CZ302488B6

CZ302488B6 - Chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6)

Info

Publication number: CZ302488B6
Application number: CZ20000075A
Authority: CZ
Inventors: Revel@Michel; Chebath@Judith; Lapidot@Tsvee; Kollet@Orit
Original assignee: Yeda Research And Development Company Limited
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2011-06-15
Also published as: PL199212B1; DE69836217T2; EP0991661A2; BG64680B1; BG104070A; HU225855B1; CY1105895T1; DK0991661T3; BR9812096B1; ES2271999T3; ATE342915T1; IL133972A; US7374912B2; EA200000109A1; PL338002A1; US20070172455A1; HUP0002426A3; EA004793B1; EP0991661B1; HK1031895A1

Abstract

Podstatu rešení tvorí chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6), tvorený rozpustným receptorem interleukinu-6 (sIL-6R) a interleukinem-6 (IL-6), pricemž uvedený protein sIL-6R/IL-6 se pri expresi v bunkách savcu glykosyluje stejným zpusobem, jako prirozene se vyskytující formy sIL-6R a IL-6, pricemž sIL-6R je fúzován s IL-6 prímo nebo pres peptidový linker, kterým je tripeptid se sekvencí E-F-M (Glu-Phe-Met) nebo peptid s obsahem 13 zbytku aminokyselin se sekvencí E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met).

Description

Chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6)

Oblast techniky

Vynález obecně popisuje biologické aktivity interleukinu 6 (IL-6), které závist na agonistickém působení rozpustného receptoru IL-6 (slL6R). Vynález popisuje nové chimérové proteiny sIL óRIL 6 konstruované z fúze podstatně přirozeně se vyskytující formy sIL 6R a IL-6 a jejich biologicky aktivních analogů, které jsou zvláště použitelné v případě léčby zhoubného bujení prostřednictvím inhibice růstu karcinogenních buněk, transplantace kostní dřeně, léčby poruch jater a jiných stavů, které souvisí s IL-6.

Dosavadní stav techniky

Interleukin 6 (IL-6) je dobře známý cytokin, jehož biologické aktivity zprostředkovává membránový receptorový systém, který obsahuje dva různé proteiny. Jeden se nazývá IL-6 Receptor (IL-6R nebo gp80) a druhý je gp 130 (Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signál transduction through gp 130 that is shraed axnong the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells, 12: 262 až 277, 1994). Rozpustné formy IL-6R (sIL-6R) odpovídající extracelulámí oblasti gp80 jsou přirozené produkty lidského těla a vyskytují se jako glykoproteiny v krvi a v moči (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M and Rubinstein M, Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligand- affinity and ímmunoaťfinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331 až 337, 1990; Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6 až 11, 1992). Výjimečnou vlastností molekul sIL-6R je, že působí jako silné agonisty IL-6 u mnoha typů buněk. Uvedené buňky zahrnují lidské buňky (Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T. lnterleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signál transducer gpl30. Cell, 58: 573 až 581, 1989; Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6 až 11, 1992). To způsobuje skutečnost, že dokonce bez intracytoplazmatické oblasti gp80, je slL-6R stále schopna spustit dimerizaci gpl30, jako odezvu na IL-6, který naopak zprostředkovává podstatný transdukční signál specifický pro IL-6 a biologické účinky (Murakami H, Hibi M, Nakagawa N, Nagakawa T, Yasukawa K, Yamashi K, Taga T and Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gpl30 and asociated activation of a tyrosine kinase. Science, 260: 1808 až 1810 1993). Komplex aktivního receptoru IL-6 ve skutečnosti vykazuje hexamérovou strukturu, kterou tvoří dva řetězce gpl30, dva IL-6R a dva ligandy IL-6 (Ward L. D, Hewlett G. J, Discolo G, Yasakawa K, Hammacher A, Moritz R. L and Simpson R. J. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gpl30. J. Biol. Chem., 269: 23286-23289, 1994; Paonessa G, Graziana R, DeSerio A, Savino R, Caipponi L, Lahmm A, Salvati A. L, Toniatti C and Ciliberto G. Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gpl30 dimer formation and signailing. EMBO J., 14: 1942 až 1951, 1995). sIL-6R má dva typy interakce s gpl30, přičemž obě uvedené interakce jsou podstatné při biologické aktivitě specifické pro IL-6 (Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chenath J. Epitop peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135 až 143, 1995).

Léčba síL-óR vede k zesílení biologické aktivity IL-6 u mnoha typů buněk. Příkladem jsou nádorové buňky, jejichž růst IL-6 inhibuje silněji v případě, že se přidá sIL-6R. Příkladem uvedených nádorových buněk jsou myší myeloleukémické buňky Ml (Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T, Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signál transducer gpl30. Cell, 58: 573 až 581, 1989), lidské buňky T47D karcinomu prsu (Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M.

-1 CZ 302488 B6

Enhancement of interleukin-ó cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL—6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-1 1, 1992) nebo lidské buňky karcinomu plic (buňky „Non-small“) (Ganapathi Μ. K, Weizr A. K, Borseliino S, Bukowski R. M, Ganapathi S, Rice T, Casey G and Kawamura K. Resistance to Interleukin-6 in human. Non--smáli cell lung carcinoma cell lineš: Role of receptor components. Cell Growth and Differentiation, 7: 923 až 929, 1996). IL-6 vykazuje aktivity proti tvorbě metastáz in vivo (Katz A, Shulman L. M, Porgador A, Revel M, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of B16 malanoma metastases by long- term low-dose lnterleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98 až 109, 1993), sIL-6R může také zesílit určité protinádorové účinky IL-6 in vivo (Mackiewícz A, Wiznerowicz M, Roeb E, Nowak J, Pawlowski T, Baumann H, Heinrich P and Rose-John S. Interleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New York Acad. Sci., 762: 361 až 374, 1995). Další aktivita IL-6, k jejímuž zesílení dojde přidáním sIL-óR, stimuluje he máto po i etické kmenové buňky, aby produkovaly vícerodové kolonie (Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S, Muraoka K, Ebihara Y, lkebuchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T and Nakahata T. Gpl30 and c-kit signalings synergize for ex vivo expansion of human promitive hemopoietic progenitor cells. Proč. Natl.Acad. Sci. USA 92: 2859 až 2863, 1995). Také se pozorovalo, že sIL-6R a kombinace IL-6 podporuje přežití primárních kultur mozkových oligodendrocytů (Oh J-W. Expression of recombinant soluble human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D Thesis Weizmann Institute of Science (Revel M, supervisor), 1997), zatímco samotný IL-6 je v takových kulturách pouze velmi málo aktivní (Kahn M. A and De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interíeukin-6 family of cytokines. Glia, 12: 87 až 98, 1994). Toto zjištění ukazuje, že IL-6, jestliže se kombinuje s slL-6R, může napodobovat aktivitu jiných neurotrofních cytokinů, jako je ciliámí neurotropický faktor (CNTF) nebo faktor inhibující leukémii (LIE), který také působí prostřednictvím gp 130, jako se také děje v případě IL-l 1 a onkostatinu M (Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signál transduction through gp!30 that is shraed among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells, 12: 262 až 277, 1994).

Při pokusu vytvořit molekulu, která může kombinovat shora uvedené funkce IL-6 a slL-6R, se popisuje produkce fúzního proteinu mezi zkráceným segmentem sekvence lidského IL-6R a IL-6 spojených s línkerem, který je bohatý na glycin, v rekombinantních buňkách kvasinek (Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brakenhoff J. P. G, Kallen K-J, Wolimer A, Grotzinger J and Rose-John S. A bioactive designér cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nature Biotechnology 15: 142 až 145, 1997). Tento fúzní protein zahrnuje v podstatě pouze N-oblast receptorů cytokinů IL-6R a C-oblast receptorů cytokinů a tak mu chybí v podstatě celá oblast podobná imunoglobulinu (Ig) interleukinu IL-6R a pre-mem bráno vá oblast receptorů (oblast mezi C-oblasti -a trans—membránovou doménou). To reprezentuje zkrácenou formu slL-6R. Tento zkrácený sIL-6R je ve fúzním proteinu spojen prostřednictvím shora v textu uvedeného linkerů v podstatě s celou přirozenou formou IL-6. Vedle chybějících částí přirozeného sIL-6R, tento fúzní protein produkovaný v kvasinkách nemá gly kosy lační patem, kteiý by měl, kdyby se produkoval v savčích buňkách, zvláště například v lidských buňkách. Ve skutečnosti tento fúzní protein produkovaný v kvasinkách má molekulovou hmotnost pouze přibližně 57 000 na rozdíl od fúzního produktu, který obsahuje v podstatě celý přirozený sIL-6R a aminokyselinové zbytky IL-6 a je v savčích (například v lidských) buňkách zcela glykosylován. Jeho očekávaná molekulová hmotnost je přibližně 85 000 (popisuje se dále v textu v příkladu 2).

Běžná zkušenost při vývoji rekombinantních proteinů, které se mohou použít při léčbě lidských pacientů ukázala, zeje důležité, aby rekombinantní proteiny zůstaly co nejvíce podobné jejich přirozeným formám, které se nacházejí v lidském těle. Důvodem je zabránit vývoji protilátek a jiným vedlejším účinkům, které je možné pozorovat při použití nepřirozených rekombinantních produktů. Z tohoto důvodu je výhodné při produkci glykosylovaných proteinů, jako je interferonβ nebo faktor stimulující kolonie granul ocytů (Chemajovsky Y, Mory Y, Chen L, Merks Z, Novick D, Rubinstein and Revel M. Efficient constitutive production of human fíbroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-βΙ gene fused to an SV40 early promotor.

. 7

DNA, 3: 297 až 308, 1984), které jsou svou chemickou formou co nejvíce podobné přirozenému lidskému produktu, použít rekombinantní savčí buněčné systémy. Bakterie nebo mikroorganizmy, jako jsou například kvasinky, kde nedochází ke správné glykosylaci, také způsobují nesprávné svinutí proteinových řetězců, což vede k imunogenní reakci. To je zvláště důležité s ohledem na IL-β, jehož molekula se silně upravuje posttranslačně N- a O-glykosylaci. stejně jako fosfory lácí (Revel M. Host defence against infections and inflamentations; Role of the multifunctional IL-6/IFN—β2 cytokine. Experientia 45: 549 až 557, 1989) a s ohledem na přirozený sIL-6R z lidské krve a moče, kterým je glykoprotein, jehož aminokyseliny N-konce a C-konce jsou konstantní a jsou známé (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M and Rubinstein M. Purifícation of soluble cytokine receptors from normál urine by ligandaffinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331 až 337, 1990; a patent US 5 216 128 a odpovídající EP 413908 Bl).

Proto se zdá, že shora uvedený fúzní produkt mezi částí slL-óR a IL-6 má řadu nevýhod zvláště s ohledem na jeho použití při léčbě lidí. To je způsobeno skutečností, že mu chybí Část slL-6R a že při jeho produkci v kvasinkách, může dojít k nesprávné glykosylaci proteinu.

Proto fúzní molekula obsahující sIL-6R, který se nachází v lidských tělních tekutinách, a IL-6, který produkují lidské nebo jiné savčí buňky, není popsána.

Cílem vynálezu je proto vytvořit takovou fúzní molekulu, která obsahuje přirozený sIL—6R a přirozený IL-6 (v libovolném pořadí) a která vzniká v savčích buňkách.

Dále vynález popisuje použití fúzního proteinu (chiméry SIL-6R/IL-6) k inhibici růstu silně metastázujících buněk melanomu při velmi nízké koncentraci. Tyto buňky jsou rezistentní vůči IL-6 a samotnému sIL~6R.

Dále vynález popisuje použití takového fúzního proteinu (chiméra slL-6R/IL-6) k in vivo štěpům lidských hematopoietických kmenových buněk při způsobech transplantace kostní dřeně.

Dále vynález popisuje použití takového fúzního proteinu při dalších poruchách spojených s IL-6, jakoje například poškození jater nebo neurologické poruchy.

Dále vynález popisuje farmaceutické kompozice, které obsahují shora uvedený přirozený fúzní protein sIL-6R- přirozený IL-6 (chiméra SIL-6R/IL-6) při léčbě zhoubného bujení, při transplantaci kostní dřeně a při jiných poruchách spojených s IL-6. Jsou to například poruchy jater a neurologické poruchy.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/lL-6), tvořený rozpustným receptorem interleukinu-6 (sIL-6R) a interíeukinem-6(IL-6), přičemž uvedený protein sIL-6R/IL-6 se při expresi v buňkách savců glykosyluje stejným způsobem, jako přirozeně se vyskytující formy slL-6R a IL-6, přičemž sIL-6R je fúzován s IL-6 přímo nebo přes peptidový linker, kterým je tripeptid se sekvencí E-F-M (Glu-Phe-Met) nebo peptid s obsahem 13 zbytků aminokyselin se sekvencí E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu- Val-Leu-Gly-GIy-GIn-Phe-Met).

