RO105528B1

RO105528B1 - Metoda de analiza a antigenelor si anticorpilor in faza solida

Info

Publication number: RO105528B1
Application number: RO130949A
Authority: RO
Inventors: Gustaf Mats Ramby; Nils Arvid Bergsdorf
Original assignee: Cytrx Biopool Ltd
Priority date: 1986-04-15
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1995-10-01
Also published as: FI875422A7; AU7357387A; DE3788402T2; WO1987006346A1; KR900005486B1; SE8601695L; DK650387A; EP0262217B1; NO875198L; JPH02500211A; EP0262217A1; AU588111B2; SE8601695D0; HUT56633A; FI875422L; OA08783A; MC1865A1; NO875198D0; FI875422A0; JPH0635977B2

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă de analiza în fază solidă pentru detectarea antigenclor și/sau anticorpilor, prin metode imunologicc.

Sunt cunoscute metode imunologice în fază solidă pentru determinarea cantitativă sau calitativă a anumitor antigene, în care faza solidă este acoperită cu anticorpi specifici antigenelor. Aceasta are loc adesea prin adsorbția fizică a anticorpilor pe partea interioară a unor tuburi sau cavități de plastic în plăci de plastic (acoperire în literatura tehnică). La contactul soluției de test conținând antigene cu suprafețele tuburilor sau cavităților astfel tratate, antigenele sunt legate selectiv (reacție anticorp antigea) de anticorpul adsorbiL După aceasta reacție, tubul sau cavitatea este apoi golit gi spălat cu grijă, astfel încât anticorpul în exces nelegat de antigen sa fie trecut în soluție gi să poată fi transferat de pe matrice pe o altă fază solidă, care se manipulează cu mult mai ușor, unde ee poate efectua detecția și cantificarea lui. Prin metoda EI,ISA binecunoscută, aceasta se efectuează cu un anticorp adiționai Acest anticorp poate fi marcat cu o enzimă, cum este peroxidaza de hrean (HRP) sau fosfataza alcalină. Anticorpul cu enzimă (conjugat cu enzimă) este plasat în tub sau cavitate și este legat de antigenul prezent pe suprafețele pereților. Excesul de anticorp marcat cu enzimă este îndepărtat prin spălare, iar anticorpul marcat cu enzimă rămas este detectat cu un substrat dc enzimă, care, în urma reacției, este transformat într-un produs colorat

Variantele tehnicii ELISA, mai sus menționată, sunt numeroase, dar principiile de baza sunt aceleași. în teorie, numai antigenul este îndepărtat din matricea lui inițială pe o altă suprafață unde este expus uniform și este accesibil la analiză. în practică, există întotdeauna alți componenți în soluția de test care sunt și ei legați de această suprafață, fie de anticorpul absorbit, fie direct de. faza solidă prin alte mecanisme. Acești componenți legați nespecific reprezintă o sursă semnificativă de eroare în metodă, întrucât ei pot interfera cu analiza ce trebuie efectuată și/sau rezultate în determinare în mod fals pozitive sau în mod fals ridicate. Astfel, în tehnica ELISA tradițională, componenții ne-antigeni din probă, care sunt legați de faza solidă, pot absorbi anticorpul conjugat cu enzimă gi dau un rezultat de determinare în mod fals ridicat Aceste măsurători mediate de produsele ne-antigene sunt considerate a rezulta dintr-o absorbție nespecifică.

De asemenea, în analiza calitativă (de exemplu, testarea numai a prezenței sau absenței anticorpilor sau antigenelor din probă) răspunsuri mari de test, datorate unor efecte nespedficcx vor cauza un rezultat în mod fals pozitiv. încercările de a reduce efectele în mod fals pozitive prin ridicarea nivelului de discriminare al testului au determinat creșteri ale numărului de rezultate în mod fals negative. Astfel, efectele nespecifice îu aceste teste creează incertitudini în diagnoză.

