PT991661E

PT991661E - Proteina quimerica do reflector soluvel da interleucina 6/ligando, seus analogos e suas utilizações

Info

Publication number: PT991661E
Application number: PT98931006T
Authority: PT
Inventors: Judith Chebath; Michel-Weizmann Revel; Tsvee Lapidot; Orit Kollet
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2007-01-31
Also published as: PL199212B1; DE69836217T2; EP0991661A2; BG64680B1; BG104070A; HU225855B1; CY1105895T1; DK0991661T3; BR9812096B1; ES2271999T3; ATE342915T1; IL133972A; US7374912B2; EA200000109A1; PL338002A1; US20070172455A1; HUP0002426A3; EA004793B1; EP0991661B1; HK1031895A1

Description

1

DESCRIÇÃO "PROTEÍNA QUIMÉRICA DO RECEPTOR SOLÚVEL DA INTERLEUCINA— 6/LIGANDO, SEUS ANÁLOGOS E SUAS UTILIZAÇÕES" Área da invenção A presente invenção enquadra-se em termos gerais na área das actividades biológicas da interleucina-6 (IL-6) que são dependentes da acção agonista do receptor solúvel de IL-6 (sIL-6R). Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com novas proteínas quiméricas SIL-6R/IL-6 preparadas pela fusão das formas essencialmente naturais de SIL-6R e IL-6, e dos seus análogos biologicamente activos, as quais são particularmente úteis para tratar cancro, através da inibição do crescimento de células cancerosas, para melhorar o transplante de medula óssea, para tratar distúrbios hepáticos e outras patologias relacionadas com a IL-6 .

Antecedentes da Invenção e Técnica Precedente A interleucina-6 (IL-6) é uma citocina bem conhecida cujas actividades biológicas são mediadas por um sistema receptor membranar compreendendo duas proteínas diferentes uma chamada receptor da IL-6 (IL-6R ou gp80) e a outra gpl30 (revista por Hirano et al, 1994) . As formas solúveis de IL-6R (sIL-6R), correspondentes ao domínio extracelular da gp80, são produtos naturais do organismo humano presentes como glicoproteínas no sangue e na urina (Novick et al, 1990, 1992). Uma propriedade excepcional das moléculas de SIL-6R é que elas actuam como agonistas potentes da IL-6 em muitos tipos de células incluindo células humanas (Taga et al, 1989; Novick et al, 1992). Isto deve-se ao facto de, mesmo sem o domínio 2 intracitoplasmático da gp80, o SIL-6R ser ainda capaz de despoletar a dimerização de gpl30 em resposta à IL-6, a qual por sua vez medeia a transdução subsequente do sinal especifico para a IL-6 e os efeitos biológicos (Murakami et al, 1993) . 0 complexo receptor da IL-6 activo é de facto uma estrutura hexamérica constituída por duas cadeias gpl30, dois IL-6R e dois ligandos IL-6 (Ward et alr 1994; Paonessa et al, 1995), na qual o SIL-6R tem dois tipos de interacção com a gpl30 os quais são ambos essenciais para as actividades biológicas especificas da IL-6 (Halimi et al, 1995) . 0 tratamento com o SIL-6R origina um melhoramento das actividades biológicas da IL-6 em muitos tipos de células. Um exemplo é as células tumorais cujo crescimento é inibido numa maior extensão pela IL-6 quando se adiciona SIL-6R, como é o caso das células mieloleucémicas Ml de murideo (Taga et al, 1989), células T47D de cancro da mama humano (Novick et al, 1992) ou células do cancro do pulmão de células não pequenas humanas (Ganapathi et al, 1996). A IL-6 tem actividades antimetastáticas in vivo (Katz et al, 1995), e o sIL-6R também pode intensificar tais efeitos antitumorais in vivo da IL-6 (Mackiewicz et al 1995) . Outras actividade da IL-6 que é intensificada pela adição de SIL-6R é a estimulação das células pluripotentes hematopoiéticas para produzir colónias multilinhagem (Sui et al, 1995) . Os actuais inventores também observaram que a sobrevivência de culturas primárias de oligodendrócitos cerebrais é suportada pela associação SIL-6R e IL-6 (Oh, 1997), enquanto a IL-6 sozinha é pouco activa nestas culturas (Kahn e De Vellis, 1994). Esta descoberta indica que a IL-6, quando combinada com o sIL-6R, pode mimetizar a actividade de outras citocinas neurotróficas tal como o 3

Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF) ou Factor Inibidor da Leucemia (LIF) as quais também actuam através da gpl30, como também é o caso das IL-11 e Oncostatina M (Hirano et al, 1994) .

Numa tentativa para proporcionar uma molécula que pudesse combinar as funções acima assinaladas da IL-6 e do sIL-6R foi recentemente relatada a produção, em células de levedura recombinantes, de uma proteína de fusão entre um segmento truncado da sequência do IL-6R humano e a IL-6, unidos por um grupo de ligação rico em glicina (Fischer et al., 1997). Esta proteína de fusão inclui essencialmente apenas o domínio N do receptor de citocina IL-6R e o domínio C do receptor de citocina, e carece desse modo praticamente de todo o domínio de tipo imunoglobulina (Ig) do IL-6R, e a região pré-membranar do receptor (a região entre o domínio C e o domínio transmembranar). Como tal ele representa uma forma truncada do SIL-6R, encontrando-se este sIL-6R truncado ligado através do grupo de ligação rico em glicina a praticamente toda a forma madura da IL-6 na proteína de fusão. Além de não possuir partes do SIL-6R natural, esta proteína de fusão ao ser produzida em células de levedura, não possui o padrão de glicosilação que uma tal proteína de fusão teria se tivesse sido produzida em células de mamíferos, em particular, por exemplo, em células humanas. Na realidade, esta proteína de fusão produzida em levedura tem um peso molecular de apenas cerca de 57 kDa em contraste com um produto de fusão contendo essencialmente todos os resíduos de aminoácido dos sIL-6R e IL-6 naturais e totalmente glicosilado em células de mamíferos (por exemplo, humanas), a qual tem um peso molecular expectável de cerca de 85 kDa (ver Exemplo 2 a seguir). 4 A experiência corrente no desenvolvimento de proteínas recombinantes que podem ser utilizadas para tratar doentes humanos mostrou que é importante permanecer tão próximo quanto possível das formas naturais das proteínas, tal como elas estão presentes no organismo humano, para evitar o aparecimento de anticorpos e outros efeitos secundários observados com produtos recombinantes não naturais. Por esta razão tem sido vantajoso utilizar sistemas celulares mamíferos recombinantes para produzir proteínas glicosiladas tal como Interferão-β ou factor estimulador de colónias de granulócitos (Chernajovsky et ai, 1984, Holloway, 1994) numa forma química tão semelhante quanto possível do produto humano natural. As bactérias ou microrganismos tais como, por exemplo, leveduras, as quais não glicosilam adequadamente, também originam um enrolamento errado das cadeias da proteína, conduzindo a reacções imunogénicas. Isto é particularmente importante relativamente à IL-6 a qual é fortemente modificada após tradução por N- e O-glicosilação bem como por fosforilação (Revel, 1989 para uma revisão) , e em relação ao SIL-6R natural do sangue e urina humanos que é uma glicoproteína cujos aminoácidos N-terminais e C-terminais são constantes e foram determinados (Novick et ai, 1990 e as patentes em co-propriedade com os actuais inventores US 5 216 128 e a sua correspondente EP 413908 Bl).

Assim sendo, pareceria que o produto de fusão acima descrito entre parte do sIL-6R e a IL-6 teria um número de desvantagens potenciais especialmente no que se refere à sua utilização para tratar humanos e isto devido ao facto de não possuir parte do sIL-6R e da sua produção em leveduras poder proporcionar uma glicosilação incorrecta da proteína. 5

Até à data não foi descrita uma molécula de fusão compreendendo o SIL-6R natural presente nos fluidos orgânicos humanos e a IL-6 natural e que seja produzida em células humanas ou de outros mamíferos.

Por conseguinte é um objectivo da presente invenção proporcionar uma tal molécula de fusão compreendendo o sIL-6R natural e a IL-6 natural (por qualquer ordem) a qual é produzida em células de mamíferos. É um outro objectivo da presente invenção utilizar uma tal proteína de fusão (quimera de SIL-6R/IL-6) para inibir o crescimento de células de melanoma extremamente metastático em concentrações muito baixas, em que estas células são resistentes à IL-6 ou ao sIL-6R sozinho. É ainda um outro objectivo utilizar uma tal proteína de fusão (a quimera SIL-6R/IL-6) para o enxerto in vivo de células pluripotentes hematopoiéticas humanas em protocolos de transplante de medula óssea. É ainda um outro objectivo da presente invenção utilizar uma tal proteína de fusão noutros distúrbios relacionados com a IL-6, por exemplo, patologias hepáticas ou patologias neurológicas.

Um outro objectivo da invenção é proporcionar composições farmacêuticas que contêm a proteína de fusão de SIL-6R natural- IL-6 natural supramencionada (quimera sIL-6R/IL-6) para o tratamento de cancro, para ser utilizada em procedimentos de transplante de medula óssea e para outros 6 distúrbios relacionados com a IL-6, por exemplo, patologias hepáticas ou patologias neurológicas.

Outros objectivos e aspectos da presente invenção serão descritos ou surgirão evidentes da descrição que se segue da presente invenção.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção foi produzida uma proteína quimérica glicosilada do receptor de interleucina-6 solúvel (SIL-6R)-interleucina-6 (IL-6) e seus análogos biologicamente activos compreendendo uma proteína de fusão entre o sIL-6R e a IL-6, em que a referida SIL-6R/IL-6 e os referidos análogos desta retêm o mesmo padrão de glicosilação do compostos quimera das sequências naturais quando expressadas em células de mamíferos, em que o SIL-6R e a IL-6 são as formas naturais ou são caracterizados por adições de até 20 aminoácidos, delecções de até 30 aminoácidos e/ou substituições de até 30 aminoácidos nas sequências naturais e em que o referido SIL-6R está fundido com a IL-6 directamente ou através de uma molécula de ligação do tipo péptido a qual é um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Fen-Met) , ou um péptido com 13 resíduos de aminoácidos da sequência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Fen-Gli-Ala-Gli-Leu-Val-Leu-Gli-Gli-Gln-Fen-Met). Uma vez que os grupos de ligação que representam sequências de aminoácidos não naturais podem ser determinantes antigénicos imunogénicos indutores de anticorpos nos doentes é preferível ter uma quimera SIL-6R/IL-6 directamente fundida que possua a actividade biológica desejada, tendo ao mesmo tempo um risco minimizado de induzir uma tal formação potencialmente perniciosa de anticorpos quando se administra uma tal quimera. 7 A conservação da sequência completa do SIL-6R incluindo o domínio de tipo Ig tal como presente na molécula natural, assim como da glicosilação apropriada e de outras modificações pós-tradução introduzidas pelas células humanas ou de mamíferos quando a quimera anterior é produzida em tais células, são também importantes para reduzir a imunogenicidade potencial do produto de proteína quimérica.

