeriu-se o ADN de plasmídeo com Notl e HindiII» terminador ADH foi obtido a partir do plasmídeo AAH5 (ver figura 8)» Digeriu-se o plasmídeo AAHS com a enzima de restrição BamHl» Preericheram-se as extremidades do ADN com enzima Klenow e com dNTP» Submeteu-se o ADN de extremidades preenchidas a extracção com fenol e precipitação com etanol» Ligou-se o oligonucleótido de cadeia dupla, anteriormente referido, ao plasmídeo de extremidades preenchidas» A ligação foi realizada de um dia para o outro â temperatura ambiente» 0 ADN resultante da ligação foi precipitado usando polietilenoglicol (PEG)„ Após a precipitação com PEG, limpou-se o ADN por extracção com fenol e precipitação

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6666-008-118

. ..............«........«a·’

-84- .i com etanol. Depois digeriu-se o ADN com as enzimas de restrição Notl e HindiII. Isolou-se um fragmento N.ot.I-HindiII de 400 pb a partir de um gel de agarose a 1,0% (TBE IX). 0 ADN foi electroeluído a partir da fatia de agarose e precipitado com etanol. Ligou-se este fragmento de ADN purificado ao plasmídeo anteriormente referido. Usou-se a mistura de ligação para transformar célululas DH5a« Espalharam-se as células transformadas sobre placas contendo meio LB com 100 mg/1 de ampicilina. Incubaram-se as placas de um dia para o outro a 37°C. Usaram-se as colónias que apareceram sobre estas placas para inocular 5 ml de meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. Desenvolveram-se as culturas a 37°C de um dia para o outro. 0 ADN foi isolado a partir de 1,5 ml. da cultura de um dia para o outro usando o procedimento de lise alcalina. Digeriu-se o AON de plasmídeo com as enzimas de restrição Notl & Hin.dIII. Na Figura 42 mostra-se o plasmídeo resultante designado por YEpSINTI.

15.5 „ CLONAÇÃO ...DE.....G LO B. IN AS.... V A R IA NTES vector para a clonação do(s) gene(s) da β-globina mutado (s) foi preparado por digestão dos plasmideos YEP51T/0 (Secção 8.4, supra) ou YEp51NTl/^~Port (15.5.5, infra) com Sall e Hin„dlll. 0 vector para clonação do gene da ^-globina foi o YEpSINTI., Esta digestão resulta em dois fragmentos (7300 e 500 pb)s isolou-se o fragmento de 7300 pb.

15.5.1, CLONAÇÃO,...00.....GENE...OA.....B-GLOBlNA.....ÇHIÇO......(.Ly.s.....6ó.....->.....T h.r.)..

A β-globina Chico foi criada por mutagénese dirigida a sítios (supra, 15.2 e 15.3). Digeriu-se o gene da β-globina mutado com as enzimas de restrição Sall e HindlII, Isolou-se um fragmento de 600 pb. Este fragmento de 600 pb, purificado, foi ligado ao vector YEpSINTI/y-Port. A ligação de ADN, a transformação de © o isolamento do ADN foram realizadas como se descreveu (15,1, supra). Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas com as enzimas de restrição PstI e EcoRl. Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram que a maior parte dos clones analisados possuiam os fragmentos esperados (dois fragmentos quando digeridos com PstI e três fragmentos quando digeridos com EcoRl). Este plasmídeo foi designado por ρΝΤΙ/β-ChiΦ

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6666-008-118 ~·85~

CO Η

15.5,, 2. CLQNA.ÇAO...DO.....GENE... DA.....BrGLOBIΝΑ.....RAINIER......LLyr.... 165... ->Cys.)..

A β-globina Rainier foi criada por uma mutagénese digerida a sítios (supra, 15.2 e 15.3). Digeriu-se o gene da β-globina, mutado, com as enzimas de restrição Sal.I e Hindi11. Isolou-se um fragmento de 600 pb. Este fragmento de 600 pb, purificado, foi ligado ao vector YEp51NTl/ -Port. A ligação de AON, a transformação de Ê.OQ.1.Í e o isolamento do ADN foram realizadas como se descreveu (15.1, supra). Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas, com as enzimas de restrição PstI e EçoRI. Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram que a maior parte dos clones analisados possuíam os fragmentos esperados (dois fragmentos quando digeridos com PstI e três fragmentos quanto digeridos com EcoRI). Este plasmídeo foi designado por ρΝΤΙ/β-Ran.

15.5.3 CLONAÇ&Q J)0.....GENE... DA.....β-GLOBINA.....TA... LI.......(Giy 83.....->.....Cys.)..

A β-globina Ta Li foi criada por uma substituição de base usando PCR. 0 gene da globina foi isolado na forma de dois fragmentos. A extremidade 5* do gene (Sal.I e BamHI) foi obtida por PCR,, Na Figura 43 mostram-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para a s ί n tese da sequêri ci a.

Digeriu-se o fragmento mutado do gene da β-globina com Sal.I e BamHI. Este fragmento de ADN digerido foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol. A extremidade 3’ do gene de β-globina foi isolada a partir do plasmídeo mplSBHS. 0 plasmídeo mplSlàHS foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e HindlII. Isolou-se um fragmento de 300 pb. Ligou-se este fragmento de 300 pb purificado, conjuntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEp51NTl/ -Port. A ligação de ADN, a transformação de E.C.O.1Í e o isolamento de AON foram realizados como se descreveu (15.1, supra.). Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição PstI. Os resultados obtidos a partir destas análises mostraram que a maior parte dos clones analisados possuíam os fragmentos esperados (dois fragmentos quando digeridos com PstI três fragmentos a partir do

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vector sem inserido)» Este plasmídeo foi designado por pNTl/B-Ta LiS»

15»5»4» CLONAÇÃO.... DO.....GENE... DA.....li-GLOB I.NA.....MOTOWN.....(Gin.....127.....->.....Glu.)..

A β-Globina Motown foi criada por uma substituição de base usando PCR» 0 gene da globina foi isolado na forma de dois fragmentos» A extremidade 3’ do gene (EcoRI-HindiII) foi obtida por PCR» NA Figura 44 mostram-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para a sintese da sequência»

Digeriu-se o fragmento mutado do gene da B-globiria» obtido por PCR, com Eço.RI e HindIIl» Este fragmento de ADN digerido (80 pb) foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol» A extremidade 5’ do gene da β-globina foi isolada a partir do plasmídeo YEp51T/NAT (7„4, supra.)» 0 plasmídeo YEp51T/NAT foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e HindIIl» Isolou-se um fragmento de 360 pb» Lígou-se este fragmento de 360 pb, purificado, conjuntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEp51NTl/y-Port cortado com Sal..I & HindIIl» A ligaçao de ADN, a transformação de E,coli e o isolamento de ADN foram realizados como se descreveu (15»1, supra)» Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição PstI„ Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram gue a maior parte dos clones analisados possuíam os fragmentos esperados (dois fragmentos guando digeridos com PstI 5 três fragmentos a partir do vector sem o inserido). Este plasmídeo foi designado por pNTl/fà-Mot» .15.5,5» CLONAÇÃO .....DO.....G ENE .....DA.....a-GLOBINA.....TITUSVILLE......(. A sp.....9.5>,A s.n.)..

A «.-globina Titusville foi criada substituindo uma base no gene de α-globina natural usando PCR» 0 gene da α-globína foi isolado na forma de dois fragmentos» A extremidade 3’ do gene (HindIIl-HindiII) foi obtida por PCR usando o plasmídeo pl9AlGT como molde» Na Figura 45 mostram-se o iniciador 5’ e o iniciador S'³ usados para a POR»

Digeriu-se o fragmento mutado do gene da α-globina com Hind.III» Este fragmento de ADN digerido foi purificado por extracção

Φ

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com fenol e precipitação com etanol- A extremidade 5’ do gene da α-globina foi isolada a partir do plasmídeo pl9Al.GT (10.2.2, supra). 0 plasmídeo pl9AlGT foi digerido com as enzimas de restrição Sall e HindIII- Isolou-se um fragmento de 300 pb- Ligou-se este fragmento de 300 pb, purificado, conjuntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEpSINTI cortado com Sall e HindIII- A ligação de ADN, a transformação de E-çolí e o isolamento de ADN foram realizados como se descreveu (15.1, supra). Digeriu-se o AON, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição HindiI- Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram gue um clone possuía os fragmentos esperados (cinco fragmentos quanto digeridos com Hindll)- Este plasmídeo foi. designado por pNTl/aTit15.5.6. CL0NA.ÇÃ0....D.0.....GENE DA.....a-.GLOBINA.....104,-S.er......(.ÇY,s...,l,04....-> Ser.)..

A α-globina 104-Ser foi criada substituindo uma base no gene da α-globina natural usando PCR. 0 gene da α-globína foi isolado ria forma de dois fragmentos. A extremidade 3’ do gene (HindiII-Hi.n.dlII) foi obtida por PCR usando o plasmídeo pl.9AlGT (supra, 10-2-2) como molde,. Na Figura 46 mostram-se os iniciadores 5 e 3“ usados para a síntese da sequência»

Digeriu-se o fragmento mu tado do gene da α-globína com Hí.n.dIII. Este fragmento de ADN digerido foi purificado com extracção com fenol e precipitação com etanol- A extremidade 5’ do gene da α-globina foi isolada a partir do plasmídeo pl.9AlGT (10-2-2, suBfâ) · 0 plasmídeo pl9AlGT foi. digerido com as enzimas de restrição S.a..l..I e HindIII- Isolou-se um fragmento de 300 pb- Lígou-se este fragmento de 300 pb, purificado, conjuntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEp51NTl cortado com Sall e Hind.III- A ligação do ADN, a transf ormação de E-cpli. e o isolamento de ADN foram realizadas como se descreveu (15-1, supra.)- Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas com a enzima de restrição Hindll- Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram que um clone possuia os fragmentos esperados (cinco fragmentos quando digeridos com Hindll)- Este plasmídeo foi designado por pNTl/alO43φ

499 *

6666—008—118 •-8815.5.7. ÇLONAÇAO....DO.....GE.NE......D.A...../-GEOBINA.....PORTO.....ALEGRE.......(.9.....Ala.....~>.....Çys)..

