PT99065A - Construcoes de dna e metodo para a insercao de dna por transposoes modificados - Google Patents

Description

Esta è uma continuação sm parte do pedido de patente c©pendente Numero de Série Θ7/59®,364, entregue em 28 de Setem™ brOj 1990, a canieúda do qual é aqui incluído par referência.

ΡϋΝΜίΜΓΟ DG........IIWEMJO

Os elementos transponívais eucariéticos são sequências de DNfi dicretas capases de se inserirem num ou em vários sítios dentro as uni genoma procariótico (para uma revisão ver D = E,. Berg ed. (1989) Mobile DMA ASM Pufalications, Washington, D.C.). Historicamente estes elementos transponíveis foram dividos em 3 classes.. A primeira classe compreende pequenos elementos trnspo-níveis, geralmente menos de 2&ΘΘ pares de bases de comprimento. Estes elementos são chamados sequências de inserção ou sequências IS e codificam apenas determinantes importantes para a sua própria transposição? especificamente, uma proteína transposase. Esta primeira classe também inclui transposões compostos que são um segmento de DMA delimitado por duas cópias de uma sequência de inserção. As fracçSes terminais de todas as sequências IS com-preenáem sequências invertidas repetidas. As funções da proteína transposase funciona reconhecendo estas sequências terminais e interactuando com as sequências para efectuar a transposição dentro do genoma» A segunda classe de transposões codifica dois produtos envolvidos num processo de transposição de dois oassoss uma transposase e uma resoivase. Os transposões pertencentes a esta segunda classe possuem repetições terminais de apronimatiamenie 35-4© pares de bases.

A terceira classe incluí c bscteríófago Mu a fagos relacionados» 0 bacteriofaqo Mu ê grande relstivamente a outros transpcsass com um genoma de 36®β® pares de bases» Mu codifica dois produtos de genes que estão envolvidos no processo de transposição, uroa transpcsass de 7ΦΦΦΦ dal tons e uma proteína acessória de aproKimsdsmente 33®®® daltons» Uma característica invulgar tís Mu que o distingue aos outros transpososs S que os seus entremos nac são sequências repetidas invertidas» Mo entanto tem-se observada que a transposase !viu ss liga a ambos os estremas num ensaio de ligação in vitro» A utilisaçãa de transpos-Ses como veículos para a introdução de BMA estranho num cromossoma de célula hospedeira foi já descrita <e»g» Way et ai». Sane 32s369-379))» Também, Brinier (Patente U.S. NS 4,784.,956) descreve um método de dois vsctoresa para a inserção de um vector da clonsgeot transponivel no cromossoma de uma célula recipiente» 0 primeiro olasmideo è portador de um transposlo tendo o gene codificador da sua função de transoosase substituído por DMA estranho a ser inserido no cromossoma da célula recipiente» 0 segunda plasmidea é portador tíe um gene de transpcsass que pode ser expresso» A função de transposase é, país, proporcionada em trans»

Narang st aí, (Patente U»S» N2 4..830,965) dexcreve uma construção referida como uns ligante transponível. 0 ligante compreende os extremos ou as sequências de reconhecimento da transposase de um transpcslo» 0 material genético que está delimitado pelas sequfncias de reconhecimento da transposase no transposão natural foi substituído com uma sequência de DMA contendo ssquinciss de reconhecimento por ensimas de restrição para facilitar a inserção de uma sequtncia de DMA estranho» Tal como foi o caso do método de Brinter» Narang et________al, ensina s introdução de um gene codificador de uma proteína transposass num vector d spiasmídeo separado» em trans»

SuMrio,.....do,.,,lflvento

Este invento diz respeito a uma construção de DMA para a introdução de uma sequência de DMA np DMA constituinte de uma célula procariótica* A construção de DMA compreende um gene codificador de uma proteína transposass ligada em cis a uma cassete transponível» A cassete transponível compreende um par de sítios de reconhecimento pela transposase <geralmente repetições invertidas) delimitando um sitio de clonagem para a inserção da sequência de DNA a ser introduzida no DMA constituinte da célula procariótica. O invento pode ser usado, por exemplo, para. inserir uma ou. ma is cópias de um gene expressável na cromossoma de um hospedeiro procariótico» Isto permite a produção eficaz de material antigénico para aplicações em vacinas» Aindas se o hospedeiro procariótico for uma bactéria entero—invasiva atenuadas o invento é útil para a construção de uma estirpe útil na formulação de uma vacina viva»

Ao dar-se a função de transposase em cis Ci»e» ligada numa molécula de DNA contínua) oferece muitas vantagens relativa-mente a técnicas conhecidas em que a função é proporcionada em trans» Por exemplo, se a sequência de DNA a ser introduzida estiver num vector separado do gene codificador ria proteína transposase, então a cotransformação de uma célula com ambos os vectorss ê necessária para se conseguir o resultado pretendido» A construção deste invento permite a introdução de uma sequência transponível através da transformação de uma célula com um único vector» Esta ê uma metodologia mais eficaz a mais conveniente pois reduz o número de células que deve ser despistada para identificar um clons tenda as propriedades pretendidas».

Unia outra vantagem está relacionada especiíicamente com o transposSo IS» Observou—se que as tr.ansposases IS são ineficientes quando introduzidas em trans* A complamentação em trans de um transposão IS com uma transposase defactiva ocorre com uma eficácia de apraMimadaments 1% ou menos (ver e»q»s Horisato et al» n Cel 1 33,5799-807 (1983?)» Uma explicação que foi sugerida para este fenómeno é que as transposases codificadas por IS se ligam insspecificsssnte a sequências ds DMA que estão físioiogi-camente perto do gene da. transposase imediatamente quando da síntese» Estas moléculas ligadas insspecificaments então correm o DMA è. procura da sequências de reconhecimento por uma difusão unidimensional ao longo do DMA (Brg st al.. „ (1981) Biochsfflistry 29Θs6929-6948)» Pelo contrário as construções de DMA do presente invento codificam o gene transposase e as sequências de reconhecimento da transposase em eis, resultando num sistema de transposição eficaz»

Breve.....Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um diagrama representando uma construção de DMA deste invento» A Figura 2 é um diagrama representando passos da construção de uma construção de DMA deste invento» A Figura 3 é um diagrama representando CA) a sequência de DMA ds um oligonucleótido sintético especifiçando o e;·;tremo esquerdo do transposSo procariótico Τηΐθ e \B) a sequência de DNA-de um adaptador ds clanagem sintético para usar com sequências sintéticas de reconhecimento pela transposase»

íR Figura 4 ê UlI! d X â'd Γ" £λ*Π& V~ epre»entsndo duas construç d s EJNi R riesb e invent o que deri V Sfíi Q o bac te-r ióf ago lambda» n, H Figura 5 é um d i -¾¾ rxuTj-s rsprsssniando UinS raacçâo de τ j** fj-r 3. por inlerméd io de t r an s poe-oe S- entre um pi asn lioeo e um oaccerxotago, A Figura 6 é um diagrama representando os passos na construção de uma construção de DMA baseada em faacteriófago deste invento a. qual é portadora de um gene do circunsporosóito Flasffiodium berqhei* A figura. 7 è um diagrama representando passos na construção da uma construção genética baseada scn plasmídeo dsste invento que & portadora de um gene LT—B expressável. ;H figura 3 um dxagras-a representaindo es-guemacxcaíTíente uma. inserção cromossómica com transposlo em Salmonella» A figurai 9 é um diagrama representando um oligonucleó-tido sintético adaptador especificando sítios de restrição único? no bactsriófago lambda» 9 A figura íD é um diagrama representando os resultado? de s1ectroporação de pPX1575 em H» in f1uen za HD685» u e sc r i q a o De t cilhada do Invento ϋ presente mvsntu esca reíacxonado com construçiSss para e. introdução de uma sequencia de DMA no DMA constituinte de uma célula procariótica e com métodos para a sua utilização» 0 DMA constituinte da célula procariótica inclui moléculas de DNA de replicaçèto autónoma dentro da célula incluindo, oor exemplo, w %

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cr οmοssοm-a5 e epissomas. A transposição ê muitas vezes independente. da sequência de DNA constituinte da célula procariótica e portanto a transposição geralmsnte ocorre em sítios ao acaso. No entanto, os trsnsposSes podem também, com uma elevada frequência, trocar com outros transposSes do mesmo tipo via transposição ou dupla recombinsç-So entre as sequências de reconhecimento da transposase. Conforme discutido abaixo, este mecanismo de troca facilita a inserção de um transposlo portador por exemplo de um gene com interesse num sítio específico no DNA constituinte de uma célula hospedeira.

Este invento pode ser usado para introduzir uma sequência de DNA tendo ou codificando qualquer função. Por exemplo, a sequência de DNA pode compreender uma sequência codificadora de uma proteína estrutural ou reguladora ou pode compreender uma sequência reguladora como seja um promotor. Como alternativa, a sequência inserida pode ser uma de que se desconhece a função biológica e que pode ser usada para interromper uma função celular, por exemplo, através da sua inserção dentro de um gene essencial interrompendo assim a função do gene.

Nas realizações preferidas, a sequência de DNA a ser introduzida no DNA constituinte de uma célula procariótica é um gene expressável» 0 gene expressável inclui todas as sequências reguladoras necessárias incluindo, por exeniplo, um promotor procariótico, sítio de ligação ao ribossoma, etc» 0 invento descreve a metodologia básica para inserir uma ou. ma is cópias de genes em cromossomas de diversas espécies» Os genes expressáveis podem ser derivados de fontes eucarióticas e podem codificar componentes antigénicos derivados de parasitas patogénicos, proteínas humanas ímunoactivas a peptídeos, hormonas, factores de crescimento, alergénios, antigénios associados a

.X tumores ε outras proteínas* Tais genes podem derivar de fontes virais e podem codificar proteínas antigénicas, componentes estruturais ou enzimas envolvidas na rsplicaçSo virai ou ligaçSo dos vírus» Benes homólogos assim como hstsróiogos podem ser obtidos a partir da bactérias, vírus, parasitas, fungos ou mamíferos e podem incluir genes codificadores de factores de virulência dos organismos patogénicos, incluindo toxinas, proteínas imunogênicas protectoras ou genes codificadores de proteínas envolvidas na regulação ou síntese tís material palissacárido antigénico s ainda podem ser enzimas estranhas para a bactéria hospedeira»

Entre os antigánios bacterianos de interesse estio os. associados a bctêrias patogénicas para humanos. incluindo por exemple? HggfflgefaUUg_2ϋ3±ΐΜ®322*!> Escherichia_____.çoli, Meisseria jjjgning.it.idis, Strigtoçaoçus__pneumoniae, Streptocgccus pypqenes

BranMmlla catarrhis. Vibrio_cholerae, * Corynebacterium d.ighteri.ae·, Cl_amvdia________jbnaçhpmatis, fteisserla,.__gonorriíosa, loLdetilla_Bgrt.us.si5g Pi^jámSQâs_asruqinosa, Staphylococçus aureus, Strefitococcus.____jg^PRenes, Kiebsieila pneuminiae, e

Ciostridium tetani» Exemplos de antigánios bacterianos específicos com interesse incluem proteínas bacterianas das quais são exemplos particularmente úteis as proteínas da membrana externa (e.g. de HsMBSEbÃÀML·._kLÍlugD-gae» Branharoella__catarrhal is ou

Neissaria meningitldis). toxinas bacterianas, <s„g», tosinas da tosse convulsa, toxina da difteria, toxina do tétano e exotaxina A de Pseudomonas) s proteínas de superfície bacterianas <e»g», flagelinas, hemaglutininas e a proteína M de Streatococcus EíS3êO§s) -