Na realidade foi surpreendentemente demonstrado de acordo com a presente invenção que os grupos de ligação mais compridos não são essenciais para a actividade da proteína quimérica indicando que o enrolamento apropriado da quimera não requer um grupo de ligação mais comprido em especial quando essencialmente a totalidade das sequências naturais das unidades sIL-6R e IL- -6 são incorporadas na molécula quimérica (ver Exemplo 3 e Fig. 5 os quais se relacionam também com a comparaçao entre uma quimera de SIL-6R/IL-6 possuindo um grupo de ligação muito curto (3 aminoácidos) e uma quimera semelhante possuindo um grupo de ligação mais comprido com 30 aminoácidos).

Estas proteínas de fusão ou quimeras SIL-6R/IL-6 foram produzidas de modo eficaz, de acordo com a presente invenção, em sistemas de expressão de células de mamíferos para produzir produtos glicosilados com actividade potente sobre células tumorais que são geralmente não reactivas à IL-6 ou ao SIL-6R sozinhos, e os quais foram extremamente eficazes em garantir o sucesso do enxerto de células de medula óssea humana transplantadas (ver abaixo e Exemplos 1-4). Na realidade, nestes transplantes de medula óssea, as quimeras de SIL-6R/IL-6 foram essenciais para a sobrevivência e proliferação das células pluripotentes 8 hematopoiéticas não diferenciadas, transplantadas. Além disso, a partir dos resultados experimentais apresentados abaixo, assim como a partir de outras análises deduz-se que se pode preparar vários análogos da proteína quimérica sIL-6R/IL-6 da invenção, os quais têm essencialmente a mesma actividade biológica da quimera de SIL-6R/IL-6, sendo estes análogos quimeras de SIL-6R/IL-6 nas quais foram eliminados, adicionados ou substituídos por outros um ou mais resíduos de aminoácidos, como se definiu acima.

As formas de realização da proteína quimérica da invenção acima incluem: (i) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6, a qual é a aqui designada sIL-6RôVal/IL-6 possuindo um grupo de ligação tripeptídico com a sequência E-F-M entre a Val-356 C-terminal do SIL-6R e a Pro-29 N-terminal da IL-6, em que a referida proteína quimérica possui a sequência descrita na Fig. 3. (ii) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6, a qual é a aqui designada sIL-6RôVal/L/IL-6 possuindo um grupo de ligação peptídico de 13 aminoácidos com a sequência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M entre a Val-356 C-terminal do sIL-6R e a Pro-29 N-terminal da IL-6, em que a referida proteína quimérica possui a sequência descrita na Fig. 3 em que o tripéptido com a sequência E-F-M entre as posições 357-359 da Fig. 3 está substituído pela referida sequência de péptido com 13 aminoácidos. (iii) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6, como acima, em que a referida proteína é produzida em células de mamíferos numa forma completamente processada. 9 (iv) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6, como acima, em que a referida proteína é produzida em células humanas. (v) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos, como acima, em que a referida proteína quimérica e análogos são caracterizados por serem capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas extremamente malignas. (vi) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos, como acima, em que a referida proteína quimérica e análogos são caracterizados por serem capazes de inibir o crescimento de células de melanoma extremamente malignas. (vii) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos, como acima, em que a referida proteína quimérica e análogos são caracterizados por serem capazes de viabilizar o enxerto in vivo de células hematopoiéticas humanas em transplantes da medula óssea. (viii) Uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos, como acima, em que a referida proteína quimérica e análogos são caracterizados por serem capazes de proteger o fígado contra agentes hepatotóxicos. A presente invenção também proporciona uma sequência de ADN que codifica uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos como assinalado acima de acordo com a invenção. 10

Além disso, a presente invenção também proporciona um vector de ADN compreendendo uma sequência de ADN que codifica uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos da invenção, como assinalado acima, em que o referido vector é adequado para a expressão da referida proteína quimérica em células de mamíferos.

Formas de realização do vector de ADN da invenção incluem: (i) Um vector de ADN em que o referido vector é adequado para a expressão da referida proteína quimérica em células humanas. (ii) Um vector de ADN em que quando o referido vector é expressado em células de mamífero ou humanas, a proteína quimérica expressada tem uma sequência que permite um processamento total da proteína quimérica pela célula de mamífero ou humana e a secreção da proteína quimérica totalmente processada das células para o meio de cultura no qual se multiplica as referidas células. (iii) Um vector de ADN, como acima, em que o referido vector é o plasmídeo aqui designado pcDNAsIL-6R/IL-6 compreendendo um vector pcDNA3 contendo a sequência de ADN que codifica a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 sob o controlo de um promotor de citomegalovírus (CMV). (iv) Um vector de ADN, como acima, em que o referido vector é o plasmídeo aqui designado pcDNA SIL-6R/L/IL-6 compreendendo um vector pcDNA3 contendo a sequência de ADN que codifica a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 sob o controlo de um promotor de citomegalovírus (CMV), e em que 11 na referida sequência de ADN que codifica a referida proteína quimérica SIL-6R/IL-6 está inserida uma sequência de ligação que codifica um grupo de ligação peptídico no sítio EcoRI colocada entre a sequência que codifica a parte sIL-6R e a sequência que codifica a parte IL-6 da proteína.

De igual modo, a presente invenção também proporciona células de mamíferos transformadas contendo um vector de ADN, como acima, que é capaz de expressar a sequência da proteína quimérica sIL-6R/IL-6 transportada pelo referido vector e de processar totalmente a proteína expressada e a segregar para o meio de cultura no qual se multiplica as referidas células.

Uma forma de realização destas células transformadas são as aqui descritas células renais embrionárias humanas 293 (HEK293) transfectadas com o vector pcDNA SIL-6R/IL-6, em que as referidas células são capazes de expressar a proteína quimérica SIL-6R/IL-6, de processar totalmente a referida proteína e de segregar a referida proteína para o meio de cultura no qual se multiplica as referidas células na forma de uma glicoproteína com cerca de 85 kDa. A presente invenção também proporciona um método para produzir uma proteína quimérica ou seus análogos biologicamente activos, como acima, compreendendo multiplicar as células transformadas supramencionadas em condições adequadas para a expressão, processamento e secreção da referida proteína ou análogos para o meio de cultura no qual se multiplica as referidas células; e purificar a referida proteína ou análogos a partir do referido meio de cultura por cromatografia de 12 imunoafinidade utilizando anticorpos monoclonais específicos para o sIL-6R. A proteína quimérica da presente invenção tem um número de utilizações que incluem: (i) utilização de uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou análogos, sais de qualquer um destes, e suas misturas como um inibidor de células neoplásicas. (ii) utilização, como em (i) acima, como um inibidor de células de melanoma extremamente malignas. (iii) utilização de uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou análogos, sais de qualquer um destes, e suas misturas, como uma substância activa para viabilizar o enxerto de células hematopoiéticas humanas no transplante de medula óssea. (iv) utilização de uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou análogos, sais de qualquer um destes, e suas misturas, como uma substância activa para aumentar a hematopoiese, para tratar patologias hepáticas e neurológicas, ou para outras aplicações nas quais são utilizados o IL-6 ou sIL-6R.

Analogamente, a proteína quimérica da presente invenção pode ser utilizada para preparar medicamentos para um número de indicações clínicas, nomeadamente, uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou análogos, sais de qualquer um destes e suas misturas para ser utilizada na preparação de um medicamento para tratar cancros através da inibição de células neoplásicas, ou na preparação de um 13 medicamento para melhorar o transplante de medula óssea através da viabilização do enxerto de células hematopoiéticas humanas no transplante de medula óssea, ou na preparação de um medicamento para aumentar a hematopoiese, ou na preparação de um medicamento para tratar distúrbios neurológicos ou na preparação de um medicamento para outras aplicações nas quais são utilizados o IL-6 ou sIL-6R.

Além disso, a presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo como substância activa uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou um seu análogo como acima, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

As formas de realização desta composição farmacêutica da invenção incluem: (i) Uma composição farmacêutica para o tratamento de cancros em mamíferos. (ii) Uma composição farmacêutica para melhorar o transplante de medula óssea. (iii) Uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios hepáticos e neurológicos, ou para aumentar a hematopoiese ou para outras aplicações nas quais são utilizados o IL-6 ou sIL-6R.

Para evitar dúvidas, a presente invenção relaciona-se com uma quimera entre a IL-6 e o SIL-6R por qualquer ordem, isto é, as partes N-terminal e C-terminal podem estar invertidas e, neste caso, a quimera é uma proteína IL-6- 14 sIL-6R, embora seja aqui referida ao longo de todo o texto como proteína SIL-6R/IL-6.

Descrição Abreviada dos Desenhos A Figura 1 (A, B) esboça uma representação esquemática dos vários vectores, reagentes e passos do processo utilizados na construção da molécula de ADN quimérico que codifica uma proteína quimérica na qual é conservada a estrutura da forma natural do SIL-6R que termina no resíduo Vai 356 seguida pela sequência da forma natural, madura, processada da IL-6, como pormenorizados no Exemplo 1; A Figura 2 (A,B) mostra os resultados obtidos a partir da análise efectuada para identificar a quimera sIL-6R5Val/IL-6 p86 por electroforese em gel de poliacrilamida (A) e por perfil de bioactividade (B), em que na Fig. 2A se mostra uma reprodução de um gel revelado com Coomassie no qual foram imunopurifiçadas fracções electroforéticas eluídas a partir de colunas de cromatografia de afinidade carregadas com uma amostra de proteína segregada obtida a partir de culturas de células transfectadas com um vector que codifica a proteína quimérica; e na Fig. 2B mostra-se uma representação gráfica da actividade biológica (inibição do crescimento de células de melanoma FIO. 9) de cada uma das fracções acima assinaladas eluídas a partir das colunas de cromatografia de afinidade, tudo como pormenorizado nos Exemplos 2 e 3;

