PT98967B

PT98967B - Processo para a preparacao de plantas transgenicas possuindo um teor modificado de carbohidratos

Info

Publication number: PT98967B
Application number: PT98967A
Authority: PT
Inventors: Jan Pen; Andreas Hoekema; Peter Christian Sijmons; Albert J J Van Ooyen; Krijn Rietveld; Wim Quax; Peter J M Van Den Elzen
Original assignee: Gist Brocades Nv; Mogen Int
Priority date: 1990-09-13
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1999-02-26
Also published as: NZ239789A; IL99482A; PT98967A; CA2072656C; AU8651491A; JPH05502591A; WO1992005259A1; EP0479359B1; DE69130698T2; CA2072656A1; AU656920B2; IL99482A0; ATE175238T1; JP3938402B2; IE913215A1; DK0479359T3; DE69130698D1; US20060195940A1; EP0479359A1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE

PLANTAS TRANSGÉNICAS POSSUINDO UM

TEOR MODIFICADO DE CARBOHIDRATOS»

DESCRIÇÃO

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se a um desenvolvimento de plantas transgénicas possuindo uma composição modificada em carbohidratos.

Antecedentes da Invenção

Constitui um objectivo antigo da indústria agrícola desenvolver culturas possuindo uma composição modificada em carbohidratos, proporcionando assim plantas ou órgãos de plantas mais adequados para certas aplicações. Essas culturas modificadas proporcionam plantas que possuem um aroma modificado, um maior teor dos sacáridos pretendidos e/ou uma textura mais desejável. Estas plantas podem ser consumidas directamente ou utilizadas em processamento adicional.

Em várias espécies de plantas, como por exemplo o milho (Shannon & Garwood 1984), ervilhas (Bhattachryya e col., 1990), batata (Hovenkamp-Hermelink e col., 1987), Arabidopsis (Caspar e col., 1985; Lin e col., 1988a; Lin e col., 1988b) e tabaco (Hanson e col., 1988), foram descobertos mutantes com uma composição alterada em carbohidratos. Este fenómeno pode ser atribuído a mutações que foram encontradas principalmente nos enzimas envolvidos na regulação da síntese do amido. Alguns destes mutantes já são utilizadas na indústria alimentar, como por exemplo o milho doce (Shannon & Garwood, supra). que pode ser consumido directamente.

Podem ser obtidos mutantes alterados no metabolismo do amido através de técnicas clássicas como por exemplo procedimentos de escrutínio e cultura aleatórios. Contudo, estes processos são muito longos e consumidores de tempo. Além disso, a cultura pode dar origem ao fenotipo

que se pretende escrutinar, mas pode conduzir a uma perda de outras características desejadas, ou à introdução de características altamente indesejáveis (como por exemplo no caso das batatas que possuem um elevado valor de alcaloides). A alteração das características das plantas através da engenharia genética é um processo preciso e previsível, a natureza do gene que é cortado do genoma é conhecida e não são integrados simultaneamente genes indesejáveis. Finalmente, a modificação de uma característica específica, por exemplo, a alteração do teor ou natureza de certos produtos no mutante é muitas vezes difícil ou mesmo impossível utilizando as técnicas clássicas. Assim, as técnicas de modificação genética abriram novas estratégias e conduziram a novos produtos gue não podem ser obtidos por técnicas clássicas.

Seria claramente vantajoso desenvolver processos sofisticados e previsíveis para a obtenção de plantas possuindo um composição modificada em carbohidratos, com base nas técnicas de engenharia genética.

Na Patente Norte-americana 4 801 540, são referidos fragmentos de ADN que codificam uma enzima susceptível de hidrolisar o poli (1,4-a-D galacturonido) glicano para o ácido galacturónico. São proporcionadas construções de expressão em que o gene estrutural que codifica este enzima está ligado a regiões de regulação modificadas de modo a modular a expressão da enzima. 0 objectivo da invenção tal como apresentada na publicação é

diminuir os teores de expressão do enzima de poligalacturonase de modo a inibir a degradação do ácido poligalacturónico e controlar assim a degradação dos frutos.

No pedido PCT WO 89/12386, são apresentados plantas e processos em que o teor de carbohidratos é modificado através da expressão, na planta, de enzimas como por exemplo a sucrase e a levano sucrase. O objecto da invenção é aumentar a concentração de polímeros de carbohidratos de elevado peso molecular nos frutos de modo a alterar os sólidos solúveis e a viscosidade.

Pedido da Patente Europeia 438 904 descreve a modificação do metabolismo de plantas (especialmente em túberos) em que o valor da actividade da fosfofrutoquinase é aumentada, resultando em teores significativamente reduzidos de sacarose e açúcares redutores que se acumulam no túberos.

pedido PCT WO 90/12876 descreve a regulação da actividade da α-amilase endógena em plantas de batata geneticamente modificadas. A descrição refere que uma redução da actividade da α-amilase da batata, e assim uma redução na degradação do amido para açúcares redutores é desejável para a produção de palitos de batata dado que os açúcares redutores podem ser submetidos a reacções de Maillard durante a fritura das batatas o que conduz a um efeito prejudicial no aroma e na textura do produto. Por outro lado, a descrição afirma que é desejável uma maior

actividade da α-amilase de batata, e assim um maior teor de açúcares redutores se os túberos de batata modificados são para serem utilizados em fermentação para a produção de produtos alcoólicos.

Resumo da Invenção

A presente invenção proporciona plantas ou órgãos de plantas transgénicos que têm uma composição modificada em polissacáridos, bem como processos para a produção dessas plantas. Isto é conseguido através da introdução na planta de uma sequência de ADN que codifica um enzima que é susceptível de degradar os polissacáridos das plantas.

A presente invenção também proporciona construções e vectores de expressão de ADN para a transformação de plantas. As construções de expressão estão sob o controlo de sequências de regulação que são susceptíveis de dirigir a expressão dos enzimas escolhidos de modificação de polissacáridos. Estas sequências de regulação podem também incluir sequências susceptíveis de dirigir a expressão das enzimas escolhidas num estado de desenvolvimento desejado da planta ou do órgão da planta e/ou o tecido especificamente.

Além disso, dependendo dos produtos pretendidos na planta podem ser introduzidos na planta construções de expressão adicionais. Estas construções de expressão adicionais contêm sequências de ADN que codificam enzimas secundários que convertem os produtos de degradação

resultantes da primeira reacção enzimática para os oligo- ou monos-sacárido pretendidos.

As plantas transgénicas proporcionadas pela presente invenção encontram aplicações como novos produtos com um gosto, teor de sólidos e/ou textura desejável, modificados.

Figura 1. Figura 2.

Figura 3

Figura 4

Figura 5.

Figura 6.

Breve Descrição das Figuras Vector binário pMOG23.

Sequência genómica do gene de α-amilase de Bacillus licheniformis tal como presente no vector pPROM54.

Duplexes de oligonucleótidos sintéticos utilizados para as várias construções. Plasmídio binário pMOG23, que compreende o vector binário pMOG23 que contem a sequência genómica de ADN que codifica a a-amilase madura de Bacillus licheniformis precedida por um códão de iniciação de translacção da metionina.

Plasmídio binário pMOG450, que compreende o vector binário pM0G23 contendo a sequência genómica de ADN que codifica a a-amilase madura de Bacillus licheniformis. precedido pelo códão de iniciação de translacção da metionina e sob o controlo do produtor de patanina de classe-I da batata.

Plasmídio binário pM0G437, que compreende o vector binário pMOG23 contendo sequências de

ADN que codificam a α-amilase madura de Bacillus licheniformis e a glucoamilase madura de Aspergillus niger. ambas precedidas por um códão de iniciação da translacção da metionina e ambas sob o controlo dum promotor de patatina de classe I da batata.

Descrição Detalhada das Realizações Preferidas

A presente invenção proporciona plantas ou órgãos de plantas transgénicos que têm uma composição modificada em polissacáridos e que resolvem as desvantagens encontradas nas técnicas clássicas de produção de plantas pela introdução estável nas plantas de sequências de ADN que codificam certos enzimas que são susceptíveis de degradação de polissacáridos.