Alte tehnici anterioare au încercat, de asemenea, să reducă absorbția nespecifică (sau legarea nespecifică) la minimum. De exemplu suprafața fazei solide a fost minuțios ^blocată, pentru a o face incapabilă dea absorbi componenți adiționali. In afară de aceasta, anticorpii captați au fost disodați enzimatic, iar fracțiunea care leagă antigenul [(Fab)2 - fragment)] a fost izolată și imobilizată de faza solidă. Totuși, nu s-a atins un succes total cu aceste tehnici.

Scopul invenției este de a reduce la minimum influența componenților legați nespecific de fazele solide și, implicit, de scădere a erorilor de analiză.

Problema pe care o rezolvă invenția consta în stabilirea etapelor și a condițiilor optime de metodă în vederea realizării scopului propus.

Metoda de analiză, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că, înaintea expunerii celor două faze solide la anticorpul (antigenul) specific, conjugat cu enzimă, prevede acoperirea primei faze solide și a celei de-a doua faze solide cu un anticorp (antigen)

- antigen (anticorp) specific, anticorpul fiind ales din grupele de anticorpi monoclonali sau policlonali și conțin imunogjobinc, suprafețele solide fiind spălate după acoperire, urmată de expunerea primei faze la aceeași soluție de anticorp (antigen) pentru blocarea completă a legăturii specifice a antigenului (anticorpului) ce urmează a fi testat și expunerea celei de-a doua faze solide la o soluție conținând un anticorp (antigen) nespecific, dar care să derive de la aceeași specie ca și anticorpul (antigenul) antigen (anticorp) specific dc mai sus și să fie preparat in mod similar cu acesta și apoi aducerea în soluțiile de anticorp (antigen) specific și nespecific, ce acoperă cele două faze solide a antigenului (anticorpului) de testat, iar determinarea cantificată a antigenului (anticorpului) se face prin scăderea cantității de antigen (anticorp) legat în prima probă din cantitatea de antigen (anticorp) legat în a doua proba.

Se da mai jos un exemplu de realizare a invenției în legătura și cu figura, ce reprezintă comparația măsurătorilor tPA prin metoda ELISA pe 43 probe de plasmă sanguină.

Pemtru detecția de antigene printr-o metodă în fază solidă, se expun două alicote de probă conținând antigenul ce urmează a fi determinat la două faze solide cu suprafețe identice acoperite antigen-anticorp. O expunere (expunerea

1) este efectuată în prezență de anticorpi în probă având aceeași specificitate ca și anticorpii cu care sunt acoperite fazele solide, iar a doua expunere (expunerea

2) fiind de preferință efectuată în prezență de anticorpi în probă având ne-specificitate pentru antigenul respectiv, dar în rest identici în esență cu anticorpii prezeuți în proba de la expunerea 1 și se detectează antigenul prin intermediul diferenței dintre răspunsul testului la anticorpul legat de la expunerea 1 gi răspunsul testului la antigenul legat de la expunerea 2.

Cele două alicote dc probă expuse în expunerea 1 și expunerea 2 sunt, de preferință, cad în felul acesta se obține direct diferența dorită între antigenul legat în expunerea 1 și antigenul legat în expunerea 2, fără vreo sursă suplimentara de eroare. Totuși, aceasta nu exclude reușita metodei cu alicote diferite, adică cantități de test sau cantități de probă, cu condiția să se cunoască cantitățile, cu precizie Proba de antigen supusă tesutlui poate fi adăugată simultan cu anticorpul specific și nespecific la ede două faze solide sau proba de antigen poate fi adăugată la cele doua cavități după ce s-au adăugat anticorpii specifici și nespecifici.

Expunerea la cele două faze solide trebuie efectuată în condiții aproximativ identice, aceasta însemnând ca ambele faze solide sunt în esență identice între ele, dar teoretic este suficient ca fazele solide să fie prevăzute cu suprafețe în esență identice acoperite anti-antigenanticorp.