A ^-globina Porto Alegre foi criada substituindo duas bases na sequência da /-globina natural usando PCR» 0 gene da ^globina foi obtido na forma de um fragmento de 450 pb» Na Figura 47 mostram-se os iniciadores 5“ e 3’ usados para a síntese da sequência»

Digeriu-se o gene da ^/-globina mutado, obtido por PCR, com 8a.l.l e HindlII» Este fragmento de ADN digerido (450 pb) foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol» Lígou-se este fragmento de 450 pb purificado, obtido por PCR, ao vector VEpSINTI cortado com Sa.l.I e HindiII» A ligação de ADN, a transformação de E-colí. © o isolamento de ADN foram realizados como se descreveu (15-1 supra)» Digeriu-se o AON, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição PstI» Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram clones que possuíam os fragmentos esperados (três fragmentos quando digeridos com Pstl; dois fragmentos a partir do vector sem inserido)» Este plasmídeo foi designado por YEp51NTl//-Port»

15.5.8. CLONAÇAO....DO.....GENE ...DA....../-GLOBINA.....CHICO......(66Lys..->Thr.)..

A /-globina Chico foi criada substituindo uma base no gene da /-globina natural usando PCR» 0 gene da /-globina foi isolado na forma de dois fragmentos» A extremidade 5’ do gene (Sall-Xcml) foi obtida por PCR usando o plasmídeo como molde» Na Figura 48 mostram-se os iniciadores 5’ © 3^S usados para a síntese de sequência»

Digeriu-se o fragmento mutado do gene da /-globina com Sa.l.I e Este fragmento de ADN digerido (230 pb) foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol» A extremidade 3^:‘ do gene da /-globina foi isolada a partir do plasmídeo YEp51NTl//~Port.Q plasmídeo YEp51NTl//-Port foi digerido com as enzimas de restrição Xçm.I e HindlII» Isolou-se um fragmento de 220 pb» Lígou-se este fragmento de 220 pb, purificado, conjuntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEpSINTI cortado com Sa.1.1 e HindlII» A ligação de ADN, a transformação com E.»ç.ol.í. e o isolamento com ADN foram realizados como se descreveu (15-1, supra.)» Digeriu-se o AON, isolado a partir das células transforma72 499

6666-008-118 das, com enzima de restrição Pstl. Os resultados obtidos a par tir desta análise mostraram que um clone esperados (três fragmentos quando digerido mentos a partir do vector sem inserido). E signado por pNTl/ -Chi., possuia os fragmentos com Pstls dois fragste plasmídeo foi de15.5.9. CLONAÇÃO..DO.....QENE.JDA.........zGL.0BI.MA.....TITUSVILLE.....( Asp.....94Asn)..

A -globína 94 Asn foi criada substituindo uma base no gene da -giobina natural, usando PCR. 0 gene da -globína foi isolado na forma de dois fragmentos. Ambos os fragmentos foram obtidos por PCR. A extremidade 5’ do gene (SalI-BstEII) foi obtida por PCR usando o plasmídeo 4p7-7 como molde. Na Figura 49 mostram-se os iniciadores

K. -¹ e 3' usados para síntese da sequência.

A extremidade 3’ do gene (BstEil-HíndllI) foi obtida por PCR usando o plasmídeo 4p7-7 como molde. Na figura 50 mostram-se os iniciadores 5’ e 3’ usados para a sintese da sequência.

Digeriu-se um fragmento mutado do gene da -giobina, obtida por PCR, com Sall e BstEIl. Este fragmento de ADN digerido (330 pb) foi purificado por extracção com fenol e purificação com etanol, A extremidade 3’’ do gene da -giobina, obtida por PCR, foi digerida com as enzimas de restrição BstEIl e HindlII. Isolou-se um fragmento de 100 pb. Ligaram-se os fragmentos purificados (330 e 100 pb) ao vector YEpSINTI cortado com S.a.1.1 e HindlII. A ligação de ADN, a transformação de E.eol.í. e o isolamento de ADN foram realizados como se descreveu (15.1, supra). Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição Hindi1. Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram gue um clone possuia os fragmentos esperados (cinco fragmentos guando digeridos com Hindll). Este fragmento foi designado por pNTl/Z9SAn.

15.5.10, CLONAÇÃO....DO.....GENE...DA.....B™GLOB1NA.....MISSISSIPPI......(SfôR...44.....->Cys.).

A β-globina Mississippi foi criada substituindo duas bases no gene da β-globina natural usando POR. 0 gene da β-globína foi isolado na forma de dois fragmentos. A extremidade 3’ do gene (A.ç.cl-HindlII) foi obtida por PCR. Na Figura 51 mostram-se os

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iniciadores usados para PCR»

Digeriu-se o fragmento mutado do gene da β-globína com Açç.I o HindIII» Este fragmento de ADN digerido foi purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol» A extremidade 5’ do gene da β-globína foi isolado a partir do plasmídeo YEp51T/NAT (7..4, supra)» 0 plasmídeo YEpSIT/NAT foi digerido com as enzimas de restrição Açcl e Sal I» Isolou-se um fragmento de 117 pb. Ligou-se este fragmento purificado, de 117 pb, cori juntamente com o fragmento obtido por PCR, ao vector YEp51NTl/B-Port» A ligação de ADN, a transformação de E..»çol.í e o isolamento de ADN foram realizados como se descreveu (15.1, supra). Digeriu-se o ADN, isolado a partir das células transformadas, com a enzima de restrição Pstl. Os resultados obtidos a partir desta análise mostraram gue a maior parte dos clones analisados possuía os fragmentos esperados (dois fragmentos quando digeridos com Pstl; três fragmentos a partir do vector sem inserido). Este plasmídeo foi designado por ρΝΤΙ/β-Miss»

15.6» EXPRESSÃO.....DE...GLOBÍNAS.....VARIANTES

15.6.1. ΕXPRESSÃO.... D E... ΒΕ T. A - G L08.1N A.....T a Li.....EM.....LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo ρΝΤΙ/β-TaLiS usando electroporaçâo» Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose, e suplementado com 20 mg/1 de, cada urn, de adenina, histidina, uracilo e tríptofano, a 30°C, num balão agitado, até â. fase logarítmica. Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ácido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tweeri 80 e suplementado com 20 mg/1 de, cada um, de adenina, histidina, uracilo e tríptofano, A incubação foi realizada a 30OS com agitação. A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%. Na indução ajustou-se o pH a 7,03 com KH2PQ4 e adicionou-se hemina até uma concentração final de 40 pg/ml» Recolheram-se amostras entre duas e 50 horas após a indução»

As globínas expressas foram quantificadas por análise de

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mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6,,6,, A globina detectada era 0,4% da proteína solúvel.

15.6.2. EXPRISSSO.....OA....ALFA-0LOB IN A.....TI TUSVI LLE....EM.....LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo pNTl/aTít usando electroporação. Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenína, histidina, uracílo e triptofano a 30 X, num balão agitado, ate à fase logarítmica» Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml. de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ãcido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tween-80 e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenína, histidina, uracílo e triptofano» A incubação foi realizada a 30*0 com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%. Na indução, ajustou-se o pH a 6,93 com KH^PO^ e adicionou-se hemina até uma concentração final de 40 pg/ml» Recolheram-se amostras entre duas e oito horas após a indução»

As proteínas expressas foram quantificadas por anãlise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção

6.6. Detectaram-se globinas nas amostras colhidas, quatro a seis horas após a indução (0,01-0,04% da proteína)»

15.6.3. EXPRESSÃO.....D A ...ALF A-GLOBINA.....SER IN A.... 104 ...EM.....LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo pNTl/alO4S usando electroporação. Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenína, histidina, uracílo e triptofano, a 30 ⁰C, num baião agitado, até à fase logarítmica» Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto, 3% de glicerol, 2% de ácido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tween 80 e suplementado com 20 mg/1 de cada um de aderiina, histidina, uracílo e triptofano» A incubação foi realizada a 30^<kC com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%» Na indução, ajustou-se o pH a 6,82 o

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-92™

com KH2PO4 e adícíonou-se hemina até uma concentração final, de 40 pg/ml. Recolheram-se amostras entre uma e 30 horas após a indução»

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6.6» Recolheram-se amostras entre uma e 30 horas após a indução» A globina detectada era 0,1% da proteína solúvel»

15.6-4» EXPRESSÃO.....DA....G AM A._ZGL OBIN A.....PORTO.....ALEGRE ....EM.....LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Sclll4 com o plasmídeo

YEp51NTl/Port usando eleotroporação» Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafínose e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracílo e tríptofano, a 30°0, num balão agitado até à fase logarítmica» Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ácido láctico, 1% de rafínose, 0,4% de Tween-80 e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracílo e tríptofano» A incubação foi realizada a 30°C com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%» Na indução, ajustou-se o pH a 7,03 com KHgPO^. e adicionou-se hemína até uma concentração final de 40 pg/ml» Recolheram-se amostras entre duas e 27 horas após a indução»

As globínas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6-6» Todas as amostras continham níveis detectáveis de globina (0,1-1,3%)»

15.6.5» EXPRESSÃO.....P A......G AM A.-G LOB.I N A.....CHI .0.0.....EM ...LEVEDURA.

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo pNTl/y-Chi usando electroporação» Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafínose, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracílo e tríptofano, a 30*0 num balão agitado até à fase logarítmica» Usou-se a cultura de

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6 6 6 ·~ Ο Ο 8—118 '93

partida para inocular 500 ml. de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ãcido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tweeri-80, e suplementado com 20 mg/Ί de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano, A incubação foi realizada a 30**C com agitação, A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%, Na indução, ajustou-se o pH a 7,06 com KH₂P0₄ e adicionou-se hemina até uma concentração final de 40 pg/ml. Recolheram-se amostras entre duas e oito horas após a indução.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos gue se descrevem na Secção

6,6, Detectou-se globina, espectro de diferença de monóxido de carbono de visivel, das células de levedura inteiras, © gerado usando um procedimento adaptado dos métodos de Springer e Slager (1987, Proc, Natl» Acad» Sei» U.S.A. 84:8961), Prepararam-se aproximadamente 1,2 ml de suspensão de levedura com uma 0,0, final a 600 nm de cerca de 2,0, usando P0₄ 0,1 mM, pH 7,0, como tampão» Depois, reduz-se a suspensão com um pequeno volume de ditioriito de sódio, agita-se num agitador de vórtice, e deixa-se em repouso durante um minuto» Depois, retira-se 1 ml e coloca-se numa cuvette de pequeno volume, a todo o comprimento» Usa-se esta suspensão como linha de base para um varrimento num espectrofotómetro registador Beckman DU-70, de feixe simples, entre 400 e 500 nm» Depois, remove-se a cuvette e faz-se borbulhar, na suspensão, monóxido de carbono (CO), isento de oxigénio, de um modo constante mas nao vigoroso. Mistura-se a suspensão agitando gentilmente durante um minuto e traça-se o espectro entre 400 e 500 nm» Por fim, mede-se o valor da D„0» a 600 nm no mesmo instrumento.

Se está presente hemoglobina, o espectro de diferença produzira um pico a cerca de 420 nm e um vale a cerca de 435 nm» Um único pico a 420 nm não indica a presença de hemoglobina.