Protože linkery reprezentující nepřirozené aminokyselinové sekvence mohou být imunogenní epitopy, vyvolávající u nemocných protilátky, je výhodné použít přímo fúzovanou chiméru sIL-GR/ÍL-6 s požadovanou biologickou účinností, čímž se minimalizuje nebezpečí tvorby potenciálně nebezpečných protilátek při případné aplikaci uvedené chiméry.

- j CZ 302488 B6

Za účelem redukce potencionální imunogenicity chimérového proteinového produktu je také důležitá konzervace celé sekvence slL-6R zahrnující oblast podobné Ig, jak se nachází v přirozeně se vyskytující molekule, stejně jako správná glykosylace a jiné po sttrans lační modifikace zavedené lidskými nebo savčím buňkami v případě, že uvedená chiméra se v takových buňkách tvoří.

Ve spojovacím místě mezi částí sIL-6R a IL-6 chimérového proteinu je však možné použít velmi krátký linker o délce přibližně 3 aminokyselin. Tak krátký linker nebude působit jako imunogenní epitop. Je také možné pro spojení obou částí použít delší linkery, až o délce 30 aminokyselin, io ale v tomto případě je nutné zaručit bezpečnost a biologickou účinnost, aby ze zjistilo, že chímérové molekuly nejsou imunogenní.

Ve skutečnosti se překvapivě ukázalo, že v souladu s vynálezem takové dlouhé linkery nejsou podstatné pro aktivitu chimérového proteinu, což ukazuje, že správné svinuti chiméry nevyžaduje delší linker, zvláště když v podstatě všechny přirozeně se vyskytující sekvence částí SÍL-6R a IL-6 jsou začleněny do chimérové molekuly (popisuje se například v příkladu 3 a na obrázku č. 5, které porovnávají chiméru sIL-6R/IL-6 vykazující velmi krátký linker (3 aminokyseliny) a podobnou chiméru s delším linkerem obsahujícím 30 aminokyselin).

Tyto fúzní proteiny nebo chiméry sIL-6R/IL-6 se účinně produkují v souladu s vynálezem v savčích buněčných expresívních systémech za vzniku gly kosy lovaných produktů, které mají potencionální aktivitu na nádorové buňky, jenž obvykle nejsou citlivé na IL-6 nebo samotný sIL-6R. Tyto proteiny zaručují úspěch při štěpech transplantovaných buněk lidské kostní dřeně (popisuje se dále v textu v příkladech 1 až 4). Ve skutečnosti v takových transplantátech kostní dřeně jsou chiméry sIL-óR/lL-6 podstatné pro přežití a proliferaci transplantovaných nedeterminovaných pluripotencionálních hematopoietických kmenových buněk. Z experimentálních výsledků a dalších analýz vyplývá, že se mohou připravit různé analogy chimérového proteinu sIL—6R/IL-6 podle vynálezu, které mají v podstatě stejnou biologickou aktivitu chiméry sl ιό R/IL-6. Tyto analogy jsou chiméry SÍL-6R/IL-6, ve kterých se de letoval, přidal nebo substituoval jeden nebo více aminokyselinových zbytků. Existuje omezení takových analogů, musí obsahovat většinu přirozeně se vyskytující sekvence sIL—6R a IL-6. Například adice aminokyselin k sekvencím přirozeně se vyskytujících sIL-6R a IL-6 jsou přednostně omezeny na přibližně 20 aminokyselin. Přednostně tyto adice probíhají v místě spojení mezi sIL-óR a IL-6, to je v místě linkeru. Podobně deíece sekvencí sIL-6R a IL-6 se přednostně omezují na 20 až

30 aminokyselin. Substituce aminokyselinových zbytků v sekvencích sIL-óR a IL-6 jinými aminokyselinovými zbytky jsou přednostně omezeny na 20 až 30 aminokyselin. Všechny tyto dříve v textu zmiňované delece, adice a substituce jsou přijatelné v souladu s vynálezem, když takto získané analogy exprimované v savčích buňkách si uchovávají v podstatě stejnou biologickou aktivitu jako chiméra sIL-6R/IL-6 obsahující v podstatě přirozeně se vyskytující sekvence a mají v podstatě stejný gly kosy lační patem chiméry složený z podstatě přirozeně se vyskytujících sekvencí.

Vynález popisuje chimérový glykosylovaný protein rozpustného receptoru interleukinu-6 (sIL-6R)-interleukin-6 (IL-6) (slL-6R/IL-6) ajeho biologicky aktivní analogy. Uvedený pro45 tein ajeho analogy obsahuji fúzní proteinový produkt mezi v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou sIL-6R a v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou IL-6. Uvedený sIL6R/1L-6 ajeho analogy se glykosylují stejným způsobem jako probíhá glykosylace přirozeně se vyskytujícího slL-6R a IL-6.

Provedení shora v textu uvedeného chimérového proteinu podle vynálezu zahrnuje:

(i) Chimérový protein S1L-6R/IL-6 ajeho biologicky aktivní analogy, kde uvedený síL-óR se fúzuje s IL-6 prostřednictvím molekuly peptidového linkeru.

-4CZ 302488 B6 (ii) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 ajeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (i), kde uvedený linker je velmi krátký a není imunogenní a je tvořen 3 až 4 aminokyselinovými zbytky.

(iii) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 ajeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (ii), kde uvedený linker je tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met).

(iv) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 ajeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (i), kde uvedený linker je peptid tvořený 13 aminokyselinovými zbytky se sekvencí E-F-G-A-GL-V-LG-G-Q-F- (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-GJy-Gin-Phe-Met) (SEQ ID NO: 1).

(v) Chimérový protein sIL-6R/IL-6, který se označil sIL-6R6Val/IL -6 a vykazuje tripeptidový linker se sekvencí E-F-M mezi C-terminální Val-356 SÍL-6R a N-terminální Pro~29 IL-6. Uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3.

(vi) Chimérový protein sIL-6R/lL-6, který se označil sIL-6R5Vat/L/IL-6 a vykazuje peptidový linker v délce 13 aminokyselin se sekvencí E-F-GA-G-L-V-L-G-G-Q-F-M mezi C-terminální Val-356 SÍL-6R a N-terminální Pro-29 IL-6. Uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3, kde tripeptid sekvence E-F-M mezi pozicemi 357 až 359 zobrazený na obrázku č. 3 je nahrazen peptidovou sekvencí uvedených 13 aminokyselin.

(vii) Chimérový protein slL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v savčích buňkách ve zcela zpracované formě.

(viii) Chimérový protein sIL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v lidských buňkách.

(ix) Chimérový protein sIL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v buňkách CHO.

(x) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny inhibovat růst vysoce maligních rakovinových buněk.

(xi) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny inhibovat růst buněk vysoce maligního melanomu.

(xii) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny umožnit in vivo štěpy lidských hematopoietických buněk při transplantaci kostní dřeně.

(xiii) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny chránit játra proti působení hepatoxických činidel.

Vynález dále popisuje sekvenci DNA kódující chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se popisuje shora v textu.

Vynález dále popisuje vektor DNA obsahující sekvenci DNA kódující chimérový protein

SÍL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu.

Uvedený vektor je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v savčích buňkách.

Provedení vektoru DNA podle vynálezu zahrnuje:

(i) Vektor DNA, který je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v lidských buňkách.

(ii) Vektor DNA, který se exprimuje v savčích nebo lidských buňkách, přičemž exprimovány chimérový protein má sekvenci, která umožňuje plné zpracování chimérového proteinu savčí nebo lidskou buňkou a vylučování zcela upraveného proteinu z buněk do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují.

(iii) Vektor DNA, jak se popisuje shora v textu označený jako plazmid pcDNAsIL-6R/IL-6 obsahující vektor pcDNA3, jenž zahrnuje DNA sekvenci kódující chimérový protein slL-óR/IL-6, který řídí cytomegalovirový promotor (CMV).

(iv) Vektor DNA, jak se popisuje shora v textu označený jako plazmid sIL-6R/L/lL-6 obsahující vektor pcDNA3, který zahrnuje sekvenci DNA kódující chimérový protein sIL—6R/IL-6, jenž je řízen cytomegalovirovým promotorem (CM V) a kde uvedená sekvence DNA kódující uvedený chimérový protein slL-6R/IL-6 se začlenila do linkerové sekvence kódující linkerový peptid v restrikčním místě EcoRI umístěném mezi sekvencí kódující část slL 6R a sekvencí kódující část IL-6 proteinu.

Podobně vynález popisuje transformované savčí buňky obsahující vektor DNA, jak se popisuje shora v textu, který je schopen exprimovat sekvenci chimérového proteinu sIL—6R/ÍL—6, kterou nese uvedený vektor, a úpravy exprimovaného proteinu a jeho vylučování do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují.

V provedení těchto transformovaných buněk podle vynálezu se popisují lidské embryonální buňky ledvin 293 (HEK293) transfekované vektorem pcDNA sIL-6R/lL-6. Uvedené buňky jsou schopny exprimovat chimérový protein slL-6R/IL—6, zcela upravit uvedený protein a vylučovat ho do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují. Uvedený protein je ve formě glykoproteinu o velikosti 85 000.

V jiném provedení transformovaných buněk podle vynálezu se popisují buňky CHO (buňky vaječníků čínských křečků) transfekované vektorem pcDNA sIL—6R/IU—6. Uvedené buňky jsou schopny exprimovat chimérový protein v cela upravené formě do kultivačního média, kde buňky rostou. Protein se vyskytuje ve formě glykoproteinu o přibližné velikosti 85 000.

Vynález dále popisuje způsob produkce chimérového proteinu nebo jeho biologicky aktivních analogů, jak se popisuje shora v textu, který zahrnuje kultivaci dříve v textu popsaných transformovaných buněk za podmínek vhodných pro expresi, úpravu a vylučování uvedeného proteinu nebo analogů do kultivačního média, ve kterém uvedené buňky rostou a čištění uvedeného proteinu nebo analogů z uvedeného kultivačního média imunoafínitní chromatografií za použití monoklonálních protilátek specifických pro sIL-óR.

Chimérový protein podle vynálezu má řadu použití, která zahrnují:

(i) Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo jeho analogů nebo jejích solí ajejich směsí, jako inhibitoru rakovinových buněk.

(ii) Použití, jak se popisuje v odst. (i) shora v textu, jako inhibitoru buněk silně maligního melanomu.

(iii) Použití chimérového proteinu sIL-óR/IL-ó nebo jeho analogů nebo jejich soli a jejich směsi, jako aktivní složky umožňující štěp lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně.

-6CZ 302488 Β6 (i v) Použití ch i měrového proteinu sil -6R/U—6 nebo jeho analogů nebo jejich soli a jejich směsi, jako aktivní složky při zesílení krvetvorby při léčbě hepatických a neurologických poruch nebo při jiných aplikacích, kdy se používají IL-6 nebo sIL-6R.

Podobně se chimérový protein podle vynálezu může použít při přípravě medikamentů vhodných pro řadu medicínských indikacích. Jmenovitě se chimérový protein SÍL-6R/IL-6 nebo jeho analogy, jejich sole nebo jejich směsi mohou použít při přípravě medikamentů vhodných pro léčbu zhoubného bujení způsobem inhibice rakovinových buněk nebo pri přípravě medikamentu vhodného pro zlepšení transplantace kostní dřeně způsobem umožňujícím štěp lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně nebo při přípravě medikamentu vhodného pro zesílení krvetvorby nebo pro léčbu neurologických poruch nebo pro aplikaci, tam kde se použije IL—6 nebo sIL- 6R.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jako aktivní složku chimérový protein slL-6R/lL-ó nebo jeho analog, jak se popisuje shora v textu, a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo a ekcipient.

Provedení této farmaceutické kompozice podle vynálezu zahrnuje:

(i) Farmaceutickou kompozici vhodnou pro léčbu zhoubného bujení u savců.

(íi) Farmaceutickou kompozici vhodnou pro zlepšení transplantace kostní dřeně.

(iii) Farmaceutickou kompozici pro léčbu poruch jater a neurologických poruch nebo po zesílení krvetvorby nebo pro jiné aplikace, při kterých se používá IL-6 nebo síL-óR.

Vynález dále popisuje způsob léčby zhoubného bujení u savců nebo zlepšení transplantace kostní dřeně nebo léčby jatemích a neurologických poruch nebo zesílení krvetvorby nebo jiné aplikace, při kterých se používá IL-6 nebo sIL-6R. Tyto aplikace zahrnují aplikaci pacientovi farmaceutické kompozice, jak se popisuje shora v textu, ve vhodné dávkové formě a vhodným způsobem.

