PT97939B - Processo de deteccao de uma sequencia nucleotidica de um pedaco simples que a contem ou susceptivel de a conter de acordo com a tecnica de hibridacao em camadas - Google Patents

Processo de deteccao de uma sequencia nucleotidica de um pedaco simples que a contem ou susceptivel de a conter de acordo com a tecnica de hibridacao em camadas Download PDF

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Description

presente invento tem por objecto um processo de detecçSo de uma sequência nucleótidica simples pendente de uma amostra que a contém ou susceptívei de a conter, de acordo com a técnica de hibridação em camadas. Este processo é aplicável, nomeadamente, ao diagnóstico das doenças infecciosas ou genética^ bem como à tipagem celular.
Sabe-se que uma das propriedades características dos ácidos nucleicos é a possibilicade de interagir com uma sequência complementar por intermédio de ligações hidrogénio e de formar assim um híbrido estável de acordo com as leis de emparelhamento A-T e G-C.
Um ácido nucleico pode portanto-ser utilizado como sonda para pôr em evidência, numa amostra, uma sequência nucleica (chamada alvo) contendo uma sequência complementar da da sonda. . A marcação do híbrido formado pelo alvo e a sonda, permite a detecção e a quantificação do alvo na amostra. Esta técnica foi utilizada por SOUTHERN E.M. para a análise de fragmentos de ADN após .separação por electroferese em gel: J. Mol. Biol.
98.5C3-(1975)
Uma modificação desta técnica, que apresenta nomeadamente a vantagem de não necessitar de purificação da amostra que contém o alvo, consiste em utilizar um protocolo dito em camadas. Uma ppimeira sonda nucleótidica (sonda de captura) fixada sobre ura suporte sólido, serve para captar o gene ou o fragmento de gene a^detectar na amostra. Uma segunda sonda (sonda de detecção), complementar de uma outra região do alvo, permite a detecçSo por intermédio de um marcador, oomo seja um marcador radioactivo ; ver por exemplo DUNN A.R. E HASSEL
J. A., Cell, 12, 23, (1977); RANKI Μ. E AL., Gene, 21, 77 (19&3); PALVA A. et al., FEMS Microbiol Lett. 23, 83 (1984); POLSKY-CYNKIN R. et al., Clin. Chem. 31, 1438
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Ref: 11T0 DCT-DC/TP Série 12 ι
(1985).
método de hibridação em camadas pode ser realizado juntando-se numa só etapa a amostra a analisar e a sonda de detecção, num contentor onde se encontra a sonda de captura fixada ao suporte. Tratasse nesse caso do método de hibridação em camadas dito simultâneo; ver por exemplo os artigos de RANKI E AL. , palva e al., POLSKY-CYNKIN e al., já referidos.
A técnica de hibridação em camadas pode, igualmente ser efectuada em duas etapas; ver por exemplo LANGDALE J.A. e al., Gene 36 201 (1985) e ZOLG J.
W. E AL., Mol. Biochem. Parasitol. 22, 145 (1987).
Para permitir a utilização destas técnicas de hibridação em ensaios de rotina, é necessário él±minar-se a marcação rrãdioactiva da sonda de detecção. Com essa finalidade foram propostos diversos sistemas que se serviam, por exemplo, de um hapteno reconhecido por um anticorpo, ou por uma proteína afim. Propuseram-se, em especial , diversos métodos de marcação do ADN ou ARN por meio da biotina ou dos seus derivados; ver nomeadamente os pedidos de patente europeia 0285057, 0285058, 0286898 e 0097373; FORSTER e al,, Nucleic Acid Res. 13, 745 (1985); CHOLLET A. e KAWASHIMA Ε. Η., Nucleic Acid Res. 13, 1529 (1985); CHIN B. C. e al., Nucleic Acid Res.11, 6513 (1983); COCUZZA A. J. , Tetrahedron Lett. 30, 6287 (1989). Não obstante, os sitemas de detecção que utilizam métodos de marcação não radioactiva são ainda deficientes em termos de sensibilidade; ver por exemplo ZOLG e al., artigo referido.
Por outro lado , o diagnÓ3tico das doenças genéticas, a tipagem celular e mesmo, nalguns casos, a identificação de vírus mutantes, necessitam da detecção de mutações pontuais no genoma. Em tais casos, o aperfeiçoamento de sondas de captura suficientemeijte sen2
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Serie 12
3ivei3 para detectar uma mutação pontual na regiSo ..do alvo complementar da sequência da sonda de captura, é difícil. Os sistemas de sondas comercializados actualmente para realizar este tipo de detecção são pouco práticos pois cada sistema comercial deve ser executado a uma determinada temperatura, que varia com o sistema utilizado, o. que impede que se façam determinações variadas operando-se em aparelhos automáticos que trabalhem a uma temperatura única.
presente invento tem por objecto um processo de detecção de sequências nucleicas, de acordo com a técnica de hibridação em camadas, tendo umaasensíbilidade suficiente para permitir a utilização de uma sonda de detecção.. não radioactiva. Isso torna-se possível graças à utilização de sondas de captura de comprimento muito pequeno que se verificou que conferem ao ensaiocem camadas uma grande especificidade, conservando ao mesmo tempo uma boa sensibilidade e que permitem detectar e diferenciar sequências homólogas com uma aproximação de cerca de um nucleótico. A utilização de oligonucleótidos de pequeno tamanho, facilita a construção de sondas em;., grande quantidade, com um rendimento aceitável e permite dispor de um grande leque de selectividades, Isso é particularmente útil no caso da tipagem HLA onde as mutações que definem o tipo.celular estão localizadas sobre porções curtas do gene.
Além disso, verificou-se que é possível realizar-se a adsorção passiva directa, sobre um suporte polímero como o polistireno, de sondas oligo-nucleotídicas de tamanho muito curto (até um mínimo de 11 nucleótidos), bem como a fixação passiva de sondas ainda mais curtas (até um mínimo de 9 nucleótidos) por intermédio de uma proteína a que a sonda está ligada de forma covalente. Trata-se de um resultado surpreendente uma vez que, até ao presente, utilizavara-se geralmente, como sondas de captura,
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT
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Mod. 71 -20.000 e*. * 90/08 sequências que comportavam mais de 100 basés (geralmente diversas centenas de bases) e também por que as sequências oligo-nucleotídicas (dT)^ não se fixam de forma passiva (quer dizer, por adsorção) no polistireno; ver LACY M. J. e VOSS E. W., J. of Immunol. Methods, 116, 87-98 (1989). Outros autores procuraram favorecer a fixação da sonda de captura saturando o suporte de polistireno com poli (dT)^QQQ e acoplando a sonda de captura, que comporta diversas dezenas de bases, a uma fila de poli(dA) que tem de 30 a mais de 100 motivos; ver MORRISSEY D. V. E COLLINS M. L. Mollecular and Gellular Probes, 3, 189—207 (1989). De acordo com a experiência do requerente, a saturação do suporte sólido com poli(dT) não melhora a detecção.
Além disso, graças à utilização de sondas de pequeno tamanho que buscam uma sensibilidade acrescida, o processo de acordo com o invento-permite escolher à vontade uma temperatura de trabalho pré-determinada e construir, em cada caso, sondas de comprimentoo adaptado para poderem efectuar as determinações dos. alvos mais diversos a uma mesma temperatura de trabalho pré-determinada. Concebe-se finalmente a simplificação do processo e as possibilidades de automatização que daí resultam.
presente invento tem, portanto,, como objecto, um processo de detecção de uma sequência nucleòtídica simples pendente de uma amostra que a contém ou é susceptivel de a conter, de acordo com a técnica de hibridação em camadas com uma sonda de captura fixada de forma passiva sobre .um suporte sólido e uma sonda de detecção marcada com um marcador não radioactivo, sendo as sondas de captura e dez. detecção capazes de hibridação, respectivamente, com duas regiões não sobrepostas da sequência nucleotídica alvo procurada, caracterizado pelo facto de a sonda de captura, que contém 9 a 30 nucleótidos, nomeadamente de 9 a 25 nucleótidos e em particular 9 a 20
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Ref: 11 TO DCT-DC/PT Serie 12
nucleótidos, estar fixada de forma passiva sobre o referido suporte sólido que é realizado em material hidrófobo.
Dado que a sonda de captura contém pelo menos 11 nucleótidos, e geralmente possível fixá-la de forma nao específica (quer dizer, por adsorção) sobre o suporte, realizado geralmente em polímero hidrófobo como o poliestireno ou um copolímero à base de estireno, nomeadamente um copolímero de butadieno-estireno ou anái_logo. Entre os copolímeros de estireno citar-seiab os que contém pelo menos 10% em peso de motivos estireno e em particular os que contêm pelo menos 30% em peso, de motivos estireno.
material que constitui o suporte sólido utilizado de acordo com o invento pode, além disso, ser constituído por uma mistura de polistireno e/ou de copolímero de estireno (especialmentee-butadie.nò-esfeiren^ítqomrqiníput-^o aBQlíraeroz qua .-permita ;· nomeadamente, melhorar as propriedades do suporte sólido (propriedades mecânicas, transparência, etc... 0 referido outro polímero é, por exemplo, um polipropileno, um policarbonato ou análogo. A mistura de um polímero estireno-acrilonitrilo, estireno-metacrilato de metilo, um polímeros que constituaa o suporte sólido contém portanto pelo menos 10% em peso e de preferência pelo menos 30% em peso, de motivos estireno. Pode-se utilizar como suporte sólido, um suporte cónico comercializado por VITEK (USA) e realizado oom o material copolímero butadieno-estireno tal como o que é vendido sob a denominação comercial K-Resin.