Nesta estirpe detectou-se, por este método, hemoglobina funcional „ <499

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15»6»6EXPRESSâO.....DA. BETA-GLOBINA.....MISSISSIPPI.....EM ...LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com o plasmídeo pNTi/í?>-Miss usando electroporação» Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio miriirno contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano, a 30*C„ num balão agitado, até à fase logarítmica. Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glieerol, 2% de ãcido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tween-80, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano» A incubação foi realizada a 30°C com agitação. A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%. Na indução, ajustou-se o pH a 7,06 com KH2PO4 © adicionou-se hemína até uma concentração final de 40 pg/ml. Recolheram-se amostras entre duas e 50 horas após a indução.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção

6.6. A globina detectada era 0,4% da proteína solúvel»

15»6»7„ EXPRESSÃO.....DA... BE.ΪAyGLOBINA.....RAINI ER.....EM. LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura Scl090 com o plasmídeo pNTl/fà-Ran usando electroporação. Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano, a 30°0, num balão agitado, até à. fase logarítmica» Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glieerol, 2% de ácido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tween-80, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano» A incubação foi realizada a 30°C com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%» Na indução ajustou-se o pH a 7,06 com KH2PO4. e adicionou-se hemína até uma concentração final de 40 pg/ml» Recolheram-se amostras entre duas e 50 horas após a indução.

Φ

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As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção

6.6. A globina detectada era 0,4% da proteína solúvel.

15.6.8. EXPRESSÃO.....DA... BETA.....S.L.0.B.I.N.A.....MQTGWN... EM.....LEVEDURA

Transformou-se a estirpe de levedura 3c340 com o plasmídeo ρΝΤΙ/β-Mot usando electroporação- Para a cultura de partida, desenvolveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafínose, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano, a 30*0, num balão agitado, até á fase logarítmica. Usou-se a cultura de partida para inocular 500 tni de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ãcido láctico, 1% de rafínose, 0,4% de Tween-80, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de aderiina, histidina, uracilo e triptofano» A incubação foi realizada a 30^φ0 com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%» Na indução, ajustou-se o pH a 7,06 com KH2PO4 © adicionou-se hemíria até uma concentração final de 40 pg/ml, Recolheram-se amostras entre duas e 8 horas após a indução.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6,6» A globina detectada era 0,1% da proteína solúvel» . EXEMPLO.........11: Ç0-EXPRESSÃO..............DE..............UM........MUTANTE........DE.........DELECÇÂO........DE

AL.FA.-G.LOB.INA..........E.....DA.....GAMA-G.LOB..INA.....EM. LEVEDURA.,......POR.....C.O.-.T.R.A.NSFORMAÇÃO.

16.1. MATERIAIS.....E.....MÉTODOS.

Usou-se a estirpe de levedura 8c340, Cultivaram-se as células de levedura em 500 ml de caldo YEPD com agitação vigorosa, a 30^OC, até um valor de 0,0. de 1,3-1,5, Recolheram-se as células de uma cultura de 500 ml, por centrifugação, a 5000 rpm durante 5 minutos, a 4°C» As células e o rotor estiveram sempre mantidos a frio» Lavaram-se as células 2X com água destilada, esterilizada, fria, e recolheram-se por centrifugação a 4°C» Ressuspenderam-se as células em 20 ml de sorbitol 1 M arrefecido em gelo e mistura-

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6666-008-118 ram-se por pipetagem» Recolheram-se as células o ressuspenderam-se num volume final de 0,5-1 ml de sorbítol (1 M) arrefecido em gelo»

Para a electroporação usou-se um equipamento Biorad (Richmond, CA) Gene Pulser com um controlador de impulsos» As cuvettes de 0,2 cm foram obtidas na Biorad» Transferirarn-se 40 pl de células de levedura para um tubo Eppendorf esterilizado» As células adicionou-se ADN (1-100 ng) em 5 pl de TE» Incubou-se a mistura em gelo durante 5 minutos, transferiu-se para uma cuvette de 0,2 cm e submeteu-se a um impulso a 1,5 kV, 25 pF, 200 ohm, durante 5 msegundos» A cuvette¹’ adicionaram-se, imediatamente, 250 pl de sorbítol 1 M frio, misturou-se gentilmente o conteúdo e colocaram-se as células sobre as placas apropriadas»

16»2» TRANSFORMAÇÃO......DA....ESX1RPE....0E.....LEVEDURA.....8ç340.....C0M. ...pNM-R-Gzal.....E

YFp51T/G

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 com os plasmídeos pNM-R-G-al (11.3, supra) e YEp51T/G (8»4,supra.) usando electroporação»

ANALISE DE MANCHA WESTERN. DA .GLOBINA. ..EXPRESSA.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6„6 (0,4% da proteína solúvel)»

16.4. D.ETEÇÇ.A.O..,...DE.....HEMOGLOBINA.....EM....LEVEDUR.A.....POR.....E3PE0TR0....DE.....DIFERENÇA.....DE....MONÓXIDO.....DE... CARBONO espectro de diferença de monóxido de carbono de visível, das células de levedura inteiras, é gerado usando um procedimento adaptado dos métodos de Springer e Slager (1987, Proc. Natl. Acad» Sei» U»S»A» 84:8961)» Preparam-se aproximadamente 1,2 ml. de suspensão de levedura, com uma 0»0» final a 600 nm de cerca de 2,0, usando PO4 0,1 mM pH 7,0, como tampão» Depois, reduz-se a suspensão com um pequeno volume de dítíoníto de sódio, agita-se num agitador de vórtice e deixa-se em repouso durante um minuto» Depois, retira-se 1 ml e coloca-se numa cuvette de pequeno volume, a todo o comprimento» Usa-se esta suspensão como linha de

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-97base para um varrimento num espectrofotómetro registador Beckman DU-7O de feixe simples, entre 400 e 500 nm» Depois, remove-se a cuvette e faz-se borbulhar, na suspensão, moriõxído de carbono (CO), isento de oxigénio, de um modo constante mas não vigoroso durante 2 minutos. Mistura-se a suspensão, agitando gentílmente durante um minuto e traça-se o espectro entre 400 e 500 nm. Por fim, mede-se o valor de D.O» a 600 nm no mesmo instrumento.

Se estã presente hemoglobina, o espectro de diferença produzirá um pico a cerca de 420 nm e um vale a cerca de 435 nm. Um único pico a 420 nm não indica a presença de hemoglobina»

Neste estirpe detectou-se, por este método, hemoglobina funcional (heme 10 μΜ)»

- EXEMPLO 1.2..: COyEX PRE 8 8.A.Q. DE MU T AN T E DE DEL EÇÇ AO DE ALE Ay GL 0-

B.INA... E....DA.....QAMA_va-|2.GL0BlNA EM....LEVEDURA.....POR.....ÇO-TRANSEORMAÇAO

17.1» MATERIAIS.....E.....MÉTODOS.

Usou-se a estirpe de levedura 8clll3» Cultivaram-se as células de levedura em 500 ml de caldo YEPD com agitação vigorosa a 30^0 até uma D.O» de 1,3-1,5. Recolheram-se as células de uma cultura de SOO ml, por centrifugação a 5000 rpm durante 5 minutos a 4’C. As células e o rotor estiveram sempre mantidos a frio» Lavaram-se as células 2X com água destilada, esterilizada, fria, e recolheram-se por centrifugação a 4°C„ Ressuspenderam-se as células em 20 ml de sorbitol 1M arrefecido em gelo e misturaram-se por pipetagem. Recolheram-se as células e ressuspenderam-se num volume final de 0,5-1 ml. de sorbitol (1M) arrefecido em gelo»

Para a electroporação usou-se um equipamento Biorad (Richmond, CA) Gene Pulser com um controlador de impulsos» As cuvettes de 0,2 cm foram obtidas na Biorad» Transferiram-se 40 μΐ de células de levedura para um tubo Eppendorf esterilizado» As células adicionou-se ADN (1-100 ng) em 5 μΐ de TE» Incubou-se a mistura em gelo durante 5 minutos, transferiu-se para uma cuvette de 0,2 cm e submeteu-se a um impulso a 1,5 kV, 25 μΕ, 200 ohm, durante 5 rnsegurido» A cuvette adicionaram-se imedíatamerite 250 μΐ de sorbitol 1M frio, misturou-se gentilmente o conteúdo e colocaram-se as células sobre as placas apropriadas»

499

666—008—11 8

17.2. TRANSFORMAÇÃO.....DAS.....ESTIRPES....DE.....LEVEDURA....Sç.1113.....E.....Sç340.....COM.

I:?HM'· R-jÇ-.n.l ...E ...pNMzSrG- _va j 1.

T r a n s f o r ι n o u - s e a estirpe d e 1 e v e d u r a S c 1113 c o m o s pia s m í d e o s p Ν M - R - 0 - a 1 (11.3, supra) e p Ν M - 5 - fâ - _{v s} -j 1 ( 9.4, supra) , u s and o e1ectroporação.

17.3. ANALISE.....DE .....MANCHA.....WESTERN.....0 A... GLOBINA ...EXPRESS A.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6 (0,1% da proteína solúvel)

17.4. ESPECTRO ...SORET.. DA.....HEMOGLOBINA.....E.M.... LEVE DURA.

espectro Soret indicou absorvância na região de 418 nm que é característica da hemoglobina e que não está presente em levedura de controlo que não exprime globinas.

. EXEMPLO...............13:..........CQ-EXPRESSfiQ.........DE.........UM.........MUTANTE.........DE.........DE.LECÇAO.........DE.

ALFA-GLO.B.I.NA....E....DA.....BETA-GLOB.INA....PORTO....ALEGRE.........EM.........LEVEDURA.....POR.

COrTRANSFORMAUAQ

18.1. MATERIAIS.....E.....MÉTODOS

Usou-se a estirpe de levedura Scl040. Cultivaram-se as células de levedura em 500 ml de caldo YEPD com agitação vigorosa a 30 ⁰C até uma D.O. de 1,3-1,5. Recolheram-se as células de uma cultura de 500 ml por centrifugação a 5000 rpm durante 5 minutos a 4°C„ As células e o rotor estiveram sempre mantidos frios. Lavaram-se as células 2X com água destilada esterilizada fria e recolheram-se por centrifugação a 4⁰C. Ressuspenderam-s© as células em 20 ml de sorbitol 1M arrefecido em gelo e misturaram-se por pipetagem. Recolheram-se as células e ressuspenderam-se num volume final de 0,5-1 ml de sorbitol (1M) arrefecido em gelo.

Para a electroporação usou-se um equipamento Bicrad (Richmond, CA) Gene Pulser, com um controlador de Impulsos. As cuvettes de 0,2 cm foram obtidas na Bicrad. Transferiram-se 40 μΐ de células de levedura para um tubo Eppendorf esterilizado. As células adicionou-se ADN (1-100 ng) em 5 μΐ de TE. Incubou-se a mistura em gelo durante 5 minutos, transferiu-se para uma cuvette

499 .. ......« '4W

6666—008- 118

.....

»·~· ·. C) >w -íi de 0.,2 cm e submeteu-se a um impulse de 1,5 kV, 25 μΡ, 200 ohm, durante 5 msegurido» A cuvette adicionaram-se imediatamente 250 μΐ de sorbitol IM frio, e misturou-se gentilmente o conteúdo e colocaram-se as células sobre as placas apropriadas.

