PT97847B - Processo para a prparacao de beta-hidroxi-alfa-aminoacidos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 97.84?

REQUERENTE: THE UNIVERSITY of notre dame du.lac., norte-americana, industrial, em Soíith Bend índia na 46556 - ESTADOS UNIDOS AMERICA NORTE

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE B-HIDROXI- -AMINOÃCIDOS

INVENTORES:

MARVIN JOSEPH MILLER

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4? da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

ESTADOS UNIDOS DA AMERICA DO NORTE, EM 4 DE JUNHO DE 1990, SOB O No.07/532,845

THE UNIVERS1TY OF NOTRE DAME DU LAC

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE B-HIDROXI-a-AMINOÁCIDOS ®tôRXA_DiS^mVA h^SU/BO

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de B~Hidroxi”«-aminoácidos cs quais são obtidos por meio ds condensação de aldeídos com glicina catalisada por hidroximetiltransfsrsss de sarins. D produto predominante com a maioria dos aldeídos ê o diastereómero L-eritro» Por exemplo? éster metílico de semisldeído succínico é condensado com glicina no processo a fim de proporcionar éster monometílico ds ácido L ~e r i t r o -·« - a mi η o - β -· h i tí r o x i a d ί p i c o =, ζ:

Λ ' \

Esta invento ais respeito a um processo para a preparação de B-hidroxi-a-aminoácidos» Em particular? diz respeito a um processo enziroãtico para a preparação de β-hidroMÍ-a-aminoácidos que se encontram substancialmente na forma L-eritro.

Gs B-hidroxi-ccaminoácidos têm muitas utilizações? incluindo -a utilização como compostos intermédios na preparação de antibióticos β-lactam. Ver? por exemplo? Mattingly? P»G„j 1981? 46? 1557 e Milier? M»J»? et al» 7026» São conhecidos vários métodos B-hidroxi-a-aminoácidos? contudo? a sais desvantagens. Estas c on t r olo sste r eoquími c o exigência de agentes auxiliares quirais? ou produção? mente., dos isómeros treo (ou sin)»

η x 1 λ e r ? H»J»	» J» Org„ Chem
J» Am = Chem«	Soc« 1980 ? 10
químicos de	preparação de
maioria apresenta uma ou
ausência de	generalidade?

incluem a deficiente? principalOs processos enzimáticos apresentam algumas vantagens óbvias rslativamente aos processos químicos» Por exemplo? são realizados em sistemas aquosos sob condições suaves? sendo frequentemente estereoselsctivos» A enzima utilizada no processo do invento é conhecida? de um modo geral? como uma a1do1ase. Uma dessas aldolases é a hidroximetiltransf-srase de serina (HMTS) ? L» Adv» Enzymol. Relat. Areas Mol» Biol» 1982? 53? 83 e Schirch? L»§ Sross? T» Biol» Chem» 1968» 245? 56-51» Os papéis biológicos naturais das aldolases envolvem a transferência de unidades de um átomo de carbono para ou da serina e -a dissociação retroaldol de β—hidroxi—a—aminoácidos tais como treoniria e a 1 p~t r eonina para dar origem a um aldeído e glicina»

As aldolases existem em olantas? bactérias e -animais.

por exemplo? rebentos de milho? rebentos ds feijão mung¹ fígado de coelho» 0 processo deste invento compreende a utilização de HMTS para preparar? sob condições suaves?

preparar ?

precursores (5-h id rax i -aaminoác idos proporciona em muitos ísQffiÈncs L-eritro pus

de antibióticos ^-lactam, casos ο β—hidroxi aminoácído na. forma é a forma desejada do precursosr propor0 processo cionando a forma diastereomérica correcta do antibióticc

-lactam.

invento proporciona um processo enzimático para a preparação de β-hidroxi-a-aminoácidos que compreende a incubaçãonum meio,aquoso a um valor de pH entre cerca de 7 s cerca ds Q e a uma temperatura entre cerca, de 3©°C e cerca de 55°C de glicina e de um aldeído alifático, por ex» acetaldeído ou butanal ou de um aldeído aromático, por ex. 2-furfural, com hidroximetiltransferase de serina CHMTS5. Por exemplo, um éster de semialdeído suceínico é convertido no processo em mono éster de ácido β-hidro>; i—cí—aminoadí pico „ _;..

U processo aqui apresentado para a (5-hidroxi-P-aminoácidos representados pela fórmula 1 sreparação de

compreende a mistura num meio aquoso a um valor de pH entre cerca de 5,,5 e cerca de 9 de glicina e de um aldeído RCHO na presença de hidroximetiltransferase de serina e 5'—fosfato de piridoxal. Lí processo é levado a cabo a uma temperatura entre cerca de 3€?^C‘C e cei- ca qs e de preferencia & cerca, de ί*7**Ό.ϊ

As proporções relativas de glicina e do aldeído RCHO podem variar % todavia, os maiores rendimentos de produto parecem ser obtidos quando se utilizam quantidades equimolares. A

quantidade de enzima utilizada depende do grau ds purificação da enzima e do efeito que quaisquer impurezas presentes possam ter sobre a actividade enzimática.

pH do meio de reacção é tamponado a um valor entre 5,5 s cerca de 9 e, com a maioria dos substratos, de preferência a um valor de pH entre 7,0 e cerca, de 8,8, Os tampões fosfato são adequados para se obter a gama de valores de pH desejada.

Como acontece com outras reacções enzimáticas, cofactores podem influenciar a especifícidade relativamente ao substrato da. enzima, bem como a. eficiência da enzima na. catálise da. reacção de um dado substrato. Um cofactor essencial para a hidroximetiltransferase de serina no processo é o 5'-fosfato de piridoxal. Outros factores para além de FPL que podem ser adicionados tê'm um efeito benéfico sobre o rendimento do produto obtido com alpuns substratos.·, Por exemplo, o ácido tetrahidrofálico intensifica a actividade da enzima na. conversão do substrato piruvaldeído. iambêm o metavanadato de sódio serve como cofactor par a conversão do mesmo aldeído.