É igualmente possível, e quando a sonda de captura é muito curta (em particular com menos de 11 nucleótidos), torna-se mesmo necessário, incluirem-se meios para melhorar a fixação da sonda de captura ao suporte sólido. Conforme anteriormente indicado pode-se por exemplo, ligar a sonda de captura, de forma covalente, de acordo com métodos conhecidos em si, a uma proteí5
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12 na que se fixa, ela própria, de forma' passiva, ao suporte (realizado com os materiais já referidos). Bem enten✓ dido, a protéina que favorece a fixação da sonda de captura não deve interferir com a deteQção: por exemplo, quando a sonda de detecção é marcada por uma enzima, a pros teina fixada ao suporte solido não deve ter actividade enzimática interferente. Entre as proteínas que se podem utilizar para a fixação passiva indirecta da sonda de captura sobre o suporte, podem eitar-se a albumina de um mamífero (por exemplo a albumina bovina) ou uma toxina proteica bacteriana como seja a toxina tetânica. De preferência escolher-se-á uia proteína e/ou um método de junção que permita fixar uma ou duas moléculas da sonda de captura por molécula de proteína.
A junçãô' entre o oligo-nucleótido e a proteína pode ser realizada, por exemplo, por intermédio de um braço alquileno com 3 a 12 átomos de carbono,que pode ser acrescentado à extremidade 5' do oligo-nucleótido que constitui a sonda de captura, aquando da síntese automática. Esse braço tem uma função amina primária que, após activação, graças a um agente de junção homobifuncional como, o DITC(fenileno-1,4-diisotiocianato), o DSS(dissuccinimidil suberato) ou o DIBS (ácido 4,4'-diisotiociano estilbeno 2,2'-dissulfónico), permite o enxerto sobre, as funções NH2 trazidas pelas lisinas da albumina. 0 conjugado é purificado por meio de cromatografia líquida de alto rendimento sobre coluna de troca de iões. Verificou-se que a fixação passiva da sonda de captura por intermédio de uma proteína, conforme indicado acima, é muito vantajosa, nomeadamente porque fornece resultados <: que apresentam um grau elevado de reproductibilidade.
A sonda de detecção pode ser, ela própria, uma sonda curta, contendo de 9 a 30 nucleótidos.
Em todo o caso, para se assegurar a especialidade desejada,
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Ref: 11ΊΌ DCT/PT
Serie 12 ·
a sonda de detecção contém, de preferência, pelo menos 15 nucleõtidos, por exemplo de 15 a 30 nucleõtidos, quando a sonda de captura é muito curta e contém, em particular, menos de 15 nucleõtidos. A sonda de detecção é ligada de forma covalente a um marcador não radioactivo, por exemplo uma enzima. A ligação covalente é efectuada de acordo com métodos conhecidos, em particular pelo método descrito acima para a ligação entre.-o oligonucleõtido que constitui a sonda de captura e uma proteína. Pode-e utilizar como marcador enzimático, nomeadamente, uma peroxidase tal como a peroxidase de rábano, uma fosfatase a3rtí_a3?i/ia?, vurrtaijsqs-.b-a-sse ácida·,- -a, be,taqalac-tosida.se -a ajnicose oxidase etc.
.· . O -. . : - . . .·. ZA ·„ J \ .
Evidentemente que, para se construírem as sondas de captura e de detecção, é necessário conhecer-se a sequência ou uma parte da sequência do alvo, ou conhecer a sequência ou uma parte da sequência da proteína codificada pelo alvo. Pode-se então sintetizar os oligonucleótidos que constituem as sondas, com um aparelho de síntese automática de ADN tal como os modelos 380 e 381 comercializados por APPLIED BIOSYSTEMS.
As sondas de captura e/ou detecção podem ser constituídas por ADN ou ARN.
Além disso, as sondas utilizadas de acordo com a invenção podem conter ou ser constituídas por alfa-nucleótidos análogos dos nucleõtidos naturais; ver nomeadamente a patente francesa 2.607.507- Os alfa-nucleótidos podem ser obtidos em sintetizadores automáticos. São deriváveis nas extremidades 3' ou 5' e ligam-se às proteínas da mesma maneira que os beta-oligo-nucleótidos. Apresentam a vantagem de uma boa estabilidade em face de nucleases (ver THUONG N. T. e al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 84.5129 (1987). Os conjugados alfa-oligonucleótido-enzimas são mais estáLveis em solução que os análogos beta e permitem conservações mais longas em diluições mais fracas.
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Ref: 11T0 DCT/PT
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.0 ácidoC nucleico a detectar .
(alvo) pode ser o ADN de cadeia dupla, o ADN de cadeia simples , um híbrido ADN-ARN ou o ARN (ribossomático ou memsageiro). Bem entendido que, no caso de um alvo nucleico de cadeia dupla ou de um híbrido ADN-ARN, convém proceder à sua desnaturação antes de se iniciar o- processo de deteção pela técnica de hibridação em camadas. 0 ADN de cadeia dupla pode ser ele próprio obtido após extracção,de acordo com os métodos conhecidos, dos ácidos nucleicos de uma amostra a examinar. Esta extracção pode ser feita por proteólise de células seguida de uma extracção com fenol-clorofórmio (ver por exemplo MANIATIS e Col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), ou mais directamente por tratamento alcalino em presença de detergente e/ou por tratamento com ultra-sons , ou por qualquer outro processo que liberte ácidos nucleicos em fase líquida. A amostra a tratar pode conter uma mistura de células, bactérias, leveduras, vírus ou outros microorganismos. 0 ADN de cadeia dupla assim obtido pode ser utilizado directamente, após desnaturação de acordo com técnicas conhecidas , ou pode ser utilizada com matriz para amplificação de ácidos nucleicos, a fim de obter quantidades suficientes para permitir a detecção .
Para obter a forma de cadeia simples a partir de um híbrido ARN-ADN ou de um ADN de cadeia dc-. r-plsa , pode operar-se por desnaturação física, química ou enzimática. Um dos métodos físicos de desnaturação corresponde à separação das duas cadeias, aquecendo-se o híbrido até que ele seja totalmente desnaturado, por exemplo a uma temperatura de 80 a 105°Cdu,i'aTit.;e'-en.-crÃltal’gun3cSeguhdos'- éilarlguns minutos. 0 método químico de desnaturação consiste, por exemplo, em pôr em contacto a amostra de cadeia dupla com uma solução 0,2M de hidróxido de sódio durante 10 minutos , sendo este tratamento seguido de uma neutralização
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Ref: 11T0 DCT/PT
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por ácido acético à mesma concentração (0,2M), até à obtenção de um pH situado entre 6 e 8. Um método enzimático de desnaturação consiste na utilização de unahelicase. As técnicas de utilização das helicases são descritas, nomeadamente, por RADDING, Ann. Rev. Genetics, 16, 405-437 (1982). Outras enzimas com a mesma função são utilizáveis com a mesma finalidade.
processo da invenção é, de preferência, efectuado de acordo com o método simultâneo.
Este método compreende:
- a fixação passiva da sonda deccaptura oligojnucleotídica sobre o suporte sólido, directamente ou por intermédio de uma proteína, conforme indicado anteriormente; opera-se por colocação em contacto do suporte com uma solução aquosa que contém a sonda;
- enxaguamento do suporte e secagem eventual para a sua conservação;
a colocação em contacto simultâneo do suporte assim obtido com uma solução que contém a amostra a analisar e com uma solução que contem a sonda de detecção oligonucleotídica marcada, podendo a amostra e a sonda de detecção ser juntas sob a forma de mistura ou separadamente ;
- a incubação da mistura obtida;
- o enxaguamento do suporte para eliminar os constituintes não fixados sobre o suporte por hibridação ;
- e a detecção qualitativa ou quantitativa com ajuda de uma reacção de revelação do marcador fixado sobre o suporte, por exemplo por colorimetria, fluo rescência ou luminescência.
Vai mostrar-se a seguir uma forma
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Ref: 11T0 DCT/PT Série 12
de realização.particular , não limitativa, de execução do processo da invenção.
1. Fixação da sonda de captura
Λ fixação da sonda de eçptura é obtida depositando-se por exemplo 100/Ul em cada um dos poços de uma placa de micro-titulação de uma solução que contém de 0,1 /ug/ml a' 10/Ug/ml de oligonucleótidos, de preferência 1 /ug/ml, sob a forma de uma solução num tampão PBS 3X (0,45 M NaCl, 0,15 M fosfato de sódio, pH 7,0).
Deixa-se a placa em contacto com a solução de sondas de captura durante pelo menos 2 horas a 37°C, depois lava-se com uma solução de PBS IX (NaCl 150 mM, tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, contendo 0,5% de Tween 20).
