PT97586A - Processo para a preparacao de timopoietina humana e de rato e de um agente de diagnostico que as contem - Google Patents

Description

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Descrição referente â patente de invenção de ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION, norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em U.S. Route 202, Raritan, New Jersey, Estadas Unidos da América (inventoress Gideon Goldstein e Tapan Audhya, residentes nos E.U.A.), para "PROCESSO PARA A PREFARAggQ DE TIMQP01ETINA HUMANA E DE RATO E DE UM AGENTE DE DIAGNÓSTICO QUE AS CONTêM11.

DESCRIÇ%Q

Âmbito da invenção A presente invenção refere-se em geral a um processo para a preparação de uma proteína isolada em forma purificada do tipo humano ou de rato ou produzida por síntese química ou por processo de engenharia genética recombinarrte, que é útil em ensaios de diagnóstico.

Enquadramento da Invenç&0

F.P A timopoietina (referida como 11TP") 1

é uma hormona de tipo polipéptido do timo com acções pleiotrópicas em protimócitos, células T maduras, receptores da acetilcolina nicatínica e corticotro-fos da pituitária. Desta •forma, tem existido muito interesse nessas substâncias e tem sido publicado um grande conjunto de artigos e patentes com elas relacionados e numa -forma isolada do timo de bovino, bem como péptidos quimicamente sintetizados simulando as propriedades das substâncias de ocorrência natural. Ver por exemplo, em particular G. Goldstein, Nature, 247 sll-í4 (London) (1974); R. S. Basch e col., Proc. Natl. ftcad. Sei., USA, 71;1474-1478 (1974); Μ. P. Scheid e col., 3, Exp, Med., 147;1727-1743 (1978); Μ. P. Scheid e col., Science, 190:1211--1213 (1975); θ. E; Ranjes e col., J, Exp. Med,, 156;1057-1064 (1982); K« Venkatasubramanian e Col., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 83;3171-3174 (1986); M. 8. Malaise e col., em "Immunoregulatory UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, ed. S. Goldstein e col., Liss, Nova Yorque, (1986), e G. H. Sunshine e col., J. Immunol. , 120; 1594-1599 (1978). A sequência completa dos cinquenta aminoácidos de TP de bovino (re-ferido como "bTP") -foi determinada, como descrito em T. Audhya e col., Biochemistry, 20;6195-6200 (1981), e veri-ficou-se que a actividade biológica residia no pentapéptido AR8-LYS-ASP-VAL-TYR, designado por timopentina (re-ferido como "TP-5") e descrito em G. Goldstein e col., Science 204;1309--1310 (1979) e Weksler e col., J, Exp. Med., 148;996--1006 bem como nas Patentes Norte Americanas N2s. 4.190.646 and 4.261.886. Adicionalmente as Patentes Norte Americanas NSs. 4.361.673, 4.420.424 e 4.629.723 descrevem vários péptidos que revelaram ter actividade semelhante á timopoietina. Os artigos e patentes acima re-feridos são aqui incorporados como re-f erência.

Embora tenha sido realizado muito trabalho em ligação com bTP bem como com péptidos sintéticos que simulam a bTP, até á data contudo não -foi isolada a timopoietina humana de timo do rato ou timopoietina de rato de tecidos do timo do rato e, obviamente, as proteínas não -foram • completamente sequenciadas ou sintetizadas.

O

gggugEJÍ*......ίηνθη,9^ A presente invenção refere-se â proteína timopoietina humana (referida como "hTF“‘) , essencialmente isenta de material nativo de timopoietina não humana, isto é, isenta de materiais associados com a proteína no seu ambiente natural no timo humano. Em particular, a presente invenção refere-se a hTP compreendendo a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos: BLY-LEU-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS-LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-GLY-VAL-THR-LEU-PRO-ALA-GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-BLN-HIS-LEU-THR-ALA-LEU—HIS.

Além disso, a presente invenção refere-se á proteína timopoietina de rato (referida como "rTP"), essencial mente isenta de material nativa de timopoietina de rato compreendendo a seguinte sequência de resíduas de aminoácidoss 6LY-MET-PR0-LYS-GLU-VAL-PR0-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS-LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-LYS-GLY-VAL-ALA-LEU-PRO-AL.A-GL. Y-GLU-GLN-ARB-LYS-ASP-VAL-TYR-V AL-ASP-1LE-TYR-PRO-GLN-HIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-ARG.

Estas proteínas podem ser isoladas do timo humana ou de rata. Alternativamente, estas proteínas podem ser quimicamente sintetizadas, ou preparadas por técnicas recombinantes ou de reacção em cadeia de polimerase (PCR).

Num outro aspecto desta invenção é referida um método para o diagnóstico ou detecção da quantidade de timopoietina circulante num paciente que inclui a fase de se utilizarem as proteínas acima descritas.

Outro aspecto da invenção inclui

sequências de ADN compreendendo sequências de ADN que codificam para a expressão de um polipéptido humano ou de rato»

Também são proporcionadas pela presente invenção moléculas de ADN recombinantes contendo uma sequência de ADN que codifica hTF* ou rTP em associação operativa com uma sequência de controlo da expressão. As células hospedeiras transfarmadas com essas moléculas para utilização na produção de hTF* ou rTP recombinantes são também proporcionadas pela presente invenção» Essas moléculas incluem vectores ou plasmídios que existem extra-cromossomicamente nas células hospedeiras, ou moléculas que integram genes de timopoietina do cromossoma de célula hospedeira.

Os vectores e células transformadas da invenção são utilizados num outro aspecto, que é um novo processo para a preparação de timopoietina recombinante humana ou de rato. Neste processo é transformada uma linha de células com uma sequência de ADN que codifica a TP adequada. A sequência de ADN de timopoietina humana (hTP) ou de timopoietina de rato (rTP) está em associação operativa com uma sequência adequada de controla de expressão na célula. A célula transformada é em seguida cultivada por técnicas convencionais em meio adequado. Este processo reivindicado pode utilizar várias células conhecidas como células hospedeira para a expressão do polipéptido. As linhas de células actualmente preferidas são as linhas de células de mamíferos e células bacterianas.

Em ainda outro aspecto da presente invenção referem-se anticorpos dirigidos contra hTF* ou rTP. Estes anticorpos são desenvolvidos utilizando a hTF* ou a rTP ou um seu fragmento como substância imunogénica em processos convencionais para preparar anticorpos ou antissoros policlonais. Estes anticorpos de anti-hTF* ou de anti-rTP podem ser utilizados como agentes de diagnóstico ou terapêuticos.

Além disso, a presente invenção refere uma composição terapêutica de substâncias que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da hTF* acima definida e que pode incluir entre outros ingredientes, um veículo 4

farmaceuticamente aceitável. Especificamente, essa quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido pode ser· de pelo menos cerca de 1-1000 pg/kg de peso corporal.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são referidos na descrição detalhada que se apresenta em seguida.

Descrição Resumida dos Desenhos A Fig. 1 ilustra, graficamente, o resultado da cromatografia em peneiro molecular Sephadex G-75 de extractos de timo humano com a medida do material imunorreactivo por RIA para bTP. Os picos de peso molecular inferior foram ainda purificados para se obter a hTF'. A Fig. 2 ilustra, graficamente, o resultado obtido da separação de digestão com CNBr de hTP dissolvido em ácido ortofosfórico a 0,1% numa coluna de fase inversa 04Θ (Vydec 218TP54, 46mm x 25cm) a um caudal de 2 ml/min. Os picos são designados como I, II, III. A linha de gradiente representa a presença do solvente orgânico. A Fig. 3 ilustra, graficamente, as produções repetitivas de aminoácidos derivados de feni1tiohidantoína durante a degradação automática de Edman de hTF* através de 46 ciclos.

Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção proporciona dois novos polipéptidas, timapoietina de rato, produzido numa forma essencialmente isenta de contaminação com outro material proteico de mamíferos. Estes polipéptidos, ou as suas modificações, são úteis nos ensaios de diagnóstico para a • detecção de níveis anormais de timopoietina ou como composições 5

Estes polipéptidos, proteico de mamíferos. Estes polipéptidos, ou as suas modificações, são úteis nos ensaias de diagnóstico para a detecção de níveis anormais de timopoietina ou como composições terapêuticas para o tratamento de várias doenças imunológicas.