A fórmula í_ atrás referida, apresenta, os β-hidroxi-a-ami noãcidos proporcionados pelo processo na forma de sal interno. Esta forma sal ê a quela que é esperada com o valor de pH do processo? todavia, a forma não-iónica representada pela fórmula.

OH

I h₂n-ch-ch-r

I

COOH pode também existir sob outras condições.

aldeído, RCHO, utilizado no processo, pode ser um alquil — , alqueml — ou alquinilaldeído cie cadeia linear ou

ramificada ou um aldeído aromático ou heterocíclico. 0 aldeído pode apresentar grupos substituintes;,· por exemplo, alcoxi tal como metoxi ou etoxi, carboxí esterificado tal como ésteres C₁~C^ alquílicos do grupo carboxí? ciano? hidroxi? hidroxi acilado tal comc formiloxi, acetoxi, propionoxi, ou butiloxi, halogénio tal como flúor ou cloro? haloalquilo tal como trifluorometilo ou clorometilo; ou o aldeído alifático pode conter grupos oxo por exn RCHO pode ser um cetoaldeído tal como 4—oxopentanal ou piruvaldeído e outros- análogos. 0 aldeído aromático ou aldeído heterocíclico pode igualmente estar substituído no anel aromático ou heterocíclico ou em qualquer sua. porção alquilo ou alquenilo. São exemplos de alquil-, alquenil- e alquinilaldeídos RCHO que podem ser usados no processo acetaldeído, propionaldeído, bufcíraldeído, valeraldeído, éster metílico de semiaideído succínico, éster benzílico de semiladeído succínico, 4-hidroxi-valeraldsido, éster metílico de semiaideído qlutárico, piruvaldeído, O-formil“4-hidroxiva1era1deído, 3 - f 1uorova1era1deído, 5-c1orovaleraldeído, 2-claropropionaldsído, propargilaldeído, e aldeídos de alquenos representados pelas fórmulas

0

HC-CH=CH-R’, H-C-CH₂-CH₂-CH=CH-R’ t-m que R'é hidrogénio ou C.-C„ alquilo tal como acroleína, crotonaldeído s 4~pentenal.

São exemplos de aldeídos- aromáticos e heterocíclicos RCHO para utilização no processo benzaldeído, tolualdeído, ani saldei do, veratr i 1 aldeído, f en i 1 acetaldeído, -3—f en i 1 propional— deído, 2-fenilpropionaldeído, furfural, 2~<2~furil)acetaldeído,

3-furilacroleína, 3-fenilacroleína, 2-tiofenoaldeído, 3-<2-tie3-<metoxifenilJacroleína, e aldeídos aromáticos nilIscrolsius, análogos.

X

Nd processa da invento, R ds fórmula 1 é de preferência C.<~C. alquenilo, C^-C, alquinilo, ou C.-C, alquilo substituído com carboxi esterifiçado, C^-C^ alcanoxiloxí, ou um grupo Cj-C_A alquilo substituído com arilalcoxi. Na acepçSo em que é aqui usado, o termo C«-C.. alquenilo diz respeito a cadeias hitírocarbonefco insaturadas de estrutura linear ou ramificada tai como etenilo, propenilo, butenilo, alquimia rstsrs se a grupos

C.--C, penteniio e nexeniio; etinilo, propinilOj, butinilo, pentinilo e hexiniloque podem ter estrutura ramificada, alquilo substituido com carboxi esterifiçado refere-se a 'ί ’-'ώ grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada substituídos com um grupo carboxi esterificado em que o qrupo éster έ C,-C, alquilo, i ‘r fenilo, benzilo, benzilo substituído tal como p-metoxibenzi Io, meti 1 benzilo, p-nitrobenzilo, difeniImeti1? protectores de carboxi convencionais.

ou outros grupos óao exemplos de caxs grupos etoxicarbonilmetilo, 2-Cmstoxícarbonilíetiio, 3-Ct-butiloxicarbonil >propilo, 3~<benziloxicarhonil > butilo, • C 4-me t ox i ben ziloxicarbonilíhexilo, e grupos alquilo análogos substituídos com grupos carboxi esterifiçados, 0 termo C^-C, alquilo substituído com Cj-C^ alcoxi refere-se a metoximetilo, 2-etoxietilo, 4-t-butiloxibutilo, 3-isopropoxi pen t i1o, 2-etoxieti1o, 4-1-buti1oxibutilo, 3-isopropoxipentilo, 2-etoxihexilo s outros grupos análogos?

alquilo substituído com flúor ou cloro refere-se a grupos tais como 2-fluoroetilo, 2-cloroetilo, 4-cIorobutiIo, 5-cloropentilo, clorometilo, fluorometilo, 3-cloro-4-metilpentilo s outros grupos análogos? Cj-C& alquilo substituído com ciano refere—se a cianometilo, 2—cianoetilo, 4—cianobutilo, 3—cianobutilo, 5—ciano— hexilo e outros grupos análogos? C---C, alquilo substituído com hidroxi refere—se a hidroximetilo, 2-nidroximetilo, 4-hidroxibutilo, 3—hidroxipropilo, 3—hidroxibexilo, e outros qrupos análogos? ^ci^cè alquilo substituído com C^-C^ alcanoiloxi refere-se a grupos tais como 2-acetoxietilo, 2-formiloxietilo, 3-acetoxipropilo, 4—propionoxibuti lo e outros grupos análogos? e C,— C..

