PT99114B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais dirigidos contra complexos formados por trombina e inibidores de trombina - Google Patents

Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais dirigidos contra complexos formados por trombina e inibidores de trombina Download PDF

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Jean-Marc Schlaeppi
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Description

Ο invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e seus derivados, processos para a sua preparação, linhas celulares de hibridoma secretoras dos referidos anticorpos monoclonais e processos para a preparação das linhas celulares de hibridoma. Ainda, o invento estã relacionado com a utilização dos anticorpos monoclonais e/ou seus derivados para a determinação do complexo trombina/hirudina assim como kits de testes compreendendo os referidos anticorpos monoclonais e/ou seus derivados.
Fundamento do invento
Um sistema hemostãtico que funcione eficazmente é de necessidade vital para o organismo dos mamíferos. Nos organismos saudáveis, os defeitos do sistema vascular sanguíneo, e.g. lesões vasculares, são reparadas num processo de dois passos: a agregação dos trombócitos é seguida da formação de um coágulo de fibrina numa cascada de enzimas com a participação de vários factores de coagulação do sangue. A maior parte destes factores são proteases serina, por exemplo trombina que cataliza a reacção do fibrinogénio para dar fibrina. O sistema de coagulação é contrariado pelo sistema fibrinolítico envolvendo entre outros a protease plasmina que cliva a fibrina. Os sistemas de coagulação e fibrinolítico estão geralmente num equilíbrio dinâmico. No entanto nos casos em que o potencial fibrinolítico do organismo é perturbado ou insuficiente, por exemplo em doentes que sofrem de tromboembolismos ou complicações pós-operatõrias, é indispensável dar ao organismo anticoagulantes para evitar a formação de fibrina e de agentes trombolíticos para dissolver os trombos formados.
A hirudina, um anticoagulante que ocorre naturalmente nas sanguessugas (Hirudi medicinalis), é um inibidor potente e i
específico da trombina, evitando a clivagem do fibrinogénio e subsequente formação de coágulos de fibrina. A hirudina reage muito rapidamente com a α-trombina para formar um complexo não covalente muito forte (K^« 1-0,01 pM) que é extremamente estável e enzimaticamente totalmente inactivo. Forma descritas várias variantes da hirudina estreitamente relacionadas, cada uma delas contendo 65 ou 66 aminoácidos, por exemplo as variantes designadas hirudina variante 1 (HV1), hirudina variante 2 (HV2), hirudina variante PA (HV3) e des-(Val)2-hirudina. As variantes diferem umas das outras numa série de aminoácidos, mas todas têm em comum uma acumulação de aminoácidos hidrofóbicos no extremo N, uma acumulação de aminoácidos polares no extremo C, um resíduo tirosina (Tir 63) presente como mono-éster de sulfato, três pontes dissulfureto e a actividade anticoagulante. Recentemente, foram clonados cDNAs e genes sintéticos codificadores da hirudina e expressos em hospedeiros microbianos. As variantes de hirudina recombinantes não possuem o grupo monoéster de sulfato em Tir63 e são portanto também referidas como dessulfato-hirudinas. No entanto, elas apresentam propriedades biológicas pelo menos equivalentes às das hirudinas naturais sulfatadas.
A hirudina tem um grande potencial para futuro uso terapêutico devido â sua inibição selectiva da trombina conjuntamente com a sua baixa toxicidade e a ausência de efeitos secundários imunológicos. No entanto, a aplicação terapêutica de hirudina com êxito também requere um sistema para controle da actividade assim como do progresso da terapia. Ainda, é desejável poder-se determinar a necessidade real do tratamento com hirudina. Uma solução para estes problemas seria o desenvolvimento de anticorpos contra o complexo formado pela trombina e hirudina que poderão ser empregues para detectar a formação de trombina mesmo em pequenas quantidades.
Objectivo do invento
Constitui um objectivo do presente invento produzir anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexotrombina/hirudina. Este objectivo é conseguido usando hirudina acoplada a um veículo adequado ou o complexo trombina/hirudina para imunizar um mamífero adequado e fundido as células secretoras de anticorpos do referido mamífero com células de uma linha celular contínua, produzindo assim células de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais pretendidos. Os anticorpos monoclonais do invento são úteis para uma série de fins de diagnóstico e terapêu ticos, por exemplo para a detecção precoce da formação de trombina e trombose.
Descrição do invento invento diz respeito a anticorpos monoclonais dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e seus derivados que retêm a especificidade do anticorpo de onde derivam.
No presente pedido de patente, o termo hirudina, quando não seja de outra forma especificado, destina-se a englobar (1) todas as variantes naturais ou sintéticas e derivados de hirudina, tais como fragmentos da hirudina e (2) toas as variantes de hirudina recombinante (dessulfato-hirudina) e derivados de hirudina recombinante (dessulfato-hirudina), tais como dessulfato-hirudinas encurtadas no extremo C, as quais estão descritas na literatura iu são obtidas por métodos de tecnologia de DNA recombinante.
Sao exemplos de tais hirudinas:
- χ’ - (a) uma variante da hirudina do tipo HV1 com a fórmula
H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40
-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60
-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-OH, (I) em que (dessulfato-hirudina)
- (R) é o grupo hidroxilo fenólico da Tir
ou um grupo -O-SO3H, e/ou
- LÍS27 é substituído por Ile ou Glu ou
- Lis36 é substituído poe Ile ou Glu ou
- LÍS47 é substituído por Ile ou Glu ou
- His51 é substituído por Leu ou Asp ou
- Vall-Val2 são substituídos por Tre ou
- Vali é substituído por Leu e Val2 por Tre
- a molécula completa é encurtada por Gln65 ou ou por Leu64 e Gln65;
(b) uma variante de hirudina do tipo HV2 com a fórmula
H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (II)
-Gly-Ser-Asn-Gly-Lys-Gly-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser60
-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln-OH, em que
- (R) é o grupo hidroxilo fenólico da Tir (dessulfato-hirudina) ou um grupo -O-SO3H, e/ou
- Ilel é substituido por Vai e Tre2 por Vai ou
- Asn47 é substituido por Lis ou Arg ou His ou
- Tir63 é substituido por Glu ou Asp;
(c) uma variante da hirudina do tipo PA (HV3) com a fórmula ** ι...
H-Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly20
-Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn30
-Val-Cys-Gly-Lys-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu40 (ui)
-Gly-Ser-Gln-Gly-Lys-Asp-Asn-Gln-Cys-Val50
-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser60
-His-Asn-Gln-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Asp-Ala-Tyr(R)-Asp-Glu-OH, em que (R) é o grupo hidroxilo fenólico de Tir (dessulfato-hirudina ou um grupo -O-SC>3H, e/ou
- a cadeia polipeptídica é encurtada no extremo C em 18, 10, 9,
6, 4 ou 2 aminoácidos ou
- a cadeia polipeptídica é encurtada no extremo N em 1 ou 2 aminoácidos.
Os anticorpos monoclonais do invento foram testados relativamente às propriedades pretendidas, preferencialmente por um radio-imunoensaio ou imunoensaio com enzima. Por exemplo, pode ser realizado um imunoensaio com enzima em que um veículo adequado como seja uma placa de microtitulação é revestida com um anticorpo monoclonal anti-a-trombina, e.g. um anticorpo monoclonal anti-a-trombina, e.g. um anticorpo monoclonal anti-a-trombina que nao interfere com a ligação da hirudina à trombina e o complexo trombina/hirudina. Em seguida adicionou-se um anticorpo monoclonal marcado com enzima do invento e uma solução de substra to e a ligação do anticorpo monoclonal de acordo com o inventofoi detectada por determinação da marca enzimática do complexo imune ligado ao veículo.
São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e seus derivados. São igualmente preferidos anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante (rHV) e seus derivados. São especialmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 recombinante (rHVl) e seus derivados.
Uma vez que o complexo trombina/hirudina contem os dois componentes trombina e hirudina, os anticorpos monoclonais reactivos com o complexo pode reconhecer a fracção da hirudina ou da trombina do complexo ou um determinante que engloba partes de ambas as fracções. Ainda, os anticorpos monoclonais anti-complexo trombina/hirudina pode reconhecer os chamados neo-determinantes específicos do complexo resultes de alterações conformacionais que ocorrem durante a formação do complexo trombina/hirudina.