2. Incubação simultânea das amostras e da sonda de detecção marcada
As amostras (alvo) são colocadas sobre a placa após terem sido submetidas, se necessário, a tratamento de desnaturação; sob a forma de uma solução no tampão PBS 3X contendo o ADN heterólogo, por exemplo ADN do esperma de salmão a 10 /ug/ml.
A sonda marcachsé'diluída no tampãb precedente a uma concentração de 20 a 100/ug/ml. Depositam-se 50 /ul desta solução no poço que contem o alvo.
A placa de micro-titulação é então incubada durante um tempo que pode variar, por exemplo, entre 30 e 120 minutos à temperatura escolhida, por exemplo 37°C ou durante menos tempo se for necessária uma sensibilidade fraca.
3· Lavagem
Efectua-se, por exemplo, a lavagem com tampão PBS 1X contendo 0,5% Tween 20 (Merk 8? 21 84).
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Ref: 11T0 DCT/PT
Série 12
11. JUÍÍ.Í39I
4. ' Revelação enzimática
A revelação é efectuada com o substrato correspondente à enzima utilizada. Por exemplo, põde-se juntar ortofenileno diamina (OPD) no caso de o marcador ser a peroxidase de rábano selvagem, paranitrofenilfosfato (PNPP) ou metil-5 umbeliferil fosfato (MUP), no caso de o marcador ser fosfatase alcalina.
tempo de revelação do substrato está geralmente compreendido entre 1 e 30 minutos, após o que a reacção é parada por meio da adição de NaOH 1N no caso da fosfatase alcalina, ou Η230^ 1N no caso da peroxidase de rábano.
Efectua-se a leitura num leitor de microplacas, a 405 nm para o PNPP, a 492 nm para, o OPD e /
em fluorescência para o MUP (excitação 340 nm, emissão 460 nm).
Debruçemo-nos a seguir sobre os estados de incubação e de lavagem consecutivos, que constituem as etapas chave do processo de hidridação em camadas. Estas operações de incubação e de lavagem são, cada uma delas, efectuadas a uma temperatura constante compreendida entre 20 e 60°C e de preferência entre 25 e 40°C. Uma das vantagens essenciais da utilização de sondas curtas é permitir a realização de ensaios em camadas para a detecção de alvos diferentes operando, para essas diversas determinações, a uma temperatura única pré-determinada que será, de preferência, 37°C, uma vez que todos os laboratórios de análises estão equipados com aparelhos com termostatos regulados para essa temperatura..
, Sabe-sé que .os .h3±»Ei.dQsíá3e..;ADN têm uma temperatura de dissociação que depende do número de bases hibridadas (aumentando a temperatura com o tamanho do híbrido) e que depende igualmente da natureza das bases hi11
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Série 12
bridadas e, para cada base hibriduda, da natureza das bases adjacentes.
A dissociação dos híbridos produz-se ao longo de um intervalo de alguns °C e pode ser facilmente determinada em espectroscopia UV: com efeito, a densidade óptica do híbrido é inferior à das sequências de cadeia simples correspondentes. É portanto possível determinar-se para cada caso, uma temperatura de semi-dissociação característica do híbrido estudado.
r O .çonhercimento da entropia e da entalpia da reacção permite aliás calcular (lei de VanfHoff) a temperatura de semi-dissociação de um dado híbrido,em condições normalizadas (por exemplo,utnaísolução de salinidade correspondente a NaCl 1M) em função da concentração total de ácido nucleíco na solução; ver por exemplo, Breslauer K. J. e al. , PNAS, 83, 3476 ( 1986);
RYCHLIK W. E RHOADS R. E., Nucl. Acid. Res. 17, 8543 (1989); e FREIER S. m. E AL., PNAS 83, 9373, 1986.
Na prática é sempre possível determinar experimentalmente a temperatura de semi-dissociação do híbrido formado por uma determinada sonda com o alvo de sequência, complementar, por meio de simples experiências de rotina.
A temperatura de hibridação do protocolo em camadas (temperatura de incubação e/ou temperatura de lavagem) deverá evidentemente ser escolhida abaixo da temperatura de semi-dissociação, sem que o alvo não se hibridaria com a sonda de captura e/ou de detecção e os resultados do ensaio seriam erróneos.
Deve entender-se que as presentes considerações acerca da temperatura de semi-dissociação relativas ao híbrido menos estável (quer dizer, o que tenha a temperatura de semi-dissociação mais baixa) dos dois
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Ref; 11 TO DCT-DC/TP Série 12 ιι.Λ / híbridos que forma o alvo com, por um lado a sonda de cap tura e pelo outro a sonda de detecção. Com efeito, para o protocolo em camadas poder funcionar correctamente, é evidentemente necessário, no caso de se procular um resultado positivo, que esses dois híbridos sejam estáveis à temperatura a que ôÇ>era.
Uma mutação pontual que arraste um mau emparelhamento centrado sobre um única par de bases no híbrido, leva a uma modificação, geralmente um abaixamento, da temperatura de semi-dissociação.
Uma vantagem essencial que resultaida utilização de sondas curtas é que um tal mau esparelhamen to único pode arrastar um abaixamento relativamente impor tante da temperatura de semi-dissociação , da ordem de 2 a 4°C. Não é esse o caso com as sondas longas, onde um tal mau emparelhamento único não arrasta senão uma varia ção muito fraca da temperatura de semi-dissociação.
Verificou-se agora que é possível tirar vantagens da utilização de sondas curtas para efectuar determinação de acordo com o protocolo em camadas a uma temperatura única pré-determinada, por exemplo 37°C conforme indicado acima.
No que se segue, vai-se dissertar a título de exemplo sobre o caso, geralmente preferido, onde é a sonda de captura que dá, com o alvo procurado, um híbrido menos estável que o híbrido alvo-sonda de detec ção. Mas é evidente que também se pbde adoptar um sistema onde, inversamente, é o híbrido sonda de detecção-alvo que é o menos estável (é então suficiente substituir, no que se segue, a expressão sonda de capturapor sonda que dá, com o alvo, o híbrido menos estável para se adaptar a discussão ao caso mais geral).
Deve-se evidentemente operar com uma sonda de captura (c uma sonda de deteoção) suficientemen13
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te longa para que a temperatura de seml-dissoeiaçao seja superior à temperatura esoelhida. Se se desejar realizar um ensaio muito sensível (em particular um ensaio sensível a uma só mutação), é conveniente utilizar-se uma sonda de captura (e/ou uma sonda de detecção) ajustada, quer dizer, de comprimento suficientemente curto e de sequência tal qiue a temperatura de semi-dissociação não seja senão muito pouco superior à temperatura de hidridação pré-determinada, sendo a diferença entre as duas temperaturas de, por exemplo, 1 a 3°C, porque é conveniente trabalhar então à temperatura máxima admissível, para evitar as hibridações não-específicas que seriam possíveis adoptando-se uma temperatura muito baixa relativamente à temperatura de dissociação do híbrido perfeitamente complementar. Com efeito, a diferença de temperaturas admissível, pode ser determinada para cada casoçpor meio de simples experiências de rotina.
No caso que acaba de ser indicado, à temperatura de hibridação fixada, apenas um alvo perfeitamente homólogo da sonda de captura ficará fixado na sonda, enquanto que um alvo que comporta uma mutação pontual na região complementar da sonda não será fixado.
Na discussão precedente, pôs-se sobretudo em evidência a escolha de uma sonda de captura que é adaptada à temperatura de hibridação eácolhida principalmente por ajustamentos do tamanho da sonda. Mas é bem evidente para os especialistas que é possível jogar-se igualmente com a escolha da sequência da sonda, uma vez que a temperatura de semi-dissociação pode variar em função da natureza das bases implicadas na formação do híbrido. É igualmente possível jogar-se com as condições de hibridação e em particular com a concentração salina da incubação e/ou da solução utilizada para a lavagem consecutiva à incubação. Sabe-se, com efeito, que o aumento da concentração salina arrasta consigo um aumento da tem14
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1UIO9I peratura de semi-dissociaçâo.
Na execução pratica do processo da invenção, quando se utiliza uma sonda de captura e/ou condições de hibridação adaptadas à temperatura pré-determinada escolhida, poderá operar-se de duas maneiras.
De acordo com um primeiro modo de execução, efectua-se a etapa de incubação à referida temperatura e efectua-se a lavagem à referida temperatura ou a uma temperatura inferior. Esta forma de execução tornau-Se possível porque à temperatura a que se opera apenas um alvo perfeitamente homólogo da sonda de captura se poude hibridar, de maneira que não há o risco de fixação de um alvo não perfeitamente homólogo, mesmo qúe se efectue a lavagem a uma temperatura inferior à temperatura de incubação.
De acordo com um segundo modo de execução, efectua-se a etapa de incubação a uma temperatura inferior à referida temperatura .pré-determinada e executa-se a lavagem à referida temperatura pré-determinada.
Com efeito, nesse caso, é a temperatura de lavagem que será descriminativa e qualquer híbrido eventualmente formado, à temperatura de incubação, entre a sonda de' caprtura e um alvo não perfeitamente homólogo, não será estável à temperatura de lavagem e não ficará portanto fixado ao suporte.