<3

alquilo substituído com arilalcoxi refere-se a benziloximetilo_: d i f en i 1 aietoK i me t i 1 o , 4-ben z i 1 o x i bu tilo, 2- ( 4-me to x i ben z i 1 o~ xiletilo, 3-difenilmetoxipropilo, e outros grupos análogos.

Os aldeídos especialmente preferidos para utilização nc processo são representados por RCHO em que R é um alquenoaldeído

HC-CH2CH2“CH=CH-R como atrás foi definido, ou C,-C „ alquilo substituído com um qrupo carboxi esteriricado ou I ^λγ um grupo Cj-C^ aloanoiloxi» São exemplos de tais grupos 2-Cmetoxicarbonil)etilo, 2-íbenziloxicarboni1)etilo, 3~íetoxicarbonil)~ propi1o, 2-C formi1oxi)eti1o e 2-acetoxieti1o»

Os aldeídos, RCHO, usados no processo são todos compostos conhecidos disponíveis no mercado ou que podem ser preparados por métodos convencionais:

processo preferido do invento compreende a utilização do aldeído RCHO em que R é 2—(carboxi es ter i f i c ad o) e t i 1 o, 2-cianoe tilo, 2-C car box i bsteri f i c ado ) etinilo, 2~ícarfaox:L esterifiçado)vinilo, 3-ícarboxi esterif içado) propilo, 2-formiloxistilo, 2-acetoximetilo, 3~formiloxipropilo, ou 3—acetoxipropilo, en» que a fracção éster do grupo carboxi esterificado é C^-C^ alquilo, por ex» metilo, etilo ou t-butilo§ fenilo, benzilo, difenilmetilo, tritilo ou benzilo substituído por ex.» 4— metoxihenzilo ou 4—nitrobenzilo» Um aldeído especialmente preferido para utilização no invento é um éster de semialdeído succínxco» Um outro aldeído especialmente preferido é um éster de ssmxaldeido qlutarxco» diagrama que se segue ilustra a reacção que tem lugar no processo deste invento» tí

RCHQ + WH^CH^COOH > R~CH í OH)-CH C NH^. ’ > COO em que R é tal coma atrás foi definido.

Tal como atrás se descreveu., a hidroximeti1transferase de serina pode ser obtida a. partir de unia variedade de fontes» Trás dessas fontes são figado ds coelho (LaVerne Schirch e Merle Mason, J» Biol» Chem», Vol, 237, N2 8, Agosto 1962), rebentos de milho (Masuda, T,, et al», Agric» Biol» Chem» 19665®, 2763) e rebentos de feijão “mung (Rao, D»N = e Rao, N.A.., Plant Physiol»

QQO i.D -ί 1

X ι £ 5-/ / tj X J. ? tt

No Quadro 1 a seguir é apresentada uma. lista de substratos aldeído representativos que foram convertidos no processo em fi-hidroxi-cí—aminoácidos com HMTS de duas origens» A conversão dos substratos do Quadro 1 foi levada a cabo incubando o substrato e glicina com HMTS sob as condições do processo» Uma série de condições do processo usadas eram comum a todos os substratos e são especificadas nos parágrafos que se seguem.. As excepções, quando existiram, estão indicadas em cada caso»

As incubações foram realizadas em tampão fosfato 1® mM, pH 7,3 contendo 5'-fosfato de piridoxal a uma concentração ds cerca de 8® μΜ» Todas as soluções foram preparadas a partir de água destilada e desionisada para obtenção dos melhores rssuiatdos» As conversões foram realizadas a 37°C em frascos selados de polipropileno próprios para microcentrifugadora de 50® μΐ num banho de água, de temperatura, constante us τraseos taram prol yidos da luz excepto quando foram removidos do banho de água para remoção da.s partes alá quotas para análise» Com todas as conversões foi realizada uma incubação em branco paralelamenta à incubação tíe HMTS» 0 volume total da mistura de incubação era tipicamente de 2®® μΐ» As condições na incubação em branco pçêía da ausência eram idênticas às da misturai de incubação» à © da. enzima»

QtlfiDRQ 1

Su bs t r a tos a I deí do C RCHQ) para. HMTS

Aldeído CRCHO) R = _ . 1 tnsima.

Fígado ds Coelho

Kebentos de Mi 1 ho

1/

-ch3	4·
-ch2ch2ch3	+
~ch2ch3	ND
-ch2ch2co2ch3	+
-CH2CH2CO2(CH3)2	+
-co2h	-
-ch2 ch2 ch2 co2 ch3	+
-C(O)CH3 2	+
-ch2ch2ch2ocho	+
c6h5	+
-ch2och2c6hs	ND
2-furilo	+
2-( 2-furilo)etilo	+

+

ND +

+

ND +

+

ND +

+ conversãos

- conversão nao detectávsl? MD = não determinada.

Com fígado de coelho estava presente HMTS VQ_ e com milho estava, presente tetrahidrofolato de HffTS processo pode ser seguido relativamente a produção de

partes aliquotas d-a análise das amostras β-hidroxi-a-aminoácido mediante remoção de mistura de incubação de tempos a tempos e por meio de separação por CLEP e detecção de fluorescãncis ds isoindoles derivados de o~ftalaldeído de todos os compostos de aminas primárias presentes na mistura. 0 procedimento experimental é descrito por Janes, B.N.? Gilligan, J.P., J, Chroni. 1985, 266, 4711 Jones, B,W» et al., J. Liq. Chrom» 19814,565, e Simons, Jr=, S. S, et al., J. Am. Chem. Soe. 1976, 98 análise por CLEP tanto da mistura de incubação como d-a ^!!em branco” permitiu a determinação de qual ou quais piooCs) no cromatograma podiam ser atribuídos a produtos enzimáticos.

