CS133091A3 - Human and rat thymopoietin - Google Patents
Human and rat thymopoietin Download PDFInfo
- Publication number
- CS133091A3 CS133091A3 CS911330A CS133091A CS133091A3 CS 133091 A3 CS133091 A3 CS 133091A3 CS 911330 A CS911330 A CS 911330A CS 133091 A CS133091 A CS 133091A CS 133091 A3 CS133091 A3 CS 133091A3
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- glu
- leu
- htp
- lys
- val
- Prior art date
Links
- 101710163560 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 title claims description 37
- 101710189385 Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 title claims description 37
- 239000000898 Thymopoietin Substances 0.000 title claims description 37
- 102100023981 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Human genes 0.000 title claims 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims 1
- 101001047746 Homo sapiens Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 description 106
- 102000046104 human TMPO Human genes 0.000 description 106
- 101001047731 Homo sapiens Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 description 105
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 102400000159 Thymopoietin Human genes 0.000 description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N thymopentin Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N 0.000 description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 6
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- -1 tert-amyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000000398 DiGeorge Syndrome Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101000773128 Rattus norvegicus Thymidine phosphorylase Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 230000003526 lymphopoietic effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 229940034252 thymus extracts Drugs 0.000 description 2
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010543 22q11.2 deletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPGXYQZKIMWRAM-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholin-4-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN1CCOCC1 HPGXYQZKIMWRAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXQJDVBMMRCKQG-UHFFFAOYSA-N 5-phenylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)NC1C1=CC=CC=C1 NXQJDVBMMRCKQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000946124 Homo sapiens Lipocalin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000796134 Homo sapiens Thymidine phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000569446 Teyl Species 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 102400000160 Thymopentin Human genes 0.000 description 1
- 101800001703 Thymopentin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- QRZVUAAKNRHEOP-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QRZVUAAKNRHEOP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003397 biobrane Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000515 cyanogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940000986 dextran 110 Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008921 facial expression Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940072783 liquimat Drugs 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- JGEMYUOFGVHXKV-UPHRSURJSA-N malealdehyde Chemical compound O=C\C=C/C=O JGEMYUOFGVHXKV-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 1
- XNBKKRFABABBPM-UHFFFAOYSA-N n,n-diphenylcarbamoyl chloride Chemical compound C=1C=CC=CC=1N(C(=O)Cl)C1=CC=CC=C1 XNBKKRFABABBPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 235000020046 sherry Nutrition 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N tert-butyl alcohol Substances CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000004862 thiobutyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004517 thymopentin Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/66—Thymopoietins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
-1-
Lidský a krysí thymopoietin
Qblast vynálezu -tjs
Tento vynález se obecně týká proteinu izolovanéhov přečištěné formě, z lidského nebo krysího thymu nebo vy-robeného chemickými syntézami nebo metodami rekombinant-ního: genového inženýrství,, který je vhodný pro diagnostic-ké-: účely.
Dosavadní stav techniky
Thymopoietin /dále označovaný jako "TP"/ je polypep-tidový hormon thymu s pleiotropním účinkem ňa prothymocy-tyr, maturované T hunky, receptory nikotínacetylcholinu ahypofyzární kortikotropiny. Těmto látkám je věnována značná'pozornost a bylo publikováno mnoho článků a patentů, týka-jících se látek přítomných v hovězím thymu a z nej izolova-ných rovněž jako syntetických peptidů s podobnými vlast-nostmi jako mají látky přirozeně se vyskytující, viz napří-klad práce: G.Goldstein, Nátuře,. 247:11—14 /Londýn/ /1974/}R.S.Basch a spol., Proč.Nati.Ácad.Sci., USA, 71 :1474-1478'/1974/1 M.P.Scheidí a spol., J.Exp.Metf., 147:1727-1743 /1978/^M.P.Scheid a spol., Science, 190:1211-1213 /1975/} G.E.
Ranjes a spol., J.Exp.Med., 156:1057-1064 /1982/J K.Venka-tasubramanian a spol., Proč.Nati.Ácad.Sci.,USA, 83: 3171-3174 /1986/; M.G.Malaise a spol., v "Immunoregulatory UCLASymposium"ón Molecular and Cellular Biology, vyd.G.Gold-stein a spol., Liss, New York /1986/; a G.H.Sunshine a spol., ; J.Immunol., 120:1594-1599 /1978/. (i ,T. *_ « τ " ΊΤ - η Λ
Byla stanovena úplná sekvence padesáti aminokyselinhovězího Tp /dále označovaná jako HbTP/ y práci, jejímž au-torem je T.Audhya a spol., Biochemistry, 20:6195-6200 /1981/a biologická aktivita byla přisouzena peptapeptidu ARG-LYS-ASP-VAL-TYR, nazvanému thymopentin /Sále označován jako ”TP-5"/ -z- a popsanému v práci G.Goldsteina a spol. Science 204:1309-1310 /1979/ a Wekslera a spol., J.Exp.Med., 148:996-1006,jakož v MS patentech, č. 4190646 a 4261886. Dále US patenty j5. 4361673) 44204.24 a 4629723 popisují různé, peptidy, ma-jící účinnost podobnou thymopoietinu. Uvedená literaturaje zde citována pro úplnost. Přestože byly provedeny rozsáhlé práce v souvislostis bTH rovněž jako ve vývoji syntetických peptidů s účinkyb.TP dosud však nebyl z lidského thymu izolován lidský thy-mopoietin nebo· ze tkáně krysího thymu krysí th.ymopoietina ovšem také dosud nebyly tyto proteiny zcela sekvenoványa ovšem také dosud nebyly tyto proteiny zcela sekvenoványnebo syntetizovány.
Podstata vynálezu Předložený vynález se týká proteinového lidského thymo-poietinu /označovaného jako MhTP*'/ v podstatě prostého hu-mánních nethymopoietinových přirozených látek, tj. prosté-ho takových, látek,, vyskytujících se společně s proteinem v .prostředí jeho výskytu v lidském thymu. Zvláště se tentovynález týká hTP,'majícího následující sekvenci aminokyse-linových zbytků: GIT-LEU-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS-LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-GLY-VAL-THR=TEU-PRO-ALA-GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ASP-VAL—TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN-HIS-LEU-THR-ALA-LEU-HIS. ý Dále se .předložený vynález týká proteinového krysíhothymopoietinu /označovaného jako "rTP”/, v podstatě .prosté-ho sekvencí netbymopoietinových přirozených látek, mající- ho následující sekvenci aminokyselinových zbytků: -3- GLY-MET-PfíO-LYS-GLU-VAL_PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS- LEU-LYS-SER-GLU-LEU—VAL-ALA-LYS-GLY-VAL-ALA-LEU-PRO-ALA- : GLY-GLU-GLN-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-ASP-ILE-TYR-PRO-GLN- ? i HIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-Aflg. ' :
Tyto proteiny mohou být izolovány z lidského nebo kry-sího thymu. Alternativně mohou být tyto proteiny synteti-zovány chemicky nebo připraveny rekombinací nebo technika- · mi výstavby řetězce polymerázou /PCR/. < Γ Ϊ
Ještě další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobu í diagnostikování nebo detekce množství th.ymopoietinu v pa- r cientově oběhu, který zyhrnuje.stupeň využívající výše popsané proteiny.. ^alší aspekt tohoto vynálezu zahrnuje DNA sekvence, ob-sahující sekvence DNA kódující expresi .lidského nebo krysí- · ho TP polypeptidu. * r
Tento vynález také poskytuje molekuly rekombinantní . . ? DNA, obsahující sekvence DNA kódující hTP nebo rTP v ope- ř rativním spojení se sekvencí řídící expresi. Tento vynález í
poskytujě také hostitělské buňky trahsformóváhě“těmito“mole- J kulami pro účel výroby rekombinan.tního hTP nebo rTP. Tyto ? molekuly obsahují vektory nebo plasmidy, které existují extra- £ chromosomálně v hostitelských buňkách, nebo molekuly, kte- ; ré integrují thymopoietinové geny do -chromosomů hostitels- i kých buněk. í í · v .i ·
Vektory a transformované buňky podle vynálezu se použí- ? vají v dalším aspektu vynálezu, novém způsobu výroby rekom-binantního lidského nebo krysího thymopoietinu. Při tomto | způsobu je buněčná linie transformována DNA sekvencí koču-jící příslušný TP. DNA sekvence lidského thymopoietinu /hTP/nebo krysího thymopoietinu /rTP/ je v operativním spojení ΐ -4- s příslušnou sekvencí řídící expresi v buňce. Transformo-vané.. buňky se pak kultivují konvenčními způsoby ve vhod-ném mediu- Tento nárokovaný postup může používat mnohoznámých buněk jako buněk hostitelských pro expresi polypep-tidu? Současné výhodné buněčné linie jsou savčí buněčná li-nie a buňky bakterií.
Ještě dalším aspektem předloženého vynálezu jsou proti-látky vůči hTP nebo rTP. Tyto protilátky se vytvoří použi-tím hTP nebo rTP nebo jejich fragmentů jako imunogenníchlátek v konvenčních postupech výroby protilátek nebo poly-klónálních antisér. Tyto anti-hTP nebo anti-rTP protilátkylze použit jako diagnostická nebo terapeutická činidla.
Kromě toho se vynález týká terapeutických směsí látek,obsahujících terapeuticky účinné množství výše definované-ho hTP, která může obsahovat mezi dalšími přísadami farma-£ceuticky vhodný nosič. Specificky může být toto terapeutic-ky účinné množství polypeptidu nejméně asi 1 až 1000 yUg/kgtělesné hmotnosti.
Jiné aspekty a výhody předloženého vynálezu vyplývajíz následujícího podrobného popisu. „
Stnučný popis výkresů
Obrázek 1 graficky znázorňuje výsledek chromatografic-ké analýzy extraktů lidského thymu na molekulárním sítu Sepha- 'dex G-75 při měření imunoreaktivní látky metodou RIA probTP. Frakce s píky o nižší molekulové hmotnosti byly dáleČištěný a poskytly hTP.