Para a detecçãoode uma mutação pontual, pode-se operar de duas formas diferentes:
- ou a sonda de captura contem a mutação complementar da mutação procurada, oaso em que só o alvo transformado se hibridirá nas condições do ensaio de hibridação;
- ou a sonda de captura é perfeitamente homóloga da sequência complementar do alvo não tnu15
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tado, caso em que só os alvos não mutados se hibridirão.
processo de acordo com a invenção é aplicável, nomeadamente:
na detecção de ADN ou do ARN men sageiro dos vírus, ou do ARN dos retrovirus;
na determinação do ADN, do ARN mensageiro ou ribossomático e dos híbridos ΑϋΝθ-ARN das bac. térias , dos parasitas e das leveduras;
e na determinação do ADN dos~ver_ tebrados e em particular no homem, para se efectuar a tipagem HLA ou para se detectarem doenças genéticas (miopatia diabetes, mucoviscidose, etc...).
Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem no entanto a limitarem.
Nestes exemplos representaram-se as sequências nucleótidas, de acordo com â^ccnvenção usual, com a extremidade 5' à esquerda.
A invenção tem igualmente por objecto a utilização das sondas descritas nos exemplos para a detecção do alvo indicado. Deve entender-se que as sondas mencioandas nos exemplos devem ser consideradas como sequências mínimas que podem ser alongadas (dentro dos limites indicados de 30, 25 ou 20 nucleótidos no máximo) por adjunção de nucleótidos suplementares que são, bem entendido, escolhidos para que a sonda seja homóloga do alvo cuja sequência é aqui suposta como conhecida. As sondas mencionadas nos exemplos como satisfatórias, permitem .todas operar-se a 37°C.
Nos exemplos para os quais se fornecem duas sequências para a sonda de captura (ou para a sonda de detecção), isso significa que se pode utilizar uma das sondas ou as duas sondas. A utilização de duas
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Serie 12 sondas de captura e/çu de dua3 3onda3 de detecção, permite aumentar o sinal quando os resultados não., são satisfatórios com uma só sonda.
As indicações referentes às figuras 1 e 2 anexas são dadas respectivamente nos exemplos 10 e
15.
EXEMPLO 1
Preparação do braço fosforamidite para a adição de um braço NH2 em 5’ de um oligonucleótido.
21,0 g (0,2 mole) de amino-5 pentanol-1 (Aldriche 12304-8) são dissolvidos em 90 ml de THF e juntam-se 5,3 g de'
NagCOg. A mistura é arrefecida até -5°C e adicionam-se gota a gota 14 g (0,067 mole) de anidrido trifluoroacético (Aldrich 10623-2) dissolvidos em 50 ml de THF em 1h.
A mistura foi deixada durante 1 hora sob agitação à temperatura ambiente. Após filtração e evaporação do THF, produto é destilado no vazio. A fracção En m = 75-90°C é recolhida e Durificada sobre gel de sílica por meio de uma mistura de CH2CI2,'MeOH 80 :20.
produto desejado tem um Rf de 0,6. 0 rendimento é de 66 %.
0,7 g de amino álcool protegido (3,48 10 mole) são secos com piridina (2x3 ml) com 3 ml de N-etildiisopropilamina (13,92 10 mole) e dissolvidos em 15 ml de CHQC1„, 1,65 g (6,96 10 mole) de cianoetil-2- N,N-diisopropilclorofosforamidite (Aldrich 30230-9) são adicionados sób argon à tem peratura ambiente durante 35 mn. Juntam-se 0,2 ml de MeOH e depois 10 mn 30b agitação, 30 ml dc acetato de etilo.A fase orgânica é lavada a frio com 2 vezes 60 ml de ^2^3 10 %, depois 2 x 80 ml de NaCl saturado, seca sobre Na2S0jj depois evaporada no evaporador rotativo.
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produto bruto é purificado em-'coluna de silício numa mistura de acetato de etilo-CH^Cl^-NEt^ (45-45-10). A fracção recolhida (Rf = 0,75) é con-
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EXEMPLO 2
Preparação de um conjugado oligonucleótido ASB:
oligonucleótido é sintetisado num aparelho automático APPLIED 381A utilizando-se a química das fosforamidites. 0 braço fosforamidite, dissolvido em acetonitrilo anidro com uma concentração de 0,2 molar, é colocado na posição X do sintetisador e a adição do braço faz-se de acordo com o protocolo normal em fim de síntese. Após desprotecção durante uma noite à temperatura de
55°C em NHuOH 33%, precipitação em etanol a -20°C, o oli/ > * gonucleotido é seco sob vazio e retomado em 1 ml de água,
3,1 O- mole de oligonucleótido são secos sob vácuo e retomados em 25 pi de tampão de borato de sódio ο,Ί M pH 9,3Adicionam-se 500 pl de uma solução a 30 mg/ml de DITC (Fluka 78480) em DMF. A mistura é agitada 1 h 30 a temperatura ambiente antes da adição de 3 ml de H.,0. Após extração da solução por meio de butanol (3x3 ml),ac.fase aquosa restante (500 pl) é seca sob vácuo depois retomada por meio de 1,Ί0~mole (6,6 m§) de BSA (Pierce 30444) em 200 pl dettam pão de borato.Após uma noite sob agitação à temperatura ambiente, o conjugado é purificado por troca de iões em CHLP numa coluna de AX300 (BROWNLEE 4,6 x 100 mm) por ura gradiente de NaCl (Quadro 1). 0 pico do conjugado é dialisado contra a água (2x1 litro) concentrado sob vácuo, retomado por meio de 1 ml HgO e armazenado a -20°C.
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12
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EXEMPLO 3
Preparação de um conjugado oligonucleótido peroxidase de rábano.
De acordo com o exemplo 2, o oligonucleótido activado seco sob vãcuo é retomado por _ 7
1,25-10- moele (5 mg de peroxidase de rábano (Boehringer 413470) em 200 jul de tampão de borato.
O prqto.co-£c$ de purificação é idêntico: o conjugado é guardado a -20°C num tampão 50 mM tris HC1 pH 7,0, 40% glicerol.
Os resultados são apresentados no quadro 2.
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT HfMIjlSI
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EXEMPLO 4
Preparação de um conjugado oligonucleótido-fosfatase alcalina .
De acordo com o exemplo 2, o oligo-8 nucleotido activado seco sob vacuo e retomado por 5,7-10 mole (0,8 mg) de fosfatase alcalina (Boehringer 567752) no tampão do fabricante.
protocolo de purificação é idêntico (Quadro 3)· 0 conjugado é armazenado a +4°C num tampão Tris HC1 30 mM, 1M NaCl, 1 mM MgCl2, pH 8,0.
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Série 12
EXEMPLO 5
Detecção de uma sequência de ácido nucleico por protocolo em camadas.
Numa placa de microtitulação em polistireno (Nunc 439454) é colocada uma solução de oligonucleó^ tido 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' a 1 ng/yul (0,15 >uM) em PBS 3X (0,45 M NaCl 0,15 M fosfato de sódio pH 7,0).
A placa é incubada 2 h a 37°C.
Após três lavagens por 300 /il de PBS Tween (0,15M NaCl, 0,05M fosfato de sódio, pH 7,0, PBS Tween 20 (MERK 822184)) 50 71I da sequência (5'-AAGGTCAACC GGAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTGCAATGTTGCCTTA-3') a diferentes concentrações de 100 pg//il (5nM) a 0,01 pg//Ul (0,5 pM) num tampão PBS salmão (PBS3X + ADN de esperma de salmão 10 /ig/ml (Sigma D9156) são juntas nos poços seguidas de 50 /il de uma solução do conjugado oligonucleótido-peroxidase à concentração de 0,1 ng,/il (15 nM) em oligonucleótido num tampão PBS de cavalo (PBS3X + 10% de soro de cavalo (BioMérieux 55842)).
A placa é incubada 1 h a 37°C e lavada por meio de 3 X 300 ul de PBS Tween 100 jil de substrato OPD (orto-fenilenodiamina Cambridge Medicai Biotechnology ref/456) num tampão OPD (0,05 M ácido cítrico, 0,1 M NagHPOjp pH 4,93) à concentração de 4 mg/ml a que se junta extemporaneamente H2C>2 a 30 volumes a 1/1000 por cada poço Após 20 minutos de reacção a actividade enzimática é bloqueada por 100 /il de H2S0^ 1N e a leitura é efectuada em Axia Microreader (BioMérieux) a 492 nm.
Sensibilidade (Quadro 4):
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QUADRO 4
ALVO (pg)
5000 1000 500 100 50 2 0,1 0
Valor D.0. > 2,5 1,007 0,559 0,136 0,067 0,028 0,006 0,005
Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08
D.O. = densidade óptica “17 limite de detecção é de 2 pg de a:vo, ou seja 10 mole.
O sistema é perfeitamente específico pois o oço contém o ADN de salmão, que está sobre a forma de cadeia simples, não é detectado (poço a 0 pg/jul de alvo).