Nesta especificação, os resíduos de aminoácidos dos péptidos e alguns materiais utilizados na sua preparação são identificados por abreviaturas convencionais por conveniência. A TP humana foi originalmente isolada do tecido de tipo humano, como é descrito em pormenor no Exemplo i a seguir apresentado. Resumidamente, o isolamento envolve a extracção do tecido num solvente aquoso, ultrafiltrado para um dimensionamento aproximado, cromatografia hidrofóbica, e CLAR (cromatografia líquida de alto rendimento) de fase inversa. Estavam presentes aproximadamente 50% do material imunorreactivo em cada extracto numa forma do peso molecular superior que representa provavelmente uma forma de precursor biologicamente inactivo CD. F. Steiner e col., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 57;473-480 (1967)3. Este foi separado durante penei ração molecular em Sephadex G-75.

Apesar da simplificação do procedimento de isolamento, a recuperação de hTP era muito baixa (0,42%), representando o material purificado uma purificação de 207 vezes (Tabela 1). Ocorriam grandes perdas de hTP durante o ensaio de CLAR. A pureza de hTP foi determinada por electroforese em gel de poliacrilamida, CLAR, e sequências de aminoácidos (ver Fig. 3).

Os procedimentos utilizados para obter a sequência de aminoácidos de hTP são da mesma forma descritos em pormenor no Exemplo 2 a seguir apresentado. Os resíduos 1—46 foram determinados por degradação automática de Edman com um sequenciador de fase gasosa, e os resíduos 1-11 e 32-46 foram confirmados por degradação de Edman em dois fragmentos de clivagem com CNBr. Isto proporcionou uma confirmação independente da região de sítios activos importantes resíduos 32-36. A sequência C-terminal 44-48 foi determinada por digestão com carboxipeptida.se libertada com o tempo. Ó ,3

Estes procedimentos proporcionaram a seguinte sequência de aminoácidos para a hTF'! 1 10 GLY-LEU-PR0-LY8-GLU~VAL--PR0-ALA-VAL-LEU-THR-LY8-GLN-LYS- 20 LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-GLY-VAL-THR-LEU-PRQ-ALA- 30 40 GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN- 48 ΗIS-LEU-THR-ALA-LEU-HIS. A timopoietina de rato -foi isolada do timo do rato e sequênciada como é a seguir descrito nos Exemplas 5 a 7. A TP de rato -foi ainda caracterizada pela sua imunogenicidade essencialmente semelhante á da TP humana. Estes procedimentos proporcionaram a seguinte sequência de 50 aminoácidos para a rTP. 1 10 GLY-MET-PRG-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS- 20 LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-LYS-GLY-VAL-ALA-LEU-PRO-ALA- 30 40 GLY-GLU~GLN-ARG~LYS~ASP~VAL-TYR-VAL-ASP-ILE-TYR-PRO-GLN- 48 ΗIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-ARG. 0s péptidos desta invenção, para além de serem isoladas de timos humanos ou de ratos, podem também ser preparados por técnicas recombinantes, técnicas de PCR ou por síntese química.

Para caracterizar a hTP e a rTP logo que sequenciadas, foram utilizados anticorpos para a bTP. Previamente,.foi utilizada a reactividade cruzada de anticorpos anti-bTP para detectar· e isolar o polipéptido muito relacionado bSP de baço de bovino ET. Audhya e col., Bio~chemistry, 20:6195-6200 <1981)3. Os anticorpos a bTP provaram, de forma semelhante, que eram cruzadamente reactivos com hTP, e o radioimunoensaio de bTP (RIA), descrito nessa referência e incorporado como referência nesta patente, foi utilizado para monitorar o isolamento de hTP de extractos de timo humano.

Quando comparado com os polipéptidos í*

de sequência conhecida, foi verificado que a hTP à semelhante na sequência de aminoâcidos á esplenina humana (referida como "hSP"), como é referido num pedido copendente de patente com o Número de Série 53 186, apresentada em 22 de Maio de 1987, e aqui incorporada como referência. A hSP tem a seguinte sequências 1 10 GLY~LEU~PRG-LYS~GLU~VAL~PRO--ALA--VAL-L.EU-THR-LYS-GLN~-L.YS- 20 * LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-ASN-VAL-THR-LEU-PRQ-ALA- 30 # 40 GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ALA-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN-* * 48 SER-LEU-THR-ALA-GLU-HIS.

As hTP e hSP são cada uma polipéptidos lineares com 48 aminoâcidos. Contudo, estes polipéptidos diferem em 4 resíduos, nas posições de aminoâcidos 23, 34, 43, e 47 (indicadas por um asterisco acima).

Foi também verificado que a hTP era semelhante a bTP e bSP (esplenina de bovino). A bTP tem a seguinte sequência de aminoâcidos; 1 10 PRO-GLU-PHE-LEU-GLU-ASP-PRO-SER-VAL-LEU-THR-LYS-GLU-LYS- 20 LEU-LYS~SER-GLU~LEU“VAL-“ALA--ASN-ASN”-VAL“THR-LEU-PRG-ALA-30 40 GLY-GLU-GLN-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN- 49 SER-LEU—THR—ALA—LEU—LYS—ARG. A bSP tem a seguinte sequência de aminoâcidos; 1 10 PR0—GLU—PHE-LEU—GLU—ASF'~F*R0—SER-VAL-LEU—THR—LYS—GLU-LYS— 20 LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-ASN-VAL—THR-LEU-PR0-ALA-30 40 GLY-GLU-GLN-ARG-LYS-GLU-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-LEU-GLN-HIS~ 48 LEU-THR-ALA-LEU-LYS-ARG.

De£ dos resíduos de aminoâcidos que são idênticos nas sequências de hTP e hSP (posições de 8

aminoácidos 1-4, 6, 8, 13, 31, 48 e 49) di-ferem das posições idênticas de aminoácidos em bTP e bSP. Além disso a hTP difere de todos estes péptidos na posição de aminoácido 23, A bTP e hTP partilham uma região de sítios activos essencialmente idêntica (resíduos de aminoácidos #32-36) , diferindo õl região apenas no resíduo 34. Contudo a bTP e hTP não partilham a imunogenicidade essencialmente semelhante que caracterisa a hTP e a r-TP,

Estas comparações confirmam que a sequência de aminoácidos de hTP foi de facto determinada e indicam que uma conversão de genes deve ter ocorrido durante a evolução para manter a evolução paralela de sequências dos polipéptidos de TP e SP dentro de cada espécie.

Outras sistemas de genes importantes que utilizam a conversão de genes incluem a imunoglobulina CP. H. Schreier e col., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 78;4495-4499 (1981)1 e o complexo importante da histocompatibi1 idade de genes CM. Steinmetz e col., Science, 222;727-733 (1983)3. A manutenção da evolução paralela das regiões de TP e SP fora da região de sítios activos (resíduos 32-36) implica que estas regiões de terminais-C e -1M da molécula devem também ter uma função importante, com requisitas semelhantes para ambas TP e SP que são mantidos dentro de cada espécie.

Sabe-se que os resíduos 32-36 de bTP representam o sítio activo, possuindo pentapéptido TP (resíduos de aminoácidos 32-36) sintética correspondente, TP-5, as actividades biológicas de TP em animais e no homem C8. Goldstein e col., Science, 204;1309-1310 (1979); e T. Audhya e col., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81;2847-2849 (1984)3. Estes estudos estabelecem que os sítios activos dos resíduas de hTP e r-TP (resíduos 32-36) são idênticos com os de bTP, e assim o TP-- 5 sintético (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) também representa o sítio humano activo. A estrutura da timopoietina de rato mostra uma maior semelhança com a humana do que a timopoietina de bovino, diferindo da sequência humana nas posições 2, 22, 25, 31, 38, 39, 41 e 46, mas diferindo da sequência de bovino

Cp

nas posições 1, 2, 3, 4, 6, 8, 13, 22, 23, 25, 38, 39, 41, 43, & 46. Com a excepção das alterações de Gln31 (rato) para Met3i (humano) e 11 (rato) até Ala*** (humano) , que necessitam de duas alterações de base nestes códões, todas as alterações do rato para o homem representam alterações de base simples em códões.Para a timopoietina de bovina, 40% das alterações de sequência de rato representam duas alterações de base, e a parte restante de 60% reflecte alterações de base simples. Existe aproximadamente uma homologia entre a rTP e a bTP; e aproximadamente 69% de homologia entre a rTP e a sTP. 0 sítio activo conhecido (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) é idêntico para todas as três proteínas CG. Goldstein, Science, 204;1309-1310 (1979)5 T. Audhya e col., Biochem, 20:6195-6200 (1981); T. Audhya e col., Proc. Natl. Acad. Sei., 84:3545-3549 (1987)1. A homologia entre a hTP e a rTP proporciona estes péptidos com uma imunogenicidade essencialmente idêntica. Assim, a rTP é muito cruzadamente reactiva com anticorpos para a hTP e os anticorpos para a rTP são cruzadamente reactivos para a hTP. Assim, os anticorpos para a rTP podem ser substituídos por anticorpos a hTP ou a rTP pode ser substituída por hTP em ensaios de diagnóstico e certas aplicações terapêuticas, quando isso for desejável.