incubação proces aldeído a uma solu cofactor ε depois Alternativamente, solução ds enzima so do invento é ção ramponaa-a cie mi s turando uma a solução tampona são misturadas e

É também possível adicionar a solução de enzima aldeído s glicina na presença da solução tampão levado a cabo adicionando o glicina contendo FLP s outro solução tamponada da enzima, da de glicina contendo FLP e a. o aldeído è depois adicionado.

a uma solução contendo FLP.

do

Não é necessário que o aldeído, RCHO, mente dissolvido para se dar a sua conversão aldeídos que são apenas parcialmente solúveis no aquoso também servem de substrato ρ-ara a enzima.

esteja no proce meio de completasse . Os reacção processo a1deido a1ifático í i = função aldeído está s o diastereómero L—er Todavia, quando o sub ligado ao carbonilo aromático) o produto do invento em que o aldeído,, RCHO, ê um e. o carbono ligado ao grupo carbonilo da aturado, CH.-,) proporciona preferencialmente itro do B-hidroxi-a-aminoácido ou éster, strato aldeído é aromático Ci.e. c? carbono da função aldeído faz parte de um sistema é obtido em ambas as formas treo e eritro em

quantidades aproximadamente iguais» For exemplo» o benzaldeído

Tor ma ‘•anto o isómero treo como o eritro de B-fenilserina.

São exemplos de p-hidroxi-a-aminoácidos obtidos no processo do invento |3fenilserina_s 13-C 2—f uri 1) serina, ácido β-hid rox i-a-antinoadí pico, ácido B-hidroxi-a-aminobexanóico, ácido β-hidroxi-a-amino-S—formiloxihexanóico.. ácido β—hidroxi-a-amino-Γ -Qxovalérico, ácido β-hidroxi-a-am.ino-T-fenilbutírico, ácido β-hidroxi-a-sminoheptanóico» ácido β-hidroxi-a-amino-rC2-furil >-psntanóico, e aminoácidos análogos»

Numa forma da realização preferida do processo..

um éster de semialdeído succínico tal como um éster C.-C„ alquílico por ex. o éster metílico ou o éster isopropílico é incubado com glicina e HMTS em tampão fosfato na presença de FLP a fim ds dar origem ao semiéster de ácido β-hidroxi-a-aminoadípico sob a forma do isómero L-eritro» Numa outra forma de realização preferida do processo.

um éster de semialdeído glutáricc, por ex o éster metílico., è incubado com HMTS a fim de proporcionar o semiéster de ácido β-hidroxi-s-aminopimélico»

As duas formas ds realização do invento atrás referidí são ilustradas pelo esquema de reacçâo seguinte»

II

RiOC-(CH₂)_cho + H₂NCH₂C00H

II

OH NH₂

RiOC-(CH₂)_n-CH-CH-COOH em que R₄ é C alquilo, fenilo, benzilo». difenilmetilo.

4-metoxibenzilo ou 4-nitrobenzilo e n é 2 ou 3..

«,

Este invento proporcione ainda Ο 'áminoácido, ácido β-hidroxi-s-aminoadípico, os seus sais e ésteres mono- e di-R^ representados pela fórmula RjOOC-CH₇~CH₇“CH(OH)CHíNH^)COORj’ , em que R^ é tal como foi atrás definido e R^' é hidrogénio ou R» , Este aminoácido é obtida no processo na forma L-eritro. Os sais do seu diácido ou monoéster podem formar-se por métodos convencionais» Esses sais incluem os sais de metais alcalinos tais como sais de sódio e potássio, os sais de metais alcalino-terrosos tal como o sal de cálcio» e os sais de amónio e sais tíe amina tais como aqueles que se formam com benzilamina, dibenzilamina? ciclohexil amina, diciclobexi lamina, C»-C., alquilaminas primárias

J.

e secundárias tais como metilamina, etilamina, dietilamina, dí-Cn-butillamina, etanolamina, dietanolamina, dipropanolamina, e sais análogos» Esses sais são úteis no isolamento e purificação do diácido ou de um seu monoéster e aminoácido estáveis para armazenamento» proporcionam lormas qq Também são proporcionados os sais de adição de ácido formados com o aminoácido e os seus ésteres» Tais sais são formados com ácidos que são mais fortes do que os grupos ácido carboxilico acídicos do aminoácido,» São exemplos de tais ácidos os ácidos clorídrico, bromidríco, fosfórico e sulfúrico, e os ácidos sulfónicos tais como ácido toiuenossulfónico, ácido naftalenossulfónico, ácido mstanossulfónico e ácido n-butanossulfónico»

Os seus ésteres R^ em que R^ tem os mesmos siqn para os esquemas de reacção» ésteres monometílico, monoetí lico, e di—t—butílico, benzíl dizem respeito aos mono- e diésteres ificados que foram atrás referidos São exemplos desses ésteres es seus lico, dimetilico, dietílico, t-butíico, 4—metoxibenzí1ico e dibenzílico

Os j3-hidroxi-a-aminoácidos proporcionados deste invento são compostos intermédios úteis para compostos β—lactam» Os produtos são convertidos pelo processo i m po rtan tes por métodos

conhecidos em compostos β-lactam qus são '0-3' i-ir £Ο*Γ3ι_άΟ LH,-.;

antibióticos conhecidos.» Por exemplo, os são convertidos em derivados hidroxamato para formar compostos β-Iactam 3-amino-4

R-’n.i d ro κ i-s-am i noác idos e estes são ciclizados •-substituidos» como se mostra no esquema de reacção seguinte

OH

I

H₃N_CH—CH—R₂ I c-o~

0* r₁onh₂

OH

I

H₂N— CH—CH— R I

C —MH —·0R₂

em que R tem os mesmos significados que foram atrás definidos para a fórmula 1 e R.__t é um grupo alquilo, alcanoilo ou aralquilo» A formação do hidroxamato e a ciclisação do hidroxamato para dar origem ao composto β—lactam são levadas- a cabo pelo método ficcfcs. Chem» Res» 1986, 19, 49;