Uma realização preferida do presente invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e que reconhecem determinantes da fracção hirudina e seus derivados. São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e que reconhecem determinantes da fracção HV1 no complexo. São também preferidos anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hírudina em que a hirudina é hirudina recombinante (rHV) e que reconhecem determinantes da fracção rHV no complexo e seus derivados. São particularmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante variante 1 (rHVl) e que reconhece a fracção rHVl no complexo e seus derivados. Neste último grupo de anticorpos monoclonais são preferidos os anticorpos monoclonais que reconhecem determinantes dentro do domínio central N-terminal da fracção rHVl no complexo trombina/rHVl, preferencialmente determinantes compreendendo os resíduos de aminoácidos 1 a 43 da fracção rHVl e seus derivados. Um exemplo de um anticorpo monoclonal particularmente preferido e seus derivados é o anticorpo monoclonal designado MAb 4158-81-7 e seus derivados.
Uma outra realização preferida do presente invento diz respeito a anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina e que reconhecem determinantes da fracção trombina no complexo trombina/hirudina e seus derivados. São preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1) e que reconhece determinantes na fracção trombina no complexo. São também preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina ê hirudina recombinante (rHV) e que reconhecem determinantes da fracção trombina no complexo e seus derivados. São particularmente preferidos os anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante variante 1 (rHVl) e que reconhecem a fracção trombina do complexo e seus derivados. Neste último grupo de anticorpos monoclonais são especialmente preferidos os anticorpos monoclonais que reconhecem determinantes da fracção trombina que ficam expostos para ligação ao anticorpo apenas quando a trombina está ligada à hirudina ou a uma superfície sólida mas não reconhecem a trombina livre em solução e seus derivados. Um exemplo de um anticorpo monoclonal particularmente preferido e seus derivados é o anticorpo monoclonal designado MAb 4107-76-1 e seus derivados.
Os derivados de um anticorpo monoclonal do invento retêm a especificidade do anticorpo do qual derivam, i.e. eles retêm o padrão de ligação característico do anticorpo parental. Exemplos de tais derivados são conjugados dos anticorpos monoclonais com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca quimioluminescente, um quelato de metais, partículas paramagnéticas, avidina, biotina ou similares ou anticorpos monoclonais marcados radioactivamente ou fragmentos de anticorpos monoclonais.
As enzimas usadas para conjugados de anticorpos do invento são, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-D-galactosidase, glucose-oxidase, glucoamilase, anidrase carbónica, acetilcolinesterase, lisozima, malato-desidro genase ou glucose-6-fosfato-desidrogenase.
As marcas fluorescentes conjugadas com anticorpos do invento podem ser fluoresceína, fluorocromo, rodamina e similares
As marcas quimioluminescentes são moléculas orgânicas que emitem luz quando da modificação da estrutura química, e.g. luminol, isoluminol, pirogalol, luciferina e similares.
São exemplos de quelatos de metais o ácido etilenodiami natetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA), 1,4,8,11-tetrazatetradecano, ácido
1,4,8,11-tetrazatetradecano-l,4,8,11-tetracético, ãcido 1-oxa-4,7,12,15-tetraza-heptadecano-4,7,12,15-tetracético ou similares
Em tais conjugados o anticorpo é ligado ao parceiro de conjugação directamente ou por meio um grupo espaçador ou ligante.
Os anticorpos marcados radioactivamente do invento contêm e.g. iodo radioactivo (123I, 125I, 131I), tritio (3H),
35 . 90 . 99m carbono ( C), enxofre ( S), ítrio ( Y), tecnecio ( Tc) ou similares.
Os fragmentos de anticorpos do invento são por exemplo os fragmentos Fab, Fab' ou F(ab')2·
Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se em gue as células de uma linha celular de hibridoma secretoras dos anticorpos monoclonais pretendidos são multiplicadas in vitro ou in vivo e, quando necessário, os anticorpos monoclonais obtidos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados.
A multiplicação in vitro é realizada em meio de cultura adequados, os quais são os meios de cultura convencionais, por exemplo Meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640, facultativamente suplementado com um soro de mamífero, e.g. soro fetal de vitela ou micronutrientes e suplementos que mantêm o crescimento, e.g. células de suporte tais como células do exsudado peritoneal de murganho, células do baço, macrõfagos da medula óssea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoptroteína de baixa densidade, ãcido oleico ou similares.
'χ
Α produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puras e permite aumentar a escala para dar quantidades maiores dos anticorpos pretendidos. São conhecidas as técnicas para a cultura de células de mamífero em condições de cultura de tecidos e incluem a cultura em suspensão homogénia, e.g. num reactor com entrada de ar ou num reactor com agitação contínua ou cultura de células imobilizada ou aprisionadas, e.g. em fibras ocas, microcápsulas, em microsferas de agarose ou cassetes de cerâmica.
Para isolamento dos anticorpos monoclonais, as imunoglobulinas nos sobrenadantes de cultura são primeiro concentradas e.g. por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico como seja polietilenoglicol (PEG), filtração através de membranas selectivas ou similares. Caso seja necessário e/ou pretendido, os anticorpos concentrados são purificados por métodos de cromatografia convencionais·, por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em DEAE-celulose ou em Proteína A ou cromatografia de imunoafinidade.
Também podem ser obtidas grandes quantidades dos anticorpos monoclonais pretendidos por multiplicação das células in vivo. Para este fim as células de hibridoma produtoras dos anticorpos pretendidos são injectadas em mamíferos histocompatíveis de forma a provocar o crescimento de tumores produtores de anticorpos. Facultativamente os animais são sensibilizados com um hidrocarboneto, especialmente óleos minerais tais como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injecção. Após uma a três semanas os anticorpos são isolados a partir dos fluídos do corpo daqueles mamíferos. Por exemplo, as células de hibridoma derivadas de murganhos Balb/c que produzem os anticorpos monoclonais pretendidos são injectadas intraperitonealmente em murganhos
Balb/c facultativamente previamente tratados com pristano e após uma a duas semanas o fluido ascítico é retirado dos animais.
Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos, e.g. por reacção de um anticor po preparado como descrito atras na presença de um agente de acoplagem, e.g. glutaraldeído , periodato, N,N'-o-fenoilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-[2'-piridilditio]-propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Os conjugados com biotina são preparados e.g. por reacção de anticorpos com um éster activado de biotina como seja o éster de N-hidroxi-succinimida. Os conjugados com marcadores fluorescentes ou guimioluminescentes são preparados na presença de um agente de acoplagem, preferencialmente isotiocianato de fluoresceína.
Os anticorpos monoclonais marcados radioactivamente com iodo ( I, I, I) foram obtidos a partir dos anticorpos do invento por iodinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou de potássio radioactivo e um agente químico oxidante, como seja hipoclorito de sódio, cloramina T ou similares ou um agente enzimático de oxidação, como seja lactoperoxidase ou glucose-oxidase e glucose. Os anticorpos de acordo com o invento são marcados com ítrio ( Y) por exemplo por quelatação com o ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA). Os anticorpos marcados com tecnécio-99m são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de tertecnato (TcO4 ) com solução de ião estanhoso, quelatação do tecnécio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicação dos anticorpos nesta coluna ou por técnicas de marcação directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente redutor como seja SnCl2, uma solução tampão como seja solução de ftalato de sódio e potássio e os anticorpos.
Fragmentos dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento, por exemplo Fab, Fab' ou F(ab')2 podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais preparados como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e.g. por digestão com enzimas tais como papaína ou pepsina e/ou clivagem de ligações dissulfureto por redução química.
invento diz ainda respeitoa linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais do invento, em particular as linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais dirigidos contra o complexo trombina/HVl ou contra o complexo trombina/rHVl, preferencialmente contra o complexo trombina/rHVl.
Em particular o invento diz respeito a linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos pretendidos os quais são híbridos de células de mieloma e de linfocitos B de um mammífero imunizado com hirudina acoplado a um veículo adequado ou com o complexo trombina/hirudina. São mamíferos e veículos adequados os descritos detalhadamente abaixo. São preferidas as linhas celulares de hibridoma de acordo com o invento as quais são híbridos de células de mieloma de murganho e linfocitos Bde um murganho imunizado com hirudina recombinante variante l(rHVl) acoplado a um veículo adequado ou ao complexo trombina/rHVl.
São particularmente preferidas as linhas celulares de hibridoma designadas 4158-81-7 e 4107-76-1 que forma depositadas na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wilts. SP4 OJG, U.K., com o número de depósito 90061405 e 90061404, respectivamente em 14 de Junho de 1990.
As linhas celulares de hibridoma do invento são estáveis geneticamente, secretam os anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser mantidos em culturas congeladas e podem ser reactivados por descongelação e facultativamente reclonagem.