A presente invenção também inclui sequências de ADN que codificam as sequências de aminoâcidos de hTP e de rTP. As variações alélicas da sequência de ADN que codifica a hTP ou a rTP são também incluídas na presente invenção, bem como os seus análogos e derivados. Assim a presente invenção também engloba estas sequências de ADN, isentas de associação com as sequências de ADN que codificam outras proteínas de primatas, e que codificam uma expressão para os polipéptidos hTP ou rTP. Estas sequências de ADN incluem as sequências que se hibridizam em condições de hibridização severas Cver, T. Maniatis e col., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387-3893. Como exemplo dessas condições de hibridização severas apresenta-se a hibridização em 4XSSC a 65°C, seguido de lavagem em 0,1XSSC 1 65°C durante 30 minutos. 10

Alternativamente, uma condição de hibridização severa exemplar é em 50% de formamida, 4XSSC a 42° C.

As sequências de ADN que codificam hTP ou rTP em condições de hibridização moderadas e que codificam em expressão para péptidos de hTP ou de rTP que possuem propriedades biológicas de hTP ou de rTP também codificam os novos polipéptidos. Exemplo dessas condições de hibridização não severas são 4XSSC a 50%°C ou hibridização com formamida a 30-40% a 42°C. Por exemplo, a sequência de ADN que partilha regiões de homologia significativa, por exemplo sítios de glicosilação ou ligações de dissulfureto, com as sequências de hTP ou rTP e codifica uma proteína possuindo uma ou mais propriedades biológicas de hTP ou rTP codifica claramente um polipéptido de hTP ou rTP mesmo se a sequência de ADN não se hibridizar especificamente para a sequência de hTP ou rTP.

De forma semelhante, as sequências de ADN que codificam para os polipéptidos hTP ou rTP mas que diferem na sequência de códão devido ás degenerescências do código genético ou variações alélicas (alterações de base de ocorrência natural na população de espécies que podem ou não resultar numa alteração de aminoácido) também são englobados por esta invenção. A presente invenção também proporciona métodos alternativos para o isolamento de tecido de timo para a produção de polipéptidos hTP e rTP. Um dos processos da presente invenção envolve a cultura de uma célula ou linha de células adequadas que foi transformada com uma sequência de ADN que codifica uma expressão para um polipéptido hTP ou rTP ou um seu fragmento activo sob o controlo de sequências de regulação conhecidas. As sequências de regulação incluem fragmentos promotores, fragmentos de determinação e outras sequências adequadas que dirigem a expressão da proteína numa célula hospedeiro adequada.

As células ou linhas de células adequadas podem ser células de mamíferos, como por exemplo células de ovários de hamster Chineses CCHO) ou células 3T3. A selecção de células hospedeiro de mamífero adequadas e os 11

processos para a transformação, cultura, amplificação, escrutínio e obtenção de produtos e sua purificação são conhecidas. Ver par exempla Bething e Sambrook, Nature, 293i620-625 ¢1981), ou alternativamente, Kaufman e col., Mol. Cell. Biol., 5(7)5 1750-1759 (1985) ou Howley e col., Patente Norte Americana N2.4.419.446. Outras linhas de células de mamíferas adequadas incluem a linha de células C0S-1 de macaco, e a linha de células CV-i.

As células bacterianas podem também ser úteis como células hospedeira adequadas para a presente invenção, desde que a molécula assim obtida retenha a actividade num estado desdobrado ou estado apenas parcial mente ou alternadamente dobrado, com base nas diferenças na glicosilação resultantes da expressão do factor em células de mamífera ou bacterianas. Por exemplo, várias estirpes de E. £oli são bem conhecidas como células hospedeiro no campo da biotecnologia. Podem também ser utilizadas neste método várias estirpes de outros bacilos, por exemplo B. subtil is.

Muitas estirpes de células de leveduras conhecidas dos especialistas também estão disponíveis como células hospedeiro para a expressão dos polipéptidos da presente invenção. Além disso, quando desejado, podem ser utilizadas células de insectos como células hospedeiro no processo da presente invenção. Ver por exemplo Miller e col., Genetic Engineering, 8 5 277-298 (Plenum Press 1986) e as referências ali citadas. A presente invenção também proporciona moléculas recombinantes, por exemplo, vectores e plasmídios, para utilização do processo de expressão de novos hTF' ou rTP. Estas moléculas cont'ê'm as novas sequências de ADN de hTF* ou rTP que codificam para os polipéptidos hTF* ou r-ΤΡ da invenção. Os vectores que incorporam fragmentos truncados ou alterados de hTF* ou rTP, e suas variantes alélicas, com sequências modificadas como acima descrito, são também consideradas realizações de presente invenção e são úteis na produção de hTF* ou rTP. 0 vector utilizado no processo também contêm sequências de regulação escolhidas em associação 12

operativa com as sequências de codificação de ADN da invenção e que são susceptíveis de dirigir a sua replicação e expressão em células hospedeiro seleccionadas»

Alternativamente os péptidos podem ser preparados por uma técnica sintética em -fase sólida descrita inicialmente por Merri-f ield, JACS, 85; 5149-2154 (1963). Esses processas são também referidos em algumas das patentes anteriores acima referidas. Podem ser encontradas outras técnicas, por exemplo, em M. Bodanszky e col., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, segunda edição (1976) bem como em outros trabalhos de referência conhecidas dos especialistas. Os grupos protectores adequados que se podem utilizar nessa síntese e as suas abreviaturas podem ser encontradas nos textos acima referidos, bem como em J. F. W. McOmie, "Protective Broups in Organic Chemistry", Plenum Press, Nova Iorque, (1973). Ambos estes livros são aqui incorporados como referência. Os grupos protectores comuns aqui utilizados são t-butiloxicarbonilo (BOC), benzilo (BZL), t-amiloxicarbonilo (AOC), tosilo (TOS), O-bromo-fenilmetoxicarbonilo (BrZ), 2-6 diclorobenzilo (BZLCIjb) , e f eni lmetoxicarboni lo (Z ou CBZ) .

Actualmente, é obtida a timopoietina humana sintética com GLN na posição 31, substituindo o MET na sequência de ocorrência natural. Verificou-se que o MET na ocorrência natural é sujeita a oxidação, tornando a hTF' instável.

Ainda outro processo para a preparação dos poli péptidos hTF' e rTP da presente invenção é através da técnica de reacção em cadeia de polimerase (PCR). A técnica (PCR) pode ser utilizada para amplificar e detectar uma sequência de ácidos nucleicos de interesse a partir de uma mistura contendo essa sequência entre outras. Assim as sequências de hTP e rTP podem ser isoladas de timo ou de outras fontes de tecida, ou linhas de células humanas ou de rato por PCR. Para utilizar esta técnica, são concebidos dois primários de lados diferentes da sequência de hTP ou rTP, um no sentido de orientação e o outro no anti-sentido de orientação. έ misturada um excesso molar dos primários de oligonucleótidos 13

com a amostra biológica ou linha de células, estendendo os produtos primários de extensão que actuam como moldes para a síntese da sequência de ácido nucleico completa de hTP ou rTP, e detectar a sequência amplificada. 0 processo é descrito com pormenor nas Patentes Norte Americanas 4.683.195 e 4.683.202. Dado que as sequências de hTP e rTP são conhecidas, o especialista pode facilmente conceber primários adequadas para isolar e amplificar grandes quantidades de hTP ou rTP a partir de uma fonte biológica por PCR.

Os polipéptidos da presente invenção, ou os seus fragmentos activos, podem ser utilizados num processo para o desenvolvimento de anticorpos monoclonais e/ou antissoros policlonais. Esses anticorpos podem ser obtidos utilizando hTP ou rTP que partilham uma imunogenicidade essencialmente semelhante, um seu fragmento, ou uma sua versão modificada ou alélica como antigénio. Utilizando processos convencionais para o desenvolvimento destes anticorpos conhecidos do especialista, por exemplo, as técnicas de Kohler e Mi 1 stein ou outros aperfeiçoamentos, são obtidos anticorpos policlonais ou monoclonais que são áteis como agentes de diagnóstico ou terapêuticos.