. Tetrahedron Lett., 1987, 28, 6257, u = Tetrahedron Lett», 1987, 28, 1861,

descrito por	i’	Li 11 e r,	M,J
Rajendra, B»		Miller,	M«
e Ko1asa, T»	e	Miller,	M,

podem

Alternativamente» os β-hidroxi—a—aminoácidos podem ser convertidos em N-ímetil substituído) azetidinonas como é descrito por Miller, K„ u», Patente dos E.U.A, NS 4,595,532» Além disso, e adicionalmente, os aminoácidos do processo .podem ser convertidos nas N-Cfosfonometil) E.U.A, NS

azstxdinonas 4 _v 820 . 8 í 5..

:as por

As preparações e exemplos que se seguem descrevem adicionalmente o processo do invento., não devendo de modo algum ser entendidos como constituindo uma limitação.

Preparação de- Hidroximetiltransferase de Ser ina a partir de Rebentos de Milho

Fodos os procedimentos a seguir descritos foram reali· zadc

4’'C

Rebentos ds milho com dias lavados foram

13.800 x g durante 40 í@ mM_? pH 7,8₃ contendo mM. A solução foi homogeneizados num misturador Waring em monohidrogenofosfato de potássio 100 mM contendo etilenodiaminatetraacetato dissódico ÍEDTft) 1 mKj, ditiotrsitol 1 mH e 5'-fosfato de piridoxal Í25 μΜ. A mistura continha aproximadamente 960 g de rebentos por litro. 0 homogenado foi filtrado através de pano queijeíro e o filtrado foi submetido a um processo de precipitação com sulfata amónio. A proteína que precipitou com sulfato de amónio após centrifugação a minutos foi dissolvida em tampão fosfato 5’-fosfata de piridoxal Í25 μΜ e EDTA submetida a diãlise s concentrada para 5-15 mg de proteína/ml na mesma solução tampão sem a presença de EDTA. 0 teste de presença de actividade de aldols.se da proteína consistiu 'num sistema, acoplado entre o retroaldol catalisado por aldolase de L-alo-treo nina com a redução NADH C forma reduzida de dinucle-ótido de nicotinamida e adeninaí-dependente do acetaldeído resultante por desidrogena.se de álcool de levedura CftDH). A actividade específica tmns o valor médio de /8 miIiunidades/mg de proteína. Lima unidade de actividade enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para provocar a variação do valor da densidade óptica em uma unidade Ca 340 nm) por minutos à temperatura

•5 *·* » i-J ambiente na presença de ADH, L-alo-treonina 1.2® mM₅ FLP 125 μΜ_? e NADH 120 μΜ em tampão fosfato 100 mi% pH 7_Ρ5 =

AHMTS quando não usada uma vez preparada foi guardada quer sob forma iiofilizada ou congelada oom glicerol a 10%.

Nos exemplos que se seguem_? e salvo indicação em contrário,, o sistema tampão era constituído por fosfato de potássio 10 mM_s pH 7_P3_P e continha 5'-fosfato de piridoxal (FLP) a uma concentração de cerca de 30 μΜ. Todas as soluções foram preparadas em água destilada e dssionizada.

As incubações com a enzima foram levadas a cabo a 37°C ens frascos selados de poiipropileno próprios para microcentriíugadoras de 500 μ!_? num banho de água de temperatura constante.

exemplos podem t>s tempos variar 1igei ramen te de retenção indicados nos de tempos a tempos nas análises por CLEP devido a ligeiras variações em factores como a coluna_? o equilíbrio. as soluções tampão, etc.

A HMTS utilizada nos exemplos que se seguem foi obtida h (atrás referido)« a partir de Tíqsoo ob coeino_? por L. hem

Exemplo 1 f reparaçao de irBunine

Uma. solução de glicina (34 mM) foi preparada no tampão fosfato contendo FLP_? e adicionou-se acetaldeído recentemente destilado em quantzdade suficiente para que a sua. concentração tosse também 34 mM. Quando adicionados a solução ds enzima, a concentração de cada substrato sra de 17 míi

X

X. ' b Uma solução ds HMTS (Omg) em 20® μΐ do tampão fosfato padrão foi colocada hum frasco ds vidro ds 2 ml» Adicionou-ss igual volume da solução de substrato e o frasco foi selado ds borracha e fio de cobre para minimizar a perda ds

COi» Uffl SSpuD acetaldeído»

Este frasco e uma sedução de enzima ^!‘em branco foram incubadas a 3,-^f,U«

Partes alíquotas ζ10 μΐ) foram removidas através de uma •seringa microlit.ro de 5®μ1 ao fim dos seguintes tempos de incubaçãos 1_?®_? 2,®, 3_S0» 4,® e 2®,5 horas e analisadas por meio de CL.EP» cromatograma revelou o maior pico para, o isómero L-eritro ao valor de tempo de retenção de 21,9 minutos e um pico menor para o isómero treo» A identidade dos aminoácidos produzidos foi confirmada por co-injecção com isómeros de treonina autênticas disponíveis no mercado»

Exemplo 2

A c i d o a-siBi η o-15- hidro x icapróic o

Uma solução de substrato foi preparada dissolvendo glicina (25,5 mg, ®,34® mmol) e n-butanal (25,3 mg, 0,351 mmol) em 10 ml do tampão fosfato padrão, proporcionando concentrações de 34 mM e 35 mM dos dois substratos-, respectivamente» mg) em i®® μΐ de polipropileno de ®,5 ml

Uma solução ds HMítí (®,í tampão foi colocada num frasco de Uutros ί®® μ.1 de solução tampão sem enzima foram colocados noutro frasco, e adicionaram-se a cada frasco 1®® μ.1 da solução de substrato„ olução v-·

' _ *ι.ύ V

Foram retiradas partes aliquotas das' soluções de ensim 'em branco ao fim dos sequintes tempos de incubacãos 1,0

2b e 21 horas, que foram analisadas por meio de CLEP.