Foi verificado inesperadamente que a transformação do tabaco com um gene bacteriano da a-amilase (a que falta uma sequência de sinal de secreção) resultava na acumulação de maltodextrinas como por exemplo a maltose e maltotriose, o que é indicador de uma actividade de aamilase. Esta descoberta demonstra que é possível modificar a composição em polissacáridos na planta pela introdução e translacção de um gene que codifica um enzima de degradação de polissacáridos.

A degradação observada do amido pela introdução do enzima de a-amilase é muito surpreendente dado que nas

células e plantas, todo processo de síntese do amido ocorre nos organelos específicos (cloroplastos, amiloplastos e órgãos semelhantes) em que o amido é armazenado, enquanto é de esperar que a α-amilase expressa da esteja presente no citoplasma dado que não estavam presentes sequências para dirigir a α-amilase para estes organelos. Alguns enzimas da degradação do amido são endógenas ao citoplasma das células das folhas das plantas. Contudo, a sua função no citoplasma nunca foi totalmente explicada e nunca foi co-relacionada com a degradação do amido, na planta, dado que a divisão em compartimentos das duas entidades (Caspar e col., 1989; Lin e col., 1988 a,b e c; Okita e col,, 1979).

De acordo com a presente invenção, pode ser regulada a extensão da modificação do gosto e/ou da textura das plantas utilizando vários sistemas incluindo a escolha do enzima ou enzimas modificadores dos sacáridos, escolha das regiões de regulação da construção de ADN concebida para a expressão da enzima de interesse e a direcção do enzima expresso para um local intracelular pré-determinado.

A escolha do enzima ou enzimas de interesse é claramente de importância fundamental na obtenção do produto final pretendido. Se for necessário expressar mais do que um enzima de interesse numa planta, as proporções dos enzimas respectivos podem ser escolhidas de modo a ser obtido o efeito óptimo (por exemplo a doçura pretendida).

A regulação da expressão das enzimas de interesse em relação ao valor da expressão e regulação espacial (específico do tecido/órgão) e/ou do desenvolvimento da expressão é também um meio de ser obtido um produto óptimo. Por exemplo, o tipo e potência de promotor em relação à altura e/ou localização da expressão dos enzimas de interesse proporcionará teores óptimos das enzimas de interesse no local pretendido da planta transformada.

Finalmente, o local (por exemplo o compartimento ou organelo celular) a que deve ser dirigida a enzima expressa pode ser escolhido de forma a que seja obtido um efeito óptimo, como por exemplo um melhor acesso ao substrato.

São por vezes observadas variações nos teores de expressão como resultado da variação do número de cópias e/ou o ponto de integração do ADN transf ormante. Esta variação natural pode ser utilizada para escolher as plantas individuais do conjunto de plantas transgênicas que têm as características desejáveis em termos de doçura, textura e propriedades semelhantes. Estas plantas individuais podem ser utilizadas para a multiplicação e/ou cultura com outras variedades.

Podem também ser utilizadas combinações das medidas acima referidas para ser obtido o efeito pretendido. Os processos para obter os produtos óptimos podem ser determinados pelo especialista utilizando os ensinamentos que se descrevem a seguir.

De acordo com a presente invenção, os enzimas (primários) de interesse a expressar em plantas incluem

quaisquer enzimas ou combinações de enzimas que são susceptíveis de degradar os polissacáridos de plantas. São especialmente preferidos os enzimas codificados por sequências de ADN que são de origem microbiana. Se necessário, as sequências de codificação e/ou regulação podem ser modificadas para se conseguir uma expressão citoplãsmica ou organelar, uma especificidade ou expressão de tecidos numa fase de maturidade desejada da planta ou do órgão da planta. Além disso, podem ser modificados os códãos para aumentar a expressão do gene na planta hospedeira escolhida.

Os enzimas de interesse susceptíveis de utilização em ligação com a presente invenção incluem:

a) enzimas de degradação do amido como por exemplo 1) aamilases (EC 3.2.1.1); 2) exo-1,4-a-D glucanases tais como amiloglucosidases (EC 3.2.1.3), B-amilases (EC 3.2.1.2), α-glucosidases (EC 3.2.1.20), e outras exoamilases; e 3) enzimas de degradação do amido tais como a isoamilase (EC 3.2.1.68), pululanase (EC 3.2.1.41), e produtos semelhantes;

b) celulases tais como exo-1,4-B-ciobiohidrolase (EC 3.2.1.91), exo-1,3-B-D-glucanase (EC 3.2.1.39), Bglucosidase (EC 3.2.1.21), e produtos semelhantes;

c) endoglucanases tais como endo-l,3-B-glucanase (EC 3.2.1.6), e endo-1,4-B-glucanase (EC 3.2.1.1.4) e produtos semelhantes;

i

d) L-arabinases, tais como endo-1,5-a-L-arabinases (EC 3.2.1.99), α-arabinosidases (EC 3.2.1.55), e produtos semelhantes?

e) galactanases tais como endo-1,4-B-galactanase (EC 3.2.1.89), endo-1,3-B-D-galactanase (EC 3.2.1.90), agalactosidase (EC 3.2.1.22), β-galactosidase (EC 3.2.1.23) e produtos semelhantes;

f) mananases, tais como endo-1,4-β-D-mananase (EC 3.2.1.78), β-manosidase (EC 3.2.1.25), α-manosidase (EC 3.2.1.24) e produtos semelhantes?

g) xilanases, tais como endo-1,4-B-xilanase (EC 3.2.1.8), β-D-xilosidase (EC 3.2.1.37), 1,3-B-D-xilanase, e produtos semelhantes;

h) outros enzimas tais como α-L-fucosidase (EC 3.2.1.51), α-L-rramnosidase (EC 3.2.1.40), levanase (EC 3.2.1.65), inulanase (EC 3.2.1.7) e produtos semelhantes.

Opcionalmente, numa outra realização, a presente invenção também contempla a introdução na planta alvo (hospedeiro) de uma ou mais construções adicionais de ADN que codificam enzimas secundários de interesse que são susceptíveis de modificar também os produtos de degradação de polissacáridos (obtidos a partir da acção dos enzimas primários de degradação de polissacáridos) para as subunidades desejadas de sacáridos. Os enzimas secundários especialmente preferidos são os enzimas codificados pelas sequências de ADN que são de origem microbiana.

Como ilustração, os enzimas secundários de ί

também a maltose, maltotriose e α-dextrinas obtidas da primeira degradação do amido, incluem entre outras, maltases, α-dextrinase, a-l,6-glucosidades, e produtos semelhantes. A acção destes enzimas resulta na formação da glicose.

Ainda numa outra realização da presente invenção podem ser expressos, se desejado, um ou mais outros enzimas secundários, que são susceptíveis de modificar os monossacáridos, na mesma planta. Esses enzimas incluem mas não se limitam a glucose isomerase, invertase, e produtos semelhantes.

À fonte a partir da qual as sequências de ADN que codificam estes enzimas de interesse podem ser obtidas não é importante desde que o enzima seja activo no ambiente em que o enzima é expresso ou em que o enzima expressado é dirigido. A escolha dos enzimas primários (degradação de polissacáridos de plantas) e se desejado secundários de interesse pode depender da especificidade de substrato e/ou do produto final de sacarido pretendido.

Os enzimas de interesse podem ser expressos constitutivamente nas plantas transgénicas durante todas as fases de desenvolvimento. Dependendo da utilização da planta ou dos órgãos de plantas, os enzimas podem ser expressos de forma específica de fases, por exemplo durante a formação de túberos ou o desenvolvimento de frutos. Além disso, dependendo da utilização, os enzimas podem ser

expressos em tecidos específicos, por exemplo em órgãos de plantas como por exemplo frutos, túberos, folhas ou sementes.

Os polissacáridos de plantas, tal como definidos no contexto da presente invenção consistem de polihidroxialdeídos ou cetonas, consistindo em mais de seis monossacáridos ligados covalentemente, que são normalmente encontrados em plantas antes da acção do enzima ou enzimas de interesse de acordo com a presente invenção. Esses polissacáridos são tipicamente polímeros de D-arabinose, Dfrutose, D- e L- galactose, D-glicose e D-xilose e manose.

As subunidades de sacáridos, que são os produtos finais pretendidos da presente invenção, são definidos como sacáridos que possuem um comprimento de cadeia mais pequeno do que o polissacárido original, incluindo monossacáridos, que são obtidos através da acção de um ou mais enzimas de interesse nos polissacáridos de plantas.