Aby se předešlo pochybnostem, vynález popisuje chiméru mezi IL-6 a sIL-6R v libovolném pořadí. To znamená, že pořadí N-terminální a C-terminální části se může obrátit a chimérou je pak protein IL-6-sIL-6R, ačkoli se zde označuje jako protein sIL-6R/IL-6.

Vynález popisuje chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, které v podstatě mají všechny přirozeně se vyskytující formy sIL-6R a v podstatě všechny přirozeně se vyskytující formy IL-6 fúzované dohromady. Fúze probíhá prostřednictvím lín keřového peptidů, jehož délku mohou tvořit pouze 3 aminokyseliny. Chimérový protein a jeho analogy mají podobné množství a patem gly kosy láce, jako přirozeně se vyskytující sIL-6R a IL-6. Zjistilo se, že takový chimérový protein SÍL-6R/IL-6 produkovaný v souladu s vynálezem v savčích buňkách, zvláště pak v lidských buňkách (popisuje se v příkladech 1 až 4 dále v textu) nebo v buňkách CHO (popisuje se v příkladu 6 dáte v textu) se účinně exprimuje v uvedených buňkách, je vysoce glykosylován a vykazuje potencionální aktivitu na nádorové buňky, které nevykazují odezvu na žádný ze samotných IL-6 nebo sIL-6R.

V souladu s vynálezem se pozorovalo (popisuje se v příkladu 3 dále v textu), že dříve zmiňovaný chimérový protein slL-6R/IL-6 podle vynálezu způsobuje zablokováni růstu vysoce maligních savčích buněk, jako jsou buňky melanomu F10.9 v koncentracích, které jsou nižší, než jsou koncentrace nutné v případě, kdy se používá směs nefúzovaných sIL-6R a IL-6. To je zvláště podstatný výsledek s ohledem na skutečnost, že buňky melanomu F10.9 nepřestávají v normálním případě růst, když se aplikují odděleně pouze IL-6 a sIL-6R. K zablokování jejich růstu dojde pouze, když se vystaví relativně vysokým dávkám kombinace nefúzovaného IL-6 a sIL-6R.

- 7 CZ 302488 B6

Chirnérový protein slL-6R/IL-6 podle vynálezu je překvapivě silnější inhibitor těchto buněk maligního melanomu, než směs jeho oddělených části. To znamená směs netuzovaného slL-6R a IL-6. Chirnérový protein podle vynálezu je zvláště možné použít, jako aktivní složku léčby různých druhů zhoubného bujení.

Vyšší aktivitu chimérového proteinu slL 6R/IL -6 způsobuje vyšší aktivita gp 130 ve srovnání se směsí netuzovaného IL-6 a sIL-óR (popisuje se v příkladu 7).

io Dále se také zjistilo v souladu s vynálezem (popisuje se v příkladu 4 dále v textu), že chimérová molekula S1L-6R/1L-6 podle vynálezu je zvláště použitelná při zlepšení transplantace kostní dřeně. Použití známého protokolu pro provedení štěpu lidských buněk kostní dřeně u těžce imunodeficitních myší (SCID), kde faktor kmenových buněk (SCF) a Flt3-ligand se používá pro umožnění přežití a pomnožení nejprimitivnějších pluripotenciálních krvetvorných kmenových buněk, umožňuje dlouho přetrvající štěp kostní dřeně. Zjistilo se, že tyto dva faktory SCF a Flt3-ligand nejsou dostatečné, aby vyvolaly štěp lidských buněk do kostní dřeně recipíentních myší a že pouze po přidání chimérového proteinu sIL-óR/IL-6 je štěp úspěšný. Toto zjištění indikuje, že chirnérový protein může být podstatný při provedení takových protokolů pro zavádění štěpů. Ve stejných experimentech, když se přidaly odděleně nefúzovaný IL-6 a sIL-6R, se zjistilo, že nejsou dostatečné pro úspěšnou transplantaci kostní dřeně a když se přidaly společně, jsou daleko méně aktivní ve srovnání s chimérovým proteinem sIL-6R/IL—6. To znamená, že chirnérový protein slL-6R/lL-6 v koncentraci 100 ng/ml zaručil úspěšnou transplantaci kostní dřeně, zatímco dvě oddělené nefúzované části sIL-6R a IL-6 v případě, že se přidaly společně v dokonce ve vyšší koncentraci (koncentrace slL-6R je v rozmezí 125 až

1259 ng/ml, koncentrace IL-6 je v rozmezí 50 až 200 ng/ml) jsou méně aktivní pří průběhu uvedené transplantace.

Shora uvedený chirnérový protein sIL-6R/IL-6 podle vynálezu je přednostně rekombinantní gly kosy lovaná chiméra sIL-óR/IL-6 produkovaná v lidských buňkách nebo v libovolném jiném savčím buněčném expresívním systému, jako jsou buňky křečků CHO, které jsou schopny glykosylovat proteiny, jak to provádějí lidské buňky a které také provádějí stejné posttranslační modifikace. Důležitou charakteristikou je, že takto produkovaný chirnérový glykoprotein se zpracovává a upravuje stejným způsobem, jako je tomu u přirozených molekul slL-6R a IL-6, které se nacházejí v lidském těle, aniž dochází ke zkrácení a k přidání dalších nepřirozených póly peptidových sekvencí. Výjimku tvoří začlenění velmi krátkého tripeptidu nebo delšího linkerového peptidů mezi části sIL-6R a IL-6 chimérového proteinu.

Aby se připravil shora uvedený preferovaný chirnérový protein podle vynálezu, zvažují se následující rysy přirozeně se vyskytujících slL-6R a IL-6:

Je známo, že IL-óR přítomný v lidských buněčných membránách se produkuje pomocí cDNA kódující 468 aminokyselin, která obsahuje signální peptid, oblast podobnou imunoglobulinu, oblast vázající cytokin, trans-membránovou oblast a cytoplazmatickou doménu (Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T and Kishimoto T.

Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825 až 828, 1988). Rozpustná forma sIL-6R se našla v tělních tekutinách, které mají, podobně jako zralý IL-6R z membrán, N-konec odpovídající Leu-20 (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leítner O, Revel M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr.,

510:331 až 337, 1990) a C-konec odpovídající Val-359 právě před trans-membránovou oblastí

IL-6R patent US 5 216 128 a EP 413 908 Bl), Za účelem fúze sekvence sIL-6R s II.6 se zavedlo za polohu Val-356 restrikční místo EcoRI. Sekvence IL—6 začínající v poloze Pro-29 cDNA 1L-6 a končící Met-212 (Zilberstein A, Ruggieri R, Kom H. J and Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2529-2537, 1986; Hirano T, Yasukawa K, Harada

-8CZ 302488 B6

H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashima S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K, Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T and Kishimoto T. Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that índuces B lympbocytes to produce immunoglobulins. Nátuře. 234: 73 az 76, 1986) se zavedla tak, aby následovaly za tímto rest5 rikčním místem EcoRL V tomto restrikčním místě EcoRI se může také nacházet, ale ne nezbytné, linkerový peptid požadované délky, který od sebe odděluje v chimérovém proteinu části slL6R/IL-6. Jak se popisuje v příkladech dále v textu, vytvořily se dva odlišné chimérové proteiny, jako příklady možných chimérových proteinů. Jeden má tripeptidový linker a druhý vykazuje linker s 13 aminokyselinovými zbytky v restrikčním místě EcoRI. Oba proteiny jsou v podstatě io stejně biologicky aktivní.

Vynález také zahrnuje analogy shora uvedeného chimérového proteinu sIL-6R/IL-ó podle vynálezu, jehož analogy si ponechávají v podstatě stejnou biologickou aktivitu chimérového proteinu, který má v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6. Takovým analogem i5 může být molekula s deleci 30 aminokyselinových zbytků, adicí nebo substitucí jiných zbytků v částech sIL-6R a/nebo IL-6 chimérového proteinu. Takové úpravy nemění podstatně biologickou aktivitu analogu chimérového proteinu s ohledem na samotný chimérový protein a ěást slL 6R takových analogů si v podstatě ponechává přirozeně se vyskytující strukturu (před zpracováním, popisuje se na obrázku č. 3) signálního peptidu, oblasti podobné Ig, N-oblasti cytokinového receptorů, C-oblasti cytokinového receptorů a receptorové premembránove oblasti. Podobně takové analogy chimérového proteinu by si měly v podstatě zachovat přirozeně se vyskytující zralou formu části IL-6. Různé analogy se mohou od sebe a od základní molekuly chimérového proteinu (molekula obsahující v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6) nejvíce lišit v místě linkerového peptidu, který spojuje části sIL-6R a IL-6.

Takový linker může obsahovat až 30 aminokyselin a slouží k oddělení částí sIL-6R a IL-6 v chimérovém proteinu. Co se týče takového linkeru, je nutné pečlivě vybrat jeho sekvenci (a také provést biologické testy ve vhodných standardních testech s každým takovým analogem) tak, že nedojde například k nesprávnému svinutí chimérového proteinu, který by nebyl aktivní, nebo nedojde ke vzniku analogu chimérového proteinu, který je imunogenní a vyvolává tak .30 u pacienta, kterému se aplikuje, protilátky nebo nevznikne analog, který by nebyl dostatečně účinný alespoň jako medikament s dlouhodobým nebo střednědobým účinkem.

Pokud jde o shora uvedené analogy chimérového proteinu podle vynálezu, jsou to analogy, kde jeden nebo více a až 30 aminokyselinových zbytků základního chimérového proteinu podle vynálezu se nahradí odlišnými aminokyselinovými zbytky nebo se deletují nebo jeden nebo více aminokyselinových zbytků se přidá k původní sekvenci chimérového proteinu podle vynálezu (kterou tvoří v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence slL-6R a ÍL-6), aniž se podstatně změní aktivita výsledných produktů ve srovnání se základním chimérovým proteinem podle vynálezu. Tyto analogy se připravují známou syntézou a/nebo metodami místně řízené mutageneze nebo libovolnou jinou vhodnou známou metodou.

Libovolný takový analog má přednostně sekvenci aminokyselin dostatečně podobnou sekvenci základní chiméry sIL-6R/IL-6, aby vykazoval dostatečně podobnou aktivitu. Lze stanovit, zda libovolný daný analog má dostatečně stejnou aktivitu, jako základní chimérový protein podle vynálezu, způsoby rutinních experimentů. V takových experimentech se analog vystaví testům biologické aktivity, které se popisují dále v textu v příkladech 2 až 4.

Analogy chimérového proteinu, které se mohou použit v souladu s vynálezem, nebo nukleové kyseliny, které je kódují, zahrnují konečnou sadu dostatečně odpovídajících sekvencí, jako substituční peptidy nebo polynukleotidy, které může odborník běžně získat, aniž musí provést experimenty, na základě zde prezentovaných informací. Detailní popis chemie proteinu a struktury se uvádí v publikaci Schulz, G. E. et al., Prineiples od Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978 a Creighton, Τ. E„ Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1983. V publikaci Ausubel et al., paragraf A. 1.1-A. 1.24 a Sambrook et

-9C7. 302488 B6 al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York v dodatku C a D.

Preferované změny u analogů v souladu s vynálezem jsou ty, které jsou známy jako „konzerva5 tivní“ substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce aminokyselin v chimérovém proteinu, který má v podstatě přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6, zahrnují synonymní aminokyseliny ve skupině, která vykazuje dostatečně podobné fyzikálně chemické vlastnosti, přičemž substituce mezi členy skupiny zachová biologickou funkci molekuly (popisuje se v publikaci Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862T864 (1974)). Je zřejmé, že začleněni a delece io aminokyselin se může také provést do shora definovaných sekvencí, aniž se změní jejich funkce, zvláště jestliže začleněni nebo delece zahrnuje pouze několik aminokyselin, například méně než

30, upřednostňuje se méně než 10, přičemž se neodstraní nebo nenahradí aminokyseliny, které jsou nepostradatelné pro funkční konformaci, například cysteinové zbytky (popisuje se v publikaci Anfinsen, „Principles That Govem The Folding of Protien Chains,“ Science, Vol. 181, pp. 223 až 230 (1973)), Analogy produkované takovou deleci a/nebo inzercí vyplývají z vynálezu.

Přednostně, skupiny synonymních aminokyselin jsou ty uvedené v tabulce I. Více se upřednostňují skupiny synonymních aminokyselin uvedené v tabulce II a nejvíce se upřednostňují skupiny zo synonymních aminokyselin, které jsou definované v tabulce III.