Observaram-se dois picos de produto no cromatograma, um grande aos 25=-,7 minutos e um pequeno aos 24,3 minutos. Os picos correspondiam aos de produto racémico autêntico» 0 material autêntico foi preparado racemicamente mediante uma reacção de aldol sobre um complexo de cobre de glicina.» S» Akabari et al», Archives od Biochefflistry and Biophysics, 195?, 83, 1, e J. P»

Greenstein e M. Winítz, Chemistry of Amino Acids· (Química. Aminoácidos), John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1961, Vol» 3. 2249-2250» <3 OS

PP

Exemplo éster monometílico de ácido cc-amino-B-hidroxiadípico

Glicina <13,3

IlfQ ,, mmol) e éster metílico de

Xu-*sem i a 1 de í d o succ ί n i c o (20 mg, 0,172 imo 1)

5,0 ml de solução tampão para proporcionar concentrações de cada ds 35 mM e 34 mM, respectivamente» 0 aldeído usado nesta experiência estava isento de DMSO, embora incubações prévia com este aldeído contivessem ainda a. impureza (resíduo resultante da sua síntese por ozon61i.se de CH₇=CH~CH_n—CH^-CDD—CH_? seguida por processamento com dimetilsulfóxido).

foram dissolvidos em

A uma solução de HMTS (0,1 mq) em 100 μ1 de solução tampão adicionaram—se 100 μΐ da mistura de substrato. Foram retiradas partes aliquotas ao fim dos s-equintes períodos de incubação? 0»5, 1„0, .X n ‘-5* Sf ;4 horas.

pico de produto maior CL-erit.ro) foi observado a u<n valor de t

minutos atingindo o seu máximo ás duas horas

Durante as duas horas iniciais, surgiu na análise por CLEP um pequena pico novo cons um tempo de retenção de aproximadamente 8 minutos. Durante um período de 24 horas este pico aumentou de intensidade enquanto os picos correspondentes à glicina de partida e ao produto intermédio éster metílico de ácido a-amino-fê-hidroxiadípica diminuíam» Passadas 24 horas» a proporção entre o novo pico e os ds glicina e do éster era de 38s47s15« A estrutura do composto que correspondia so novo pico foi determinada, como sendo ácido L-eritro-a-amino-|5-hidroKiadipico CR = CH^-CH^-CQ^H) por uma síntese Independente e co-injecção do produto autêntico com aquele que foi produzido enzimaticamente. A síntese química do material autêntico foi realizada por meio de condensação de aldol do éster metílico de semialdeído succínico com um enolato de boro de uma oxazina quiral (Reno, D» S»s Lote, B» T«? Miller» ΙΊ» J« Tetrahsdron Lett,., 1990 * 51« 827)» seguida, de desprotseção e hidrólise para dar origem ao composto descrito»

A formação deste aminoácido de origem durante a síntese enzimática dá---se por hidrólise do éster inonometí lico do amínoácido Inicialmente produzido» Uma vez qus o produto possui um grupo ácido carboxilico ionizado adicional não constitui um substrato para a condensação de aldol enzimaticamente reversível» Assim» o novo produto aminoácido (ácido L-erifcro-a-amino-fl-hidroxiadípico) acumula—se» Enquanto produto aminoácido ácido dicarboxí lico., pode ser purificado a partir da mistura de reacção por meio de cromatografia de permuta iónica CSreensteirs» J« p«₅ Winitz» M», “Cbemistry of tbe Amino Acids’¹' (Química dos Aminoácidos) Vol. 2» pp 1452-í46ô₅ Uliley» Nova Iorque»

M = V,. 1961) «

Exemplo 4

éster mono-isopropílico de ácido s-~amíno-f3-hidroxiadípií-O

Slicina (26,1 mg₅ 0_?348 mmol) foi dissolvido em t®_s® ml de solução tampão e adicionaram-se 34 mg de éster isopropílico de ssmialdeído succínico (contendo DMSO como contaminante proveniente da sua preparação) . A presença de DMSO na. incubação não tem quaisquer efeitos nocivos sobre a enzima ou a reacção» A concentração de aldeído na solução tampão₅ depois de levada em linha de conta a. presença de DMSO, era de 18 mmolar. As concentrações iniciais ds glicina e aldeído na mistura de incubação eram de 17,4 mM e 9 mM respectívamente.

A mistura de substrato (100 μΐ) foi adicionada a uma solução de HMTS Í®₉1 mg) em Í0S μΐ de solução tampão e à preparação em branco”„

Partes alíquotas foram recolhid-a períodos de incubação: ®_?5₅ í₅@₅ 2_?0_? 4 ^:im dos seguintes

17, ? fl rf-.-uí n horas e examinadas por meio de CLEP» 0 pico de produto principal (L-eritro) apareceu a um valor de T_ de 23 minutos, ao fim de k

horas e cresceu até um máximo no espaço ds 2-4 horas»

Exemplo 5 éster raanuÍitetí 1 ico de ácido u-amino-β—hidroxipimélico □ ester metilico de semialdeído qlutárico usado nesta incubação continha DMSO numa proporção ds cerca ds Isí em peso» O DMSO é um produto secundário da preparação do -aldeído por osonólise de í-metoxiciclopsnteno que inclui DMSO no i etrahedron processamento? (Cline? D, L» 0=?