' O invento também diz respeito a um processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais do invento em que um animal adequado é imunizado com hirudina acoplada a um veiculo adequado ou com o complexo trombina/hirudina, as células produtoras de anticorpos do murganho são fundidas com células de uma linha celular continua, as células híbridas obtidas na fusão são clonadas e selelccionados os clones celulares que secretam os anticorpos monoclonais pretendidos.
imunogénio usado para induzir os anticorpos monoclonais do invento é um conjugado imunogénico da hirudina, em particular da hirudina variante HV1, da hirudina recombinante (rHV) ou preferencialmente da hirudina recombinante HV1 (rHVl) ou do complexo trombina/hirudina, em particular o complexo trombina/HVl ou o complexo trombina/rHVl, ou preferencialmente o complexo trombina/rHVl.
A acoplagem da hirudina a um veículo para formar um conjugado imunogénico de hirudina é necessário para aumentar a imunogenicidade da hirudina que é apenas fracamente imunogénica por si sõ.
Moléculas veículo adequadas são por exemplo proteínas ricas em lisina com grupos amina livres disponíveis para acoplagem, especialmente proteínas de alto peso molecular como seja albumina sérica bovina (BSA; PM 66200) alfa-amilase derivada de
Bacillus subtilis (PM 58000) ou hemocianina de lapa (KLH; PM >1000000) que podem ser adquiridas comerclalmente em grandes quantidades. Podem ser também usados como veículos tiroglobulina porcina, toxinas tais como as toxinas do tétano, cólera ou difteria, albumina sérica humana (HSA), beta-2 microglobulina e similares podem ser igualmente usados como veículos. A fracção de IgG de coelho purificada contra IgG(H+L) (Kawamura & Berzofsky,
J. Immunol. 136, 58, 1986) pode também ser empregue como veículo. Outras moléculas veículo possíveis incluem polissacáridos, lipopolissacãridos naturais ou sintéticos, polipeptídeos sintéticos tais como polilisina, membranas activadas, partículas de latex, bactérias tais como Salmonella e similares.
É preferido um conjugado imunogénico de hirudina, particularmente hirudina variante HV1, estã acoplada a hemocianina de lapa (KLH). É particularmente preferido um conjugado imunogénico de hirudina em que a hirudina recombinante, particularmente hirudina recombinante variante HV1 (rHVl) estã acoplada a KHL.
Os conjugados de hirudina são preparados por métodos conhecidos per se, quer por adsorção da hirudina ao veículo quer por acoplagem usando periodato, glutaraldeído, carbodimidas, e.g.
φ N,N'-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-[2'-piridilditio]-propionoxi)-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Caso se pretenda acoplagem via grupos carboxilo, os grupos amina da hirudina podem ser primeiro protegidos, e.g. por acilação, por exemplo com ' grupos acetilo ou butoxicarbonilo terciários.
complexo trombina/hirudina usado para imunização foi preparado misturando hirudina com trombina, em particular misturando um excesso de hirudina com trombina. O complexo trombina/hirudina pode ser separado da hirudina livre por exemplo através de filtração em gel por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).
conjugado imunogénico de hirudina ou o complexo trombina/hirudina podem ser misturados com adjuvantes, i.e. agentes que vão aumentar mais a resposta imune, para o processo de imunização. São possíveis adjuvantes o adjuvante completo de Freund (emulsão de ãgua e óleo apenas), géis minerais, e.g. géis de hidróxido de alumínio, substâncias tensoactivas tais como lisolecitina, polianiões, peptídeos, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), etc.,
Os imunogénios são usados para imunizar mamíferos adequados que os reconhecem como moléculas estranhas, por exemplo murganhos, ratos, coelhos, burros, cabras, carneiros, cavalos, porcos ou chimpanzés, especialmente murganhos ou ratos, preferencialmente murganhos. São particularmente preferidos os murganhos Balb/c.
As vias de imunização incluem, entre outras injecção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular e intracranial.Uma vez que se pretende títulos elevados de anticorpos normalmente dã-se uma série de injecções. A imunização é realizada por exemplo por injecção do conjugado imunogénico de hirudina, facultativamente misturado com adjuvante incompleto ou completo de Freund, três a oito vezes parenteralmen te, e.g. intraperitonealmente e/ou subcutâneamente, em quantidades de 10-50 /ig em murganhos Balb/c em intervalos de 1-3 semanas, seguido de uma injecção de reforço de aproximadamente 50-500 /ig 1-3 meses após a última imunização.
As células produtoras de anticorpos dos murganhos imunizados, preferencialmente células linfóides tais como linfócitos do baço, retirados por exemplo um a cinco dias após a injecção fianl, são fundidas com as células de uma linha celular contínua, i.e. um clone celular que se replica continuamente o qual confere esta capacidade de replicação às células híbridas resultantes da fusão. Um exemplo para tal linha celular é a linha de células tumorais (mieloma) que por si só não produz imunoglobulinas ou seus fragmentos mas que tem o potencial de produzir e secretar grandes quantidades de anticorpo e que é portador de uma marca genética de forma a que as células híbridas possam ser seleccionadas contra células parentais não fundidasSão conhecidas várias linhas celulares de mieloma adequadas. São preferidas as linhas celulares de mieloma sem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT) ou a enzima timidina-cinase (TK), que portanto não sobrevivem num meio de cultura selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). São particularmente preferidas as células de mieloma e linhas celulares derivadas qque não sobrevivem em meio HAT e que não secretam imunoglobulinas ou seus fragmentos, particularmente as linhas celulares de mieloma de murganho Sp2/O-Agl4 (Shulman et al., Nature 276, 269, 1978) ou X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123. 1548, 1979) que podem ser adquiridos comercialmente (Flow) ou a linha celular de mieloma de murganho PAI (Stocker et al., Research Disclosure 21713, 1982).
A fusão é realizada na presença de um promotor de fusão, por exemplo vírus Sendai ou outros paramixovírus, facultativamente na forma inactivada por UV ou agentes de fusão químicos tais como iões cálcio, lipidos tensioactivos, e.g. lisolecitina ou polietilenoglicol (PEG) ou por electrofusão, Preferencialmente, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células do baço derivadas de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietilenoglicol de um peso molecular entre 1000 e 4000.
Após a fusão as células foram ressuspensas e cultivadas num meio selectivo escolhido dependendo da marca de selecção genética, por exemplo meio HAT. Neste meio, apenas sobreviverão as células de hibridoma, pois estas combinam a cpacidade de crescer e replicar in vitro herdada das células de mieloma parentais e a ausência dos genes HGPRT ou TK essencial à sobrevivência em meio HAT herdada das células do baço produtoras de anticorpos derivadas dos mamíferos imunizados.
Meios de cultura adequados para a expansão de células de hibridoma são os meiso de cultura convencionais, tais como Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM), meio mínimo essencial, RPMI 1640 e similares, facultativamente suplementado com um soro de mamífero, e.g. 10 a 15% de soro fetal de vitela. Preferencialmente, são adicionadas células de suporte, e.g. células de exsudato peritoneal de murganho normal, células do baço, macrófagos da medula óssea ou similares, no início do crescimento celular imediatamente após o passo de fusão para alimentar as células de hibridoma e suportar o seu crescimento, especialmente sempre que as densidades celulares sejam baixas, proporcionando factores de crescimento e similares. Se se usar células fagocitãrias tais como macrofagos ou monócitos, elas podem desempenhar um serviço útil na limpza dos detritos das células de mieloma mortas sempre encontradas após tratamento com aminopterina. Os meios de cultura são suplementados com meio selectivo para evitar que as células de mieloma cresçam mais do que as células de hibridoma.
Os sobrenadantes das culturas de células de hibridoma são testados relativamente aos anticorpos monoclonais pretendidos com um imunoensaio, preferencialmente um radio-imunoensaio ou imuno-ensaio com enzimas. Por exemplo, um veículo adequado como seja uma placa de microtitulação é revestido com o complexo trombina/hirudina e incubado com o sobrenadante de hibridoma a ser testado. Em seguida, são adicionados os anticorpos marcados com enzima que reconhecem os anticorpos ligados ao complexo trombina/hirudina no veículo e uma solução de substrato e os anticorpos marcados ligados ao complexo anticorpo/trombina/hirudina são detectados por determinação da marca enzimática ligada ao veículo.
