PT99452B

PT99452B - Metodo para o controlo biologico de pragas utilizando estirpes bacterianas e para a preparacao de composicoes contendo as referidas estirpes

Info

Publication number: PT99452B
Application number: PT99452A
Authority: PT
Inventors: Paul Jarrett; Philip Francis White; Nicole Jane Pethybridge
Original assignee: Agricultural Genetics Co
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-07
Publication date: 2000-12-29
Also published as: PH31040A; IL99928A0; US5512279A; WO1992008354A1; IE913876A1; DE69124261D1; PT99452A; JPH06501477A; CA2095835A1; HUT69978A; AU8863091A; ATE147581T1; DE69124261T2; KR930701920A; HU9301326D0; EP0556238A1; EP0556238B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

RESUMO

O presente invento diz respeito a um método para o controlo biologico de dípetros parasitários que não sejam mosquitos, que consiste na utilização de estirpes isoladas de Bacillus Thuringiensis HD 541 (NCIMB 40373) ou HD 571 (NCIMB 40374), ou de um dos seus mutantes,

AGRICULTURAL GENETICS COMPANY LIMITED

MÉTODO PARA 0 CONTROLO BIOLOGICO DE PRAGAS UTILIZANDO ESTIRPES BACTERIANAS E PARA A PREPARAÇAO DE COMPOSIÇOES CONTENDO AS REFERIDAS ESTIRPES recombinantes ou derivados, ou de um material insecticida delas derivado.

E também referido o processo para a preparação de composições farmacêuticas que contem as referidas estirpes e que são utilizadas no referido método.

presente invento refere-se ao combate de pragas por meio de métodos biologicos e, mais especialmente, se refere a métodos e composições em que intervém Bacillus thuringiensis para o combate de pragas com incidência nos domínios da agricultura, horticultura e da saude pública.

Bacillus Thuringiensis é uma bactéria formadora de esporos de que se sabe há muito tempo que é capaz de destruir insectos. Desta especie existe uma listagem de muitas centenas de estirpes. As culturas dessas estirpes estão catalogadas e elaboradas/arquivadas pelos Serviços de Investigação Agrícola do Depto. Norte-Americano da Agricultura, Peoria, Illinois, e figuram ainda uma serie de outras Colecções Internacionais, podendo ser consultadas a pedido, pelos investigadores interessados. A obtenção de algumas culturas necesssita de autorização das entidades que contribuíram para a colecção das culturas, embora a maioria destas culturas possam ser obtidas sem quaisquer condições ou compromissos. Os espectro de acção destas estirpes e a sua potência em relação a determinados insectos poderão variar dentro de largos limites.

presente invento refere-se ao emprego das estirpes HD 541 e HD 571 de B. thuringiensis para o combate/controlo de dípepteros parasitários, que infestam plantas e cogumelos comestíveis. Por conseguinte o presente invento diz respeito a um método para o combate de parasitas, atarves do qual se protegem produtos agrícolas e hortícolas contra as pragas pela aplicação das estirpes desta sub-espécie sobre as plantas em crescimento ou

outros produtos hortícolas, ou ainda sobre as áreas em que alas se desenvolvem. 0 presente invento abrange, também, composições contendo uma ou mais estirpes de B.thuringiensis formuladas para as aplicações nos domínios da agricultura, horticultura e da saude publica. As duas estirpes que figuram na feferida Colecção de Culturas Norte-Americana sob as siglas de HD 571 e HD 541, têm apresentado características muito promissoras para os fins do presente invento. Estas estirpes estão disponíveis na Colecção de Culturas Norte-Americanas desde Agosto de 1979 (HD 541) e Dezembro de 1979 (HD 571/), podendo ser obti das sem qualquer restrição. No entanto, a fim de garantir a obtenção continuada destas estirpes, viemos depositalas na Colecção Nacional de Bactérias de Utilidade Industrial e Marítima, Aberdeen, Escócia, em 8 de Março de 1991, nos termos do Tratado de Budapeste.

As estirpes depositadas foram atri buidas as siglas de entrada de respectivamente NCIMB 40 373 (HD 541) e NCIMB 40 374 (HD 571).

Sabe-se que as estirpes HD 541 e HD 571 do B.thuringiensis exercem efeitos sobre o insecto diptero Aeses aegypti (mosquito).. No entanto, o grau da acção sobre sete insecto é fraco, sendo cerca de 10.000 vezes menor do que a acção desenvolvida pelo B.thuringiensis israelensis, a sub-especie que está a ser utilizada actu almente, no combate de mosquitos.

A eficacia das estirpes HD 541 e HD 571 foi também verificada em relação a outras especies de mosquitos; no entanto, descobriu-se de que a sua potência era demasiado diminuta para ser util para fins práticos.