A Figura 3 representa a sequência de aminoácidos (código de uma letra) da quimera sIL-6RôVal/IL-6 na qual se mostra os vários domínios da molécula, incluindo o péptido de sinalização N-terminal (linha na parte superior da sequência), o domínio tipo imunoglobulina (Ig), o domínio N 15 do receptor de citocina (sublinhado), o domínio C da citocina (linha na parte superior da sequência) e a região pré-membranar do receptor (a região entre o domínio C e o domínio transmembranar), todos da parte SIL-6R da quimera; assim como a unidade de IL-6 madura (sublinhada) da quimera, como se descreve nos Exemplos 1 e 2; A Figura 4 (A, B) mostra fotografias de células do melanoma FIO.9 em cultura sem (A) e com (B) tratamento com a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 durante 4 dias, em que na Fig. 4B estão evidentes as alterações morfológicas induzidas nas células de melanoma metastáticas (células FIO. 9) pelo tratamento com a quimera de SIL-6R/IL-6, como se descreve no Exemplo 3; A Figura 5 é uma representação gráfica dos resultados que representam a inibição do crescimento de células de melanoma FIO.9 pela proteína quimérica SIL-6R/IL-6 em várias concentrações da quimera que variam desde cerca de 0,12 ng/ml até cerca de 150 ng/ml, na qual a quimera com um grupo de ligação contendo apenas 3 aminoácidos IL-6RIL-6 como se descreve no Exemplo 3 é comparada com uma quimera possuindo um grupo de ligação com 13 aminoácidos de comprimento (IL-6RLIL-6); A Figura 6 é uma representação gráfica dos resultados que mostram a ausência de efeitos inibidores do crescimento em células de melanoma FIO.9 da IL-6 isolada, sozinha (curva superior a tracejado com quadrados a branco) a concentrações que variam desde 0-40 ng/ml de IL-6 e do sIL-6R sozinho (ponto de convergência de todas as curvas no eixo vertical onde a concentração de IL-6 é zero) ; assim como os efeitos inibidores do crescimento observados quando 16 a IL-6 e o SIL-6R são adicionados em conjunto a várias concentrações de cada um em que a concentração de IL-6 varia desde 10 ng/ml até 40 ng/ml, e o SIL-6R é adicionado a três concentrações de 100 ng/ml, 200 ng/ml e 400 ng/ml para cada concentração de IL-6, como se ilustra nas três curvas inferiores (duas curvas a tracejado com triângulos e círculos a branco e uma curva contínua com quadrados a cheio), como se descreve no Exemplo 3; A Figura 7 é uma reprodução de um autorradiograma de uma transferência de Southern que mostra a necessidade da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 para um enxerto com sucesso de células pluripotentes hematopoiéticas humanas durante o transplante de medula óssea em ratinhos SCID-NOD (as duas pistas da direita representam os ratinhos que receberam a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 para além dos outros factores necessários, SCF, FLT-3, e isto em contraste com as três pistas da esquerda que representam ratinhos que receberam apenas SCF e FLT-3 e SCF, FLT-3 assim como isolado, isto é, IL-6 e sIL-6R não fundidos), como se descreve no Exemplo 4; A Figura 8 é um gráfico de Scatchard das características de afinidade da quimera de SIL-6R/IL-6 relativamente à mistura de IL-6 e sIL-6R, os valores da quimera estão representados por quadrados a cheio e os da mistura por losangos a cheio, sendo a relação dos declives de 4 para 1; A Figura 9 mostra a actividade mais elevada da quimera de SIL-6R/IL-6 nas células de melanoma F10.9 relativamente à da mistura de SIL-6R + IL-6, ou à do SIL-6R (sem IL-6); 17 A Figura 10 mostra a protecção da quimera de sIL-6R/IL-6 contra a toxicidade hepática, correspondendo os valores à média de 4 experiências, em que os quadrados a cheio representam IL-6-/ratinhos, os losangos a cheio representam ratinhos IL-6-/- que receberam IL-6 e as estrelas a cheio representam ratinhos IL-6-/- que receberam a quimera; A Figura 11 representa a sequência de aminoácidos (código de uma letra) da quimera IL-6-sIL-6R5Val 3e, em que está sublinhado o grupo de ligação; e A Figura 12 mostra a actividade biológica da quimera 3e nas células de melanoma da Fig. 9 (estrelas cheias a escuro) relativamente à quimera de SIL-6R/IL-6 (quadrados a cheio) e a dois mutantes (Mutt 39 (HD) - losangos a cheio) e Mutt NHD - estrelas cheias a claro), como se descreveu no Exemplo 9.

Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção relaciona-se com uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos, como definidos acima. Constatou-se que uma tal proteína quimérica SIL-6R/IL-6 produzida de acordo com a presente invenção em células de mamíferos, em particular, em células humanas (ver Exemplos 1-4 abaixo) ou células de CHO (ver Exemplo 6 abaixo) é expressada eficientemente em tais células, é altamente glicosilada e tem actividade potente em células tumorais que não apresentam nenhuma à IL-6 ou ao sIL-6R sozinho.

Mais particularmente, de acordo com a presente invenção observou-se (ver Exemplos 1-3 abaixo) que a 18 proteína quimérica SIL-6R/IL-6 supramencionada da invenção provoca a paragem do crescimento de células de mamíferos extremamente malignas tais como as células de melanoma FIO.9 a concentrações menores do que as necessárias quando se utiliza uma mistura de sIL-6R e IL-6 não fundidos. Este é um resultado particularmente significativo tendo em consideração que estas células de melanoma FIO.9 continuam a crescer normalmente quando tratadas apenas com IL-6 ou apenas com sIL-6R em separado, e sofrem uma paragem do crescimento apenas quando expostas a doses relativamente elevadas de uma associação de IL-6 e SIL-6R não fundidos.

Assim sendo, a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 da presente invenção é surpreendentemente um inibidor mais potente destas células de melanoma extremamente malignas do que uma mistura das suas partes separadas, isto é, uma mistura de IL-6 e SIL-6R não fundidos. A proteína quimérica da presente invenção é assim particularmente útil como uma substância activa para tratar vários tipos de cancros. A maior actividade da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 proteína é explicada pela sua maior afinidade para a gpl30 do que a da mistura de IL-6 e sIL-6R não fundidos (Exemplo 7) .

Além disso também se constatou de acordo com a presente invenção (ver Exemplo 4 abaixo) que uma molécula quimérica de SIL-6R/IL-6 da presente invenção é particularmente útil para melhorar o transplante de medula óssea. Na realidade, utilizando um protocolo conhecido para enxerto de células de medula óssea humana em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID), nos quais são utilizados o factor de células pluripotentes (SCF) e o 19 ligando Flt3 para viabilizar a sobrevivência e proliferação das células pluripotentes hematopoiéticas pluripotenciais mais primitivas capazes de enxerto a longo prazo na medula óssea do receptor, constatou-se que estes factores, SCF e ligando Flt3, eram insuficientes para promover o enxerto de células humanas na medula óssea do ratinho receptor e que só quando a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 era também adicionada foi o enxerto efectuado com sucesso. Estas observações indicam que a proteína quimérica pode ser essencial em tais protocolos de enxerto. Nas mesmas experiências, os IL-6 e sIL-6R não fundidos quando adicionados separadamente foram insuficientes para promover com sucesso o transplante da medula óssea e quando adicionados em conjunto foram muito menos activos do que a proteína quimérica SIL-6R/IL-6, isto é a uma concentração eficaz de 100 ng/ml a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 promoveu o transplante com sucesso de medula óssea, ao passo que os sIL-6R e IL-β não fundidos, separados quando adicionados em conjunto em concentrações mais elevadas (sIL-6R desde 125-1250 ng/ml, IL-6 desde 50-200 ng/ml) foram muito menos activos na promoção de um tal transplante. A proteína quimérica SIL-6R/IL-6 acima da invenção é de um modo preferido uma quimera de SIL-6R/IL-6 glicosilada recombinante produzida em células humanas ou em qualquer outro sistema de expressão de células de mamífero adequadas que seja capaz de glicosilar proteínas como o fazem as células humanas e que introduza as mesmas modificações pós-tradução como o fazem as células humanas. Uma característica importante é que a glicoproteína quimérica assim produzida é processada e modificada como o são as moléculas parentais sIL-6R e IL-6 naturais presentes no 20 organismo humano, sem truncamento e sem adição de sequências de polipéptidos não naturais estranhas, à excepção do tripéptido muito curto ou quando um grupo de ligação peptídico mais comprido é incorporado entre as unidades sIL-6R e IL-6 da proteína quimérica.

Para preparar a proteína quimérica preferida da invenção acima consideraram-se as seguintes características dos sIL-6R e IL-6 naturais: sabe-se que o IL-6R presente nas membranas de células humanas é produzido por um ADNc que codifica 468 aminoácidos compreendendo um péptido de sinalização, um domínio de tipo Imunoglobulina (Ig), um domínio de ligação de citocina, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático (Yamasaki et al, 1988) . Nos fluidos orgânicos está presente uma forma solúvel de sIL-6R o qual tem, tal como o IL-6R maduro das membranas, uma extremidade N correspondente à Leu-20 (Novick et al, 1990) e uma extremidade C correspondente à Val-356 imediatamente antes da região transmembranar do IL-6R (ver Patente U.S. n° 5 216 128 e EP 413.908 BI das quais somos co-proprietários). Para fundir esta sequência de SIL-6R à IL-6, introduziu-se um sítio de restrição EcoRI após a Val-356. A sequência da IL-6 madura que começa na Pro-29 do ADNc da IL-6 e que termina na Met-212 (Zilberstein et al, 1986; Hirano et al, 1986) foi introduzida após este sítio EcoRI. Neste sítio EcoRI poderia também ser introduzido, mas não obrigatoriamente, um grupo de ligação peptídico do comprimento desejado para separar as unidades SIL-6R e IL-6 uma da outra na proteína quimérica. Como se descreve nos exemplos abaixo, produziu-se duas proteínas quiméricas diferentes como exemplos de tais proteínas quiméricas possíveis, uma possuindo um grupo de ligação tripeptídico e a outra possuindo um grupo de ligação com 13 resíduos de 21 aminoácidos neste sítio EcoRI, possuindo ambos essencialmente a mesma actividade biológica. A presente invenção relaciona-se também com os análogos anteriores da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 da invenção, análogos esses que retêm essencialmente a mesma actividade biológica da proteína quimérica possuindo essencialmente apenas as sequências naturais dos sIL-6R e IL-6. Estes análogos podem ser aqueles nos quais foram eliminados, adicionados ou substituídos por outros até cerca de 30 resíduos de aminoácidos nas unidades sIL-6R e/ou IL-6 da proteína quimérica, de modo a que as modificações deste tipo não alterem substancialmente a actividade biológica do análogo da proteína quimérica relativamente à própria proteína quimérica e nos quais a unidade SIL-6R de tais análogos retenha essencialmente a estrutura natural (antes do processamento - ver Fig. 3) de um péptido de sinalização, um domínio de tipo Ig, domínio N do receptor de citocina, domínio C do receptor de citocina e domínio pré-membranar do receptor. Do mesmo modo, esses análogos da proteína quimérica devem reter essencialmente a forma madura natural da unidade de IL-6. Os vários análogos podem diferir mais uns dos outros e da molécula básica da proteína quimérica (aquela essencialmente com as sequências naturais dos SIL-6R e IL-6) no sítio do grupo de ligação peptídico que une as unidades de SIL-6R e IL-6 na proteína quimérica. Um tal grupo de ligação pode possuir até cerca de 30 aminoácidos de comprimento e serve para separar as unidades sIL-6R e IL-6 uma da outra na proteína quimérica. No que se refere a um tal grupo de ligação deverá ter-se cuidado para escolher a sua sequência (e, por isso, também testar biologicamente em ensaios correntes apropriados cada um desses análogos) para que ela, por exemplo, não origine 22 um enrolamento incorrecto da proteína quimérica que a possa tornar inactiva ou que não transforme o análogo da proteína quimérica numa proteína imunogénica que induza anticorpos contra a mesma num doente que esteja a ser tratado com aquele, resultando daqui um análogo que será ineficaz pelo menos como um medicamento de médio ou longo prazo.

No que se refere aos análogos acima da proteína quimérica da invenção, estes análogos são aqueles nos quais um ou mais e até cerca de 30 dos resíduos de aminoácidos da proteína quimérica básica da invenção estão substituídos por resíduos de aminoácidos diferentes, ou estão eliminados, ou nos quais estão adicionados um ou mais e até cerca de 20 resíduos de aminoácidos na sequência original da proteína quimérica da invenção (aquela essencialmente com apenas as sequências naturais dos sIL-6R e IL-6) sem modificar consideravelmente a actividade dos produtos resultantes em relação à proteína quimérica básica da invenção. Estes análogos são preparados por sínteses conhecidas e/ou por técnicas de mutagénese orientadas para o local, ou por qualquer outra técnica conhecida adequada para esse efeito.