As células de hibridoma positivas foram clonadas, e.g. por diluição limite ou em agar mole, peferencialmente duas ou mais vezes. Facultativamente, as células de hibridoma são passadas em animais, e.g. murganhos, por injecção intraperitoneal e colheita de ascistes, o que estabiliza os hibridomas e melhora as caracteristicas do crescimento. As linhas de células clonadas podem ser congeladas de forma convencional.
Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são úteis para uma série de fins médicos in vitro e in vivo, todos eles baseados na determinação qualitativa e/ou qantitativa do complexo trombina/hirudina. E particular, os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados podem ser empregues no diagnóstico precoce de trombose, especialmente em grupos de alto risco e pacientes com perturbações trombóticas. Isto é conseguido através da detecção de pequenas quantidades de trombina gerada espontaneamente através da injecção de hirudina como marca seguido da medição do complexo formado, determinando assim o momento em que é necessário o tratamento com hirudina ou aconselhável a terapia preventiva com hirudina. Em adição, os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são úteis para o controle da terapia com hirudina pela determinação da actividade de hirudina, para o estabelecimento da dosagem correcta de hirudina e para o registo da prograssão possível da doença.
Para a determinação quantitativa do complexo trombina/hirudina, os anticorpos minoclonais do invento e/ou seus derivados podem ser usados por exemplo em qualquer dos imunoensaios conhecidos que se baseiam na interacção da ligação entre os determinantes antigénicos da molécula do complexo trombina/hirudina e os paratopos dos anticorpos monoclonais. São exemplos de tais ensaios os imunoensaios que usam marcação radioactiva, enzimas, fluorescência, quimioluminescência, imunoprecipitação, aglutinação com latex e hemeglutinação, desvio de raios laser ou testes com luz evanescente.
Os anticorpos monoclonais do invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados marcados radioactivamente (RIA). Tais imunoensaios também incluem processos de testes em que são usados os anticorpos marcados radioactivamente conhecidos per se que reconhecem e ligam um epitopo dos anticorpos do invento. Pode ser usada qualquer uma das modificações reconhecidas de RIA, por exemplo RIA em fase solúvel (homogénea), RIA em fase sólida (heterogénea), RIA simples ou RIA dupla (sanduíche) com determinação directa ou indirecta do complexo trombina/hirudina.
É preferida uma RIA em sanduíche na qual um veículo adequado, por exemplo a superfície de plástico de uma placa de microtitulação ou de um tubo de ensaio, e.g. de polistireno, polipropileno ou cloreto de polivinilo, esferas de vidro ou plástico, papel de filtro, dextrano, etc., filtros de acetato de celulose ou nitrocelulose, partículas magnéticas ou similares, é revestido com um anticorpo monoclonal do invento, preferencialmen te MAb 4107-76-1. Em seguida são adicionadas as soluções a
testar, por exemplo plasma de um doente, que contêm o complexo trombina/hirudina e finalmente o segundo anticorpo policlonal ou monoclonal que reconhece um epítopo do antigénio diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo . . 125 e que estão marcados radioactivamente, e.g. com I, preferencialmente anticorpo monoclonais marcados radioactivamente do tais como MAb 4158-81-7.A quantidade do complexo trombina/hirudina na | solução a testar é directamente proporcional à quantidade de segundo anticorpo ligado e é determinado por medição da radioactividade ligada ao veículo.
_ Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma dos derivados enzima-conjugado num imunoensaio com enzima. Tal imunoensaio também inclui processos teste em que são usados os anticorpos marcados com enzima conhecidos per se que reconhecem e se ligam a um epítopo dos anticorpos do invento. Comodescrito atrás para os radio-imunoensaios, pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas dos imunoensaios com enzimas.
Os testes são realizados de forma análoga aos radio-imunoensaios descritos atrás usando uma marca nezimática em lugar de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formado que φ corresponde à quantidade do complexo trombina/hirudina presente na solução a testar é determinado pela adição de uma solução de substrato da enzima. A reacção do substrato com a enzima resulta, por exemplo, numa alteração de cor que pode ser observado a olho nu ou com sistemas ópticos de medição.
É preferido um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) no qual um veículo como o descrito atrás para a RIA é revestido com um anticorpo monoclonal do invento, preferencialmente MAb 4107-76-1, incubado com soluções a testar contendo o complexo trombina/hirudina, com segundo anticorpo policlonal ou monoclonal quie reconhecem um epítopo do antigénio diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo e que estã conjugado com enzima, preferencialmente anticorpos monoclonais conjugados com enzimas do invento tais como MAb 4158-81-7 e com uma solução de substrato. A reacção da enzima e substrato resulta por exemplo numa alteração de cor e pode ser observado a olho nu ou com sistemas ópticos de medição, de forma que pode ser determinada a quantidade de enzima ligada, a qual é proporcional à quantidade do complexo trombina/hirudina na solução a testar. Uma alternativa consiste num imunoensaio que é realizado essencialmente como descrito atrás mas em que o primeiro anticorpo monoclonal ligado ao veículo do invento está acoplado a um grupo químico pequeno como seja biotina e é detectado por um reagnete marcado, e.g. uma proteína de ligação à biotina como seja a avidina ou a estreptavidina.
Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de derivados conjugados com marcas quimioluminescentes num imunoensaio quimioluminescente. Tais imunoensaios também incluem processos teste em gue são usados anticorpos conhecidos per se que reconhecem e se ligam a um epítopo dos anticorpos do invento e que estão conjugados com marca quimioluminescentes. Conforme descrito atrás para os radio-imunoensaios pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de um imunoensaio quimioluminescente.
Os testes são realzados de forma análoga aos radio-imunoensaios descritos atrás usando uma marca quimioluminescente em vez de uma marca radioactiva. A quantidade de complexo imune formada que corresponde à quantidade de anticorpos dirigidos contra o complexo trombina/hirudina presente nas soluções a testar é determinada pela adição de um composto que capta a luminescência, e.g. H2O2 e NaOH e medindo a emissão de luz com um sistema óptico de medição.
A utilização de acordo com o invento dos anticorpos monoclonais e seus derivados como aqui jádescrito para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina também inclui outros imunoensaios conhecidos per se. por exemplo ensaios de imunofluorescência usando anticorpos ou derivados do anticorpo conjugados com marcas fluorescentes tais como fluoresceína, aglutinação a latex com partículas de latex revestidas com anticorpo ou com antigénio, hemaglutinação com corpúsculos de glóbulos vermelhos revestidos anticorpo ou revestidos com antigénio, ensaios com luz evanescente usando uma fibra óptica revestida com anticorpo e outros imuno-sensores de actuação directa que convertem o acontecimento de ligação a um sinal eléctrico ou óptico ou similares.
A aplicação dos anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados como jã descrito permite a determinação da presença e/ou a concentração do complexo trombina/hirudina no tampão, urina e plasma em concentrações que variam entre 1 e 200 ng/ml.
O invento também diz respeito a kits de testes para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina compreendendo anticorpos monoclonais do invento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou aditivos.
Kits de testes de acordo com o invento para o radio-imunoensaio contêm, por exemplo, um veículo adequado, e.g. placas de microtitulação ou folhas de nitrocelulose, não revestidas ou revestidas com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradasde um segundo anticorpo marcado radioactivamente dirigido contra um epítopo do complexo trombina/hirudina diferente do reconhecido pelo anticorpo monoclonal ligado ao veículo e/ou um seu derivado marcado radioactivamente, soluções padrão do complexo trombina/hirudina, soluções tampão e facultativamente, polipeptídeos e detergentes para prevenção da adsorção inespecífica e formação de agregados , pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de instruções e similares.
Os kits de teste de acordo com o invento para um imunoensaio com enzima contêm por exemplo, um veículo adequado, revestido ou não com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente soluços liofilizadas ou concentradas de um segundo anticorpo marcado com enzima dirigido contra um epítopo do complexo trombina/hirudina diferente do reconhecido pelo primeiro anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado marcado com enzima, substratos de enzimas na forma sólida ou dissolvida, soluções padrão do complexo trombina/hirudina, soluções tampão e, facultativamente polipeptídeos e detergentes para a prevenção da adsorção inespecífica e formação de agregados, pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de intruções e similares.
Os exemplos que se seguem ilustram o invento, mas não o limitam de forma alguma.