Descobriu-se agora de que as referidas estirpes desenvolvem uma acção altamente potente como agentes insecticidas relativamente a determiandos dípte ros parasitarios que não sejam mosquitos; nomeadamente em relação as pragas que afectam plantas e cogumelos, tais como a mosca sciarida que ataca fungos.

Elas mostram-se altamente eficazes em relação âs larvas de sciarida de cogumelos, Lycoriel la auripila, que é a praga mais devastadora das culturas de cogumelos no Reino Unido, e que causa enormes prejuízos no rendimento das culturas de cogumelos; presentemente, esta praga está a ser combatida sobretudo pelo insecticida químico diflubenzuron. Uma especie semelhante, L. mali, actua nos mesmos domínios nos EUA e na Australia.

A actividade dos referidos estir pes a nivel destas pragas é também significativamente mais acentuada do que a exercida por outras:estirpes de B.thurin giensis, incluindo algumas de cada uma das sub-especies israelensis , dendrolimus, Kyushensis e morrisoni. Assim, estas estirpes constituem os tão almejados novos agentes para o controlo das referidas pragas. Além das sciaridas, as foridas de cogumelos são outras tantas pargas de cogumelos que podem ser combatidas por esssas estirpes. No entanto, as mencionadas estirpes não exibem qualquer acção inusitadamente eficaz sobre pragas, tais como cecídas que

-6χ: £ atacam cogumelos. Outros dípteros parasitarios com significado no domínio agrícola abrangem a mosca da fruta do Mediterrâneo.

Tal como ja fora mencionado, o presente invento utiliza as estirpes naturais HD 541 e HD 571. 0 presente invento se aplica também a mutantes, recom binantes e derivados destas estirpes naturais, que sejam activos a nivel de dípteros parasitarios. Derivados deste genero abrangem aqueles que se podem obter por manipulação genetica. 0 invento inclui ainda a utilização de delta-endotoxinas derivadas dos organismos atras mencionados.

presente invento refere-se a uma substancia entomocida (insecticida) derivada da estirpe HD 541 òu HD 571 de B.thuringiensis, ou de um dos seus mutantes ou derivados, ou de uma estirpe produzida de acor do com um processo atrás definido. De acordo com uma forma de realização do invento, a substancia entomocida ê um complexo esporo-cristal.

presente invento refere-se ain. da a uma substancia entomocida derivada de Baci11us thuringiensis , estirpe HD 541 (NCIMB 40 373) ou HD 571 (NCIMB 40 374) ou de um dos seus derivados ou mutantes, ou se refere a uma substancia entomocida segundo a definição atras referida, em conjunto, com uma substancia adjuvante agrico la, tal como um excipiente, diluente, tensio-activo ou um adjuvante para facilitar a aplicação da substancia activa A composição pode também conter mais um composto biologicamente activo, escolhido do grupo formado por fertilizantes micro-nutrientes, preparados para o desenvolvimento vegetal, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactéricidas, nemati cidas e moluscidas e suas misturas entre si.

A referida composição pode conter entre 0,1 e 99%, em peso,de B.thuringiensis na forma de estirpe HD 541 ou HD 571, ou de um dos seus derivados ou mutantes, ou a substancia entomocida; entre 1 e 99,9%, em peso, de um adjuvante solido ou liquido e netr 0 e 25% em peso, de um agente tensio-acti vo.

Além disso, o invento revela um método para o combate de pragas , segundo o qual se aplica às pragas ou às areas em que estas se desenvolvem (habitat) uma quantidade eficaz em termos entomocidas, da estirpe HD 541 ou HD 571 de B .thuringiensis, ou de um dos seus derivados de/ou mutantes ou de uma substância entomocida atrás definida ou ainda uma composição que contem a estirpe um derivado, mutante ou substancia entomocida mencionados .

As estirpes de HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis ou as composições contendo estas estirpes podem ser aplicadas âs plantas ou âs culturas que se pretendem proteger, em conjunto com determinados outros insecticidas ou produtos quimicos sem qualquer perda da potência entomocida.

As estirpes ou composições são compatíveis com a maioria dos materiais de pulverização (sprays) normalmente utilizados na agricultura, mas elas não deveriam ser empregadas no seio de soluções pulverizáveis extremamente alcalinas.

8Elas podem ser'Administradas sob a forma de um material pulverizado, suspensão ou um pó humectavel, ou em qualquer outra forma que seja apro priada para a aplicação no domínio da agricultura .