Tabulka č. 1: Preferované skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina	j Synonymní skupina
Ser ,	i Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
	Gly, Ala, Thr, Pro

- 10CZ 302488 B6

ÍŤhř 1 í 1	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, pro, Ser, Gly
Tle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
-,-------- - Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Tle, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabulka č.II: Více preferované skupiny synonymních aminokyselin

:Aminokyselina	Synonymui skupina
Ser	Ser
Arg	Arg, Lys, His
Leu ^!	Tle, Phe, Met, Leu
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Met, Tle, Val
Gly	Gly

lle	Met, Phe, Val, Leu, lle
Phe	Met, Tyr, lle, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
i o a	Ser, Cys
His	Gin, Are, His
Gin	Glu, His, Gin
?.sn	Asp, Asn
Lys	Arg, Lys
Asp	Asn, Asp
G1 u	Gin, Giu
Met	Pne, 1ie, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabulka č.III: Nejvíce preferované skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina	Synonymní skupina
Ser	Ser
Arg	Arg i
Leu	lle, Met, Leu
Pro	Pro
Thr	Thr
Al a	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lle	Met, Leu, lle
Phe	Phe
1 Tyr	Tyr
Cys	Ser, Cys
His	Hus
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp

,j-U -Glu


Met	ille, Leu, Met
Trp	' Me t

- 12CZ 302488 B6

Příklady produkce aminokyselinových substitucí v proteinech, které se mohou použít za účelem získání analogů chimérového proteinu podle vynálezu zahrnují libovolné známé kroky metod, jak se popisuji v US patentu RE 33,653, US 4 959 314, US 4 588 585 a US 4 737 462 (Mark ct al.), US 5 116 943 (Koths et al. ) US 4 965 195 (Namen et ak), US 4 879 111 (Chong et al.) a i.JS 5 017 691 (Lee et ak) a lyzinem substituované proteiny uvedené v patentu US 4 904 584 (Shaw et ak).

V jiném preferovaném provedení vynálezu má libovolný analog chimérového proteinu vhodný pro použití podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající aminokyselinové sekvenci shora v textu uvedeného základního chimérového proteinu podle vynálezu. Termín „v podstatě odpovídající“ zahrnuje analogy s minoritními změnami sekvence základního chimérového proteinu, které neovlivňují jeho základní charakteristiky, zvláště jeho schopnost inhibovat proliferaci rakovinových buněk nebo podporovat transplantace kostní dřeně. Typ změn, které v obecném případě spadají do „v podstatě odpovídající“, jsou ty, které vznikly běžnými metodami mutageneze DNA kódující chimérový protein podle vynálezu, což vede k několika málo minoritním modifikacím a k testování požadované aktivity způsobem uvedeným shora v textu.

Analogy podle vynálezu zahrnují ty molekuly kódované nukleovou kyselinou, jako je DNA nebo RNA, která hybridizuje s DNA nebo RNA za přísných podmínek, kóduje chimérový protein v souladu s vynálezem a která obsahuje v podstatě všechny přirozeně se vyskytující sekvence kódující sIL-6R a IL-6. Takovými hybridizujícími DNA nebo RNA mohou být například ty, které kódují stejný protein podle vynálezu, který vykazuje například sekvenci uvedenou na obrázku č. 3, ale která se lisí svou nukleotidovou sekvencí od přirozeně získané nukleotidové sekvence schopností degenerovat genetický kód. To znamená, že odlišná sekvence nukleové kyseliny může stále kódovat stejnou aminokyselinovou sekvenci, což způsobuje tato degenerace. Dále, jak je uvedeno shora v textu, množství změn aminokyselin (delece, adice, substituce) se omezuje až na přibližně 30 aminokyselin tak, že dokonce s maximálním množstvím změn analogy podle vynálezu budou ty, které si v podstatě zachovávají vedoucí sekvenci (před úpravou), oblast podobnou Ig, N- a C-oblasti cytokinového receptoru a receptářovou pre-membránovou oblast (oblast mezi C-oblasti a transmembránovou oblasti) v části sIL-óR a v podstatě celou část IL-6. Taková nukleová kyselina je primárním kandidátem pro stanovení, zda kóduje polypeptid, který si zachoval funkční aktivitu chimérového proteinu podle vynálezu. Termín „přísné podmínky“ znamená hybridizační a následné promývací podmínky, které odborník nazývá přísné (popisuje se v publikaci Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Intersence, N.Y., para 6.3 a 6.4 (1987, 1992) a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York), Příklady přísných podmínek bez omezení zahrnují promývací podmínky při teplotě o 12 až 20 °C nižší než je vypočítaná Tm studovaného hybridu, například 2 x SSC a 0,5 % SDS po dobu 5 minut, 2 x SSC a 0,1 % SDS po dobu 15 minut; OJ x SSC a 0,5 % SDS pri teplotě 37 °C po dobu 30 až 60 minut a pak OJ x SSC a 0,5 % SDS při teplotě 68 °C po dobu 30 až 60 minut. Odborník rozumí, že přísné podmínky také závisí na délce sekvencí DNA, oligonukleotidových sond (jako je 19 až 49 bází) nebo smíchaných oligonukleotidových sond. Jestliže se používají smíchané sondy, preferuje se použití tetramethylamoniumchloridu (TMAC) místo SSC (popisuje se v publikaci Ausubel, supra).

Termín „sole“ znamená sole karboxylových skupin a kyselinové adiční sole amino-skupin chimérového proteinu podle vynálezu nebo jejich analogy. Sole karboxylové skupiny se mohou tvořit způsobem, kterýje dobře znám v oboru, a zahrnují anorganické sole, například sole sodíku, vápníku, amoniaku, železa nebo zinku a podobně a sole s organickými bázemi, které vznikají například s aminy, jako je trieth ano lamin, arginin nebo lysin, piperidin, prokain a podobně. Kyselé adiční sole zahrnují například sole s minerální kyselinou, jako je například kyselina chlorovodíková nebo sírová a sole s organickými kyselinami, jako je například kyselina octová nebo kyselina šťavelová. Samozřejmě libovolné takové sole musí mít v podstatě stejnou aktivitu vztahující se k chimérovému proteinu podle vynálezu nebo k jeho analogům.

- 13 CZ 302488 Β6

Vynález dále popisuje sekvence DNA kódující shora v textu uvedený chimérový protein podle vynálezu a jeho analogy, stejně jako vektory DNA nesoucí takové sekvence DNA vhodné pro expresi ve vhodných savčích buňkách. Upřednostňují se lidské buňky. Vektor podle vynálezu je plazmid pcDNA sIL-6R/IL-6 obsahující vektor pcDNA (Invitrogen) zahrnující fúzované sekvence slL-6R/IL-6 řízené cytomegalovirovým promotorem (CMV).

Vynález také popisuje transformované savčí, přednostně lidské, buňky schopné exprimovat shora v textu uvedené proteiny podle vynálezu. Takové transformované buňky zahrnují lidské embryonální ledvinové buňky 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfekované pcDNA SÍL-6R/IL-6, které vylučuji fúzovaný chimérový glykoprotein slL 6R/1L 6 o molekulové hmotnosti 85 000,

V dalším provedení vynálezu se popisuje plazmid pcDNA sil. 6R/L/IL-6, který se liší od shora v textu popsaného pcDNA sIL- 6R/1L-6 začleněním krátkých linkeru, které kódují 10 dalších aminokyselin, do restrikčního místa EcoRI. Za účelem optimalizace vzdálenosti mezi sIL-6R a IL-6 je možné zavést řadu různých sekvencí různé délky.

Vynález také zahrnuje chimérový protein, ve kterém část IL-6 předchází sIL-óR (zobrazeno na obrázku č. 11).

Vynález dále popisuje způsob produkce a čištění chimérového proteinu podle vynálezu nebo jeho analogy, který zahrnuje kultivaci shora uvedených transformovaných buněk za podmínek vhodných pro expresi a vylučování chimérového proteinového produktu do kultivačního média a pak čištění vylučovaného proteinu imunoafinitní chromatografií za použití anti-sIL-óR monoklonálních protilátek 34.4, jak se popisuje v příkladu 2 a 5 dále v textu.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jako aktivní složku chiméru sIL-óR/IL-6 nebo její analogy nebo jejich směsi nebo sole a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo ekcipient. Provedení farmaceutické kompozice podle vynálezu zahrnuje farmaceutickou kompozici pro zesílení působení typu IL-6, pro léčbu zhoubného bujení, pro transplantaci kostní dřeně, pro zesílení krvetvorby, pro léčbu neurologických poruch, pro léčbu poruch jater a pro jiné aplikace IL-6 nebo příbuzných cytokinů.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu se pro aplikaci připravují smícháním chimérového proteinu nebo jeho analogu s fyziologicky přijatelnými nosiči a/nebo stabilizátory a/nebo ekcipienty a připravují se v dávkové formě například lyofilizaci ve zkumavkách. Způsob aplikace se děje v libovolných přijatelných módech vhodných pro podobná činidla a bude záviset na stavu, který se lečí. Aplikace probíhá intravenózně, intramuskulámě, podkožně, lokální injekcí nebo povrchovým nanesením nebo nepřerušovaně infúzí atd.. Množství aktivní látky, která se má aplikovat závisí na způsobu aplikace, léčeném onemocnění a stavu pacienta. Lokální injekce například bude vyžadovat menší množství proteinu vzhledem ke hmotnosti ve srovnání s intravenózní infúzí.

Vynález také popisuje použití chimérového proteinu podle vynálezu nebo jeho analogů nebo směsí pro léčbu zhoubného bujení, pro transplantace kostní dřeně, zesílení krvetvorby, pro léčbu neurologických stavů, pro ochranu tkáně jater u pacientů s nekrózou způsobenou chemikáliemi (například chlorid uhličitý, alkohol, paracetamol) nebo jiné případy (například virové, chirurgické nekrózy) a pro použití při jiných aplikacích IL-6 nebo příbuzných cytokinů. Podobně vynález popisuje chimérový protein nebo jeho analogy nebo směsi pro použití při přípravě medikamentů pro léčbu shora uvedených stavů nebo pro použití ve shora uvedených indikacích.

Vedle shora uvedených metod léčby vynález zahrnuje také ex vivo postupy a genovou terapii s chimérou a/nebo s DNA ji kódující.

- 14 CZ 302488 B6

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku ě. 1 se nachází schéma různých vektorů, činidel a kroků používaných při konstrukci chimérové molekuly DNA kódující chimérový protein, ve kterém po konzervativní struktuře ? přirozené formy sIL 6R končící zbytkem Val 356 následuje sekvence přirozené, upravené formy IL-6. Detailněji se popisuje v příkladu 1.

Na obrázku č. 2 (A, B) jsou zobrazeny výsledky získané z analýzy, která se uskutečnila za účelem identifikace chiméry sIL™6R5Val/IL-6 p86 elektroforézou na polyakrylovém gelu (A) a na io základě profilu bioaktivity (B). Obrázek č, 2A ukazuje gel obarvený podle Comassie, na kterém se analyzovaly imunologicky Čištěné frakce vymyté z kolony afinitní chromatografie, na kterou se nanesl vzorek vylučovaného proteinu získaného z buněčných kultur transfekovaných vektorem, který kóduje chimérový protein. Obrázek č. 2B zobrazuje graf biologické aktivity (inhibice růstu buněk melanomu F10.9) každé ze shora uvedených frakcí vymytých z kolon afinitní chromatografie. Detailněji se popisuje v příkladech 2 a 3.

Obrázek č. 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci (jednopísmenný kód) chiméry sIL6RóVal/IL 6. kde jsou znázorněny různé oblasti molekuly zahrnující N-terminální signální peptid (linka nad sekvencí), oblast podobnou imunoglobulinu N-oblast receptoru cytokinů (podtrže20 no), C-oblast cytokinů (linka nad sekvencí) a receptorovou pre-membránovou oblast (oblast mezi C-oblasti a trans-membránovou oblastí), celou část SÍL-6R chiméry, stejně jako upravenou část IL-6 (podtrženo) chiméry, jak se popisuje v příkladu 1 a 2.

Na obrázku č. 4 (A, B) je fotografie melanomových buněk F10.9 v kultuře, aniž se aplikuje chimérový protein (A) a při aplikaci (B) chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 po dobu 4 dní. Na obrázku č. 4B jsou patmé morfologické změny vyvolané v takových buňkách metastáz melanomu (buňky F10.9) aplikací chiméry SIL-6R/1L-6, jak se popisuje v příkladu 3.

Na obrázku č. 5 je graf reprezentující výsledky inhibice růstu buněk melanomu F10.9 ?o chimérovým proteinem sIL-6R/IL-6 při různých koncentracích chiméry, které se pohybují v rozmezí přibližně 0,12 až 150 ng/ml, kde se chiméra s linkerem IL-6RIL-6 obsahující pouze 3 aminokyseliny, jak se popisuje v příkladu 3 porovnává s chimérou s linkerem obsahujícím 13 aminokyselin (IL-6RLIL-6).