Leti ipse,

v¹'

Russel, C»

1399)= A solução de substrato foi preparada mediante dissolução de glicina (25,6 mg? 0,341 mmol) ε d-a mistura aldeído/DMSO (&6?7 mg) em 10 ?0 ml de solução tampão para proporcionar concentrações de glicina. e aldeído de 34?! e aproximadamente 25 mM»

A solução de enzima consistia em 0,1 de HMTS dissolvida. em 40 u], de solução tampão sm vez de ui. A solução de substrato (40 μΐ> foi adicionada às soluções de enzima e em branco e alíquotas 0,5? 1,0?

incubada do modo usual. Foram recolhidas partes (10 μΐ) ao fim dos seguintes períodos de incubaçãos 1?5? 2?0? 3,0, 4,0 s 17,õ horas, Passadas 0,5 horas surgiu na CLEP um pico produzido pela enzima a 23,7 minutos correspondente ao produto desejado e intergrantío um rendimento de cerca de 202» Um segundo pico mais pequeno induzido pela enzima apareceu com um tempo de retenção de 22?3 minutos? podendo corresponder a uma quantidade ínfima do isómsro treo.

t-xsinplo &

Ac i d o <x~ am i n o—fi- h i d r ox i—Γοχ ον a 1 é r i c ο

Glicina (25,5 mg? 0,0340 mmol) e piruvaldeítío (61?l mg de uma solução a 402 em peso, 0,327 mmol ds pxruvaldeido) foram dissolvidos em 10 ml ds solução tampão ? pH 7?2? para proporcionar concentrações de 34 mM (glicina) e 32,7 mM (pxruvaldeido) na solução stack. Adicionou-se metavanadato ds sódio (1,5 mg decomposto puro a 902 de Aldrich), Passados 30 minutos tinha—se dissolvido? proporcionando u.ma concentração ds 1,11 mM, á solução de enzima Co?í mg ds HMTS sm 80 μΐ) adicionaram-se 80μ1 da solução de substrato, Parte aliquotas í10 μΐ)

- ί ί ( ·' foram removidas ao fim dos seguintes períodos de incubação! 9,5, _;9, 5, noraí

A análise de aminoácidos por meio de CLEp indicou um tempo ds retenção de 8,5 minutos para o novo aminoácido» Para confirmar que se tratava do aminoácido desejado, preparou—se material racémico autêntico pelo procedimento de glicianato de cobre» Assim» 4,23 g de glicianato de cobre (II) (20 mmol) foram dissolvidos em 10 ml ds solução aquosa de KOH 9M„ Adicionou-se piruvaldeído (16,2 ml de uma sedução a 40% em peso em água, correspondendo a 7,0 g, 9,71 mmol de aldeído),, Passadas 5,25 horas, adicionou-se ΝΗ,,ΟΗ 3M (40 ml) a solução castanha resultante e os solventes foram evaporados para proporcionar um óleo castanho» 0 óleo foi passado através ds uma coluna de Dowex-50 (forma com eluição com água para proporcionar o aminoácido sem i pur i f i c ad o„

Exemplo 7

Ac ido a-amino-fê-hidrox i-6~ formi1ox i haxanóico aldeído nesta incubação retinha ainda uma quantidade significativa de DMSO da sua preparação por meio de ozonólise de di—hidropirano seguida por processamento com DMSO» A 10,o ml de solução tampão adicionaram-se 4-hidroxibutanal de O-formilo (39,5 mg, cerca de '9,20 mmol, tendo em conta mg, 0,340 mo1)»

A solução de =ubstrato (40 pl) foi adicionada à solução de enzima í0,l mg de HMTS em 49 μΐ) e à solução em branco» As concentrações dos dois subtratos na mistura de incubação eram de 17 mM (glicina) e 10 mri (aldeído). Partes alíquotas (10 μΐ) mM (aldeído)

' s $ Ii \ foram recolhidas- ao fim dos seguintes períodos de incubaçãos 'ί. ο..0!} 7,3 e 24 hufsSi

A análise de aminoácidos da primeira parte alíquota revelou dois novos aminoácidos» Um pequeno pico surgiu aos 15,6 minutos, logo após o pico da glicina» 0 outro era um pico grande e acentuada, aos 22,5 minutos» ãs três horas, o pico aos 22,5 minutos correspondente ao aminoácido esperado atingiu um máximo a cerca de 10% do pico de glicina e depois decresceu lentamente, enquanto o pico aos 15,6 minutos aumentou ligeiramente de intensidade» 0 aminoácido que ss elui aos 15,6- minutos é o produto da hidrólise lenta do éster formato no meio de reacção» A estrutura corresponde ao ácido «-amino—β—hidroxi—6~hidroxihexanóico«

Exemplo 8 β—Fenilseri na

A solução tampão utilizada continha FLP numa concentração de 160 μΜ em vez de 83 μΜ» Destilou-se benzaldeído imediata mente antes da sua utilização» A solução tampão foi desoxigenada fazendo borbulhar nela azoto antes ds adicionar os substratos» Isto foi feito para minimizar a possibilidade do benzaldeído ser oxidado enquanto em solução»

C25,4 mg, solução (133 μΐ) mg de enzima)» seg ui n tes período

Em 13,3 ml de solução tampão dissolveram—se glicir 3,2.38 mmol) e benzaldeído (35 μΐ, '3,344 mmol 1» Es foi adicionada a 100

Partes alíquotas for ds xncuoaçáos ϊ,3, o»25 e />,& horas.

μΐ da solução de HMTtí (3 ~sm recolhidas ao fim dt

Eram visíveis nos cromatogramas dois oicos de oroduto.

o maior -aos 24,8 minutos e o mais pequeno ao-í minute

X . χ ίζ-V ·' mistura de produtos desta experiência foi comparada com a β-fenil· serina autêntica, racémica, disponível no mercado. Os picos das duas misturas coincidiam exactamente. Além disso, quando comparado por meio de co-injecção com treo B~fenilserina autêntica, o primeira pica (mais pequeno) era intensificado relativamente ao fnais tareio, os pares de

Estes resultados indicam que a enzima produz ambos enantiómeros dos aminoácidos aromáticos. embora favoreça os isomeros entro.