As plantas transgénicas, tal como definidas no contexto da presente invenção, incluem plantas (bem como partes e células das referidas plantas) e sua progenia que foram geneticamente modificadas utilizando técnicas de ADN recombinante para provocar ou aumentar a produção de pelo menos um enzima de interesse na planta ou órgão de planta pretendido.

As plantas susceptíveis de serem utilizadas em ligação com a presente invenção incluem, mas não se limitam a culturas que produzem flores alimentares como por exemplo

a couve-flor (Brassica oleracea), alcachofra (Cvnara scolymus), frutos como por exemplo a maçã (Malus, por exemplo domesticus), banana (Musa, por exemplo acuminata), amoras (tal como a framboesa, Ribes. por exemplo rubrum), cerejas (tal como a cereja doce, Prunus, por exemplo avium), pepino (Cucumis. por exemplo sativus), uva (Vitis. por exemplo vinifera), limão (Citrus limou), melão (Cucumis melo), nozes (tal como a noz comum, Juglans, por exemplo regia; amendoim, Arachis hvpogeae), laranja (Citrus. por exemplo maxima), pêssego (Prunus. por exemplo pérsica), pera (Pvra. por exemplo communis), pimenta (Solanum, por exemplo capsicum), ameixa (Prunus. por exemplo domestica). morango f Fragaria. por exemplo moschata), tomate (Lycopersicon. por exemplo esculentum). folhas, tal como a luzerna (Medicago. por exemplo sativa), couves (tal como a Brassica oleracea), endiva (Cichoreum. por exemplo endivia), alho fAllium. por exemplo porrum), alface (Lactuca. por exemplo sativa), espinafres (Spinacia, por exemplo oleraceae), tabaco (Nicotiana. por exemplo tabacum), raízes tal como a maranta (Maranta. por exemplo arundinacea), beterraba (Beta. por exemplo vulgaris), cenoura (Daucus, por exemplo carota). mandioca (Manihot, por exemplo esculenta), turnip (Brassica. por exemplo rapa), rábano (Raphanus. por exemplo sativus), inhame (Discorea. por exemplo esculenta), batata doce (Ipomoea batatas) e sementes, tal como as de feijão (Phaseolus. por exemplo vulgaris), ervilha (Pisum. por exemplo sativum),

soja (Glicina. por exemplo max), trigo (Triticum. por exemplo aestivum), cevada (Hordeum. por exemplo vulqare), milho (Zea, por exemplo mays), arroz (Orvza. por exemplo sativa), túberos tal como o kohlrabi (Brassica. por exemplo oleraceae), batata (Solanum. por exemplo tuberosum), e produtos semelhantes.

A escolhas da espécie de planta é determinada pelo uso pretendido da planta ou das suas partes e da tendência das plantas para a transformação.

A expressão de genes recombinantes em plantas envolve fenómenos como a transcrição de gene pelas polimerases de plantas, translacção de mARN, etc., que são conhecidos dos especialistas das técnicas de ADN recombinante. Apenas os pormenores relevantes para a completa compreensão desta invenção serão a seguir discutidos.

Podem ser utilizadas na presente invenção as sequências de regulação que são conhecidas ou que se sabe causarem a expressão do gene que codifica um enzima de interesse na planta. A escolha das sequências de regulação depende da cultura alvo e/ou do órgão alvo de interesse. Essas sequências de regulação podem ser obtidas de plantas ou vírus de plantas, ou podem ser quimicamente sintetizadas. As sequências de regulação são promotores activos na direcção da transcrição em plantas, quer constitutivamente quer em fases e/ou tecidos específicos em desenvolvimento, dependendo da utilização da planta ou das suas partes. Estes promotores incluem, mas não se limitam a

promotores que revelam uma expressão constitutiva, como por exemplo o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor ((CaMV) (Guilley e col., 1982), os dirigidos para a expressão específica em folhas, como por exemplo o promotor do gene da subunidade pequena de carboxilase bifosfato de ribulose (Coruzzi e col., 1984), dos dirigidos à expressão específica em raízes, tal como o promotor do gene da glutamina sintase (Tingey e col., 1987), os dirigidos à expressão específica em sementes, tal como o promotor da cruciferina A de Brassica napus (Ryan e col., 1898), os dirigida à expressão específica em túberos como por exemplo o promotor de patatina de classe-I da batata (Rocha-Sosa e col., 1989; Wenzler e col., 1989) ou os dirigidos para a expressão específica em frutos, como por exemplo o promotor da poligalacturonase (PG) do tomate (Bird e col., 1988).

Outras sequências de regulação como por exemplo as sequências de terminação e sinais de poliadenilação incluem qualquer sequência que funcionem dessa forma em plantas, e a sua escolha pertence ao especialista. Como exemplo dessa sequência pode-se mencionar a região 3' de flanqueamento do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984).

As sequências de regulação podem também incluir sequências potenciadoras, como por exemplo as encontradas no promotor 35S de CaMV, e sequências de estabilização de um ARN como por exemplo a sequência líder do Vírus do

Mosaico de Luserna (A1MV) ARN4 (Brederode e col., 1980) quaisquer outras sequências que funcionem de forma idêntica.

Numa das realizações da presente invenção, se for desejado uma expressão simples de um enzima de interesse no citoplasma da célula das plantas, o enzima expressado não deve conter um péptido de sinal de segrecreção ou qualquer outra sequência alvo.

Numa outra realização da presente invenção, a construção de ADN que codifica um enzima escolhido de interesse de acordo com a presente invenção pode opcionalmente ser provida com sequências líder susceptíveis de dirigir o enzima expressado para um local predeterminado de modo a ter um melhor acesso do enzima ao seu substrato. As sequências alvo que podem ser acopladas de forma operativa ao enzima de interesse de modo a conseguir esta função foram já descritas na literatura (Smeekens e col., 1990; van den Broeck e col., 1985; Schreier e col., 1985. Por exemplo, para se obter a expressão em cloroplastos e mitocôndrios, o enzima expressado deve conter um assim designado péptido de trânsito específico para importação nestes organelos (Smeekens e col., 1990). Se a actividade do enzima for também desejada nos vacuolos, deve estar presente uma sequência de sinal de secreção, bem como uma sequência alvo específica que dirige o enzima para estes vacuolos (Tague e col., 1988). Ela também pode conduzir ao direccionamento do enzima para as sementes.

Todas as partes das construções relevantes de ADN (promotores, sequências de regulação, de estabilização, de direccionamento ou de terminação) da presente invenção podem ser modificadas, se desejado, para afectar as suas características de controlo utilizando processos conhecidos dos especialistas.

Existem várias técnicas para a introdução da construção de expressão contendo uma sequência de ADN que codifica um enzima de interesse para as plantas alvo. Essas técnicas incluem mas não se limitam à transformação de protoplastos utilizando o processo do cálcio/polietileno glicol, electroporação e microinjecção ou bombardeamento de partículas (revestidas) (Potrykus, 1990).

Para além dos designados processos de transformação de ADN dirigidos, são também muito utilizados sistemas de transformação envolvendo vectores, como por exemplo os vectores virais, (por exemplo o Vírus de Mosaico da Couve-flor (CaMV), Fraley e col., 1986) e vectores bacterianos (por exemplo do género Agrobacterium) (Potrykus, 1990). Após a escolha e/ou escrutínio, os protoplastos, células ou partes de plantas que foram transformados podem ser regenerados para plantas integrais, utilizando processos conhecidos (Horsch e col., 1985). A escolha das técnicas de transformação e/ou de regeneração não é crítica a presente invenção.

Para plantas dicotiledóneas, uma das realizações da presente invenção utiliza o princípio do sistema de

- 18 vector binário (Hoekema e col., 1983; Schilperoort e col., 1984) em as estirpes de Agrobacterium são utilizadas quando contêm um plasmídio vir com os genes da virulência e um plasmídio compatível contendo a construção de gene que se pretende transferir. Este vector pode replicar em E. coli e em Agrobacterium. e é derivado do vector binário Binl9 (Bevan, 1984) que é alterado nos pormenores que não são relevantes para a presente invenção. Os vectores binários tal como utilizados neste exemplo contêm sequências limites direita e esquerda de T-ADN, um gene NPTII idêntico que codifica para a resistência à canamicina (Bevan, 1984) e um ponto de clonação múltipla para clonar nas construções do gene pretendidas.