Obrázek 2 graficky znázornuje výsledek separace CN3rdigestu hTP po rozpuštění v 0,1# kyselině ortofosforečnéna koloně s reverzní fáaí Cjg /Vydec 218TP54, 46 mm x 25 cm/ -5- při průtokové rychlosti 2 ml/min. Píky jsou označeny I, IIa III. Gradientová linie znázorňuje přítomnost organickéhoroapouštědla.
Obrázek 3 graficky 'znázorňuje repětitivní výtěžkyfenylthiohydantoinem derivatizovaných aminokyselin běhemEdmanovy degradace hTP za použití 46 cyklů.
Popis vynálezu
Tento vynález poskytuje dva nové polypeptidy, lidskýthymopoietin a krysí thymopoietine, vyrobené ve formě v pod-statě prosté kontaminace dalšími savčími proteinovými lát-kami. Tyto polypeptidy nebo.jejich modifikace jsou vhodnépro diagnostické účely pro detekci abnormálních hladin thy-mopoietinu nebo jako terapeutické přípravky pro léčení růz-ných imunologických.chorob. V tomto popise aminokyselinové zbytky peptidů a urči-té látky použité při jejich přípravě jsou označovány provýhodnost konvenčními zkratkami.
Lii3š']^_TP"6yl—ÍzoTóváň_'z'"tfcáně~lidskěhó’ thymu,“ jak"jě”podrobně popsáno v příkladu 1 dále. Ve; skutečnosti tatoizolace zahrnovala stručně uvedeno, extrakci tkáně ve vodnémrozpouštědle, ultrafilraci pro přibližné rozdělení, hyóro-fobní chromátografii a HPLC na reverzní fázi. Přibližně50 % imunoreaktivní látky v každém extraktu bylo přítomnove formě o vyšší molekulové hmotnosti, která pravděpodobněpředstavuje formu biologicky inaktivního prekurzoru /D.F.Steiner a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 57:473-480/1967//.xato byla separována na molekulovém sítě Sephadex G-75. Přes zjednodušení izolačního postupu výtěžek hTP bylvelmi nízký /0,42 %/, přečištění produktu vyžadovala -207 se- -6- paračních kroků /Tabulka 1/, Velké ztráty hTP vznikaly bě-Λ hem HPLC.. Čistota hTP byla hodnocena elektróforézou na poly- akrylamidovém gelu, HPLC a stanovením aminokyselinové sek-í.’· -—vence /viz obr.3/.
Postupy použité ke stanovení sekvence aminokyselinhTP jsou rovněž podrobně popsány v příkladu 2. dále. Zbytky1-46 byly stanoveny automatizovanou Edmanovou degradacíza použití sekvenátoru v plynné fázi a zbytky 1-11 a 32-46byly ověřeny Edmanovou degradací dvou štěpných fragmentůCNBr. Tím bylo poskytnuto nezávislé potvrzení důležitě ak-tivní oblasti, zbytků 32-36. C-koncová sekvence 44-48 bylastanovena štěpením karboxypéptidázou v závislosti na Čase* *·
Tyto postupy poskytly následující sekvenci aminokyse-lin v hTP: 1 10GIY-LEV-PRO-LYS- GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR—LYS-GLW-LYS- v ' 20 LEU-LYS-rSER-GLU-LEU—VAL-ALA-ASIT-GLY-VAL-THR-LEUvPRO-ALA- . -v . * · - . 30 40 GLY- GLU-MET-ARG-LYS-ASP—VAL-TYR-VAL-GLU-LEU—TYR-LEU-GLN— 48 HIS-LEU-THR-ALA-LEU-HIS. ' .
Krysí thymópoietin byl izolován z krysího thymu a sek- 4 ... věnován jak je popsáno dále v příkladech. 5 až 7. Krysí TPbyl dále charakterizován, jeho v podstatě podobnou imunoge- * nicitou. lidskému TP. Tyto postupy poskytly následující sek- venci padesáti aminokyselin v rTP, 1 10GLY-MET-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THŘ-LYS-GLN-LYS-. - 2θ LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-LYS-GLY-VAL-ALA-LEU-PRO-ALA- 30 . 40 GLY-GLU-GLN-ARG-EYS-ASP-VAL-TYR—VAL-ASP-ILE-TYR-PRO-GLN- 48 HIS-LEU-THR-ILE-LEU-HIS-LYS-ARG. ffpto peptidy podle vynálezu, kromě jejich izolace zlidského nebo krysího thymu, lze také vyrobit rekombinant-ními postupy, P.CR postupy a chemickými syntézami. -< charakterizaci, sekvenovaných hTP.. a,; rTP;.byly; použity.zprotilátky vůči bTP. Již dříve bylo využito křížové reakti-vity anti-bTP protilátek k detekci a izolaci blízce podob-ného polypeptidu bSP z hovězí sleziny /T.Audhya a spol., Biochemistry, 20:6195-6200 /1981//. Podobně protilátky vůčibTP vykázaly křížovou .reaktivitu k hTP ark monitorováníizolace hTP z extraktů lidského thymu byla použita bTP rádioinimunoassay /RIÁ/ popsaná ve výše uvedeném odkazu, který jezde začleněn pro úplnost. Při srovnání s polypeptidy známé sekvence bylo zjiště-no, Že hTP má podobnou sekvenci aminokyseliny jako lidskýsplenin /označovaný jako MhSP*'/, jak je uvedeno v souvisejí-cí patentové přihlášce č. 53186 podané 22. května 1987 ®uvedené zde pro úplnost. hSP má sekvenci: 1 10GLY-LEU-PRO-LYS-GLU-.VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR-LYS-GLN-LYS- x . 20 , \ASN . LEU-LYS-SEfí-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN/VAL-THR-LEU-PRO-ALA- 30 x 40
GLY-GLU-MET-ARG-LYS-ALA-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN x x 48 SER-LEU-THR-ALA-GLU-HIS. -8-
Uak hTP tak. hSP jsou lineární polypeptidy o 48 amino-kyselinách. Nicméně tyto polypeptidy ae liší ne čtyřechzbytcích v. polohách aminokyselin 23, 34, 43 a 47 / jsouvýše označeny hvězdičkou/. _ . . ......
U hTP bylo také zjištěno, že je podobný bTP a bSP /hovězí šplenin/. bTP má následující sekvenci aminokyselin:1 ' “ 1 1 10PRO-GLU-PHE-LEU-GLU-ASP-PRO-SER-VAL—LEU-THR-LYS-GLU-LYS- 20 LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-ASN-ASN-VAL-THR-LEU-PRO-ALA- 30 40 GLY-GLU-GLŇ-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-TYR-LEU-GLN- 49 SER-LEU-THR-ALA-LEU-LYS-ARG. bSP má aminokyselinovou sekvenci: 1 10PRO-GLU-PHE-LEU-GLU-ASP-PRO-SER-VAL-LEU-THR-LYS-GLU-LYS- 20" LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-.ALA-ASN-ASN-VAL-THR -LEU-PRO-ALA- 30 40 GLY-GLU-GLN-ARG—LYS-GLU-VAL-TYR-VAL-GLU-LEU-LEU-GLN-HIS- 49 LEU-THR-ALA-LEU-LYS-ARG. . Deset aminokyselinových zbytků, které jsou totožné vsekvencích hTP a hSP /aminokyseliny v polohách 1-4, 6,8,13,31, 48 a 49/ jsou v těch samých polohách odlišné' v sekven-cích bTP á bSP. Kromě toho se hTP liší od všech těchto pep-tidů aminokyselinou v poloze 23· bTP a hTP vykazují v pod-statě stejnou oblast aktivního místa /aminokyselinové zbyt-ky 32-36/ s tím, že tato oblast se liší pouze ve zbytku 34.Nicméně bTP a hTP v podstatě nevykazují takovou podobnouimunogenicitu jako vykazuje hTP a rTP. -9- .... .Tato srovnání potvrzují, že sekvence aminokyselin hTP‘ byla skutečně stanovena a indikují, že během, vývoje se musela vyskytnout genová konverzek udržení paralelníhosekvenčního vývoje polypeptidů TP a SPu každého druhu.
Další důležité genové systémy, které využívají genovékonverze, zahrnují: imunoglobulinoýé /P.H.Schreier a spol.,Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 78:4495-4499 /1981// geny a genyhlavního histokompatibilního komplexu /M.Šteinmetz a spol.,Science, 222:727-733 /1983//* Udržení paralelního vývojeoblastí TP a SP mimo oblast aktivního místa /zbytky 32 - 36/vede k závěru,, že. tyto C- a N-koncové’oblasti molekuly, musí ..mít také důležité, funkce; s podobnými.nároky.na. TP a SP zacho-vávané u každého druhu. O zbytcích 32-36 bTP je známo,, že představují aktivnímísto,: které, odpovídá, syntetickému. TP /aminokyselinové zbyt- ky 32-36/ pentapeptidu; , TP-5, majícímu biologickou ak-tivitu TP u zvířat a lidí /G.Goldstein a spol., Science,20.4:1309-1310 /1979/$ a T.Audhya a spol., Proč.Ňatl.Acad. Séi., USA, 81 :2847-2849 /1984//. Tato sstudie potvrdila, že ___________aktivní místahTP a rTP /zbytky 32-36/ jsLou_rden.tická s_ak-______ tivními místy bTP, takže syntetický TP-5 /Arg-Lys-Asp-Val-Tyr/ i rovněž představuje aktivní místo u lidí. t- I Struktura krysího thymopoietinu je podobnější lidskému než hovězímu thymopoietinu, kde od lidského se liší v polo-hách 2,22, 25, 31, 38, 39, 41 a 46 a od hovězího v polohách1,2,3,4,6,8,13, 22, 23, 25, 38,-39,. 41, 43 a 46. S výjimkouzměny Gin^^ /krysí/ na Met^ /lidský/ a Ile^g /krysí/ na * - ' Ala^g /lidský/,, které vyžadují změnu dvou bází v těchto kodo- nech, všechny změny kysího peptidu na lidský představujizměnu jedné báze v kodonech.Pro hovězí thymopoietin 40 %sekvenčních změn z krysího thymopoietinu na tento představu-je změnu dvou bází- a zbývajících 60 % odpovídá změnám jednébáze. ^ezl rTP a hTP existuje, asi 83& homologiej mezi hTPq hTP -ip hn-nl nciů ari 77 T-, a πιοκί rTP s hTP ήρ hnmnl ησΐ p -10- asi. 69 %· Známé aktivní místo /Arg-Lys-Asp-Val-Tyr/ je provšechny* tři proteiny stejné /G.Goldstein,. Science, 204:1309-1310//1979/; T.Audhya a spol., Biochem., 20:6195-6200/1981/ a ^.T.Audhuya a spol., Proč.Nati.Acad.Sci., 84:3545-3549 /1987//. •Homologie mezi hTP a rTP skýtá u těchto peptidů v podstatě ' 'podobnou imunogenicitu. rTP má tedy blízkou křížovou reak-tivitu ,s protilátkami proti hTP a protilátky proti rTP jsoukřížově reaktivní proti hTP. Z toho vyplývá, že protilátkyvůči.rTP mohou.nahrazovat protilátky vůči hTP a nebo rTP mú-za být nahrazen hTP v diagnostických stanoveních a určitýchterapeutických stanoveních, je-li to žádoucí. - ,’ζ£.