Qualquer um destes análogos tem de um modo preferido uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa da quimera básica de SIL-6R/IL-6 de modo a possuir uma actividade consideravelmente semelhante a esta. Assim pode determinar-se se um dado análogo tem consideravelmente a mesma actividade da proteína quimérica básica da invenção por meio de experiências de rotina compreendendo submeter um tal análogo aos ensaios de actividade biológica descritos nos Exemplos 2-4 abaixo. 23

Os análogos da proteína quimérica que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, ou os ácidos nucleicos que os codificam, incluem um conjunto finito de sequências fundamentalmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição os quais podem ser rotineiramente obtidos por um técnico médio na matéria, sem experimentação excessiva, com base nos ensinamentos e directrizes aqui apresentadas. Para uma descrição pormenorizada da química e estrutura da proteína, ver Schulz, G.E. et al., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1978; e Creighton, T.E., Proteins. Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983. Para uma apresentação de substituições de sequência de nucleótidos, tais como preferências de códão, ver Ausubel et al, supra, em §§ A.1.1-A.1.24, e Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y. §§ 6.3 e 6.4 (1987, 1992), nos Apêndices C e D.

As alterações preferidas para os análogos de acordo com a presente invenção são aquelas que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos da proteína quimérica possuindo essencialmente as sequências naturais dos SIL-6R e IL-6 podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo que têm propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula, Grantham, Science, Vol. 185, páginas 862-864 (1974). É evidente que também podem ser feitas inserções e delecções de aminoácidos nas sequências definidas acima sem que se altere a sua função, em particular se as inserções ou delecções envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta, e 24 de um modo preferido menos de dez, e não eliminarem ou substituírem aminoácidos que sejam críticos para um conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína, Anfinsen, “Principies That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, páginas 223-230 (1973). Os análogos produzidos por tais delecções e/ou inserções caem dentro do objectivo da presente invenção.

De um modo preferido, os grupos de aminoácidos sinónimos são os definidos no Quadro I. De um modo mais preferido, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro II; e de um modo muito preferido os grupos de aminoácidos sinónimos são os definidos no Quadro III. QUADRO I Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo

Ser Ser, Tre, Gli, Asn Arg Arg, Gin, Lis, Glu, His Leu Ile, Fen, Tir, Met, Vai, Leu Pro Gli, Ala, Tre, Pro Tre Pro, Ser, Ala, Gli, His, Gin, Tre Ala Gli, Tre, Pro, Ala Vai Met, Tir, Fen, Ile, Leu, Vai Gli Ala, Tre, Pro, Ser, Gli Ile Met, Tir, Fen, Vai, Leu, Ile Fen Trp, Met, Tir, Ile, Vai, Leu, Fen Tir Trp, Met, Fen, Ile, Vai, Leu, Tir Cis Ser, Tre, Cis His Glu, Lis, Gin, Tre, Arg, His Gin Glu, Lis, Asn, His, Tre, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lis Glu, Gin, His, Arg, Lis 25

Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lis, Asn, Gin, His Met Fen, Ile, Vai, Leu, Met Trp Trp

Arg, Glu QUADRO II Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos

Aminoácido Grupo Sinónimo Ser Ser Arg His, Lis, Arg Leu Leu, Ile, Fen, Met Pro Ala, Pro Tre Tre Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, Ile Gli Gli Ile Ile, Met, Fen, Vai, Leu Fen Met, Tir, Ile, Leu, Fen Tir Fen, Tir Cis Cis, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lis Lis, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Fen, Ile, Vai, Leu Trp Trp QUADRO III Grupos Muito Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met 26 26 Pro Pro Tre Tre Ala Ala Vai Vai Gli Gli Ile Ile, Met, Leu Fen Fen Tir Tir Cis Cis, Ser His His Gin Gin Asn Asn Lis Lis Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Trp Os exemplos da produção de substituições de aminoácidos em proteínas que podem ser utilizados para se obter análogos da proteína quimérica para serem utilizados na presente invenção incluem quaisquer passos metodológicos conhecidos, como os apresentados nas patentes U.S. RE 33 653, 4 959 314, 4 588 585 e 4 737 462, de Market et al; 5 116 943 de Koths et al., 4 965 195 de Namen et al; 4 879 111 de Chong et al; e 5 017 691 de Lee et al; e as proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente U.S. n° 4 904 584 (Shaw et al).

Noutra forma de realização preferida da presente invenção, qualquer análogo da proteína quimérica para ser utilizado na presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que corresponde à da proteína quimérica básica 27 da invenção assinalada acima. 0 termo "que corresponde essencialmente à" pretende incluir análogos com modificações menores na sequência da proteína quimérica básica que não afectam as características básicas desta em particular no que se refere, por exemplo, à sua capacidade para inibir a proliferação de células neoplásicas ou promover os transplantes da medula óssea. Os tipos de modificações que são geralmente consideradas dentro da linguagem "que corresponde essencialmente à" são aquelas resultantes de técnicas de mutagénese convencionais do ADN que codifica a proteína quimérica da invenção, que originam algumas modificações menores, e da selecção da actividade desejada do modo discutido acima.

Os análogos de acordo com a presente invenção incluem os codificados por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, o qual hibridiza com ADN ou ARN em condições rigorosas e o qual codifica uma proteína quimérica de acordo com a presente invenção, compreendendo essencialmente todas as sequências naturais que codificam os sIL-6R e IL-6. Por exemplo, um tal ADN ou ARN híbrido pode ser um que codifique a mesma proteína da invenção possuindo, por exemplo, a sequência descrita na Fig. 3, mas que difira, na sua sequência de nucleótidos, da sequência de nucleótidos naturais em virtude da degeneração do código genético, isto é, uma sequência de ácido nucleico algo diferente pode continuar a codificar a mesma sequência de aminoácidos, devido à sua degeneração. Além disso, como também foi assinalado acima, a quantidade de modificações de aminoácidos (delecções, adições, substituições) está restringida até cerca de 30 aminoácidos, de modo a que até mesmo com a quantidade máxima de modificações, os análogos de acordo com a presente invenção serão aqueles que retêm 28 essencialmente a sequência líder (antes do processamento), o domínio tipo Ig, os domínios N e C do receptor de citocina e a região pré-membranar do receptor (a região entre o domínio C e o domínio transmembranar) na unidade de sIL-6R e essencialmente toda a unidade de IL-6. Um tal ácido nucleico seria um candidato fundamental para se determinar se ele codifica um polipéptido que retém a actividade funcional da proteína quimérica da presente invenção. 0 termo "condições rigorosas" refere-se às condições de hibridação e lavagem subsequente a que os técnicos médios na matéria se referem convencionalmente como "rigorosas". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. Interscience. N.Y., parágrafos 6.3 e 6.4 (1987, 1992), e Sambrook et al., supra. Sem restrições, os exemplos de condições rigorosas incluem condições de lavagem 12-20 °C abaixo do Tm calculado para o híbrido em estudo, por exemplo, em 2 x SSC e 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% de SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37 °C durante 30-60 minutos e depois 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Os técnicos médios na matéria compreendem que as condições rigorosas também dependem do comprimento das sequências de ADN, das sondas de oligonucleótidos (tal como 10-40 bases) ou sondas mistas de oligonucleótidos. Se forem utilizadas sondas mistas é preferido usar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel supra. O termo "sais" refere-se aqui tanto a sais de grupos carboxílicos como a sais de adição de ácido de grupos amino da proteína quimérica da invenção ou análogos destes. Os sais de um grupo carboxilo podem ser preparados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por 29 exemplo, sais de sódio, cálcio, amónio, férrico ou zinco, e semelhantes, e os sais com bases orgânicas como aqueles preparados, por exemplo, com aminas, tal como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e similares. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, os sais com ácidos minerais tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Evidentemente, quaisquer destes sais têm de ter uma actividade consideravelmente semelhante à da proteína quimérica da invenção ou seus análogos. A presente invenção também se relaciona com sequências de ADN que codificam a proteína quimérica da invenção acima e seus análogos, assim como com vectores de ADN portadores de tais sequências de ADN para expressão em células de mamífero adequadas, de um modo preferido células humanas. Uma forma de realização de um vector da invenção é um plasmídeo de pcDNA SIL-6R/IL-6 compreendendo o vector pcDNA3 (Invitrogen) contendo as sequências de SIL-6R/IL-6 fundidos sob o controlo de um promotor de citomegalovírus (CMV). A presente invenção também se relaciona com células de mamíferos, de um modo preferido células humanas, transformadas que sejam capazes de expressar as proteínas anteriores da presente invenção. Uma forma de realização de tais células transformadas são células renais embrionárias humanas 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfectadas com o pcDNA SIL-6R/IL-6 que segregam a proteína quimérica de sIL-6R/IL-6 fundidos como uma glicoproteína de 85 kDa. 30

Uma outra forma de realização é um plasmídeo de pcDNA sIL—6R/L/IL—6 que difere do pcDNA SIL-6R/IL-6 anterior pela inserção de grupos de ligação curtos que codificam 10 aminoácidos adicionais no sitio EcoRI. Pode introduzir-se um número de sequências diferentes, de vários comprimentos, para se optimizar a distância entre o sIL-6R e a IL-6. A invenção também inclui uma proteína quimérica na qual a unidade de IL-6 precede o sIL-6R (como na Fig. 11). A presente invenção relaciona-se ainda com um método para produzir e purificar a proteína quimérica da invenção ou os seus análogos o qual compreende multiplicar as células transformadas anteriores em condições adequadas para a expressão e secreção do produto proteína quimérica para o meio de cultura e depois purificar a proteína segregada por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos monoclonais anti-sIL-6R 34.4 como se descreve nos Exemplos 2 e 5 abaixo. A invenção também se relaciona com a composição farmacêutica compreendendo como substância activa uma quimera de SIL-6R/IL-6 ou seus análogos ou suas misturas ou sais destes e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma forma de realização da composição farmacêutica da invenção inclui uma composição farmacêutica para intensificar a acção de tipo IL-6, para o tratamento de cancros, para o transplante de medula óssea, para aumentar a hematopoiese, em particular trombopoiese, para o tratamento de patologias neurológicas, para o tratamento de distúrbios hepáticos e outras aplicações da IL-6 ou citocinas relacionadas. 31

As composições farmacêuticas da invenção são preparadas para administração misturando a proteína quimérica, ou seus análogos com veículos e/ou estabilizantes e/ou excipientes fisiologicamente aceitáveis, e preparadas numa forma de dosagem, por exemplo, por liofilização em frasquinhos de dosagem. 0 método de administração pode ser via qualquer um dos modos de administração aceites para agentes semelhantes e dependerá da patologia a ser tratada, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, por injecção local ou aplicação tópica, ou continuamente por infusão, etc. A quantidade de substância activa a ser administrada dependerá da via de administração, da doença a ser tratada e do estado do doente. A injecção local, por exemplo, requererá uma quantidade menor da proteína numa base de massa corporal do que a infusão intravenosa. A presente invenção também se relaciona com utilizações da proteína quimérica da invenção ou dos seus análogos ou suas misturas para o tratamento de cancros, para transplantes da medula óssea, para aumentar a hematopoiese, em espacial a trombopoiese, para o tratamento de patologias neurológicas, para a protecção de tecidos hepáticos em doentes com doenças necróticas devido a substâncias químicas (por exemplo, tetracloreto de carbono, álcool, paracetamol) ou outras causas (por exemplo, virai, cirúrgica) e para serem utilizados noutras aplicações da IL-6 ou citocinas relacionadas. Do mesmo modo, a presente invenção também se relaciona com a proteína quimérica ou seus análogos ou suas misturas para serem utilizados na preparação de medicamentos para tratar os males supramencionados ou para serem utilizados nas indicações descritas acima. 32

Além dos métodos de tratamento mencionados acima, também são contemplados os procedimentos ex-vivo e a terapia de genes com a quimera e/ou com o ADN que a codifica . A presente invenção será agora descrita em mais pormenor nos Exemplos não restritivos que se seguem e nos desenhos que os acompanham.