A transformação e a regeneração das culturas de monocotiledóneas não é um procedimento convencional. Contudo, o progresso científico recente mostra que em princípio as monocotiledóneas são susceptíveis de transformação e que podem ser regeneradas plantas transgénicas a partir de células transformadas. O desenvolvimento de sistemas de cultura de tecidos reprodutíveis para estas culturas, em conjunto com processos poderosos para a introdução de material genético nas células das plantas tem facilitado a transformação. Actualmente os processos de escolha para a transformação de monocotiledóneas são o bombardeamento de micropartícuias de explantes ou de suspensões de células, e a absorção directa de ADN ou electroporação de protoplastos. Por exemplo,

foram obtidas com sucesso plantas transgénicas utilizando o gene hph bacteriano, codificando para a resistência à hidromicina, como marcador de selecção. 0 gene foi introduzido por electroporação (Shimamoto e col., 1989). Foram obtidas plantas de milho transgénicas obtidas por introdução do gene bar de Streptomvces hygroscopicus, gue codifica para a fosfinotricina acetiltransferase (um enzima que desactiva o herbicida fosfinotricina), em células embriogénicas de uma cultura de suspensão de milho por bombardeamento de partículas (Gordon-Kamm e col., 1990). A introdução do material genético em protoplastos de aleurona de outras culturas de monocotiledóneas como por exemplo o trigo e a cevada também já foi referida (Lee e col., 1989). Foi recentemente descrita a transformação estável de culturas em suspensão de células de trigo através de bombardeamento de microprojécteis (Vasil e col., 1991). Foram regeneradas plantas de trigo a partir de uma cultura em suspensão embriogénica por escolha de apenas tecidos envelhecidos compactos e do caule embriogénico nodular para o estabelecimento de culturas em suspensão embriogénicas (Vasil e col., 1991). A combinação de técnicas de regeneração com sistemas de transformação para estas culturas permite a aplicação da presente invenção a monocotiledóneas. Estes processos podem também ser aplicados na transformação e regeneração de dicotiledóneas.

Se desejado, podem ser utilizados vários processos para obter plantas transgénicas em que é

processos incluem mas não se limitam a:

a. Fertilização cruzada de plantas transgênicas expressando cada uma um enzima de interesse diferente.

b. Transformação de plantas com um fragmento de ADN ou plasmídio que contem genes múltiplos, codificando cada um um enzima de interesse contendo cada um as sua próprias sequências de regulação necessárias.

c. Transformação de plantas com fragmentos de ADN ou diferentes plasmídios simultaneamente, contendo cada um um gene para uma enzima de interesse, utilizando as sequências de regulação necessárias.

d. Transformações sucessivas de plantas, utilizando de cada vez um fragmento de ADN ou plasmídio que codifica um enzima diferente de interesse sob o controlo das sequências de regulação necessárias.

e. Uma combinação dos processos acima mencionados.

A escolha dos processos acima referidos não é crítica em relação ao objectivo desta invenção.

Numa das realizações da presente invenção, é constitutivamente expressada intracelularmente uma aamilase em plantas de tabaco e de tomate, resultando na degradação do amido nestas plantas para sacáridos de baixo peso molecular. É colocado um fragmento de ADN genómico codificando a α-amilase madura a partir de Bacillus licheniformis. isto é codificando a α-amilase sem a

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sequência de sinal de péptido, sob o controlo da sequência promotora e potenciadora CaMV 35S. É incluída a sequência líder estabilizante de mARN de ARN4 de AlMV, bem como as sequências de sinal de terminação e de poliadenilação do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens. A construção é em seguida subclonada para um vector binário tal como pMOG23 (depositado no Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda em 29 de Janeiro de 1990 com o número de acesso CBS 102.90) Este vector é introduzido em Agrobacterium tumefaciens que contem um plasmídio Ti desarmado. As células bacterianas contendo esta construção são co-cultivadas com tecidos obtidos de plantas alvo, e são escolhidas células de plantas transformadas em meio nutriente contendo antibióticos e induzidas de forma a regenerarem-se em plantas diferenciadas nesses meios. As plantas resultantes contêm o gene integrado estabilizado e expressam intracelularmente a a-amilase.

A actividade do enzima de α-amilase das plantas trasngénicas pode ser ensaiada com diferentes ensaios de enzimas utilizando técnicas colorimétricas ou ensaios de gel. 0 ensaio escolhido não é crítico para a presente invenção. A proteína é detectável em revelações de Western com anticorpos criados contra a α-amilase de Bacillus licheniformis.

As plantas podem ser qualitativamente ensaiadas para determinar o teor de amido por revelação para o amido

com o iodo. Podem ser quantitativamente ensaiadas plantas para determinar a presença de produtos de degradação do amido utilizando técnicas como por exemplo RMN (Ressonância Magnética Nuclear) e CLAR (Cromatografia Líquida de Alto Rendimento). Podem também ser utilizados outros processos. A escolha do processo não é crítica para a presente invenção.

Noutra realização preferida, são expressas uma α-amilase e uma glocuamilase em batatas. Os enzimas são expressos apenas nos túberos das plantas. O resultado é a degradação do amido nos túberos por ambos os enzimas para sacáridos de peso molecular inferior. São colocados um fragmento de ADN genómico codificando a α-amilase madura de Bacillus licheniformis e um fragmento de cADN codificando a glucoamilase madura de Apergillus niger sob o controlo do promotor específico do túbero a partir de um gene da patatina de classe I a partir da batata. Ambas as construções também incluem as sequências de sinal de terminação e de poliadenilação do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens. Ambas as construções são em seguida subclonadas em conjunto no vector binário pMOG23. Este vector é introduzido em Agrobacterium tumefaciens, que contém um plasmídio Ti desarmado. As células bacterianas contendo esta construção são cocultivadas com tecidos obtidos de plantas da batata e são escolhidas células de plantas transformadas em meios nutrientes contendo antibióticos, e induzidas de forma a

regenerarem-se em plantas diferenciadas nesses meios. As plantas resultantes contêm genes estavelmente integrados. Quer a α-amilase quer a glucoamilase são expressados apenas nos túberos das batatas transformadas. Ambas as enzimas são expressados intracelularmente.

As actividades dos enzimas de α-amilase e glucoamilase nos túberos transgénicos podem ser determinadas utilizando vários ensaios. Por exemplo, a actividade da glucoamilase pode ser determinada por meio de um ensaio que mede o p-nitrofenol libertado a partir de pnitrofenol-a-D-glucopiranósido pela glucoamilase. A actividade da alfa-amilase pode ser medida da forma acima descrita e nos exemplo a seguir fornecidos. A presença de ambos os enzimas pode ser demonstrada por imunorregulação, por exemplo. A escolha dos ensaios não é importante para a presente inveção.

Os túberos de batata transgénicos podem ser ensaiados para determinar a sua composição em carbohidratos utilizando técnicas para a detecção de açúcares como por exemplo CLAR e RMN. Podem também ser utilizados outros processos. A escolha do processo não é crítica para a presente invenção.

Podem ser utilizadas plantas ou órgãos de plantas transgénicos (como por exemplo flores, frutos, folhas, raízes, túberos) possuindo um elevado teor de produtos de degradação de polissacãridos e consequentemente um aroma modificado e/ou textura desejada, como o novo

produto quer tal e qual quer sob a forma obtida após o processamento de não fermentação que retém as qualidades que distinguem a planta resultante da modificação dos sacáridos da planta. Exemplos dessas utilizações são a produção de alimentos para crianças, sumos, molhos, pastas, concentrados, edulcorantes, doces, geleias, xaropes, e rações para animais. Podem ser utilizados grãos possuindo uma composição alterada em carbohidratos na produção de produtos cozidos, por exemplo, possuindo um gosto modificado. Os tabacos possuindo uma composição alterada em carbohidratos apresentam um gosto e aroma modificados.

Alternativamente, os produtos de degradação de polissacáridos podem ser extraídos de planta ou órgãos da planta e utilizados tal e qual, por exemplo, como edulcorantes, ou em vários processos.