Assim, outro aspecto da invenção inclui agentes de diagnóstica que compreendem toda ou parte das sequências de hTP ou rTP. Estes agentes, opcionalmente marcados com sinais detectáveis de vários tipos convencionais, podem ser utilizados para o diagnóstico de estados de doença que apresentem níveis elevados ou reduzidos de TP. Entre estes estados de doença estão incluídos, sem limitação, miastenia grave, doenças de imunodeficiência, doenças mediadas imunologicamente como por exemplo artrite r-eumatóide, lucus eritemotos sistémico e alergia, cancro, nutrição deficiente e infecções.

Um ensaio adequado utilizando hTP e/ou rTP é descrito com pormenor no Exempla 5 a seguir apresentado. Outros ensaios para TP são descritos na Patente Norte Americana 4.124.700, aqui incorporada como referência. • Outros formatos de ensaio podem também utilizar os polipéptidos 14

hTF‘ e rTP, os seus fragmentos, ou os anticorpos desenvolvidos com estes polipéptidos como é acima descrito. A utilização destes agentes de diagnóstico nesse ensaio pode ser útil para monitorar a eficiência da terapia em cada um dos tipos acima mencionados de estada de doença.

Dadas as características imunomoduladoras de hTP e rTP, a invenção também engloba a utilização terapêutica destes polipéptidos no tratamento de seres humanos e animais. Estes polipéptidos têm a capacidade de induzir a diferenciação de células mastro linfopoiéticas em tecidos hemopoiéticos em células derivadas do timo (células T) que são susceptíveis de envolvimento na resposta imune do corpo. Como resultado disso, os presentes péptidos são considerados como tendo múltiplos usos terapêuticas.

Na sua aplicação mais ampla, os presentes compostos são úteis para regular o sistema imune de um paciente, humano ou animal, que necessite dessa regulação. Tal como aqui utilizado, o termo "regulação" significa que os presentes compostos fazem com que o sistema imune regresse de um estado anormal de doença para um estado normal equilibrado. Principalmente, dado que os compostos têm a capacidade de efectuar algumas das funções indicadas do timo, eles têm aplicação em várias funções do timo e áreas de imunidade. Os presentes compostos são geralmente consideradas úteis em qualquer área em que a imunidade celular seja um facto a considerar e particularmente quando existem deficiências na imunidade, tal como, Síndroma de DiGeorge, que é uma condição em que existe uma ausência congénita do timo.

As hTP e rTP desta invenção podem também ser utilizadas para tratar condições de actividade imunológica excessiva. Assim, quando existe um excesso de produção de anticorpos devido a células T e células B desequilibradas, as presentes polipéptidos podem ser utilizados para tratar esta condição por estimulação da produção de células T. Assim, espera-se que estes polipéptidos tenham utilização terapêutica em certas doenças autoimunes em que são produzidos anticorpos danificantes, como por exemplo lupus 15

eritematoso sistémico, artrite reumatóide, ou doenças semelhantes.

Adicionalmente, estes péptidos são considerados úteis para o auxílio á imunidade colectiva do corpo, dado que eles aumentam ou ajudam a estimulação terapêutica da imunidade celular e assim são úteis no tratamento de doenças que envolvem a infecção crónica, como por exemplo infecções por -fungos ou mi copl asmas, tuberculose, leprose, infecções agudas e crónicas e virais. A presente invenção inclui assim processos para a regulação do sistema imunológico de um paciente que necessite dessa regulação que compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico (ou imunorregulador) de um dos presentes compostos, bem como composições farmacêuticas para a aplicação destes métodos. Tal como aqui utilizada o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que é eficaz para tratar condições que resultam da deficiência de células T, ou deficiência do timo, respectivamente. A presente invenção proporciona um processo de tratamento de condições que resultam de deficiências relativas ou absolutas do timo ou das células T num paciente (ser humano ou animal) que possua essa condição que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de hTP. Por exemplo, a administração de um dos presentes péptidos a um paciente que sofra da Síndroma de DiSeorge, ajudará, por exempla, a vencer esta deficiência. Os especialistas em imunologia podem facilmente determinar o regime adequado para a administração, (de preferfncia parentericamente) e podem determinar a quantidade eficaz de um dos presentes péptidos para o tratamento do Sindroma de DiGeorge. A invenção também proporciona um processo de induzir células mastro 1infopoiéticas de um paciente para desenvolver as características de linfócitos derivados do timo que compreende a administração ao paciente de uma quantidade indutora eficaz de hTP. A invenção proporciona 16

ainda composições -farmacêuticas para a realização destes métodos.

Para preparar as composições farmacêuticas da presente invenção, a hTP é combinada como ingrediente activo em mistura íntima com um veículo •farmacêutica de acordo com técnicas convencionais de preparação de composições -farmacêuticas. Este veículo pode ter uma grande variedade de -formas dependendo da -forma da composição pretendida para a administração, por exemplo, para a administração sublingual, rectal , nasal, oral, ou par-entérica. Na preparação das composições em -forma de dosagem oral, podem ser utilizadas quaisquer meios -farmacêuticos habituais, como por exemplo água, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e produtos semelhantes no caso de composições orais líquidas (por exemplo, suspensões, elixires e soluções) ou veículos como por exemplo amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubri-ficantes, ligantes, agentes de desintegração e produtos semelhantes no caso de composições sólidas orais <por exemplo pós, cápsulas e comprimidos). As -formas de libertação controlada podem também ser utilizadas. Dada a sua facilidade de administração, os comprimidos e as cápsulas representam a forma de unidade de dosagem mais vantajosa, e nesse caso os veículos sólidos são obviamente os utilizados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com açúcar ou revestidos entericamente por técnicas convencionais.

Para utilizações parentéricas, o veículo compreenderá habitualmente água esterilazada, embora se possam incluir outros ingredientes para auxiliar e aumentar a solubilidade ou para objectivos de conservação (por exempla). Podem também ser preparadas suspensões injectáveis, e nesse caso podem e devem ser utilizados veículos líquidas, agentes de suspensão, e produtos semelhantes, adequados. A hTP é geral mente activa quando é administrada parentericamente em quantidades acima de cerca de ljjg/kg de peso corporal. Para o tratamento do Sindroma de DiGeorge, os péptidos podem ser administrados parentericamente 17

de cerca de 0,1 a cerca de lOmg/kg de peso corporal. Beralmente, pode ser utilizada a mesma gama de quantidades de dosagem no tratamento de outras doenças ou condições aqui mencionadas em que tem que ser tratada a imunodeficiência. São úteis maiores quantidades (por exemplo, cerca de 10-100 mg/kg de peso corporal) para suprimir a actividade imune em excesso.

Os seguintes exemplos ilustram o isolamento de hTF' e processos para a produção recombinante de hTP e/ou r-TP. Estes exemplos não pretendem limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1; Isolamento de hTP do Timo Humano

Foram obtidos timos humanos -frescos de espécimes cirúrgicos pediátricos e espinal medula humana de espécimes cirúrgicos ou de autópsia e foram guardadas a ~35°C. Os materiais de separação e o dispositivo utilizado foram adquiridos comercialmentes Sephadex (Pharmacia), hidroxiiapatite (Bio-Gel ΗΡΗΤ; Bio-Rad) , e coluna de permuta iónica preparativa de grandes poros (2,5 x 25 cm: DE 500, tamanho de partícula 40-60 μ) para CLAR - Cromatografia Líquida de Alto Rendimento (Separation Industries, Metuchen, HJ). A purificação de hTP foi controlada utilizando um ensaio de RIA para a bTP que era reactiva cruzadamente com a hTP EG. Goldstein, 3. Immunol., 117;690-692 (1976), e P. J. Lisi e col., Clin. Chem. Acta., 107;111-119 (1980)3. Resumidamente, a bTP foi marcada com i£aasI pelo método de Boiton-Hunter CA. E. Bolton e col., Biochem. J., 133:529-539 (1973)3 e a bTP radiomarcada foi purificada da forma descrita CT. Audhya e col., Arch. Biochem. Biophys., 534:167-177 (1984)3. 0 anticorpo anti-bTP (diluição de 1:10.000) foi marcado com **=1 (10.000 cpm), na presença ou ausência de vários fracções de péptido em tampão de fosfato, e foram incubadas durante 8 horas a 22°C. A separação de bTP livre e 18 4 *

ligada -foi efectuada em 24¾ de polietileno glical â temperatura ambiente, seguido de centrifugação a 2000 rpm durante 15 minutos» A bTP ligada -foi avaliada num espectrómetro-3T LKB»