18.2. TRANSFORMAÇÃO.....DA ...ESTIRPE ...DE.....LEVEDURA... Scl041 ...COM.....pNM-R-G.-·al

E.....YEpWB5.1T/Pqr

Transformou-se a estirpe de levedura 3cl041 com os plasmideos pNM-R-G-al (11.3, supra) e YEpWB51T/Port (6.2, supra.) usando e1ectroporação18.. 3.. A N A L13 E D Ε Μ A N C Η A W E 3 T E R N D A G L 0 ΒIΝ A Ε X P R E 3 3 A

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6. Os níveis de globina detestados eram de 0,03% da proteína solúvel..

18.4. ESPECTRO SORET DA HEMOGLOBINA EM LEVEDURA espectro Soret indicou absorvância na região de 418 nm que é característica da hemoglobina e que nâo estã presente em levedura de controlo que não exprime globínas.

19. EXEMPLO.......14 s........00-EXPRE3SÃ0.......DE......UM......MUTANTE......DE......DELEÇ.ÇÃ.0......D......E.......ALFA:

-GLOBINA E DA BETA-GLOBINA CM ICO EM LEVEDURA POR CQ-TRAN3F0R’

MAÇÃO.

19.1. MATERIAIS.....E.....MÉTODOS.

Usou-se a estirpe de levedura Scl090. CuItívaram-se as células de levedura em 500 ml de caldo YEPD com agitação vigorosa a 30^,:>C até uma D.O. de 1,3-1,5. Recolheram-se as células de uma cultura de 500 ml por centrifugação a 5000 rpm durante 5 minutos a 4^eC. As células e o rotor estiveram sempre mantidos frias. Lavaram-se as células com 2X água destilada esterilizada fria e recolheram-se por centrifugação a 4⁰C. Ressuspenderam-se em 20 ml de sorbitol IM arrefecido em gelo e misturaram-se por pipetagem. Recolheram-se as células e ressuspenderam-se num volume final de 0,5-1 ml de sorbitol (IM) arrefecido em gelo.

499

6666-008-118

-100Para a electroporação usou-se um equipamento Biorad (Richmond, CA) Gene Pulser, com um controlador de impulsos» As cuvettes de 0,2 cm foram obtidas na Biorad» Transferíram-se 40 μΐ de células de levedura para um tubo Epperidorf esterilizado» As células adicionou-se AON (1-100 ng) em 5 μΐ de TE» Incubou-se a mistura em gelo durante 5 minutos, transferiu-se para uma cuvette de 0,2 cm e submeteu-se a um impulso a 1,5 kv, 25 μΕ, 200 ohm durante 5 msegundos» A célula adicionam-se ímediatamente, 250 μΐ de sorbitol 1M frio, misturou-se gentílmente o conteúdo e colocaram-se as células sobre as placas apropriadas»

19..2.. TRANSFORMAÇÃO OA ESTIRPE DE.....LE.yEO.URA....Sç.lO9O.....COM.....pN.MrRr.G-a.

E.....pNTl/B.“Ç.hiço

Transformou-se a estirpe de levedura Scl090 com os plasmídeos pNM-R-G-al (11.3, supra) e ρΝΤΙ/β-Chico (15-5.1, supra.) usando e1ect ropo ração»

19»3 „ ANALISE... DE ...MANCHA.....WESTERN.....D.A.....GL0B.I.N A.....E.XPRESS A.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6» Detectaram-se níveis de globina de 0,4% de proteina solúvel»

19„4» DETECÇÃO... DE.....HEMOGLOBINA.....EM...LEVEDURA.....POR.....ESPECTRO....DE.....D.I.E.E-.

RENÇA.....DE.....MONÓ.XIDO.....OE....ÇARBONO espectro de diferença de monoxido de carbono de visível, das células de levedura inteiras, é gerado usando um procedimento adaptado dos métodos de Springer e Slager (1987, Proc» Natl. Acad. Scí» U.S.A» 84:8961)» Prepararam-se aproximadamente 1,2 ml de suspensão de levedura com uma 0»0» final a 600 nm de cerca de 2,0, usando P0₄ 0,1 mM, pH 7,0, como tampão. Depois, reduz-se a suspensão com um pequeno volume de dítíoníto de sódio, agita-se num agitador de vórtice e deixa-se em repouso durante um minuto» Depois, retira-se 1 ml e coloca-se numa cuvette de pequeno volume, a todo o comprimento» Usa-se esta suspensão como linha de base para um varrimento num espectrofotómetro registador Beckman 0U-70, de feixe simples, entre 400 e 500 nm» Depois remove-se a cuvette e faz-se borbulhar, na suspensão, monóxido de carbono

499

6666-008-113 _λ·'Λ

101 (CO), isento de oxigénio, de um modo constante mas não vigoroso durante 2 minutos» Mistura-se a suspensão agitando geritilmente durante um minuto e traça-se o espectro entre 400 e 500 nm» Por fim, mede-se o valor de D»0» a 600 nm no mesmo instrumento»

Se está presente hemoglobina, o espectro de diferença produzirá um pico a cerca de 420 nm e um vale a cerca de 435 nm» Um único pico a 420 nm não indica a presença de hemoglobina»

Nesta estirpe deteotou-se, por este método, hemoglobina funcional »

0 „ EXEMPLO 15» 00-EXPRESS Ã0.... DE MUTANTE D E.... D E L E C R A 0 DE A L F A. ~.G LO BINA E. DA GAMA-QLOBINA PORTO ALEGRE ...EM...LEVEDURA POR .CO.-TRANSEORMA.QÃO

20»1 „ MATERIAIS.....E.....MÉTODOS.

Usou-se a estirpe de levedura Sc340„ Cultivaram-se as células de levedura em 500 ml de caldo YEPD oom agitação vigorosa a 3O⁰C, até uma 0.0. de 1,3-1,5. Recolheram-se as células de uma cultura de 500 ml. por centrifugação a 5000 rpm durante 5 minutos a 4*0. As células e o rotor estiveram sempre mantidos frias» Lavaram-se as células com 2X água destilada, esterilizada fria e recolheram-se por centrifugação a 4^<:,C» Ressuspenderam-se as células em 20 ml de sorbitol 1M arrefecido em gelo e misturaram-se por pipetagem» Recolheram-se as células e ressuspenderam-se num volume final de 0,5-1 ml. de sorbitol (1M) arrefecido em gelo»

Para a electroporaçâo usou-se um equipamento Biorad (Richmond, CA) Gene Pulser· com um controlador de impulsos. As cuvettes de 0,2 cm foram obtidas na Biorad» Transferiram-se 40 μΐ de células de levedura para um tubo Eppendorf esterilizado» As células adicionou-se ADN (1-100 ng) em 5 μΐ de TE» Incubou-se a mistura em gelo durante 5 minutos, transferiu-se para uma cuvette de 0,2 cm e submeteu-se a um impulso a 1,5 kV, 25 μΕ, 200 ohm durante 5 msegundos» A cuvette adicionaram-se imediatamente 250 μΐ de sorbitol 1M frio, misturou-se geritiimente o conteúdo e colocaram-se as células sobre as placas apropriadas»

20.2. TRANSFORMARaO.....Θ A.... E. 3 TIR P E..... .0 E.....L Ε V E OU R A... S ç340.... C 0 Μ .....pN M - R - G - α 1.....E.

499

6666—008—118 ,,, , * -,*,¥*·* íL-t <

-102YEpNTl/.....-Port

Transformou-se a estirpe de levedura Sc340 oom os plasmídeos pNM-R-G-al (11 »3, supra.) e YEpNTl/ -Port (15.5.9, supra) usando electroporação»

20.3. ANALISE.....D E. ...M AN Ç Η. A.....WESTERN.....DA.... GLOBINA ...EXPRESSA.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos descritos na Secção 6.6»

20.4„ DETEÇÇÃO....DE.....HEMOGLOBINA.....EM... LEVEDURA.....POR.....ESPECTRO DE.....DIFERENÇA.....DE.....MONÓX..IDO.....DE....ÇARBONO espectro de diferença de monóxido de carbono de visível, das células de levedura inteiras, é gerado usando um procedimento adaptado dos métodos de Springer e Slager (1987, Proc» Natl,. Acad» Sei» U.S.A. 84:8961). Prepararam-se aproximadamente 1,2 ml de suspensão de levedura com uma 0.0. final a 600 nm de cerca de 2,0, usando PO^ 0,1 mM, pH 7,0, como tampão» Depois, reduz-se a suspensão com um pequeno volume de ditionito de sódio, agita-se num agitador de vórtice e deixa-se em repouso durante um minuto» Depois, retira-se 1 ml e coloca-se numa cuvette de pequeno volume, a todo o comprimento» Usa-se esta suspensão como linha de base para um varrimento num espectrofotómetro registador Beckman DU-70, de feixe simples, entre 400 e 500 nm» Depois, remove-se a cuvette e faz-se borbulhar, na suspensão, monóxido de carbono (CO), isento de oxigénio, de um modo constante mas não vigoroso durante 2 minutos» Mistura-se a suspensão agitando gentilmente durante um minuto e traça-se o espectro entre 400 e 500 nm» Por fim mede-se o valor de D.O. a 600 nm no mesmo instrumento»

Se está zirã. um pico único pico a presente hemoglobina, o espectro de diferença produa cerca de 420 nm e um vale a cerca de 435 nm» Um 420 nm não índica a presença de hemoglobina»

Nesta estirpe detectou-se, por este método, hemoglobina funcional »

21» EXEMPLO 16: CO-EXPRESSAO DA ZETA-GLOBINA TITUSVILLE E DA GA;

499 & 666-008-118 '103

M..A-GL0BIN.A...EM.....LEVEDyRA....RQR... .CO-TRANSFORMAÇÃO.

„ 1. TRANSFORMAÇÃO.....DA....EST1RPE....DE.....LEVEDURA... Sçl.115.....COM.....pNTl/Z95An

E.....Y.Ep5.1.T/.G

Transformou-se a estirpe de levedura Sclll.5 com os plasmídeos YEpSIT/G (8.4, supra.) e pNTl/Z95An (15.5.12, supraj usando electroporaçâo. Para a cultura de partida, descri volveram-se as células em meio mínimo contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 1% de rafinose e suplementado com 2.0 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano, a 30^e>C num balão agitado até à fase logarítmica. Usou-se a cultura de partida para inocular 500 ml de meio contendo 0,67% de base de azoto de levedura, 3% de glicerol, 2% de ácido láctico, 1% de rafinose, 0,4% de Tween-80, e suplementado com 20 mg/1 de cada um de adenina, histidina, uracilo e triptofano» A incubação foi realizada a 3O'^?C com agitação» A cultura foi induzida pela adição de galactose até uma concentração final de 2%, Na indução, ajustou-se o pH a 7,06 com KH^PO^ e adicionou-se hemina até uma concentração final de 40 pg/ml. Recolheram-se amostras entre duas e 30 horas após a indução»

As globinas expressas foram quantificadas por análise de Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção

21,2» ANALISE.....DE...MANÇHA.....WESTERN.....DA....GL0B.1NA....EXPRESSA.