Exemplo 1: Construção do vector de expressão da quimera de SIL—6R5Val/lL—6

Na Figura 1 é mostrado um diagrama de fluxos esquemático dos passos efectuados para construir o vector de expressão portador da sequência que codifica a proteína quimérica de sIL-6RôVal/IL-6, abrangendo todos os vários vectores de partida e intermediários, os vários reagentes e passos reaccionais. Este procedimento de construção baseou-se essencialmente na utilização de técnicas bem conhecidas na área para a construção de vectores de expressão de escolha (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989). 0 procedimento foi, abreviadamente, como se segue:

Clonou-se uma biblioteca de ADNc a partir de células T47D de carcinoma da mama humano no bacteriófago lambda(λ)gtll e seleccionou-se com sondas de oligonucleótidos derivadas da sequência do IL-6R de Yamasaki et al (1988) . Isolou-se um clone de ADNc Xgtll que possuía a sequência codificadora do IL-6R humano inteiro. A inserção foi retirada por excisão a partir do Xgtll pela EcoRI e clonada no Sítio de Clonagem Múltipla (MCS) do fagemídeo de E.coli Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Califórnia). Este plasmídeo pBS/SK-IL-6R 33 (Figura 1) foi cortado pela EcoRI, as extremidades foram depois tornadas planas e novamente cortadas com a EcoRV para isolar o fragmento 5' do IL-6R com 959 pares de bases (bp) que termina no sitio EcoRV do IL-6R (coordenada 1203) . Este fragmento, extraído de uma electroforese de gel em agarose, foi clonado num novo vector pBS/SK aberto no EcoRV do MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV na Figura 1). O ADN de pBS/SK-IL-6R anteriormente obtido, acima descrito foi submetido à Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar um fragmento com 368 pb entre o iniciador directo 1137-1156 e o iniciador inverso 1505-1488. O iniciador inverso foi sintetizado com um sítio EcoRI imediatamente após o códão para a Valina-356 do IL-6R (ver Figura 1), uma vez que se determinou anteriormente que este resíduo de Valina correspondia ao aminoácido da extremidade carboxilo da forma natural do sIL-6R solúvel excretado na urina humana (Novick et al, 1990; Oh et al, 1996; Patente U.S. em co-propriedade n° 5 216 128 e Patente EP n° EP 413908 Bl) . O produto de PCR foi cortado pela EcoRV e pela EcoRI e ligado ao pBS/SK-sIL-6R-RV entre o sítio EcoRV do IL-6R e o sítio EcoRI do MCS (Figura 1) . O plasmídeo pBS-sIL-6R-ôVal-RI resultante foi depois encurtado para eliminar sequências 5' não traduzidas por ligação do sítio HindIII do MCS com o sítio Ncol no par de base 410 do IL-6R (em que as extremidades de ambos os sítios são primeiramente tornadas planas), para produzir o pBS-sIL-6R-5Val-RI-NcoI (Figura 1).

A sequência da IL-6 foi derivada do plasmídeo ρΚΚβ2-7 o qual, como anteriormente descrito (Chen et al, 1988), foi construído pela inserção do ADNc de IFN-P2/IL-6 sem BstNI 34 (Zilberstein et al, 1986) no sítio EcoRI do vector de expressão pKK223-3 de E.coli (Pharmacia, Uppsala, Suécia) utilizando um oligonucleótido sintético com um sítio EcoRI seguido de um codão de Metionina e o codão para a Prolina- 29 da IL-6 e que termina num sítio BstNI (EcoRII). A inserção de ADNc da IL-6 do ρΚΚβ2-7 termina 7 pares de bases após o codão de terminação num sítio NlalV e é seguida 11 pb mais à frente pelo sítio HindIII do vector pKK223-3 (Figura 1) . 0 ADN do ρΚΚβ2-7 foi cortado com HindIII, as extremidades foram tornadas planas e novamente cortado com EcoRI e o ADNc da IL-6 inserido no pBS-sIL-6R-ôVal-RI-NcoI de modo a fundir a sequência madura da IL-6 (começando na Prolina-29) imediatamente após a Valina-356 do IL-6R e separada por apenas 3 codões (Glu-Fen-Met). 0 plasmideo de pBS/SK-sIL-6R/IL-6 resultante (Figura 1) foi depois novamente cortado nos sítios Sall e Notl do seu MCS e a inserção foi clonada no sítio EcoRV do pcDNA3 (Invitrogen Corporation, SanDiego, Califórnia). 0 plasmideo pCDNA3-sIL-6R/IL-6 resultante (Figura 1) contém a inserção a jusante do promotor forte do citomegalovírus (CMV), seguido de um sítio de poliadenilação que garante a transcrição eficiente da quimera de sIL-6RôVal/IL-6. A conservação da extremidade 5' do sIL-6R na quimera garante que após expressão em células de mamíferos a função de sinalização do péptido e o processamento da extremidade N da proteína quimérica serão como no sIL-6R natural.

Como indicado acima, uma característica vantajosa da construção de sIL-6R5Val/IL-6 é aquela que é essencialmente a fusão da forma natural do SIL-6R e da forma natural da IL-6 como elas existem no organismo humano e sem sequências de polipéptidos estranhas. No entanto, a conservação do 35 sítio EcoRI na construção sIL-6RôVal/IL-6 (Figura 1) permite introduzir facilmente segmentos de ligação à base de polipéptidos entre as unidades de SIL-6R e IL-6. Foi também construída uma tal construção (sIL-6RôVal/L/IL-6) com a sequência de ligação de 13 aminoácidos Glu-Fen-Gli-Ala-Gli-Leu-Val-Leu-Gli-Gli-Gln-Fen-Met introduzida entre a Val-356 do SIL-6R e a Pro-29 da IL-6.

Exemplo 2: Expressão da quimera de sIL-6R5Val/IL-6 em células humanas.

Utilizando técnicas essencialmente correntes de cultura de células de mamíferos, transfecção celular e análise das células transfectadas para a expressão da sequência de ADN introduzida de novo a ser expressada (para procedimentos, ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989), utilizou-se a construção de plasmídeo acima (Exemplo 1) para transfectar células humanas e avaliou-se a sua expressão nestas. Abreviadamente, utilizou-se os procedimentos seguintes:

Transfectou-se células humanas HEK 293 (ATCC CRL 1573, células primárias renais embrionárias humanas transformadas) com a construção plásmica de ADN de pCDNA3-SIL-6R/IL-6 (descrita no Exemplo 1 acima). Adicionou-se tripsina a culturas de fase logarítmica de HEK 293 e semeou-se em placas Nunc de 9cm (2,5xl06 células/placa). Um dia depois, efectuou-se a transfecção com 10 μρ de ADN de pCDNA3-sIL-6R/IL-6 pelo procedimento de precipitação com CaP04 (Sambrook et al, 1989) e 1 hora depois mudou-se o meio para DMEM-10% de FCS e prosseguiu-se a cultura durante mais 16 horas. Depois de mudar o meio para DMEM-2% de FCS, recolheu-se as proteínas segregadas durante dois períodos 36 consecutivos de 48 horas. Eliminou-se os detritos por centrifugação a 1.000 rpm durante 10 minutos e testou-se o sobrenadante com um ELISA para o SIL-6R utilizando anticorpos policlonais anti-sIL-6R de coelho e McAB 17.6 de ratinho (Novick et al, 1991). Determinou-se uma concentração de 1,2 pg/ml de equivalentes de sIL-6R, indicadora de uma expressão muito eficiente da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 nas células humanas transfectadas. A imunopurificação da proteína quimérica segregada (sIL-6R/IL-6) foi realizada com o Anticorpo Monoclonal 34.4 específico para um determinante antigénico no domínio extracelular do SIL-6R humano (Novick et al, 1991; Halimi et al, 1995). Multiplicou-se as células de hibridoma 34.4 na cavidade peritoneal de ratinhos e obteve-se a fracção de imunoglobulina (Ig) a partir do fluido da ascite por precipitação com sulfato de amónio. Utilizou-se Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, Califórnia) para imobilizar McAB 34.4 (15 mg de Ig acoplado a 1 ml de Affigel-10). Adsorveu-se os sobrenadantes contendo as proteínas segregadas a partir das células HEK 293 transfectadas com pCDNA3-sIL-6R/IL-6 nas colunas de McAB 34.4 (colunas de 0,3 ml para 15 ml de sobrenadante) . Depois de lavar com PBS, eluiu-se as proteínas ligadas com ácido cítrico 25 mM pH 2,5, neutralizou-se imediatamente a seguir com tampão de Hepes 1 M pH 8,5 e submeteu-se a diálise dum dia para o outro (cerca de 8-12 h) contra PBS. A análise da proteína imunopurifiçada por electroforese em gel de poliacrilamida em SDS mostrou uma banda única de proteína revelada com azul de Coomassie (Figura 2). 0 peso molecular da proteína foi de 85 quilodaltons como esperado para a fusão das formas 37 glicosiladas de sIL-6RôVal (60 kDa como se mostra em Oh et al, 1996) e IL-6 glicosilada (23-26 kDa como se mostra em Zilberstein et al, 1986) . A sequência de aminoácidos da SIL-6R/IL-6 possui 543 aminoácidos r o que após processamento dos péptidos de sinalização levaria a prever uma proteína com 524 aminoácidos ou cerca de 58 kDa (Figura 3). 0 tamanho muito maior da quimera de SIL-6R/IL-6 produzida a partir do ADN recombinante em células humanas indica que a glicosilação contribui para uma porção bastante grande da molécula.

Exemplo 3: A quimera de SIL-6R/IL-6 pára o crescimento e induz a diferenciação de células metastáticas de melanoma. 0 clone FIO.9 derivado de células de melanoma B16 forma tumores extremamente metastáticos em ratinhos C57Pretos/6 o qual mata os animais de metástase pulmonar em 2-3 meses (Katz et al, 1995). A adição da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 a culturas de células FIO.9 produz uma alteração morfológica profunda nas células e uma paragem no seu crescimento (Figura 4) . As células FIO. 9 tratadas pela quimera tornam-se mais alongadas, com extensões dendríticas salientes, que se assemelham à diferenciação espinal de melanócitos embrionários ou células gliais.