Tento vynález také zahrnuje DNA sekvence kódujícísekvence aminokyselin hTP a rTP, V tomto vynálezu jsou takézahrnuty variace alel sekvence DNA, kódujících hTP nebo rTProvněž jako jejich analogy nebo deriváty. Tento .vynáleztedy zahrnuje tyto DNA sekvence, bez spojení s DNA sekven-cemi, kódujícími jiné primátové proteiny a kódující expre- .,.A si polypeltidů hTP nebo rTP. Tyto DNA sekvence zahrnují sek-vence, které hýbridizují za přísných hybridizačních podmínek . /viz T.Maniatis a spol., ^olecular Cloning /A LaboratoryManual/, Cold Spring Harbor Laboratory /1982/, str. 387-389/. Příkladem jedné takové přísné hybridizace je hybridi-záce v. 4XSŠC při 65 °C s následujícím promýváním v 0,1XSSCpři. 65 °C po dobu 30 minut. Alternativní příklad přísnýchhybridizačních podmínek je 50% formamiď, 4XSSC při 42 °C. DNA’ sekvence, které hýbridizují k sekvenci kódujícíhTP nebo rTP za mírných hybridizačních podmínek a které kó-dují expresi hTP nebo rTP peptidů, majících hTP nebo rTPbiologické vlastnosti, také kódují nové polypeptidy. Pří-klady takových mírných hybridizačních podmínek zahrnují4XSSC při 50 °C nebo hybridizaci 30 - 40 % formamidu při 42 °C.Například DNA sekvence, která sdílí výrazné oblasti homo-logie:, např. místa glykosylace nebo disulfidických vazeb, sesekvencemi hTP nebo rTP a kóduje protein, mající jednu nebo 4!- -11- vícehTP nebo rTP biologických vlastností, samozřejmě kódu-je hTP nebo rTP polypeptidůi když DNA sekvence se nebudeza přísných podmínek hybridizovat k hTP nebo rTP sekvenci.
Podobně, DNA sekvence, které' kódují hTP nebo rTP po-lypeptid, ale které se liší v sekvenci kodonu což je způ-sobeno gegenerací genetického kódu nebo variaci alel /při-rozeně se vyskytující změny báze v populaci druhu, kterémohou, ale nemusí mít za následek změnu aminokyseliny/· jsoutaké zahrnuty v tomto vynálezu. Variace v DNA sekvencí hTPnebo rTP, které jsou způsobeny bodovými mutacemi nebo induko-vanými modifikacemi ke zvýšení účinnosti, half-life-neboprodukce polypeptidů takto· kódované, jsou také, zahrnutyve vynálezu.
Tento vynález také poskytuje alternativní způsobyizolace .z tkáně, thymu pro výrobu hTP a. rTP. polypeptidů..
Jeden postup podle vynálezu zahrnuje kultivaci, vhodné buňky·nebo' buněčné linie, která byla transformována ..DNA sekvencí,,.,kódující expresi hTP nebo ..rTP polypeptidů. nebo. jeho aktiv-ního fragmentu pod kontrolou známé regulační sekvence. Re-gulační sekvence zahrnují promotorové fragmenty, koncové“fragmenty a další“ vhodné "sěkvende",“které “řídí" expresi pro-teinu v příslušné hostitelské buňce.
Vhodnými buňkami nebo buněčnými liniemi mohou být savčíbuňky jako buňky ovarií čínských křečků /CHO/ nebi 3T3 buň-ky. Výbér vhodných savčích hostitelských buněk a způsobyjejich transformace, kultivace, amplifikace, screening avýroby produktu a čištění jsou v oboru známy. Viz např.Gething a Sambrook, Nátuře, 29.3:620-62-5 /1981/, nebo-alterna-tivně Kaufman a spol., Mol.Cell.Biol., 5/7/:1750-1759/1985/nebo Howley a spol·., US patent Č. 4419446. Další vhodné bu-něčné linie zahrnují opičí COS-1 buněčnou linii a CV-1buněčnou linii. -12- v V tomto vynálezu mohou být jako hostitelské buňkyvhodné také buňky bakteriální za předpokladu, že produko-vaná molekula si udržuje aktivitu v částečně či cele roz- „ vinuté, stavu nebo v přeměněném složeném stavu, založenouna rozdílech v glykosylaci vyplývajících z expresaítes fak-toru v savčích a bakteriálních buňkách. Například různé v kmeny E.coli jsou dobře známé jako hostitelské buňky v ob-lasti biotechnologií. Různé kmeny jiných bakterií, např. B.subtilis;, lze také v tomto postupu použít.
Také mnoho kmenů kvasinkových buněk bude odborníkům v k dispozici jako hostitelské buňky/ pro expresi polypepti- dů podle vynálezu. Kromě toho, je-li to žádoucí, lze jako ** hostitelských buněk v postupu podle vynálezu využít i bu- něk hmyzu. Viz například tóiller a spol., Genetic Engňneering,8:277-298 Alenum Press 1986/ a odkazy tam uvedené. «s Předložený vynález také poskytuje: rekombinantní mole- - kuly, např. vektory a plasmidy, pro použití v postupu ex- ‘Λ? prese nových hTP a nebo rTP. Tyto molekuly obsahují nové hTP nebo rTP DNA sekvence, které kódují hTP nebo rTP poly-peptidy podle vynálezu. Vektory zahrnují zkrácené nebo pře- měněné fragmenty hTP nebo rTP, jejich álelické varianty ne-bo modifikované sekvence jak jsou popsány výše., patří takémezi provedení tohoto vynálezu a jsou vhodné při výroběhTP nebo rTP. Vektor použitý v tomto postupu také obsahujevybrané regulační sekvence v operativním spojení s DNA kódu-jícími sekvencemi podle vynálezu a je schopný řídit jejichreplikaci a expresi ve zvolených hostitelských buňkách.
Alternativně lze tyto peptidy připravit následujícímisyntetickými postupy v pevné fázi, původně popsanými Merrifiel-dem, JACS, 85:2149-2154/1963/. Tyto postupy jsou také uvedá- -13- ny v určitých patentech z oboru, které byly jíž dříve cito-vány. Další postupy lze nalézt například v práci M.Bodansz-kyho a spol., "Peptide Synthesis” John Wiley and Sons, dru-hé vydání /1976/ jakož i v jiných pracech, které jsou odbor-níkům·· známy. Vhodné chránící skupiny použitelné pro tytosyntézy a jejich zkratky lze nalézt ve výše uvedených pra-cech a rovněž v práci, jejímž autorem je J.P.W.McOmie,”Pro-tective Groups in Organic Chemistry” / Plenům Press, NewYork. /1973/· Obě. tyto monografie- jsou zde: uvedeny pro úpl-nost*. Běžné chránící skupiny, které jsou používány zahrnujíterč.buroxykarbonyl /BOC/, benzyl /BZL/, terc»amyloxykar-bonyl /AOC/, tosyl /TOS/, O-bromfenylmethoxykarbony1 /BrZ/,2j6-dichlofbenzyl /BZLC^/ a genylmethoxykarbonyl /Z nebo.CBZ/.
Bgžně je syntetický lidský thymopoietin vyráběn s GLN .v poloze-31, nhrazující MET v přirozeně.se vyskytujících,sekvencích. Bylo zjištěno, že přirozeně se vyskytující METje předmětem' oxidace a Činí hTP nestabilním.
Ještě-další postup přípravy hTP a rTP polypeptidůpodle vynálezu vede přes techniky výstavby řetězce polymerá- zou /PGR/." PCR lze' pouzít k nmplifikaci a detekci požadova-'né nukleóvé kyseliny ze směsi, obsahující tuto sekvenci mezijinými dalšími. Tímto způsobem lze izolovat hTP a rTP sek-vence z thymu nebo jiných tkáňových>zdrojů nebo lidskýchnebo krysích linií pomocí PCR. Při použití tohoto postupuse navrhnou dva příměry pro každou stranu sekvence. hTP neborTP, jeden ve smyslu orientace a druhý v opačném smyslu. Mo-lárná přebytek oligonukleotidových primerů se smísí s bio-logickým vzorkem nebo buněčnou linií za rozšiřování prime-rových prodloužených produktů, které působí jako templáty prosyntézu úplných hTP nebo rTP sekvencí nukleóvé kyselinya za detekce amplifikováných sekvencí. Tento postup je podrobně popsán v US patentech č. 4683195 a 4683202. Jelikož sek- -14- ' vence;. hTP a rTP jsou známy, odborníci snadno navrhnou. .vhodné primerý k izolaci a amplifikaci velkých množstvíhTP/nebo rTP z biologických zdrojů pomocí PCR. . Polypeptidy podle vynálezu nebo jejich aktivní frag- > menty lze použít v postupu při vývoji monoklonálních proti-látek a/nebo polyklonálních antisér. Tyto protilátky lzegenerovat za použití hTP nebo rTP, které vykazují v podsta-tě podobnou impjt&nocitu, jejich fragmentů nebo jejich mo-difikovaných nebo alelických verzí, jako antigenů. Použi-tím standardních postupů pro tvorbu protilátek známýchodborníkům, napr. postupů podle Kohlera a íáilsteina nebojejich vylepšenými způsoby, lze vyrobit polyklonální nebomonoklonální protilátky, které jsou vhodné pro diagnostic-ké nebo terapeutické účely.