Os seguintes exemplos são proporcionados de forma a dar aos especialistas uma apresentação e descrição completa da forma de realizar e utilizar a invenção e não pretendem limitar o âmbito considerado pelos inventores para a sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, pH, etc.) mas devem ser tidos em consideração algus erros e desvios experimentais. A menos que se diga o contrário, a temperatura é referida em graus Celsius e a pressão é a atmosférica ou próximo dela.

Exemplo 1

Contrução do vector binário pMQG23

O vector binário pMOG23 (depositado em Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda em 29 de

Janeiro de 1990 com o número de acesso CBS 102.90,apresentado na Figura 1) é um derivado do vector Binl9 (Bevan, 1984). Em primeiro lugar, as posições do limite esquerdo (LB) e do limite direito (RB) forma interpermutados com referência ao gene II da neomicina fosfotransferase (gene NPTII). Em segundo lugar, foi invertida a orientação do gene NPTII que dá origen à transcrição na direcção de LB. Finalmente, foi substituída a poliligação de Binl9 por uma poliligação que possui os seguintes pontos de reconhecimento de enzimas de restrição: EcoRI_f Kpnl_f Smal, BamHI. Xbal. Saci. Xhol,. e HinlII.

Exemplo 2.

Clonacão do gene da α-amilase de Bacillus licheniformis

Todas as transformações neste exemplo foram efectuadas em E. coli estirpe DH5a

a. Contrução do gene de α-amilase de Bacillus licheniformis gene da α-amilase (Figura 2) de Bacillus licheniformis está presente no vector de Bacillus pPROM54, que é descrito no Pedido de Patente Européia 224 294, cuja apresentação é aqui incorporada como referência. O plasmídio pPROM54 foi depositado no Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda em 5 de Novembro de 1985 com o número de acesso CBS 696.85.

O plasmídio pPROM54 foi digerido com Xbal e

Bell. O fragmento Xbal/Bell foi clonado no plasmídio pUC18 digerido com Xbal e BamHI, resultando no plasmídio pMOG318. Foi sintetizado um fragmento de SalI/BamHI com pMOG318 como molde com a tecnologia de PCR (Reacção de Cadeia de Polimerase) criando o ponto BamHI por utilização de um primário de incoerência (a posição do ponto BamHI criado é indicada na Figura 2). 0 fragmento SalI/BamHI foi clonado no plasmídio pIC-19R (Marsh e col., 1984) digerido com Sall e BamHI resultando no plasmídiop pMOG319. 0 fragmento Sall de pMOG319 (o segundo ponto Sall está presente em pUC18), contendo a extremidade 5' do gene da α-amilase, foi clonado em pMOG319 digerido com Sall. Isto resultou no plasmídio pMOG320 que contém todo o gene da a-amilase.

b. Construção do vector pMOGIS

Foi clonada a região de expressão de pROKI (Baulcombe e col., 1986) um fragmento EcoRI/HindiII em pUC18. Esta região contém o fragmento promotor do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV) 355 de 800 pb num fragmento EcoRI/BamHI e o terminador de transcrição de nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens num fragmento BamHI/HindlII. O fragmento promotor consiste na sequência de -800 a +1 (ambos os extremos incluídos) do promotor CaMV. A posição +1 é o ponto de iniciação da transcrição (Guilley e col., 1982). A sequência a montante do ponto Ncol na posição -512 foi eliminada e este ponto foi alterado para um ponto EcoRI. Isto foi conseguido cortando a cassete de expressão presente em pUC18 com Ncol, enchendo

nas extremidades de banda simples com a polimerase de Klenow e ligação de um ligador de EcoRI.

plasmídio resultante foi cortado com EcoRI. resultando na eliminação do fragmento de EcoRI contendo as sequências do promotor CaMV 35S a montante do ponto original de Ncol. 0 fragmento BamHI/HindIII. contendo o terminado nos foi substituído por um segemento sintético de ADN (duplex de oligonucleótido A, Figura 3) contendo a sequência líder de ARN4 do Vírus do Mosaico de Luserna (A1MV) (Brederode e col., 1980). Isto foi feito por clivagem com BamHI, seguida por clivagem com HindiII e ligação do fragmento de ADN sintético. O ponto BamHI e os três nucleótidos a montante foram eliminados por mutagénese dirigida a pontos.

No plasmídio resultante, foi reintroduzido o fragmento BamHI/HindIII contendo o terminador nos. O gene que codifica a beta-glucurodinase (originária do plasmídio pRÀJ 275; Jefferson, 1987) foi ligado num fragmento Ncol/BamHI resultando no plasmídio pMOG14.

É sabido que a duplicação da sequência entre -343 e -90 aumenta a actividade do promotor CaMV 35S (Kay, e col., 1987). Para obter um fragmento promotor com uma dupla assim designada, sequência potenciadora, o fragmento potenciador do plasmídio pMOG14 foi isolado como fragmento ACCI/EcoRI e posteriormente foi terminado com a polimerase de Klenow. O fragmento assim obtido foi introduzido em pMOG14 cortado com EcoRI e terminado, de forma a que o ϊ

limite entre os pontos terminados EcoRI e Accl produziram um novo ponto EcoRI. O plasmídio resultante pMOG18 contém o promotor 35S CaMV com uma dupla sequência potenciadora, a sequência líder de ARN4 de A1MV o e terminador nos numa região de expressão ainda presente como fragmento

EcoRI/HindIII.

c. Clonação do gene de α-amilase de Bacillus licheniformis no vector binário

Foi digerido o plasmídio pMOG320 com Hgal e BamHI.0 fragmento Hgal/BamHI foi clonado em conjunto com o duplex de oligonucleótidos sintético B (Figura 3) em pMOG18 digerido com Ncol e BamHI, resultando no plasmídio pMOG322. 0 gene da β-glucurinidase foi assim substituído pela sequência de codificação para a α-amilase madura de Bacillus licheniformis precedido pelo tripleto ATG codificando o códão de iniciação de translacção da metionina. 0 plasmídio pMOGl8 contém o promotor 35S e potenciador do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV), o terminador da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens e a sequência líder ARN4 do Vírus de Mosaico da Luserna (A1MV). A construção resultante não contem a informação de codificação para um péptido de sinal. Toda a construção foi cortada com EcoRI e HindIII e transferida para o vector binário pMOG23 digerido com EcoRI e HindIII. 0 plasmídio resultante foi designado por pMOG228 (Figura 4).

gene de α-amilase quimérico do plasmídio

pMOG228 foi mobilizado, numa coerência triparental com a estirpe E. coli HB101 contendo o plasmídio pRK2013 (Ditta e col., 1980), em Agrobacterium estirpe LBA44Q4, que contém um plasmídio contendo os genes da virulência necessários para a transferência de T-ADN para a planta (Hoekema e col., 1983).

Exemplo 3

Transformação de tabaco

Foi transformado tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR 1) por co-cultura de discos de folhas da planta (Horsch e col., 1985) com Agrobacterium tumefaciens. contendo o vector binário pMOG228 com o gene de a-amilase. Foram escolhidas plantas transgénicas para a resistência à canamicina. As plantas transgénicas foram ensaiadas para determinar a actividade do enzima de interesse. As plantas que expressam o gene da α-amilase foram analisadas mais completamente e utilizadas em outras experiências.

Foram cortados discos de folha com aproximadamente 5 x 5 mm de folhas de plantas cultivadas axenicamente de Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna SR1. Os discos foram feitos flutuar durante 20 minutos em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) contendo 30 g/1 de sacarose com 1% (p/v) de uma cultura de Agrobacter ium tumefaciens

LBA4404 (pMOG228) (10⁹ células/ml). Posteriormente, os discos foram ligeiramente secos em papel de filtro e transferidos para placas contendo um meio sólido consistindo em meio MS, contendo 30 g/1 de sacarose, 7 g/1 de ágar, 1 mg/1 de cinetina e 0,03 mg/1 de ácido naftil acético (NAA). Passados dois dias, os discos foram

transferidos para placas contendo o mesmo meio e 500 mg/1 de carbenicilina. Passada uma semana, os discos foram de novo transferidos para placas contendo o mesmo meio, desta vez comcerca de 50 mg/1 de canamicina para escolher os pés transgénicos. Foram transferidos discos para placas frescas com três semanas de intervalo. Os pés em desenvolvimento foram excisados e transferidos para vasos contendo meio sólido consistindo em meio MS, contendo 30 g/1 de sacarose, 100 mg/1 de canamicina e 100 mg/1 de cefotaxima para o desenvolvimento de raízes. Após as raízes se terem desenvolvido, as plantas foram transferidas para o soio. As plantas foram ensaiadas para a determinação da expressão do gene de interesse.