Quantificou-se o crescimento das células 4 dias após a cultura de 3xl03 células nos poços de uma microplaca de 96 poços em 0,2 ml de meio RPMI 1640 com 10% de FCS. Fixou-se as células em glutaraldeído a 12,5% durante 30 minutos, lavou-se em água e revelou-se com violeta de cristal a 0,1% durante 30 minutos. Após lavagem profunda e secagem, extraiu-se a mancha com ácido acético a 10% e determinou-se 38 a densidade óptica a 540 nm. A quimera produziu uma inibição do crescimento dependente da dose com uma inibição total do crescimento a concentrações tão baixas como 10 ng/ml da proteína quimérica (p85) (Figura 5) . Ambas as proteínas quiméricas sIL-6R5Val/IL-6 e sIL-6RôVal/L/IL-6 (quimera com o grupo de ligação mais comprido entre as unidades de SIL-6R e IL-6, ver Exemplo 1) foram igualmente activas. Este resultado também serve para mostrar que o grupo de ligação peptídico entre as unidades de sIL-6R e IL-6 na quimera não é essencial para a actividade da quimera já que a quimera sIL-6RôVal/IL-6 acima tem apenas um grupo de ligação muito curto com 3 aminoácidos enquanto a sIL-6RôVal/L/IL-6 acima tem um grupo de ligação peptídico mais comprido com 13 aminoácidos, mas ambas têm essencialmente a mesma actividade na inibição do crescimento de células metastáticas. Em contraste, nem a IL-6 sozinha nem o sIL-6R 5Val sozinho inibiu o crescimento destas células de melanoma (Figura 6) o que demonstra a actividade única da proteína quimérica de SIL-6R/IL-6 (p85). Para se obter um efeito semelhante é necessária uma mistura de 200-400 ng/ml de IL-6 e 125 ng/ml de sIL-6RÔVal (Figura 6). Quando calculada em concentrações molares, a inibição máxima das células F10.9 requereu 7,5 nM de IL-6 e 2 nM de sIL-6RôVal contra apenas 0,12 nM da quimera de sIL-6R/IL-6. A actividade inibidora do crescimento da proteína quimérica de p85 SIL-6R/IL-6 foi seguida durante a imunopurificação nas colunas de McAB 34.4 (ver Exemplo 2). O padrão de actividade correspondeu à intensidade da banda p85 observada nas diferentes fracções da electroforese de gel em poliacrilamida de SDS na Figura 2. 39

Exemplo 4: A quimera de SIL-6R/IL-6 é essencial para o enxerto de células de medula óssea humana transplantadas 0 enxerto de células pluripotentes a partir da medula óssea humana pode ser estudado após transplante em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) (Vormoor et al, 1994) . Submeteu-se ratinhos SCID-NOD a irradiação subletal e injectou-se na veia da cauda com 3xl05 células de medula óssea humana CD34+. Antes da injecção, as células de CD34+ purificadas foram mantidas durante 3 dias em culturas liquidas com combinações diferentes de citocinas. Após um mês, sacrificou-se os ratinhos e retirou-se os ossos para se colher as células da medula óssea. Avaliou-se o enxerto de células humanas no ratinho SCID-NOD receptor por hibridação da transferência de Southern com ADN de repetição humano.

Constatou-se que o factor de células pluripotentes (SCF, factor "steei" ou ligando de ckit) e o ligando de Flt3 (ligando do receptor de tirosina-cinase flt3/flk2) são importantes para a sobrevivência e proliferação das células pluripotentes hematopoiéticas pluripotenciais mais primitivas capazes de enxerto a longo prazo em medula óssea receptora (McKenna et al, 1995). Como se observa na Figura 7, estes dois factores por si só foram insuficientes para promover o enxerto de células humanas na medula óssea dos ratinhos SCID-NOD receptores. A adição da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 foi necessária para se detectar o enxerto a níveis significativos. A 100 ng/ml, a quimera de SIL-6R/IL-6 foi muito mais activa do que os IL-6 (50-200 ng/ml) e SIL-6R (125-1250 ng/ml) isolados (Figura 7) . A exigência para a presença da quimera de SIL-6R/IL-6 indica que esta proteína é essencial para a sobrevivência e 40 proliferação das células pluripotentes hematopoiéticas pluripotenciais não diferenciadas as quais se podem alojar e repovoar o meio da medula óssea, indicando que esta proteína pode ser útil em protocolos clínicos de transplante de medula óssea.

Esta é a primeira demonstração de que a quimera de SIL-6R/IL-6 tem pelo menos estas duas actividades agora encontradas: (i) Quando adicionada em conjunto com ambos os factores SCF e ligando de Flt3 a células progenitoras primitivas hematopoiéticas humanas, ela promove a sua sobrevivência e proliferação; e (ii) É activa (e manifestamente essencial) num modelo in vivo de um transplante de medula óssea humana em ratinhos imunodeficientes.

Exemplo 5: A quimera de SIL-6R/IL-6 é activa em células pluripotentes hematopoiéticas primitivas extremamente purificadas

Colocou-se estas

Submeteu-se células mononucleares do sangue do cordão umbilical humano a fraccionamento de células mononucleares de baixa densidade (NMC) em Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) seguida de um estojo mini MACS (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) para preparar uma população com 80% de pureza de células CD34+. Passou-se em seguida estas células sobre anticorpos monoclonais anti-CD38 imobilizados ou escolheu-se por selecção de células activadas por fluorescência e recuperou-se a população CD34+CD38”, correspondente a cerca de 0,1% das células originais. Colocou-se estas células pluripotentes 41 purificadas (20.000 células) em culturas de suspensão em 0,5 ml de meio RPMI, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de albumina de soro de bovino contendo 50 ng/ml do factor de células pluripotentes (SCF) e 100 ng/ml de ligando de flt3 (FL) (ambos da R & D Systems, Minneapolis, MN) . Fortificou-se metade das culturas com 100 ng/ml da quimera de SIL-6R/IL-6, enquanto a outra metade não foi fortificada. A incubação foi efectuada a 37 °C em CO2 a 5%, durante 6 dias. O número das células de repovoamento da medula óssea foi avaliado por injecção (i.v.) de todas as células destas culturas in vitro em ratinhos NOD-SCID irradiados subletalmente. Os ratinhos foram mantidos em condições livres de micróbios. Após 6 semanas, sacrificou-se os ratinhos e recuperou-se a medula dos ossos compridos. Aplicou-se estas células de medula óssea (BM) em placas semi-sólidas de metilcelulose a 0,9% com 30% de FCS, β-mercaptoetanol 50 μΜ, 50 ng/ml de SCF, 5 ng/ml de IL-3, 5 ng/ml de GM-CSF, 6 u/ml de eritropoietina (todos do R&D Systems). As culturas também continham soro humano, condições que evitam o crescimento de colónias de ratinho. Os resultados (Quadro IV) indicam que a adição da quimera de SIL-6R/IL-6 às culturas de suspensão produz um aumento de 30-50 vezes no número de células formadoras de colónias humanas (CFU) recuperadas a partir de ratinhos transplantados relativamente ao SCF e FL sozinhos. Isto representa um grande aumento no número de células pluripotentes de repovoamento de SCID presentes nas culturas de suspensão no 6o dia relativamente ao dia 0. Na ausência da quimera de SIL-6R/IL-6, os SCF e FL não produziram qualquer aumento no número de células pluripotentes durante os 6 dias de cultura em suspensão. Analisou-se o ADN das células BM recuperado dos ratinhos NOD/SCID transplantados por transferência de Southern como 42 no Exemplo 4. A quantidade de ADN humano recuperado foi 10 vezes superior quando os ratinhos receberam as células cultivadas com quimera relativamente àqueles sem quimera.

Os progenitores de CFU de medula óssea de ratinhos NOD/SCID como no Quadro IV deram origem a células hematopoiéticas de diferentes linhagens mielóides (macrófagos e granulócitos) bem como das linhagens eritróide e linfóide (por exemplo, CD19+, CD56+) apenas quando as células de sangue humano foram cultivadas com a quimera de SIL-6R/IL-6 antes do transplante.

QUADRO IV Células pluripotentes humanas capazes de repovoar a medula óssea de ratinhos NOD/SCID

Adições durante a cultura Dias de em suspensão de células cultura humanas CD34+CD38” de sangue do cordão umbilical 0 SCF + FL 6 SCF + FL + SIL-6R/IL-6 6 Número de colónias hematopoiéticas humanas formadas a partir de BN de ratinhos NOD/SCID transplantados 4 2-3 50-100

Experiências adicionais compararam o efeito de sIL-6R/IL-6 na população de CD34+CD38+ do sangue do cordão umbilical com os de células pluripotentes CD34+CD38“ extremamente purificadas. A expansão in vitro das células extremamente purificadas foi muito mais intensificada pela SIL-6R/IL-6 do que aquela das células menos purificadas (Quadro V) . Isto indica que as células pluripotentes mais primitivas são o alvo preferido do efeito da SIL-6R/IL-6 na expansão celular. 43 QUADRO V Expansão in vitro de Células Pluripotentes

Hematopoiéticas

População celular aplicada Número de células Número de células no 6o dia (20.000 células) no 6 o dia com SC + com SC + FL + sIL-6R/IL-6 FL Exp. 1 CD34+CD38+ 780.000 675.000 (x 0,86) CD34+CD38~ 42.000 153.000 (x 3,6) Exp. 2 CD34+CD38+ 330.000 507.000 (x 1,5) CD34+CD38" 3.000 18.000 (x 6,0) A manutenção in vitro da actividade de repovoamento da Medula Óssea foi medida aumentando a duração da suspensão de culturas de células pluripotentes CD34+CD38~ extremamente purificadas antes da injecção em ratinhos NOD/SCID. 0 enxerto foi avaliado pela proporção de ADN humano na Medula Óssea dos ratinhos receptores 6 semanas após injecção i.v. das células cultivadas. Quando se adicionou SIL-6R/IL-6 aos SCF e FL durante as culturas, continuou-se a observar um enxerto elevado (> 1% de ADN humano) após duas semanas de cultura e o enxerto foi maior do que nas células não cultivadas. Em contraste com estas, experiências com culturas contendo SCF, FL, GM-CSF, IL-3 mostraram que não permanecem quaisquer células de repovoamento de SCID após uma semana de cultura (Bhata, M. et al., J. Exp. Med. 186, 619-624, 1997).

Estes resultados mostram que a SIL-6R/IL-6 permite aumentar e manter, as células pluripotentes primitivas humanas capazes de sofrerem enxerto em medula óssea receptora. As células pluripotentes permanecem activas num estado não diferenciado enquanto se multiplicam. A quimera 44 de SIL-6R/IL-6 proporciona um novo meio para cultivar células hematopoiéticas de enxerto. Isto também pode permitir utilizar vectores retrovirais para introduzir genes em células pluripotentes de enxerto, em protocolos de terapia génica. Até à data, isto não tinha sido possível com células pluripotentes humanas porque ainda não se tinha conseguido manter estas células primitivas num estado de repetição cíclica in vitro, como requerido para integração no ADN retroviral. A quimera de SIL-6R1L-6 resolve este problema.

Exemplo 6: Produção da quimera de IL-6R/IL-6 em células CHO

Co-transfectou-se ADN do plasmídeo SIL-6R/IL-6 pcDNA3 como na Figura 1, em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em conjunto com ADN do plasmídeo pDHFR como descrito em Mory et al (DNA 5, 181-193, 1986). Entre os transfectantes que cresceram em Metotrexato 50 nM, isolou-se o clone L12-[IL-6R/IL-6] . Constatou-se que este clone era estável ao longo de muitas passagens e culturas semi-confluentes segregando rotineiramente para o meio de cultura quantidades de 2,5 μρ/ιηΐ da quimera de IL-6R/IL-6.