Proto další aspekt vynálezu zahrnuje diagnostické činid-la, která obsahují celé nebo Části sekvencí hTP nebo rTP. ^ato činidla, popřípadě ve spojení s detektovatelnými sig- 'nály různých konvenčních typů. lze použít pro diagnózy cho-robných stavů, které vykazují buď snížené nebo zvýšené hla-diny TP,. Mezi tyto chorobné stavy, bez omezení pouze na ně,patří choroby myasthenia. gravis, choroby imunitní nedosta-tečnosti, imunologicky vyvolané chroroby jako je arthritisrheumatoides, systemický lupus. erythematosus> a alergie, ra-kovina, podvýživa a infekce. ' Jedno vhodné stanovení používající hTP a/nebo rTP je podrobně popsáno v příkladu 5 dále. Jiná stariovení TP jsou . uvedena v US patentu 4124700. Další skupiny stanovení mohoupoužívat buď polypeptidy hTP nebo rTP, jejich fragmenty neboprotilátky vyvinuté průti těmto polypeptidům jak je popsánovýše. Použití těchto diagnostických činidel ke stanoveníhladin může být vhodné k řízení účinnosti terapie: pro každýdříve uvedený chorobný stav. -15-
Vzhledem k imunomodulačním vlastnostem hTP a rTPtentovynález také zahrnuje, terapeutické, použití těchtopolypeptidů při léčení lidí a zvířat. Tyto polypeptidymají schopnost vyvolávat diferenciaci lymfopoietických kme-nových buněk v hemopoietických tkáních na thymus-odvozenébuňky7 /T buňky/, které jsou schopné se zapojit do 'imunitníodezvy organismu. Z tohoto důvodu jsou tyto polypeptidy pokládány za látky s mnohostranným terapeutickým použitím. * své nejširší aplikaci jsou uvedené látky vhodné proregulaci imunitního systému subjektu, člověka nebo zvířete·,při potřebě takové regulace. Výraz "regulovat" použitý vtomto popise znamená, že dané sloučeniny způsobí, že imunit-,ní systém se upraví z abnormálního, chorobného stavu donormálního, vyváženého stavu. V první řadě mají uvedené slou-čeniny schopnost působit v určitých indikovaných funkcíchthymu a mají proto oblast aplikace v různých funkcích thý-mu a oblasti imunity. Uvedené sloučeniny se obecně pokládajíza vhodné v jakékoliv oblasti, kde buněčná imunita chybí' azvláště tam, kde dochází k imunitním .nedostatečnostem jakoje DiGeorgův syndrom-a stav se vrozenou absencí thymu.'
Uvedené hTP a rTP podle vynálezu lze také použít k lé-čení stavů se zvýšenou imunologickou aktivitou, Jestližedochází' k nadbytku tvorby protilátek způsobené nerovnováhoumezi T buňkami a B buňkami, uvedené polypeptidy lze použítk léčení tohoto stavu tím, že stimulují produkci T buněk. Z toho vyplývá, že od těchto polypeptidů se očekává tera-peutické použití při určitých autoimunitních chorobách, přikterých dochází ke tvorbě škodlivých protilátek jako jesystemický lupus erythematosus, arthritis rheumatoides apodobně. -16- \
Kromě toho uvedená1 peptidy se pokládají za užitečnétím, že přispívají k celkové imunitě organismu tak, že zvy-šují nebo přispívají k terapeutické stimulaci buněčné imuni-ty a tak jsou vhodné při léčení chorob, zahrnujících chro-nické^infekce/jako jsou fungální nebo mykoplasmatické in-.fekce, tuberkulóza, lepra, -akutní a chronické a virové in-fekce.
Tento vynález proto také zahrnuje způsoby regulaceimunitního systému daného subjektu v případe potřeby takovéregulace, která zahrnuje podání terapeuticky /iraunoregulač-ně účinného množství jedné z látek podle vynálezu danémusubjektu a rovněž farmaceutické přípravky pro praktické pro-vedení těchto postupů. Výraz "terapeuticky účinné množství“ použitý v tomto popisu znamená množství, které je účinné ” k léčení stavů, vyplývajících z deficitu T buněk nebo po-případě při deficitu thymu. Předložený vynález poskytuje způsob léčení stavů, vyp- ΆήΛ lývajících ze selektivního nebo.absolutního, deficitu thymu nebo T/buněk daného systému /Člověka nebo zvířete/, který zahrnuje terapeuticky účinné "množství hTP tomuto subjektu.
Například podání jednoho z uvedených peptidů pacientovi, trpícímu DiGeorgeovým syndromem přispívá k překonání tohoto deficitu. Odborník v imunologii snadno stanoví vhodné dávko-vání /Výhodně parenterálně/ a účinné množství jednoho z uve-dených peptidů pro léčení DiGeorgeova syndromu.
Tento vynález také poskytuje způsob indukce lymfopoietic-kých kmenových buněk subjektu k vývoji charakteristickýchthymujs-odv o zených lymfocytů, který zahrnuje podání účinnéhomnožství hTP, vyvolávajícího indukci danému subjektu. Tentovynález dále skýtá farmaceutické přípravky pro praktické pro-vedení těchto postupů. -17- Při přípravě farmaceutických přípravků podle vynálezuse hTP jako aktivní složka kombinuje do směsi s farmaceu-tickým nosičem podle konvenčních farmaceutických postupůpro výrobu lékových forem. Tento nosič může být různý podlezdruhu podání lé&ové formy, např. sublinguální, rektální/K,nasální, orální nebo parenterální. Při přípravě orálních lé-kových forem lze použít každé vhodná farmaceutická media:jako například vodu, oleje, alkoholy, chuíové přísady, kon-zervační . činidla, barviva a podobně» to v případě orálníchtekutých přípravků /např. suspenzí, elixírů, a roztoků/ nebonosiče jako škroby, cukry, ředidla, granulaČni přísady,kluzné látky, pojivá, látky usnadňující rozpadavost a podob-ně v případě orálních pevných přípravků../např. prášků, to-bolek a tablet/, ^za také použít forem s řízeným*uvolňová-ním. 2 důvodů snadného podávání představují tablety a to-bolky nejvýhodnější orální lékovou formu, pro kterou se použí-vají pevné látky jako farmaceutické nosiče. «Je-li to žádoucí,tablety mohou být obduktovány. cukrem nebo mohou být entero-solventní za použití standardních, postupů. Při přípravě parenterálních přípravků je nosičem ob-vykle' sterilní vody, ačkoliv mohou být zahrnuty i jiné lát-ky, sloužící k usnadnění rozpustnosti nebo pro konzervaci /na-příklad/. Lze také připravit injekční suspenze, kdy se použi-je vhodných kapalných nosičů, suspendačních činidel a podob-ně. hTP je obecně aktivní při parenterálním podání v množ-stvích nad asi 1 /Ug/kg tělesné' hmotnosti. Pro léčení DiGeor-geova syndromu Se-peptidy mohou podávat parenterálně od asi.0,1. do ási 10 mg/kg tělesné hmotnosti. ^becně lze stejné roz-mezí dávek použít při léčení dalších chorob nebo stavů,kte-ré již byly uvedeny, kdy je zapotřebí léčit imunitní nedosta-tečnost. Větší dávky /např. asm 10 až 100 mg/kg tělesné hmot-nosti/ jsou vhodné pro potlačování nadměrné imunitní aktivity. 18- Následující příklady ilustrují izolaci hTP a postupypro výrobu hTP a/nebo rTP rekombinací. Tyto příklady všakrozsah vynálezu nijak neomezují. Příklady provedení vynálezu Příklad 1
Izolace hTP z lidského thymu čerstvý lidský thymus získaný z dětské chirurgie a lidská slezina získaná chirurgicky nebo z pitvy, byly nakrá-jeny a skladovány při -35 °C. Sepárační prostředky a zaří-zení byly získány komerčně: Sephadex /Pharmacia/, hydroxy-apatit /Biogel HPHTj Bio-Rad/ a preparativní kolona s mě- ”·ničem1 aniontů o velkých pórech pro HPLC /2,5 x 25 cm, DE 500,velikost částic 40 - 60 /um/ /Separation 1ndustries, Metu-chen, NJ/. Čištění hTP bylo sledováno metodou RIA s bTP, který má křížovou reaktivitu s hTP /G.Goldstein, J.Immunol., 117: 690-692/1976/. a P.J. Lisí a spol., Glin.Chem.Acta, 107: 111-119/1980//. Stručně, bTP byl označen metodou podle Bólton-Hunterá /A.E.Bolton a spol., Biochem.J., 133:529-539 /1973// a radioaktivně značený bTP byl čištěn jak je po- . psáno /T.Audhya a spol., Arch.Biochem.Biophys., 234:167- 177 /1984//. Protilátkou anti-bTP /zředěnou 1:10000/ byl125 I značený bTP /10000 cpm/ inkubován za přítomnosti neboabsence různých peptidových frakcí ve fosfátovém pufru podobu 8 hodin při 22 °C. Separace vázaného a volného bTPbyla provedena 24% polyethylengl.ykolem při teplotě místnos-ti s následným odstředěním při frekvenci otáčení 2000 minT^po dobu 15 minut. Výsledný bTP.byl stanoven na (S. spektro-metru LKB.