Os antigánios virais derivados de vírus patogénicos incluem mas não estão limitados a vírus da imunodeficiência humana κ tipos I e II), vírus dos- linfócitos T humanos (tipos Ϊ, II e 111} 5 vírus dos sincicios respiratórios.;, Vírus ds. hepatite A5 hepatite B, hepatite C, hepatite não A e não B, vírus herpes simplex < tipos I ε ϊ ΐ > , citomegalovírus, vírus da iníluenza, vírus da parainfluensa, poliovírus, rotavírus, coronavirus, vírus da rutoéola, vírus do sarampo, varicela? vírus Epstein Barr, adenovírus, vírus papiioma e vírus da febre amarela» Vários antigénios virais específicos destes vírus patogénicos incluem as proteínas F ípeptídso 283-315) e S do vírus dos sincicios respiratórios ÍRSV), polipeptídeo vP4 do rotavírus, polipeptídeo VP7 do rotavírus, glicoproteínas do envólucro do vírus da imunodeficifncia adquirida e os antigénios E e pre~3 da hepatite B„ os genes codificadores de parasitas e fungos podem também ser usados na presente invento» Os antigénios de parasitas com interesse incluem, por exemplo? os de Plasmodium spp,, loj&gBlasroa. spp, ? Leishmania spp. , trypanosQma spp, , Schxstosoma spp,, Toxocara, spp», Ascaris spp», e Fasciola spp» Antigénios de fungos incluem os de Candlda alfaicans,: Crystococcus neoformans e Çocçidiodes immitis. São também de interesse os vários antigénios associados a doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide e lupus eritematoso, antigénios de tumores, antigénios de cancro s cópias simples ou múltiplas de genes codificadores de hormonas, peptí-deos bioactivd-Ss citocinas, linfoquinas e factoras de crescimento, assim como encimas e proteínas estruturais de origem proca-rxélica ou eucariótica, sspecialmsnta par-a usar em vacinas s terapêutica» ser tara proporcionar novas formulações ds vacinas, os genes codificadores ds antigénios protectores podem 3 •st ' * ' r

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introduzidos nos cromossomas do bactérias atenuadas, as quais actuam como veículos de libertação para a estimulação da resposta imune contra o patogénio de onde deriva o gene expresso* Ver Douqan & Ti te , Seminars in Viroloav 1_ ;i .29 (199©)« Os genes codificadores de antigénios derivados da bactérias, v+irus ou parasitas patogénicos podem ser introduzidos nos cromossomas de S. typbi atenuada para usar como vacinas vivas para usar em humanos (para proteger por exemplo contrai a febre tifoide, doenças que provoquem diarreia e doenças transmitidas sexualmente incluindo AIDS) =, Como alternativa, tais genes podem ser integrados nos cromossomas de outras Salmonella capazes de infectar espécies animais, e.g. S. dublin para usar como vacinas vivas atenuadas em gado íe.g», contra a febre do embarque), 5» choleraesuis para usar como vacinas vivas atenuadas para porcos e S. qallinarum ou 5« puílorum para usar como vacinas vivas atenuadas para aves» Numa realização particular do invento, os antigénios derivados de parasitas Eimerja podem ser inseridas no cromossoma de S» qal1 imarum para produzir uma vacina oral para coccidiose. Como alternativa, os genes codificadores de antigénios podem ser inseridos nos cromossomas de outras bactérias para serem usados como vacinas vivas» Exemplos disto incluem bactérias enteroinva™ eivas atenuadas Escheríchia coli, Yersinia enterocolitica„ SM.gel„ia_flexnsri, g.___dysgnteriae, Campylpbacteriuro_

Vibrio choleras e Bacilo Calmstte-Buerin (BCS) um mutante aviru-lento de Mycotoacteriam bovis»

Em adição, tais genes podem ser inserido como uma ou mais cópias nos cromossomas bacterianos para proporcionar uma produção eficaz de material antigénico para s. produção ds vacinas. A inserção de genes nativos ou mutagsnizados derivados de bactérias patogénicas nos cromossomas pode resultar numa produção melhorada e mais eficaz do antioénio» Por exemplo, os genes codificadores de toxinas mutantes, genes codificadores de

factores de virulfncia ou outros imune-génios protéctares nativos ou mutantes podem ser introduzidos- no cromossoma de uma estirpe hacteriana homóloga ou heteráIoga» Em muitos casos, factores de virulência ou ímunogénios protectores podem ser produzidos eficazmente apenas numa bactéria hospedeira particular. Em adição, genes que codificam produtos envolvidos em vias de biossíntese completas conduzindo à produção de polissacárido da superfície bacteriana ou cápsula são muito grandes para serem clonados a expressas em outras bactérlascam a finalidade de produzir material antigênico para usar como vacinas.

Exemplos de tais utilizações incluem a inserção de moléculas de toxina mutagenizadas que dão reacção cruzada de Bordeis!la oertussis no cromossoma de organismos deficientes em toxinas para a produção de uma vacina eficaz contra a tosse convulsa e a inserção de sinais reguladores alteradas aumentando a produção de um produto de gene de toxina mutante. 0 material capsular antigênico derivado de Haemophilus influenza tipo b pode ser obtido a partir da fermentação das bactérias» A inserção de genes alterados que afectem a regulação da síntese da cápsulapode conduzir a uma maior produção de material cpasular de H.~ influenza» A produção eficaz de proteínas

da membrana externa de H»___________influenza pode ser aumentada pela inserção de genes codificsdores de novas proteínas de fusão num fundo genético sem actividade de proteína de membrana externa tipo selvagem»

Os genes expressáveis podem ser inseridos nos cromossomas resultando em organismos recombinantes capazes de elevada produção dos produtos proteicos a partir de uma única cópia de gene» Através de inserção ao acaso de genes nos loci cromasse·— rnais, podem ser isoladas bactérias expressando níveis elevados de produtos» A localizaç-Io ao acaso conduz a isolados nos quais

pedem ser detectados os efeitos posicionais- aumentando a sxpressão do gene» A expressão aumentada de genes pode dar recombinan-tés estáveis que expressam a proteína em níveis que excedem os de construções genéticas semelhantes existentes em veículos de piasmídeos com múltiplas cópias»

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Os genes expressáveis podem ser inseridos no cromossoma de forma a que a herança dos genes inseridos possa ser mantida indefinidamente de forma estável» Os vectores plssmídso extracro-mossómicos que são normaImente usados para a expressão de proteínas estranhas podem ser instáveis conduzindo à perda da expressão do gene estranho» A inserção de genes em sítios ao acaso ou específicos dentro do cromossoma bacteria.no conduz a uma transmissão estável da expressão das genes» é possível fazer o enriquecimento e detectar a inserção estável de múltiplas cópias do mesmo gene no cromossoma de uma estirpe bacterisna* Este invento proporciona, a introdução de múltiplas cópias do mesmo gene no cromossoma do organismo hospedeiro ou uma ou várias cópias de diferentes, genes»

) A construção de DNA deste invento compreende um gene codificador de uma proteína transposase ligada em cis a uma cassete genética transponível como uma molécula de DNA contínua,, A cassete compreende um par de sítios de reconhecimento pela transposase (geralmente repetições invertidas) delimitando um sitio de clonagem para a inserção da sequtncia de DNA a ser introduzida no DNA constituinte da célula ρrocari.61ica,, .mas não delimitando o gene codificador da proteína transposase.

Os elementos transponíveís naturais possuem sítios de reconhecimento pela transposase que estão situados nos extremos 5? e 3’. Estes extremos e qualquer sequ@ncia de DNA interna podem !/ w BUJ 3' X tDS til tran C & 1 U 1 £& α t S t G BE =quên

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o do DNA c on s t i t u i n t s de uma variar gr •andemente de compri- pares de bases no c sso das dores no C i O lslj TSí»|0 Mu» Uma sequências IS e sequências muito característica comum desta sequência interna, e.m todos os transpo-sões é que a porção deis que codifica uma transposase que reco~ nhece especificamenfce as sequências terminais 55 e 35 ou sequências de reconhecimento pela transposase» do transposão particular em que está contida» a situação natural descrita atrás, a xem uma cassete transponível tendo >ela. transposase mas estas· sequências de reconhecimento não delimitam o gene da. transposase» 0 gene da transposases foi inserido num outro local da construção deste inventa» h sequência transposta não inclui um gene de transposase e ê portanto estávelmente integrada na ausência de

Ao c οn t r á r x o d s construção jcs· d. te invente o sequências de necn on tiecz i cneo "t qualqi gene transposase εκ terno.-. Os métodos deste invento permitem estabilizar uma célula procariótica clonada particular tendo u.itsâ cassete transponível contida dentro do seu DNA constituinte num sítio particular»

uuaíqusr r série de sequências de rec yn i rec X !BK1 ! t.O LJw X es codi fiçador es da transpo _q- ít. e cor responden ii na rea i, x deste xnven t.O a Numa reali; l clL % tu@ncias de rec on hec imento da teansp osase C DuV prsTsriaaas i prsendem repetições invertidas.-. TransposSes naturais tendo repetições invertidas incluem, por exemplo, IS1? 132, 133» 134· e 1S5| e os elementos jjn incluindo TnV» Tn1D e Tn9©3» HS equências < do bacter iõfago Mu 5r? transposSe ir exemplo Τη 1, Tn2s Tn3, TnS5 hcsr· í íTtcsnf r» M js í- ,z— r-»/—»·<— .r»t—, Ο l 1Qi iclduS O U-tótuuêíH U. C0 X3 não para a realização deste invento» As sequências- de reconhecimento pelas transposases do fago Mu e transposoes relacionados ~τ repetições invertidas. Tais sequências e sequências codificadoras da proteína. fcransposase correspondente podem ser isoladas a partir do transposSo natural usando técnicas convencionais» Como alternativa^ tais sequências ou sequências que sejam funcionalmente equivalentes e substancialmente homólogas5 podem ser sintetizadas quimicamente»

I A construção deste invento foi sintetizada através de uma série de manipulações genéticas empregando métodos e enzimas conhecidos dos familiarizados com α campo» Os dois s 1 emntos-essenciais são a cassete transponível e o gene da transposase expressávei» Est.es elementos são ligados em cis para formar uam única molécula de DNA contínua» De preferência* como se mostra na Figura 1* esta molécula continua esta ligada a uma origem de replicação que permite a propagação da construção em pelo menos um tipo de célula procariótica e uma. marca seleccionável como seja um gene codificador de uma proteína que confere resistência a antibióticos5 a marca seleccionável sendo delimitada pela sequência de reconhecimento pela transposase»

Se bem que marcas sslsccionàveis que conduzem aà resistência a antibióticos possam ser facilmente usadas para construir os elementos transponíveis modificados descritos.» os organismos resistentes è. droga não são adequados para todos os tmsj especial mente para usar corno· vacina bactsrina viva onde ê possível a disseminação do alelo de resistência à droga para a flora do tubo digestiva»

Durante a. fermentação para a produção de proteínas recombinantesj enzimas e outros produtos.! a adição de antibióticos ao meio de crescimento permite a seiecção de células contendo plasmídeos ou. elementos transponíveis modificados.» mas pode ser .inaceitável em muitos casos devido aos custos e possível

contaminação da produto final. Para os transposSes modificados aqui descritos, a resistência a antibióticos é usada para seisc-cionar a - inserção e pode ser eliminada durante passas subsequentes devido á estabilidade inerente dos elementos» »

Para substituir qe determinantes de resistência a antibióticos com marcas sslsecionáveis que possam ser usadas onde a dissemniação dos organismos no ambiente seja possível, existem numerosas estratégias que podem ser empregues» Os transposSes modificados podem ser seleccionados a introduzidos em células recipientes por complementação de mutações cromossómicas do hospedeiro. Os sistemas da complementação baseiam-se na construção de mutaçSes cromossómicas particulares do hospedeiro, mas podem ser usadas com reproducibilidade para uktrapassar a inclusão de antibióticos para o meio de cultura» Marcas seleccio-nâveis que têm sido usadas nalguns casos para selsccionar e manter de plasmídeos em culturas bacterianas durante a fermentação podem ser usadas para selsccionar casos de transposição» Por exemplo,, a complementação de uma mutação cromossómica para a de5sidr0gena.se do semialdeido aspártico íasd) em Salmonel la typhimuriuffl ou mutação da D-alanina-racsmase Cdal)em Baclllus subtilis, que conduz à síntese deficiente de parede celular, dá transmissão estável de plasmídeos na ausência de selecçao em todas as células viáveis da cultura. Tanto as mutaçSes asd como dal podem ser suplementadas com aditivos nutricionais» Assim», os transposões marcados com um gene dal ou asd funcional podem ser seleccionados em hospedeiros bacterianos contendo aquelas mutações» Por outro lado, & complementação de um gema essencial do hospedeiro» que não pode ser proporcionado por suplementacão nutricional pode também conduzir â manutenção estável de plasmí-deos» Um gene de· E. coli. ssb, á necessário para a replicação do DNA e vi-abilida.de celular, o que evita a acumulação de células sem plasmíuso durante a fermentação num bio-reactor quando >ν "•ν calocado num plasmídeo. De forma análoga5 uma cópia transportada num plasmídeo de valil-tRNA-sintetase estabiliza os plasmídeos em E» coli contendo uma valil—tRNA—sintetase sensível ã temperatura» Os plsmídeos podem ser também estabilizados por inclusão de um gene repressor de bacteriófago, a perda do qual conduz à indução do profago do hospedeiro e morte celular» Assim, funcionalmente qualquer um dos sistemas de selecção referidos pode ser aplicado a elementos transponíveis descritos atrás» Em adição, os elementos transponíveis podem ser modificados de forma a conterem marcas seleccionáveis que podem ser usadas nas células hacteria-nas recipientes que não tenham sido modificadas pela mutação para aceitar a marca» Por exemplo, os genes de resistência a metais pesados (Silver, S = e Misra, T = !<», Ann» Rev* Microbiol», 1988, 42f;717-743» Plasmid mediated heavy metal resistance) que- não são usados em terapia humana podem ser introduzidos em elementos transponíveis. Estas marcas incluiriam genes que- codificam resistência a arsenito ou arsenato, antimónio, cádmio ou compostos organo-mercôricos» Numa realização particular, os genes arsA e arsB, os quais estão envolvidos apenas na resistência ao arsenito, podem ser facilmente adaptados aos elementos transponíveis modificados.