Durante a produção, por fermentação, e após o desenvolvimento normal do Bacillus thuringiensis verifica-se lise das células progenitoras, libertan do-se os esporos e cristais para o meio nutritivo onde se desenvolvem mais. Os esporos e cristais podem ser colhi dos mediante centrifugação ou filtração, secagem por pulverização, secagem num vazio, ou mediante um processo de precipitação, tal como a co-precipitação com lactosetécnica, descrita por Dulmage et al., (Journal of Invertebrate Pathology, 15, 15-20, 1970). 0 complexo esporos-cristais resultante mantem-se estável durante longos períodos de tempo, e pode ser formulado num produto apropriado para ser aplicado a culturas de plantas uteis.

método para a preparação de uma composição insecticida de acordo com o presente invento, caracteriza-se pela obtenção de culturas das estirpes HD 541 ou HD 571 de Bacillus thuringiensis através das seguintes etapas:

a) Conservação da estirpe em ampolas 1iofi1izadas,

b) Inoculação da estirpe em gradientes de ágar-ágar,

c) Incubação desses gradientes, durante 1 a 5 dias, a temperaturas compreendidas entre 20 e 40°C, de preferencia entre 25 e 33°C.

d) Transferencia de fragmentos desses gradientes, por inoculação em frascos agitados, contendo um meio de cultura aquoso,

e) Agitação deste recipiente, a umaatemperatura entre 20 e 40°C de preferencia a 30°C, durante 1 a 5 dias, de preferencia 1 a 2 dias, e, eventualmente, repetição desta etapas de crescimento vegetal, pelo menos 1 vez, num frasco separado.

f) Inoculação, numa cuba de fermentação para culturas previas, num meio aquoso de cultura, das culturas obtidas na etapa e),

g) Agitação e ventilação do meio contendo o meio inoculado, a uma temperatura entre 20 e 40oC,de preferencia entre 30° e 35°C, e, eventualmente repetição desta etapa de fermentação de cultura previa, pelo menos uma vez, num recipiente separado de maiores dimensões,

h) Introdução de 2 a 20%, em peso, de fluido de incubação da etapa g) numa cuba de fermentação para produção, contendo um meio de cultura aquoso.

i) Agitação e ventilação do meio a uma temperatura entre 20 e 40°C, de preferencia entre 30° e 35°C.

j) Colheita do caldo contendo HD 541 ou HD 571 de B_. thuringiensis logo que a esporulação e formação de cristais

-10* -? ? ? ' na cuba de fermentação correspondente tenham atingido a fase máxima.

K) 0 ágar-ágar e o caldo em a) a d), deveriam conter, pelo menos uma fonte dadora de azoto, uma fonte dadora de carbono, e pelo menos, um sal de preferencia, peptona, glucose e,pelo menos um sal.

Os meios de f) a j) deveriam con ter, pelo menos, uma fonte de azoto (por ex., peptona extracto de levedura, milho macerado, farinha de soja farinha de peixe, farinha de sementes de algodão), pelo menos uma fonte de glicidos (por ex., glucose, lactose, sucrose, amido ou uma materia-prima rica nesses componentes), e, pelo menos, um sal mineral. As fontes de azoto e de glicidos deveriam estar presentes em quantidades que garantissem a sua absorção mais ou menos simultânea.

complexo de esporos e de cri£ tais ou a composição contendo esse complexo poderá administrar-se às plantas ou às colheitas que se pretendem proteger juntamente com determinados outros produtos insecticidas ou químicos, sem qualquer perda da sua capacidade entomicida.

Os esporos presentes no complexo de esporos-cristais podem ser destruídos (por ex., por raios gama) ou se pode impedir a produção de esporos pelo recurso a um mutante cristalifero esporogéríco, obtendo-se deste modo, um produto não-viavel. Um produto não-viável poderá vir a ser util em determinados circunstancias em que

S\- seja desejável de impedir a disseminação de bactérias por razões esteticas ou afim de evitar doenças em insectos úteis No entanto, os produtos não-viaveis não são geralmente tão activos como aqueles que contêm esporos vivos e, como desvantagem adicional, há os elevados custos implicados para a destruição dos esporos.

presente invento refere-se ainda um método para o tratamento de culturas, caracteriz^ do por se aplicar uma quantidade eficaz em termos entomicidas, de HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis , ou uma composição contendo estas estirpes.

Geralmente, as estirpes HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis são aplicadas sob a forma de composições e podem ser administradas â area cultivada que se pretende tratar, quer simultâneamente, quer sucessivamente, com outros compostos dotados de actividade biológica. Estes compostos podem ser fertilizantes ou produtos que libertam micro-nutrientes quer outros preparados capazes de influenciar o desenvolvimento das plantas. Eles podem ainda ser produtos selectivos,. tais como herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscieidas ou misturas de vários desses preparados, e, caso se desejar, em conjunto com outros excipientes, agentes tensioactivos ou adjuvantes que facilitam a aplicação e que se utilizam geralmente na técnica de formulações.

Excipientes e adjuvantes apropria^ dos podem ser solidos ou líquidos e correspondem ao genero das substancias que se empregam normalmente na técnica de formulação, por ex., substancias minerais, naturais ou regeneradas, solventes, dispersivos, agentes humectantes, agluti nantes, ligantes ou fertilizantes.