Foi extraído um tisno humano em foieabornato de amónio 100 mM f contendo 50 ng de 2-mercaptoetanol, 175 feniImetiIsulfonilo, e 375 pg de ácido

tetraacético (EDTA) por ml) por homogeriização num Misturador Waring Blender (Dynamics, New Hart-ford, CT) » Após centrifugação a 14.000 x g durante 10 minutos a 4°C, o sobrenadante -foi filtrado através de um pano de queijo a armazenado a 4oC após adi ção de timerosal a 0,1% e as ida de sódio a 0,1%. 0 extracto solúvel foi processada por ul-traíiltração a 4°C utilizando uma membrana Amicon Diaflo XM1C0 (limite de exclusão molecular — 100.000) e concentrada com Diaflo UH2 (limite de exclusão molecular — 1000), reduzindo o volume de 1/10 para 1/50.

lote de 714 g do rio (25% em peso, Mg de -flúor et o de etileno diamino 0 retido continha proteínas com um peso molecular compreendido entre 1000-100.000 da filtração com UM2, e foi cromatogr-afada em resina Sephadex G-75 de tipo pérola (tamanho de partícula, 40-120 Pm) á temperatura ambiente numa coluna de 5 x 150 cm em bicabornato de amónio. As fracções imunorreactivas foram 1iafi1izadas. Foram determinadas dois picos importantes contendo material imunorreactivo (ver Fig. 1). As proteínas de maior peso molecular não foram caracterizadas. Foi ainda processado o pico de peso molecular inferior (M,- 3000-8000) por cromatograf ia de coluna em hidroxiapatite utilizando Bio-Sel HPHT (coluna 2,5 x 60 cm 5 5 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,8), sendo a mostra aplicada no mesmo tampão. A eluição foi feita com 30ml do mesmo tampão e em seguida com 35 ml de tampão de fosfato 50mM. As fracções imunorreactivas foram combinadas, concentradas numa membrana Amicon Diaflo UM2, dessalinizadas uma coluna de Sephadex S-25 (fina) 0,6 x 30 cm em bicabornato de amónio 10 mM (pH 8,0), e 1iof11izadas.

A hTP foi submetida a CLAR utilizando uma coluna de permuta iónica DE 500 preparativa de 19

2,5 κ 25 cm. Ο gradiente de solvente linear é iniciado com tampão de Tris acetato 20 mH (pH 6,0) e acabado com uma diluição a 80% do mesmo tampão com acetato de sódio 500 mH. As fracções imunorreacti vas •foram combinadas, dialisadas com Spectrapor—6 (limite molecular de exclusão = H^ 1000), e 1iofi1 iradas» Foi e-fectuada uma cromatogra-fia adicional numa coluna de -fase inversa Vidac Ciq (218TP54) com um gradiente linear, partindo de formato de amónio 50 mH ípH 6,5) e acabando com uma diluição a 60% com acetonitrilo, fts fracções eluídas por CL.AR foram parcialmente evaporadas, liofilizadas e reconstituídas em 500 pl de bicabornato de amónio 50 mH (pH 8,0). Foram ensaiados volumes de 25 pl em duplicada por RIA com combinação e liofilisação das fracções imunorractivas.

Os rendimentos obtidos com as fases de purificação para hTF' são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 F-e&Sfô dí3 Pur i f i c. Proteína Total,mg Proteína Imunor react i va mg % Tas-ía de Pur i f i c Rec % Proteína UItraf i1trada 68.000 309,5 0,45 1 100 Filt. de Gel de 8-75 2.950 76,9 2,6 6 25* Cromatog. Hidrofóbica 181,2 32,6 18 40 11 CLAR Prep. Cromatog.de 3,4 2,8 82 182 0,9 fase inversa 1,4 1,3 93 207 0,42 * Pico de peso molecular inferior Eí<emplo 25 Análise de Seg urança de hTP Foi efectuada a análise de 1 aminoácidos com um analisador de aminoácidos Liquimat III após 20 " ' "iisMTCpwwwaaw11,

hidrólise ácida em HC1 5,7 H contenda 0,5% de 2-mercaptanol durante 22 horas a 100°C CD. H. Speckam e col., Anal. Chem., 30s1190-1206 (1958)3.

Foi preparada hTP maleatada por adição de anidrido maleico em 1,4-dioxano <100 pl) com um excesso de 20 vezes em relação aos grupos de amino livres dos polipéptidos <500 pl), que foram dissolvidos em borato de sódio lOOmM <pH 9,3). 0 anidrido maleico foi adicionado em fases durante um período de 4 horas, sendo mantido um valor· de pH 9,3 com Na0H 6M« A proteína maleatada foi em seguida dessalinizada em Bio-Gel P-2 em NH^hcO.^ 100 mM <pH 8,2) e lionilizada»

As digestões tripticas de hTP maleatada foram efectuadas num tampão de acetato de N-etilmorfolina 0,2 M <pH 8,1) a 337°C durante 6 horas. Foi adicionada tripsina pancreática de bovino (tratada com cloreto de difeniIcarbonilo? 8400 unidades de éster etílico da N -benzoli1-L-arginina por mg de proteína, tipo Sigma XI) para uma proporção final de enzirna/substrato de ls 100 em peso. 0 valor do pH foi mantido a 8,5 durante a digestão e em seguida diminuído para 2,0 por adição de HC1 10 mH para terminar a reacção. A mistura foi em seguida liofilizada.

Foi clivada a hTP (200pmol) com CNBr em 150 pl de ácido fórrnico a 70% durante 23 horas a temperatura ambiente no escuro? e foi utilizado um excesso molar de 200 vezes de CNBr em relação ao teor de metionina na amostra. 0 volume foi em seguida reduzido para 60 pl em 1½ @ aplicado directamente ao filtro de vidro do sequenciador de fase gasosa CM. W» Hunkapiller e cal., Methods Enzymal., 91s599-413 (1983)3.

Os péptidos digeridos com tripsina e clivadas com CNBr foram purificados da seguinte forma. Os péptidos trípicos foram dissolvidas em ácido ortofofosfórico a 0,1% (pH 2,2) e foram centrifugados a 15.600 x g durante 5 minutos? o sobrenadante foi aplicado á coluna de fase inversa Ci.® CVidac 218TP54, 46 mm x 25 cm, tamanho de partícula 5 Pm, The Separation Group, Hasperia, CA3 por CLAR (gradiente LDC módulo com espectromonitor H e integrador de computação CI-10 r?i .Ui .!.

Foi ligado a um colector· de fracções de Redirão LKB 2112). utilizado um gradiente de eluição linear partindo de ácido fosfórico a 0,1% e acabando com acetonitrilo a 80%, Foi obtido acetonitrilo de pureza muito alta de Burdick e Jackson (Muskegon, MI) e destilado em vidro. Foi filtrado o ácido fosfórico (í%) através de um filtro de Millipore tipo HA 0,45 JJm (Millipore). Todos os solventes foram desagasi ficados durante 20 minutos em vazio com agitação.

Foi efectuada a análise de sequência automática em hTP intacta e tríptica e os fragmentos de brometo de cianogénio de hTP por sequenciação em fase gasosa sendo utilizada um sequenciador em fase gasosa da Applied Biosystems modelo 470A com Polybrene como veículo e um programa convencional de acoplamento simples, clivagem simples. Gs aminoácidos derivados de feni1tiohidantóina resultantes foram identificados por CLAR com um cromatógrafo líquido de alta pressão Hewlett Packard modela 1084B CD. H. Schlessinger, Methods enzymol., 93^:494-502 (1983)1. A análise do terminal C de hTP (150 Mg cada) foi efectuada em carboxipeptidase de levedura Y (2 nmol) dissolvida em acetato de sódio 100 mM (pH 6,0) a 37°C. Em várias alturas, foram removidas alíquotas do digerido e adicionadas a tubos contendo Ml de ácido acético glacial, e a mistura foi seguida liofilizada. A amostra foi dissolvida em citrato de sódio 0,2 M (pH 2,2) e aplicada ao analisador de aminoácidos. As partes vazias de enzima e péptido foram também processadas.