Como marcas seleccionáveis são também úteis genes codifieadores de resistência a herbicidas» Foi descrita uma série de tais genes, cada um deles conferindo resistência a. uma gama limitada de herbicidas, tais como imidazolinanas , sul fornilureias íYa.dav et ah. FNftS USA S3s 4418-22» 1986) glifosato (Cornai et âls.5 -3° Biol» Chem» 2684724-4728, 1985) | e fosfotrinicina ® bialofos (Thompson et al» EMBO 3 . é>s2519-2523, 1987 s Dassarma et ilis Science 232;1242-1244, 1986)»

Para a aplicação particular a vacinas vivas______de

Salmonella, os transposSes modificados podem ser marcados com um gene que complementa um Igcu.s secundária de atenuação para assegurar a vacinação do mamífero hospedeiro com os organismos que expressam o antigénio. Por exemplo., -o gene codificador da adenil-succinatosintetase, codificada pelo gene purA, pode ser introducido em transposõss modificados contendo também um antigeri io expresso. Os casos de transposição podem ser seleccionados em estirpes vacinais de Saimonella através da selecção da independência è. adenina num fundo genético purA. Quando uma mutação purA está presente juntamente com outras mutações atenuadas, como sejam aroA, as células de Saimonella ficam essencialmente hiper-atenuadas e não -se replicam no hospedeiro mamífero. Assim, as estirpes vacinais que contêm um transposão de complemenisção purA são completamente imunagénicas.

Os familiarizados com a matéria podem sintetizar uma cnstrução genética como aqui descrito usando técnicas de clonagem molecular conhecidas. Ainda, as fontes de cada um dos componentes de partida necessários estão normalmente disponíveis. Por exemplo, um gene codificador de uma marca selectiva tal como kan^ pode ser removido de qualquer uma de uma série de fontes conhecidas comuns íe.g», Tn5) por digestão com as enzimas de restrição adequadas. As fontes para as sequências de reconhecimento pela transposase a o gene do transposão correspondente foram descritas atrás. A figura 3A representa um oliqarmcl eótido sintético que especifica os 31 pares ds bases do extremo direito de Tnlff; aproximadamente 27 pares de bases de Tη 1 !õ è suficiente para o reconhecimento pela transposase Tni® ÍWay e Kleekner, Proc. Natl. Acad ,= Sci . USA Sl_s3452-3456 (1984)). Os sítios de clonagem par-a a inserção da sequência de DMA <preferencialmente um sítio de clonagem múltipla contendo várias sequências únicas de reconhecimento por enzimas de restrição) podem também ser facilmente e

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conseguidos ou podem ser sintetizados quimicamente» A figura 3B,por exemplo, representa um adaptador de clonagem sintético que foi inserido nc? pPX1569 para gerar pPXi572, como ss mostra na Figura 2= A ordem e o arranjo dos componentes está apresentada claramente nas Figuras i © 2„ Os familiarizados com a área reconhecerão que as posições da transposass na construção de DMA não ê critico desde que ela seja expressável e estejais? fora (i.e», não delimitadas por) das sequências de reconhecimento peia transposass gealmente repetições invertidas). De forma semelhante, a ordem da marca selectiva e da sequência de DMA inserida pode ser o contrária do apresentado na Figura 1, desde que ambas estejam delimitadas pelas sequências de reconhecimento pela transposass. Numa realização preferida, cada uni dos componentes atrás identifiçados são colocados num replicSo contendo a molécula de DNA vector. Qualquer vector de clonagem, modificado como descrito atrás, ê adequado»

A construção descrita atrás pode ser -propagada por transformação de uma célula procariótica na qual o replicSo é funcional» A construção replicada pode então ser usada para outros passos de manipulação genética» Por exemplo, usando técnicas bem conhecidas qualquer sequência íe.g., um gene com interesse) pode ser inserida no sitio de clonagem da cassete transponivel e a nova construção pode ser usada para transformar células procarióticss»

Na célula transformada o gene da transposass será transcrita» pois ele transporta todas as sequências reguladoras necessárias Ce»g=, promotor, sítio de ligação ao ribossoma, etc»)» A proteína transposass reconhece os extremos da cassete transponivel induzindo assim a sua transposição para o DNA constituinte da célula» 0 gene transportado pela cassete

r«gu x adQTcíb necessários genéticas que também tem os sir também será expresso. replicão condicional replica-se em condições permissivas, mas não em condições restritivas. A utilização de replicSes condicionais permite a esta!: jilicaçSo de uma célula procar: iótica clonad particular tendo ΙΑ(Ώ& Cta3S£5 Λ. Lc transponívei contida dentro ua sei DMA constituinte numa loca 1 n ~v ã. X ώ. «Λ ção particular, Esta estab: Llizaçl é conseguida por remoção o U. 1 Pí activaçáo sticss do gene da trans z— i nr. anc posase (por crescimento das células em condiçSes não restritivas) e finalmente, a proteína transposase, derivada da célul

Por exemplo, alguns plasmídeos são portadores de um defeito condicional, como seja um replicão sensível á temperatura» As construções deste invento que são derivadas de tais plasmídeos t?m a capacidade de se replicar a uma temperatura permissiva, mas não se podem replicar a uma temperatura restric-tiva» as células portadoras do plasmídeo podem, no entanto, crescer e dividir—se a ambas as temperaturas» Após identificação de uma célula tendo uma cassete transponívei dentro do seu. DMA constituinte num sitia particular, a temperatura de incubaoSo é i mudada para a t em pe ratura restrictiva, As cê cr*escep vr: a di vidir-se usas a construção na o se ;pi íca» h construção genética portadora do -gene da transposase s consequente— mente a proteína transposase é assim diluida para o grsu em que a cassete transponívei integrada fica estabilizada dentro do DMA constituinte» Um exemplo de tal plasmídeo curável é o factor F sensível à temperatura de E» coli» Qualquer replicão tendo tal defeito condicional é útil na realização do invento» plasmídeos tendo qama de hospedeiros limitada condicionai e podem cambem usados para permiti r

estabilização de material integrado com interesse. São exemplas bem conhecidos deste grupo de plasmídeos os derivados do vector plasmídeo pBR322 de £, coli colEÍ ·, Estes plasmídeos slo pequenos s fáceis de preparar em grandes quantidades para passos de clonagem in vitro» Eles estio limitados na gama de hospedeiros a E» coli e enterobactérias estreitamente relacionadas e slo incompetentes para a replicaçlo em outras espécies a menos que seja proporcionada a funçlo de DNA-polimerase de E» coli. Esta dependência â devida á necessidade da origem de replicaçlo colEÍ para a funçlo de DNfi-poIimerase tipo I do tipo E. coli- Portanto, estes plasmídeos podem ser usados com vectores de libertação suicidas para outras bactérias» A libertação suicida» tal como aqui é usado, refere-se à introdução de um transposlo via uma construção genética que nlo se pode replicar no hospedeiro» Os plasmídeos dirigem a síntese da proteína transposase quando da transformação que resulta na intsgraçlo da cassete transponível no DNA constiuinte» No entanto, devido ao replicão ser incompetente para a replicaçlo na célula procariótica seleccionada, a proteína transposase é rapidamente diluida no ponto onde a transposição já nlo tem lugar»

Qualquer vector plasmídeo que tenha gama de hospedeiro limitada pode ser um veículo de libertação para os transposSes modificados descritos atrás» For exemplo, a origem do pBR327, usada na construção de pPX1575 e seus derivados,. replicam-se livremente em E» coli e -Saimanei ia» mas nlo se replicam em H» lD.iiuBn.sa ou B. pertussis» Assim, pPX1575 é um plasmídeo suicida para a libertação de transposSes modificados dentro daquelas células bacterisnas» Os replicSes condicionais para libertação de transpasão modificada para dentro de hospedeiras bacterianos entéricos podem ser construídos como uma alternativa à libertação em bacteriófagos tais como 1ambda ou fsetores F sensíveis à temperatura como descrito atrás» A origem do plasmídeo R6K requer '7/, »

ν ι. uma prat&lnã n: funcional, a qual funciona em trans para a repix- cação» Vectores suicid as c< truidos is«ç« j 1 ii 1 ler r, 1 l ! V u l_ 17Θs2575-1583)„ Usando nos hltók a 1 a* jos« í -CTtí i —- para a RòK j á foram j ___t 7 n à /fao q d s £ÍctL. uuiíto" a ?·~ 1 ros E * coli ou ;s* c ΟΠ t ®\i\ â proteína p i. -cã "~· í Π Í.dt?’J\3 5U. 2. .cidas port adores de t-âdOS » tstfcfS plasmídeos . ϊ ' ‘_ X ϋ Cl:. C!" elementos transponíveis mu d: actuariam para libertar elementos transponíveis5 par transformação ou por conjugação5 em bactérias tais como Sa 1 mona11 aShiciellê e outras bactérias entéricas estrsitemente rslacionadsss Axndaj os replicões derivados de organismos gram— positivos,, tais como pUBl 1Θoriginaimente isolado em S, aureus, não se replicam em bac térias g ram-neq a t ivas tais cood p coli ou Balmonella e portanto pode ser usada na consuru1 Ç àO de veículos plasmideo su.ícidas para transpDsSss íTsod i f i c a d os um te?· l8j.í' o txpo Ce cu.nstí·"uçáu as i..":;^é pa?'~a 1 iL/ert-ac^o da cassete transponivel num cromossoma proocsriótico é um derivado d? bacteriófago» Numa reali .zação prefe ‘rida* o bac teriófaao é o iófago lambda» Como se mostra nas Figuras 5 e ò, um fago incapaz de se replicar r c e x u x a hospedei ra p roc a r i ò t i c a (i«e«? um replicão condicional) é usado para libertar a cassete transponivelQ sistema tira partido da propriedade dos transpo-sões residentes permutarem construcba Ãffl •pontaneamente in vi- vo. Portanto, S0 :GSSQ S"SpOC X 3. X .1. seoo pretendido for .dor de uma primeira m a r c a se1ec C1 Q“ riâvei introduzido numa célula h.coii lisogenizada com um fago lambda contendo a sequência de reconhecimento da transposase delimitando uma segunoa marca ssieccion-ável, o transposâo piasmí— deo pode permutar frequentemente com o transposâo do profago» Tais trocas podem ser facilmente deteciadas e isoladas por indução do profago residente e despiste do lisstio relativamente a fagos capazes de transduzirem a primeira marca» Estes lisogénios podem então ser induzidos para dar uma população pura do fago C-l l í! Βά

transdutor portador da cassete genética transponívsl Um outro método para a estabilização de uma inserção cromossómica particular envolve a utilização de um promotor regulável para controlar a expressão da proteína transposase» liuitos promotores reguláveis são conhecidos dos familiarizados com a área incluindo tac» íac, recAP, e T7 . Tais promotores são activos em condições definidas mas inactivos noutras condições.· A discussão anterior está relacionada essencialmente com inserção ao acaso de uma sequência de DMA, Md entanto, ao usar-se uma célula hospedeira, contendo um transposSo residente num locus genético predeterminado» έ possível dirigir a inserção de uma sequência de DMA para aquele locus predeterminado, Isto á devido à transposição específica ou recombinação homóloga entre sequências de reconhecimento de tranposase geralmente repetições invertidas)«