EXEMPLO 6
Conforme foi mostrado para anemia falciforme ou para os oncogenes (em Human Genetic Diseases, A Praticai Approach,
K.E- DAVIES ed, IRL Press, 1986), as mutações pontuais,em posições especificas de um gene, são responsáveis por doenças genéticas e podem ser detectadas por hibridação do ADN genórnioo, com sondas nucleicas. Em certas condições,um mau emparelhamento de uma base pode destabilizar um híbrido ADN-oligonucisitixio Assim, WALLACE R.B. e col.' (Nucl, Acid. Res., 6_, 3543 ( 1979) detecta uma mutação am-3 (A-C para o, genemurfeaiãDdeitexrezeâeÇ.CiQjara o gene normal) no gene ηογ-.Ί) ,;”-ηε do bacteríofago 1X174 por um sistema de hibridação direcfcSo por filtro.
Trabalhos ulteriores mostraram que as mutações não eram equivalentes do ponto de vista da destabilização de um híbrido.
63.590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12 /
Assim, F. ABOUBELA E Col. (Nuc. Acid. Res. J_3, 4811, 1985.) verificam que os maus emparelhamentos que contêm uma Guanina (GT-GG-GA) são menos destabilizadores que os maus emparelhamentos que contém uma Citosina (CA-CC) ou um mau
5. e3parclhamento entre 2 pirimidinas (TT-CC-TC).
S. IKUTA e col. (Nucl. Acid. Res., 1_5, 797, 1987) mostram que os maus aparelhamentos GT, GA são menos estabilizadores que AA, TT, CT; CA.
O exemplo aqui descirióo ^aprésehta'-um-':métOdó'-de'-'detecção ' de umAÂfiN perfeitamente homólogo por um protocolo em camadas a · 37°C. Os oligonucleótidos de captura são fixados passivamente sobre a placa.
Os 5 alvos estão descritos no quadro 515
Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08
63.590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT
Série 12
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63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
As mutações estão situadas na zona 32 a 35 do alvo. Os 4 maus emparelhamentos são de tipo GT(XGT), AA(XAA), TT(XTT) e AG(XAG) e encontram-se dois maus emparelhamentos GT e AG que são os menosçK destabilizantes para um híbrido.
A sonda de detecção D1 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-31, é complementar da região 1-20 do alvo e é comum a todos os alvos. Está marcada na extremidade 5' com peroxidase conforme o exemplo 3·
A especificidade do sistema é. trazida pelos oligonucleotidos de captura (Quadro 6)
63.590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12
ι
QUADRO
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0 o 0 0 CJ O cu
63-590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT
Série 12
Os 5 oligonucleclidcs possuem em 5' um braço C^NH^ para permitir a ligação covalente. sobre a albumina de soro de boi (C15, C13, C12, C11 e C9).
Salvo indicações contrárias, ò protocolo em camadas é idêntico ao descrito no exemplo 5.
alvo e depositado a 10 mole/1 ou se — 8 — ja 20 pg/jul (Quadro 7) ou 10 mole/1 ou seja 200 pg/ul (Quadro 8) .
QUADRO 7
ALVO (1,00E-09 M)
X XGT XAA XTT XAG
C 15 2,390 0,667 0,061 0,137 0,234
Cl 3 0,405 0,030 0,005 0,008 0,018
C12 0,271 0,015 0,003 0,005 0,007
C11 0,100 0,004 0,004 0,005 0,005
C9 0,005 0,004 0,005 0,005 0,005
valor de D.O.ã 492 nm
= 32 =
63’.590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Serie 12
X /
11.MÍ39I
QUADRO 8
... . - ALVO (1 , OOE-Ol M)
X XGT XAA XTT XAG
c 15 >2,5: >2,5. 0,211 0,973 í,3?8
03 2,320 0,198 0,010 0,060 0,081
02 1,500 0,095 0,005 0,028 0,032
O 1 0,610 0,014 0,003 0,014 0,008
C9 0,002 0,004 0,003 0,007 0,003
Valor de D.0. 4Ç2 nm
híbrido formado com o alvo que contém um mau emparelhamento de tipo GT é o menos destabilizado, logo o mais difícil de detectar. 0 rácio sinal X/sinalífXGT sorte portanto servir de referência para se medirem os desempenhos do sistema (Quadro 9):
QUADRO 9
RACIO X/XGT
1,00E-08 1 , 00E-09
C15 - 4
C1 3 12 14
C12 16 18
C11 44 25
C9 -
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12 oligonucleótido de captura C12 permite detectar qualquer maus emparelhamento na sequência de ácido nucleico , conservando para todos os maus emparelhamentos um sinal inferior a 0,100 para as 2 concentrações e um rácio X/XGT 10.
EXEMPLO 7
Método de detecção de um ADN perfeitamente homólogo a 37°C. Os oligonucleótidos de captura estão acoplados ao ASB e fixados passivamente à placa.
protocolo eem camadas é idêntico ao exemplo 5.
Os oligonucleótidos de captura estão acoplados ao ASB conforme exemplo 2.
A sonda de detecção é a mesma que para o exemplo 6.
Os resultados são apresentados nos
Quadros 10, 11 e 12.
QUADRO 10
ALVO (1, 0OE-08 M)
X XGT XAA XTT XAG
C 15 2,5 2,5 0,330 1 ,445 2,139
C13 2,5 0,394 0,025 ; 0,078 0,092
C12 2,319 0,24-1 0,0-16 0,044 0,056
C11 0,763 0,025 0,006 0,007 0,009
C9 0,010 0,007 0,005 0,007 0,006
Valor de D. 0. a 492 nm
- 34 = ι
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
1uW
QUADRO 11
ALVO (1,O0E-09 M)
X XGT XAA XTT XAG
C 15 2,421 1 ,154 0,080 0,200 0,364
Cl 3 0,050 0,075 0,015 0,019 0,024
C12 0,423 0,043 0,007 0,010 0,013
C11 0,134 0,007 0,007 ' 0,006 0,009
09 0,006 0,006 0,007 0,005 0,009
QUADRO 12
RACIO X/XGT
1 , OOE-O8 1,00E-09
2
C 15 -
C1 3 T 6 7
Cl 2 10 10
C11 31 19
C9 - -
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Serie 12 oligonucleótido de captura Cl 1 acop lado ao ASB permite detectar qualquer mau emparelhamento na sequência de ácido nucleico, conservando para todos os maus emparelhamentos um sinal inferior a 0,100 às 2 concentrações e um rácio X/XGT 10.
EXEMPLO 8
Método de detecção de um ADN perfeitamente homólogo a diferentes temperaturas.
protocolo de detecção é o mesmo que para o exemplo 7.
oligonucleótido de captura C11 está ligado ao ASB e fixado passivamente à placa. A coneen- -9 tração do alvo e constante e fixada em 10 molar. A tem peratura de hibridação é variável (Quadro 13).
QUADRO 13
TEMPERATURAS °C X XGT X/XGT
22 0,155 0,007 22
30 0,313 0,024 13
37 0,229 0,009 25
45 0,32.-1 0,013 25
50 0,052 0,010 5
- 36 =
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
EXEMPLO 9
Método de detecção de um perfeitamento homólico a diferentes temperaturas.. .Opr-otocolo de detecção- é o mesmo que para o exemplo '7.
oligonucleótido de captura C13 é fixado passivamente directamente sobre a placa. A concen— 8 tração do alvo é constante e fixada a 10 molar. A temperatura de hibridação é variável (Quadro 14).
QUADRO 14
TEMPERATURA X XGT X/XGT
22 2,5 0,343 7
30 2,028 0,337 6
37 2,281 0,227 10
45 1,458 0,134 1 1
50 0,653 0,017 38
EXEMPLO 10
Detecção específica da sequência ADN ou ARN correspondente ao gene daβ lactamase da E. Coli (Tem).
No caso de a sequência a detectar corresponder ao ARN mensageiro, este é obtido seja a partir de uma purificação específica do ARN (MANIATIS e col.em Molecular Cloning, a laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), seja a partir de uma lise directa das bactérias após aadição de soda (0,2 M final) sobre o depósito bacteriano. 0 sistema de detecção utilizado é complementar da cadeia ARN mensageiro correspondente ao gene Tem.
= 37 -
Este sistema eompôe-se de 2 bligonucleótidos de captura. A adsorção passiva é efectuada a uma concentração total de 0,15 /UM utilizada conforme descrito no exemplo 5.
63-590
Ref: 11 TO DCT_DC/PT Série 12
A detecção é efectuada por meio do utilização de 2 oligonucleotidos marcados pela peroxidase (com a concentração total de 15 rv.M) .
A sequência dos oligonucleotidos utilizados são as seguintes:
CAPTURA 1 = 5'-GCACTGCATAATTCTT-3'
CAPTURA 2 = 5'-TACTGTCATGCCATCC-3'
DETECÇÃO 1 = S^GTTGGCCGCAGTGTTAT-3'
DETECÇÃO 2 = 5’-CACTCATGGTTATGGCA-3'
Detecção em ARN não·amplificado, purificado (Quadro 15):
QUADRO 15
ARN PURIFICADO VALOR D.O.
10 ug ARN específico 0,100
1 ug ARN específico 0,014
10 ug ARN não específico 0,006 ·
= 38 =
Detecção em ARN de colónias nSo purificado (Quadro 16):
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12 i 1.M1S91
QUADRO 16
NÚMERO DE COLÓNIAS Valor D.O.