As formulações, isto é, as compo sições ou misturas contendo B.thuringiensis sob a forma de estirpes HD 541 ou HD 571 como composto activo ou as suas combinações com outros compostos activos, e, caso seja apropriado, um adjuvante solido ou liquido, são preparados de maneira conhecida, por ex., pela misturação e/ou trituração homogenea dos compostos activos com diluentes, por ex., dissolventes, excipientes solidos, e, nalguns casos, compostos tensioactivos (tensides).

Dissolventes apropriados são: hidrocarbonetos aromáticos, de preferencia os termos contendo 8 a 12 ãtomos de carbono, por ex., misturas de xilenos ou naftalenos substituidos, ftalatos, tais como ftalato de dibutilo ou ftalato de dioctilo, hidrocarbonetos alifãticos, tais como ciclohexano ou alcanos, álcoois e glicois, tal como ciclohexanona, solventes fortemente polares, tais como N-meti1-2-pirrolidona, dimeti1-sulfoxido de/ou dimetilformadia, e bem assim óleos vegetais ou óleos vegetais aproximados, tais como óleo de coco epoxidado ou óleo de soja epoxidado; ou a água.

Os excipientes solidos utilizados por ex.,para os produtos pulverizados e pós dispersivos, são geralmente materiais de enchimento (cargas) minerais, naturais, como calcite. talco, caolino, montmori1lonite

-13X .

ou atapulgite. Para melhorar as propriedades físicas é também possível juntar acido altamente silicico disperso ou poli meros absorventes, altamente dispersos. Excipientes adsorventes granulados, apropriados, são produtos porosos, por ex., pedra-pomes, pó de tijolo, sepiolite ou bentonite; e excipientes não-absorventes apropridados são materiais tais como calcite ou areia.

Arem disso, podem utilizar-se um grande numero de materiais previamente granulados de natureza organica ou inorgânica,, por ex., e em especial, do lomite ou resíduos vegetais pulverizados.

Consoante a natureza dos compostos activos que se pretendem formular, compostos tensioactivos adequados são compostos tensio-activos não-ionogenicos, cationicos, e/ou anionicos com boas propriedades emulsivas, dispersiveis e humectantes. 0 termo tensioativo abrange, também as misturas de compostos tensioactivos.

Compostos tensioactivos anionicos apropriados podem ser tanto sabões (mistura de sais de sodio de ácidos gordos) e compostos tensioactivos sintéticos hidrossolúveis .

Sabões apropriados são os sais de metais alcalinos, alcalino-terroso ou os sais de amónio, substituído ou insubstituído de ácidos gordos superiores

P°^{r ex}-> ^os saisde sódio ou de potássio do ácido oleico. ou do ácido esteárico, ou de misturas de ácidos gordos naturais, que se podem obter, por ex., a partir de óleo de coco ou'do óleo sebaceo. Outros compostos tensioa£ tivos adequados são também os sais de meti1-taurina de ácidos gordos, bem como os fosfolipidos modificados e não-modifiçados.

No entanto, utilizam-se mais frequentemente os chamados compostos tensio-activos sintéticos, em especial sulfonatos de ácidos gordos, sulfatos gordos, derivados sulfonados de benzimidazole ou alquilarilo -sulfonatos.

Geralmente, os sulfonatos gordos ou sulfatos gordos estão presentes sob a forma de sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos ou de sais de amónio, insubstituído ou substituído e, geralmente, contêm um radical alquilíco com u.m número de átomos de carbono entre 8 e 22 (6₈-0₂₂) > que inclui, também a fracção alquilica de radicais de acilo, por ex., o sal de sódio ou do cálcio de sulfatos de alcoóis gordos, obtidos a partir de ácidos gordos naturais. Estes compostos incluem também os sais de ésteres do acido sulfúrico e de ácidos sulfónicos de produtos de adição de álcoois gordos ao êxido de etileno.

De preferencia, os derivados sulfonados do benzimidazole contêm 2 grupos de acido sulfonico e um radical de acido gordo contendo cerca de 8 a 22 átomos de carbono.

Exemplos de alquilo-arilo-sulfonatos são os sais de sodio, cálcio ou trietanolamina do acido dodecilbenzenossulfonico , ácido dibutilnaftalenossulfonico ou de um produto da condensação do acido naftalenos sulfonico ao formaldeido. São tamb'em apropriados os corres^ pondentes fosfatos, por ex., os sais de ester do acido fosforico ou dum aduto de p-nonilfenil a 4 a 14 moles de oxido de etileno.

Os compostos tensioactivos não-ionogenicos são preferentemente os derivados de éter poliglicolico de álcoois alifaticos ou ciclo-alifáticos ou de ácidos gordos saturados ou insaturados e de alquilfenois, sendo que os referidos derivados contem entre 3 e 30 grupos de éter glicolico e 8 a 20 átomos de carbono na fracção de hidrocarboneto (alifatico) e 6 a 18 átomos de carbono na parte alquilica dos alquilfenois.