Determinar a posição de um tran.sposão residente» ou. de uma sequência de DMA introduzida pelos métodos deste invento, é um assunto reistivamente simples que pode ser resolvido por digestão enzimática e análise de gel. Em situações complexas, pode ser necessária a hibridação "SouthernK. Quando um transposSo residente é identificada numa localização desejada, é introduzida uma construção genética deste invento utilizando qualquer método apropriado., Poderá ocorrer, com alguma frequência, recombinação homóloga, e as células nas quais a recombinação ocorrem podem ser detectadas, por exemplo, por meio de hibridação "Southern" 0 invento é ainda ilustrado pelos Exemplos que ss seguem

ía> Estirpe bacterianas e bacterláíaqa

As abreviaturas que se seguem sSo utilisadas ao longo de todo este pedido de patente, quando se reterem a resistência á drogas

Resistênc ia kanamicina Kari'' Resistência kanamicina KanR Sensível á kanamicina Kan'"‘ Resistência à ampicilina -% R -Amp Resistente à ampicilina Aaip' Sensível á ampicilina Amp'“‘ Resistência ao cloranfenicol Cmn: Resistente ao cloranfenicol CmR Sensível ao c 1 o r an f en i c o 1 CmS Resistência á tetraciclina TstR Resistente à te t rac i c 1 i n a Ji ! et^ Sensível à tetraciclina Tet°

J

As estirpes que se sequem foram depositadas na NRRL, Peoria., Illinois, em 12 de Julho, 199Φ nos termos do Tratado de Budapeste5 E. noli JMl®3/pPX1575........... acesso #MRRL B-Í8672 E- coli MC 1 €>61 /oMC9„ lambdaPBi©® = . .acesso #NRRL B-18Ò73 En coli HC1061 /oHC9. lambdaP81®3.. .acesso f-NRRL B~i8é>74 E. ...coli C600/F5 1 ac s s Tni® acesso #NRRL B-Í8675 E- coli JC1553/FH2 foi obtido do Dr,. B. Bachmann (Coli Genetic Stock 'Center, Yale University) e tem o qsnétipo? 10.66, ffiEfeS1? his~l, Isua, recA/ .,· mtl2? χνί7? galá, lacYl, rpsL104, p _ tonfl2tsxlambda % lambda , sugF440 F112 έ portadora do de um receptor de lambda Intacta i1amB) b genes para a utilização da mal tose íMal1-)»

Outras estirpes de E._coli usadas na construção d© plasmideos s fages lambda recombinantes são as seguintes? Υ1Θ88 (delta lacU169 supE supF hsdR hsdH' metB trpR tonA21 proCs sTn5 <pnC9> CATCC 371953) foi usada como estirpe hospedeira na recuperação de lisoqénios para lambda recombinanta (Younq and Davis» Science 222s778 (1983)5; MCÍôéí CATCC 53338) (delta ara-leu) 7697 delta (lacFOZY) X74 hsdR hsdrl" araD139 qalElo qalKiè rpsL·) foi também usado coma um hospedeiro para alguns dos fagos lambda recombinantes e para a titulação dos stocks de lambda ímeíssner et al.. Proc» Natl. Acad» Sei» USA 84s4171 (1987)); 3 Η1Θ3 CATCC 394Θ39 (F3traD56 proAB laci" delta Mi5/delta (pro-Iac) suqE hsdR sbcBiS thi-1 endftl lambda > foi usado como estirpe hospedeira para a construção de plasmídeos contendo genes regulados pelo promotor tac ou lac (Hessing et aL, Nucl» Acids fies. 9?309 <Í98D); M99c1(F qali<2 rpsL lambda cl') é uma estirpe hospedeira contendo o gene do repressor cl tipo selvagem, mas com muitas deleçSes noutras funçSes de lambda (Sottesman et al,, J„

Wol, Biol, 140537 (1980)); 0600 CATCC 470243 <F~ thi leuBò lacYl tre-1 hsdR supE44 tonA2t lambda ) foi usada como estirpe hospedeira para o factor F sensível à temperatura,, F, ...lac Τηΐβ; e KBT001 < purE lacY 1vsA leuA5 oroC metE arqH rpsL lambda > foi usada como descrito nos exemplos (Kadner e Liggins, Bact. l|5s514-521 (1973))» 0 veículo de clonagem bacteriófago lambda lambda g tl 1 CATCC 371943 ícI857 nin5 lac5 Sacn 10Θ delta shnd 111 lambda'2-3 srílambda3~ srllambda#" srllambda5w) foi mantido em Υ1Θ89 (Young e Davis, Proc» Natl» ficad, Sei USA 8©síi94 (1983))» 0 veículo de

·-? 1 . ·'. V clonagem lambda lamhdaMM816 (itnm clts nin5 iãc5) fox mantxdo como lisogénico em lambda!@89 CMurrav, H„ In_; L.AHB&A 11 (1983) =

Hendrix et al»,, sds,= Cold Spring Harbor Laboratory„ NY.? p« 395)*

As estirpes vacinais atenuadas de SalmonelIa usadas forams Ty523 (aroA delta4©7 hisG46), um derivado de 5. typhi CDC 108Θ C Pa tente U.S. NS 4,,735,80135 SL3261 <aroA554g sTnÍ0Tc5 uma 9 \-y deleçSo estável nSEo revertente ar o A derivada de 5» typhimurium, biotipo Wrayp e SL1438 CATCC 391843 <ftisS46 aroA 554 Tnl© TcS), um mutants de deíeçao de S, dubiin. 8, typhimuriuiii LB5010 é um mutants qalE derivado de LB5000 (Bulias â Ryu, J»_ Bacteriol„ 156x471 (1983))» 0 receptor lamB de E, coli foi introduzido em LB5®1© por conjugação com Ε_^_ col i KL.Í88 contendo r- í i2dTjil®(cm), seleccionando Cm‘\ A CmrRír,1^ foi obtida por transformação de F112/JC1553 cam o plasmídeo

pNK!210 (Way et aL, Bene 32x369-379 (1984))? e seleccionando os P exconjugantss Cm1 de PRÍ3 Cpnpl3-, rna!9, trei, leuB6, thil, lacVl, mv 17, mt.12, ma 1A, rps-L, malBs descrito por Hautala et al., (Proe, Natl. ftcad» Sei„„ 76x5774-5778 (1979)) que eram sensíveis a lambda = 0 factor lamB·*· F foi mudado para uma estirpe de E, d.P.lX auxotrófica CKL188 (thil, pyrsD34, hisáS, trp95. mt!2. hv17» ma l AI, qa,IK55, rpsLi18, lambda”', lambda )? obtidas de B, Bachmannj Coli Genetic Stock Center, Ysle Universíty, a qual foi contra-SBlsccionada numa conjugação subsequente com S .-= typhimurium ί_Β5Θ1Θ por omissão de histidina, uracilo e timina no meio mínimo que suporta o crescimento de !_.Β5ΘίΘ„ 0 factor F lamB foi movido para estirpes vacinais atenuadas de Salmanella por conjugação com L.tí5©'i€?, contra—seleccionando a estirpe dadora num meio definido contendo todos os aminoácidos com excepsção de isoleucina., valinas metionina e leucina.

Hasmophi1us inf1uenzae Rd estirpe HDS85 (Dsich and Breen, 3, Bacterial 17Θη 489--498 (1988)) foi usado como descrito nos Exemplos abaixa,

Bordetella gertussis,, estirpe ΒΡ37Θ, discutida abaixo no Exemplo ó, ê um isolado FHA ds B, pertussis, obtida do Dr = Stanley Falkow, Stanford University, Paio Alto, california, tendo produção da toxina da tosse convulsa e hemolisina tipo selvagem, ík> WgiP.......α......Crescimento, de Bactérias

As estirpes deE^jcoli., 8« typhimurium, 5.......dublin e S-. tvohi foram cultivadas em caldo L, As células ds Hasmophilus influsnza foram cultivadas em caldo Brain Heart Infasion contendo 10 μα/ml de hemirta e 2 μ-g/ml de NAD, Sempre que adequado, estava presente ampicilina a 1Θ0 microgramas por ml e canamicina a 50 μα/ml, B, partussis estirpe ΒΡ37Θ (FHA TQX+> foi propagada a partir de stacks congelados em agar de sangue semi-sólido Bordet--Bengou (BB) (Kimura, A- et al, ,, Infect, Iromun, 59s7-16 (1990)),

A massa de bactérias do meio de agar foi inoculada em meio CL para cultura em meio líquido, (Imaízuini et al, , Infect,__I mmun, 41:1138-1143 (1983)),

Para inoculação de murganhos com derivados vivos de Salmonella typhimurium SL3261, as bactérias foram cultivadas nuii! meio definido consistindo por litro smn 6 g Na^HPQ, , 3 g KH.-,POrt,

jSm* *T **T 0,5 g NaCl, 1 g ajustado a pH 7,0 e contendo ainda 2 q de B—glucose, 0S2 g ds iiaSO., imM citrato ds sódio, 5 α de casamino- *r ácidos sem vitaminas, 5 mg de ácido nicotinico, IS mg ds ácido di-hidroxibenzòico, lv mg de ácido para—aminobenzóico e 35 ma de fsnilaianina, triptofano e tirosina. ·/.-

. Ν . Λ ν

Os murganhos foram inoculados oraImante 'com um inocula 1 ("í ate !«$“" bactérias por incubação cíirecta no estômago com uma agulha sem bisel * As bactérias crescidas como atrás foram centri-fugadaSii lavadas e ressuspensss em 1,5% de bicarbonato de sódio» íc> Métodos Genéticos

Os plasmídeos foram usados para transformar estirpes de E, coli ou de S, tyohimurium LB5010 pelo método do CaCX.-, (Dagert and Ehrlich, Gene a;25-28 U979>>. 0 bacteriófago HT intlBS foi usado na transdução generalizada de genes de S» tyshimurium LB5010» LB5&ÍB foi sensibilizado para o fago por indução da síntese de LPS por inclusão de D-galactose no meio de crescimento de uma cultura em fase log durante uma hora antes da infscção com fagos para a produção de Usados do fago. 0 fago P00 preparado em LBS1@1 foi misturada a uma multiplicidade de infecçlo de 1 com SL3261, 8L1438 ou Ty523 e os transdutantes foram sslsccionados em meio adequado„

td) Síntese de. 0,1 igopuc 1 eótidps

Os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizado?-de DMA Applied Biosystems ÍFoster City» CA) 380B usando química de fê-cianoeti 1 fosforamideto, <e) Expressão de Genes LT---8 é a subunidade não tóxica da toxina sensível <L7> enterotoxigánica de E» coli e foi expressa em E, coli JH103 num -/,-

vector pUCS por clonagsm de um fragmento EcoRI--Hind III de 59# pares de bases nos sítios EcoRI-HindIII de pUC8-, A proteína CS de tamanha completo de P1asmodium ber qhei foi expressa num vector de expressão com o promotorP, e consistiu na sequência codificadora completa mais 8 aminoácidos (Met—Blu-AIs—Leu-Ile-Leu-Asp—tis) no extremo amina (Fig.-. 6) Os sete primeiros aminoácidos derivaram do vector de expressão e um adaptador e a lisina derivaram do sítio Dralsituado num codão a montante da região codificadora da proteína CS=

s—/ <f> .gg.tr.^r^ jãl.irlD.P l.a....para., a Detecçfp de ântiMpio A síntese de proteína recombinante heteróloga foi detectada em células de E. coli ou de Satmonella por trasnferfn-cia da amostras ds proteína separadas por electroforsse am gel de poliacrilamida para membranas de nitroceluloses bloqueio com Θ35% Twesn-2# em PBSs seguida de ligação do anticorpo em #=,1% Tween-2®..