Obrázek č. 6 je graf výsledků znázorňující absenci účinků inhibice růstu na buňky melanomu F10.9 při aplikaci buď samotného izolovaného IL-6 (čárkovaná horní křivka vyznačená prázdnými čtverci) při koncentraci v rozmezí 0 až 40 ng/ml IL-6 nebo samotného sIL-óR (bod konvergence všech křivek na vertikální ose, kde koncentrace IL-6 je nulová). Dále graf znázorňuje pozorované účinky inhibice růstu, kdy ÍL-6 a sIL-6R se přidá dohromady, ale v rozdílných koncentracích každé složky, kde koncentrace IL-6 je v rozmezí 10 až 40 ng/ml a sIL-6R se přidá ve třech koncentracích 100, 200 a 400 ng/ml v případě každé koncentrace IL-6, což zobrazují tři spodní křivky (dvě přerušované značené křivky s prázdnými trojúhelníky a kolečky a křivka znázorněná nepřerušovanou čarou s plnými čtverci), jak se popisuje v příkladu 3.

Obrázek č. 7 znázorňuje autoradiogram Southemova blotu ukazující nutnost přítomnosti chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 při úspěšném štěpu lidských krvetvorných kmenových buněk během transplantace kostní dřeně u myší SCID-NOD (dvě dráhy po pravé ruce reprezentují myší, kterým se aplikoval chimérový protein slL-6R/IL-6 spolu s dalšími nezbytnými faktory, SCF, FLT-3 a naopak tri dráhy po levé ruce reprezentují myší, kterým se aplikoval pouze SCF a FLT-3 a SCF, FLT-3 stejně jako izolovaný, to znamená ne fúzovaný, IL-6 a slL-6R), jak se popisuje v příkladu 4.

Obrázek č. 8 znázorňuje Scatchardův graf afinitních charakteristik chiméry SÍL-6R/IL-6 ve srovnání se směsí IL-6 a sIL-6R. Hodnoty spojené s chimérou jsou označeny plnými čtverci a hodnoty spojené se směsí jsou označeny kosočtvercem, poměr sklonu je 4:1.

- 15 CZ 302488 B6

Obrázek č. 9 znázorňuje vyšší aktivitu chiméry slL-6R/IL-6 v případě buňky melanomu F10.9 ve srovnání s jednou ze směsí sIL-6R + IL-6 nebo s jedním z sIL-6R (bez IL-6).

Obrázek č. 10 znázorňuje ochranu chimérou slL -6R/IL -6 proti toxickým účinkům na játra. Hodnoty reprezentují průměr čtyř experimentů. Plné čtverce reprezentuji myši IL-6-/-, plné kosočtverce reprezentují myši IL-6-/-, kterým se aplikoval IL- 6 a plné hvězdy reprezentují myši IL6-/-, kterým se aplikovala chiméra.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1: Konstrukce expresívního vektoru chiméry sIL—6RóVaI/IL-6

Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma kroků při konstrukci expresívního vektoru, který nese sekvenci kódující chimérový protein sIL-6RÓVal/lL—6. Schéma zahrnuje všechny různé počáteční a intermediární vektory, různá činidla a reakční kroky. Postup konstrukce je v podstatě použití metod, které jsou dobře známy v oboru a slouží ke konstrukci expresívních vektorů (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York).

Knihovna cDNA z buněk T47D lidského karcinomu prsu se klonovala do bakteríofága lambda (λ) gtl 1 a testovala se oligonukleotidovými sondami odvozenými od sekvence IL-6R (popisuje se v publikaci Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hírano T and Kishimoto T. Cloning and expressíon of the human Interleukin-6 (BSF-2/lnterferon beta-2) receptor. Science, 241: 825 až 828, 1988). Izoloval se jeden klon cDNA (X)gtl 1, který nese celou sekvenci kódující lidský IL-6R. Tento inzert se z (Z)gtll vystřihl restrikčním enzymem EcoRI a klonoval se do vícenásobného klonovacího místa (MCS) .to fágemidu E. coli Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, Califomia), Tento plazmid pBS/SK-IL-6R (obrázek č. 1) se štěpil restrikčním enzymem EcoRI, pak se konce fragmentu upravily na tupé konce a znovu se štěpil restrikčním enzymem EcoRV za vzniku 5'fragmentu IL-6R o velikosti 959 párů bází (bp), který končí restrikčním místem EcoRV IL-6R (koordináta 1203). Tento fragment extrahovaný z agarózového gelu elektroforézy se oxidázoval do nového vektoru pBS/Sk otevřeného v restrikčním místě EcoRV MCS (pBS/SK-sIL-6R~RV zobrazen na obrázku ě. 1).

Jak se popisuje shora v textu, dříve získaná DNA pBS/SK--IL-6R se použila pro PCR za účelem amplifikace fragmentu o velikosti 368 bp mezi forvard příměrem 1137—1156 a reverzním io příměrem 1505-1488. Reverzní primer se syntetizoval s restrikčním místem EcoRI, které bezprostředně následuje po kodónu pro valín-356 IL-6R (zobrazeno na obrázku ě. 1). Dříve se určilo, že val i nový zbytek je aminokyselinou C-konce přirozené formy rozpustného sIL—6R vylučovaného do lidské moči (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M and

Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by íigand-affinity and immunoaffmity chromatography. J. Chromatogr., 510:331 až 337, 1990; Oh J-W, Revel M and Clebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encode by a differentially spliced mRNA, Cytokine, 8: 401 až 409, 1996; patent US 5 216 128 a EP patent 5 413 908 Bl). Produkt PCR se štěpil restrikčními enzymy EcoRV a EcoRI a ligoval se do pBS/SK-sIL-6R-RV mezi restrikční místa EcoRV v ÍL-6R a EcoRI MCS (zobrazeno na obrázku č. 1). Výsledný plazmid pBS-sIL-6R-5Val-RI se pak zkrátil tak, že se odstranily 5'nepřekládané sekvence ligací restrikčního místa HindlII MCS s místem Ncol v místě páru bází 410 1L-6R (konce obou míst se nejdříve upravila na tupé konce). Vznikl pBS-sIL-6R-ÓVal-RI-NcoI (zobrazeno na obrázku č. 1).

- 16 CZ 302488 Bó

Sekvence IL-6 se získala z plazmidů ρΚΚβ2-7, který se, jak se uvádí dříve (Chen L., Mory Y, Zilberstein A and Revel M. Growth inhibition opf human breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lineš by rekombinant interferon-beta 2/1L-6. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 8037 az 8041, 1988) zkonstruoval inzercí cDNA !FN-p2/IL-6 štěpené restrikčním enzymem

BstNT (Zilberstein A, Ruggierí R, Kom H. J and Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growth-timulatory cytokines. EMBO J„ 5: 2529 až 2537, 1986) do restrikčního místa EcoRl expresívního vektoru pKK223-3 E. coli (Pharmacia, Uppsala, Sweden) za použití syntetického oligonukleotidů s restrikčním místem EcoRl, po němž následuje kodón methioninu a kodón pro proIin-29 IL-6 a končící io v restrikčním místě BstNI (EcoRII). Inzert cDNA ÍL-6 ρΚΚβ2-7 končí 7 párů bází po terminačním kodónu v místě NlalV a o 11 bp dále následuje restrikční místo HindlII vektoru pKK223-3 (zobrazeno na obrázku č. 1). DNA ρΚΚβ2-7 se štěpila restrikčním enzymem HindlII. Konce fragmentu se upravily na tupé konce a fragment se znovu štěpil restrikčním enzyme EcoRl a cDNA IL-6 se začlenila do pBS-slL-6R-ÓVal~-RI-NcoI tak, že fúzovala přirozená sekvence

IL—6 (počátek v poloze prolin-29) bezprostředně po vaIinu-356 části IL-6R. Sekvence jsou odděleny pouze třemi kodóny (Glu-Phe-Met). Výsledný plazmid pBS/SK-síL-6R/IL-6 (obrázek č. 1) se pak znovu štěpil v restrikčních místech Sall a Notí jeho MCS a inzert se oxidázoval do restrikčního místa EcoRV pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, Califomia). Výsledný plazmid pC DN A3-s I L-6 R/IL-6 (obrázek č. 1) obsahuje inzert po směni exprese genu silného cytomegalovirového promotoru (CMV) a pak následuje polyadenylační místo, které zaručuje účinnou transkripci chiméry sIL-6R-ÓVaI/IL-6. Konzervace 5'konce sIL6R v chiméře zaručuje, že při expresi v savčích buňkách je signální peptid funkční a zpracování N-konce chímérového proteinu bude stejné jako u přirozeného sIL-6R.

Jak se uvádí shora v textu výhodnou charakteristikou konstrukce sIL-6R-óVal/IL-6 je, že je v podstatě fúzí přirozené formy sIL-óR a přirozené formy IL-6, jak se nacházejí v lidském těle, bez dalších peptidových sekvencí. Konzervace restrikčního místa EcoRl v konstrukci sIL-6R-8Val/IL-6 (zobrazeno na obrázku č. 1) však jednoduše umožňuje zavést linkerové poiypeptidové segmenty mezi části sIL-6R a IL-6. Vytvořila se jedna taková konstrukce

3o s linkerovou sekvencí obsahující 13 aminokyselin GIu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-Gln-Phe-Met zavedenou mezi Val-356 sIL-6R a Pro-29 IL-6 (síL-6R-dVal/L/IL-6).

Příklad 2: Exprese chiméry slL-6R-8Val/IL-6 v lidských buňkách

Za použití v podstatě standardních metod kultivace savčích buněk, transfekce buněk a analýzy transfekovaných buněk, kdy se zjišťovala exprese nově zavedené sekvence DNA (postupy se popisují například v publikaci Sambrook et al., Molecular Clon ing: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York) se shora v textu uvedená plazmidová konstrukce (popisuje se v Příkladu 1) použila při transfekci lidských buněk a posuzovala se její exprese.

Lidské buňky HEK 293 (ATCC CRL 1573, transformované primární lidské embryonální ledvinové buňky) se transfekovaly konstrukcí pCDNA3-sIL-6R/IL~6 DNA (popisuje se v příkladu 1 shora v textu). Kultura buněk HEK 293 v log fázi se ošetřila trypsinem a buňky se nanesly na plotny Nunc o velikosti 9 cm (2,5 x 10⁶ buněk/plotnu). O jeden den později proběhla transfekce s 10 pg pCDNA3-slL-6R/lL-6 DNA postupem precipitace sCaPO₄ (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York) a o hodinu později se kultivační médium nahradilo DMEM-10 % FCS a kultivace pokračovala po dalších 16 hodin. Po výměně kultivačního média za

DMEM-10% FCS, se shromáždily vylučované proteiny během dvou po sobě jdoucích period o délce 48 hodin. Debris se odstranil centrifugací při lOOOot./min, po dobu 10 minut avsupernatantu se testovala testem ELISA přítomnost SÍL-6R za použití polyklonálních králičích protilátek proti sIL-6R a myších McAB 17.6 (Novick D, Engetmann H, Rvel M. Leitner O and Rubenstein M. Monclonal antibodies to the soluble 11-6 receptor: affinity purifícations, ELISA

- 17CZ 302488 B6 and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10: 137 až 146, 1991). Zjistila se přítomnost sIL6R ekvivalentů v koncentraci l,2pg/ml, což ukazuje na velmi účinnou expresi chimérového proteinu SÍL-6R/IL-6 v transfekovaných lidských buňkách.

Vylučovaný chimérový protein (slL-6R/IL-6) se čistil imunologickou cestou pomocí monoklonálních protilátek 34.4 specifických pro epitop v extracelulámí oblasti lidského slL 6R (Novick D, Engelmann H, Rvel M. Leitner O and Rubenstein M. Monclonal antibodies to the soluble 116 receptor: aťfinily purifications, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10: 137 až 146, 1991; Halimi H, Eisensteín M, Oh J, Revel M and Cbenath J. Epitop peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135 až 143, 1995). Buňky hybridomu 34.4 se kultivovaly v perítoneální dutině myší a imunoglobuhnová frakce (Ig) se získala z ascitové tekutiny precipitací se síranem amonným. K imobilizaci McAB 34.4 se použil Affigel-10 (Bío-Labs, Richmond, California) (15 mg Ig se spojilo s 1 ml přípravku Affigel-10). Supernatanty obsahující proteiny vylučované z buněk HEK 293 transfekované pCDNA3-sIL-6R/IL-ó se adsorbovaly na kolony s McAB 34.4 (kolona o objemu 0,3 ml slouž.í pro 15 ml supematantu). Po promytí PBS se navázané proteiny vymyly 25 mM kyselinou citrónovou pH 2,5 a bezprostředně potom se neutralizovaly 1 M pufrem Hepes pH 8,5. Přes noc proběhla dialýza (přibližně 8 až 12 hodin) proti PBS.