Vsádka 714 g lidského thymu byla extrahována studeným.100 mM hydrogenuhličitanem amonným /25% hmotn., 50 ^ug 2-merkaptoethanolu, 175 yug fenylmethylsulfonylfluoridu a 375 -19- /Ug.kyseliny ethylendiamintetraoctové /EDTA/ v 1 ml/ homoge-.nižací ve Waringově mísiči /Dynamics, New Hartford, CT/. Poodstředění při 14000 x g při 4 °C po dobu 10 minut bylsupematant zfiltróván přes plátno a skladován při 4 °Cpo přídavku 0,1 % thiomersalu a 0,1.% azidu sodného. Roz-pustný extrakt byl zpracován ultrafiltrací při 4 °C za použi-tí membrány Amicon Diaflo x M 100 /mezní molekulární, limit 100 000/ a zahuštěn na Diaflo UM2 /mezní molekulární -limit JT 1000/ s redukcí objemu z 1/10 na 1/50.
Metentát z UM2 filtrace, obsahující proteiny relativ-ní molekulov^hmotnostimezi 1000 - 100000 byl chromátogra-fován na Sephadexu G-75 zrnitého, typu·/velikost částic'40120 /um/ při teplotě místnosti na koloně 5 x 150 cm v 50 mMhydrogenuhličitanu sodném, imunoreaktivní frakce byly lyofi-lizovány. Byly nalezeny dva hlavní píky, obsahující imuno-.reaktivní látky /viz. obr.1/. Proteiny s vyšší molekulární ..hmotností .nebyly charakterizovány. .Látky, tvořící' pík onižší molekulové hmotnosti /M 3000,- 8000/ byly dále zpra-.covány chromatograficky.na koloně s hydroxyapatitem za pou-žití Bio-Gelu HPHT /kolona 2,5 x 60 cm, 5 /uM pufr fosforečxnan sodný pH 6,8/, kde byly vzorky aplikovány ve stejném" pufru. ......- ’ ’; '
Eluce byla provedena 30 ml téhož pufru.a pak 35 ml50 mM pufru fosforečnanu sodného. Imunoreaktivní frakce v byly.shromaždovány, zahuštěny na membráně Amicon Diaflo UM2,odsoleny na koloně 0,6 χ 30 cm Sephadex G-25 /jemný/ v 10mM hydrogenuhličitanu sodném /pH 8,0/ a lyofilizovány. hTP byl zpracován metodou HPLC za použití preparační.kolony DE 500 s měničem aniontů o rozměrech 2,5 x 25 cm. Li-neární rozpouštědlový gradient byl zahájen 20 mí<í tris ace-tátovým pufrem /pH 6/ a ukončen 80% zředěným stejného puf-ru 500 mhá octanem sodným. Imunoreaktivní frakce byly shro-maž.dovány, dialyzovány na Spectraporu -o /mezní molekulární limit - M 1000/ a lyofilizovány. Další chromatografie byla -20- provedena na koloně s reverzní fází Vydac /218TP54/ zapoužití lineárního gradientu na počátku s 50 nM mravenčenuamonného /pH 6,5/ a na konci s 60% zředěním acetonitrilem.Eluované HPLC frakce,byly Částečně zahuštěny, lyofilizová-ny a znovu rozpuštěny v 500 ^ul 50 mM hydrogenuhličitanuamonného /pH 8/. Objemy po 25 /Ul byly hodnoceny dvojímpokusem metodou RIA a imunoreaktivní frakce byly shromáž-děny. a lyofilizovény. Výtěžky z čistících stupňů hTP jsou uvedeny v tabulce imunoreaktivní celkové protein výtěžek proteiny mg r % počet čiš- % tění 1. labulka Čistící stupen ultrafilrace 68000 309,5 0,45 1 100 gelová filtrace 2950G-75 76,9 2,6 6 25* hydrofob. chromatog. 181,2 32,6 18 40 11 prep.EPLC 3,4 2,8 82 182 0,9 Chrom s rev. fází 1,4 1,3 . 93 207 0,42 Kpík o nižší molekulové hmotnosti Příklad 2
Sekvenční analýza hTP
Analýza aminokyselin byla provedena na analyzátoru aminokyselin Liquimat III po kyselé hydrolýze po dobu 2ihodin -21-
s L· íi y. .při‘100 °C v prostředí 5,7 M HC1, obsahující 0,5 % 2-mer- í' y.^Áč-kápToéthanolu./D.H.Speckman a spol., Anal.Chem., 30:1190-,
‘ '1206/1958//. ;’ M
Maleátovaný hTP byp přípraven přídavkem maleianhydri- du v 1,4-dioxanu /100 yul/ ve 20ti násobném přebytku vzhledem1 í: k volným aminoskupínám polypetidů /500 /Ug/t které byly Š rozpuštěny ve 100 mM boří tanu sodném /pH 9,3/. Maleinan- £ hydrid byl přidáván postupně během 4 hodinového intervalu, š- při kterém, byla hodnota pH. udržována na 9,3 pomocí 6M NaOH. £
Tento maleinanovaný protein pak byl odsolen na Bio-Gelu P-2 ϊ ve 100 mM hydrogenuhličitanu amonném./pH 8,2/ a pak byl lyofilizován.
Digesce trypsinem maleátovaného hTP byly provedeny v ί'ΐ 0,2M N-ethylmorfolinovém acetátovém pufru /pH 8,1/ při £ 37 °C po dobu 6 hodin. Byl přidán, hově2Í pankreatický-tryp- ;í sin /zpracovaný' difenylkarbamylchloridemj N </" -r benzoyl- | L-arginiňr-ethylesterových jednotek na mg proteinu, typ Sig- j: ma XI/ v konečném hmotnostním poměru enzym/substrát 1:100. Během digesce bylo pH udržováno na hodnotě 8,5 a pak bylo sníženo na 2,0 přídavkem 10 mM HC1 pro ukončení reakce. Směs- " pak:-byΙεΓ lydŤilizbvánal ' . £ hTP /200 pmol/ byl Štěpen CKBr. ve 150 yul. 70% kyseliny í mravenčí po dobu 23 hodin,ve tmě při teplotě místnostij byl j í použit. 200násobný přebytek CNBr vzhledem k obsahu methioni- £ nu ve vzorku. Objem pak byl zmenšen na 60 ^ul pod dusíkem a aplikován přímo na skleněný filtr sekvenátoru v plynné fázi /M.W.Hunkapiller a spol», Methods Enzymol., 91:399- ΐ 413 /1983//. < T 1 * f· -22-
Peptidy zpracované digescí s trypsinem a Štěpené CNBrbyly přečištěny následujícím způsobem. Tryptické peptidybyly rozpuštěny v 0,1% kyselině ottofosforečné /pH 2,2/a pak odstředěny při 15600 x g po, dobu 5 minut. Supernatantbyl vnesen.na kolonu s reverzní fází Ογθ pro HPLC /Vydac .218TP54) 46 mm x 25 cm, velikost částic 5 /um, The Separa-tion Group, Hespeřia CA, LDC gradient modul se spektro-monitorem II a integrátorem Cl—10 ve spojení se sběračemfrakcí LKB Redirac 2112/. Byla použita lineární gradiento-vě eluce na počátku za použití 0,1% kyseliny fosforečné a 80%acetonitrilu na konci. Byl použit acetonitril vysokého stup-ně čistoty provenience Burdich a Jackson /líuskegon, MI/,který byl předestilován ve skle. Kyselina fosforečná /1%/byla zfiltrována pres filtr; Milíipore HA 0,45 ^um /Milli-pore/. Veškerá rozpouštědla byla odplyněna pod vakuem zamíchání po dobu 20 minut.
Automatizované sekvenční analýzy intaktního hTP a tryp-tických a bromkyanových fragmentů hTP byly provedeny sek-,věnováním v plynné fázi na sekvenátoru v. plynné fázi mo-del 47ŮA Applied Biosystems za použití Polybrenu jako nosi-če a standardního programu single-coupling sing-cleavage.Vzniklé fenylthiohydantoinem derivatizované aminokyselinybyly identifikovány metodou HPLC za použití vysokotlakéhokapalinového chromatográfu Hewlett Packard 10843 /P.H.Schlesinger, Methods Enzymol., 91:494-502 /1983//. C-koncová analýza hTP /vždy 150 /Ug/ byla provedenakvasinkovou karboxypeptidázou Y /2 nmol/ v roztoku 100 mMoctanu sodného /pH 6,0/ při 37 °C, V různých intervalechbyly z: digestu odebírány alikvotní podíly a vnášeny do zku-mavek, obsahujících /ul ledové.kyseliny octové a taťó směspak byla lyofilizována. Vzorek pak byl rozpuštěn v 0,2Moctanu sodném /pH 2,2/ a aplikován do analyzátoru aminokyse-lin. Současně byly zpracovány slepé vzorky enzymu a peptidu. -23- Výsledkem výše uvedených postupů, byl výtěžek 1,3 mg'imunoreaktivního. hTP /výtěžek 0,4 %//Tabulka 1/ z přibliž-ně 1,4 kg čerstvě zmrazeného lidského thymu. Tento produktměl jeden hlavní pruh a několik menších pruhů při isoelek-trické gelové fokusaci. Isoelektrický bod hlavního pruhů, byl6,1+0,2, Tabulka 2 dále znázorňuje aminokyselinové složeníhTP v molárních poměrech.