Abreviaturas
HAT - hipoxantina/aminopterina/timidina HPLC - cromatografia líquida de alta pressão MAb - anticorpo monoclonal
MES - ãcido 2-[N-morfolino]etanossulfónico PBS - tampão de fosfatos salino PEG - polietilenoglicol
I rHVl - hirudina recombinante variante HV1
RT - temperatura ambiente
THC - complexo trombina-hirudina
Exemplos
Exemplo 1 Preparação de anticorpos monoclonais contra o complexo trombina/hirudina
1.1 Preparação dos imunogénios
Como imunogénios podem ser usados: (1) um conjugado de hirudina recombinante HV1 (rHVl) com (rHVl) com hemocianina de lapa (KLH) e (2) o complexo trombina/rHVl.
rHVl (Plantorgan/Ciba-Geigy) é acoplado a KLH (Calbiochem) pelo método da carbodiimida como descrito a seguir: 2 mg de rHVl em 560 μΐ de tampão O,1M MES pH 4,75 são misturados com 100 μΐ de KLH (10 mg/ml) e 200 μΐ de hidrocloreto N-etil-N'-(3-dimetliaminopropil)-carbodiimida (20 mg/ml). Após 2 horas a 22°C, a mistura foi dialisada em PBS.
O complexo trombina/rHVl foi preparado misturando um excesso de rHVl com trombina em PBS (proporção molar de 1,7:1).
1.2 Protocolo de imunização
A dois grupos de cinco murganhos fêmea Balb/c (4-6 semanas de idade) foram dadas três séries de injecções com rHVl conjugado com KLH (30 Mg/injecção; grupo I) ou com o complexo trombina/rHVl (15 Mg/injecção; grupo II). A primeira injecção consiste em 0,1 ml do respectivo imunogénio em PBS numa prporção molar de 1:1 com 0,1 ml de adjuvante completo de Freund (Difco);
μΐ foram injectados intraperitonealmente e 150 μΐ subcutaneamente. No segundo (dia 14) e terceiro (dia 30) das injecções, o adjuvante completo de Freund foi substituido por adjuvante incompleto de Freund. Uma semana após a última injecção, o soro foi colhido e determinados os títulos de anticorpos por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) como descrito no exemplo 1.3.
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1.3 Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para determinação do título de anticorpos no soro
Os títulos de anticorpos no soro foram determinados por ELISA como se descreve a seguir.
Misturou-se um excesso molar de duas vezes de trombina com rHVl (0,2 yg e 0,02 jug/cavidade, respectivamente). As placas de microtitulação (Dynatech) foram revestidas com 100 μΐ por cavidade de uma solução do complexo trombina/rHVl em tampão de revestimento (tampão carbonato de sódio 50 mM pH 9,6: 477 mg Na2C03, 1,8 ml NaN3 0,5M ad 300 ml H20). As placas foram incubadas durante a noite a 4°C numa câmara húmida e lavadas cinco vezes com PBS-Tween 0,1% (lml Tween-20, Serva, 1000 ml PBS). As cavidades foram deixadas a secar, cheias com 200 ml por cavidade de PBS-BSA 1% (lg BSA, 3 ml NaN3 0,5M, ad 100 ml de PBS), incubadas duas horas à t.a. e lavadas cinco vezes com PBS-Tween 0,1%. Em seguida adicionou-se 100 μΐ do respectivo soro diluído em PBS-Tween 0,1%. Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente as placas foram lavadas cinco vezes com PBS-TweenO,1%. No passo seguinte, adicionou-se a cada uma das cavidades 100 μΐ anticorpo de cabra purificado por afinidade contra IgG de murganho e conjugado com fosfatase alcalina (Kikegaard & Perry Laboratories) diluido a 1:1500 em PBS-Tween 0,1%. Finalmente, adicionou-se 150 μΐ por cavidade de solução de substrato (1 mg de p-nitrofenilfosfato [Sigma] por ml de tampão dietanolamina pH 9,8 : 97 ml de dietanolamina [Merck], 6 ml NaN^ 0,5M, 100 mg MgC^.ôB^O, ajustado a pH 9,8 com HCl concentrado, ad 1000 ml H^O), a reacção foi parada pela adição de 50 μΐ de NaOH 3M e lida a densidade óptica a 405 nm após 2 horas de incubação à t.a. no escuro.
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1.4 Protocolo de fusão
Após um período de descanso de mais de dois meses, os murganhos receberam uma injecçâo de reforço intraperitoneal com 300 Mg de conjugado rHVl-KLH (grupo I) ou 70 Mg do complexo trombina/rHVl (grupo II). Três a quatro dias mais tarde os murganhos foram sacrificados, as células do baço foram fundidas com alinha de células de mieloma murino PAI (Stocker et al., Research Disclosure Ne 21713, p.155, 1982), usando PEG 4000 (Merck), por uma modificação do método original de Kohler e Milstein (Galfre et al., Nature 266, 550, 1977) e as células foram distribuídas por cavidades de placas de microtitulação contendo meio HAT (Boehringer). Após 2 a 4 semas, as cavidades contendo hibridomas a crescer foram testadas relativamente a anticorpos monoclonais específicos por ELISA do Exemplo 1.5.
1.5 Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para despiste de hibridomas ' Os hibridomas que cresceram foram testados quanto à presença de anticorpos específicos por uma ELISA como descrito no Exemplo 1.3. Em vez de soro adicionou-se 200 μΐ de sobrenadantes de hibridomas diluidos a 1:2 em PBS Tween 0,1% às placas de φ microtitulação revestidas com o complexo trombina/rHVl.
Destas três fusões realizadas como grupo de murganhos I (eficiência de fusão 100%), obtiveram-se seis secretores de MAbs reactivos com o complexo trombina/rHVl. As três fusões com os murganhos do grupo II resultam em quatro desses hibridomas, um dos quais secreta MAbs que dão reacção cruzada co m rHVl, enquanto que os MAbs secretados pelos restantes três hibridomas dão reacção cruzada com trombina. Duas linhas de células de hibridoma, uma de cada grupo, foram seleccionadas para posterior jjw
I caracterização dos MAbs secretados. Ambas as linhas secretadas foram depositadas em 14 de Junho, 1990 na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), com os números de depósito 90061405 para o hibridoma 4158-81-7 (grupo I) e 90061404 para o hibridoma 4107-76-1 (grupo II). Os anticorpos monoclonais secretados por estes hibridomas foram designados pelo prefixo ”MAb” e o número interno do respectivo hibridoma, e.g. MAb 4107-76-1.
1.6 Armazenamento e processamento de hibridomas
As células de hibridoma seleccionadas podem ser cultivadas em cultura, congeladas a -80°C e mantidas em azoto líquido e depois reactivadas. As células foram clonadas pelo método de diluição limite (J.W. Goding, J. Immunol. Methods 39., 285, 1980) e expandidas formando ascites em murganhos Balb/c sensibilizados com pristano (ver Exemplo 2.1).
Exemplo 2 Produção, isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais anti-THC
2.1 Expansão de hibridomas in vivo e purificação dos anticorpos monoclonais
Para a produção de ascites, murganhos fêmea Balb/c (20-25 g) (Tierfarm Sisseln, Switzerland) foram prétratados com 0,3 ml de óleo de pristano (Aldrich) intraperitonealmente. 1 A 3 semanas mais tarde, os murganhos receberam uma segunda injecção de pristano (0,2 ml i.p.) e foram simultaneamente inoculados i.p. com 2 x 10 células de hibridoma em 0,2 ml de PBS. Após 8-10 dias, o fluido de ascites resultante foi colhido centrifugado a 800 g e guardado a -20°C ou a -80°C.
I
O fluido de ascites descongelado foi clarificado por centrifugação a 30000g durante lh. Após remoção a camada de cima contendo lípidos, determinou-se a concentração de proteína e ajustou-se a 10-12 mg/ml com PBS. A facção de imunoglobulina G (IgG) foi precipitada adicionando gota a gota 0,9 volumes de sulfato de amónio sarturado a 0°C. Após 1 hora, a fracção de IgG foi sedimentada por centrifugação durante 1 hora a 22000g. 0 sedimento foi dissolvido em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,9 contendo 50 mM NaCl e foi dialisado contra o mesmo tampão durante a noite a 4°C. A fracção de IgG foi ainda purificada por cromatografia de permuta aniónica numa coluna de DE52 dietilaminoetilcelulose (Whatman). A amostra foi diluida a 1:2 (v/v) em 20 mM Tris-HCl pH 7,9 para uma concentração final de 25 mM NaCl e 10 mg de proteína por ml de gel foram aplicados na coluna. A eluição foi obtida aumentando a concentração de cloreto de sódio de 25 mM para 200 mM (gradiente linear). Em geral, os MAbs foram eluidos à volta de 80 mM NaCl. As fracções foram dialisadas contra PBS durante a noite a 4°C e guardadas a -70°C. A pureza foi testada por SDS-PAGE e focagem isoeléctrica. A pureza era mais de 90%.