După cum s-a menționat mai sus, anticorpii prezenți în expunerea 1 au aceeași specificitate ca și anticorpii cu care a fodt acoperită faza solidă. în principiu, aceasta însemnează că anticorpii reacționează cu sau leagă antigenul ce trebuie detectat și blochează antigenul de a reacționa cu anticorpul pe faza solidă.

în schimb, anticorpii prezenți în expunerea 2 manifestă o nespecificitate pentru antigenul respectiv, adică nu reacționează cu sau nu leagă antigenul. Totuși, pe de altă parte, ei trebuie să fie în esență identici cu anticorpii prezenți în expunerea 1, ceea ce însemnează că ei sunt de aceeași origine (aceeași specie animaliera) și sunt preparați prin aceeași metodă.

Detecția antigenului prin intermediul diferenței dintre antigenul legat în cursul expunerii 1 și antigenul legat în cursul expunerii 2, este efectuată confonn unui procedeu cunoscut

Metoda din prezenta invenție pentru detecția de antigen este de un interes special pentru detecția de antigen t-PA (activator de țesut plasminogen) în probe biologice. Plasma sanguină, fluidul sinovial, fluidul cerebrospinal, fluidul seminal sau mediile de cultură de celule pot fi citate ca exemple de asemenea probe biologice.

Pentru a realiza invenția, se utilizează trei preparate de anticorpi. Primul pentru acoperirea fazei solide, un al doilea cu aceeași specificitate pentru blocarea valorii de determinare specifică (acesta poate fi același preparat de anticorp ca cel folosit pentru acoperire) și un al treilea care nu blochează rezultatul specific. Cele două din urmă preparate de anticorp reprezintă o pereche șî trebuie să fie cât mai asemănătoare între ele. De preferință, ele trebuie să difere numai în ce privește o singură proprietate reacția cu antigen, și anume, unul rebuie să reacționeze (să fie specific), iar celălalt să nu reacționeze (să fie nespecific) cu antigenul. Anticorpii trebuie, prin urmare, să aibă o origine identică sau similară (de exemplu, să derive de la aceeași specie animalieră, ambele fiind monoclonale ale aceleiași subgrupe sau ambele fiind polidonale) și trebuie să fie preparate în același mod sau în moduri sinulare.

Faza solidă poate fi constituită și din particule, cum sunt mărgelele. Această compoziție de particule cuprinde, dar nu se limitează la: agaroză, polistiren, latex și polimetacrilaL Se poate adăuga un volum de anticorpi corespunzând la

5...95% din volumul dispozitivului respectiv, de preferință, volumul de anticorpi poate corespunde la 10...91% din volumul dispozitivului și, mai dc preferat, volumul de anticorpi poate corespunde la 2(1..80% din volumul dispozitivului.

Cantitățile de anticorp prezente în cursul expunerii 1 sau expunerii 2, respectiv concentrația acestora poate fi cuprinsă aproximativ între 1 și 100 mg/1, de preferat concentrația între 20 și 80 mg/l Domeniul concentrației de anticorp este dependent de testul respectiv care trebuie efectuat Totuși, domeniul între aproximativ 1 și 100 mg/1 este adecvat pentru determinarea de t-PA în probe biologice. Metoda de analiza pentru detecția antigenului, conform invenției, poate fi aplicată și pentru reacția direct ί

opusă, adică pentru detectarea de anticorpi.