Exemplo 9

Acido u-amino-R.-hidroxi-p-Cz-f uril) propiónico

2-furfural usado neste exemplo foi preparado por meio de duas destilações sobre carbonato, de sódio com a. segunda destilação sob uma atmosfera ds azoto. Q aldeído destilado foi guardado, antes da sua utilização, exsicado, sob uma atmosfera de azoto e protegido da luz.

ft solução de substrato foi preparada por dissolução de glicina <14,£J mg, 0,186 mmol) e furaldeido (15,5 μΐ, 0,187 mmol) em solução tampão (10,0 ml). Quando 36© μΐ desta solução foram* adicionados à solução de enzima (0.2 mg de HMTS em 40 μΐ), a concentração de cada substrato passou a ser de Í7 mM.

Partes alíquotas (10 μΐ) foram recolhidas ao fim eguintes períodos de incubação·; 1,0, 2,0, 4,0, 5,0, 18, 24 o Tim de í hora, a análise por meio de dos

CL.C.P pico maior que revelou a produção de dois novos aminoácidos. 0 corresponde a um isómero tinha um período de retenção de 21-22 minutos, enquanto o pico mais pequeno (< SÔ5Í do pico maior) correspondia ao outro isómero (treo) e tinha um tempo de retenção de 19—2© minutos.

ÃC X LfU

imino—$-hidroxi-5- C 2-f uri 1 ) va 1 érico

A solução ds sufo glicina (25,5 mg» 0,34© mmol) em i®,© .ml de solução tampão» de quinze minutos a dissolver trato foi preparada dissolvendo e o aldeído (46,3 mg, 0,373 mmol) aldeído (um líquido) levou cerca

A solução ds substrato CIO® ul) adicionada solução de enzima (0,1 mg de HMTS em 100 μΐ ds incubada a 3z’^:'C = partes alíquotas foram reco seguintes períodos ds incubaçãos 0,55, 1,0, 2, solução tampão) e Ihidas ao fim dos 0, 4,25, 8,0 e 21 reve1ava um pi c o ando uma conversão horas» Ao fim de 0,5 horas a análise por CLEP com um tempo de retenção de 21,3 minutos, irsdic em cerca de 3Z de glicina no produto aldol» xemp.

Obtém--se ácido x—amino—ji—hidroxi he j—enóico seguindo os procedimentos da incubação descritos nos exemplos com aldeído propargílico» anteriores

c. xemp a o

Obtém-se ácido s—amino—β—hidroxihex—5—enóico com aldeído allílico sob as condições ds incubação descritas nos exemp1os an teriores»

b.XSiii lo 13

Obtém· âciao

ν· ·' α-affli no-β-hidroxi-pen t-4~snóico c om acroleína seguindo os procedimentos e sob a nas exemplos anteriores condicSe

SC r*i ffiS

Produz—ss ácido a—amino—j as condições dos exemplos anteriores •hidroxicaiR fl-ci δ ^:™ í a i t ο γ ΰΛ 1 e í* -L C í~‘t ~· O anopropionaldeído.

Claims (2)

REIVINDICASSES iâ. Processo para a preparação de um hid r ox i-ci-ami noácitío de fórmuli em que R é substituído cloro? aromo, ou benziloxi? «-C, alquenilo; C.-?~C, alquinilo? ciano, bxdroxx, Ί “4 ienxlo? ou iurilu?
1. '1 **!«.· j

   Ί ^4

   -alcanoiloxi, fenilo.

   alquilo í 1 u u r o .. furilo?

   c aracter i zado cerca de 3u °C entre cerca de em que R tem hidroximsti1tr por compreender a mistura? a uma temperatura entre e cerca de 55'-'C? numa solução aquosa com um pH 5?5 e cerca de 9? de um aldeído de fórmula RCHD? os significados atrás definidos? e glicina com ansferase de serina na presença de 5'-fosfato de piridoxal„ terizado por R alquilo substi ou alquilo sub

   Processo ds acordo com a Reivindicação 1 caracser C.-.--C, alquenilo, C^-C, alquinilo, ou C.~C, xo ^{1 ?} z & - lo uído com carboxi esterxfiçado? C.—C» alcanoiloxi, X *r tituido com arilalcoxx»
2. 2/ .X <3ã, t e r i z a d o po r

   Processa ds acordo com a ReivUnd'icação 1, caracser ou C, ;_Λ alquiíi su bs t i t u í d o c om c a r bo x esterifiçado, ou L-, -C, alcanoiloxi .aa.

   Processo de acordo com a Reivindicação ί, caracterizado por o aldeído RLHO ser

   IJ u

   R» OC-ÍCí-U >_CHO, i Ζ. ΐ I em que R» ê alquilo, benzilo, difenilme lo ou 4-nitrobenzilos e n é 2 ou 3» etilo,

   -me tox i oen zi02 r. terizado por o succínico»

   Processo ds acordo com a aldeído RCHD ser éster

   Wxivxnaicação 4, caracmetílico de semialdeídc òã» - Processo de acordo com a Reivindicação terizado por o aldeído RCHO ser éster qlutárico.

   mM t.x 13.co de semi a1dexdu

   7ã» - Processo de acordo com a Reivindicação í terizado por R ser alquilo substituido com carboxi ficado, alcanoiloxi, fenilo, furilo ou benziloxi.

   Cctr’S.C~ esteríSS, — Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o a-amino-fS-bidroxiácido ser o diastereómero L-eritro»