Como resultado da aplicação dos processos acima referidos, 1,4 kg de timo humano congelado recentemente produziram 1,3 mg de hTP imunorreacti va (recuperação de 0,4%s Tabela 1). Este produto tinha uma banda importante e algumas bandas menores por focagem de gel isoeiéctrico. 0 ponto isoeléctrico da banda importante era de 6,1 ± 0,2. A Tabela 2 ilustra a composição em aminoácidos de hTP em proporções molares. nrj s

Tabela 2

Aminoácido Determinado Média + SK* Ácido Cisteico 0 ND Ácido Aspártico n At 2,29 i 0,12 Treonina 3 3,11 ± 0,23 Serina 1 0,81 ± 0,19 Ácido BlutSmico 6 5,55 ± 0,22 Prolina 3 2,80 i 0,30 G1 icina 3 At ^ ± 0,27 Alai i na 4 4,25 ± 0,10 Vaiina 6 6,23 ± 0,30 Metionina 1 0,87 í 0,13 Isoleucina 0 0,10 ± 0,11 Leuci na 9 £3 "7^ w if f A· 0,36 Tirosina *-} A* 1,90 ± 0,12 Fenilalanina 0 0,16 + 0,11 Lisina 5 4,92 ± 0,31 Histidina n At 1,76 Hl· 0,12 Arginina 1 1,07 Hl· 0,13 ND, não detectado • * Média de duas determinações (24 e 76 horas) . A serina foi aumentada de 10% e a treonina de 5% para compensar a destruiçlo pelo ácido. A hidrólise -foi efectuada com HC1 em ebuli çSo constante a 110°C em vazio. A clivagem com brometo de ciagénio de hTP produziu 3 fracções distintas (ver Fig it At / 1 e as sequências de aminoâcidos resultantes para cada uma sâo resumidas na Tabela 3. O A. 3

Método de sequenciação

Resíduos Identi-ficados

Degradação N-terminal

Clivagem com CNBr de TP nativa i-46

Pico I 1-11

Pico II 32—46 Método de carboxipeptidade C-terminal 44-48

Pico III 37-47

Pico IV Não foram obtidas sequências

Pico V 18-30 Método de carboxipeptidase C-terminal 45-48 A determinação estrutural de hTP foi efectuada por sequenciação de terminal—N automatizada de 240 pmol de hTP atravésde 46 ciclos por degradação de Edman, que produziu um rendimento repetitiva (rendimento médio por ciclo) de 93,4% e identificado cada um dos 46 resíduos de terminal-N (ver Fig. 3). A libertação tamporizada de aminoácidos do terminal C de hTP intacta com carboMipeptidase Y (Tabela 4) proporcionou uma sequência de tetrapéptidos no terminal C inequívoca com sobreposição de dois aminoácidos (resíduos 45 e 46) com sequência de terminal—N. A sequência parcial de hTP foi confirmada pela determinação da estrutura do fragmento CNBr (Fig. 2), que englobam os resíduos 32-40 e que incluia o sítio activo. Além disso, a composição em aminoácidos de hTP intacta (Tabela 2) tinha em conta todos os aminoácidos determinados por análise da sequência. A Tabela 4 seguinte demonstra a libertação de aminoácidos livres ao longo do tempo do terminal C com Carboxipeptidase Y. 24

Tabela 4

Aminoácido Produção de lOOs 120s aminoácidos 150s 200s 250s 300s Thr — — - *•*5*2» i U 210 263 Ala _ - 88 258 276 288 Leu 148 275 283 418 503 His 289 310 300 308 299 Exemplo 3s Isolamento de rTP de Timo do Rato

Foi descongelado timo congelada em gelo, e -foram removidas cápsulas e skcsssd de gordura. 0 timo (74 g) -foi homogeneizado em gelo com bicabornato de amónio 0,05 M (25% de humildade p/v; pH 8,3) contendo 50 ng de 2-mercaptoetanol , 175 Pg de -flúor et o de -fenil meti 1-sulf oni lo e 375 pg de etileno diamino tetra acetato de di-sódio por ml de tampão. Os materiais insolúveis -foram removidos por centri-fugação a 17.000 x g durante 60 minutos. 0 sobrenadante foi filtrado através de gaze e foram adicionados timerosal e azida de sódio como agentes bacteriostáticos, cada um deles para uma concentração final de 0,1%. 0 extracto solúvel foi processado a 4°C através de Lima célula agitada com 350 ml de Amicon com membrana YM-100 (100.000 como peso molecular de corte). D filtrado foi concentrado (740 para 70 ml) com uma membrana YM-2 (corte de P.M. 2.000), e a parte retida foi submetida a cromatografia de coluna em Sephadex 8-50 (tamanho de partícula 20-80 pm) numa coluna de vidro de 2,5 x 100 cm á temperatura ambiente em tampão de bicabornato de amónia 0,05 M (pH 8,3).

Foram carregadas amostras de 20 ml (gama de peso molecular de 2.000 a 100.000 dal tons) para cada lote (caudal de 40ml/h), e as fracções contendo timopoietina foram identificadas por um radioimunoensaio HG. Goldstein, J. Immunol., 117s 690-692 (1970)3. 0 teor de proteínas foi determinado por um reagente de ensaio de proteínas de Azul de Coomassie (Pierce, Rockford, 1L), de acordo com as instruções do fornecedor e a proteína liofilizada foi submetida a uma penei ração de alta resolução molsicular como se descreve a seguir.

Foi embalada Sephacryl HR-lOO (Pharmacia, Fiscataway, NJ) de acordo com as recomendações do fornecedor numa coluna Pharmacia XK 16/70 ligada a um sistema de cromatograf ia rápida de alto rendimento (FPL.C). 0 tampão para a embalagem e processamento da coluna foi o bicabornato de amónio 0,02 ΙΊ (pH 7,0) A capacidade do leito da coluna era de aproximadamente 130 ml. A proteína liofilizada (2,0 a 3,0 mg) foi ressuspensa em 1,3 ml de tampão e aplicada á coluna através de um circuito de injecção de 0,1 ml, sendo a coluna processada através de um caudal de 1,5 ml/min. A absorção de ultravioletas do efluente da coluna de filtração de gel foi monitorada por um dispositivo LKB Unicord-s II ligado a um registador de 2 canais, e foram recolhidas as fracções de 1,5 ml.

As fracções correspondentes de vários lotes de cromatografia foram combinadas, e o teor de proteína foi determinado por O.D. a 280 nm. Elas foram em seguida liofilizadas em recipientes de vidro com silicone e ensaiados para a determinação da imunorreactividade da forma a seguir descrita.

Exemplo 4s Imunorreactividade de rTP

Foi ensaiada a timopoietina de rato, isolada da forma descrita no Exemplo 3, utilizando o anticorpo 26

de timopoietina anti-humana de coelho de elevado título. 0 antissoro foi incubado com diferentes concentrações de proteína solúvel isolada de coluna Sephacryl HR-100 durante 2 horas a 37°C numa plataforma rotativa. A mistura foi adicionada a uma placa de microtitulação de policloreto de vinilo revestida com timopoietina de rato de acordo com os processos anterior-mente descritos CT. Audhya e col., Scand. J. Immunol., 31;199-204 (1990)3 e incubada a 37°C durante 2 horas. Após lavagem da placa com uma solução salina tamponada com fosfato 0,15 M, pH 7,2 contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween 20), foi adicionado anticorpo anticoelho de cabra conjugada com peroxidase de rábano (HRP0) (Jackson Labs, West Grave, PA) e a placa foi incubada a 37°C durante 1 hora. Após três lavagens posteriores com PBS-Tween 20 foi adicionada um sistema de substrato-cromogénio consistindo em Heoh e 3,3, 5,5-tetra metil benzidina (TMB) (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) e deixou-se desenvolver a cor â temperatura ambiente no escuro durante 30 minutos. A reacção foi terminada com a adição de HC1 2,5 N, e a densidade óptica foi registada a 450 nm. 0 ensaio de imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) utilizando placas revestidas com timopoietina de rato e anticorpos de timopoietina anti-humanos, a timopoietina de rato e humana purificada deram curvas de deslocamento paralelas revelando uma semelhança imunológica, possuindo a timopoietina de rato 10,4% de imunorreactividade quando comparada com a timopoietina humana. Pelo contrário, a timopoietina de bovino não tinha uma curva de de deslocamento paralela e tinha menos do que 0,1% de reactividade cruzada com a timopoietina humana neste imunoensaio»