2.2 Expansão de hibridomas in vitro
Uma précultura de qualquer uma das linhas celulares foi obtida cultivando as células de hibridoma à temperatura fisiológica (cerca de 37 °C) em meio RPMI1640 (Seromed) contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) para uma densidade final de 5 x 10 a 10° células por ml. Toda a précultura foi foi usada para encher frascos de cultura Bellco e ajustada a um volume total de 1500 ml com meio RPMI fresco/10%FCS. A cultura foi agitada a 37°C com 5% de C02 a 30 rpm durante dois a três dias, depois diluido para um volume total de 3000 ml com RPMI 1640/10% FCS e agitada durante mais sete a dez dias. Após este tempo, 95% das células estavam mortas. O caldo de cultura foi centrifugado a lOOOxg durante 20 minutos a 4°C. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro com um poro de 0,2 /xm em condições de esterilidade. A imunohglobulina bruta foi precipitada pela adição lenta gota a gota de 0,9 volumes de sulfato de amónio saturado a 0°C. Este precipitado foi purificado como descrito no Exemplo 2.1.
Exemplo 3 Determinação da classe e subclasse dos anticorpos monoclonais anti-THC
A classe e subclasse dos anticorpos monoclonais foi determinada num kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) da Bio-Rad. MAb 4158-81-7 e MAb 4107-76-1 são da classe de IgGl.
Exemplo 4 Preparação de análogos de rHVl
4.1 Preparação de peptídeos sintéticos de rHVl
Peptídeos sintéticos de rHVl representando as sequências 52-65, 40-65, 29-38 e 1-15 foram sintetizados pelo método de fase sólida conhecido (Rink, Tetrahedron Letters 28., 3787, 1987) . 0 peptídeo representando a sequência 1-43 foi sintetizado como descrito em Chang et al., FEBS Letters 260, 209, 1990.
4.2 S-carboximetilação redutora
A S-carboximetilação redutora de rHVl foi realizada segundo Hirs (Methods in Enzymol- 11, 199, 1967). Ela resulta na destruição completa da estrutura tridimensional de rHVl.
4.3 Digestão de rHVl por protease estafilocóccica V8 de rHVl nativo dissolvido em 90 (NH4)HCO3 50 mM, pH 8,0, suplementado com EDTA misturados com 20 μ% (em 20 μΐ) de protease de aureus estirpe V8 (Sigma) e incubado durante 30 minutos, 2 h ou 4 h a 37°C. A reacção foi parada pela adição de 5 μΐ de diisopropil fluorofosfato 0,01M (Sigma). O grau de digestão foi testado por HPLC de fase reversa como descrito por Schlaeppi et al. (Eur. J. Biochem. 188, 463, 1990) ou por análise amino-terminal (Chang,
Analytical Biochem. 170, 542, 1988) e por SDS-PAGE.
μΐ de tampão 2 mM, foram Staphylococus
4.4 Digestão de rHVl por lisil endopeptidase
A 70 jug de rHVl dissolvido em 97,5 μΐ de 25 mM Tris/HCl pH 8,3, adicionou-se 2,5 Mg em 2,5 μΐ de lisil endopeptidase (Wako Chemicals) e incubou-se durante diferentes períodos de temopo a 37°C. Os fragmentos proteolíticos foram separados por HPLC como descrito por Schlaeppi et al., (loc. cit.) e determinado o grau de digestão por análise N-terminal quantitativa.
Exemplo 5 Processos teste usados para a caracterização dos anticorpos monoclonais anti-THC »
5.1 Biotinilação de rHVl, trombina e os anticorpos monoclonais
A trombina (1,1 nmol em 2 μΐ de DMSO) durante 3 horas a 4°C. Em seguida adicionou-se 360 μΐ de PBS antes da diálise durante a noite contra PBS.
A biotinilação dos anticorpos monoclonais foi realizada essencialmente como descrito pr Bayer et al. (Methods Enzymol. 62, 308, 1979). Éster de biotina-X-N-hidroxissuccinimida (200 μg em 200 μΐ de DMSO) foi adicionado a 5 mg do MAb purificado em 5 ml de PBS (pH 7,0) (proporção molar de 13:1). Após 4 h a 4°C a mistura foi extensivamente dialisada em PBS.
0,5 mg de rHVl em 200 μΐ de tampão acetato (20 mM, pH 6,0) foram misturados com 100 μg do éster de biotina-X-N-hidroxis succinimida (Calbiochem) dissolvido em 40 gl de etanol/água (1:1, v/v) de forma a que a razão molar de biotina para rHVl seja de 3,2:1 e a mistura foi incubada 20 minutos à t.a. Em seguida, 260 μΐ de PBS foram adicionados e a solução dialisada durante a noite contra PBS a 4°C.
5.2 ELISA competitiva mapeamento de epítopos foi realizado por experiências de ELISA competitiva usando rHVl, análogos de rHVl como descrito no exemplo 4 e hirudina recombinante variante PA (rHV3; Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367. 803, 1983). A ELISA competitiva em dois passos foi realizada como descrito a seguir.
rHVl (0,2 μ9/100 μΐ de tampão de revestimento 50 mM) foi adosrvida a placas de mierotitulação. Após incubação durante a noite a 4°C, as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,1% e os restantes sítios livres no suporte sólido foram bloqueados por incubação com PBS/BSA(1% p/v). Em tubos de ensaio separados, 50 μΐ de cada um dos MAb purificados (40 a 400 ng/ml) foram incubados com 650 μΐ de uma solução padrão contendo quantidades crescen tes de rHVl ou análogos de rHVl. Após incubação durante a noite a 4°C, 200 μΐ da mistura de anticorpo-antigénio foram adicionados a cada uma das cavidades e incubado mais uma hora. As cavidades foram então lavadas cinco vezes e adicionados 100 μΐ por cavidade de anticorpo de cabra anti-murganho conjugado com fosfatase alcalina (diluição 1:1500) durante 1,5 h. Após lavagem,
adicionou-se às cavidades 150 μΐ por cavidade do substrato p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml em tampão dietanolamina pH 9,8, suplementado com 0,5 mM MgCl2.H2O).A mudança de cor, que é proporcional à quantidade de anticorpo que reage com o antigénio ligado à fase sólida foi controlado a 405 nm. Todas as amostras correram em triplicado. Obtiveram-se curvas de inibição típicas representando graficamente B/Bo x 100 (percentagem ligada) vs. a concentração de inibidor presente (Bo representa a absorvância medida sem rHVl adicionado ao anticorpo e B a absorvância medida com várias concentrações de rHVl). O valor de ΙΟ^θ representa a concentração de antigénioque inibe 50% da ligação do anticorpo à fase sólida. IC5Q foi calculado usando uma adaptação do program de adaptação de curvas ENZFITTER (R. J. Leatherbarrow, Elsevier) baseado numa curva de quatro parâmetros logísticos: U=(D-C)/1+(z/A)b)+C, onde U é a resposta esperada para uma dose z do padrão. Os quatro parâmetros descrevem a forma da curva, D e C dão a assímtota superior e inferior e A é a dose da assímtota média (Raab, Clin. Chem. 29., 1757, 1983).
5.3 ELISA dupla em sanduíche com MAbs selectivos para a hirudina livre para determinar epítopos sobreponíveis
Realizou-se uma ELISA com dois anticorpos em sanduicheusando MAbs selectivos para a hirudina livre como descrito a seguir para determinar se anticorpos monoclonais reconhecem epítopos sobreponíveis.
As placas de microtitulação foram revestidas com 0,5 ^g/cavidade de MAb purificado anti-THC do grupo I preparado em tampão carbonato de sódio (50 mM, pH 9,6) e incubado durante a noite a 4°C. Após os passos de bloqueio e de lavagem (por 1% BSA e PBS-Tween 0,1%, respectivamente), adicionou-se concentrações crescentes de rHVl preparado em PBS-Tween 0,1% (0 a 100 ng/cavidade) ao anticorpo monoclonal ligado e incubou-se durante 1 hora à t.a. Após lavagem, adicionou-se um segundo MAb biotinilado selectivo para rHVl livre (0,5 ^g/cavidade) e incubou-se durante 2 h. Como segundo anticorpo monoclonal foram empregues MAb 4114-96-1, MAb 4120-37-7 e MAb 4049-83-12 respectivamente, como descrito por Schlaeppi et al., (loc. cit.). Em seguida, apóslavagem, adicionou-se 100 μΐ de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluida a 1:2500) e incubou-se durante 1,5 h à t.a. Após lavagem, o substrato (ver Exemplo 5.2) foi adicionado e medida a absorVancia a 405 nm após diferentes intervalos de tempo, começando 15 minutos após a adição do substrato.