0 anticorpo ligada foi detectada com Proteína A marcada com peroKida.se de rábano silvestre íKirkegaard" and Perry* Baithersgurq5 MD)* Para a detecçSo do antigénío LT--BS o anticorpo primário foi reagente policlonal cu-LT-B parcialment-s purificado por eluição do material ligado de uma coluna de afinidade de proteína A Sepharose 4B„ í9) El^imiransfor^

As células ds Haemophilus influanzae foram cultivadas em meio ΒΗϊκν até ã fase mid-log <006ΘΘ = #,3) a 37*8» As células foram sedimentadas, lavadas duas vezes com 10 mM Hepes, pH 75ftç 2.0% ρ/v de giicerol e ressuspensas em Ι/ϊΦΘ volume de 1# mM HEPE8 pH 7,0/20¾ Cv/v) de glicerol, 0 DMA de plasmídeo <pPX1575) foi adicionado a KÍDgg/nml de as células foram electroporadas com um •ν

χ

electraporador BIX Transfsctor» A suspensão de células 5O microlitros) foi diluida em í ml ds meio BHIxv e cultivadas durante 2 horas a 37°C para permitir a expressão da marca trans- dusida» As culturas foram então diluídas seriadamsnte em BHI s semeadas em agar seleciivo BHIxv-canamicina ί2Θ μα/πιΐ) e incuba- , d-as a 37 °C» v_y h) fcleçtmtranafofm£l6^g-Bm:.a -gertussls.

As culturas ds partida de ΒΡ37Θ em meio CL foram incubadas durante a noite a 35-37°C e depois inoculadas em 1,3 litros de meio CL e incubadas com agitação durante 18-24 horas a 35 °C» As culturas foram colhidas por centrifugação a ΞΘΘΘ kq durante 3Θ minutos num rotor Sorvsll 683 = 0 sedimento de células foi ressuspenso em 2&Θ ml de tampão HEPEB Θ,ΘΘΙπ, ρΗ 7,2 e sujeitas a ma is dois ciclos sucessivas de las·· agem em t amo ao ΘHEPEB» FinaImante, as células foram ressuspensas em 20 ml da tampão Θ»®Θ1Η HEPES contendo 12% de gliceral» As células foram congeladas e guardadas a -7®°0= Durante as operações de lavagem, as células foram mantidas a ©°C = Para electroporação de DMA» uma quantidade adequada de DMA (-até 1Θ μα) foi adicionada a 450 μΐ de uma suspensão de células- descongelada e -as misturas foram sujeitas a um pulso eléctrico de .33,6 kilovolts/cm com uma duração de •580 microsegundos» Imediatamente após electroporação, as células foram diluídas em 1 ml de meio CL não suplementado e incubadas a -37°C durante uma hora antes de semear em placas tíe agar com sangue BB contendo 25 μα de canamicina por ml ou 5Θ μα de ampici— lina por ml» 1 > IraMtefllncia_boujhern__de..........uNA Cromossómico de S*.

2mfaÍl?MrÍ2iíL partir de 5 ml de

Preparou-se DMA cromossómico a

culturas crescidas durante a noite dos clanes candidatas par lise das bactérias em 6Θ& μΐ de TE contendo θ»5% SDS e 10® pg de prateinase K por ml» Os detritos da parede celular e polissacári-dos foram removidos pela adxçlo de 1% de brometo de cetiltrimetil-amónia (CTAB) em Θ?7Μ NaCl a 65°C seguido de eKtrscçSo com clorofórmio/âlcool isoamílico. 0 DMA cromossómico foi digerido com as enzimas de restrição adequadas s o DMA cortada fai sujeito a electroforese em ®5ó% de agarose s transferencia para membranas de nylon» ft

Prepararam-se sondas de DMA a partir de preparações de plasmídeo purificada em CsCl par marcação através de incorporação ao acaso de desoKiuridinatrifosfato marcado com digoKigenina» As condições de hihridaçSoforam desenvolvidas de acorda com processo descritos em Molecular Cloninq (Maniatis* T« et ai» Cold Spring Harbor, 1982)« A detenção da DMA hibridado marcado com digoxigeni-na foi de acordo com o fabricante (Boebringer Mannheim).

EXEMPLO I

Qsnãinò£Mo.ÉÊJ!iBçM£^^lâãMâms.

ÇgnMQdo_Fun£ães_... de... Tonsposlçãa_,,MMlçadas

Como se mostra na Figura 2» pNKí21® foi usado como vsctor plasmídeo parental na criação de uma construção para inserir estavelmente uma sequência de DMA (e«g« um gene expressá— vel) no cromossoma ds uma bactéria gram negativa» pMKi2I® contem uma transposase controlada por um promotor tac» as repetições invertidas de Trri© e um gene codificador de cloranfenicol—acetil transíerase» pMK12í© deriva de pNKBòl (Way et alSena 32s369-379 (1984)) por substituição do determinante Kan ' com um fragmento de

__ P 13/4 pb portador do gene Cm" de Tn9„ A construção foi modificada

par remoção das repetições invertidas naturais de Τηίθ e sua substituição com u<n oligonucleótido especificando uma sequência invertida repetida compreendendo os 3í pares de bases terminais do extremo direito de Tnl 3 delimitando um único sitio de clonagem ÍFig. 3A) para. dar o olasmídeo pPX 1569, Um segundo oligormc 1 eotido adaptador <Fíg„ 3B> foi inserido para um plasmideo com vários sítios de clonagem <pPX1572> o qual foi ainda modificado por inserção de um determinante K.an‘‘ de Tn5 no sítio Xhol do pPXÍ5/2 = Nesta, configuração, os genes inseridos nos sítios de clonagem delimitados pelas repetições invertidas podem ser transpostos na presença de trs.nspcvssse s.oiiva.

Um ensaio ds conjugação foi realizado para verificar que a. sequência repetida invertida, derivada do oligonucleótido sintético de 31 pares ds bases do pPX1575 actua como substrato para. a transposase e dá casos de transposição» pPX1575 foi transformado em Fi12/CÓ0® α qual foi subsequentemente conjugado com E. coli KBTDD1 seguido de indução das funções de transposase com IPTB« A selecção dos exconjugantes Mal ou Kan“ de KBTDOi reveiau que aproxiffladaments 1® ~ exconjugantes Hal eram também Kan^ e Amp" e exconjugantes Kan^ eram Mal‘„ Uma experiência semelhante realizada com F112/C6®® transformada com um vectar semelhante sem as sequências repetidas invertidas deram exconju-gantes Mal mas nao KarV'» tstes resultados indicam que o determi— p nante Kan ' foi transposto para o factor F e a repetição invertida de -51 pares de bases, conforme esperado, é um substrato da transposase s

EXEMPLO 2

Vectores Suicidas......do Bacteriáfago lambda para Transposição em Salmoneiia

A libertação suicida, como aqui é usado» refere-se à introdução de um transposãa via uma construção de DMA recombinan-te a qual não se pode replicar no recipiente» Vectores piasmí-deos baseados em GolEi-pí5a~ e pSC 1 © 1 replicam-se livremente ís-m S» typhxmurium e na maior parte das outra espécies de Sal manei la,. Cama tal, estes vectores não slo adequados para a. libertação suicida de transposSes modificados em Salmoneila. Por outro lado d bacteriófago lambda não sofrerá ciclo lítico em Salmoneiia a menos que estejam presentes nus A= uma função do hospdeiro E» colí tipo selvagem que é necessária para a antiterminação da transcrição do DMA de lambda dependente da proteína N de lambda e 1 amBa qual έ necessária para a ligação do fago lambda» Em adição, o fago lambda não lisogeniza S» tvphimurium devido a necessitar do produto do gene nus A (Harkkirtol» Ssn, Senet» 2§9ϊ 6θ7~άί1 (1987))= Assim, os veículos do fago lambda não são propagadas em Salmoneila e podem ser usados como veículos de libertação suicida para mutagénsse com transposSss deste hospedeiro se o produto do gene lamB (o receptor da .membrana externa do fago lambda) for fornecido» Como se mostra abaixo na Tabela I? uma série de -estirpes do bacterióf ago lambda derivadas estirpes largamente estudadas de lambda gtll 15 du lambda NM8:l6 foi testada quanto à capacidade para formar placas (i»e»s sofrem crescimento lítico) em várias estirpes ds Salmoneila portadoras do plasmideo conjuga-tivo F112rfTη10(cm)= Se bem que capaz de formar placas em E. coli estirpe 1101061 nenhum dos fagos foi capaz de formar placas numa variedade de estirpes de Sa1mane11a» Não se compreende a razão pela qual os fagos (todos eles portadores da deleção nln-5) não formam placas em Salmoneila lamB+ (Harkki et al·. Mol. 0en=

Ggnet». 20V s 60/-611 (1V 8 / ) 5 = As versões modificadas deste bacteriófago portador de sequências de reconhecimento pela transposase e funções de trensposase podem ser usadas como sistemas de libertação suicida.

IhBEUL-1

Eficiência de Palqueamento do Bacteriófago lambda em Salfflanella s E,.......cpli S^. Si. Si. tvphimurium typhinsuriufis tisbi. E» .coli Fi12cm/ F112cm/ Fi12cm/ Hcieèi LBSeít SL3261 Ty523 x w. íTíLi O gtll 1 K 10A* <20 <20 <20 lambda NH816 1 10^ <2Θ <20 <20 lambda PBie®0, 5 K 10¥ <20 <20 <20 lambda PB1Ô31 7 >5 1Θ9 <20 <20 <20 lambda PB105 ~ ? ' 3 K 1Θ9 <20 <20 <20 lambda PB1073'í2 1 X 10¥ <20 <20 <2®

NetâSs 1 Derivados de lambda NHBlé

Fago especializado em transposição e transuçSo para a proteína CS de P. berghsi

Derivados de lambda gtll 4

Fago especializado sm transduçSo para LT-B

Ambos os fagos descritos na. Figura 4 foram modificados para conterem uma função de transposase e rspetiçSas invertidas de lD.10 delimitando uma marca seleccionàvel. Lambda P8100 foi construído por clonagem de um fragmento E.co RI de 5?2 Kb do DNA de ρΝΚ 121Θ5 contendo uns gene de transposase controlado pelo promotor tac« as repetições invertidas de Tnl0e um gene de

t w

í

cloranfenical-aceti1-transferass no sitia de lambda gtll. Os R lisogênicos Cm ‘ foram ssleccionados sm E. coil Υ1Θ88 na qual a transposase é reprimível pelo produto do gene laci contido no plasmídeo pMC9e lambda ΡΒ1ΘΘ pode acomodar a inserção até 2 kb de DMA estranha, lambda PB1©3 foi construído de forma análoga por subclonagem de um fragmento EcoRI de 5,2 Kb contendo a transposa-- se controlada pelo promotor tacuma repetição invertida de 31

P pares de bases derivada de Τη 1£ delimitando o determinante kan“ de tn5 e um sítio de cionagem múltipla? em sítios EcoRI de lambdaMMSlò, resultando na substituição do fragmento prescindível lac UV5. Os lisogénios Kan1' de T!C18ói ípMCT) foram seleccionados. Lambda PB183 pode acomodar até 7 Kb de DMA estranho.