Tabulka 2
Aminokyseliny nalezeno průměr + SK cysteinová kyselina 0 ND aspartová kyselina 2 2,29 +0,12 threonin 3 3,11 + 0,23 serin. 1 0,81 + 0,19 glutamová kyselina 6 5,55 + 0,22 prolin 3 2,80 + 0,30 glycin 3 2,28 +0,27 alanin 4 . 4,25 + 0,10 valin 6 . 6,23 + 0,30 methionin ' : 1 ' //0,87 + 0,13 isoleucin 0 0,10 +0,11 leuein 9 8,72+0,36 tyrosin 2 1,90 +0,12 fenylalanin 0 1 0,16 + 0,11 lysin 5 4,92 + 0,31 histidin 2 1,76 + 0,12 arginin 1 1,07 + 0,13 ND - nedetegováno
Průměr dvou stanovení /24 a 76 hodin/,. Hodnota pro serinbyla zvýšena o 10 % a pro threonin'o 5 % ke kompenzacidestrukce kyselinou. Hydrolýza byla provedena s konstantně vroucí HC1 při 110 °C ve'vakuu. -24- Štěpení hTP bromkyanem poskytlo 3 rozlišené frakce /vizobr.2/ a výsledky aminokyselinové sekvence pro každou frak-ci jsou shrnuty v tabulce 3·'
Tabulka 3
Způsob sekvenování N-koncová degradaceCNBr štěpení nativního TPpík 1
pík II C-koncová karboxypeptidázová metoda
pík III
pík IV
pík V C-koncová karboxypeptidázovámetoda identifikované zbytky 1-46 1-11 32-46 44- 4837-47 nezískána žádná sekvence18-30 45- 48
Stanovení struktury hTP bylo provedeno automatizo-vaným N-koncovým sekvenováním 240 'pmol hTP při 46 cyklechEdmanovy degradace, která poskytla repetitivní výtěžek/průměrný výtěžek na cyklus/ 53,4 % a byly identifikoványvšechny ze 46 N-koncových zbytků /viz obr.3/. Uvolňováníaminokyselin C-konce intaktního hTP pomocí karboxypeptidá-zy Ϊ /tabulka 4/ poskytlo neekvivokální tetrapetidovousekvenci se dvěma aminokyselinami, překrývajícími se '/zbyt-ky 45 a 46/ s N-koncovou sekvencí, Parciální sekvence hTPbylá stanovena stanovením struktury CNBr fragmentu I /obr.2/, který zahrnuje zbytky 32-40 a který obsahuje aktivnímísto. Kromě toho složení aminokyselin intaktního hTP /ta-bulka 2/ odpovídá všem aminokyselinám nalezeným sekvenčníanalýzou. Tabulka 4 dále uvádí výsledky časového uvolňo-vání volných aminokyselin z C-konce pomocí karboxypeptidá-zy Y. ' -25-
Tabulka 4 aminokyseliny výtěžek, nmol
Aminokyselina lOOs 120s 150s 200s 250s 300s Thr 75 210 263 Ala - - 88 258 276 288 Leu 148 275 283 418 503 His 289 310 300 . 308 299 Příklad 4
Izolace řTP z.krysího thymu . Zmrazený krysí, thymus byl rozmražen na ledu, konden- zován a přebytek tuku byl odstraněn. Thymus /74 g/ byl ho- .mogenizován v ledem chlazeném ^,05M hydrogenuhličitanu amon-ném /25 % suroviny hmotn./obj., pH 8,3/, obsahujícím 50 ng2-merkaptoethanolu, 175 ^ug fenylmethylsulfony1fluoridu a375 ^ug dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové naml pufru. Nerozpustné látky bylý odstraněny odstředěním’při 17000 x g po dobu 60 minut. Supernatant byl zfiltrovánpřes plátno a byla přidána bakteriostatika, thiomersal aazid sodný, každý v konečné koncentraci 0,1 %, . ·.
Extrakt, obsahující rozpustné látky byl zpracován ve 350ml míchané kyvetě Ámicon za použití membrány ΪΜ-100 /100000mol. hmotnost dělící hodnota/, filtrát byl zahuštěn /740ml. na 70 ml/ na membráně YM-2 /2000 mol.hmotn.-dělící hodno-ta a reteritát byl zpracován sloupcovou chromatografií naSephadexu G-50 /velikost Částic 20 až 80 /um/ za použitískleněné kolony 2,5 x 100 cm, při teplotě místnosti v roz-.toku pufru 0,05M hydrogenuhličitanu amonného /pH 8,3/. Bylyvnášeny vzorky objemu 20 ml v každém dílčím stupni /průtok -26- v 40- ml/h/, frakce, obsahující thymopoietin. byly zjišťoványpomocí radioimunoassay /GwGoldstein, J.Immunol., 117:690—692/1976// a lyofilizovány. . t ‘
Obsah proteinu teyl stanoven činidlem'Cóomassie Bluepro stanovení proteinů /Pierce, Rochforď, IL/ podle instruk-cí výrobce a lyofilizovány protein byl zpracován na moleku-lovém sítě s vysokým stupněm rozlišení jak je popsáno dále.
Do kolony Pharmacia XK 16/70 spojené s účinným, rychlým,kapalinovým chromátografem /systém FPLC/ byl podle pokynůvýrobce naplněn Sephacrýl HR-100 /Pharmacia, Pistaway, NJ/,Pufrem pro plnění a eluci kolony byl 0,02M hydrogenuhli-.Čitan amonný /pH 7,0/ při objemu kolonového lože asi 130ml. Lyofilizovaný protein /2,0 až 3,0 mg/ byl resuspendovánv. 1,3 ml pufru a nanesen na< kolonu pomoci 1,0ml injekčnísmýčkyy při eluci kolony za průtokové rychlosti 1,5 ml/min.Výtok z kolony gelové filtrace byl sledován. UV absorpcí po-mocí LKB-Unicord-S-II spojeného se dvoukanálovým zapisovat- v Čem, přičemž byly shromažďovány frakce po 1,5 ml.
Odpovídající frakce z několika chromatografických pro-vedení. byly shromážděny a obsah proteinu byl stanoven mě-řením O.D. při 280 nm. Pak byly tyto frakce lyofilizoványv silikonových skleněných nádobách a byla stanovena jejichimunoreaktivita způsobem popsaným níže. Příklad 5
Imunoreaktivita rTH
Krysí thymopoietin izolovaný postupem v příkladu 4 bylstanoven pomocí králičí antihumánní thymopoietinové proti-látky. Toto antiserum bylo.inkubováno s různými koncentracemi -27- rozpustného proteinu izolovaného- na Sephackrylové koloněHR-100 po dobu 2 hodin-při 370¾ na kyvné podložce?. Tato směsbyla přidána do krysím thymopoietinem pokryté' polyvinyl-chloridové mikrotitrační destičky podle dříve popsanýchpostupů /T.Audhya a spoí., Bcand.J.Immunol., 31:199-204/1990// a inkubovéna při 37 °C po dobu 2 h. Po promytí des-tičky 0,1 5M fosforečnanovým pufrem pH 7,2, obsahujícím0,05 % Tweenu 20 /PBS-Tween 20/, byla přidána kozí- anti- 'králičí protilátka konjugovaná na křenovou peroxidázu/HRPO/ /Jackson Labs., West Grove·, PA/ a destička byla inku-bována při 37 °C po dobu 1 h. Po třech postupných promytíchPBS-Tweenem 20 byl přidán substrát-chromogenní systém, ob»sáhující HgO;, a 3,3*,5,5*-tetramethylbenzÍdin /TMB/ /SigmaChemical St.Louis, MO/ a nechala se proběhnout barev- ná reakce při teplotě místnosti a ve· tmě po dobu 30 minut.Reakce byla ukončena přídavkem 2,5N" HC1 a byla změřena op-tická hustota při 450 nm. . V enzymatické imunoalalýze;/ELISA/ za použití krysímthymopoietinem pokrytých destiček, a antihumánní thymopoi.eti-nové protilátky, poskytly přečištěný krysí a lidský thymopoitin paralelní vytěsňovaeá křivky, dokládající iminologickoupodobnostr, "přTčěmž“krýší' thýmbpbiTťířrvýkazujeT~10,4% reaktivity ve srovnání s lidským thymopoietinem. wa rozdíl odvýše uvedeného- hovězí thymopoietin neposkytl paralelní vy- v těsnovací křivku a vykázal méně než 0,1 % křížové' imino- f reaktivity s lidským thymopoietinem v této imunoanalýze. Příklad 6
Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu /PAGE/ a WesternBlot analýza ; - Vzorek proteinu, získaný postupem uvedeným výše v pří-'kladu 4 byl dále charakterizován zpracováním 10 /ul tohotovzorku s 0,25 /ul 10% dodecylsulfátu sodného /SES/ a 1 /Ul -28- bromfenolové modři a elektroforezou na přistrojí PharmaciaPhast System za použití 20% homogenního polyakrylamidovéhogelu. Před vlastním provedením gelové elektroforézy bylo 6kusů- filtračního papíru a jeden kus 0,2 mikrometrového nit-rocelulozového papíru smočeno v transferovém pufru /25 mM.Tris, 192 mM glycin, 20% methanol, pH 8,3/. Transferový. -sendvič; byl sestaven následujícím způsobem: 3 kusy filtrač-ního papíru, nitrocelulózový papír, gel a 3 kousky filtrač-ního papíru. Protein byl pak převeden do PhastTransfer sys-tému za podmínek 6 min/gel a 25 mA/gel. Membrána pak bylablokována přes noc 3% hovězím sérovým albuminem /SigmaChemical Co., St.Louis, M0/ v PBS-Tweenu 20, pak byla tři-krát promyta PBS-Tweenem 20 a ponechána k průběhu reakce ýs HRPO konjugovanou monoklonální protilátkou vůči lidskémuthymopoietinu při 37 °C po dobu 2 hodin za míchání pohybem.Membrána pak byla promyta třikrát v PBS.Tweenu 20 a inku-bována se směsí substrát-chromogen /TMS membránové peroxi-dáza, Kirkergaard Perry Labs, Gaithersberg, MD/ po dobu 15až 30 minut, promyta vodou a vysušena na vzduchu. PostupemPAGS bylo demonstrováno,. že krysí a lidský thymopoiet.inmyjí podobné molekulové hmotnosti. Krysí thymopoietin pro-kázal podobné migrační vlastnosti jako,lidský thymopoietinpři Western blottingu. Příklad 7
Charakterizace přečištěného krysího thymopoietinu a. Složení aminokyselin: Složehí aminokyselin bylo stano-veno čtyřnásobně na. vzorcích polypeptidu hydrolyzovaných 6NHC1. při 110 °C ve vakuu po dobu 24, 50, 71 a 94 hodin a zís-kané hodnoty byly extrapolovány na nulovou dobu hydrolýzjr.Analýza byla5provedena na analyzátoru aminokyselin Qeckman6300/řalo Alto, CA/ metodou podle Moorea a spol /Anal.Chem.30:1185-1190 /1958//. -29-