Exemplo 4

Expressão de g-amilase em plantas de tabaco transgénicas Foi determinada a actividade da α-amilase pelo processo descrito por Saito (1973) a 56°C. Foram definidas unidades neste caso com uma quantidade de enzima que produz uma redução da absorvância a 690 nm de 10% em 10 minutos. A actividade específica para a α-amilase de Bacillus llcheniformis era de 8,7 x 10⁵ U/mg de proteína. A ponta de uma das folhas de cima (cerca de 100 mg) foi cortada e homogeneizada em 100 μ1 de tampão de ensaio de a-amilase (Saito, 1973). 0 homogeneizado foi feito centrifugar durante 10 minutos numa centrifugadora de Eppendorf. Foi

recolhido o sobrenadante e ensaiado para a determinação do teor de proteínas e de α-amilase. As plantas de controlo tinham teores de actividade iguais ou inferiores ao limite de detecção.

Nas 62 plantas transgénicas obtidas, os teores de expressão medidos, determinados pelo processo de Saito (1973) variavam entre 0 e 3,29 U/pg de proteína. Com base na actividade específica do enzima, estes níveis correspondiam a 0 - 0,38% da quantidade total da proteína solúvel. A média era de 0,11% da quantidade total da proteína solúvel. A proteína estava claramente presente de forma intracelular, dado que não foi detectada quantidade significativa de actividade de α-amilase no fluido extracelular que foi isolado por filtração em vazio nas folhas com tampão, seguido de recolha do fluido por centrifugação (Sijmons e col., 1990). Estes resultados foram confirmados com a detecção imunológica da a-amilase de Bacillus licheniformís em revelações de Western, que demostraram que a proteína é de facto a a-amilase pretendida. Foi obtida outra confirmação processando extractos e fluido extracelular em géis de poliacrilamidaSDS. Após electroforese, os géis foram incubados em meio Tris/HCl 0,04 M pH 7,4 durante 3 horas com 6 alterações do tampão para efectuar a re-naturação dos enzimas. Os géis foram cobertos com 0,25% de amido de batata Lintner, 0,75% de ágar em Tris/HCl 0,05 M pH 7,4 contendo CaCl₂l mM de, incubados durante a noite a 37°C e posteriormente revelados

com I₂ 1 mM KI/0,5 M Kl em água. A actividade da alfaamilase foi detectada como uma zona clara na parte de cima (Lacks & Springhorn, 1980). Nas plantas transgénicas, foi detectada uma α-amilase possuindo um peso molecular aparente de cerca de 55 000 kDa, o mesmo da α-amilase de Bacillus licheniformis.

As plantas de tabaco que expressam a a-amilase tinham uma cor verde clara pálida (clorótica) e tinham por vezes um crescimento retardado quando comparado com as plantas de controlo.

Exemplo 5

Análise da carbohidratos de plantas de tabaco transgénicas

Foi determinado qualitativamente o teor de amido em folhas de tabaco transgénicas, recolhidas aproximadamente a meio do fotoperíodo, por descoloração das folhas durante a noite efectuada por agitação em etanol a 96%, seguido de revelação do amido com I₂ 5,7 mM e Kl 43,3 mM em HCl 0,2 N. As folhas contendo amido ficavam com uma cor preto-azul, enquanto que as folhas sem amido ficavam com uma cor amarela acastanhada (Caspar e col., 1985).

Foram homogeneizadas porções com aproximadamente 2,5 g de material das folhas (armazenado na forma liofilizada) obtidas de plantas de controlo e transformadas (boas expressoras de α-amilase) em 10 ml de água a 4°C com um dispositivo de ultra-turrax. A inspecção microscópica revelou que não permaneciam célula intactas. Após a remoção dos fragmentos das células por centrifugação, foi

determinado o teor de oligómeros de glicose no sobrenadante com coloração verde. As amostras filtradas foram analisadas por CLAR numa coluna Aminex HPX-42A (300 mm x 7,8 mm, 85°C) utilizando a água como eluente. A presença de maltose e de maltotriose foi detectada nas amostras das plantas transformadas e não nas plantas de controlo (não transformadas). Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 1, a seguir apresentada.

Tabela 1

Sacáridos extraídos de folhas de tabaco e analisados numa coluna Aminex HPX-42A-HPLC

Prenaração	sacárido	ma de Sacárido por material húmido
Controlo	Maltotriose	não detectável
	Maltose	não detectável
Transgénica	Maltotriose	0,34
	Maltose	1,73

Exemplo 6

Clonação do gene de a-amilase de Bacillus licheniformis numa construção de expressão específica de túberos

Todas as transformações em E, coli neste exemplo foram efectuadas na estirpe DH5a.

Para construir uma cassete de expressão para a expressão específica em túberos, é sintetizado o promotor de um gene da patatina da classe I da batata f Solanum tuberosum cv. Bintje) utilizando a tecnologia de PCR com ADN genómico isolado (Mettler, 1987) como molde. Os genes

de patatina da Classe I revelam uma expressão específica de túberos na batata. Quer as sequências de codificação quer de flanqueamento de vários elementos da família de multigenes da patatina foram determinados (Rocha-Sosa e col., 1989; Bevan e col., 1986; Mignery e col., 1988). Foram referidos genes quiméricos contendo regiões de flanqueamento 5' de um gene da patatina da classe I fundido a β-glucuridinase, dando origem a uma expressão específica de túberos de β-glucurodinase (Wenzler e col., 1989).

São sintetizados dois oligonucleótidos correspondentes à sequência dos genes pAT21 e B33 (Mignery e col., 1989; Bevan e col., 1986), permitindo a amplificação da região de flanquemanto 5' da patatina da classe I como por exemplo um fragmento HindIII/Ncol;

5' ATTAAAGCTTATGTTGCCATÀTAGAGTAGT 3'

5' GTAGGATCCATGGTGCAAATGTTCAAAGTGT 3'

Os oligonucleótidos são concebidos para conterem pontos de restrição adequados (HindIII e Nçol) nos seus terminais para permitirem a montagem da região de expressão após a digestão dos fragmentos com os enzimas de restrição. Foi sintetizado um fragmento com cerca de 1,3 kb contendo um fragmento promotor da patatina da classe I funcional. Após a adição dos ligadores sintéticos EcoRI por ligação, o fragmento foi clonado em pUC18 linearizado com EcoRI. resultando no plasmídio pMOG546. Numa ligação a três vias, o fragmento HindIII/Ncol do plasmídio pMOG322, juntamente

com o fragmento NcoI/HidIII do plasmídio pMOG322 (ver Exemplo 2, codificando a α-amilase madura de Bacillus licheniformis precedida por um códão de iniciação de translação de ATG e seguido por um terminador nos de Agrobacterium tumefaciens1 foram ligados ao vector binário pMOG23 cortados com HindIII. resultando num plasmídio binário pMOG450 (ver Figura 5).

Exemplo 7

Transformação de tomate

Foi transformado tomate (Lvcopersicon esculentum cv. Moneymaker) com Agrobacterium estirpe LBA4404 (pMOG228). 0 meio de cultura básico consistia em meio MS (Murashige & Skoog, 1970), suplementado com 30 g/1 de sacarose, vitaminas B5 (Gamborg, 1970), 2 mg/1 de zeatina ribósido e 0,1 mg/1 de ácido indole acético (IAA). Os meios foram solidificados quando necessário com 0,7 g/1 de ágar Daichin.