Tais vectorss de fago lambdas 03 quais contêm o gene da transposase foram das repetiçSes invertidas que são o substrato para a recombinação especifica de sítio e transposição,. actuarão não sé como partículas de fagos transdutores temperados em E. COiLs como também catai içara a transposição de qualquer DMA (s.g.s um gene sKpressàvel> contido dentro das repetições invertidas. Uma vez que a gene da transposase está fora das repetições invertidas5 a inserção pode ser estabilizada, Devido a tais vectorss fágicos não poderem ser propagados eni Salmonel la lamB" ou outros recipientes 1 am.B~r, liticamente ou como lisogénios, o fago s consequente-menta a proteína transposase foi diluída no processo de divisão celular. Como a concentração da proteína transposase decresce,; qualquer transposao que tenha sofrido transposição do fago para o cromossoma hacteriano será estahilx-· & ed ο κ

Uma. sequência de DMA íe = g, - um gene ecipressável) pode ser introduzida entre as repetições invertidas dos vectorss Λ 'ν bacteriofágicos tais como os apresentados na Figura 4, Uma forma pela qual isto pode ser conseguido é pela troca de transposões plasmídeo-fagc< como se mostra esquematicamente na Figura 5, Uma sequência de DWA (e=Q=s um gene eKprsssável) foi clonado num veicula olasmideo (e.e, 5 pPX1575) de forma a que -a marca selec™ cionável e o gene eKprsssável fiquem delimitados por repetiçSes invertidas. Numa célula hospedeira., 1 isogénica para um fago do tipo descrito na Figura 54 s a recomhinação especifica de sitio ou transposição entre as repetiçSes invertidas do plasmideo e o fago lisogénico resultarão numa proporção dos lisogénios contendo o gene eKprsssável e a marca, ssleccionávsl do plasmideo, A proporção pequena do fago portador do caso de troca, pode ser seleccio— nado em hospedeiros E, coli por seiseção de lisogénios portadores da marca seleccionável originalmente associado ao plasmideo, 0 gene exprsssável não seleccionado está ligado a esta marca, EXEMPLO 5 j^.rmuM....PIamj^gQ/Fayg......dê..um Sane Expressável......em......E. coli_Delimi- j^áo_-£S£L-§g[gM^I£Ââg_!jÍÊ-^l£SilllM.!£j.íBgiLtQ.^gÍ.ã-.XíIâ.0.spg.sase LT-B pode ser e>; pressa em espécies de Sal manei la s mostrou-se ser ímunogénico em murganhos quando expresso e administrado em estirpes vacinais vivas atenuadas de Salmona1 la CClements et al., Infect, Immun, 55;665-692 (19S6)), h Figura 7 ilustra a construção de uma cassete genética transponívs1 portadora de uma sequência de DMA codificadora da subunidads B de 11ΘΘΘ dal tons da toxina snterotoxigéníca sensível ao calor de E. coli (LT-B). 0 gene que especifica a subunide.de não tóxica foi local içado num fragmento EcoRI/HindΣ11 de 6©« pares de bases em pPX1©© no qual a expressão de LT—B foi φ

controlada pelo promotor lac, a sequfncia do qsne correspondendo aos resultados .eonq st al» ílnfect. Immun,

Um f raqmento Hasϊ I de Ε'βθ oares de bases contendo a seouência codificadora de L)-B e o promotor lac foi subclonada no

;iO

Ba/nHIde pPX 15/5, o qual foi dotado de extremos cerses pela acçSo imerase 1„ LambdaPBí03 foi inteqra- do Tragiiiei * tu Kleno^i o a DNA-p do em 3Μ1Θ3 contendo o plasm 0 1isogénio resultante 1’DX 1: de transdos Í.Ç.3.Q de L i η pPXL ido a fazer • a transposi çSo pa rtículas fágicas foi inau . ' R .an , Cmb de JM103 foram S»1 Λ naaos. π te ji.· 5 tdS s pa *r ϊίϊιΟ

Bproximadamence 2oà as ......R ' _ ____.. :Onss transdutantes Kan t; Γ a (li uUpiDS 1isogéniDS es de ambos. Qs clones

Hf nhsm lisogénios simples portad foram considerados como do 1isogénio lambdaPBi㮄 Se bem que o determinante Kan p usado para. seleccionar permuta putativa, todos os clones Kan também expressaram LT--B por análise de transferência de colónias taao sugere qu.e -a jnado (LT—B) sofreu wiTl derivado por permuta de genes i repetições invertidas r". t\ j- vpob indução Cuís IPF8 e temperatura» hste f cassete de expressão do qens não selecc » 0 n DiT= «3 marca de resi s t« n c i a -à d j___ H* Kan'' foi escol hido e o fago o k de ía.qc 3s resulta nte (1ambdPBi 05) zotransposição como prevista Jm dos lisogénios resultant sor indução a 42°C* 0 stock usado para infectar S, typhimurium e 3 „_tyghi Conforme discutido anteriormente, tal construção serve como um sistema de libertação suicida. A construção 1ambdaPB1Θ5 não pode ser propagada, litica— mente ou como 1isogénio, em Sa1mone11a. No entanto, o gene da transposass será espressávs1 e como descrito no Exemplo 4, o qens □ a •"a o LT—B pode sofrer transposição com a cassete genética, cromossoma de SaImaneila. -s \

-s \ L.U ΉΡΙ

Iao5e^.slgLai Saimonena a) Selec£.ão......dejàasos. de_.j^anssosi£.|[o.. em S. typhimyrlum e S, typhi

De acordo com o esquema geral mostrado na Figura B? vários f agos especializados em transdução foram usados para transduzir S. typhimurium F112dTnie (cm/L.B501Q (lamB') ou S,

typhi F1 !2dTn 10 (cm)/Ty523 para resistência a. drogas,. A Tabela II mostra os resultados obtidos usando lambdaPBl®5. A frequência de

P transposição 'foi determinada por enumeração de colónias Kan ” de Salmonella após infecçlo com o fago lambda transdutante. lambda-PB 1Θ5 foi misturado com 2 x ίθ,_ células recipientes de Salmonella na <n»o«i. indicada, as quais foram cultivadas até meio da fase logarítmica na presença de 0S5% de mal tose para induzir o recep— tor do bacfcsriéfago lambda» As- células infectadas foram incubadas _ _ p durante ls5 horas a 3/°U para permitir a expressão de Kan" antes d a semen te í r a *

Como se mostra na Tabela II s S. tvphimarium resistente a drogas foram obtidos apenas em S,, typhiiTsu.rl.um 1 amB" mas não em lamB „ Para cada um dos fagos lambda surgiram clonss resistentes —Λ a drogas com frequências até 1® ‘ a uma m „ o „ i „ de ©2 partículas fágicas activas sm S. typhimurium F1 i2dtni€> < cm > /LB5®i0 e com uma frequência ma is baixa em S, typhi F112dTn ícm>/Ty523»

ΤΑ

Transposição em Salmonella Usando Fagos Especialisados em Transposição Portadores de Cassetes de Expressão de Genes Hetenólogos

Bacteriófaqo Dador Estirpe de Salmonella Kecipienta% F112cm/ FMI12/ lambda ΡΒΪΘ5 LB5Ô1Ô Ι.Β5Θ10 Tv523 Ii£523 m. o« i» = 2 4,0x10“° <lxl#“tó <1x1Θ_/ <ixl0~b m«o« i» = 2 1 ,Θχίθ"4 <1χ1β“Β 4η©χ1β“"/ <lxí0~tí ffl » Q . X » i52xléfa <ixie“tí 150μ10_Β <lxl0“S sem fago 15θχ1θ~4 <1χ10“ϋ 150χ1θ~8 <lxl©”8

b) Caraçle£ÍAãCÍS„.á:l^

P

Clones Kan" de 5. typhimurium LB5Ô1® (1amB ) que surgiram após infecção com lamhdaF^BieS foram caracterizadas reiativamente â eKprsssão da marca não seleccionada e à localização cromossómica da análise de transferência. Southern» A transferência de BWA cromossómico digerido com Kpnl despistado com DMA

— R de pPX lo?’? biotínilado revelou que cada um dos clones Kan surgiu de casos de transposição separados, uma vez que cada um dos clones tinha uma única cópia do transpasão em loci ao -acaso

O no cromossoma.de S„ typhimurium=» Ainda s cada um dos clones Kan‘‘‘ expressou o antigénio LT~B como determinado por análise de transferência Western» A expressão do antigénio LT-B foi controlada pelo promotor 1acUV5 que é não é controlado quando introduzido em Salmonella que seja deficiente em genes do metabolismo da lactose» Um cisne sm particular expressou mais antigénio do que os restantes '? clones analizadoss sugerindo que pode haver

- X efeitos posicionais na expressão ds genes estranhas integrados ao acaso no cromossoma de Salmonella- O Estirpes de Vacinais de Salmonel,1a. Atenuada. Exoressando.....os

Sgnss Integrados 0 derivado LB5Bs.B de S» typhimuriuffl LT2 è uma estirpe de laboratório de Salmonella que tem algumas características convenientes para a manipulação de genes em Salmonella» LB50I6 é transformável com elevada frequência com DMA de plasmídea s, devido à sua deficiência de restrição, pode aceitar DMA propagado em Escherichia coli. Mo entanto, não é por si só uma estirpe candidata a vacina- Para criar candidatos a vacina de Salmonella viva atenuada, o fago P22 HT intlBS foi propagado em derivados FÍÍ2dTnÍ0 (cm)/LB5i®í contendo LT-B expressando trsnsposões modificados e usado para transdusir várias espécies de Sa1mone11a px deficientes aroA para Kan '« Obtiveram-se os transdutantes de S» typhi Ty523, S. dublin SL1438 e S» typhimurium SL3261- Encontrou--se que cada um dos transdutantes das diferentes espécies expressam LT-B e ainda, se o,locus no qual LT-B foi integrado em LB50Í0 deu maior expressão do antigénio, maior expressão do antigénio foi também observada nos transdutantes» isto indica- a probabilidade da iransdução das cassetes de expressão com LT-B inserida, a qual depende da. recombinação homóloga, em loei idênticos noutras espécies de Salmonella»

Como sistema de libertação alternativo, o transposão LT-B foi integrado em várias espécies de Salmonella usando factares F? sensíveis è. temperatura,·. Os factares F5 termossensi— veis repiícam-se num número limitado ds espeécies de bactérias gram-negativas, incluindo Salmonel 1-5» a baixa temperatura mas não se replicam a temperaturas elevadas» 0 factor F?' sensível à temperatura contendo um Tnl® intacto para fornecer a função de

ο

- ρ transpasa.se5 α operão lactose e α transposão LT-B Kan ' fai isoaldo em E. coli e depois foi introduzido em S«__typhimurium _ p LB5010 por conjugação a partir de fc.„ coli e selcçla tíe Tet"' s p utilização de lactose a temperatura baixa. 0 transposão Kan'' LT-B foi construído primeiro em £., coli por transformação de uma estirpe F? ^iacTniO com o plasmídeo pPX1579» A transposição de LT-B para o factor Fs foi induzida com IPTG e seleccionados os p p ^L. exconjuqant.es Kan % Tet ', Lac’ numa cruzamento com £, coli ΚΊΒΤΘ€?ί» Os Fg, lacTnlff portadores do transposão LT-B Kan1’ defec-tivo foi subsequentemente introduzido em S, typhimurium LBSOiO por conjugação» 0 factor F5 em S, tynhlmurium Ι.Β5Θ1Θ foi então introduzido sm S» typhi Ty523 (3, dublin SL143S) e S, typhimurium p £? •SL32Ó15 por conjugação seleccionando exconjugantes Kan" Tet" Lac e contrã-ss 1 sccinatíos contra a estirpe- dadora LB501Ô» Os casos de transposição de LT-B foram seleccionados em cada uma destas

— R S estirpes por sei seção de colónias Lac 5 Kan’ 5 Tet". após 40 gerações de crescimento em caldo sem selecção com droga a tempe-ratura elevada C42’-C) » Todas as colónias Kan" Tet° Lac que se presumiu terem perdido o factor F5 por segregação, expressaram LT-B conforme determinado por transierfncia de colónias para o antigénio LT-B, A transposição dos transposSes modificados do factor F sensível â temperatura está dependente da transposass fornecida por Tη1& também situado no factor F, d> i.gjbab.411dadg da Transposição

Os transposSes modificados não sofrem nova transposição para outros loci pois a função de transposase que normalmente é codificada pela repetição invertida direita de Tnl© está -ausente. Ainda, a transposição em Salmonella é estável pois nunca foram detestados os elementos 1810 í i»e,5 ausfncia de genes tíe transpo-sase constituintes), os -quais foram 'detestados em numerosas estirpes de E^mlis em SaljgDnella typbimurium (Klecknsr et al..