b. Izoelektrická fokusace za použití PAGE
Byla použita metoda izoelektrické fokusace podle;Fin-laysona a Chrambacha, Anal. Biochem.,40:292-311 /I97l/^a;použití směsi s amfolinem, poskytující pH mezi 3,5 a 8.Metodou isoelektrické fokusace. byla zjištěna hodnota píkrysího thymopoietinu. 6,8. c. Analýza karboxy-terminálu karboxypeptidázou
Analýza karboxy-terminálu krysího thymopoietinu bylaprovedena postupem popsaným v práci, jejímž autorem je T.Audhya a spol., Proč.Nati.Acad.Sci., 84:3545-3549 /1987/.Poměr enzymu k.substrátu byl 1 :200. Analýza karboxypepti-óázou v závislosti na čase poskytla Arg, Lys a His v ekvimo-lárních poměrech. , d. HHo-terminální sekvenční analýza
Podíl přečištěného proteinu /200 nmol/ byl frakciono- ván 4-20% SDS-PAGE elektroforezou za konstantního proudu 50mA. Po elektroforéze byly proteiny převedeny z gelu na mem-bránu z. pólyvinylidehdifluořidu /PVDF/ s použitím polosuchéelektroblotterové jednotky /Integrated Separation SystemS110201 /Hyde Park, MA/ při 200 V za_konstantniho — po dobu 30 minut. Membrána pak byla vybarvena Coomassie.modří a odbarvena. PVDF membrána, obsahující blottovanýprotein v oblasti 5,5 kDa byla rozřezána na kusyr2 x 4 mma umístěna na vrchol kondiciovaného filtru Biobrane jakoinertního nosiče. Automatizovaná Edmanova . degradace byla provedena na sekvenátoru Applied Biosys-tems; Model 477A s pulzní kapalnou fází /Applied Biosystems,Foster City, CA/. Fenylhydantoinové /PTH/ aminokyselinybyly identifikovány on line Applied Biosystems PTH analy-zátorem aminokyselin /Model ABI 120A/. Eluent byl deteko-ván při 269 nm. Automatická sekvenace 1000 pmol proteinupři 48 cyklech od N-konce poskytla repetitivní výtěžek 93 %. -30- Příklad 8
Exprese, rekombinantního lidského nebo krysího TP i, ' · . K výrobě hTP nebo rTP se cDNA, která je kóduje? pře-»' - vede do vhodného'expresního vektoru, takové vektory jsou známy v. mnoha typech pro savčí, hmyzí, kvasinkovou, plís-novou a bakteriální expresi pomocí standardních postupů mo-lekulární biologie. Například pUC serie vektorů je obchod-ně dostupná. Další vektory pro savčí expresi jsou popsány,např, pXM /Y.C.Yang a spol., Cell, 47:3-10 /1986//. Vy-braný vektor může být linearizován s příslušným endonukleá-zovým enzymem a postupně ligován v ekvimolárním množstvíseparátně, k cDNA kódující hTP nebo rTP, která byla předemmodifikována přídavkem syntetických ,oligonukleotidů, kte-ré generují komplementární konce tak, aby generovaly kon-strukty pro expresi. Tyto konstrukty mohou být exprimová-n.y v různých hostitelích s příslušnými vektorye
Odborník může zkonstruovat další savčí expresní vek-tory např. vložením DNA sekvencí hTP a rTP do plasmidu spříslušnýmienzymy a .použít, známé metody genového inženýrst-ví a další známé vektory jako je- pUC18, který je obchod-ně dostupný od firmy Amersham, Buckinghamshire, GB neboPharmacia, Uppsala,'.Švédsko. a. Exprese v,savčích buňkách
Vektor pro expresi v savčí nunce. lze syntetizovat pos-t tupý dobře známými v oboru. Komponenty těchto vektorů, na- příklad replikony, vybrané geny, enhancery, promotory apodobně lze získat z přirozených zdrojů nebo je lze synte-tizovat známými postupy. Viz např. Kaufman a spol., J.Kol.Biol.159:511-521 /1982/ a Kaufman, Proč.Nati.Acad.Sci., USA, 52:689-693 /1985/. Příklady savčích hostitelských tuněk zahrnujízejména buněčné linie primátů a buněčné linie hlodavců,včetně transformovaných buněčných linií. Normální diploidnť -31- buňky, buněčné kmeny odvozené od in vitro kultur primárníchtkání rovněž jako primární explantáty jsou rovněž vhodné.Navrhované buňky nemusí být genotypicky deficientni ve vybra-ném, genu pokud tento selekční gen je dominantně působící. Prostabilní integraci vektorů. DNA a následnou amplifikaci in-tegrovaných vektorů DNA lze použít v obou případech kon-venčních metod pomocí CHO buněk. Alternativně vektor DNAmůže zahrnovat celý nebo část genomu hovězího paúillom viru/Lusky a spol., Cell, 36:391-401 /1984//, který může být v vnesen do takových buněčných linií jako jsou C 127 myší buň-ky jako stabilní episomální prvek. Další vhodné buněčnélinie zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, HeLa, opičí buň-ky COS-1, myší buňky. L-929, 3T3 linie. odvozené od Swiss,Balb-c nebo NIH myších, BHK nebo HaK křeččích buněčných li-nií . transformace vektorů hTP nebo rTP do vhodných hosti-telských buněk může mít za následek expresi hTP nebo rTPpolypeptidů. Stabilní transformanty jsou screenovány z hle-diska, exprese produktu pomocí, standardních imunologických,biologických nebo ..enzymatických stanovení. Přítomnost DNAnebo mENA kódujících hTP nebo rTP polypeptidy-lze detegovatstandardními postupy jako je Southern bloťting nebo RNÁ’ blo"ť-ting. transientní exprese DNA kódující polypeptidy běhemněkolika dnů po zavedení expresního vektoru DNA do vhodnýchhostitelských buněk jako jsou COS-1 opičí buňky, se sta-noví bez výběru podle aktivity nebo imunologického stanoveníproteinů v kultivačním mediu. b. Systémy bakteriální exprese ^odobně odbornívi mohou zpracovávat sekvence kódující hTP nebo rTP eliminací každé savčí regulátorové sekvence,blokováním kódujících sekvencí a vnesením bakteriálníchregulátorových sekvencí, vytvářejících bakteriální vektory “32- pro intracelulární nebo extracelulární expresi. hTP neborTP podle vynálezu bakteriálními buňkami. DNA kódující hTPnebo rTP může být dále modifikována tak, aby obsahovalarůzné kodony k optimalizaci bakteriální exprese jak již vje v oboru známo. Výhodně sekvence kódující maturovanýhTP nebo rTP se operativně připojí v rámečku k nukleotido-vým sekvencím kódujícím.sekreční leader polypeptid, umož-ňující bakteriální expresi, sekreci a zrání hTP nebo rTPpolypeptidu, také postupy známými v oboru. Exprese.hTPnebo rTP v E.coli za použití takových sekrečních systémůmůže mít za následek sekreci aktivního polypeptidu.
Sloučeniny exprimované nějakým způsobem z bakteriál-'nich hostitelských buněk lze pak izolovat, čistit a/nebocharakterizovat z hlediska fyzikálně-chemických, bioche-mických a/nebo klinických parametrů všemi známými metodami. v c. Exprese hmyzími nebo kvasinkovými buňkami
Eodobné .postupy lze provést.pro konstrukce hmyzího vek-toru pro expresi hTP nebo rTP polypeptidů ve hmyzích buň-kách /viz např. postupy popsané v publikované Evropské pa-tentové přihlášce Č. 155476/.
Podobně se konstruují kvasinkové vektory za použitíkvasinkových regulátorových sekvencí k expresi cDNA kódu-jících hTP nebo rTP ve kvasinkových buňkách za tvorby sek-retovaných extracelulárních aktivních hTP nebo rTP /viznapř. postupy popsané v publikované PCT přihlášce WO86/00639 a evropské patentové přihlášce 123289/. V každém expresním systému popsaném výše výslednébuněčné linie lze dále amplifikovat vhodným léčivem, výsled-né buněčné linie lze reklonovat a hladinu exprese lze. sta-novit za použití hTP nebo rTP stanovení popsaného v tomtopopise. -33- .ν’. .Příklad 9
ϊ,' : Diagnostická stanovení za použití hTP nebo rTP Následující stanovení lze použít k diagnóze cirkulu- v jícího-TP v tkáňových tekutinách vybraného pacienta z hle-diska diagnózy choroby nebo sledování účinnosti léčby, A.Radioimunostanovení - separace polyethylenglykolem
Pro stanovení hladiny Tp ve vzorku cerebrospinálnítekutiny daného pacienta se tento vzorek zpracuje chroma-tografií na molekulovém sítě Sephadexu G-50 v O,1M hydro-genuhličitanu amonném při pH 8, Erakce mezi vylučovanou/Vo/ a propouštěnou hodnotou /Vi/ jsou shromaždovány a lyo-filizovány a lyofilizát je jbak vyjmut do pufru pro thymo-poietin. Toto zpracování má za účel vyloučit molekuly mole-kulové hmotnosti větší nebo menší než má thymopoietin z to-hoto stanovení. K 0,5' ml hTP-antisera-. zředěného v 5 % hovězího gama-glo·bul inu v 0,01M. fosfátovém pufru - 0,15M NaCl. /BGG pufr/ se.přidá 0,2 ml vzorku CSF zvoleného pacienta a 0,3 mi ^^IhTPnebo IrTP podle vynálezu /50000 cpm v SGG pufru/. Inkuba- ------------ce- by-l-a -provedena· třikrát V' plastikových zkumavkách 'roz- měrů 12 x 75 mm.