Foram cortados cotilédenos com seis dias de idade, e os pés cultivados axenicamente em ambas as extremidades e pré-incubados durante 24 horas em meio sólido com um alimentador de uma suspensão de células Petunia com 10 dias de idade. Os cotilédones foram depois co-cultivados durante 20 horas com uma cultura de fase logarítmica de Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404 (pMOG228) que foi lavada com meio MS. Os cotilédones foram secos ligeiramente em papel de filtro esterilizado e colocados em meio sólido com uma camada de alimentação com

dias de idade de Petunia na forma de suspensão de células. Passadas 48 horas, os cotilédones foram trasferidos para placas contendo o mesmo meio sem a camada de alimentação e com 200 mg/1 de cefotaxima e 100 mg/1 de vancomicina. Passados 5 dias após a co-cultura, os cotilédones foram transferidos para o mesmo meio adicionado de 100 mg/1 de canamicina. Os cotilédones foram transferidos para placas frescas em cada três semanas.

Foram cortados os pés e colocados num meio de crescimento de raízes (meio MS suplementado com 10 mg/1 de sacarose, 100 mg/1 de cefotaxima e 50 mg/1 de vancomicina). Após a formação de raízes, as plantas forma transferidas para o solo e posteriormente ensaiadas para a determinação da expressão da a-amilase.

Exemplo 8

Expressão de a-amilase de Bacillus licheniformis em tomate ê análise de carbohidratos do fruto transqénico

As plantas de tomate transgénicas obtidas por transformação com a construção de expressão constitutiva pMOG228 não revelavam efeitos fenótipos. As folhas das plantas de tomate transgénicas cultivadas durante três semanas no solo foram ensaiadas para a determinação da actividade de α-amilase da forma descrita no Exemplo 4. Os níveis de expressão da α-amilase nas plantas analisadas variavam entre 0 e 1,2 U/gg de proteína solúvel. A presença do enzima foi confirmada pela revelação de Western utilizando anticorpos cultivados contra a α-amilase de

Bacillus licheniformis.

teor de amido nas folhas obtidas das plantas cultivadas durante 3 semanas no solo e recolhidas a meio do fotoperíodo foi determinado da forma descrita no Exemplo 5. As plantas transgênicas que expressavam a a-amilase continham claramente menos amido nas suas folhas do que as plantas de controlo.

Exemplo 9

Clonação de cADN que codifica a glucoamilase madura de Aspergilus niger

Todas transformações em E. coli neste exemplo foram efectuadas na estirpe DH5a.

a. Isolamento de poli A⁺ ARN de Aspergilus niger

São inoculados cerca de 1 χ 10θ esporos de Aspergilus niger estirpe DS2975 (depositado em Central voor Schimmelcultures em 10 de Agosto de 1988, com o número de acesso CBS 513.88) em 100 ml de meio de pré-cultura contendo (por litro): 1 g de KH₂PO₄; 30 g de maltose; 5 g de extracto de levedura; 10 g de hidrolisado de caseína; 0,5 g de MgSO₄.7H₂O e 3 g de Tween 80. 0 pH é ajustado a 5,5.

Após cultura durante a noite a 34°C num agitador rotativo, é inoculado 1 ml do meio de cultura em 100 ml de meio de cultura principal contendo (por litro): 2 g de

KH₂PO₄; 70 g de malto-dextrina (Maldex MDO₃, Amylum); 12,5 g de extracto de levedura; 25 g de hidrolizado de caseína; 2 g de K₂SO₄; 0,5 g de MgSO₄.7H₂O? 0,03 g de ZnCl₂; 0,02 g

de CaCl₂? 0,05 g de MnSO₄.4H₂O e FeSO₄. O pH é ajustado a 5,6. O micélio é cultivado durante 140 horas e depois colhido. São congelados 0,5 g de micélio seco com azoto líquido e depois faz-se a sua moagem. O material é posteriormente homogeneizado com Ultra turrax (velocidade total, 1 minuto) a 0°C em 10 ml de LÍC13 M, Ureia 6 M e mantido durante a noite a 4°C da forma descrita por Auffray e Rougeon (1980). 0 ARN celular total é obtido após centrifugação a 16000 g e dissolvido em 3 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), 0,5% de SDS e extraído duas vezes com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (50:48:2). O ARN é precipitado com etanol e redissolvido em 1 ml Tris-HCl de 10 mM (pH 7,4), 0,5% de SDS. Para a selecção de poli A⁺, é aquecida a amostra de ARN total durante 5 minutos a 65°C, ajustada a NaCl 0,5 M e posteriormente aplicada a uma coluna de oligo(dT)-celulose. Após várias lavagens com uma solução contendo Tris 10 mM pH 7,0, 0,5% de SDS e NaCl 0,1 mM, é recolhido o poli A⁺ ARN por eluição com Tris lOmM pH 7,0 e 0,5% de SDS.

b. Preparação e clonação de cADN que codifica a glucoamilase

Para sintetizar a primeira banda do cADN, são dissolvidos 5 pg de poli A⁺ ARN, isolado de acordo com o Exemplo lia, em 16,5 μΐ de H₂O e são adicionados os seguintes componentes: 2,5 μΐ de RNasin (30 υ/μΐ), 10 μΐ de um tampão contendo Tris 50mM, MgCl₂ 6 mM e KC1 40 mM, 2 μΐ de KC1 1 M, 5 μΐ de DTT 0,1 M, 0,5 μΐ de oligo(dT)₁₂_₁₈

(2,5 mg/ml), 5 μΐ de dNTP-mix 8 mM, 5 μΐ de BSA (1 mg/ml) e 2,5 μΐ de Moloney MLV transcriptase inversa (200 U/μΙ). A mistura é incubada durante 30 minutos a 37 ’c e a reacção é parada por adição de 10 μΐ de 0,2 M EDTA e 50 μΐ de H₂0. É efectuada uma extracção utilizando 110 μΐ de clorofórmio e após centrifugação durante 5 minutos, é recolhida a fase aquosa e são adicionados 110 μΐ de NH^AC 5 M e 440 μΐ de etanol absoluto (temperatura: -20°C). A precipitação é efectuada numa solução de gelo seco/etanol durante 30 minutos. Após centrifugação durante 10 minutos a 0°C, a pastilha de cADN/mARN é lavada com etanol a 70% refrigerado com gelo. A pastilha é seca e dissolvida em 20 μΐ de água.

isolamento de um cADN que codifica a glucoamilase é efectuado com a Reacção em Cadeia de Polimerase. São sintetizados, dois oligonucleótidos com base nas sequências de nucleótidos de glucoamilase G1 cADN publicado por Boel e col. (1984).

oligo 1: 5' CTTCCACCATGGCGACCTTGGATTC 3' oligo 2: 5' AGCTCGAGCTCACCGCCAGGTGTC 3'

Com estes dois oligonucleótidos, é amplificada a região codificando o enzima maduro, isto é sem péptidos e pro-péptidos de sinal de secreção, precedidos por um códão de iniciação de translacção ATG (sublinhado) e flanqueada por pontos de clonação adequados. O ADN obtido é digerido com Ncol e SstI. Em ligação com o fragmento de Ssti/HindIII de p35SGUSINT (Vacanneyt e col., 1990) contendo o fragmento de transcrição de terminação de CaMV 35S, o fragmento

Ncol/SstI é clonado numa ligação a três vias em pM0G18 (ver Exemplo 2), que é digerido com Ncol e HindlII. resultando num plasmídio pM0G567.

fragmento de PstI/SstI de pMOG567 é posteriormente clonado em pIC20H (Marsh e col., 1984), digerido com PstI e SstI. No plasmídio resultante, o fragmento PstI/HidIII é substituído pelo fragmento de cADN de amiloglucosidase correspondente, resultando em pMOG568. A sequência do fragmento HindIII/SstI é comparada com a sequência publicada por Boel e col. (1984). 0 fragmento PstI/SstI de pMOG568 é ligado ao fragmento Pstl/Stvl do CÀDN da amiloglucosidase, e o fragmento resultante é clonado numa ligação a três vias, juntamente com um adaptador sintético:

5’ CATGGCGAC 3·

3' CGCTGGAAC 5' em pMOG567 digerido com Ncol e SstI, resultando no plasmídio pMOG569 que codifica a amiloglucosidase madura sob o controlo do promotor e terminador CaMV 35S.

Exemplo 10

Clonacão de α-amilase de Bacillus licheniformis e glucoamilase de AspergiIlus niger

Todas as transfomrções neste exemplo são efectuadas em E. coli estirpe DH5a.