Analýza imunologicky čištěného proteinu elektroforézou na polyakrylovém gelu v SDS ukázala jediný proteinový pruh obarvený Coomassie modří (obrázek č. 2). Molekulová hmotnost proteinu je 85 000, jak se odhadlo z fúze gly kosy lované formy sIL-6R5Val (v publikaci Oh J—W, Revel M and Clebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encode by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401 až 409, 1996; se uvádí molekulová hmotnost je 60 000 ) a glykosylované formy 1L-6 (v publikaci Zílberstein A, Ruggieri R, Kom H. J and Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J., 5: 2529 až 2537, 1986; se uvádí molekulová hmotnost 23 000 až 26 000), Aminokyselinovou sekvenci sIL—6R/IL-6 tvoří 543 aminokyselin. Po zpracování signálních peptidů vznikne protein tvořený 524 aminokyselinami nebo s molekulovou hmotností přibližně 58 000 (obrázek č. 3). Daleko větší velikost chiméry sIL-6R/IL-6 produkované z rekombinantní DNA v lidských buňkách ukazuje, že gly kosy láce tvoří výraznou část velikosti molekuly.

Příklad 3: Chiméra sIL-6R/IL-6 brání růstu a vyvolává diferenciaci metastázujících buněk meianomu.

Klon F10.9 získaný z buněk B16 melanomu tvoří vysoce metastázující nádory u myší C57BIack/6. Zvířata umírají na základě výskytu pulmonámích metastáz ve dvou až třech měsících (Katz A, Shulman L. M, Porgador A, Revel M, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of B16 malanoma metastases by long-term low-dose lnterleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98 až 109, 1993). Vedle chimérového proteinu sIL-óR/IL-ó kultura buněk F10.9 produkuje zjištěné morfologické změny a blokuje jejich růst (obrázek č. 4). Buňky F10.9 ošetřené chimérou se prodlužují vystupujícím dendritickým prodloužením a podobají se vřeteno vité diferenciaci embryonálních melanocytů nebo gliových buněk.

Růst buněk se hodnotí čtyři dny po nanesení 3 x 10³ buněk do prohlubně mikrotitrační destičky s96 prohlubněmi. Buňky se kultivují v kultivačním médiu RPMI 1640 s 10 % FCS o objemu 0,2 ml. Buňky se fixovaly v 12,5 % glutaraldehydu po dobu 30 minut, promyly se vodou a barvily se 0,1% krystalickou violetí po dobu 30 minut. Po promytí a usušení se barvivo extrahovalo 10% kyselinou octovou a stanovila se optická hustota při vlnové délce 540 nm. Chiméra inhibovala růst v závislosti na dávce. K úplné inhibici růstu dochází při koncentraci 10 ng/ml chimérového proteinu (p85) (zobrazeno na obrázku č. 5). Oba chimérové proteiny sIL-6RÓVaI/IL-ó a sIL-6RÓVal/L/lL-6 (chiméra s delším linkerem mezi sIL-óR a IL-6, popisuje se v příkladu 1) vykazují stejnou aktivitu. Tento výsledek také ukazuje, že línkerový

- 18CZ 302488 B6 peptid mezi částmi sIL-6R a IL-6 v chiméře není pro aktivitu chiméry podstatný. Shora v textu uvedená chiméra slL-6RÓVal/IL-6 má pouze velmi krátký linker tvořený pouze 3 aminokyselinami, zatímco chiméra sIL-6RóVal/L/IL-6 má delší linkerový peptid tvořený 13 aminokyselinami, přičemž obě chiméry vykazují v podstatě stejnou aktivitu při ínhibici růstu metasíázujicích buněk. Naopak ani samotný IL-6 ani samotný sIL-6R5Val neinhibují růst těchto melanomových buněk (zobrazeno na obrázku č. 6), což demonstruje jedinečnou aktivitu chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 (p85). Aby se získal podobný účinek, je nutné použít směs obsahující 200 až 400 ng/ml IL-6 a 125 ng/ml sIL-6RÓVal (zobrazeno na obrázku č. 6). Pro maximální Ínhibici buněk F10.9 je nutné použít 7,5nM IL-6 a 2 nM sIL-6RÓVa] ve srovnání io s pouze 0,12nM chimérou sIL-6R/IL-6.

Během imunologického čištění na koloně s McAB 34.4 (popisuje se v Příkladu 2) se sledovala inhibiční aktivita růstu chimérového proteinu p85 SÍL-6R/IL-6. Patem aktivity odpovídal intenzitě pruhu proteinu p85, kteiý se objevil v různých frakcích na elektroforetickém SDS poty15 akry 1 amidovém gelu na obrázku Č, 2.

Příklad 4: Chiméra SÍL-6R/IL-6 je podstatná při ujmutí štěpů transplantovaných buněk kostní dřeně.

Přijetí krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně se může studovat po transplantaci do těžce imunodeficitních (SCID) myší (Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdon G, Patterson B, Broxmeyer Η. E and Dick J. E. SCID mice as an in vivo model of human cord blood hematopoiesis. Blood cells 20: 316 až 320, 1994). Myši SCID-NOD se vystavily subletálnímu ozáření a do ocasní žíly se injekcí zavedlo 3 χ Ϊ0⁵ buněk CD34“ lidské kostní dřeně. Před injekcí se buňky CD34⁺ držely po dobu 3 dní v kapalné kultuře při různých kombinacích cytokinů. Po jednom měsíci se myši usmrtily a z kostí se shromáždily buňky kostní dřeně. Ujmutí štěpů lidských buněk u recipientních myší SCID-NOD se hodnotilo Southemovou hybridizaci s repeticemi lidské DNA.

Zjistilo se, že faktor kmenových buněk (SCF, ckit-ligand) a Flt3-ligand (flt3/flk2 ligand receptoru ty rozino vé kinázy) je důležitý pro přežití a proliferaci nej primitivnějších pluripotenciálních krvetvorných kmenových buněk vhodných pro dlouhodobé štěpy v recipientu kostní dřeně (McKenna HJ, de Vries P, Brasel K, Lyman S. D. and Williams D. E. Effect of flt3 liqand on the ex vivo expansion of human CD34+ hemtopoietic progenitor cells. Blood 86: 3413 až 3420, 1995). Jak je možné spatřit na obrázku č. 7 tyto dva faktory samostatně nejsou dostačující, aby vyvolaly přijetí štěpu lidských buněk v kostní dřeni recipientních myší SCID-NOD. Aby došlo k dostatečnému přijetí štěpu je nutné přidat chimérový protein sIL-6R/IL-6. Při koncentraci 100 ng/ml chiméra sIL-6R/IL-6 je daleko více aktivní ve srovnání s IL-6 (v koncentraci

50 až 200 ng/ml) a slL-6R (v koncentraci 125 až 1250 ng/ml) (obrázek č. 7). Nutnost chiméry

SÍL-6R/1L-6 indikuje, že tento protein je podstatný pro přežití a proliferaci pluripotencionálních krvetvorných kmenových buněk, které mohou znovu obsadit prostředí kostní dřeně, což indikuje, že tento protein se může použít při klinických protokolech při transplantaci kostní dřeně.

Toto je první demonstrace, že chiméra SÍL-6R/IL-6 má následující alespoň dvě nově nalezené aktivity:

(i) Když se přidá dohromady s oběma faktory SCF a Flt3-ligandem k lidským krvetvorným primitivním progenitálním buňkám, podpoří jejich přežiti a proliferaci a (ii) je aktivní (a zjevně podstatná) v modelu in vivo transplantace lidské kostní dřeně v imuno50 deficitních myších.

- 19CZ 302488 B6

Příklad 5: Chiméra sIL-6R/IL-6 je aktivní v případě vysoce čistých primitivních krvetvorných kmenových buněk.

Za účelem přípravy 80 % čisté populace buněk CD34+ se lidské chordové krevní jednobuněčné buňky rozdělily na jednobuněčné buňky s nízkou hustotou (NMC) na Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), pak se použil kit MACS (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Tyto buňky pak prošly přes imobilizované monoklonální protilátky proti CD38 nebo se roztřídily pomoci třídění fluorescenci aktivovaných buněk a získala se populace CD34+CD38 což odpovídá přibližně 0,1 % původních buněk. Tyto čištěné kmenové buňky (20 000 buněk) se io umístily do suspenzních kultur do kultivačního média RPM1 o objemu 0,5 ml, 10 % fetální telecí sérum (FCS), 1% bovinní sérový albumin obsahující 50 ng/ml faktoru kmenových buněk (SCF) a 100 ng/ml flt3-ligandu (FL) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Polovina kultury se doplnila chimérou sIL-6R/lL—6 o koncentraci 100 ng/ml, další se kultivovaly bez přítomnosti chiméry. Inkubace proběhla při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO₂ po dobu 6 dní. Počet znovu obsazených buněk kostní dřeně se hodnotil tak, že se sub-letálně ozářeným myším NOD-SCID zavedly injekci (i.v.) všechny buňky z těchto in vitro kultur. Myši se udržovaly v prostředí bez mikrobů. Po šesti týdnech se myší usmrtily a z jejich dlouhých kosti se získala kostní dřeň. Tyto buňky kostní dřeně (BM) se nanesly na semi-pevné plotny s 0,9% methyleelulózou s 30 % FCS, 50 μΜ β-merkaptoethanolem, 50 ng/ml SCF, 5 ng/ml IL—3, 5 ng/ml GM-CSF, 6 u/ml erythropoietinu (R&D Systems, Minneapolis, MN). Kultury obsahovaly také lidské sérum a kultivace probíhala za podmínek, které brání růstu myších kolonií. Výsledky (tabulka č. IV) indikovaly, že při přidání chiméry sIL-6R/IL-6 do suspenzních kultur dochází k 30 až 50 násobnému zvýšení počtu lidských buněk, které tvoří kolonie (CFU), získaných z myší, u kterých proběhla transplantace, ve srovnání se samotným SCF a FL. To reprezentuje velké zvýšení počtu kmenových buněk, které znovu obsadily SCID v suspenzních kulturách 6. den ve srovnání s 0. dnem. V nepřítomnosti chiméry sIL-6R/lL-6 SCF a FL neprodukují zvýšené množství kmenových buněk během 6-ti dnů kultivace suspenzní kultury. DNA buněk BM získaná z transplantovaných myši NOD/SCID se analyzovala Southemovým přenosem, jako v příkladu 4. Množství získané lidské DNA bylo 10 krát vyšší než u myší, kterým se aplikovaly buňky kultivované v přítomnosti

3« chiméry.

Progenitory CFU z kostní dřeně myší NOD/SCID, jak se uvádí v tabulce č. IV, byly příčinou zvýšení krvetvorných buněk různých myeloidů (makrofág a granulocyt) stejně jako erythroidů a lymfoidů (např. CD19+, CD56+) pouze, když lidské krevní buňky se před transplantací kultivovaly s chimérou sIL-óR/IL—6.

Tabulka IV: Lidské kmenové buňky schopné znovu obsadit kostní dřeň myší NOD/SCID

\|Přidáni během kule iva.ee suspenzní kultury CD34+CD38-1í lidských buněk z chordové krve	Dny kultivace kultury	Počet irdských krvetvorných kolonií vytvořených z BM transplantovaných ’ myší NOD/SCID !
	0	4
SCF + FL	6	2 až 3
SCF - FL + SL-6R/IL- \|	6 ί 1	50 až 100
6	í 1

Další experimenty porovnávaly účinek sIL-6R/IL-ó na populaci CD34+CD38+ pupečníkové krve s účinkem na vysoce čištěné kmenové buňky CD34+CD38-. Expanze vysoce čištěných

-20CZ 302488 B6 kmenových buněk in vitro byla daleko silnější v přítomnosti chiméry sIL-6R/lL-6 než u méně čištěných kmenových buněk (tabulka č. V). To indikuje, že nejprimitivnější kmenové buňky jsou preferovaným cílem účinku chiméry sIL-6R/IL-6 na expanzi buněk.

Tabulka č. V: In vitro expanze krvetvorných kmenových buněk

Nanesená buněčná	Počet buněk 6-tý den	Počet buněk 6-tý den
populace {20 000	s SC + FL	s SC + EL ř sIL-
buněk)		•6B/IL-6
Experiment 1
CD34+CD38+	780 000	675 000 {x 0,86)
CD34+CD3S-	42 000	153 000 (x 3,6)
Experiment 2
CD34+CD38-	330 00	507 000 (x 1,5)
CD34+CD38+	3 000	18 000 (x 6,0)

Zachování znovu obsazené kostní dřeně in vitro se měřilo prodloužením kultivace suspenzních kultur vysoce čistých kmenových buněk CD34-tCD38- před zavedením injekcí do NOD/SCID io myší. Přijetí štěpů se hodnotilo poměrem lidské DNA v kostní dřeni u recipientních myší 6 týdnů po i.v. injekci, kterou se aplikovaly kultivované buňky. Když se během kultivace kultury přidala k SCF a EL chiméra sIL-6R/lL-6, se po dvou týdnech kultivace pozorovalo vysoké přijetí štěpů (větší než l % lidské DNA) a příjem štěpů byl vyšší než u nekultivovaných buněk. Naopak experimenty s kulturami, které obsahují SCF, FL, GM-CSF, IL-3 ukázaly, že SCIEt-znova obsazené buňky nezůstávají v kultuře po jednom týdnu kultivace (Bhata, M. et al., J. Exp. Med. 186, 619^Λ624 1997).