1,00E+08 colónias específicas 0,150
1,00E+07 colónias específicas 0,045
1 ,00E+06 colónias específicas 0,004
1,00E+05 colónias específicas 0,001
1,00E+08 colónias não específicas 0,001
limite de detecção do sistema no
ARN, sem amplificação, é defug de ARN total purificado e
7 z de 10° - 10 colónias bacterianas.
No caso de a sequência a detectar cor respTxráàeraa ADN não amplificado (plasmido pBR 322, contendo ó gene da β lactamase).
Nesse caso, a dètecção é efectuada directamente no ADN desnaturado segundo condições anteriormente descritas.
sistema de detecção utilizado é o seguinte:
CAPTURA 1 = 5'-GGATGGCATGACAGTA-3'
CAPTURA 2 = 5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-TGCCATAACCATGAGTG-3'
DETECÇÃO 2 = 5’-ATAACACTGCGGCAAC-3 ’
63.byo
Ref: 11 TO DCT-DC/PT Série 12
ι
Os resultados são os seguintes (Quadro 17)i
QUADRO 17
ADN pBR322 Valor D.O.
1 /Ug 0,130
0,1 /Ug 0,012
0,01 jug 0,002
10 ug ADN salmão 0,002
A sensibilidade sobre o ADN não amplificado é de 0,1 ug, ou seja 3,48.10-^ mole correspondente a 2.1010 moléculas verdadeiras.
No caso em que o ADN a detectar corresponde a ADN amplificado por reacção em cadeia utilizando uma polimerase, os oligonucleótidos utilizado para a amplificação são os seguintes:
ISCO 1 = 5’-ATCAGCAATAACCAGC-3'
ISCO 2 = 5’-CCCCGAAGAACGTTTTC-3’
ADN a detectar é desnaturado pelo protocolo anteriormente referido. A detecção faz-se utilizando-se um dos dois sistemas descritos neste exemplo.
A figura 1 mostra os resultados obtidos com, nas abcissas a quantidade do ADN (ng) e em ordenadas a densidade óptica.
A sensibilidade é da ordem de 1 ng
63-590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT Série 12
de ADN obtido após amplificação e considerando-se a quantidade total de ADN gerada após a amplificação da ordem dos 2,0 ug .
Para um fragmento amplificado de 560 pares de bases , o limiar de detenção é portanto da ordem -1 5 9 de 2,94.10 mole ou seja 1,7 10 moléculas verdadeiras .
EXEMPLO 11
Detecção da sequência correspondente ao gene E7 do papilomavírus humano do tipo 6.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as.sequências utilizadas são as seguintes :
Mod. 71 · 20.OCO ex. - 90/08
ISCO 1 = 5’-TACACTGCTGGACAACATGC-3'
ISCO 2 = 51-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado seguinte (detecção de cadeia) pelo sistema
CAPTURA 1 = 5'-CAGTGTACAGAAACA-3'
CAPTURA 2 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3’ DETECÇÃO 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
EXEMPLO 12
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene E7 do popilomavírus humano tipo 11.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado , as sequências utilizadas s5o as seguin41
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
ISCO 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3 '
ISCO 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (Detecção de cadeia).
CAPTURA 1 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3'
CAPTURA 2 = 5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
DETECÇÃO 2 = 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
EXEMPLO 13
Detecção da sequência ADN correspondente aos genes E7 dos pailomavírus humanos tipo 6 e 11.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes :
ISCO 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3'
ISCO 2 = 5 ’-GTGCGCAGATGGGÃ.OA.CAC33Í
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (Detecção de cadeia).
CAPTURA 1 = 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3'
CAPTURA 2 = 5’-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG-3’ '
DETECÇÃO 1 = 5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3'
DETECÇÃO 2 = 51-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
EXEMPLO 14
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene E7 do
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12 \ / papilomavírus humanos tipo 16. '
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1 = 5'-CCCAGCTGTAATCATGCATGGAGA-3'
ISCO 2 = 5’-GTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCA-31
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (Detecção de cadeia).
CAPTURA 1 - 5'TATATGTTAGATTTGCAACC-3'
CAPTURA 2 = 5’-GACAACTGATCTCTAC-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3’
DETECÇÃO 2 = 5’-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3'
EXEMPLO 15
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene E7 do papilomavírus humano tipo 18.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1=5' -CGACAGGAACGACTCCAACG-3'
ISCO 2 = 5-GCTGGTAAATGTTGATGATTAACT-31
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (Detecção de cadeia).
CAPTURA 1 = 5 '-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
CAPTURA 2 χ 5 ' -ATGTCACGAGCAATTAAGCA-3'
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12
DETECÇÃO 1 = 5' -GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3 ’
DETECÇÃO 2 = 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
ADN a detectar é desnaturado pelo protocolo anteriormente referido.
A figura 2 representa os resultados obtidos , com a quantidade do ADN em abeissas e a densidade óptica em ordenadas (vê-se na figura 2 que apenas é detectado o HPV18; o HPV16 não o é).
A sensibilidade é da ordem de 1 ng de ADN.
EXEMPLO 16
Sistemas de detecção de papilomavírus humano de tipo 6, , 16 e 18.
exemplo descreve a detecção de cada um dos tipos após uma amplificação não específica, por reacção em cadeia utilizando uma polimerase.
Esta é efectuada com uma mistura de todos os oligonucleótidos descritos nos exemplos 11, 12, 13, 14 θ 15Cada um dos oligonucleótidos é utilizado numa concentração de 0,3 /iM.
A captura faz-se com a utilização do conjunto dos oligonucleótidos de captura descritos nos exemplos 11, 12,13, 14 e 15 (adsorção passiva, protocolo descrito no exemplo 5).
A detecção faz-se especificamente utilizando um dos pares de oligonucleótidos. marcados com a peroxidase descritos nos exemplos 11, 12, .13, 14 ® 15.
Os resultados e especificidade obtidos são os seguintes , sem o caso em que a detecção é efectuada sobre 1 /1 00e do produto da amplificação.
(Quadro 18)
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Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
í
QUADRO 18
SISTEMA DE DETECÇÃO I HPV6/11 O o 0,008 0,002 O co -=t o O C\J m o 0,6 87 0,007 0,002 ò Ξ) O
r~ > X 0,004 O ΧΓ co o 0,028 LtT) CO o I 0,821 I 0,020 O -=r >- o 0,01 8 zr o o
HPV18 O o o 0,002 0,600 0,001 o xr m o O co LTi O 0,516 —· o o o o o o
o l< CJ> o H Cm H J CU £ Z Q ·=< > X X kO > X X HPV18 HPV6+16 HPV6+16+18 HPV6+18 co r-“ + > X X -! HPV2 não específico c c <x r* c α c. v. α c ta c c X c ε α χ v α X α δ)
63.590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT
Serie 12
V
EXEMPLO 17
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene da proteína maior da membrana externa (MOMP) de Chlamydia Trachoraatis.
No caso de a sequência a detectar ser
ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO DE AMPLIFICAÇÃO 1 = 5'-CACCATAGTAACCCATACGC-3'
ISCO DE AMPLIFICAÇÃO 2 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3’
ADN amplificado ou não pode ser deteotado pelo sistema seguinte (detecção de cadeia)
CAPTURA 1 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3'
CAPTURA 2 = 5'-CTTGGCAAGCTCTGCCTGTGG-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3'
DETECÇÃO 2 = 5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3'
EXEMPLO 18
Detecção da sequência ADN correspondente à região gag do retrovirus HIV 1.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1 = 5'-GGACATCAAGCAGCCATGC-3'
ISCO 2 = 5'-CTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte
CAPTURA 1 = 5'-AATGTTAAAAGAGAC-3'
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
DETECÇÃO 1 = 5'GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
EXEMPLO 19
Detecção da sequência ADN correspondente à região gag do fstroviru3 HIV 2.
No caso da sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes :
ISCO 1 = 5'-GACCATCAAGCAGC.CATG.C-3;
ISCO 2 = 5'-CTTGTTGTCCCTGCTATGTC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte
CAPTURA 1 = 5'-CTTACCAGCGGGGCAGC-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
EXEMPLO 20
Detecção da sequência ADN correspondente à região env do retrovirus HIV 1.
No caso de a sequência a detectar· ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes :
ISCO 1 = 5'-CAGGAAGCACTATGGGCGC-3'
ISCO 2 = 5'GCTGCTTGATGCCCCaGAC-3V
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte:
CAPTURA 1 = 5'-TGTCTGGTATAGTGCA-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3'
63.590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT
Serie 12 >
EXEMPLO 21
Detecção da sequência ADN correspondentes à região env do retrovirus HIV 2.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes :
ISCO 1 = 5’-CAGGCAGTTCTGCAATGGG-3'
ISCO 2 = 5’-GGTTTTTCGTTCCCCAGACG-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte
CAPTURA 1 = 5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3'
DETECÇÃO 1 = 5’-GGTCAAGAGAGACAACAAGAA-3'
EXEMPLO 22
Detecção da sequência ADN correspondente à região pol do retrovirus HIV 1.