Para purificação da quimera de IL-6R/IL-6, concentrou-se 3,25 litros de meio das culturas do clone L12 em soro de bovino a 2% até 200 ml. Adsorveu-se esta mistura numa coluna de 18 ml de Anticorpo Monoclonal anti-sIL-6R humano 34.4 acoplado a esferas de Affigel 10 e eluiu-se como descrito (Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). Neutralizou-se imediatamente um eluato de ácido cítrico 25 mM com tampão de Hepes 1 pH 8,6. Concentrou-se as proteínas numa membrana de corte de 10 kDa da Amicon até uma concentração final de 1 mg/ml. Após SDS-PAGE, observou-se uma única banda de 85 kDa correspondente à quimera de IL- 45 6R/IL-6. A glicosilação foi confirmada por redução do tamanho após tratamento com glicosidase (Boehringer, Mannheim). A actividade biológica da quimera de IL-6R/IL-6 produzida em CHO foi estável durante pelo menos 5 meses a 4 °C. Por rotina a armazenagem é efectuada a -70 °C.

Exemplo 7: Afinidade da quimera de IL-6R/IL-6 para a gp!30

Comparou-se a quimera de IL-6R/IL-6 produzida em células de CHO e uma mistura dos IL-6 e sIL-6R humanos para a sua ligação à forma solúvel da gpl30 (sgpl30), a qual é a segunda cadeia do sistema receptor da IL-β (ver antecedentes). Revestiu-se uma placa microtitulo de 96 poços (Nunc) com anticorpo monoclonal anti-gpl30 humana e adicionou-se 50 ng/ml de sgpl30 (ambos da R&D Systems, Minneapolis). Depois de lavar em soro fisiológico tamponado com fosfato, adicionou-se a quimera de IL-6R/IL-6 em poços diferentes a várias concentrações na gama desde 0,1 até 50 ng/ml. Em poços separados, adicionou-se rhuIL-6 (Ares-Serono, Geneva) a 500 ng/ml em conjunto com sIL-6RôVal humano a concentrações desde 2 até 500 ng/ml. Depois de incubar dum dia para o outro a 4 °C, adicionou-se um anticorpo policlonal anti-IL-6R de coelho (Oh et al., Cytokine, 8,401-409, 1996), seguido de Ig anti-coelho de cabra conjugada com peroxidase de rábano-silvestre a qual foi detectada por uma reacção corada (Sigma, St. Louis). A Figura 8 mostra um gráfico de Scatchard dos resultados. Constatou-se que a afinidade da quimera de IL-6R/IL-6 para a gpl30 era mais de 4 vezes superior à das duas partes da molécula adicionadas separadamente (6,3 x 10-11 M contra 2,6 x 10~10 M) . Este resultado está em consonância e explica a maior actividade da quimera relativamente à combinação IL-6 46 + sIL-6R nas células de melanoma e hematopoiéticas (Figura 9 e Exemplo 4).

Exemplo 8: A quimera de IL-6R/IL-6 protege da hepatotoxicidade A injecção de tetracloreto de carbono (CCI4) em ratinhos produz uma necrose grave do fígado que leva à morte dos animais (Slater T.F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sei. 311, 633-645, 1985). Quando ratinhos que são geneticamente deficientes em IL-6 (IL-6 / ) são administrados com doses relativamente baixas de CCI4 (2-3 ml/kg de peso corporal) por injecção intraperitoneal, as taxas de mortalidade às 24 horas são de cerca de 70% (Fig. 10) . A injecção da quimera de IL-6R/IL-6 produzida em CHO uma hora antes do CC14 e novamente 4 horas após o CC14 protege os animais, não se observando quaisquer mortes às 24 horas. Em contraste, a rhuIL-6 livre injectada de modo semelhante não tem qualquer efeito (Fig. 10). A quimera de IL-6R/IL-6 foi eficaz a doses de 2-3 μρ por injecção, o que em proporções molares são 10 vezes menores do que a dose de IL-6, que não foi eficaz. A doses mais elevadas de CC14 (por exemplo, 3,5 ml/kg na Fig. 10), a quimera foi também protectora, sendo a mortalidade menor do que com a IL-6 ou sem a citocina. A diferença na mortalidade entre ratinhos tratados com quimera e ratinhos não tratados, que receberam ambos a mesma inoculação com CC14, foi significativa para p<0,01. A observação histológica de secções do fígado reveladas com hematoxilina-eosina confirmou que o CC14 originava a necrose do tecido do figado, e que a quimera de IL-6R/IL-6 protege os hepatócitos deste efeito químico tóxico (não mostrado). 47

Uma aplicação da quimera de IL-6R/IL-6 pode ser na protecção de tecido hepático em doentes com doenças necróticas devido às substâncias químicas (por exemplo, álcool, paracetamol) ou outras causas (por exemplo, hepatite virai).

Exemplo 9: Construção e actividade da quimera de IL-6/sIL-6R5Val

Construiu-se uma molécula quimérica na qual a unidade de IL—6 está na extremidade N enquanto a unidade de SIL-6R está na extremidade C. 0 plasmídeo de pBS-sIL-6RôVal foi cortado no Sau3a (bp 1086) e no HindIII a seguir ao codão de paragem após a Val-356 (ver Exemplo 1) . Um grupo de ligação contendo três sítios de restrição: Spel, Smal e

BamHl foi sintetizado do seguinte modo:

Spel Smal BamHi

5' CT AGI GGG CCC GGG GTG GCG GG A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQ ID NO: 2)

Este sítio Sau3a do sIL-6R foi ligado ao BamHl do grupo de ligação e clonado no sítio de clonagem múltipla de um plasmídeo Bluescript pBS SK. A sequência da IL-6 foi amplificada por PCR a partir de ADN ρΚΚβ2-7 utilizando os iniciadores (códão de iniciação sublinhado)

Spel

Directo 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC ICC TTC TC (SEQ ID NO: 3) Inverso 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEQ ID NO:4) O produto de PCR cortado com Spel e HaelII foi introduzido entre os sítios Spel e Smal do grupo de ligação acima. Outro grupo de ligação BamHl-Ncol com um Smal interno foi sintetizado como se segue 48

Smal 5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[NcoI] [BamHl] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5' (SEQ ID NO: 5)

Clonou-se este entre o BamHl do grupo de ligação anterior e o Ncol 1464 da sequência do IL-6R. Introduziu-se em seguida um fragmento de IL-6R desde o Smal 86 7 até ao Ncol 1464 entre o Smal do segundo grupo de ligação e o Ncol do IL-6R. 0 ADN quimérico resultante foi sequenciado e reclonado em pCDNA3 para expressão em células HEK 293 humanas. A sequência de aminoácidos desta quimera de IL-6-IL-6R 3e é apresentada na Figura 11 (grupo de ligação sublinhado). A quimera 3e foi purificada por cromatografia de afinidade num anticorpo monoclonal anti-IL-6 (como em Novick et ai., Hybridoma 8, 561-567, 1989). Em SDS-PAGE, observou-se uma banda de 75 kDa. A actividade biológica da quimera de IL-6-IL-6R 3e para inibir o crescimento das células de melanoma FIO. 9 é mostrada na Figura 12. Ela é claramente activa comparativamente à quimera IL-6R/IL-6 (preparação 1-3) na mesma experiência, se bem que seja necessária uma maior quantidade para 50% de inibição do crescimento.

Preparou-se dois mutantes de IL-6R/IL-6 nos quais os aminoácidos His- -280 e Asp-281 da unidade de IL-6R da IL- 6R/IL-6 (Fig. 3) foram substituídos por Ser e Vai respectivamente por mutagénese de PCR (Mutant 3 9 ou HD), ou onde o Asn-230 estava ainda substituído por Asp (Mutant NHD) . Como se pode observar na Figura 12, estes dois mutantes não tinham quase nenhuma actividade por comparaçao com as quimeras IL-6R/IL-6 e IL-6-IL-6R. Uma vez que no IL- 49 6R, este aminoácido interage com a gpl30, como se mostrou por modelação molecular (Halimi et al., 1995), isto demonstra que a quimera de SIL-6R/IL-6 conserva este sitio de interacção essencial. A quimera de IL-6-IL-6R 3e carece do domínio de tipo imunoglobulina do IL-6R o qual está presente na IL-6R/IL-6. No entanto, a eliminação apenas deste domínio de Ig da IL-6R/IL-6 não diminuiu a sua actividade biológica sobre as células FIO.9. A ligação da quimera de IL-6-IL-6R 3e à gpl30 foi cerca de 30% da de outra quimera de IL-6R/IL-6 (não mostrado). Esta menor ligação está em consonância com a menor actividade no crescimento de células de melanoma.

Estes resultados demonstram que o bloqueio da extremidade carboxilo da IL-6 por fusão através de um grupo de ligação ao sIL-6R mantém uma boa actividade biológica nas quimeras novas.

Referências

Chen L, Mory Y, Zilberstein A e Revel M. Growth inhibition of human breast carcinoma e leukemia/lymphoma cell lines by recombinant interferon-beta 2/IL-6. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 85: 8037-8041, 1988.

Chernajovsky Y, Mory Y, Chen L, Marks Z, Novick D, Rubinstein M e Revel M. Efficient constitutive production of human fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-βΙ gene fused to an SV40 early promoter. DNA, 3: 297-308, 1984.

Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brakenhoff JPG, Kallen K-J, Wollmer A, Grotzinger J e Rose-John S. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nature Biotechnology 15: 142-145, 1997. 50

Ganapathi MK, Weizer AK, Borsellino S, Bukowski RM, Ganapathi S, Rice T, Casey G e Kawamura K. Resistance to Interleukin-6 in human Non-small cell lung carcinoma cell lines: Role of receptor components. Cell Growth and Differentiation, 7: 923-929, 1996.

Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M e Chebath J. Epitope peptides from interleukin-β receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135-143, 1995.

Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashimura S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K, Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T e Kishimoto T. Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Nature, 234: 73-76, 1986.

Hirano T, Matsuda T e Nakajima K. Signal transduction through gpl30 that is shared among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem cells, 12:262-277, 1994.

Holloway CJ. Applications of recombinant DNA technology in the production of glicosylated recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Eur. J. Câncer, 30: S2-6, 1994.

Kahn MA e De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-6 family of cytokines. Glia, 12: 87-98, 1994.

Katz A, Shulman LM, Porgador A, Revel M, Feldman M e Eisenbach L. Abrogation of B16 melanoma metastases by long-term low-dose Interleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98-109, 1993.

Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, Nowak J, Pawlowski T, Baumann H, Heinrich P e Rose-John S. Interleukin-6-type 51 cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sei., 762: 361-374, 1995.

McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, Lyman SD e Williams DE. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 86: 3413-3420, 1995.

Murakami M, Hibi M, Nakagawa N, Nagakawa T, Yasukawa K, Yamanishi K, Taga T e Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gpl30 and associated activation of a tyrosine kinase. Science, 260: 1808-1810, 1993.

Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M e Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normal urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510: 331-337, 1990.

Novick D, Engelmann H, Revel M, Leitner O e Rubinstein M. Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10: 137-146, 1991.

Novick D, Shulman LM, Chen L e Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11, 1992.

Oh J-W, Revel M e Chebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned médium of human breast carcinamoa cells is encoded by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401-409, 1996.