Tyto výsledky ukazují, že chiméra sIL-6R/IL-6 umožňuje expanzi a udržení lidských primitivních kmenových buněk schopných obsadit v recipientu kostní dřeň. Kmenové buňky zůstávají aktivní v nediferencio váném stádiu, zatímco se dělí. Chiméra s IL-6 R/Ί L-6 umožňuje nový způsob kultivace krvetvorných buněk, které tvoří štěpy pro transplantaci. To také umožňuje použití retrovirových vektorů pro začlenění genů do kmenových buněk, což se využívá v metodách genové terapie, Do dnešní doby toto nebylo možné s lidskými kmenovými buňkami, protože tyto primitivní buňky se nemohly udržovat in vitro v cyklujícím stádiu, jak to vyžaduje integrace retrovirové DNA. Chiméra sIL-6R/IL-6 řeší tento problém.

Příklad 6: Produkce chiméry ÍL-6R/IL-6 v buňkách CHO

DNA plazmidu sIL-6R/IL-6 pcDNA3 zobrazená na obrázku č. 1 se ko-transfekovala do buněk vaječníků čínských křečků (CHO) spolu s DNA plazmidu pDHFR, jak popisuje v publikaci Mory et ak, DNA 5, 181 až 193, 1986). Mezi transformanty rostoucími v 50nM methotrexátu se izoloval klon L12~[IL-6R/IL~6]. Zjistilo se, že tento klon je stabilní po mnoho pasáží a semi- konfluentní kultury vylučují do kultivačního média chiméru IL-6R/IL-6 v množství

2,5 pq/mk

Za účelem čištění chiméry 11—6R/IL-6 se 3,25 litrů kultivačního média z kultury klonu L12 v 2% bovinním séru zakoncentrovalo na objem 200 ml. Médium se absorbovalo na koloně o objemu 18 ml obsahující monoklonální protilátky 34.4 proti lidskému slL~6R spojené s částicemi přípravku Affigel 10 a chiméra se etuovala způsobem, který se popisuje v publikaci Novick et al., Hybridoma, 10, 131 až 146, 1991). 25mM eluát kyseliny citrónové se ihned neutralizoval pufrem

-21 CZ 302488 B6 x Hepes pH 8 6. Proteiny se zakoncentrovaly na membráně Amtcon oddělující molekuly o molekulové hmotnosti 10 000 na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Při testu SDS-PAGE se objevil jediný pruh odpovídající molekulové hmotnosti 85 000, což koresponduje s chimérou IL-6R/IL-6. Glykosylace se demonstrovala zmenšením velikosti molekuly po ošetření s glykosidázy (Boehringer, Mannheim). Biologická aktivita chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO je stabilní po dobu alespoň 5 měsíců při teplotě 4 °C. Uchovávání probíhá při teplotě -70 °C.

io

Příklad 7: Afinita chiméry IL-6R/IL-6 vůči gp 130

U chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO a směsi lidského IL-6 a sIL-óR se porovnávala jejich schopnost vázat se na rozpustnou formu gpl30 (sgp 130), který je druhým řetězcem receptorového systému IL-6 (popisuje se v části dosavadní stav techniky). Mikrotitrační destička s 96 prohlubněmi (Nunc) se potáhla s monoklonálními protilátkami proti lidskému gpl30 a přidalo se 50 ng/ml sgpl30 ((R&D Systems, Minneapolis, MN). Po promytí fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem se do různých prohlubni přidala chiméra 1L-6R/1L-6 v různých koncentracích, které se pohybují v rozmezí 0,1 až 50 ng/ml. Do ao separátních prohlubni se přidal rhuIl-6 (Ares-Serono, Geneva) v koncentraci 500 ng/ml spolu s lidským slL óRÓVal v koncentracích v rozmezí 2 až 500 ng/ml. Po celonoční inkubaci při teplotě 4 °C se přidaly králičí polyklonální protilátky proti IL-6R (Oh et al., Cytokine, 8, 401 až 409, 1996). Pak se přidaly kozí anti—králičí Ig konjugované s křenovou peroxidázou, která se detekovala barevnou reakci (Sigma, St. Louis). Obrázek č. 8 ukazuje Scatchardův graf výsledků. Zjistilo se, že afinita chiméry IL-6R/ÍL-6 vůči gpl30 je více jak 4 krát vyšší než afinita dvou částí molekul, které se přidaly odděleně (6,3 x 10“ M versus 2,6 χ ΙΟ”¹⁰ M). Tento výsledek vysvětluje vyšší aktivitu chiméry ve srovnání s kombinací IL-6 + sIL-6R vůči melanomu a vůči krvetvorným buňkám (zobrazeno na obrázku č, 9 a popisuje se v Příkladu 4).

Příklad 8; Chiméra IL-6R/IL-6 chrání před toxickými účinky na játra.

Zavedením chloridu uhličitého (CC1₄) injekcí do myší vzniká silná nekróza jater vedoucí k úmrtí zvířat (popisuje se v publikaci Slater T. F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311,633 až 645,

1985). Když se myším, které jsou geneticky deficitní na IL-6 (ÍL—6-/-), aplikuje relativně malá dávka chloridu uhličitého (2 až 3 ml/kg tělesné hmotnosti) intraperitoneální injekcí, stupeň úmrtnosti během 24 hodin je přibližně 70 % (zobrazeno na obrázku č. 10). Injekce chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO jednu hodinu před aplikací chloridu uhličitého a opět 4 hodiny po aplikaci ochrání zvířata před smrtí po dobu 24 hodin. Naopak podobně zavedený volný rhulL -6 nevykazuje žádný účinek (zobrazeno na obrázku č. 10). Chiméra IL-óR/IL-6 je účinná v dávkách 2 až 3 pg na jednu injekci, kde vyjádřeno v molámím poměru je 10 krát nižší než dávka IL-6, které není účinná. Při vyšších dávkách chloridu uhličitého (např. 3,5 ml/kg zobrazeno na obrázku č. 10) chiméra má také ochranný účinek, přičemž úmrtnost je nižší ve srovnání s IL-6 nebo bez aplikace cytokinů. Rozdíl v úmrtnosti mezi myšmi ošetřenými chimé45 rou a neošetřenými myšmi, přičemž obou skupinám se aplikovala stejná dávka chloridu uhličitého, je podstatný a hodnota p je menší než 0,01. Histologické pozorování sekcí jater obarvených hematoxilinem-eosinem potvrdilo, že chlorid uhličitý způsobuje nekrózu tkáně jater a že chiméra IL-6R/IL-6 chrání hepatocyty před uvedeným toxickým účinkem (není zobrazeno).

Aplikace chiméry IL-6R/IL-6 se může použít při ochraně jatemá tkáně u pacientů s nekrotickým onemocněním, které je způsobené chemikáliemi (například alkohol, paracetamol) nebo v jiných případech (například při virové hepatitidě).

-22CZ 302488 Bó

Příklad 9: Konstrukce a aktivita chiméry IL-ó/sIL-óRóVal

Zkonstruovala se chimérová molekula, ve které část IL-6 je na N-konci, zatímco část sl L-6R je na C-konci. Plazmid pBS-sIL-6RóVal se štěpil v restrikčním místě Sau3a (bp 1086) a HindlII.

které následuje po terminačním kodónu po Val-359 (popisuje se v Příkladu 1). Syntetizoval se linker obsahující tří restrikční místa Spěl, Smál a BamHL

Spěl Smál BamHI

5' CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG

A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5 (SEQ ID NO: 2)

Toto restrikční místo Sau3a sIL-6R se ligovalo do restrikčního místa BamHI linkeru a vše se oxidázovalo do vícenásobného klonovacího místa plazmidu Bluescript pBS SK. Sekvence IL-6 io se amplifikovala pomoci PCR z DNA ρΚΚβ2-7 za použití primerů (počáteční kodónje podtržen)

Spěl

Fcrward 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC TC (SEQ ID NO: 3)

HaelII

Reverzní 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEQ ID NO: 4)

Produkt PCR štěpený restrikčním enzymem Spěl a HaelII se zavedl do restrikčního místa Spěl a Smaí shora uvedeného linkeru. Dále se syntetizoval jiný linker BamHl-NcoI s vnitřním restrikčním místem SmaL

5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[Ncol] [BamHI] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5' (SEQ ID ,s NC: 5)

Tento linker se klonoval mezi restrikční místo předchozího linkeru a Ncol 1464 sekvence IL-6R.

Fragment IL-6R od Smál 867 do Ncol 1464 se pak zavedl mezi restrikční místo Smál druhého linkeru a Ncol IL-6R. Výsledná chimérová DNA se sekvenovala a znovu oxidázovala do pCDNA3 za účelem exprese v lidských buňkách HEK 293. Aminokyselinová sekvence chiméry

IL-6-IL-6R 3e je zobrazena na obrázku č. 11 (linker je podtržen). Chiméra 3e se čistila afinitní chromatografií na monoklonálních protilátkách proti IL-6 (popisuje se v publikaci Novick et al., Hybridoma 8, 561Í567, 1989). Při testu SDS-PAGE se objevil pruh odpovídající molekulové hmotnosti 75 000.

Biologická aktivita chiméry IL-6-IL-6R 3e inhibovat růst buněk melanomu F 10.9 je zobrazena na obrázku č. 12. Uvedená chiméra je jasně aktivní ve srovnání s chimérou 1L-6R/IL-6 (příprava 1 až 3) ve stejném experimentu, ačkoli je nutné její vyšší koncentrace, aby došlo k 50% inhibici růstu.

Pomocí PCR mutageneze se připravily dva mutanti IL-6R/IL-6, ve kterých aminokyseliny His-280 a Asp-281 části IL-6R chiméry IL-6R/IL-6 (obrázek č. 3) se zaměnily za Ser a Val (mutant 39 nebo HD) nebo kde Asn-230 se dále zaměnil za Asp (mutant NHD). Jak je možné spatřit na obrázku č. 12, tyto dva mutanty nevykazovaly skoro žádnou aktivitu ve srovnání s chimérami IL-6R7ÍL-6 a IL-6-1L-6R. Protože v IL-óR tyto aminokyseliny interagují s gp 130, jak se ukázalo molekulárním modelováním (popisuje se v publikaci Hal i mi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chenath J. Epitop peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135 až 143, 1995), což demonstruje, ze chiméra sIL-6R/IL-6 konzervuje toto podstatné místo interakce.

-23 CZ 302488 B6

Chiméra IL -6-1L-6R 3e nezahrnuje oblast IL-6R podobnou imunoglobulinu, která je přítomna v IL 6R/IL 6. Avšak pouhé odstranění Ig—oblastí z 1L6R/IL-6 nesníží její biologickou aktivitu vůči buňkám F10.9. Navázáni chiméry IL-6-1L-6R 3e na gp!30 tvoří přibližně 30 % navázání další chiméry IL6R/IL6 (není zobrazeno). Tato menší schopnost se vázat je v souladu s nižší aktivitou vůči růstu buněk melanomu.

Tyto výsledky ukazují, že blokování C-konce IL-6 fúzí prostřednictvím linkeru s sIL-6R, konzervuje v nových chimérách dobrou biologickou aktivitu.