No caso de a sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1 = 5'-ATTAGCAGGAAGATGGCCAG-3'
ISCO 2 = 5'-CTGCCATTTGTACTGCTGGTC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte
CAPTURA 1 = 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-GCCTGTTGGTGGGC-3'
EXEMPLO 23
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene.da'região
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12
11.JUii.Wl β glucoronidase de E. coli.
No caso de á sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1 = 5'-CAATACGCTCGAACGACGT-3'
ISCO 2 = 5'-CACGGGTTGGGGTTTCTAC-3'
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (detecção de cadeia).
CAPTURA 1 = 5’-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3'
CAPTURA 2 = 5'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3'
DETECÇÃO 1 = 5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT-3'
DETECÇÃO 2 = 5 *-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3'
EXEMPLO 24
Detecção da sequência ADN correspondente ao gene da região β globina humana.
No caso da sequência a detectar ser ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes:
ISCO 1 = 5'-GACTCAGAATAATCCAGCCT-3'
ISCO 2 = 5'-TGTTTAGGCAGTCTGCCTAG-3J
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (detecção de cadeia}
CAPTURA 1 = 5'-TGiTTACGCAGTCTGCCTAG-3'
CAPTURA 2 = 5'-C’aCATATTGACCAAATCAGG-3 ' =
63.590
Ref: 11 TO DCT-DC/PT Série 12
DETECÇÃO 1 = 5'-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3'
DETECÇÃO 2 = 5'-TTTCTGGGTTAAGGCAATAGC-3’
EXEMPLO 25
Detecção da sequência ADN correspondente ao oncogene ras
No caso de a sequência a detectar ser
ADN amplificado, as sequências utilizadas são as seguintes :
ISCO 1 = 5'-TGTTATGATGGTGAAACCTG-3'
ISCO 2 = 5'-CTGTAGAGGTTAATATCCGCAAA-3’
ADN amplificado ou não pode ser detectado pelo sistema seguinte (detecção de cadeia).
CAPTURA 1 = 5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3'
CAPTURA 2 = 5'-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3'
DETECÇÃO:.. 1 = 5 ' -TT.CCTCTGTGTATTTGC.C'AT-3/ ·
DETECÇÃO 2 = 5T-ACATGAGGACAGGCGAAGGC-3’
EXEMPLO 26
Utilização de alfa-oligonucleótido marcado com peroxidase na detecção.
Protocolo conforme exemplo 5. .
Alvo:
5'-TCATCGTTTTCTTCCTCTGAGTCGCTTAATTGCTCGTGACATAGAAGGTCAACCG GAATTTCATTTTGGGGCTCTAAATGCAATACAATGTCTTGCAATG TTGCCTTA-3'
CAPTURA: 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
A sonda de detecção utilizada é o alfa-oligonucleótido
63.590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT
Série 12
5'-ACCCCGAGATTTAGGTTATGT-3 ' enxertado com pcroxidaao de rábano de acordo com o exemplo 3· limite de detecção é de 5 pg de -1 7 alvo, ou seja 5.10 mole (Quadro 19).
QUADRO 19
ALVO (pg)
5000 500 50 5 0,5 0
Valor D.O. >2,5 0,622 0,073 0,025 0,008 0,007
EXEMPLO 27
Fosfatase alcalina como enzima de detecção em colorimetria
Protocolo conforme exemplo 5:
A sonda de detecção 5'-TAAGGAACA TTGCAAGACA-3’ está ligada à fosfatase alcalina de acordo com o exemplo 4.
100 jul de substrato PNPP(Sigma 104-0) com a concentração de 2 mg/ml (num tampão de dietanolamina 1,29 M; MgSO^O,56 mM ; NaN^ 38 mM; HC1' 0,012N;pH 9,8) são adicionados por poço Após 20 mn de reacção, a actividade enzimática é bloqueada por meio de 100 ^1 de ? ·’1 is NaOH 1 N e a leitura é efectuada num Axiamicroreader (BioMérieux) a 402 nm.
Captura: 5'-TCAGAGGAAGAACGATG'A-3? '
BR
Alvo: pla3mido p 322 contendo o gene do PVH de tipo 18 a 20 ^ug/ml
63.590
ReF: 11 TO DCT-DC/PT
Série 12
QUADRO 20
C diluição do alvo . .
100 500 1000 2000 5000 vazio
Valor D.O. 0,505 0,086 0,054 0,029 0,008 0,008
O limite de detecção é de 1/2000 do alvo (Quadro 20), — 1 6 quer dizer, da ordem de 500 pg ou seja 1,8 10 mole.
Mod. 71 · 20.000 ex. · 90/08
EXEMPLO 28
Fosfatase alcalina como enzima de detecção em fluorescência .
protocolo é o mesmo que para o exemplo 27 mas acrescenta-se como substrato 100jul de metil-4 umbeliferil fosfatase (MUP, Boehringer ref. 405663) num tampão de glicina-NaOH 100 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 0,1 mM, NaN^ 0,5 g/1, pH 10,3, com uma concentração de 80 jug/ml.
A reacção é bloqueada após 20 minutos por meio de 100 μ.1 de KHgPO^ 0,5 M, pH 10,4, 10 mM EDTA e lida no fluorímetro (excitação 340 nm, emissão 460 nm) (Quadro 21).
QUADRO 21
diluição do alvo
100 500 1000 2000 5000 vazio
Unidade fluores- cência 643 167 94 82 66 47
63-590
Ref; 11T0 DCT-DC/PT
EXEMPLO 29
Detecção do virus HIV 1.
a) Região NEF
Para amplificação utlllzam-se as sequências seguintes
ISCO 1 ! 5’-CATTGGTCTTAAAGGTACCTG-3* í
ISCO 2 5’-AAGATGGGTGGCAAITGGTC-3’
As sondas de captura e de detecção são as seguintes:
CAPTURA 5’-GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA-3’
DETECÇÃO 5'GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG-3’
B) Região VPR
Para amplificação utilizam-se as sequências seguintes:
ISCO 1 5’-TGGAACAAGCCCCAGIAGACC-3’
ISCO 2 5’-TGCTATGTIGACACCCAATTCTG-3’
As sondas de captura e de detecção são as seguintes:
63-590
Ref: 11T0 DCT-DC/PT Série 12
CAPTURA 5'-TATGAAACTTATGGGGATAC-3 ’
DETECÇÃO 5' -GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3'
c) Região POL
As sondas de captura e de detecção são as seguintes:
CAPTURA 5’-TGAACAAGTAGATAAATTAG-3’
DETECÇÃO 5’-GGAATCAGIAAAGTACTATT-3’

Claims (60)

  1. = REXVXNDXCAÇÕBS = la - Processo para a detecção de uma sequên cia nucleotídica de um pedaço simples de uma amostra que a contém ou susceptível de a conter de acordo com a técnica de hibridaçao em camadas compreendendo uma fase de incubação de amostra com uma sonda de captura fixa de forma passiva sobre um suporte sólido e uma sonda de detecção marca da com um marcador não rádioactivo, sendo as sondas de cap tura e de detecção capazes de hibridaçao, respectivamente, com duas regiões não sobrepostas da sequência nucleotídica-alvo procurada, sendo a fase de incubação seguida de uma etapa de lavagem para eliminar as substâncias reactivas não fixadas pela hibridaçao, caracterizado por a sonda de captura conter entre 9 a 30 nucleotídicos e estar fixada de forma passiva sobre um suporte sólido hidrófobo.
  2. 2a - Processo de acordo com a reivindicação
    1, caracterizado por o referido material hidrófobo ser um polímero hidrófobo.
  3. 3a - Processo de acordo com a reivindicação
    2, caracterizado por o referido polímero ser um pcrhirrte rct íou dbpoâfimeiSb-de estireno.
  4. 4a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sonda de captura conter entre 9 a 25 e em particular 9 a 20 nucleótidos.
  5. 5a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se operar a uma temperatura pré-determinada e de se escolherem sondas de captura e de detecção de tamanho suficientemente longo e de sequência tal que o híbrido de cada sonda formado com o alvo procurado seja estável à referida temperatura, nas condições de hibridaçao utilizadas.
    63.590
    Ref: 11TO DCT-DC/PT Série 12
  6. 6a _ Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida sonda de captura e/ou a sonda de detecção serem suficientemente curtas e de sequên cia tal que apenas a presença de uma sequência complementar perfeitamente homóloga no alvo permite formar com a referi da sonda suficientemente curta, um híbrido estável à referida temperatura nas condições de hibridação utilizadas.
  7. 7a - Processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado por se efectuar o passo de incu bação à referida temperatura pré-determinada e efectuar-se a lavagem à referida temperatura ou a uma temperatura inferior .
  8. 8a - Processo de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado por se efectuar o passo de incubação a uma temperatura inferior à referida temperatura pré-determinada e efectuar-se a lavagem à temperatura pré-determinada.
  9. 9a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado por a referida tem peratura pré-determinada estar compreendida entre 20 e 60°C, nomeadamente entre 25 e 40°G e ser, em particular, igual a 3 7 °C.
  10. 10a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a sonda de detecção conter pelo menos 9 nucleótidos.
  11. 11a - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sonda de detecção conter pelo menos 15 nucleótidos .