As globinas expressas foram quantificadas por análise de

Mancha Western usando os procedimentos que se descrevem na Secção 6,6» A globína detectada era 0,2% da proteína solúvel» „3. DE.IE.CÇÃO....D.E.....HEMOGLOBINA.....EM....LEVED.yRA.....POR.....ESPEÇTRQ.....DE.....DIFERENÇA.....D.E.. M0.N.ÓX.IDO.....DE... CARBONO espectro de diferença de monóxido de carbono de visivel, das células de levedura inteiras, é gerado usando um procedimento adaptado dos métodos de Springer e Slager (1987, Proc. Natl. Acad» Sei» U.S.A» 84:8961), Preparam-se aproximadamente 1,2 ml de suspensão de levedura com uma D.,0» final a 600 nm de cerca de 2,0, usando PO^ 0,1 mM, pH 7,0, como tampão» Depois, reduz-se a suspensão com um pequeno volume de ditioníto de sódio, agita-se φ

499

6666-008-118

-104num agitador de vórtice e deixa-se em repouso durante um minutoDepois, retira-se 1 ml e coloca-se numa cuvette de pequeno volume, a todo o comprimento- Usa-se esta suspensão como linha de base para um varrimento num espectrofotõmetro registador Beckman 0U-70, de feixe simples, entre 400 e 500 nm- Depois, remove-se a cuvette e faz-se borbulhar, na suspensão, monóxido de carbono (CO), isento de oxigénio, de um modo constante mas nâo vigoroso durante 2 minutos- Mistura-se a suspensão agitando gentilmente durante um minuto e traça-se o espectro entre 400 e 500 nm- Por fim mede-se o valor de D-0- a 600 nm no mesmo aparelho.

8e está presente hemoglobina o espectro de diferença produzirá um pico a cerca de 420 nm e um vale a cerca de 435 nm- Um único pico a 420 nm não indica a presença de hemoglobinaNesta estirpe detectou-se, por este método, hemoglobina funcional 23- DEPÓ8.I.T0.....DE.....MI.CR0.0R.Gi.A.N.ISM08.

As estirpes de levedura seguintes das espécies Saccharomyc.es.

çereviseae, contendo os plasmídeos listados, foram depositadas no Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL,

Acesso

Estirpe de	Plasmídeo	Numero	Data do Depósito
1evedu ra 340g2p	YEpWB51WB/Port	Y-18640	2 de Abril de 1990
340VGTB	pNML-V-fâ-1	Y-18641	2 de Abril de 1990
340g2G	YEpSIT/fâ	Y-18695	7 de Agosto de 1990
340SGgVAL	pMM-5-G”tfva1	Y-18735	16 de Outubro de 1990
8 c 1012 - R - A - a 1	pNM-R-A-al	Y-18694	7 de Agosto de 1990
1041GabCotl	pNM-R-6-α!	Y-18794	27 de Março de 1991
lllSXIVfâab	pNML-V-G-1 pBM-V-Xl-G-αβ	Y-18791	27 de Março de 1991
340fâagCot6	pMM-R-Θ-αΙ	Y-18792	27 de Março de 1991
1.113fâagVALCot5	YEp51T/fâ pMM-R-fâ-al	Y-18793	27 de Março de 1991
340g2QC	pMM-5-G-^Ça|l pNTl/jf-Chíco	Y-18801	27 de Março de 1991

499

6666—008—118

		“105-
1114g2fâP	YEpSINTI/y-PORT	RT Y-18798	27 de Março	de 1991
340g2ATí	pNTl/aTit	Y-18795	27 de Março	de	1991
34Qg2A104S	pNTl/alG48	Y-18797	27 de Março	de	1991
340q2BMo	pNTl/íi-Mot	Y-18799	27 de Março	de	1991
340g2BTaS	pNTl/B-TaLiS	Y-18804	29 de Março	de	1.991
340g2GPRA	pNM-R-G-al	Y-18800	29 de Março	de	1991
	YEpSlNTl/^-PORT
1090g2BChRAl	pNM-R-fâ-al		29 de Março	de	1991
	pNTl/ )f~Chico
1090g2BRa	ρΝΤΙ/β-Ran	Y-18802	29 de Março	de	1991
340g2BMS	ρ'ΝΤΙ/β-Miss	Y-18803	29 de Março	de	1991
1113X8agVALl	ρ Β Μ - V - X 8 - β α/*ν a j	Y-18806	6 de Abril	de	1991
1041gaTPORTCot7	pNM-R-G-al	Y-18807	6 de Abril	de .	1991
	YEpWBSIT/Port
1115g2GTZTi	pNTl/Z.95	y-18808	6 de Abril	de	1991

ΥΕρ51Τ/β

A invenção que aqui se descreve e reivindica não está limitada no seu âmbito pelas concretizações especificas que aqui se descrevem, uma vez que se pretende que estas concretizações sejam ilustrações dos vários aspectos da invenção» Pressupõe-se que quaisquer concretizações equivalentes sejam também abrangidas pelo âmbito da invenção. De facto, várias modificações da invenção, para além das que aqui se mostram e descrevem, serão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior. Entende-se também que estas modificações estão incluídas no âmbito das reivindicações.

São aqui citadas várias referências, cujas descrições sâo aqui incorporadas como referência na sua totalidade.

Claims (73)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para a produção de uma cadeia de globina cu de um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracte ri zado po r comp reende r:

   (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante compreendendo: (I) uma primeira sequência de ADN codificando uma cadeia de globina ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN; (iii) uma segunda sequência de ADN codificando um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) uma origem de replicação de levedura; e (v) uma sequência de terminação da transcrição; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina ou o seu fragmento de ligação a heme.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor transcricional de levedura ser um promotor trans™ c r í c ί o n a 1 i n d u t í v e 1
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor transcricional indutível de levedura ser um prometo r t ranscr í ci on aI u ηí d irecoi on a1.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor transcricional indutível de levedura ser um prometo r transerieion a1 bi dí reccional.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor transcricional de levedura ser um promotor transc r í c i o n a 1 c o n s t i t u t ί v o „
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado po r o p romoto r t ran sc r i c í on a .1. de 1. e vedu ra, comp reen de r; (í) u ma p r imei ra sequên ci a contendo u ma regi ão regu1ado ra tran scr i c i on a1 de um promotor indutível; e (ii) uma segunda sequência contendo

   Φ 72.499

   6666—009—1.18

   Υ ?

   uma região de inciação da transcrição de um promotor constitutivo localizado a jusante da primeira sequência»
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a primeira sequência do promotor transcricional de levedura ser uma sequência de activaçao a montante, de um promotor indu t i ve1 de 1evedura»
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de AON codificando um marcador seleccíonãvel de levedura ser o gene LEU2»
9. 9 - Processo de acordo oom a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de AON codificando um marcador seleccíonãvel de levedura ser o gene l.eu2d„
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1» caracterizado por a sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura ser o gene URA3»
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação I, caracterizado por a origem de replicação de levedura ser um sistema de replicaçâo plasmídico 2μ de levedura ou uma sua porção funcionalmente actíva.

    >
12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a origem de replicaçâo ser uma sequência de replicação autónoma„
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1,, caracterizado por a sequência de AON codificar uma cadeia de globina tipo alfa ou uma sua variante substancialmente homóloga»
14. 14 - Processo d® acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a cadeia de globina do tipo alfa ser uma cadeia de zeta-globina embrionaria ou uma sua variante substancialmente homóloga»

    72499

    6666—009—118 i„e^!awaB»

    -10815 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a cadeia de globina do tipo alfa ser urna cadeia de alfa-globina de ser humano adulto ou uma sua variante substancialmente homóloga»
15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de ADN codificar uma cadeia de globina tipo beta ou uma sua variante substancialmente homóloga»
16. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a globina do tipo beta ser uma cadeia de beta-globina de ser humano adulto ou uma sua variante substancialmente homóloga„
17. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a cadeia de globina do tipo beta ser uma cadeia de gama-globina de feto humano» .
18. 19 - P r o c e s s o d e a c o r · d o c o m a r e i v i n d i c ação 1, ca r a c t e r i z a d o por o vector de ADN recombinante compreender uma primeira sequência de ADN codificando uma primeira cadeia de globina e uma segunda sequência de AON codificando uma segunda cadeia de globina»
19. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o vector de ADN recombinante compreender ainda uma segundo promotor transcricíonal de levedura que promove a transcrição da segunda sequência de ADN»
20. 21 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante ou de um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de Ievedu ra, car acter í zado ρo r comp reende r s (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante compreendendo: (i.) urna primeira sequência de ADN codificando uma cadeia de globina variante ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricíonal de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de AON; (iii) uma segunda sequência de ADN codificando um marcador

    Ζ

    72499

    666ό Ό 0 9 —118

    109 seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo a que seja expressa a cadeia de globina variante ou o seu fragmento de ligação a heme.,
21. 22 - Processo para a produção de uma cadeia de gama-globina ou de um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução., numa célula de levedura, de um vector de

    ADN recombinante compreendendo: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de gama-globina ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON codificando a cadeia de gama-globina ou o seu fragmento de ligação a heme; (iii) uma sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de gama-globina ou o seu fragmento de ligação a heme»
22. 23 - Processo para a produção de uma cadeia de zeta-globina ou de um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de zeta-globina ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura compreendendo: (i) uma primeira sequência de AON codificando uma cadeia de zeta-globina ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN; (iii) uma segunda sequência de ADN codificando um marcador seleccionável de levedura ou uma. sua porção funcional men te activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de zeta-globina ou o seu fragmento de ligação a heme»

    Λ .< α

    72499

    6 ό66—009—113

    -.11024 - Processo para a produção de uma cadeia de beta-globina Porto Alegre humana ou de um seu fragmento de ligação a hem©, numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de beta-globina Porto Alegre humana, numa célula de levedura compreendendo; (i) um promotor GA.L.10, (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor G.AL10, codificando uma cadeia de beta-globina Porto Alegre humana; (iii) um marcador LEU2 seleccionável ou uma sua porção funcionalm®nte activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de beta-globina Porto Alegre ou o seu fragmento de ligação a heme.
23. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o vector de ADN recombinante ser o plasmídeo Y E p W B 51 / Ρ o r t
24. 26 ~ Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a célula de levedura ser uma Sajsç„haromY.çes. oereyis.iae tal como depositada no NRRL com o nQ de acesso Y-18640 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética.
25. 27 - Processo para a produção de uma cadeia de gama-globina de feto humano ou de um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender;

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de gama-globina de feto humano, numa célula de levedura compreendendo: (i) um promotor GAL.IO, (ii) uma sequência de AON localizada a jusante do promotor GAL.1O, codificando uma cadeia de gama-globina de feto humano; (iii) um marcador LEU_2 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ. ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de gama-globina fetal, que compreende a

    Μ99

    6666—0Ο9~118

    111região de terminação da transcrição do gene da ãlcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula d© levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de gama-globina de feto humano ou o seu fragmento de ligação a heme»
26. 28 - Processo d© acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o vector de ADN recombinante ser o plasmídeo YEpSIT/fâ _
27. 29 - Processo de aoordo com a reivindicação 27, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saccharomyces. cerevisiae tal como depositada no NRRL com o nS de acesso Y-18695 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
28. 30 - Processo para a produção de uma cadeia de gama-globina de feto humano, variante, que compreende uma valina na posição gama-i ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender;

    (a) a introdução, nutria célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de gama-globina de feto humano, variante, que compreende uma valina na posição gama-1 , compreendendo; (i) um promotor híbrido compreendendo um promotor GAL1.0 e um promotor T.DH.3; (ii) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de gama-globina humana, variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina fetal e que compreende uma valina na posição gama-1, sequência esta localizada a jusante do promotor híbrido ; (iii) um marcador LEU 2 seleccíonável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicaçao plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globína variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de gama-globina de feto humano.