Exemplo 5; Electroforese de Gel de Poliacrilamida (PAGE) e Análise de Revelaçgjp de Western A amostra de proteína, obtida pelos procedimentos acima descritos no Exemplo 3, foi caracterizada

preparando 10 pl de amostra em 0,25 1 de dedodecil fosfato de sódio a 10% (BDS) e 1 pl de bromofenol azul e efectuando a electroforese num sistema de Pharmacia PhastSystem utilizando um gel de poli criamida homogéneo SDS a 20%. Antes do final do processamento com electroforese de gel, foram humidificadas seis pedaços de papel de filtro e um pedaço de papel de microcelulose com 0,2 micrometros com um tampão de transfer'i'ncia (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol 5 pH 8,3). Foi em seguida montada uma sanduíche de transfer'i'ncia na seguinte ordem! 3 pedaços de papel de filtro, papel de nitroceiulase, o gel, e 3 pedaços de papel de filtro. A proteína foi em seguida transferida para um sistema de PhastTransfer durante 6 min/gel a 25 mA/gel. A membrana foi bloqueada durante a noite com 3% de albumina de soro de bovino (Sigma Chemical Ca., St. Lauis, M0) em PBS~Tween 20, lavada por três vezes com PBS-Tween 20, e deixada reagir com Anticorpo Manoelanal conjugado HRPQ contra timopoietina humana a 37°C com rotação durante 2 horas. A membrana foi lavada por 3 vezes em PBB-Tween 20 e incubada com a mistura de substrato-cromogénio (membrana de peroxidase TMB, Kirkegaard Perry Labs, Gaithersberg, MD) durante 15 a 30 minutos, lavada com água, e seca ao ar. 0 ensaio de PAGE demonstrou que a timopoietina de rato e humana tinham pesos moleculares semelhantes. Foi demonstrado que a timopoietina de rato migrava de forma semelhante á timopoietina humana pelo ensaio de revelação de Western.

Exemplo 6s Caracterização de Timopoietina de Rato Purificada a. Composição em Aminoácidos. A composição em aminoácidos foi determinada por amostras em quadripliçado de polipéptido hidrolisado com HC1 6 N a 110°C em vazio durante 24, 50, 71 e 94 horas, e os valores obtidos foram extrapolados para um tempo de hidrólise de zero. As análises foram efectuadas num analisador de aminoácidos Beckman modelo 6300 (Paio Alto, CA) pelo método de Moore e col., Anal. Chem., 30;1185-1190 (1958). 28 b. Focagem Isoeléctrica Utilizando PftGE. 0 método da -focagem isoeiéctrica utilizado foi o de Finlayson e Chrambach, ftnal. Boichem., 405292-311 (1971) dando a mistura de anfolina um gradiente de pH entre 2,5 e 8,0, A focagem isoeléctrica revelou que o valor de pi da timopoietina de rato era de 6,8. c. Análise dos Terminais Carboxi com Carboaipeptidase. A análise dos terminais de carboxi de timopoietina de rato foi efectuada da forma descrita por T. Audhya e col. , F‘roc. Natl. Acad. Sei., 84i3545-3449 <1987). A proporção de enzima para substrato era de ls200. Esta análise de carboKipeptidase dependente do tempo produziiu Arg, Lys, e His em proporções equimolares.

d. Análise de Sequência de Terminal-NH-», Foi fraccionada uma parte da proteína purificada (200 nmol) por electroforese de F'AGE com 4-20% de SDS para uma corrente constante de 50 mA. No final do ensaio, as proteínas foram transferidas do gel para uma membrana de polidifluoreto de vinilideno (PVDF) utilizando uma unidade de electrorrevelação semi-seca (integrated Separation System SI 10201 (Hyde Park, MA) utilizando uma corrente constante a 200 V durante 30 min. A membrana foi revelada com Azul de Coomassie e bem lavada. A membrana de PVDF contendo a proteína revelada na área de 5,5 kD foi cortada em pedaços de 2 x 4 mm e colocada por cima do filtro condicionado de Biobrane como suporte inerte. 0 ensaio de degradação automática de Edman foi efectuada num dispositivo sequenciadar de proteínas em fase líquida pulsada da Applied Biosystems Modelo 477A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os aminoácidos de feniltiohidantoína (PTH) foram identificados num analisador de aminoácidos em linha da Applied Biosystems PTH (Modelo ABI 120A) . 0 eluente foi monitorado a 269 rim. A sequenciação automática de 1000 pmol da proteína através de 48 ciclos a partir do terminal-N resultou na obtenção de um * rendimento repetitivo de 93%« 29

Exemplo 7; Expressão do TP Recombinante Humana ou de Rato

Para se obter a hTP ou a rTP, o cADN que as codificam é transferido para um vector de expressão adequado, de que se conhecem vários tipos para a expressão em mamíferos, insectos, leveduras, fungos e bactérias, por técnicas de biologia molecular convencionais, Por exemplo, a série pUC de vectores está comercialmente disponível. Outros vectores para a expressão em mamíferos são descritos, por exmplo, em pXM CY. C. Yang e col., Cel1, 47i 3-10 ¢1986)3. 0 vector escolhido pode ser linearizado com a enzima de endonuclease adequada e pósteriormente ligado numa quantidade equimolar separadamente em relação ao cADN que codifica a hTP ou a rTP que foram previamente modificadas por adição de oligonucleótidos sintéticos que produzem terminais complementares para gerar construções para expressão. Estas construções podem ser expressas em vários hospedeiros com vectores adequadas. 0 especialista pode também construir outros vectores de expressão em mamíferos por, por exemplo, inserção das sequências de ADN de hTP ou rTP num plasmídio com enzimas adequadas e utilizando técnicas de engenharia genética recombinante bem conhecidas e outras vectores conhecidos tais como pUC18, que é comercialmente vendido pela Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido ou Pharmacia, Uppsala, Suécia. a" Expressão em Células de Mamíferos 0 vector de expressão em células de mamíferas pode ser sintetizado por técnicas bem conhecidas dos especialistas. Os componentes dos vectores, por exemplo replicões, genes de selecção, potenciadores, promotores e produtos semelhantes, podem ser obtidos a partir de fontes naturais ou sintetizadas por procedimentos conhecidos. Ver, por 30

exemplo, Kaufman e col. , J. Mol. Biol. , 159; 511-521 (1982) 5 e Kaufman, Froc. Natl. Acad. Sei., USA, 82; 689-693 (1985). As células de hospedeiro de mamíferos exemplares incluem linhas de células de roedores, incluindo linhas de células transfarmadas. As células diplóides normais, estirpes de células derivadas de uma cultura invitro de tecido primária, bem como explantes primários são também adequadas. As células candidatas não necessitam ser genotipicamente deficientes no gene de selecção desde que o gene de selecção esteja a actuar do ponto de vista dominante. Para uma integração estável dis ADN de vectores, e para amplificação posterior dos ADN de vectores integrados, ambos por processos convencionais, podem ser utilizadas células CHG. Alternativamente, o ADN do vector pode incluir todo ou parte do genoma do vírus do papiloma de bovinos CLusky e col., Cel1, 3hi391-401 (1984)3 e pode ser realizado em linhas de células como por exemplo células de rato C127 como elemento epissómico estável. Outras linhas de células de mamíferas adequadas incluem mas não se limitam a HeLa células de macaco C0S--1, células de linhas de hamsteres BHK ou HaK. A transformação dos vectores com hTP ou rTP em células hospedeira adequadas pode resultar na expressão dos polipéptidas hTP ou rTP. Os transformantes estáveis são em seguida escrutinados para a expressão do produto por ensaios convencionais imunológicos, biológicos ou enzimáticos. A presença de ADN e mARN que codificam os polipéptidas hTPou rTP pode ser detectada por procedimentos convencionais como por exemplo a revelação de Southern e revelação de ADN. A expressão transiente do ADN que codifica os polipéptidas durante os vários dias que passam após a introdução do ADN no vector de expressão em células hospedeiro adequadas, como por exemplo células de macaco C0S-1, é medida sem selecção por actividade ou ensaio imunológico das proteínas no meio de cultura. 31

b. Sistemas de Expressão Bacterianos

Os especialistas podem manipular·, de forma semelhante, as sequências que codificam hTF* ou r-TP eliminando quaisquer sequências reguladoras de mamíferos que flaqueiam as sequências codificantes e inserindo sequências reguladoras bacterianas para criar vectores bacterianos para expressão intracelular ou extracelular de hTP ou rTP da invenção por células bacterianas. 0 ADN que codifica a hTP ou rTP pode ser ainda codificada para conter diferentes códões para optimizar a expressão bacteriana, como é sabido. A sequência que codifica a hTP ou a rTP maduras é de preferência operativamente ligada á estrutura das sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido líder de secreção permitindo a expressão bacteriana, secreção e processamento do polipéptido de hTP ou rTP maduras, também por processos conhecidos. A expressão de hTP ou rTP em E. coli utilizando esses sistemas de secreção pode resultar na secreção de um polipéptido activo.