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

G— - Cíly Aj-S. uly Leu Val Gly GIv Glr. ?he Xsc

5 IC (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ÍD NO: 2:

CTAGTGGC-CC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC C7AG (2) Informace o SEQ ID NO: 3 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

-24 CZ 302488 B6

GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4: AGGC-CCATTT GCCGAAGAGC C (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 párů bází

2o (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

GACCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT 6G

AC ⁶² (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly ?ro Gly

-25CZ 302488 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 543 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Mot 1

Leu

Ala

Val

Gly 5

Cys

Ala

Leu

Ala 10

Ala

Leu

Ala

Ala 15

Pro

Gly

Ala

Leu 20

Ala

Pro

Arg

Cys 25

Pro

Gin

C-lu

Val 30

Ala

Arg

Gly

Val

Leu 35

Thr

Ser

Leu

Pro

Gly 40

Asp

Ser

Val

Thr

Leu 45

Thr

Cys

Pro

Gly

Val 50

Glu

Prc

Glu

Asp

Asn 55

Ala

Thr

Val

His

Trp 60

Val

Leu

Arg

Lys

Pro 65

Ala

Gly

Ser

His 70

Pro

Ser

Arg

Trp

Ala 75

Gly

Meh

Gly

Arg

Arg 80

Leu

Arg

Ser 85

Val

Gin

Leu

His

Asp 90

Ser

Glv

Asn

Tyr

Ser 95

Cys

Tyr

Arg

Ala

Gly 10C

Arg

Pro

Ala

Gly

Thr 105

Val

His

Leu

Val 110

Asp

Val

Pro

Glu 115

Glu

Pro

Gin

Leu

Ser 120

Cys

Phe

Arg

Lys

Ser 125

Prc

Leu

Ser

Α3Π

Val 130

Val

Cys

Glu

Trp

Gly 135

Pro

Arg

Ser

Thr

Pro 140

Ser

Leu

Thr

Lys 14 5

Ala

Val

Leu

Val 150

Arg

Lys

Phe

Gin

Asn 155

Ser

Pro

Ala

Glu

Asp 160

Phe

Gin

Glu

Pro

Cys 163

Gin

Tyr

Ser

Gin

Glu 170

Ser

C-ln

Lys

Phe

Ser 175

Cys

Gin

Leu

Ala

Val 180

Pro

Glu

Gly

Asp

Ser 135

Ser

Phe

Tyr

Ile

Val 190

Ser

Met

Cys

Val

Ala 195

Ser

Val

Gly

Ser 200

Lys

Phe

Ser

Lys

Thr 205

Gin

Thr

Phe

Gin

Gly 210

Cys

Gly

113

Leu

C-ln 215

Pro

Asp

Prc

Pro

Ala 220

Asn

Ile

Thr

Val

Thr

Ale

Val

Ala

Arg

Asn

Pro

Arg

Trp

Leu

Ser

Val

Thr

Trp

Gin

Asp

225 230 235 240

-26CZ 302488 B6

Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu A.rg phe Glu Leu Arg 245 250 255

Tyr Arg Ada Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270

Leu Gin His His Cys Val lle His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 235

Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser 290 295 300

Glu Tro Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser

3C5 ' 310 315 320

Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr

325 330 335

Asn Lys Asp Asp Asp Asn lle Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr

340 ' 345 350

Ser

Leu

Pro 355

Val

Glu

Phe

Met

Pro 360

Val

Pro

Gly Glu 355

Asp

Ser

Lys

Asp

Val

Ala

Pro

His

Arg

Gin

Pro

Leu

Thr

Ser Ser

Glu

Arg

lle

37 0

375

330

Asp

Lys

Gin

lle

Arg

Tyr

lis

Leu

Asp

Gly

lle

Ser Ala

Leu

Arg

Lys

3S5

33G

395

400

Glu

Thr

Cys

Asn

Lys

Ser

Asn

Met

Cys

Glu

Ser

Ser Lys

Glu

Ala

Leu

405

410

415

Ala

Glu

As Λ

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Met

Ala

Glu lys

Asp

Gly

Cys

420

425

4 30

Phe

Gin

Ser

Gly

Phe

Asn

Glu

Thr

Cys

Leu

Val lys

Zle

lle

Thr

435

440

Gly

Leu

Gin

Phe

Glu

Val

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu Gin

Asn

Arg

Phe

450

455

460

Glu

Ser

C-lu

Glu

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

C-lr.

Met Ser

Thr

Lys

Val

465

470

475

480

Leu

lle

Gin

Phe

Leu

Gin

Lys

Ala

Lys

Asn

Leu Asp

AÍcL

lle

Thr

455

4*90

495

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

Leu

Thr Lys

Leu

Gin

Ala

500

505

510

Glu

Asn

Gin

Trp

Leu

Gin

Asp

Met

Thr

Kus

Leu Zle

Leu

Arg

Ser

515

520

525

Phe

Lys

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser

Leu

Arg

Αχ a

Leu Arg

Gin

Met

530

535

540

-27CZ 302488 B6

Informace o

SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 471 amin

okyselin

(B) TYP: aminokyselina

(C) DRUH RETEZCE: jcdnořetězcová

(D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: peptid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO

»: 8:

Met Asn

Ser Phe Ser

Thr

Ser

Ala

Phe

Gly

' Pro

Val

Ala

Phe

Ser

Leu

i

5

10

15

Giy Leu

Leu Leu Val

Leu

Pro

Ala

Phe

Pro

Ala

Pro

Val

Pro

20

25

30

Gly Glu

Asp Ser Lys

Asp

Val

Ala

A3a

Pro

His

Arg

Gin

Pro

Leu

Thr

35

40

4 5

Ser Ser

Glu Arg Xle

Asp

Lys

C-ln

Ile

Arg

Tyr

Ile

Leu

Asp

Gly

Tle

50

55

60

Ser Ala

Leu Arg Lys

Glu

Thr

Cys

Asri

Lys

Ser

Asn

Met

Cys

Glu

Ser

65

70

75

80

Ser Lys

Glu Ala Leu

Ala

Glu

Asn

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Met

Ala

S5

50

55

Glu Lys

Asp Gly Cys

Phe

Gin

Ser

Gly

Phe

Asn

Glu

Thr

Cys

Leu

i00

105

110

Vel Lys

Ile Ile Thr

Gly

Leu

Glu

Phe

Glu

Val

Tyr

Leu

Gj_ui

Tyr

115

120

125

Leu Gin

Asn Arg Phe

Glu

Ser

Glu

Gin

Ala

Arg

Ala

Val

Gin

130

135

140

Met Ser

Thr Lys Val

Leu

Ile

Gin

Phe

Leu

Gin

Lys

Ala

Lys

Asn

145

150

155

160

Leu Asp

Ala Tle Thr

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

Leu

165

170

175

Thr Lys

Leu Gin Ala

Gin

Asn

Gin

Trp

Leu

Gin

Asp

Men

Thr

His

íao

185

190

Leu Ile

Leu Arg Ser

Phe

Lys

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser

Leu

Arg

Ala

l ας

200

205

Leu Arg

Gin Met Gly

Gly

Asp

Pro

Gly

210

215

220

- 28CZ 302488 B6

Pro 225	Gly	Val Pro	Pro Glu Glu 230	Pro	Gin	Leu	Ser Cys Phe Arg 235	Lys	Ser 240
Pro	Leu	Ser Asn	Val Val Cys	Glu	Trp	Gly	Pro Arg Ser Thr	Pro	Ser
			245			250		255
Leu	Thr	Thr Lys	Ala Val Leu	Leu	Val	Arg	Lys Phe Gin Asn	Ser	Pro
		260			265		270
Ala	Glu	Asp Phe	Gin Glu Pro	Cys	Gin	Tyr	Ser Gin Glu Ser	Gin	Lys
		275		230			235
Phe	Ser	Cys Gin	Leu Ala Val	Pro	Glu	Gly	Asp Ser Ser Phe	Tyr	Ile
	290		295				300
Val	Ser	Met Cys	Val Ala Ser	Ser	Val	Gly	Ser Lys Phe Ser	Lys	Thr
305			310				315		320
Gin	Thr	Phe Gin	Gly Cys Gly	Ile	Leu	Gin	Pro Asp Pro Pro	Ala	.Asn
			325			330		335
Ile	Thr	Vsi Thr	Ala Val Ala	Arg	Asn	Pro	Arg Trp Leu Ser	Val	Thr
		340			345		350
Trp	Glr.	Asp Pro	His Ser Trp	Asn	Ser	Ser	Phe Tyr Arg Leu	Arg	Phe
		355		360			365
Glu	Leu	Arg Tyr	Arg Ala Glu	Arg	Ser	Lys	Thr Phe Thr Thr	Trp	Met
	37C		375				380
Val	Lys	Asp Leu	Glr. His His	Cys	Val	Ile	His Asd Ala Tro	Ser	Gly
385			390				395		400
Leu	Arg	His Val	Val Gin Leu	Arg	Ala	Gin	Glu Glu Phe Gly	C-ln	C-ly
			405			410		415
Glu	Trp	Ser Glu	Trp Ser Pro	Glu	Ala	Met	Gly Thr Pro Trp	Thr	Glu
		420			425		430
Ser	Arg	Ser Pro	Pro Ala Glu	Asn	Glu	Val	Ser Thr Pro Met	Gin	Ala
		435		440			445
Leu	Thr	Thr Asn	Lys Aso Asp	Asp	Asn	Ile	Leu Phe Arg Asp	Ser	Ala
	450		455				460
Asn	Ala	Thr Ser	Leu Pro Val

465

470

-29CZ 302488 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-GR/IL-6), tvořený rozpustným receptorem interleukinu-6 (sIL-6R) a interleukinem-6(lL 6). přičemž uvedený protein sIL-6R/IL—6 se při expresí v buňkách savců glykosyluje stejným způsobem, jako přirozeně se vyskytující formy slL-6R a IL-6, přičemž slL-6R je fúzován s IL-6 přímo nebo přes peptidový linker, kterým je tripeptid se sekvencí E-F-M (Glu-Phe-Met) nebo peptid s obsahem 13 zbytků aminokyselin se io sekvencí E-F-G-A-G-L-V-L-G- G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-Gin-Phe-Met).
2. Chimérový protein slL-GR/IL-6 podle nároku 1, kterým je sIL-6RÓVal/IL-6 s trípeptídem se sekvencí E-F-M mezi C-terminálním Val-356 v sIL-6R a N-terminálním Pro-29 v IL-6

15 chimérního proteinu se sekvencí, znázorněnou na obr, 3.
3. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 podle nároku 1, kterým je sIL-6R8Val/L/lL-6 s peptidovým linkerem se sekvencí 13 zbytků aminokyselin E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M mezi Cterminálním Val-356 v slL-6R a N-terminálním Pro-29 v IL-6 chimérního proteinu se

20 sekvencí, znázorněnou na obr. 3, přičemž tripeptid se sekvencí E—F-M mezi polohami 357 a 359 na obr. 3 je nahrazen svrchu uvedenou sekvencí s 13 zbytky aminokyselin.
4. Chimérový protein slL-6R/IL—6 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který se produkuje ín vitro v savčích buňkách ve zcela zpracované formě.
5. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 podle nároku 4, který se produkuje v lidských buňkách.
6. Chimérový protein sIL 6R/Ii. 6 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, který je charakterizován svou schopností inhibovat buňky vysoce maligních nádorů, vyvolat in vivo přijetí lidských

30 krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně a ochránit játra před působením hepatotoxických látek.
7. Chimérový protein slL-óR/IL-6 podle nároku 6, charakterizovaný svou schopností inhibovat růst buněk maligního melanomu.
8. Sekvence DNA, kódující chimérový protein sIL-6R/IL—6 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
9. Vektor DNA s obsahem sekvence DNA podle nároku 8, vhodný pro expresi uvedeného

40 chimérového proteinu v savčích buňkách.
10. Vektor DNA podle nároku 9, vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v lidských buňkách.

45
11. Vektor DNA podle nároku 9 nebo 10, při jehož expresi v uvedených buňkách má exprimovaný chimérový protein sekvenci, která dovoluje úplné zpracování chimérového proteinu savčími nebo lidskými buňkami a jeho vylučování z buněk do kultivačního média, v němž jsou uvedené buňky pěstovány.

50
12. Transformované savčí buňky, obsahující vektor podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, schopné exprimovat chimérový protein slL-6R/IL-6, obsažený v tomto vektoru a plně zpracovat exprimovány protein a vyloučit jej do kultivačního média, v němž jsou uvedené buňky pěstovány.

-30CZ 302488 B6
13. Způsob výroby chimérového proteinu podle kteréhokoliv z nároků laž7, vyznačující se tím. že se pěstují transformované buňky podle nároku 12 za podmínek, vhodných pro expresi, zpracování a vylučování uvedeného proteinu do kultivačního média, v němž jsou uvedené buňky pěstovány a získaný protein se čistí.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se čištění provádí imunoafinitní chromatografií s použitím monoklonálních protilátek, specifických pro sIL-6R.
15. Použití chimérového proteinu síL-6R/IL-Ó podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 jako inhibitorů zhoubných nádorových buněk ex vivo.
16. Použití podle nároku 15, při němž buňkami zhoubného nádoru jsou buňky vysoce maligního melanomu.
17. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje chirnérový protein sIL-6R/IL-6 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo sekvenci DNA podle nároku 8 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo pomocnou látku.
18. Použití chimérového proteinu sIL-6R/IL-ó podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo sekvence DNA podle nároku 8 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení zhoubných nádorů u savců, vyvolání in vivo přijetí lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně, pro zvýšení tvorby krve, nebo k léčení jaterních a neurologických poruch.
19. Použití podle nároku 18, při němž jsou buňkami zhoubného nádoru buňky vysoce maligního melanomu.