>ν

Mofaile DMA, ASM Publications, Washington D»C = (1989)}= Em adição, os casos de transposição estável resultarão na expressão cie genes que seriam inerentemente estáveis quando comparado com cópias do mesmo gene inseridas em plasmídeos» as quais podam ser perdidas na ausência de selecção positiva devido à segregação natural do piasmídeo ou devido à selecção da perda da plasmideo devido aos efeitos deletérios da expressão do gene»

I

Para testar a estabilidade de transposões expressando LT-B, um isolado SL32613 lambda 3 isolado por transduçSa com P22 dos segregantes de F112dTni0(cm)/LB501S (lambdaS) foi crescido em caldo L sem canamicina durante 4€> gerações como se mostra na Tabela III,. Para comparar, pPX:l®0/SL32ól (um derivado do piasmídeo pUCS expressando LT-B) e pUC8/SL326I foram também cultivados sem selecção com ampicilina durante 4® gerações em LB» Mo primeiro exemplo, partindo de culturas de SL3261 (lambda 3) 100% das colónias que surgiram no agar LB eram K-an e expressavam o antigénio LT-B? igualmente? não houve diferença no número da colónias recuperáveis por sementeira directamente em LB contendo canamicina ou sem ela» Por outro lado, apenas 3% das colónias da cultura pPXl®®/SL32òl sua apareceram em meio LB após 4€> gerações de crescimento sem seiseção com droga e por sementeira directa apenas 3% das colónias capares de crescer em agar LB foram recuperáveis em agar LBcontendo ampicilina» Ainda, não houve decréscimo .aparente na expressão genética de LT—B em culturas de lamoda 3 reiativamente a pPX100/3L32óí» Isto indica que d acontecimento transposição deu expressão estável sem selecção nas condições de cultura numa estirpe- vacinai atenuada de Sa 1 mone 11 a

TABELA III

Estabilidade do Plasmídeo de EKpresslo LT-h varsus LT--B Integrado no Cromossoma % os Retenglo nas Condições de Cultura após 46 6-sraçoss de festiT.m Baçteriana Passagem (% Eapressando.LT^il

Meio Meio Def inido Definido + Droga pUC8/SL32él 93%(Μ/A) 1.66% pP X166/BL32ó1 3% (3%) i@©% SL326Ílambda3 166% <10©%) 106% e> Estabilidade da Expressão senétiça_da_Estirjge.....yaoinaI. de

Salmonella Contendo o TranspgMo i-T-B

Um iransdutante isolado de SL3261, uma estirpe vacinai arofi de S* tvphimu.riurn„ foi esaminada ralativamente à -retenção da expressão de LT--B após imunização de. murganhos Balb/c com uma 9 única dose de 16' bactérias per os (oralmente)* Como testemunhas, 9 grupos separados de muragnhos foram imunizados oralmente com 1Θ' pUCS/SL3261 ou í€C pPX16ô/SL32ói» salmonelIa foi cultivada s partir da homogenatos de fígado, baça ou nódulos linfáticos isolados obtidos a partir de murganhos imunizados e a proporção de organismos contendo plasmideo ou de organismos contendo transposSes foi determinada >.

Como se mostra, na Tabela IV, obtiveram—ss muito poucas salmonelas derivadas de homogenatos de tecidos de murganhos imunizados com pUC8/SL32òI ou pPXÍ6Ô/SL32Ó1 e daqueles apenas uma pequena percentagem apresentou plasmídeos da dose de vacinação

oriqinal.. Vários foram dissecados nódulos linfáticos nus rodsavaiB o intestino de cada um dos animais vacinados no dia 16 ou no

Uai. Urfí X w.Ir· j dia 15 após vacinaçlú

As amostras de nódulos linfáticos foram homogenisadas e amostras em duplicado semeadas em meio LB ou LB* droga selectiva. Por

I ou t ro 1 ado, mur ga con tinha. m o? rgan ie? Aio* da Ί : 000 das ] amo C2 de org 3o- aca 50 de 26 iso 1 -5j Est re sul-1 tado 5· ri com 109 BL32Ó1CIasnbda3> e 15 após vacinação, las por sementeira de 3o o. 0 an t igênio LT-B. .“.r de uma ΙλΠ ICâ cópia de um an tigénia pode

Kan" mostraram sk* •incc i- cr·. m iq r· i rvf c. Γ0 1 x. · 3. l. i va de cóQíe.s da mesma cassete de sor pia smídeos no conte: sto de uma estirpe vacina1 viva de 8a1mcne11a,

TABELA TE* siahiI idade das Formas Integradas ds Após Vacinação Oral de Murganhos

Estirpe VcíC XI l-ck 1 Dia Í0 υχa lo Animal# 1 Ou· al DroqaR % jnta i Droaa**' /* pUCS/SL3261 1 2 160 1 j i 1 ΦΦ *“? 0 0 0 0 - F 1 t 100 158 3 fjp X1ΘΘ / SL32Ó1 I T; 7ξ 100 59 *£? 0 2 36 0 Θ 44 0 0 -n* •20^· X*"t 0 0 C-Ί - SL326Ílambda 1 í J Λ 612 100 0 L'7 - 2 36Θ 100 103 106 100 o λ cr y 4jo 456 100 102 102 1ΘΘ ΐ) Trans posx c S r| ... .-¾ et-es de ΕΚΟΓΕ5Ξ ão Contendo p r o ra a t o r e s A 3. tornados e Sinais j Reoul adores de Genes a ρ r e s e n t a d o atí á.‘=. pctra a B pQOE S6?f~ aplicado de um ρ res sa o b c: entro 1 âve 1 por

9

i jjJ f. ável de u.fn an •S. outr as prot ScXi iais regu. Iadores di i-cs.0 [jp genes,. P dest Q ÍI>É todo pa ra :D de pr*Q tBinas ou d la, C Λ 3 setes d orte 0 w !3⣠tsr* X DT vârxos sxnax- 'âriDs exemplos da çSes de nanes- para tirpe vacina1 viva contendo o promotor esquerdo forte do bacteriófago lambda CF*, ) foram incorporadas em pPX1075 e os derivados Kan ' de iamhdaPBi04 foram obtidos por permuta m. plasmídeo-fagc ‘"-'Λ',

De forma seiseIhante? como se mostra na Figura 6,, α antiqénio de superfície ρ-rotector (proteína CS) de· um parasita de malária nsurina, Flasmodium bera hei» foi expresso num vector de ’-sa ! j_ “ uma série de con^xirutp, rj·_ _ de plasm quais a totalidade da sequência C DQ X T X C β.Ο ora do gene herqhei foi inserido no vector de e>: pressão oP* Λ 1 Ò t5 C O 01

OsTi Ο μ rOiBQ— ierqhsi esta de Cell» Biochem. 6s39é>5-3972 tor = A sequência do gene da proteína Cb" de F acordo com Eichinaer et al. u ΙΊΟ i ( 1 V bí (Z‘ ) ) a A casswte para íz\ tfxpressãu do gene CS estava contida num fragmento de restrição BamHI de 2S3 Kh q us f o i su bc 1 on a d ο η o sítio BamHI do vector de transposição pPX 1575» 0 plasmídeo resultante foi usado para transformar um a estirpe hospedeira 1 λ. sog én i c a para lambda PBj.04» lambda ΡΒ1Θ4 der a vou de 1 Sítíhd aPB 1 d3 por permuta com CmR de PMK121-3» As ρar t i cu1 as τ-áqícas que troca— ram o determinante !<snu situado n.o η I a 1 smideo foraíB R Cm° portadc COÍBO 1 X ‘5- O Q C' O Í. 3.0 1·-. Xl O = do gene CS ρroteina CS incorporaàa eift pr λ i O / 5 deu lambdaPB107.

Para se obter as estirpes hospedeiras de E» coli nas quais estão reprimidos a promotor PL e a promotor lac UV5» qualquer um dos plasmídeo pMc9s que contêm D gene laci num p1asmídeo pBR322» foi usado para t ran sformar L· n coli Ν99οΓ ou lambda gtií foi 1 isogenícado em ou JM189. „ A s construçõe e de d1asmí dsos inicia is para a e>tpres são de CS de P» berqhei em pPX1575 foram recuperadas em E* coli ϋίίίθ3 (lambda gtíl) para controlar a expressão das funções de transposição pelo promotor tac e possíveis s i 01 XíJht- 7 ϋ idiciais rf p PL da proteína CS em Ecoli» f~] /d j·" vados cassetes de ex P 'f -0 é;1: Ό d B. p roteína CS f: íxpressso proraovid;

[JU foram 1isogsnizawQs com lambda P.tíi%?3 para criar uma estirpe duplamente lisoqénica para lambda gtií e lambda ΡΒ1Φ3 parai a reacção de permuta» Os lisoqé-nios lambda PB1<?3 de JHÍ03 não são hospedeiros adequados paira, reprimir a expressão de genes controlados pelo promotor PL pois ' /

lambda ΡΒ1Θ3 contem a região de imunidade do fago 21= Os lidsoqé-nios duplos foram induzidos para as funções de-· fago por mudanças de temperatura das culturas candidatas e os lisogénios í<an'' foram 4* p* q seleccionados em N99cl‘ <pMC9). Os lisogénios que eram Kan” ε Cm'" foram retidos como candidatos e presumiu-se terem surgido por ' permuta das cassetes de expressão com P, transportadas pelos plasmídeos e marcas ssleccionáveis flanqueadas por repetições sintéticas invertidas com a região da repetição invertida de lambda PBÍB3 . Φ W' 9> ygl.CUlas^e_Xlonaqem..no Baçteriáfago lambda ...para. Dar

Directamente Origem a Linhas Especializadas ...na......Transgosiclo £õm....Faqos

Criaram-se derivados de lambda gtíl e de lambda NMS16 os quais são vectores de clonagem adequados para a geração do fago lambda que pode ser usado directamente para a inserção de genes expressos em cromossomas de outros organismos usando técnicas de ”splicingn convencionais em lugar da permuta de transposões lisogânio-plasmideo» Isto é conseguido por subclona-gem da região laca de pUClB no sitio BamHl do pPXÍ575? seguido da clonagem de um adaptador no sito Xoaí da região do poliadapfcador de pUClB» Tais adaptadores podem codificar a leitura na mesma grelha do peptideo laca e? por exempla, qualquer um ou todos as sequências de reconhecimento por encimas de restrição que de outro mod-o não estariam presentes no baçteriáfago lambda» A região do adaptador de pUClB modificado pode ser subclonada como um fragmenta HaeII de 4ββ pb no sitio BamHl preenchido do pPX1575= Por permuta desta região modificado do pUClB para lambda PB100 (um derivado -de lambda gtli) ou lambda PB1@3 (um derivado de lambda NíiSIé), são gerados veículos de clonagem em lambda de forma que os antigénios ou proteínas podem ser danados em

qualquer um dos três sítios de clonagem únicos usando adaptadores adequados por despiste relativamente à expressão da proteína ou da inserção do DMA clonado por interrupção da função laca num fundo genético JM103 ou JHÍ@9, desde que esteja presente a mutação hf1 para elevada frequência de lisagsnizaçSo* Os faqos resultantes podem ser usados direclamente na construção de estirpes vacinais vivas únicas sem a necessidade de passos de ex pressão separados *

Isolou-se a caracterizciu-sa um faacteriófago lambda semelhante aos descritos» 0 bacteriófaqo lambdaPBIià foi isolado por permuta piasmidea-lIsogénio como descrito atrás usando pPXi5’?i como veículo plasmídeo e lambda PB 104 como 1 isogénio, 0 bacteriéfago lambda ΡΒ1Θ4 derivou de lambda PB:l Θ3 por permuta da resistência á canamicina com resistência ao cloranfenicol. Assim, lambda PB104 ê um derivado de lambda NiΊ816 contendo a transposase Τη1Θ controlada peio promotor tac situado fora das repetições invertidas de Tnl® que delimitam o gene da cloranfenicol—aeetil---transferase. 0 plasmídeo pPX159í foi isolado como se segue. Um fragmento BaslI de 4£# pares de bases isolado s partir do plasmídeo pUC18, dotado de extremos cersss cpm polimerase ds T4, foi clonado no sitio BamHI do pPX1575 tratado com a enzima Klsnow, Este vector intermediário, designado pPX1575, continha o peptídeo lacae d sítio de c: 1 onagem múltipla do pUCISum determinante de resistência è. canamicina, delimitado pelas repetições invertidas sintéticas de 31 pares de bases de Tnl®,, Este plasmídeo foi digerido com Xjbal e o oligonucleótido adaptador de cadeia dupla, a prssentado na Figura 9, foi inserido.