Os compostos expressas através de qualquer das vias em células de hospedeiro bacteriano podem serem seguida recuperadas, purificadas, e/ou caracterizadas em relação aos parâmetros físico-químicos, bioquímicos e/ou clínicos, todos eles por processos conhecidos. c* Expressão em Células de Insecto ou de Levedura

Podem ser efectuadas manipulações semelhantes para a construção de um vector de insecto para expressão de polipéptidos hTP ou rTP em células de insecto CVer, por exempla, os procedimentos descritos na pedida de patente Europeia publicad nfi.155.47&]. São construídos de forma semelhante vectores de leveduras utilizando sequências reguladoras de • levedura para expressar o cADN que codifica a hTP ou a rTP em 3^

células de levedura para produzir hTP ou rTP extracelular activo e segragado. EVer, por exemplo, os procedimentos descritos no pedido PCT publicado WQ 86/00639 e pedido de patente Europeia EP 123.2893.

Em qualquer dos sistemas de expressão acima descritos, as linhas de células resultantes podem ser ainda amplificadas por selecção de medicamentos adequados, resultando linhas de células reclonadas e sendo o nível de expressão avaliado utilizando o ensaio de hTP ou rTP aqui descrito.

Exemplo 8i Ensaios de Diagnóstico Utilizando hTP ou rTP

Podem ser utilizados os segintes ensaios para diagnosticar os níveis de TP em circulação em fluídos de tecidos de um paciente escolhido para diagnóstico de doença ou monitor-ação da eficácia do tratamento. a. Radioimunoensaio-Separação de Polietileno Glicol

Para ensaiar uma amostra de fui do cerebrospinal de um paciente escolhido (“CSF") para conhecer o nível de TP, a amostra é preparada por cromatografia em peneiro molecular em Sephadex G-50 em bicabornata de amónio 0,1 m, pH 8,0. As fracções além do volume excluído (V0) e antes do volume incluído (V4) são combinadas e 1iofi1izadas e o pó resultante retomado em tampão para a timopoietina. Esta preparação serve para excluir as moléculas com pesos moleculares superiores ou inferiores á timopoietina do ensaio. A 0,5 ml de antissoro hTP diluído em 5% de gama globulina de bovino em NaCl 0,15 M tamponado com fosfato 0,01 M (tampão BBS) são adicionados 0,2 ml de uma amostra de CSF de um paciente escolhido e 0,3 ml de iSí®i-hTP ou 33 iasj-r-ΤΡ desta invenção (50.000 cpm em tampão B88). fts incubações são efectuadsa em triplicado em tubos de plástico de 12 75 mm.

Os tubos de ensaio são agitados num misturador de vórtex e deixados em repouso durante 2 horas á temperatura ambiente, é em seguida adicionado meio mililitro de polietileno glicol a 30% -frio a cada tubo que é em seguida agitado num misturador de vórtex e centrifugado a 2.000 rpm num centrifugador refrigerado durante 30 minutos. Os sobrenadantes são aspirados e a radioactividade nos precipitados é determinada num espetrómetro gama automático. é calculada a quantidade de iaasi-hTF’ precipitada (%) de acordo com a -fórmula i~c(b-c0 x 100 em que a^cpm precipitado com anticorpo» b-cpm total adicionado, e c=cpm precipitado não espeeificamente com o soro normal de coelho ou com o anticorpo e a timopoietina não marcada em excesso (estes são habitual mente de valor aproximado de 10% do cpm total). Para a curva padrão da inibição da ligação, a ligação de timopoietina foi calculada como a percentagem da ligação de timopoietina máxima com anticorpo a 10*"1. é utilizada uma diluição de anticorpos de is3.000 para a curva padrão da inibição de ligação. b“ Radioimunoensaio-Separapão de Anticorpos Duolos é repetido o procedimento A anterior com a excepção de ser utilizado o tampão de BGG com KC1 4 M e após duas horas de incubação adicionados um total de 0,1 ml de anticorpo anti-coelho de cabra e 0,2 ml de anticorpo normal de coelho, os componentes misturados num misturador de vórtex e a mistura resultante deixada em repouso ã temperatura ambiente durante 5 minutos e em seguida -foi centri-fugada. 0 sobrenadante foi aspirado e contou-se o precipitada para a determinação da radioactividade tal como na Parte A anterior. 34 c. Radioimunoensaio-Separagão de Carvão Revestido com Dextrano é preparado carvão revestido com dextrano misturando volumes iguais de íi) 5 g de carvão Norit A por cada ml de tampão de -fosfato contendo KC1 2 11 e gama globulina de bovino e <ii) 0,5 g de dextrano 110 por cada 100 ml de tampão de'fosfato contendo KC1 1 M e gama globulina de bovino. é adicionado um total de 0,5 ml de carvão revestido com dextrano a 4oC ao tubo de ensaio após a incubação de duas horas tal como na parte B anterior e a mistura é deixada em repouso a 4°C durante 30 minutos. Os tubos são centrifugados e os sobrenadant.es aspirados. Os agregados são contados para a determinação da sua radioactividade que representa a timopoietina "não ligada" neste ensaio. A curva padrão de inibição da ligação sobre a timopoietina não marcada no ensaio utilizando a separação com polietilino glicol do complexo de antigénio-anticorpo revela uma sensibilidade ás concentraç,ões de timopoietina superiores a 5 ng/ml. Não é produzido deslocamento significativo pelos polipéptidos de controlo que incluem insulina, alfa-bungarotoxina, ubiquitina, histona e um fragmento de tridecapéptido sintético de timopoietina (resíduos 29-41) a concentrações de 10 1 1.000 ng/ml.

As curvas de ligação-inibição para a timopoietina não marcada nos ensaios utilizando a separação de anticorpo duplo e de carvão revestido com dextrano do complexo de antigénio-anticorpo revelam sensibilidade ás concentrações de timopoietina a 0,1 ng de timopoietina/ml. Estes dois últimos procedimentos são assim especialmente adequados para medir teores de timopoietina em amostras de CSF.

Estão inclídas na especificação acima descrita várias modificações e variações da presente invenção e entende-se que elas são óbvias para o especialista. Por exemplo, a utilização de vectores, componentes de vectores e células hospedeiras, adequados para a produção recombinante 35

Claims (1)

1. dos polipéptidos desta invenção é considerada dentro da técnica apresentada nesta especificação» Considera-se que estas modificações e alterações ás composições e processos da presente invenção estão englobadas no âmbito das reivindicações «ϋΠθΚ í&S η REIVINDICAÇSES - lã - Processo para a preparação de timopoietina de rato, essencialmente isenta de contaminação com outras substâncias proteicas de mamíferos, possuindo a seguinte sequência de resíduos de aminoácidos GLY-MET-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYG-LEU-LYS-SER”GLU-LEU-VAL“ALA-LYS--GLY-VAL”ALA”LEU~PRO~ALA“ GLY-GLU-GLN-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-AGP-ILE--T YR-PRG-GLN-HIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-ARG. caracterizado por se efetuar a cultura de uma linha de células t r ansf or mad a com uma sequência de ADN que c od i f i c a uma expressão de timopoietina de rato ou um seu fragmento em assoei ação operativa com uma sequência de controlo de expressão. 36

   - 2â - Processo para a preparação de um agente de diagnóstica para determinar α teor de timopoietina numa amostra de um -fluído de tecido de um paciente caracterizada par se incorporar timopoietina de mamíferas possuindo toda ou parte da sequtncia de aminoácidos consistindo em GLY-MET~PRQ~LYS-6LU“VAL-PRa~ALA-VAL-LEU--THR~LYS~BLN-LYS- LEU~LYS-SER~BLU~LEU“VAL-ALA-LYS-BLN-VAL~ALA-LEU“PRO-ALA- BLY-BLU-GLN-ARQ-LYB-ASP-VAL-T'YR--VAL-ASP~ILE-TYR-PRO-SLN- HIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-AR6. opcionalmente em associação com um marcador detectável. 3ã Processo para a preparação de timopoietina de rato caracterizada por se sintetizar quimicamente a sua sequtncia de aminoácidos. - 4ã - Processo para a preparação de timopoietina de rato caracterizada por se utilizarem primários adequados para isolar e amplificar grandes quantidades de timopoietin de rato de uma fonte biológica por meio de uma r-eacção em cadeia de polimerase. - 51 - Processo para a preparação de timopoietina de rato caracterizado por se isolar a sequência de tecido do timo de rato. A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 8 de Maio de 1990, sob o número de série 07/520,672. Lisboa, 7 de Maio de 1991.

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