O fragmento promotor da patatina da classe I de HindlII/NcoI (ver Exemplo 6) do plasmídio pMOG546 é clonado, em conjunto com o fragmento Njcol/HindlII do plasmídio pM0G567 codificando a amiloglucosidase madura de

Aspergillus niger e o fragmento terminador CaMV 35S (ver

Exemplo 11), em pIC19R (Marsh e col., 1984) linearizado com

HindlII, resultando no plasmídio pMOG440.

plasmídio pMOG450 (ver Exemplo 6) é digerido com HindlII. O fragmento HindlII, contendo o promotor de patatina de classe I, o fragmento de ADN que codifica a aamilase madura de Bacillus licheniformis e o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens. é clonado no vector binário pMOG23 linearizado com HindlII. Isto resulta no vector binário pMOG436.

plasmídio pMOG440 é digerido com EcoRI. 0 fragmento EcoRI, contendo o promotor de patatina de classe I, o fragmento de cADN que codifica a glucoamilase madura de Aspergillus niger e o terminador CaMV 35S, é clonado no plasmídio binário pMOG436, linearizado com EcoRI. Utilizando a análise de enzimas de restrição, são escrutinados os transformantes determinar a presença das duas regiões de expressão numa orientação dupla. 0 vector binário com as regiões de expressão que possuem esta orientação, designadas por pMOG437 (Figura 6) é utilizado nas experiências de transformação.

gene de α-amilase quimérico de Bacillus licheniformis e o gene da glucoamilase quimérico de Aspergillus niger, ambos sob controlo de promotor de patatina de classe I específico de túberos, presente no plasmídio binário pMOG437, são mobilizados numa coerência

triparental com a E. coli estirpe HB1O1 contendo o plasmídio pRK2013 (Ditta e col., 1980) na estirpe Agrobacterium LBA44Q4 que contém um plasmídio possuindo o gene de virulência necessários para a transferência de TADN para a planta (Hoekema e col., 1983).

Exemplo 11

Trasnformação da batata

Foi transformada a batata (Solanum tuberosum cv. Désiree) com Agrobacterium estirpe LBA4404 (pMOG437) da forma descrita por Hoekema e col, (1989).

O meio de cultura básico foi o meio MS30R3, consistindo de meio MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementdo com 30 g/1 de sacarose e com vitaminas R3 (Ooms e col., 1987) e, quando indicado, 5 μΜ zeatina ribósido (ZR) e ácido indole acético 0,3 μΜ (IÀA). Os meios foram solidificados quando necessário com 0,7 g/1 de ágar de Daichin.

Foram descascados túberos de Solanum tuberosum cv. Désiree e foram esterilizados à superfície durante 20 minutos em solução de hipoclorito a 0,6% contendo 0,1% de Tween-20. As batatas foram bem lavadas com grandes volumes de água esterilizada durante pelo menos 2 horas. Foram cortados discos com aproximadamente 2 mm de espessura a partir de cilindros de tecidos de túberos preparados com um aparelho de abrir furos em rolhas. Os discos foram incubados durante 20 minutos numa suspensão consistindo em meio MS30R3 sem ZR e IAA, contendo entre 10⁶-10⁷ bactérias/ml de Agrobacterium LBA4404 (pMOG437). Os discos foram posteriormente revelados a seco num papel de filtro esterilizado e transferidos para um meio sólido MS30R3 com ZR e IÀA. Os discos foram transferidos para um meio fresco com 100 mg/1 de cefotaxima e 50 mg/1 de vancomicina após 2 dias. Passada uma semana, os discos foram de novo transferidos para o mesmo meio mas nessa altura estavam presentes 100 mg/1 de canamicina para escolher as raízes transgénicas. Passadas 4 a 8 semanas, emergiram os pés dos discos a uma frequência de 5 a 10 pés por cada 100 discos. Foram cortados os pés e colocados num meio de crescimento de raízes (meio MS30R3 sem ZR e IAA, mas com 100 mg/1 de cefotaxima e 100 mg/1 de canamicina), e propagados axenicamente por cortes de meristem e transferidos para o solo. A plantas foram deixadas criar túberos e foram posteriormente ensaiadas para a determinação da expresão do gene de interesse.

Exemplo 12

Expressão simultânea específica de túberos de a-amilase fBacillus licheniformis) e glucoamilase (Aspergillus niger) em batatas e análise de carbohidratos de túberos transgénicos

São transformadas plantas de batata com o vector binário pMOG437 da forma descrita no Exemplo 7. As plantas são ensaiadas para determinação da actividade de a-amilase e glucoamilase. A actividade da α-amilase é determinada da forma descrita no Exemplo 4. A presença da glucoamilase é demonstrada por revelação de Western, utilizando anticorpos

criados contra Aspergillus niger glucoamilase. É homogeneizado o material das plantas (cerca de 50 mg) em 100 μΐ de tampão de ensaio e depois é homogeneizado. 0 homogeneizado é centrifugado durante 10 minutos numa centrifugadora Eppendorf. O sobrenadante é ensaiado para a determinação da actividade de α-amilase, para determinar a presença de glucoamilase e para determinar o teor de proteínas. A presença das enzimas é apenas detectada nos túberos das batatas transgénicas.

São analisados os túberos de batatas transgénicas que expressam ambos os enzimas para determinar a presença de açúcares solúveis por meio do ensaio de CLAR. Ê encontrado um teor superior de açúcares solúveis em túberos transgénicos quando comparados com plantas de controlo.

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Claims

- 1“ Processo para a modificação da composição em carbohidratos de uma planta ou de um órgão de planta caracterizado por se efectuar a cultura de uma planta transgénica contendo um bloco de expressão que contêm uma sequência de ADN que codifica um enzima (primária) de interesse susceptível de degradar um polissacárido de plantas, em condições adequadas a que a referida sequência de ADN que codifica a referida enzima seja expressa e a composição em carbohidratos da referida planta ou órgão de planta seja modificada, com a condição de que se a referida planta ou órgão de planta for a batata, a sequência de ADN que codifica a referida enzima (primária) de interesse ser originária de uma fonte microbiana.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido bloco de expressão conter uma sequência de regulação susceptível de dirigir a expressão da referida enzima de interesse num estado de maturidade escolhido do desenvolvimento da planta ou órgão de planta transgénicos.

- 3^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida construção de expressão ser susceptível de dirigir a expressão especifica de tecidos da referida enzima de interesse.

- 4^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência de ADN que codifica a referida enzima (primária) de interesse ser provida com uma sequência líder susceptível de deslocar a enzima expressa para um compartimento celular ou organelo pré-determinado.

- 5^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o aumento no teor de sacáridos solúveis tlWWM contendo até seis unidades de monossacáridos ser obtido na referida planta ou órgão de planta transgénicos como resultado da acção da referido enzima de interesse.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida enzima (primária) de interesse ser escolhida no grupo consistindo em amilases, glucanases, celulases, endoglucanases, arabinases, galactanases, mananases, xilanases, fucosidades, ramnosidades, levanase e inulanase.

-7^aProcesso de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência de ADN que codifica a referida enzima (primária) de interesse ser originária de uma fonte microbiana.

- 8^a Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por a sequência de ADN que codifica a referida enzima (primária) de interesse ser escolhida no grupo consistindo numa α-amilase originária de Bacillus lincheniformis e uma glucoamilase originária de Aspergillus niger.

- 9^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a referida planta transgénica conter uma ou mais construções de expressão contendo construções de ADN que codificam um enzima secundária de interesse diferente de e em adição à referida enzima (primária) de interesse, sendo a referida enzima secundária de interesse susceptível de utilizar os produtos da degradação do amido que resultam da acção da referida enzima primária de interesse como substrato.

- 10^a Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por a referida enzima adicional de interesse ser escolhida no grupo consistindo em glucoamilases, pululanases, isoamilases, ciclomaltodextrina-Dglucotransferases, a-(l-4)-glucanases, a-(l-4)glucosidades, a-(l-6)-glucosidades, β-glucosidades, Dglicoseisomerases e inulinases.

- 11^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 caracterizado por a referida planta transgénica ser escolhida no grupo consistindo em tomate, batata, milho, mandioca, cenoura, alface, morango e tabaco.

As requerentes reivindicam a prioridade do pedido patente europeia apresentado em 13 de Setembro de 1990 sob o número 90202434.8.