Outros compostos tensioactivos não-ionogenicos são os adutos hidrossoluveis do oxido de polietileno ao propilenoetileno glicol, etiledodiaminopolipro pileno glicol e alqui1-polipropileno glicol contendo 1 a 10 átomos de carbono na cadeia de alquilo, sendo que os referidos adutos contem entre 20 e 250 grupos de éter de etileno glicol e entre 10 e 100 grupos de éter de propileno glicol.

-16Geralmente, estes grupos contem 1 a 5 unidades de etileno glicol por unidade de propileno glicol.

Exemplos representativos de compostos tensioactivos não-ionogenicos são noniIfenol-poli-etoxietanois, éteres de poliglicol do óleo de rícino, produtos da reacção de adição entre polipropileno e oxido de polietileno, tributilfenoxi-poli-etoxietanol, polietileno glicol e octilfenoxi-poli-etoxietanol. São ainda apropriados como compostos tensioactivos não-ionogenicos os ésteres de ácidos gordos de polioxietileno-sorbitano, como o trioleato de polioxietileno-sorbitano.

De preferencia, compostos tensioactivos cationicos são os sais de amonio quaternário, que contem, como substituinte no átomo de azoto, pelo menos, um ra dical Cg-C₂₂- alquilo e, como substituintes adicionais, radicais de alquilo inferior insubstituidos ou halogenados, radicais de benzilo ou radicais de hidroxialquilo inferior. De preferencia, os sais estão presentes sob a forma de haletos, meti 1-sulfatos ou eti1-sulfatos , por ex., cloreto de esteari1-trimeti1-amonio ou brometo de benzil-di-(2-cloro etilo)-etil-amonio.

Os compostos que se empregam normalmente na técnica de formulação vêm referidos, por ex., nos manuais de Mc Cutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey 1979;

Dr. helmut Stache, Tensid Taschenbuch (Manual de compostos tensioactivos), Cari Hanser Verlag, Munique/Viena.

-17As composições'entomicidas con. têm, geralmente, as estirpes HD 541 ou HD 571 de Baci 1 lus thuringiensis numa percentagem de 0,1 a 99%, de preferência de 0,1 a 95%, ou as suas combinações com outros compostos activos, um produto adjuvantes, sólido ou líquido, numa percentagem de 1 a 99,9% e um tensioactivo numa percentagem de 0 a 25%, de preferência de 0,1 a 20%. Ao passo que os produtos comerciais estão preferentemente formulados como produtos concentrados, o consumidor final deverá utilizar normalmente, as formulações diluídas em concentrações substâncialmente menores.

As referidas composições pod£ rão também conter outros componentes, tais como estabilizantes, agentes anti-espuma, produtos para regular a viscosidade ligantes, aglutinantes, bem como fertilizantes ou outros com postos àctivos, a fim de se obterem efeitos especiais.

presente invento será, agora explicitado em mais pormenor no respeitante aos resultados obtidos em ensaios laboratoriais e no campo, no âmbito de estudos comparativos sobre as estirpes HD 541 e HD 571 e outras estirpes isoladas de B.thuringiensis. A taxa de aplicaçã de Bacillus thuringiensis HD 541 ou HD 571 âs pestes ou ao seu ambiente pode variar amplamente.As taxas de aplicação adequa-das podem ser fácilmente determinadas pelos peritos nesta técnica com base em testes preliminares. Exemplos de taxas adequadas são: 0,001 g a 100 g por kg de material contendo pradas (por ex., substracto de cogumelos) e 0,001 mg a 100 mg por larva de insecto.

-18EXEMPLO 1

Cultura bacteriana

Fez-se uma cultura de bacteVias a 30°C , em 50 ml de um meio de cultura, contido num balão com caneluras, de 250 ml de capacidade, colocado sobre um dispositivo agitador orbital (250 rpm) procdendo-se â inoculação de uma cultura bacteriana na fase semi-exponencial a 1% (v/v). Um meio nutritivo típico era composto de 10 g/1 de farinha de.soja, 10 g/1 de fe^cula de batata, 5 g/1 de K₂ ^HP04 ^{e 10} m 1 /1 de uma solução de oligoelementos.

A solução de oligo-elementos era constituída por 8 g/1 de CaCl₂.2H₂0, 5 g/1 de MnCl₂.2H₂0 e 0,5 g/1, respectivamente de CuC1₂.2H₂0, ZnCK₂, CoCl₂ θ FeClg. 0 desenvolvimento das culturas foi verificado ao microscopio em contraste de fases, procedendo-se ã colheita a seguir à autólise das células.