    .«ãrAÍaJ?’

    72499

    6666-ΟΟ9-118 que compreende uma vaiina na posição gama-l, ou o seu fragmento de ligação a heme»
29. 31 - Processo de acordo caracterizado por o vector de ADN ρΝΜ-5-G- ι „ com a reivindicação 30, recombinante ser o plasmídeo
30. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a célula de levedura ser uma SacçJiaromyces çe.hoyisíae tal. como depositada no NRRL com o n8 de acesso Y-18735 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»

    Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeira de alfa-globína de ser humano adulto e que compreende uma serina na posição alfa-104 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir numa célula de levedura uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto e que compreende uma .serina na posição alfa-104, compreendendoi; (i) um promotor GÁLIO e um promotor TDH3: (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor 6AL10, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de alf a-globína de ser humano adulto e que compreende uma. serina na posição alfa-104; (iii) um marcadorURA.3 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ. ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desídrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de alfa-giobína de ser humano adulto e que compreende uma serina na posição alfa-104,

    72499

    6666—009—1Λ8

    113

    - .....‘ígief^' ou ο sou fragmento de ligação a heme, ” ' * com a reivindicação 33, caracterizado por o vector de AON recombinante ser o plasmídeo pNTl/a!04S„
31. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saççharomyces. Ç.er.eyis.iae tal como depositada no NRRL com o nS de acesso Y-18797 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
32. 36 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmerite homóloga a uma cadeia de gama-globina fetal e gue compreende uma cisteina na posição gama-9 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura.

    ca racte r izado po r compreen der:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, gue é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama- -globina fetal e gue compreende uma cisteina ria posição gama-9, compreendendo: (i) um promotor GAL10; (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GA.L10, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano e que compreende uma cisteina na posição gama-9; (iii) urn marcador LEU 2 seleccionável ou uma sua porção funcional men te activas (iv) um sistema de repl icação plasmidíco 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano e que compreende uma cisteina na posição gama-9, ou o seu fragmento de ligação a heme.

    72499 ό ό 6 ό—Ο Ο 9 — 118

    11437 - Processo de acordo caracterizado por o vector de ADN YLpNTl/ PORT „ com a reivindicação 36,, recombinante ser o plasmídeo por
33. 38 - Processo de acordo com a a célula de levedura ser urna rei v indicaçâo 6„ ca racter i zado S a cc h a r om y ç e s.........c e r e v i si. a e t a 1 como depositada no NRRL. com o nQ de acesso Y-18798 ou um seu derI vado mutan te, recombinante ou obtido por engenharia genética»
34. 39 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina fetal e que compreende uma treonina na posição gama-66 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender::

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama- -globina de feto humano e que compreende uma treonina na posição gama-66, compreendendo: (i) um promotor GÁLIO ; (ii) uma sequência de ADN localizada, a jusante do promotor híbrido, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina fetal e que compreende uma treonina na posição gama-66; (iii) LEU2 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente um marcador activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da ãlcool-desídrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homologa à cadeia de gama-globina de feto humano, que compreende uma treonina na posição gama-66, ou o seu fragmento de ligação a heme»
35. 40 - Processo de acordo caracterizado por o vector de ADN pNTl/ Chico» oom a reivindicação 39, recombinante ser o plasmídeo

    7249

    6666—009-.1.,18
36. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 39., caracterizado por a célula de levedura ser uma Saçcharpmyces cerevisiao tal como depositada no NRRL com o nâ de acesso Y-18801 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética.
37. 42 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende urn ácido glutàmíco na posição beta-127 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a urna cadeia de beta-globina de adulto e que compreende um ácido glutâmico na posição beta-127, compreendendo: (i) um promotor GAL10 ; (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende urn ácido glutâmico na posição beta-127; (iii) um marcadorLEU? seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante humana, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto, que compreende um ácido glutâmico na posição beta-127, ou o seu fragmento de ligação a heme.
38. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por o vector de ADN recombinante ser o plasmídeo pNTl/Ê-Mot.

    Processo de acordo com a reivindicação 42

    72499

    6666—009-118 —1,16 ca racterizado por &. célula de levedura ser uma 8açchj.romy.çes cerevislae tal como depositada no NRRL com o nô de acesso Y-18799 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
39. 45 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, qu© & substancialment© homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteína na posição beta-83 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula d© levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de AON recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, gue é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteína na posição beta-83, compreendendo: (i) um promotor GAL10 ; (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GÁLIO, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancia lmente homóloga a urna cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteína na posição beta-83; (iii) um marcadorLEU2 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina humana, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da ãlcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina humana, que compreende uma cisteína na posição beta~83, ou o seu fragmento de ligação a heme.
40. 46 - Processo de acordo caracterizado por o vector de AON com a reivindicação 45, recombinante ser o plasmídeo ρΝΤΙ/β-Tali.S
41. 47 - Processo de acordo com a rei vindicação 45, caracterizado por a célula de levedura ser uma (Mç.Ç.haromy.ces çorevísíae tal como depósitada no NRRL com o nQ de acesso Y-18804

    72499

    6666-009-1.18

    -117“ ou um sou derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
42. 48 ~ Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteina na posição beta-44 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, que © substancíalmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteina na posição beta-44, compreendendo: (i) um promotor GAL1O ; (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GAL1O, codificando uma cadeia de globina variante, que & substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteina na posição beta-44; (iii) um marcador LEU2 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante humana, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancíalmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto, que compreende uma cisteina na posição beta-44, ou o seu fragmento de ligação a heme»
43. 49 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por o vector de ADN recombinante ser o plasmídeo ρΝΤΙ/β-Miss»
44. 50 - Processo de acordo com a reivindicaçao 48, caracterizado por a célula de levedura ser uma âacçjhjaromyçes çereyisiae tal como depositada no NRRL com o nfâ de acesso Y-18803 ou um seu derivado mutarite, recombinante ou obtido por engenharia genética»

    72499

    6666-009-118 ii'» **118
45. 51 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteína na posição beta-145 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender:

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homologa a uma cadeia de beta-globina de adulto e que compreende uma cisteína na posição beta-145, compreendendo: (i) um promotor 6AL10 ; (ii) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor 6AL10. codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina de adulto & que compreende uma cisteína na posição beta-145; (iii) um marcador LEU2 seleccionável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase I; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de beta-globina humana, que compreende uma cisteína na posição beta-145, ou o seu fragmento de ligação a heme»
46. 52 - Processo de acordo caracterizado por o vector de ADN pNTl/là-Ran» com a reivindicação 51, recombinante ser o plasmídeo
47. 53 - Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a célula de levedura ser uma Sacçharomyceg. çerevlslae tal como depositada no NRRL com o nô de acesso Y-18802 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
48. 54 - Processo para a produção de uma cadeia de globina variante humana, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de

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    6666—009™118

    -119alfa-globína de adulto e que compreende uma asparagina na posição alfa-94 ou um seu fragmento de ligação a heme,numa célula de levedura, caracterizado por compreender;

    (a) a introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de alfa-globína de adulto e que compreende uma asparagina na posi ção a1f a-94, comp reen dendo; ( i) u m promoto r fâALIO ; (í i ) uma sequência de AON localizada a jusante do promotor QAL10, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a urna cadeia de alfa-globina de adulto e que compreende uma asparagina na posição alfa-94; (iii) um marcador LEU.2 seleccíonável ou uma sua porção funcionalmente activa; (iv) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (v) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de AON que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase X; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que seja expressa a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de alfa-globína humana, que compreende uma asparagina na posição alfa-94, ou o seu fragmento de ligação a heme.
49. 55 - Processo de acordo caracterizado por o vector de ADN com a reivindicação 54, recombinante ser o plasmídeo pNTl/aTít.
50. 56 - Processo de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por a célula de levedura ser uma ç.oro.yioiae tal como depositada no NRRL com o nâ de ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido

    Saçc.ha romyçes acesso Y-18795 por engenharia genética.
51. 57 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmen te ? ·' > 4 Ο Ο i 2 ϊ·

    6666-009-118

    -120 homóloga, e uma cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga ou utn fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancialmente homóloga, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introduzir, numa primeira célula de levedura, um vector de AON recombinante, compreendendo o vector de AON recombinante: (i) uma sequência de ADN codificando urna cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; (ii) um promotor transcricíonal de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON codificando a cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma variante substancialmente homóloga; e (iii) uma sequência de codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura de sua

    ADN

    OU uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura;

    (b) introduzir, numa segunda célula de levedura, um vector de ADN recombinante, compreendendo: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou utn fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substan c i a 1 men te homó 1 oga; (i i) u m p romoto r t ran sc r i c i on a I de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de ADN codificando cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substanciaimente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancialmente homóloga; e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de reρ1icação de 1 evedura;

    (c) cultivar a primeira célula de levedura de modo que seja expressa a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substanciaimente homóloga:

    (d) cultivar a segunda célula de levedura de modo que seja ' ό*'*'!

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    6666—ΟΟ 9—118

    -121expressa a cadeia de globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga;

    (e) isolar, da primeira célula de levedura, a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga ;

    (f) isolar, da segunda célula de levedura, a cadeia de globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga ; e (g) combinar, com uma fonte de heme, a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga, isolados, e a cadeia d© globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligaçao a heme, da cadeia de globina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga, isolados»
52. 58 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina tipo alfa, ou urna sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga, e uma cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancialmente homóloga, caracterizado por compreender os passos des (a) introduzir, numa célula de levedura, um vector de ADN. recombinante, compreendendo: (i) uma primeira sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma. sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; (ii) uma segunda sequência de AON codificando uma cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante

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    6666-009-118 /6'

    .....