Este oligonucleótido, quando inserido na orientação mostrada na Figura 9 no sitio Xbal do pPX1577, deu um plasmídeo que continha um peptideo 1aca funcionalmente sctivo que complemento a deleção iacZCHlb) de E, coli JM103, As colónias que tinham o aligonuclsótiod adaptador na orientação oposta deram um peptideo laca não funcional» 0 plasmioeo resultante, designado pPXi59i, continha sitios de restrição únicos Notl e Sfil e ainda um sitio único Xbal regenerada no extremo 35 do adaptador» A sequenciação do DNA usando iniciadores convencionais para M13 r ενe1ou uua O uliqui nucleótido x π se r x d u e =-1 a v a _________x__ .· Γ Γ j~" ?*"« J [ } jwi i n d i c ad o» Pa rs isola r lambda PBi13« E. coli u Μ1Θ3 con pl"' X i 591 f o i infectada com lambd a PB104 resistente e.o cloran col a 36°C em cultur as OvD C -3.1 do na fase logarit mica indu ;oína pa. ra o receptor de lambda por inclus-So de Φ92Χ de mal ϋ as culturas atingiram a fase 1 ogariimica tardi Cí tf foram pa. ra 1isar por choque térmico a 42 °C» 0 lisado de f ago’

te foi usado para infectar uma cultura fresca de JM163, a qual foi subsequen temen te seieccionada rels.tivsifisnt.e 1 isogèn ios resistentes ã canamicina oue formaram colónias azuis em aqar LB contendo 2' 00 ffli c rog ramas de x-yãl μυΓ ml. Um lisogénio transduziu 3 resx s 11nci a è canamicina com ele v-3.da frequSncia designado lambda PB113» Q DNA isolado a ρ erti f' tifc?™· ts bacteríó que como colóni as Ο X ΓΌ E. coli lambda„ Assim, lambda PB1I3 tem propriedades que permitem a clonaqem de fragmentos de DNA como seja um fragmento que pode ir até 7 kilohases nos sítios únicos Notl e Sfil deter.tado em liso-génios resistentes à canamicin· brancas em meio contendo X—qal usando α hospí de uma d θ1bç3o 1ac iSo do i JpJh inssndo clanada se o UMA inserido estiver na cia reiau vamen r.e ao pepcioso adequados. 0 fa.gu tem ainda a ;A c X Bf \ -3. d Ο E>£r Γ Bfíi esssnci a1men as XnSBf”ÇofíS uS DNA ex press· 10íTl ssr ?Kaminadas por integração estável num cromossoma hospedeiro •elha de leitura correcta r os s: c5© S: _ ______________ bacteriano

Um lisogénio £. coli JMÍ03 portador do bactsriófago lambda FBI13 foi depositado na colecçlo de culturas do National Regional Research Laboratory íMRRL) e foi-lhe atribuido o MQ ds Acesso B-1SS71.

Transposição em, Haemophilus influenza

O A transposição de Kan“' de pPX1575 foi testada em H,= influsma Rd estirpe HD685» Este plasmideo deverá actuar como um sistema de libertação suicida, em H. influensas·, pois encontrou-se que os plasmidsos derivados ds colEI não se replicam em células de H. influenza (Danner e Pifer, Gene 18 s 101.-105 (1982))=, 0 D NA de plasmídeo foi introduzido em células ds H. influenza por electraporação econtados os recombinants-s Kan1 . Conforme resumido na Figura 1θ5 ρΡΧ1575 (?- 1Θ microgramas) foi adicionado a células HSD85 de Hinfluenza, as quais foram sujeitas a elsctroporaçSo p nas voltagens indicadas. 0 número total de microcolónias Kan por ml da mistura de electroporaçSo foi representado em função da voltagem de electroporação. Nas condições usadas., obtiveram-se

R ~ p derivados Kan ' de HDB85 com transduçlo óptima para Kan a ?ί3Θ

Kilovolts/cm.

Quando as misturas de electroporaçSo de H„ influsnsa s p-PX 1575 foram semeadas em meio selectivo, era visível um grande número de microcolónias após 24 horas. No entanto, a maior parte destas colónias nlo cresceu mais e não voltaram a crescer quando subcultivsdas em placas de canamicina. No entanto, após 72 horas, 1-27 destas microcolónias desenvolveram colónias de H=.- inf 1 Pencas aparentsmente normais. As células retiradas destas colónias tornaram a crescer sob selecção com canamicina. NSo foram ΐ ’ - ' ΰ/>

observadas microcolónias e não foram obtidos rscombinantes Kan estáveis quando as células foram electroporadas com o DMA vector ou quando as células e pK1575 foram misturadas mas não elecfcropo-radas „ EXEMPLO L· JJiD§B8sigI.o Bordetella Fertussis » fi transposição do determinante Kann contido dentro da sequência de repetição invertida de 31 pares de bases do pPX1575 foi demonstrada em B. pertussis estirpe BP37S. O DMA de plasmídeo foi introduzido em PB370 por slectroparaçSo» Os casos de transposição foram seleccionados semeando as células electroporadas em

R meio selectivb contenda canamicina» Surgiram microcolónias Kan1' com uma frequência superior a 1 por 1Θ'"' células viáveis e foram visiveis nas placas de selacção dentro de 48 horas após sementeira» Estas colónias foram ainda crescidas individualmente em placas de canamicina e placas contendo ampicilina para testar a transmissão do veiculo plasmídeo,, Das 75 colónias bemolítieas

p Q

Kan1' testadas,, nenhuma era também Amo17 Do mesmo modo, células electroporadas foram semeadas em meio contendo ampicilina para examinar a transmissão transitória da veículo plasmídeo» 0 número

R de colónias Kan que surgiram nas placas de selecçlto foi 1ΘΘ& vezes superior ao número de colónias que surgiram no meio conten-do ampicilina. A baixa frequência de transformant.es Amp resulta da. transmissão instável do veiculo plasmídeo nas células recipientes? aproximadamente Í5% dos clones Amp^eratn simultaneamente Kan % sugerindo rearranjos de plasmideos nas células recipientes como consequência da expressão da transposa.se Tniô. Estes dados indicam que da transposição especifica, resulta uma frequência de transformação elevada de B. pertussis com DMA incapaz de replicar

:do ma ter ia q jC\ ·“, çpt cc di estave 1 βι«ιite dentro das cêiuioss recipientes mas tendo genético seleccionável contido dentro dos 31 pares DMA da repetição invertida Τη1β =

Sw/ é possível LíSâ Γ d vector de clonaqem ρΡΧ 1575 H OU S8US d « r x v a d o s adequadam ente iTiOd x τ xcaoos para con ter ©fíi sítios de restrição ú.n i c os a d i c iona is e outras o ... __ ^ ^ c. n i v* a.s descritas atrás», para inserir ao acaso DNA modificado da toxina pertussis directemente no cromossoma de B„ pertussis» Numa aplicação ideal desta ideia, mutações especificamente conseguidas por de1seção» ou inserç π a. ma das 3. reduzir or de transdosic3o * For d κ pertussis sssenc ial- subunida.de Bi do oporão da toxina, pertus— rsauzir geneticamente a actxvidade tóxica da toxina pertussis,,. ainda que retendo a capacidade para formar holotoxina, pode ser clonada juntamente com o seu promotor nativo em sitios de clonagem adequados do vi electroporaçSo de tal DNA no hospedeiro B„ pertussis mente destituído de todas as sequência s do operão da toxina Ou* nospeoeiro e sexec :cionando a marca cotransmi tida podem se r obtidas uma ou mais i n se r c Ses ao acaso qo oeserão itioqxt içado« rotina,

Eqmvalen i. escapastes de conseguir us-anoo n*ao maxs do que expíerirrientac-so de muitos equivalentes das realisacões especificas do inventu aqui descritas» Pretende—se que tais equivalentes sejam abrangioos pelas rexvxnoicaçoes que se sequem,. \_y

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES 1 *. - Processo para a obtenção de uma construção de DNA adequada para introdução de uma sequência de DNA no DNA constituinte de uma célula procariótica, caracterizado por compreender a ligação de um gene codificador de uma proteína transposase em cis a uma cassete transponível, compreendendo a cassete um par de sítios de reconhecimento pela transposase delimitando o sítio de clonagem para inserção da sequência de DNA, mas não delimitando o gene codificador da proteína transposase. 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a cassete transponível compreender ainda uma marca seleccionável e a sequência de DNA, sendo tanto a marca seleccio-nável como a sequência de DNA delimitadas pelos sítios de reconhecimento pela transposase. 3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sequência de DNA ser um gene expressável derivado de uma fonte seleccionada a partir do grupo constituído por fontes bacterianas, virais, parasitas, fúngicas e mamíferas. 4*. - Processo de acordo com as Reivindicações 1-3, caracterizado por o par de sítios de reconhecimento pela transposase sereih idênticos ou substancialmente homólogos e funcionalmente equivalentes às sequências de reconhecimento pela transposase de um transposão procariótico. 5a. - Processo de acordo com as Reivindicações 1-4, caracterizado por a célula procariótica ser uma bactéria e por a sequência de DNA codificar um antigénio capaz de estimular a resposta imune. -53-

   6a. - Processo de acordo com a Reivindicação 5, caracte-rizado por a bactéria ser uma bactéria entero-invasora atenuada, seleccionada a partir do grupo constituído por Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri, S. dysenteriae, Campylobacterium jejuni, Vibrio cholerae, Bacille Calmette--Guerin, mutantes avirulentos de Mycobacterium bovis, Salmonella thyphimurium-, Salmonella gallinarium, Salmonella cholerae suis. 7a. - Processo para a obtenção de um epissoma adequado para a introdução de DNA no DNA constituinte de uma célula procariótica, caracterizado por compreender a ligação de : a) um gene codificador de uma proteína transposase; b) uma cassete transponível ligada em cis ao gene codificador da proteína transposase, compreendendo a cassete transponível um par de repetições invertidas delimitando um sítio de clonagem múltipla e uma marca seleccio-nável, mas não delimitando o gene codificador da proteína transposase; e c) um replicão tendo uma origem de replicação que é substancialmente homóloga e funcionalmente equivalente a uma origem de replicação procariótica. 8a. - Processo para a obtenção de um derivado de bacteriófago adequado para introdução de DNA no DNA constituinte de uma célula procariótica, caracterizado por compreender a inserção, num hospedeiro bacteriófago, de: a) um gene codificador de uma proteína transposase; -54- b) uma cassete transponível ligada em cis ao gene codificador da proteína transposase, compreendendo a cassete transponível um par de repetições invertidas delimitando um sítio de clonagem múltipla e uma marca seleccio-nável, mas não delimitando o gene codificador da proteína transposase; e c) uma origem de replicação que é substancialmente homóloga e funcionalmente equivalente à origem de replicação do bacteriófago. 9a. - Processo para a obtenção de uma vacina viva, caracterizado por compreender a inserção, no DNA constituinte de uma bactéria atenuada, de uma cassete transponível contendo um gene codificador de um antigénio com interesse. 10a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, para a obtenção de uma vacina para administração a seres humanos, caracterizado por a bactéria ser seleccionada a partir do grupo constituído por Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Campylobacterium jejuni, Vibrio cholerae, Bacille Calmette-Guerin e mutantes avirulentos de Mycobacterium bovis, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarium, Salmonella paratyphi e Salmonella cholerae suis. 11*. - Método para a introdução de uma sequência de DNA no DNA constituinte de uma célula procariótica, caracterizado por compreender os passos de: a) introdução de uma construção de DNA na célula procarió-tica nas condições adequadas para transposição, a construção de DNA compreendendo um gene codificador de uma proteína transposase ligada em cis a uma cassete -55- transponível, a cassete tendo um par de sítios de reconhecimento pela transposase delimitando a sequência de DNA; e b) identificação de células recipientes tendo a sequência de DNA inserida no DNA constituinte. 12». - Método para a introdução de uma sequência de DNA no DNA constituinte de uma célula procariótica num local genético previamente determinado, contendo a célula procariótica um transposão residente no locus genético pré-determinado, caracte-rizado por compreender: a) a introdução de uma construção de DNA na célula procariótica adequada, a construção de DNA compreendendo: i) uma cassete genética transponível. tendo um par de sítios de reconhecimento pela transposase delimitando uma marca seleccionável e a sequência de DNA; ii) um gene codificador de uma proteína transposase ligada em cis à cassete transponível, reconhecendo a proteína codificada reconhecendo os sítios de reconhecimento pela transposase presentes no vector e os sítios de reconhecimento pela transposase do transposão residente; e b) a identificação de células procarióticas tendo a sequência de DNA inserida no DNA constituinte da célula procariótica no local genético pré-determinado. Lisboa, 26 de Setembro de 1991

   RUA VICTOR COROON, 1G-A 3.» 1200 LISBOA