A duração da incubação variará entre 40 e 72 horas, consoante a estirpe utilizada. A preparação do meio nutriente e a transformação das culturas em'produtos pulverizados, anidros, por meio do método utilizando lactose-acetona, realizaram-se dê acordo com os prece_i_ tos delineados por Dulmage et al., (Journal of Invertebrate Pathology, 1970, 15, 15-20). A produção de bacteVias para serem utilizadas nos ensaios com cogumelos foi idêntica â atrás mencionada, com a excepção que se utilizaram 400 ml de um caldo, nutrientes em balões com canaluvas de 2 litros de capacidade e que o caldo não foi transformado num pó.

-19EXEMPLO 2

Bioensaios com insectos

Para a realização do bioensaio em escala laboratorial homogeneizaram-se pós bacterianos em água desionizada; os homogeneizados foram diluídos de forma apropriada e porções de 10 ml foram adicionados a 40 g de uma mistura de turfa; farinha de soja (20:1). Em seguida, o meio tratado foi dividido, em partes iguais e introduzido em 2 vasos de material plástico (A.W. Gregory Ltd., Londres). Juntando-se, pelo menos, 20 larvas de Lycoriella auripila ou L. mali, recém-nascidas, tem cada um dos vasos. Obtiveram-se ovos de larvas de L.auripila ou de L.mali através do método idealizado por Binns (annals of Applied Biology, 1973, 73,119-126). Os vasos foram incubados a 24°C, sendo diariamente registada a eventual emer gencia (saida) de insectos adultos. Para as comparações dos tratamentos utilizou-se a ^emergencia de adultos de 8 vasos de controlo, sem B.thuringiensis.

Todas as estirpes foram inicialmente experimentadas, sendo submetidas a uma concentração de 10 mg de pó bacteriano por cada grama de meio. Aquelas estirpes que causassem uma taxa de mortalidade superior a 95% foram novamente testadas mais exaustivamente numa gama de varias concentrações. Todos os dados foram analisa dos por meio do método estatístico Probit..

-20A actividade das estirpes de B^. thuringiensis em relação â L.auripila variou consideravelmente, tendo desenvolvido uma boa e moderada actividade 9 de um numero total de 22 estirpes (Tabela 1). As estirpes pertencentes âs sub-especies morrisoni, darmstadiensis, Kyushensis e israelensisforam es estirpes mais activas.

As moscas que emergiam de culturas contendo doses sub-letais de B.thuringiensis também precisaram de mais tempo para o seu desenvolvimento atê â fase de mosca adulta do que o controlos. Em média, os períodos de dessenvolvimento eram 4 dias mais longos naqueles tratamentos que causaram uma taxa de mortalidade maior que 50% nos ensaios laboratoriais. A analise estatística dos dados otidos do bioensaio vieram mostrar que as estirpes HD 541 e HD 571 eram significativamente mais activas do que qualquer uma das outras também submetidas a teste.

No âmbito de ensaios separados verificou-se de que as estirpes HD 541 e HD 571 eram significativamente mais activas sobre L> auripila do que outras estirpes pertencentes â sub-especie Kyushensis.

Fez-se uma comparação da activida^ de das amostras, submetidas a raios gama, das estirpes HD 571 e IPS 82 versus L. ma li. Descobriu-se de que a estir pe HD 571 de B.thuringiensis era signíficativamente mais efj_ caz (CL₅₀ de 44,4 ug por g; margens de confiança: 27,40 -58,75) do que B.thuringiensis israelensis sob a forma da estirpe IPS 82, que apresentou um valor de CL_5Q superior a 100 ug por grama.

-21EXEMPLO 3

Ensaios com cogumelos

Húmus de cogumelos com micelios abundantes foi introduzido em 48 vasos de material plástico de 25 cm de diâmetro, numa quantidade de 2,5 kg por cada vaso. Uma mistura húmida constituída por volumes iguais de turfa e de cal (terra gredosa) foi adicionada â superfície do humus, numa proporção de 1,5 kg por cada vaso.

Antes da sua aplicação sobre o húmus, a mistura húmida foi deixada sem tratamento ou foi tratada com dif1ubenzurona, a 30 mg de s.a./kg - ouseja. a concentração-standard do agente quimico de controlo, comercial, ou foi tratada com culturas de caldos ou de formulações das estirpes em 4 concentrações diferentes: 0,4 , 2, 10, ou 50 ml/kg da mistura húmida, no caso de HD 541 e de 4,0, 10,0 25,0 ou 62,5 ml/kg de mistura húmida no caso de HD 571. Os 6 tratamentos foram repetidos, em cada caso, por 8 vezes.

vasos, um de cada tratamento, foram colocados, numa ordem de sequencia eleatória, num tabu leiro de madeira para cogumelos (0,9 χ 0,6 m), e introduzidos numa estufa pará cogumelos. No total, havia 8 tabuleiros, dispostos em dois andares de 4 tabuleiros. Na estufa havia uma população abundante de L.auripila adultos. Decorridos 7 dias, os adultos foram sacrificados através de uma corrente de piretróides sintéticos, para impedir a postura de mais ovos. 11 dias após o tratamento, colocaram-se tiras de apanha-moscas sobre o recipiente para capturar os adultos que emergissem. Em seguida, os vasos individuais foram embrulhados numa malha de rede de poli-éster, â prova de moscas.