    122 substãncialmente homóloga; (iíi) um primeiro promotor transcrícional de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN; (iv) um segundo promotor transcrícional de levedura, o qual promove a transcrição da segunda sequência de ADN; (v) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcíonalmente activa; e (vi) uma origem de replicação de ievedu ra;

    (b) cultivar a célula de levedura de modo gue seja expressa a cadeia de giobina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de giobina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga, e uma cadeia de giobina tipo beta, ou a sua variante substaricíalmerite homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de giobina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga;

    (e) isolar, da célula de levedura, a cadeia de giobina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de giobina tipo alfa ou da sua variante substãncialmente homóloga, e a cadeia de giobina tipo beta, ou a sua variante substãncialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globína tipo beta ou da sua variante substãncialmente homóloga ; e (d) combinar, com uma fonte de heme, a cadeia de globína tipo alfa, ou a sua variante substãncialmente homologa, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globiria tipo alfa ou da sua variante substãncialmente homóloga, e uma cadeia de giobina. tipo beta, ou a sua variante substancial men te homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de giobina tipo beta ou da sua variante substãncialmente homóloga »
53. 59 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de giobina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de giobina tipo alfa ou do uma sua variante substãncialmente homóloga, e uma cadeia variante de globiria tipo beta ou um seu fragmento de ligação a heme, caracterizado por compreender os passos de:

    / 2499

    6666— O 0 9—1. J„ 8

    -123- r?' (a) introduzir, numa célula de levedura, um vector de ADN recombinante, compreendendo: (i) uma primeira sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; (ii) uma segunda sequência de ADN codificando uma cadeia variante de globina tipo beta, ou um seu fragmento de ligação a heme; (iii) um primeiro promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN;(iv) um segundo promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da segunda sequência de ADN; (v) uma sequência de AON codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; & (vi) uma origem de replicação de levedura;

    (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado, de modo que a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga, e uma cadeia variante de globina tipo beta, ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ligados conjuntamente a heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina»
54. 60 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia variante de globina tipo alfa, ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de globina tipo beta ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introduzir, numa célula de levedura, um vector de ADN recombinante, compreendendo: (i) uma primeira sequência de ADN codificando uma cadeia variante de globina tipo alfa, ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) uma sequência de AON codificando uma cadeia de globina tipo beta, ou um seu fragmento de ligação a heme; (iii) um primeiro promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN;(iv) um segundo promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da segunda sequência de ADN; (v) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável φ

    72499

    6666-009-113

    -124' ,·'-,..,.....

    ΐ’ί· de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (vi) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meie apropriado, de modo que a cadeia variant® d® globina tipo alfa, ou o seu fragmento de ligação a heme, e a cadeia de globina tipo beta, ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ligados, conjuntamente a heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina,,
55. 61 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de alf a-globina de adulto, ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de gama-globina, ou um seu fragmento de ligação a heme, · numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de;

    (a) introduzir, numa célula de levedura, um vector de ADN recombinante, compreendendo; (i) uma primeira sequência de ADN codificando uma cadeia de alfa-globina de adulto, ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) uma segunda sequência de ADN codificando uma cadeia de gama-globina, ou um seu fragmento de ligação a heme; (iii) um primeiro promotor transcriciorial de levedura, o qual promove a transcrição da primeira sequência de ADN;(iv) um segundo promotor transcriciorial de levedura, o qual promove a transcrição da segunda sequência de ADN que codifica a cadeia de gama-globina ou uma sua variante substancialmente homóloga; (v) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (vi) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado, de modo que a cadeia de alfa-globina de adulto, ou um seu fragmento de ligação a heme, e a cadeia de gama-globina, fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ou o seu ligados, conjuntamente a heme, hemoglobina,.

    na célula d® levedura, para formar
56. 62 - Processo para a produção de uma hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a urna cadeia de gama-globina fetal e que compreende uma ί ζ ζ

    0666-009-118

    -125vaiina na posição gama-1 e uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12 ,numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução, numa célula de levedura, de um vector de ADN recombinante que compreende:

    (i) um primeiro promotor híbrido compreendendo urn promotor A.0H.2 e um promotor TDH3;

    (ii) uma primeira sequência de ADN localizada a jusante do primeiro promotor híbrido, codificando uma cadeia de globina variante, que é substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina fetal e que compreende uma valina na posição gama-1;

    (iii) uma primeira sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da primeira sequência de ADN, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase 1;

    (iv) um segundo promotor híbrido compreendendo um promotor ADH2 e um promotor TDH25.;

    (v) uma segunda sequência de ADN localizada a jusante do segundo promotor híbrido, codificando uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecção de alanina na posição alfa-12;

    (vi) uma segunda sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da primeira sequência de AON, que compreende a região de terminação da transcrição do gene GAL10;

    (vii) um marcador seleccionável URA3 ou uma sua porção funcionalmente activa; e (viíi) urna origem de repl icação plasmídica 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressas a cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadela de gama-globina fetal, e que compreende uma valina na posição gama-1 e a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12, e ligadas conjuntamente com heme, numa célula de levedura, para formar hemoglobina.

    72499

    6666-009-118

    W'

    -12663 - Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por o vector de ADN recombinante ser o plasmídeo pBM-R-X8-A-a _va|»
57. 64 - Processo de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saççharomyces......cerevisíae tal como depositada no NRRL com o nQ de acesso Y-18806 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
58. 65 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo, uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga e uma cadeia variante de globina tipo beta ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introduzir, numa célula de levedura, dois vectores de ADN recombinante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homologa, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadela de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicaçao de levedura; e em que o segundo vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de AON codificando uma cadeia variante de globina tipo beta, ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de ADN que codifica a cadeia variante de globína tipo beta, ou um seu fragmento de ligação a heme; e (iii) uma sequência de ADN codificando peio menos um marcador seleccíonável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de leveduο

    72499

    6666-009-118 // ,

    -127- * tf»*' ra; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado, de modo que a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga e a cadeia variante de globína tipo beta, ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ligados conjuntamente a heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina.
59. 66 - Processo para a produção de. hemoglobina compreendendo, uma cadeia variante de globina tipo alfa, ou um seu fragmento, de ligação a heme, e uma cadeia de globina tipo beta ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de π (a) introduzir, numa célula de levedura, dois vectores de AON recombinante, em que o primeiro vector de AON recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia variante de globina tipo alfa ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON que codifica a cadeia variante de globina tipo alfa ou um seu fragmento de ligação a heme; e (i í i ) u m a se q uênci a d e A 0 N codificando p e 1 o meη os um ma rcado r seleccionãvel de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e em que o segundo vector de AON recombinante compreende; (i) uma sequência de AON codificando uma cadeia de globina tipo beta, ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON que codifica a cadeia de globina tipo beta ou um seu fragmento de ligação a heme; e (iii) uma sequência de AON codificando pelo menos um marcador seleccionãvel de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicaçao de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado, de modo que a cadeia variante de globina tipo alfa ou o seu fragmento, de ligação a heme e a cadeia de globina tipo beta, ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ligados conjuntamente a heme, na célula de levedura, para formar

    CB

    72499

    6666—009—118

    -128hemoglobina» ,1*
60. 67 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de alf a-globina de adulta, ou um seu fragmenta de ligação a heme, e uma cadeia de gama-globina ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introduzir, numa célula de levedura, dois vectores de ADN recombinante, em que o primeiro vector de AON recombinante compreende: (i) uma sequência de AON codificando uma cadeia de alf a-globina de adulto ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON que codifica a cadeia de alfa-globina de adulto ou um seu fragmento de ligação a heme; e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; © em que o segundo vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de gama-globina, ou um seu fragmento de ligação a heme; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON que codifica a cadeia de gama-globina ou um seu fragmento de ligação a heme; e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado, de modo que a cadeia de alfa-globina de adulto ou o seu fragmento, de ligação a heme e a cadeia de gama-globina, ou o seu fragmento de ligação a heme, sejam expressos e ligados conjuntamente a heme, na célula, de levedura, para formar hemoglobina»
61. 68 - P uma cadeia da alanína heme, © uma rocesso para a produção de hemoglobina compreendendo de alfa-globina de adulto compreendendo uma de1ecção na posição alfa-12 ou um seu fragmento de ligação a cadeia de beta-globina Porto Alegre humana ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura.

    caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução, numa célula de levedura, de dois vectores de

    72499

    6666—ΟΟ9“118

    -129-íÊjgF·

    AON recombinante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreendex (í) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto compreendendo uma delecçao da alanina na posição alfa-12, numa célula de levedura., compreendendox (A) um promotor híbrido compreendendo um promotor G.ALl-iQ e um promotor T.DH.3;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor híbrido, codificando uma cadeia de alfa-globina humana compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12;

    (C) um marcador seleccíonável URA3 ou uma sua porção f u n c i on a 1 men te acti. va;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de AON codificando a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, que compreende a região de terminação da transcrição do gene GA.L1O; © (ii) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de beta-globina Porto Alegre humana, numa célula de 1evedu ra, compreendendo x (A) um promotor GÁLIO;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GAL1O, codificando uma cadeia de beta-globina Porto Alegre humana;

    (C) um marcador seleccíonável LEU 2 ou uma sua porção funcionalmente activa; e (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressos a cadeia de alfa-globina de adulto compreendendo uma delecção de alanina na posição alfa-12 ou o seu fragmento de ligação a heme e a cadeia de beta-globina Porto Alegre humana, ou o seu fragmento de ligação a heme, e ligados conjuntamente com heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina.