Oh J-W. Expression of recombinant soluble human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D. Thesis Weizmann Institute of Science (Revel M, supervisor), 1997.

Paonessa G, Graziani R, DeSerio A, Savino R, Ciapponi L, Lahmm A, Salvati AL, Toniatti C e Ciliberto G. Two distinct 52 and independent sites on IL-6 trigger gpl30 dimer formation and signalling. EMBO J., 14: 1942-1951, 1995.

Revel M. Host defense against infections and inflammations: Role of the multifunctional IL-6/IFN~p2 cytokine. Experientia 45: 549-557, 1989.

Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989.

Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S, Muraoka K, Ebihara Y, Ikebuchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T e Nakahata T. Gpl30 e c-kit signalings synergize for ex vivo expansion of human primitive hemopoietic progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 2859-2863, 1995.

Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T e Kishimoto T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer gpl30. Cell, 58: 573-581, 1989.

Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdon G, Patterson B, Broxmeyer HE e Dick JE. SCID mice as an in vivo model of human cord blood hematopoiese. Blood cells 20: 316-320, 1994.

Ward LD, Howlett GJ, Díscolo G, Yasukawa K, Hammacher A, Moritz RL e Simpson RJ. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gpl30. J. Biol. Chem., 269: 23286-23289, 1994.

Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T e Kishimoto T. Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/ Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1988.

Zilberstein A, Ruggieri R, Korn HJ e Revel M. Structure and expression of cDNA e genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2529-2537, 1986. 53

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Yeda Research and Development Co. Ltd. (B) RUA: Weizmann Institute of Science, P.O.B. 95 (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100 (G) TELEFONE: 972-8-9344093 (H) TELEFAX: 972-8-9470739 (A) NOME: REVEL, Michel (B) RUA: Beit Brazil 5, Weizmann Institute of Science (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100 (A) NOME: CHEBATH, Judith (B) RUA: Rehov Miller 13 (C) CIDADE: Rehovot (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76284 (A) NOME: LAPIDOT, Tsvee (B) RUA: Rehov Boxer 6 (C) CIDADE: Ness-Ziona (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 74046 (A) NOME: KOLLET, Orit (B) RUA: Rehov Ramat Chen 14 (C) CIDADE: Ramat Gan (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 52232 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Proteína quimérica do receptor solúvel de Interleucina-6/Ligando, seus análogos e suas utilizações 54 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (vi) DADOS DE PEDIDO PRECEDENTE: (A) NÚMERO DE PEDIDO: IL 121284 (B) DATA DE ENTRADA: 10-JUL-1997 (vi) DADOS DE PEDIDO PRECEDENTE: (A) NÚMERO DE PEDIDO: IL 122818 (B) DATA DE ENTRADA: 30-DEC-1997 (2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GIu Pha Gly Ala Gly Leu Vai Leu Gly Gly Gin Phe Met 15 10 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 55 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQD NO: 4: AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 56 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT 60 AC 62 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Gly Gly Giv Giy Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 543 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Het Leu Ala Vai Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15

Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Vai Ala Arg 20 25 30

Gly Vai Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Vai Thr Leu Thr Cys p*o 35 40 45 57

Gly Vai Glu Pro Giu Asp Asn Ala Thr Vai His Trp Vai Leu Arg Lys 50 55 60

Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Hat Gly Arg Arg 65 70 75 80

Leu Leu Leu Arg Ser Vai Gin Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 PO 95

Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Vai His Leu Leu Vai Asp Vai 100 105 110

Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 A$n Val Vai Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140

Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro Ala Giu Asp 145 150 155 160

Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys 165 170 175

Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ilg Val Ser Met ISO 185 ' 190

Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gin Thr Phe 195 200 ; 205

Gin Gly Cys Gly ile Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220

Thr Ala val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp 225 230 235 240

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255

Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270

Leu Gin His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285

Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser 290 295 300

Glu Trp Ser Pro Giu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320

Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr 325 330 335

Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 58

Ser Leu Pro Vai Glu Phe Met Pro Vai Pro Pro Gly Glu Asp Ser Ly$ 355 360 365

Asp Vai Ala Ala Pro Hís Arg Gin Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg lie 370 375 380

Asp Lys Gin Ile Arg Tyr lie teu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys 385 350 355 400

Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu 405 410 415

Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys 420 425 430

Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Vai Lys lie ile Thr 435 440 445

Gly Leu Leu Glu phe Glu Vai Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe 450 455 460

Glu Ser Ser Glu Giu Gin Ala Arg Ala Vai Gin Met Ser Thr Lys Vai 465 470 475 480

Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 485 490 495

Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin Ala 500 ' 505 . 510

Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser 515 520 525

Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin Het 530 535 540 (2) INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 471 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) MULTIPLICIDADE DA CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 59 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro vai Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Vâl Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Set Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg He Asp Lys Gin Ile Arg Tyr Ile Leu ; Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys i Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys : Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Giu Thr • Cys Leu ido 105 no

Vai Lys lie lie Thr Gly Leu Leu Giu Phe GIu Vai Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125

Leu Cln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Giu Giu Gin Ala Arg Ala Vai Gin 130 135 140

Met Ser Thr Lys Vai Leu Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160

Leu Asp Ala ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175

Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His ISO 185 190

Leu iie Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205

Leu Arg Gin Met Gly Gly Gly Gly Aso Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly 210 215 220

Pro Gly Vai Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser 225 230 ' 235 240

Pro Leu Ser Asn Vai Vai Cys Glu Tro Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser 245 250 255 60

Leu Thr Lys Ala Vai Leu Leu Vai Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro 260 265 270 Ala Giu Asp Phe Gin Giu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys 275 280 285 Phe Ser Cys Gin Leu Ala Vai pro Giu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr lie 290 295 300 Vai Ser Met Cys Vai Ala Ser Ser Vai Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr 305 310 315 320 Gin Thr Phe Gin Gly Cys Gly lie Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn 325 330 335 íle Thr Vai Thr Ala Vai Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser val Thr 340 345 350 Trp Gin Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe 355 360 365 Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp «et 370 375 380 Vai Lys Asp Leu Gin His His Cys Vai . Ile His Asp Ala Trp Ser Gly 385 390 395 400 Leu Arg His Vai Vai Gin Leu Arg Ala Gin Glu Giu Phe Gly Gin Gly 405 410 415 Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu 420 425 430 Ser Axg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Va 1 Ser Thr Pro Met Gin Ala 435 440 445 Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn I le Leu Phe Arg Asp Ser Ala 450 455 460

Asn Ala Thr Ser Leu Pro Vai 463 470

Lisboa, 5 de Dezembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína quimérica (SIL-6R/IL-6) glicosilada do receptor solúvel de interleucina-6 (SIL-6R)-interleucina-6 (IL-6) e seus análogos biologicamente activos compreendendo um produto de proteína de fusão entre o SIL-6R e a IL-6, em que a referida SIL-6R/IL-6 e os referidos análogos desta retêm o mesmo padrão de glicosilação que as sequências naturais quando expressados em células de mamíferos, em que o sIL-6R e a IL-6 são as formas naturais ou são caracterizados por adições de aminoácidos de até 20 aminoácidos, delecções de até 30 aminoácidos e/ou substituições de até 30 aminoácidos nas sequências naturais e em que o referido SIL-6R está fundido com a IL-6 quer directamente ou via uma molécula de ligação peptídica a qual é um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Fen-Met), ou um péptido de 13 resíduos de aminoácido da sequência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Fen-Gli-Ala-Gli-Leu-Val-Leu-Gli-Gli-Gln-Fen-Met).

2. Proteína quimérica SIL-6R/IL-6 de acordo com a reivindicação 1, a qual é a aqui designada sIL-6RôVal/IL-6 possuindo um tripéptido da sequência E-F-M entre a Val-356 C-terminal do sIL-6R e a Pro-29 N-terminal da IL-6 em que a referida proteína quimérica possui a sequência descrita na Fig. 3.

3. Proteína quimérica sIL-ôR/IL-β de acordo com a reivindicação 1, a qual é a aqui designada sIL-6RôVal/L/IL-6 possuindo um grupo de ligação peptídico com 13 aminoácidos da sequência E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M entre a Val-356 C-terminal do sIL-6R e a Pro-29 N-terminal da IL-6, em que a referida proteína quimérica possui a sequência 2 descrita na Fig. 3 em que o tripéptido da sequência E-F-M entre as posições 357-359 da Fig. 3 está substituído pela referida sequência peptídica com 13 aminoácidos.

4. Proteína quimérica SIL-6R/IL-6 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que a referida proteína é produzida in vitro em células de mamíferos numa forma completamente processada.

5. Proteína quimérica SIL-6R/IL-6 de acordo com a reivindicação 4, em que a referida proteína é produzida em células humanas.

6. Proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que a referida proteína quimérica e análogos são caracterizados por serem capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas extremamente malignas, viabilizar o enxerto in vivo de células hematopoiéticas humanas em transplantes da medula óssea ou de proteger o fígado de agentes hepatotóxicos.

7. Proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos de acordo com a reivindicação 6, em que as referidas células neoplásicas malignas são células de melanoma maligno.

8. Sequência de ADN que codifica uma proteína quimérica SIL-6R/IL-6 e seus análogos biologicamente activos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5.

9. Vector de ADN compreendendo a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8, em que o referido vector é 3 adequado para a expressão da referida proteína quimérica em células de mamíferos.

10. Vector de ADN de acordo com a reivindicação 9, em que o referido vector é adequado para a expressão da referida proteína quimérica em células humanas.

11. Vector de ADN de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que quando o referido vector é expressado nas referidas células, a proteína quimérica expressada tem uma sequência que permite um processamento total da proteína quimérica pelas referidas células e a secreção da proteína quimérica totalmente processada das células para o meio de cultura onde se multiplica as referidas células.

12. Células de mamíferos transformadas contendo o vector de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 até 11 as quais são capazes de expressar a sequência da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 transportada pelo referido vector e de processar completamente a proteína expressada e a segregar para o meio de cultura no qual se multiplica as referidas células.

13. Método para produzir uma proteína quimérica ou seus análogos biologicamente activos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7, compreendendo multiplicar as células transformadas de acordo com a reivindicação 12 em condições adequadas para expressão, processamento e secreção da referida proteína ou análogos para o meio de cultura onde se multiplica as referidas células; e purificar a referida proteína ou análogos a partir do referido meio de cultura. 4

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a purificação é realizada por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos monoclonais específicos para o sIL-6R.

15. Utilização da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou análogos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, sais de qualquer um destes, e suas misturas, como um inibidor de células neoplásicas ex vivo.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que as células neoplásicas são células de melanoma extremamente maligno.

17. Composição farmacêutica compreendendo como substância activa a proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou um seu análogo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, sais de qualquer um destes e suas misturas, ou a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

18. Utilização da proteína quimérica SIL-6R/IL-6 ou um análogo desta de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, sais de qualquer um destes e suas misturas, ou a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar cancros em mamíferos através da inibição das células neoplásicas de mamíferos, para melhorar o transplante de medula óssea através da viabilização do enxerto de células hematopoiéticas humanas no transplante de medula óssea, para aumentar a hematopoiese, para tratar distúrbios hepáticos ou neurológicos, ou para outras aplicações em que são utilizados o IL-6 ou SIL-6R. 5 5 células melanoma

19. Utilização da reivindicação 18, em que as neoplásicas de mamífero são células de extremamente maligno. Lisboa, 5 de Dezembro de 2006