  12. 12a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o híbrido formado pela sonda de captura e o alvo procurado ser menos estável do que o híbrido formado pelo referido alvo com a sonda de detecção .
    63.590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT
    Série 12
  13. 13a — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a sonda de detecção ser mais longa, em número de nucleótidos, que a sonda de captura.
  14. 14a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterziado por a sonda de captura e/ou a sonda de detecção conterem ou serem cons tituidas por alfa-D-nucleótidos.
  15. 15a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a referi da sonda de captura conter pelo menos onze nucleótidos e estar fixada de forma passiva directamente sobre o suporte sólido .
  16. 16a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a sonda de captura estar fixada sobre o suporte por intermédio de uma proteína à qual se encontra ligada por ligação covalente .
  17. 17a - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida proteína ser uma albumina de mamífero ou uma toxina proteína bacteriana.
  18. 18a - Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o suporte ter a forma de um tua% 3,f^ea partículas ou de cones de pipetagem ou a forma de placa de microtitulação.
  19. 19a — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se operar com a técnica de hibridação em camadas simultâneas.
  20. 20a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sonda de captura ser de sequência perfeitamente homóloga à sequência complementar do alvo, ou seja uma sequência contendo uma mutação pontual relativamente à sequência complementar do alvo.
    63-590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT Serie 12
  21. 21s — Processo âe acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o alvo ser a sequência do ADN do virus do papiloma humano HPV 18 e a sonda de captura conter a sequência:
    TCAGAGGAAGAAAACGATGA
  22. 22a - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência :
    TAAGGCAACATTGCAAGACA
  23. 23a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência ARN mensageira correspondeste ao gene da beta-lactamase de E.Coli (Tem) e a sonda da captura conter a sequência seguinte:
    5'-GCACTGCATAATTCTT-3' e/ou ' 5 '-TACTGTCATGCCATCC -3'
  24. 24a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5'-GTTGGCCGCAGTGTTAT-3' e/ou 5'-CACTCATGGTTATGGCA-3'
  25. 25a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado' por o alvo ser uma sequência de ADN contendo o gene da beta-lactamase de E.Coli e a sonda de captura conter a seguinte sequência:
    5'-GGATGGCATGACAGTA-3' e/ou 5'-AGAGAATTATGCAGTGC-3'
  26. 26a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a sequência seguinte:
    63.590
    Ref: 11TO DCT-DC/PT
    Série 12 »
    11.Μ9Ι
    5 1 - -TGCCATAACCATGAGTC-3? e/ou 5 1 -ATAACACTGCGGCCAAC-3' 27a - Processo de acordo com qualquer uma
    das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao gene E7 do virus do papiloma humano do tipo 6 e sonda de captura conter a sequência seguinte:
    5 ' -CAGTGTACAGAAACA-3' e/ou 5 1 -GAGTGCACAGACGGA-3' 28a - Processo de acordo com a reivindica-
    çao anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5 *-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' e/ou 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
  27. 29a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência ADN correspondente ao gene E7 do virus do papiloma humano tipo 11 e a sonda de captura conter a sequência seguinte:
    5 ' -GAGTGCACAGACGGA-3’ e/ou 5 ' -CAACTACAA<?ACCTTTTGC-3 ' 30a - Processo de acordo com a reivindica-
    ção anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    51-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' e/ou 5 '-TGACCTGTTGCTGTGGA-3 '
  28. 31a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente aos genes E7 do virus do
    63.590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT
    Serie 12
    I papiloma humano tipos 6 ou 11 e a sonda de captura conter a seguinte sequência:
    5 *-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3' e/ou 5'-CAGCAACGT(T/C)CGACCTGGTTG-3'
  29. 32a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' e/ou 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3'
  30. 33a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao gene E7 do virus do papilo ma humano tipo 16 e a sonda de captura conter a sequência seguinte:
    5'-TATATGTTAGATTTGCAACC-3' e/ou 5'-GACAACTGATCTCTAC-3'
  31. 34a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção conter a seguinte sequência:
    51-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3' e/ou 5 *-CCGGACAGAGCCCATTAC-3 '
  32. 35a — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao gene E7 do virus do papilo ma humano do tipo 18 e a sonda de captura conter a sequência 3eguintc:
    5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' e/ou 5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3'
    63.590
    Ref: llTO DCT-DC/PT Série 12
  33. 36a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a sequência seguinte:
    5 '-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' e/ou 5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
  34. 37a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao virus do papiloma humano do tipo 18 e a sonda de captura conter a sequência seguinte :
    5 ' -TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3'
  35. 38a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a sequência seguinte:
    5 ' -TAAGGCAACATTGCAAGACA-3'
  36. 39â - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao gene da proteína maior da membrana externa (MOMP) de Chlamydia trachomatis e sonda da captura conter a sequência seguinte:
    5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3' e/ou 5·-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3'
  37. 40a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a seguinte sequência:
    5 '-AATCCTGGCTGAACCAAGCCT-3' e/ou 5 '-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3 '
  38. 41a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser
    63.590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT
    Séire 12
    11.JUN.i89l lima sequência correspondente, sob a forma de ADN, à região gag do retrovirus HIV1 e a sonda de captura conter a sequên cia seguinte :
    5'-AATGTTAAAAGAGAC-3'
  39. 42â - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a sequência seguinte:
    5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
  40. 43a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente, sob a forma de ADN, na região gag do retrovirus HIV2 e a sonda de captura conter a sequên cia seguinte:
    5'-CTTACCAGCGGGGCAGC-3'
  41. 44a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3'
  42. 45a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente, sob a forma de ADN, à região env do retrovirus HIVl e a sonda de captura conter a sequência seguinte:
    5 ' -TGTCTGGTATAGTGCA-3 1
  43. 46a - Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado por a sonda de detecção con ter a sequência seguinte:
    5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3'
  44. 47§ - Processo de acordo com qualquer uma
    63.590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT
    Serie 12 das rei v inditaçOes 1 a 20., caiacLeiizado por o sequência correspondente sob a forma de ADN, à do retrovirus HIV2 e a sonda de captura conter seguinte:
    alvo ser urna região env a sequência
    5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3 ’
  45. 48a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5 ' -GGTCAAGAGACAACAAGAA-3 '
  46. 49a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente, sob a forma de ADN, à região pol do retrovirus HIVl e a sonda de captura conter a sequên cia seguinte:
    5 ' -GACAATGGCAGCAATTTCACC-3 '
  47. 50s - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    5 '-GCCTGTTGGTGGGC-3 '
  48. 51a — Processo de acordo das reivindicações 1 a 20, caracterizado sequência ADN correspondente ao gene da ronidase de E.Coli e a sonda de captura seguinte:
    com qualquer uma por o alvo ser a região beta-gloco conter a sequência
    5 '-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3 ' e/ou 5' -ATGCGATCTATATCACGCTG-3’
  49. 52a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    63.590
    Ref: 11TO DCT-DC/PT Serie 12
    I e/ou
    5'-GATCCCGGTGTCAGTTCTTT-3
    5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3
  50. 53a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao gene da região beta globidina humana e a segunda sonda de captura conter a sequência seguinte:
    e/ou
    5 '-TGTTTACGCACTCTGCCTAG-3
    5 ' -CACATATTGACCAAATCAGG-3
  51. 54a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    e/ou
    5 1-GTATCATGCCTCTTTGCACC-3
    5 '-TTTCTGGGTTAAGGAATAGC-3
  52. 55a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência ADN correspondente ao oncogénio ras e a segunda sonda de captura conter a seguinte sequência:
    e/ou
    5'-CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3'
    5 '-CGACGCAGCCATGGTCGATGC-3
  53. 56a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência seguinte:
    e/ou
    5'-TTCCTCTGTGTATTTGCCAT-3
    5 '-ACATGAGGACAGGCGAAGGC-3
  54. 57a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser a sequência adn de hpv tipo 18 e á-sonda-de captura - contera-sequência seguinte:
    63.590
    Ref: 11T0 DCT-DC/PT Serie 12
    I
    5 ’ t-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3 ’
  55. 58a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência (alfa-nucleotídica) seguinte:
    alfa oligonucleõtido 5'- ACCCCGAGATT
  56. 59a - Processo de acordo com qualquer uma . das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente à região NEF do retrovírus HIVl e a sonda de captura conter a sequência:
    5 '-GAGGAGGTIGGTTTTCCAGTCA-3 '
  57. 60a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência:
    5 '-GGATGGCCTICTITAAGGGAAAGAATG-3 '
  58. 61a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente à região VPR do retrovírus HIVl e a sonda de captura conter a sequência:
    5 '-TATGAAACTTATGGGGATAC-3 '
  59. 62a - Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a sonda de detecção conter a sequência;
    5 ' -GAAGCTGTTAGACATTTTCCTAG-3 ’
  60. 63a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o alvo ser uma sequência correspondente à região POL do retrovírus HIVl e a sonda de captura conter a sequência:
PT97939A 1990-06-11 1991-06-11 Processo de deteccao de uma sequencia nucleotidica de um pedaco simples que a contem ou susceptivel de a conter de acordo com a tecnica de hibridacao em camadas PT97939B (pt)

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