    6666-009-118 /

    ...... ..JOWMí

    -130 ' / “ ' ’^Τϊ,-ΐϊ
62. 69 - Processo de acordo oom a reivindicação t>8 „ caracterizado por a célula de levedura ser uma Saççharomyçes. ç©teyisi.ae tal como depositada no NRRL com o nQ de acesso Y-18807 ou um seu derivado mutante,, recombinante ou obtido por engenharia genética
63. 70 - Processo para a produção d uma cadeia de alfa-globina de adulto da alanína na posição alfa-12 ou um heme, e uma cadeia de gama-globina ou e hemoglobina compreendendo com p reendendo u m a de1ecçao seu fragmento de ligação a um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura.

    caracterizado por compreender os passos de:;

    (a) introdução, numa célula de levedura, de dois vectores de ADN recombinante, em gue o primeiro vector de ADN recombinante compreende:

    (í) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globína de ser humano adulto compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12, numa célula de levedura, compreendendo:

    (A) um promotor híbrido compreendendo um promotor GAL1-10 e um promotor T0H3:

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor híbrido, codificando uma cadeia de alfa-globina humana compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12;

    (C) um marcador seleccionável URA3 ou uma sua porção funciona1mente activa;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcíonalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN codificando a cadeia de alfa globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12, que compreende a região de terminação

    da transcrição do gene GÁLIO; e (ií) um vector de ADN reco mbί nante capaz de exprimir uma cadeia de gama-globina de feto humano, numa célula de levedura, compreendendo: (A) um promotor GAL10; (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do

    72499

    6ó6ó~Q09~113 ff

    -131- . ........ r promotor GALiO, codificando uma cadeia de gama-globina de feto humano 3 (C) um marcador seleccionável LEU.2 ou urn a sua porção funcionalmente activa:

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de gama—globina fetal, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase X; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressos a cadeia de alfa-globina de adulto compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 ou o seu fragmento de ligação a heme e a cadeia de gama-globina de feto humano, ou o seu fragmento de ligação a heme, e ligados em com junto oom heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina
64. 71 - Processo de acordo com a reivindicação 71, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saççharomyçes. çereyisiae tal como depositada no NRRL com o nS de acesso Y-18792 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética»
65. 72 - Processo para a produção de uma hemoglobina compreendendo uma cadeia de cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de zeta-globina de embrião humano,e que compreende uma asparagina na posição zeta-94 ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de gama-globina ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução, numa célula de levedura, de dois vectores de ADN recombiriante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreende:

    (i) um vector de ADN recombiriante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de cadeia de globina variante que é substancialmente homóloga a uma cadeia de zeta-globina de embrião humano, e que compreende uma. asparagina na posição zeta(Β

    72499

    6 6 66—Ο Ο 9—118

    -132”94, compreendendo:

    (Α) um promotorG.AL.10;

    (Β) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor QAL1O, codificando a cadeia de globina variante:

    (C) um marcador seleccionável LEU2 ou uma sua porção f u nc í on a1mente ac t i va;

    (D) um sistema de replicaçâo plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool desidrogenase I; e (ii) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de gama-globina de feto humano, numa célula de levedura, compreendendo:

    (A) um promotor GÁLIO;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GAL1O, codificando uma cadeia de gama-globina de feto humano;

    (C) um marcador seleccionável LE.U.2 ou uma sua porção funcionalmente actíva;

    (D) um sistema de replicaçâo plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da seguência de ADN que codifica a cadeia de gama-globina fetal, gue compreende a região de terminação da transcrição do gene da ãlcool-desidrogenase 1; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressos a cadeia de cadeia de globina variante gue é substancialmente homóloga a uma cadeia de zeta-globina de embrião humano, e que compreende uma asparagína na posição zeta-94 ou o seu fragmento de ligaçao a heme e a cadeia de gama-globina de feto humano, ou o seu fragmento de ligação a heme, e ligados em conjunto com heme, na célula de levedura, para f o r m a r h e m o g 1 o b ί n a.

    Processo de acordo com reivindicação 7 2, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saççharomyçes

    72499

    6666—009—118 a

    :·ίΐ jwjíií

    Ί63· çer.ev.isj,ae tal como depositada no NRRL com o n© de acesso Y-18808 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética-
66. 74 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma de cadeia de alfa-globina de adulto compreendendo uma delecçao da alanina na posição alfa-12 ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de globina variante substâncialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma cisteína na posição gama-9, fragmento de ligação a heme, numa célula de caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução, numa célula de levedura, de dois vectores de AON recombinante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreende:

    (i) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globíria de ser humano adulto compreendendo uma delecçao da alanina na posição alfa-12, numa célula de levedura, comp reen den do:

    (A.) um promotor híbrido compreendendo um promotor ou um seu levedura, fâALI-10 e um promotor TDH3;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor híbrido, codificando uma cadeia de alfa-globina de humana, compreendendo uma delecçao da alanina na posição alfa-12:

    (C) um marcador seleccionável URA3 ou uma sua porção f un ciona1men te act i va;

    (0) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecçao da alanina na posição alfa-12, que compreende a região de terminação da transcrição do gene GÁLIO; e (ii) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula do levedura, uma cadeia do globina variante, substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma cisteína na posição gama-9,

    72499

    6666-009-118

    -134 compreendendo:

    (A) um promotor GAL10;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GAL..10, codificando urna cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma cisteina na posição gama-9;

    (C) um marcador seleccionável LEU2 ou uma sua porção f u ncí on a1mente acti va;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase 1; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressas a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 e uma cadeia de globina variante substancialmente homologa a uma cadeia de gama-globina de feto humano,© compreendendo uma cisteina na posição gama-9, e ligadas conjuntamente com heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina.
67. 75 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado por a célula de levedura ser uma S.açcharqmyçes. cerevisiae tal como depositada no NRRL com o nô de acesso Y-18800 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por- engenharia genética.
68. 76 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma de cadeia de alfa-globína de adulto compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma vaiina na posição gama-1, ou um seu fragmente de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução., numa célula de levedura, de dois vectores de

    AON reccmbi nan te, em que o primeiro vector de ADN recombinante

    72499

    6666—Ο Ο 9 — 1 .1.8

    -.1.35 compreende:

    (i) um vector de ADH recombinante capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12, numa célula de levedura, compreendendo:

    (A) um promotor híbrido compreendendo um promotor GAL1-1O e um promotor TDH3:

    (8) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor hibrido, codificando uma cadeia de alfa-globina humana, compreendendo uma delecção da alanina na posição alfa-12;

    (C) um marcador seleccionável UR A 3 ou uma sua porção f u nci on a1mente act i va;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma deleçao da alanina na posição alfa-12, que compreende a região de terminação da transcrição do gene QAL1O; e (ii) um vector de ADN recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, substancialmente homóloga a uma cadeia variante de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma vai iria na posição gama-i, compreendendo:

    (A) um promotor GAL1Q;

    (8) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GAL..1O, codificando uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma valina na posição gama-1;

    (C) um marcador seleccionável LEU2 ou uma sua porção f u nci on aImente act iva;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogena.se X; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de

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    -136- •9 modo qu© sejam expressas a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 e uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina d© feto humano,e compreendendo uma valina na posição gama-1, e ligadas conjuntamente com heme, na célula de levedura, para formar hemoglobina.
69. 7 7 - Processo d© acordo com a reivindicação 76, caracterizado por a célula de levedura ser uma Saçcharomyços coreyijsiae tal como depositada no NRRL com o nQ q© acesso Y-18793 ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido por engenharia genética.
70. 78 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma ds cadeia de alfa-globina de adulto compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 ou um seu fragmento de ligação a heme, e uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma treonina na posição gama-66, ou um seu fragmento de ligação a heme, numa célula de levedura, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) introdução, numa célula de levedura, de dois vectores de AON recombinante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreende:

    (i) um vector de AON recombinante capaz de exprimir uma cadeia de alfa-globina de ser humano adulto compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12, numa célula de levedura, compreendendo:

    (A) um promotor híbrido compreendendo um promotor GAL1-10 e um promotor TDH3;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor híbrido, codificando uma cadeia de alfa-globina humana, compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12:;

    (C) um marcador seleccionável URA 3 ou uma sua porção fu n ci on a1men te acti va;

    (D) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição

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    6666-009-118 —137— ···· >·** localizada a jusante da sequência de AON que codifica a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12, que compreende a região de terminação da transcrição do gene QALlú; e (ii) um vector de AON recombinante capaz de exprimir, numa célula de levedura, uma cadeia de globina variante, substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma treonina na posição gama-66, compreendendo:

    (A) um promotor J3AL10;

    (B) uma sequência de ADN localizada a jusante do promotor GA.L10, codificando uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano, e compreendendo uma treonina na posição gama-66;

    (C) um marcador seleccionável LEU2 ou uma sua porção f u n c i on a1men te act i va;

    (0) um sistema de replicação plasmídico 2μ ou uma sua porção funcionalmente activa; e (E) uma sequência de terminação da transcrição localizada a jusante da sequência de ADN que codifica a cadeia de globina variante, que compreende a região de terminação da transcrição do gene da álcool-desidrogenase 1; e (b) cultivar a célula de levedura num meio apropriado de modo que sejam expressas a cadeia de alfa-globina de ser humano adulto, compreendendo uma delecçâo da alanina na posição alfa-12 e uma cadeia de globina variante substancialmente homóloga a uma cadeia de gama-globina de feto humano,e compreendendo uma treonina na posição gama-66, e ligadas conjuntamente com heme, na céluia de levedura, para formar hemoglobina.
71. 79 - Processo de acordo com a reivindicação 78, caracterizado por a célula de levedura ser uma cerey.isj.ae tal como depositada no NRRL com o n2 de ou um seu derivado mutante, recombinante ou obtido

    Saççharomyçes.

    acesso p o r e n g e n h a r i a genética
72. 80 - Processo para a produção de hemoglobina compreendendo uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancial- mente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancial mente homóloga, e uma cadeia de globina tipo beta ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancialmente homóloga, caracterizado por compreender os passos de;:

    (a) introduzir» numa célula de levedura, dois véctorés de

    ADN recombinante, em que o primeiro vector de ADN recombinante compreende: (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo alfa, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga; (ii) um promotor transcricional de levedura, o qual promove a transcrição da sequência de AON que codifica a cadeia de globina tipo alfa ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou de uma sua variante substancialmente homóloga;e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura, ou urna sua porção funcionalmente activa; e (ív) uma origem de replicação de levedura; e em que o segundo vector de ADN recombinante compreende; (i) uma sequência de ADN codificando uma cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancialmente (ίomó 1. oga; ( i i) u m p romo t o r t r an sc r i c ί on a 1 de 1 e vedu r a, o qu a 1 promove a transcrição da sequência de ADN, que codifica a cadeia de globina tipo beta, ou uma sua variante substancialmente homóloga, ou um fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou de uma sua variante substancial men te homóloga; e (iii) uma sequência de ADN codificando pelo menos um marcador seleccionável de levedura, ou uma sua porção funcionalmente activa; e (iv) uma origem de replicação de levedura; e (b) cultivar a célula de levedura de modo que sejam expressos a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente

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    -139homóloga, e a cadeia de globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga:

    (c) isolar, da célula de levedura, a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga e a cadeia de globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme,, da cadeia de globina tipo betei ou da sua variante substancialmente homóloga; e (d) combinar, com uma fonte de heme, a cadeia de globina tipo alfa, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo alfa ou da sua variante substancialmente homóloga, e a cadeia de globina tipo beta, ou a sua variante substancialmente homóloga, ou o fragmento, de ligação a heme, da cadeia de globina tipo beta ou da sua variante substancialmente homóloga.
73. 81 - Processo de preparação de uma composição de hemoglobina caracterízado por se associar uma hemoglobina, produzida de acordo com o processo das reivindicações 57 a 80 com um portador farmaceuticamente aceitável.