Zkumavky byly promíchány vortexovým mixerem a ponechá-ny stát dvě hodiny při teplotě místnosti. Poté bylo přidá-no do každé zkumavky půl mililitru chladného 30% polyethy-lenglykolu.za míchání vortex-mixerem a pak byly zkumavkyodstředěny při 2000 ot.min"^ po dobu 20 minut v chlazené . centrifuze. Supernatanty byly odsáty a byla stanovena.radio-aktivita srsženin pomocí automatizovaného gama spektrometru. -34-
Vysrážený ^^I-hTP /v %/ se vypočte podle vzorce 1-a/b-c/x \100, kde a = cpm sraženiny s protilátkou, b = celkové, při-dané cpm a c = cpm nespecificky vysráŽené s. normálním krá-ličím šerem nebo. s protilátkou a přebytkem neznačenéhothymopoietinu. /obvykle se pohybuje oklo 10 % celkového cpm/. Ve standardní křivce byla vazebná inhibice^ thymopoie-tinové vazby kalkulována jako procenta maximální thymopoie-tinové vazby s protilátkou při 10”\ Pro standardní křivkuvazebně inhibicní se použijí ředěné protilátky 1 .*3000. B.. Rádioimunostanovení- dvojitá separace protilátky Výše uvedený postup A se opakuje s výjimkou toho, že se použije 4M KCl BGG pufr a po dvou hodinách inkubace se !přidá celkem 0,1 ml kozí anti.králičí protilátky a 0,02ml normální- králičí protilátky, kde komponenty se smísí navortex-mixeru a vzniklá směs se; ponechá stát při teplotěmístnosti po dobu 5 minut a pak se odstředí. Supernatant sepak odsaje a precipitát se hodnotí na radioaktivitu jakov části A výše. C.Radioimunostanovení -separace aktivním uhlím potaženýmdextranem
Dextranem potažené' aktivní uhlí se připraví smísenímstejných objemů /i/ 5 g aktivního uhlí Nořit A ve 100 mlfosforečnanového pufru, obsahujícího 2M KC1 a hovězí gama-globulin a /ii/ 0,5 g dextranu 110 ve 100 ml fosforečnano-vého pufru, obsahujícího 110 KC1 a hovězí garaaglobulin.
Celkem 0t5 ml dextranem potaženého aktivního uhlí Sepřidá při 4 °C do zkumavky pro stanoveví obsahu po 2 hodi-nách inkubace jak j‘e uvedeno výše v-části B a směs se po-nechá stát 30 minut při 4 °C. Zkumavky se pak odstředí a su _pernatanty se odsají. Pelety jsou pak hodnoceny na rádio-·aktivitu, která v tomto případě představuje stanovený "nevá-zaný" thymopoietin. -35- Při stanovení křivky vazebně.inhibiční pro neznačenýthymopietin za použití separace polyethylenglykolem vy-kazuje koplex antigen-protilátka citlivost na thymopoieti-nové koncentrace větší než 5 ng/ml. 2ádné větší odchylkynejsou pozorovány u kontrolních polypeptidů, které zahr-nují inzulín, alga-bungarotoxin, ubiquitin, histon asyntetický tridekapeptidový fragment thymopoietinu /zbyt-ky 29-41/ v koncentracích 10 až 1000 ng/ml.
Vazebně inhibiční křivky pro neznačený thymopoietinv těchto stanoveních používajících dvojí separaci proti-látek a separaci komplexu antigen-protilátka. na dextranempotaženém aktivním uhlí vykazují citlivost na.thymopoie-tin v koncentracích pod 0,1 ng thymopoietinu na ml; Tyto1poslední dvě uvedené metody jsou tak zvláště vhodné proměření hladin thymopoietinu ve vzorcích CSP. Výše uvedený popis zahrnuje mnoho, modifikací a varia-cí podle vynálezua a předpokládá se, že: pro odborníky budou .taková řešení- zřejmá. Například použití vhodných vektorů,vektorových komponent a hostitelských buněk pro rekombi-nantní výrobu polypeptidů podle vynálezu je v rozsahu zna-lostí odborníků, ďvedené modifikace a změny ve složení jsou.samozřejmě zahrnuty do rozsahu vynálezu.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Krysí thymopietin v podstatě prostý kontaminace jinýmsavčím proteinovým materiálem, mající sekvenci aminokyse-linovýhh zbytků GLY-MET-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL-LEU-THR- LYS-GLN-LYS-LEU-LYS-SER-GLU-LEU-VAL-ALA-LYS- GLY-VAL-ALA-LEU-PRO-ALA-GLY-GLU-GLN-ARG-LYS- ASP-VAL.TYR-VAL-ASP-ILE-TYR-PRG-GLN-HIS-LEU- THR-ILE-LEU-HIS-LYS-ARG. [ 2» Způsob přípravy krysího thymopofetinu, v yz n a č u j ,í- c.í s 'e t X m, že se kultivuje^buněčná linie transformo-vaná DNA sekvencí kódující krysí thymopoietin nebo jehofragment v operativním spojení se sekvencí řídící" jeho ex-presi. 1
- 3. Buňka transformovaná aminokyselinovou sekvencí podle?nároku 1 v operativním spojení se sekvencí řídící expresi. 4· Buňka podle nároku 3} kterou je savčí nebo bakteriál-ní buňka. 5, ' Plásmidóvý vektor, obsahující aminokyselinovou sek- venci podle nároku 1. -37- 6». Diagnostické činidlo, obsahující savčí thymopoietinmající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahr-nující GIY-MET-PRO-LYS-GLU-VAL-PRO-ALA-VAL- LEU-THR-LYS-GLN-LYS-LEU-LYS-SER-GLU- LEU-VAL-ALA-LYS-GLY-VAL-ALA-LEU-PRO- ALA-GLY-GLU-GLR—ARG-LYS-ASP-VAL-TYR- VAL-ASP-XLE-TYR-PRO-GLN-HIS-LEU-THR- ILE-LEU-HIS-LY3-ARG.
- 7. Způsob éšeřgnwsřtšky hladiny thymopoietinu ve vzorkukapaliny pacientovy tkáně, vyznačují cí se tím,že využívá všechny nebo část sekvencí podle nároku 6, popří-padě spojené s. radioaktivním značením, jako reagencie. ii
- 8, Způsob podle nároku 7,v yznačující set. í. m, že? uvedenou tkáňovou kapalinou je cerebrospinálníkapalina. .· ' '.· á'. i. ,a
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52067290A | 1990-05-08 | 1990-05-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS133091A3 true CS133091A3 (en) | 1992-01-15 |
Family
ID=24073606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS911330A CS133091A3 (en) | 1990-05-08 | 1991-05-07 | Human and rat thymopoietin |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU7951791A (cs) |
| CA (1) | CA2041183A1 (cs) |
| CS (1) | CS133091A3 (cs) |
| IE (1) | IE911546A1 (cs) |
| IL (1) | IL97997A0 (cs) |
| PT (1) | PT97586A (cs) |
| WO (1) | WO1991017182A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA913369B (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL106545A0 (en) * | 1993-08-01 | 1993-12-08 | Q B I Enterprises Ltd | Human and human-like thymopoietin,method for its production and recombinant dna sequences encoding it |
| US9050314B2 (en) * | 2009-07-27 | 2015-06-09 | Cmi Research Management, Llc | Methods of treatment of arthritis using thymus-derived compositions |
-
1991
- 1991-04-25 CA CA002041183A patent/CA2041183A1/en not_active Abandoned
- 1991-04-29 IL IL97997A patent/IL97997A0/xx unknown
- 1991-05-03 ZA ZA913369A patent/ZA913369B/xx unknown
- 1991-05-07 WO PCT/US1991/003187 patent/WO1991017182A1/en not_active Ceased
- 1991-05-07 IE IE154691A patent/IE911546A1/en unknown
- 1991-05-07 AU AU79517/91A patent/AU7951791A/en not_active Abandoned
- 1991-05-07 PT PT97586A patent/PT97586A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-05-07 CS CS911330A patent/CS133091A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2041183A1 (en) | 1991-11-09 |
| IL97997A0 (en) | 1992-06-21 |
| IE911546A1 (en) | 1991-11-20 |
| AU7951791A (en) | 1991-11-27 |
| PT97586A (pt) | 1992-03-31 |
| ZA913369B (en) | 1993-01-27 |
| WO1991017182A1 (en) | 1991-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3155002B2 (ja) | エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 | |
| US4816561A (en) | Biologically active polypeptides | |
| US5240912A (en) | Transforming growth factor (TGF) peptides | |
| EP0246753B1 (en) | Fibroblast growth factor antagonists | |
| AU616672B2 (en) | Growth hormone receptor | |
| US4505853A (en) | Enzyme-resistant immunomodulatory peptides | |
| FI92325C (fi) | Menetelmä tymopentiinianalogien valmistamiseksi | |
| US4863899A (en) | Biologically active polypeptides | |
| US4659694A (en) | Prothymosin alpha | |
| US4864019A (en) | Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom | |
| JPH03504013A (ja) | Ｔ細胞ヘルパー活性を有するペプチド | |
| US4002740A (en) | Tridecapeptide compositions and methods | |
| US4716148A (en) | Prothymosin alpha | |
| KR940001711B1 (ko) | 심방성 나트륨이뇨성 펩티드의 동족체 | |
| JPH04503812A (ja) | メラニン濃縮ホルモンおよびそれを用いた処置法 | |
| JP2729498B2 (ja) | ヒトインシユリンアナログ類 | |
| Audhya et al. | RETRACTED: Isolation and complete amino acid sequence of human thymopoietin and splenin. | |
| EP0372352A2 (en) | Aequorin fused with a protein having a specific-binding activity, its preparation, its purification and detection method by its use | |
| FI78918B (fi) | Foerfarande foer framstaelling av immunmodulatorpeptid. | |
| EP0138616A2 (en) | Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them | |
| EP0132021B1 (en) | Tgf polypeptides, antigenic oligopeptides derived therefrom and antibodies produced therefrom | |
| CS133091A3 (en) | Human and rat thymopoietin | |
| US4923964A (en) | Human splenin | |
| EP0300741A2 (en) | Human thymopoietin | |
| JPH09157294A (ja) | 副甲状腺ホルモン誘導体 |