5.4 ELISA em sanduíche para determinar o complexo rHVl/trombina complexo trombina/rHVl foi preparado misturando 3 pmoles de a-trombina (3000 unidades NIH/mg;CBR Laboratories) com 15 pmoles de rHVl em 100 μΐ de PBS Tween 0,1% contendo 0,1% BSA ou em 100 μΐ de plasma humano diluído a 1:3 em PBS-Tween 0,1% contendo 0,1% BSA ou em 100 μΐ de plasma humano diluido a 1:3 em PBS-Tween.
As placas de microtitulação foram revestidas com o MAb anti-trombina MAb EST6 (0,2 ^g/100 μΐ; Bioscot, Edinburgh, UK). Após incubação durante a noite a 4°C, bloqueio com PBS-BSA (0,1%) e lavagem com PBS-Tween, 100 μΐ de uma série de diluições de duas vezes do complexo trombina/rHVl preparado como descrito atrás (proporção molar 1:5) foram adicionados à cavidade e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se consecutivamente os seguintes reagentes: (1) 0,5 μg/100 μΐ do MAb 4107-76-1 biotinilado e MAb 4158-81-7, respectivamente, durante 2 h, (2) estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluido a 1:2500) durante 1,5 horas, (3) substrato (ver exemplo 5.2). As incubações foram feitas a 22°C. Entre cada passo as placas foram lavadas com PBS-Tween 0,1%. A absorvância foi controlada a405 nm após 15 a 30 minutos.
Foi desenvolvido um ensaio simplificado usando placas de microtitulação revestidas com o MAb escolhido. Adicionou-se trombina biotinilada (0,2 /zg/cavidade) complexada com rHVl (proporção molar 1:1) às cavidades e a trombina biotinilada foi revelada directamente por estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina.
5.5 Filtração em gel por HPLC
Usou-se filtração em gel por HPLC (cromatografia líquida de alta resolução para analisar o complexo trombina/rHVl ou complexos antigénio-anticorpo. As amostras contendo trombina (0,3 nmole) e rHVl (1,5 nmoles) foram incubadas durante 15 minutos. O MAb testado anti-THC ou o controle anti-hirudina MAb 4049-83-12 (0,2 nmole; Schlaeppi et al., loc. cit) foi adicionado (volume total 45 μΐ) e ainda incubado durante 5 h à temperatura. As amostras foram injectadas numa coluna de filtração em gel TSK-G3000SW (LKB; 8 x 300 mm) e eluidas com PBS a um fluxo de 0,3 ml/min. A absorvância da proteína foi controlada a 280 nm.
Exemplo 6 Caracterização dos anticorpos monoclonais anti-THC
6.1 Os anticorpos monoclonais do grupo I os resultados da ELISA competitiva do exemplo 5.2 MAb 4158-81-7 (grupo I) estão apresentados na Tabela 1 abaixo.
-» ί Λ
Tabela 1: Caracterização do MAb 4158-81-7 por ELISA competitiva
I 1- |hirudina variante/anãlogo | I I IC5O(ng/ml)A |
1 1 |rHVl | 3,5 |
|rHV3B | 1000 |
|rHVl 1-43 | 1,0 |
| HV1 peptídeo 52-65 | >1000 |
|HV1 peptídeo 40-65 | >1000 |
| HV1 peptídeo 29-38 [ >1000 |
|HV1 peptídeo 1-15 | >1000 |
|S-CM-rHVlC | 200 |
|rHVl + protease V8 (2h)° | 0,5 |
|rHVl + lisil endopeptidase (1,5 h)E | 1 1 11,8 I
Legenda:
A- concentração de inibidor para 50% de inibição do MAb em fase sólida
B- resíduos de rHV3 que são diferentes de rHVl: Ile, Tre 2, Lis 24, Gin 33, Lis 35, Asp 36, Gin 53, Pro 58, Asp 62, Ala 63,
Asp 65, Glu 66
C- rHVl reduzida e S-carboximetilada
D- 97% de clivagem em Glu 43; 50% de clivagem em Glu 61
E- 100% de clivagem em Lis 47; 100% de clivagem em Lis 36
MAb 4158-81-7 liga-se a rHVl em solução com um valor de IC5Q de 3,5 ng/ml mas não apresenta reactividade cruzada com os quatro peptídeos rHVl 1-15, 29-38, 40-65 e 52-65 que constituem a maior parte da sequência de rHVl. Ainda, a ligação de rHVl reduzida e S-carboximetilada decresceu drasticamente comparado com rHVl não modificada, sugerindo uma conformação dependente de epítopo. 0 MAb 4158-81-7 dá totalmente reacção cruzada com o domínio central N-terminal de rHVl, assim como com rHVl digerido com protease V8 na qual o domínio central de rHVl permaneceu intacto. A afinidade do MAb para rHVl 1-43 e para rHVl digerido com V8 é superior do que para a molécula de rHVl completa, sugerindo que ocorre algum impedimento espacial do domínio C-terminal, o qual altera a sua conformação nativa.
Na ELISA dupla em sanduíche do exemplo 5.3, o MAb 4158-81-7 combina-se com qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-hirudina que se ligue ao domínio C-terminal (ver Schlaeppi et al., loc. cit.), indicador de epítopos não sobreponíveis. No entanto, são necessárias concentrações dez a vinte vezes superiores de rHVl quando o MAb 4158-81-7 foi combinado com o MAb 4049-83-12 que se liga aos resíduos dentro do domínio 41-47. Isto indica uma sobreposição parcial entre os epítopos de ambos os MAbs que foi ainda confirmado por proteolise limitada do complexo rHHl/anticorpo pela protease V8. A clivagem entre Glu 43e Gli 44 foi evitada pela ligação do MAb 4158-81-7 a rHVl.
Todos os restantes MAbs do grupo I também dão reacção cruzada com o peptídeo rHVl 1-43, sugerindo que os MAbs do grupo I se ligam a apenas ao domínio central N-terminal de rHVl. Estes resultados também indicam que os principais determinantes antigénicos de rHVl acessíveis na superfície do complexo trombina/rHVl estão situados exclusivamente no domínio N-terminal, conforme sugerido pela estrutural cristalina do complexo trombina/hirudina (Grutter et al., EMBO Journal 9, 2361, 1990).
MAb 4158-81-7 não seliga ao complexo trombina/rHVl em solução, mas liga-se ao complexo adsorvido numa superfície sólida como seja uma placa de microtitulação ou apresentado por um anticorpo como seja o MAb EST6 ou MAb 4107-76-1. Em adição, o MAb 4158-81-7 não se liga ao complexo trombina biotinilada/rHVl (ao
contrário do MAb 4107-76-1, ver abaixo). Portanto, concluiu-se que a conformação do complexo trombina/rHVl em solução é diferente do comportamento num suporte sólido e que o domínio central de rHVl, ao qual se liga o MAb 4158-81-7, fica exposto apenas na última conformação. Segue-se que o MAb 4158-81-7 dã reacção cruzada com o complexo trombina/rHVl apenas em condições restrictas mas não em geral.