-22Α presença de moscas nas tiras foi verificada 18, 22, 28 e 33 dias após o tratamento.

A temperatura do ar dentro da estufa foi mantida a 20°C durante o ensaio.

A adição de caldos de culturas das estirpes HD 541 e HD 571 à camada da mistura, no âmbito dos ensaios com cogumelos deu origem a uma redução significativa da eclosão subsequente de adultos de L.auripila em comparação com os controlos não-tratados (Tabela 2 (a) + (b)). HD 541, numa concentração de 50 ml/kg e HD 571 em concentrações superiores a 10 ml/kg, conseguiram taxas de controlo comparáveis âs obtidas no tratamento com diflubenzurona.

EXEMPLO 4

Exemplos de formulações para compostos activos solidos de

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis ou com outros compostos activos.	das suas associações
(as percentagens vêm expressas	em termos	ponderais)
1. Pós Humectaveis	a)	b)	c)
Bacillus thuringiensis (HD 541 ou HD 571 )	25%	50%	7 5%
Lignossulfonato de sodio	5%	5%	-
Lauri1-sulfato de sodio	3%	-	5%
Di isobuti1 naftalenossulfonato de sodio	-	6%	10%
eter polietilenoglicolico de octilfenol (7 a 8 moles) de oxido de etileno	-	2%	-
Acido silício altamente disperso	5%	10%	10%
Caolino	6 2%	27%

-24Mistura-se intimamente HD 541 ou HD 571 de B .thuringiensis com os adjuvantes, e a mistura resultante é triturada energicamente, num moinho apropriado obtendo-se pós humectaveis que se podem diluir com água para se formularem suspensões nas concentrações desejadas.

2) Concentrado emulsivo

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis 10%

Eter polietilenoglicolico de octilfenol (4 a 5 moles de oxido de etileno) 3%

Dodecilbenzenossulfonato de cálcio 3%

Eter poliglicolico de oleo de rícino (36 moles de oxido de etileno)

Ciclohexanona

Mistura de xilenos

30%

50%

Mediante diluição com água se podem obter deste concentrado emulsões em qualquer concentração desejada.

-253. Produtos para polvilhamento

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis

a) b)

5% 8%

Talco

Caolino

Obtem-se pós

95%

92% prontos a serem utj_ lizados pela misturação do composto activo com os excipien tes e pulverizando a mistura obtida, num moinho adequado.

4. Granulados de extrusão

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis 10%

Lignossulfonato de sodio 2%

Carboximetil-celulose 1 %

Caolino 87% compostoractivo ou a respectiva combinação é misturado e pulverizado com os adjuvantes, e a mistura obtida é humedecida com água. Procede-se â extru são da mistura, à sua granulação e secagem subsequente numa corrente de ar.

265. Granulados revestidos

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis 3%

Polietileno glicol (PM 200) 3%

Caolino 94% composto activo, finamente pul verizado, ou a respectiva combinação, é aplicado, de modo uniforme, sobre o caolino humedecido com polietileno glicol. Obtêm-se desta maneira, granulados revestidos, não-pulverulentos.

6. Concentrado de suspensão

HD 541 ou HD 571 de B.thuringiensis 40%

Etileno glicol 10%

Eter polietilenoglicolico de nonilfenol (15 moles de oxido de etileno) 6%

Lignossulfonato de sodio 10%

Carboximetilcelulose 1%

Solução aquosa, a 37% de formaldeído 0,2% óleo de silicone sob a forma de uma emulsão aquosa, a 75% 0,8%

Agua 32% composto activo, finamente puj_ verizado ou a combinação correspondente, ê misturada infimamente com os adjuvantes, obtendo-se um concentrado para suspensões, a partir do qual se podem preparar suspeji sões em qualquer concentração desejada, mediante diluição com ãgua.

-28EXEMPLO 5

Formulações: ensaios da eficacia insecticida

Tal como se descreve no Exemplo 4, prepararam-se varias formulações da estirpe HD 571, procedendo-se à comparação com um caldo de cultura não-formulado e um caldo não-formulado, seco por pulverização em relação à eficacia de controlo de L.auripila, no âmbito de um ensiao de fungos (cogumelos). A Tabela 3 apresenta os resultados, expressos em percentagens de controlo entomicida, observado em vasos tratados com diflubenzurona. Todas as preparações da estirpe HD 571 desenvolvem uma actividade sobre L.auripila se bem que o grau desta acção varie de acordo com o genero da respectiva formulação. Estas representam exemplos de apenas algumas formulações eficazes; os peritos nesta matéria certamente saberão preparar muitas outras formulações igualmente eficazes.