6.2 Os anticorpos monoclonais do gruno II
Entre os quatro MAbs do grupo II, apenas um MAb dá reacção cruzada com rHVl, no entanto com baixa afinidade. Como se mostra pela ELISA competitiva do exemplo 5.2, este MAb também dá reacção cruzada com o domínio central de rHVl (resíduos 1-43), indicando que ele está estreitamente relacionado com os MAbs do grupo I. Entre os restantes três MAbs, o MAb 4107-76-1 foi estudado mais detalhadamente pois liga-se muito fortemente ao complexo trombina/rHVl. Não se liga nem a rHVl nem a trombina em solução. No entanto, este MAb liga-se à trombina adsorvida às placas de microtitulação. Várias linhas de evidência sugerem que a ligação ocorre apenas quando a trombina está adsorvida a uma superfície sólida mas não quando está em solução. Em primeiro lugar nas experiências de filtração em gel por HPLC como descrito no exemplo 5.6, o MAb 4107-76-1 liga-se ao complexo, mas não à trombina livre. 0 MAb 4049-83-12 anti-rHVl que apenas reconhece rHVl livre, é usado como testemunha. Em segundo lugar, usando trombina biotinilada, o MAb 4107-76-1 liga-se apenas ao complexo e não à trombina biotinilada livre. Finalmente pela ELISA dupla em sanduíche com dois MAb usando o MAb EST6 para evitar adsorção directa da trombina à placa, a ligação do MAb 4107-76-1 ocorre apenas com o complexo mas não com trombina. Quando o peptídeo C-terminal de rHVl 40-65substitui rHVl no complexo, não ocorre ligação do MAb 4107-76-1, sugerindo que toda a molécula de rHVl é
158, 1988), conforme (Grutter et al., loc.
necessária para a ligação. No entanto, a substituição de rHVl pela variante rHV3 reduz a ligação do MA 4107-76-1 ao complexo apenas parcialmente, sugerindo gue os MAbs reconhecem um determinante comum. Nem inibidores de baixo peso molecular nem heparina puderam induzir a ligação do MAb à trombina. Estes resultados sugerem que o MAb 4107-76-1 reconhece um neo-epítopo na trombina expresso quando da ligação de rHVl ou da adsorção de trombina a uma fase sólida. A trombina sofre alteração conformacional quando da ligação de rHVl (S. Konno et al., Arch. Biochem.Biophys. 267.
confirmado por dados de cristalografia cit.). Esta alteração conformacional deve criar neo-epítopos imunodominantes. A alteração conformacional ou mesmo a desnaturação de um antigênio quando da adsorção a uma superfície sólida está bem documentado e pode explicar a ligação do MAb 4107-76-1 à trombina adsorvida à superfície.
Alguns resultados de testes para o anticorpo monoclonal do grupo II MAb 4107-76-1 estão apresentados na Tabela 2.
» «
Tabela 2: Determinação por ELISA da ligação do complexo trombina/rHVl aos MAbs absorvância (405 nm) reagentes adicionados
MAb4107-76-l| MAb EST6
trombina biotinilada 1 0,040 | 0,719
trombina biotinilada e rHVl 1 1,027 | 1,018
rHVl biotinilada 1 0,013 [ 0,020
PBS-Tween 1 0,009 | 0,017
A: Os reagentes foram adicionados às placas de microtitulação revestidas com os MAbs e foram reveladas com estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina
Exemplo 7 ELISA em sanduíche oara determinação do complexo trombina/hirudina no plasma
A determinação específica do complexo trombina/hirudina no plasma foi conseguida pela ELISA em sanduíche usando o MAb4107-76-l como anticorpo de captura e o MAb 4158-81-7 como segundo anticorpo. A ELISA é uma modificação da ELISA descrita no exemplo 5.4 por substituição do MAb EST6 com o MAb 4107-76-1 e foi realizada como descrito a seguir.
Placas de microtitulação foram revestidas com o MAb 4107-76-1 (0,2 gg/100 gl). Após bloqueio com PBS-BSA 1% e lavagem com PBS-Tween 0,1%, 200 gl de plasma a ser testado foram adicionados à cavidade e incubados durante 2 horas. Então adicionaram-se consecutivamente os seguintes reagentes: (1) 0,5 gg/100 gl do MAb 4158-81-7 biotinilado durante 2 hors, (2) estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (diluido a 1:2500) durante 1,5 h, (3) substrato (ver exemplo 5.2). As incubações foram feitas a
22°c. Entre cada um dos passos as placas foram lavadas com
PBS-Tween 0,1%. A absorvância foi controlada a 405 nm após 15 a minutos.
teste permite a determinação da presença e/ou a concentração do complexo trombina/hirudina em concentrações que variam entre 1 e 200 ng/ml.
Exemplo 8 Kit de testes para uma ELISA para determinação do complexo trombina/hirudina
Um Kit de testes para a ELISA descrito no exemplo 7 contem:
. placas de microtitulação em cloreto de polivinilo;
. 20 ml do anticorpo monoclonal MAb 4107-76-1 (10^g/ml) em tampão de revestimento;
. 20 ml do MAb 4158-81-7 biotinilado em PBS-Tween 0,1% (5 μ9/ιη1) ; . 2 ml de solução padrão contendo 5 ^g de rHVl;
. 300 ml de PBS-Tween 0,1%;
. 300 ml de PBS-BSA 1%;
. 0,5 ml de estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina;
. 50 ml de p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml) em tampão de dietanolamina (10%, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN^, ajustado a pH 8,9 com HCl);
. curva de calibração;
. escala de intensidade de cor;
. manual de instruções.

Claims (19)

  1. lâ. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal que é dirigido contra o complexo trombina/hirudina, e de um seu derivado que mantém a especificidade dos anticorpos de onde eles derivam, caracterizado por as células de uma linha de células de hibridoma que secretam o referido anticorpo serem multiplicadas in vitro ou in vivo e, quando necessário, o anticorpo monoclonal obtido ser isolado e/ou convertido num seu derivado.
  2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser dirigido contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina variante 1 (HV1).
  3. 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser dirigido contra o complexo trombina/hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante (rHV).
  4. 4S. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para apreparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser dirigido contra o complexo trombina-hirudina em que a hirudina é hirudina recombinante variante 1 (rHVl).
  5. 5a.
    cações 1 a 4 seu derivado,
    - Processo de acordo com qualquer uma das reivindipara a preparação de um anticorpo monoclonal e um caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer * * determinantes da fracção de hirudina no complexo trombina-hirudina.
  6. 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 4 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer determinantes da fracção hirudina recombinante variante 1 (rHVl) no complexo trombina/rHVl.
  7. 7a. - processo de acordo com a reivindicação 6 para a preparação de um anticorpo monoclonal e de um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer determinantes dentro do domínio N-terminal no nucleóide da fracção hirudina recombinante variante 1 (rHVl) no complexo trombina/rHVl.
  8. 8§. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser designado MAb 4158-81-7.
  9. 9§. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer determinantes da fracção trombina no complexo trombina/hirudina.
    IOã. - Processo de acordo com a reivindicação 4 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer determinantes da fracção de trombina no complexo trombina/rHVl.
    llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 10 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal reconhecer determinantes da fracção de trombina no complexo trombina/rHVl que ficam expostos para ligação ao anticorpo apenas quando a trombina está ligada à hirudina ou a uma superfície sólida mas não reconhecer a trombina livre em solução.
  10. 12a. - Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11 para a preparação de um anticorpo monoclonal e um seu derivado, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser designado por MAb 4107-76-1.
  11. 13 3. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal, qeu é um conjugado com uma enzima, com uma marca fluorescente, com uma marca quimioluminescente, com um quelato de metais, com avidina, com biotina ou similares.
  12. 14a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal que é marcado radioactivamente.
  13. 15a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal que é um fragmento.
    »
    163. - Processo para a preparação de uma linha de células de hibridoma que secreta anticorpos monoclonais dirigidos contra o complexo trombina/hirudina, caracterizado por um animal adequado ser imunizado com hirudina acoplada a um veículo adequado ou com o complexo trombina/hirudina, células produtoras de anticorpos de ratinho serem fundidas com células de uma linha celular contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas e os clones de células que secretam os anticorpos monoclonais pretendidos serem seleccionados.
  14. 17ã. - Processo de acordo com a reivindicação 16 para a preparação de uma linha celular de hibridoma, caracterizado por a linha celular de hibridoma ser um híbrido de células de mieloma e de linfócitos B de uma mamífero imunizado com hirudina acoplada a um veículo adequado ou com o complexo trombina/hirudina.
  15. 18â. - Processo de acordo com a reivindicação 17 para a preparação de uma linha celular de hibridoma, caracterizado por a linha celular de hibridoma ser um híbrido de células de mieloma de ratinho e linfócitos B de um ratinho imunizado com hirudina recombinante variante l(rHVl) acoplada a um veículo adequado ou complexo trombina/rHVl.
  16. 19a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18 para a preparação de uma linha celular de hibridoma, caracterizado por a linha celular de hibridoma ser designada 4158-81-7 e ter sido depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) com o número 90061405 em 14 de Junho de 1990.
  17. 20- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18 para a preparação de uma linha celular de hibridoma, caracterizado por a linha celular de hibridoma ser designada 4107-76-1 e ter sido depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) com o número 90061404 em 14 de Junho de 1990.
  18. 21§. - Método para a utilização de um anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado preparado por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o referido anticorpo ser utilizado para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina in vitro ou in vivo.
  19. 22s. - Equipamento (kit) de testes para a determinação qualitativa e quantitativa do complexo trombina/hirudina, caracterizado por compreender um anticorpo monoclonal e/ou um seu derivado preparado por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e, facultativamente outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou aditivos.
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