TABELA 1

Actividade de Bacillus thuringiensis contra Lycoriella auripi Ia

Código Sub-espécie ^CL50 ug de B.t./g de meio de cultura

Margens de confiança

IPS-82 HD657	israelensis tl	130, 4 154, 4	95, 103,	9 4	- 180,0 - 223, 8
HD 240	qalleriae	2027, 6	998,	6	- 4530, 6
PG 14	morrisoni	117, 9	88,	3	- 156, 9
HD 753	darmstadiensis	144, 0	84,	9	- 216, 5
HD 754	11	330, 2	225,	6	- 537, 5
HD 573	wuhanensis	2304,9	1575,	4	- 3064, 0
HD 541	kvushuensis	31, 4	20,	9	- 42,3
HD 571	It	12, 5	' 9,	2	- 16, 9

estirpes englobando 11 outras sub-especies .tiveram pouca, ou nenhuma actividade (0 a 77% de mortalidade com a dose extremamente elevada de 10.000 ug de Bithuri ngiens is em pó/g de meio de cultura).

-30TABELA 2

Efeito de duas estirpes de

Bacillus thuringiensis e de diflubenzurona sobre o numero total de dipteros de Lycoriella auripilá' que emergem da mistura tratada.

(a) Estirpe HD 541

Tratamento		HD	541		Dif*	Testemunha
Concentração	0,4	2,0	10,0	50,0	30,0	-
Numero total	1602	1301	901	192	193	2071
% de Controlo	entomicida	9
	77,4	62,8	43,5	9,3	9,3	100,0
(b) Estirpe	HD 571
Tratamento		HD	571		Dif*	Testamento
Concentração	4,0	10,0	25,0	62,5	30,0	-
Numero total	313	81	31	10	22	754
% controlo entomicida 41,5	10,7	4,1	1,3	2,9	100,0

*Diflubenzurona formulada como pó humectável, 25% -HD 571 e HD 541, ml de caldo/kg de mistura:

Diflubenzurona, mg de s.a./kg

TABELA 3

Actividade de formulações de contra Lycoriella auripila.

Formulação

Caldo de cultura

Caldo de cultura seco por pulverização

WP 50²

SC 100³

SC 200⁴

HD 571 de B .thuringiensis

Actividade

100

D

Actividade expressa em termos de % de controlo entomicidas conseguido por diflubenzurona. As formulações foram adicio nadas â mistura numa concentração de 0,625 g/kg (ou equivalentes) .

2)

Pó humectavel (WP = wettable powder) contendo HD 571 de

B.thuringiensis, e preparado tal como se refere no exemplo

4.

) ' Concentrado para suspensão (SC = suspension concentrate) preparado tal como se descreve no exemplo 4.

4)

Concentrado para suspensão preparado tal como se refere no exemplo 4.

Claims

1^a.- Método para o controlo biologico de dipteros parasitarios que não sejam mosquitos, caracterizado por se aplicar aos parasitas ou as pragas ou ao seu habitat, uma estirpe isolada para Bacillus thuringiensis HD 541 (NCIMB 40373 ) ou HD 571 (NCIMB 40374 ), ou um dos seus mutantes, recombinantes ou derivados ou ainda um material insecticida dela derivado.

2^a.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material insecticida compreender endotoxina delta.

3^a.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado por os dipteros parasitarios serem pragas que infestam plantas e fungos comestíveis.

4^a.- Metódo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os dipteros parasitarios serem pragas que infestam cogumelos.

5^a.- Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os dípteros parasitários serem Nematocera das famílias Sciaridae ou Mycetoph i1idae.

6^a.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por os dípteros parasitarios pertencerem? ao genero Lycoriella.

7^a.- Método de acordo com uma quaj_ quer das reivindicações 1 a 6 _s caracterizado por os dipteros parasitarios serem Lycoriella auripila ou L. mali.

8^a.- Processo para a preparação de uma composição para o controlo biologico de dípteros parasitarios que não sejam mosquitos, caracterizado por se incluir na referida composição estirpes isoladas de B.thurin giensis HD 541 ou HD 571 ou um material insecticida delas derivado, em conjunto com um excipiente, diluente, agente tensioactivo, ou adjuvante para facilitar a sua aplicação.

-359^a.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se incluir ainda na refe rida composição mais um composto biologicamente activo, escolhido do grupo formado por fertilizantes, compostos dadores de micronutrientes, preparações para o crescimento de plantas, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas e moluscicidas e suas misturas.

10^a.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se incluir na referida composição entre 0,1 e 99%, em peso, de Bacillus thuringiensis HD 541 ou HD 571 ou um dos seus variantes ou mutantes, ou do material insecticida; entre 1 e 99,9%, em peso, de um adjuvante solido ou liquido; e entre 0 e 25% em peso, de um agente: tensio-activo.

Lisboa, 7 de Novembro de 1991