Pentru detecția de anticorpi printr-o metodă imunologică în faza solidă se expun două alicote, de preferință de aceeași mărime, din proba conținând anticorpul ce urmează a fi determinat la două faze solide cu suprafețele identice acoperite cu antigen, o expunere (expunerea 1) fiind efectuată în prezență de antigeni dizolvați în alicotă având o specificitate similara celei a antigenilor cu care au fost acoperite fazele solide și cealaltă expunere (expunerea 2) fiind efectuată în prezență de antigeni dizolvați în alicotă având o aespecificitate pentru anticorpul respectiv. Antigenul în expunerea 2 trebuie să fie similar ca structură cu antigenul dizolvat în alicotă în expunerea 1. Se detectează anticorpul prin intennediul diferenței între anticorpul legat din expunerea 1 și anticorpul legat de la expunerea 2 Aceasta metoda poate fi utilizată pentru determinarea anticorpilor HTLV ΙΠ-specifici (HIV AIDS virus- specific) în fluidele corpului. Alți anticorpi antigea-epecifici care pot fi determinați prin prezenta invenție includ, făiă a se limita la cudiolipină, fosfatidil colină, colagen, antigen de hepatitis A, antigen de hepatitis B și Borelea.

Metoda confonn invenției este efectuată astfel:

Plăci microtitru sunt acoperite cu anticorp prin incubare în cavitățile plăcilor 100...1000/zl dintr-o soluție conținând

1.. .100 mg/1 anticorp și 0,1...1,0 moli4 NaHCQj agitând ușor, timp de 2..4 h, la 2O...3O°C. Tampoanele care pot fi utilizate în procesul de acoperire conțin un detergent care nu denaturează proteina j ca: Tween 20, Triton 100, surfactanți pluronici, de exemplu, Tween cu soluție de sare tamponată cu fosfat (PBS) sau Tween PBS cu EDTA.

Cavitățile sunt golite și conținuturile sunt spălate cu Itaeen PBS. Pentru fiecare probă, se umplu două cavități: una cu

100.. .200/zl anticorp normal, 5...15 mg/ml, și una cu 100..200 /zl anticorp specific, 5„.15iczg/ml, ambele dizolvate în Tween PBS. într-o alternativă, tamponul poate

Ί fi tampon PET care conține EDTA Daca se utilizează tampon PET, procedeul de acidulare descris mai jos nu este necesar.

Probele de sânge sc colectează în modul obișnuit și sunt centrifugate la

1000...3000 x g timp de câteva minute. Plasma este acidulată prin incubarea aproximativ la un volum de plasmă cu un volum tampon de acidulate, cum este tamponul de acetat de sodiu, pH=3,5 ...4,5, timp de 10...20 min, la 20..30°C. Plasma acidulată este neutralizată, adăugând un volum de tampon pentru reglarea pH-ului, cum este fosfatul trisodic, pH=8...11.

O alicotă de 20...50 μί din fiecare plasmă este plasată în cavitățile preum plute cu anticorp normal san specific, respectiv, la o concentrație de 5...15 mg/1 dizolvat în Tween PBS. Proba este incubată timp de 4...5 h, la 20...30°C, sub agitare moderată.

Cavitățile sunt golite de conținuturile lor și sunt spălate cu Tween PBS.

O alicotă de 100...300μί din anticorpul HRP- conjugat, 1...3 mg/1 dizolvat în Tween PBS este incubată timp dc 4...S h, la 20...30°C, în cavități Cavitățile sunt golite de conținuturile lor și sunt spălate cu Tween PBS sau Tween PBS cu EDTA.

O alicotă de 100...300 μί substrat de peroxidază dizolvată în tampon de citrat-fosfat, pM 4_6 este incubată apoi în cavități, la 20.~30°C, la întuneric, timp de 20...40 min.

Reacția de substrat este întreruptă adăugând 10... 100 μί H2SO4 4..S moli/l.

Se înregistrează absorbanța la 490... 495 nm. Diferența de absorbanța dintre cavitățile umplute cu anticorp normal și cavitățile umplute cu anticorp specific este calculată pentru respectivele probe de plasmă. Aceasta reprezintă partea antigen- specifică a răspunsului și se compară cu o curbă standard în care antigenul este diluat în plasmă sanguină normala.

Determinările concentrațiilor de antigen activator de țesut plasminogen t-PA în plasmă au fost efectuate după cum urmează, însă pentru a înțelege semnificațiile simbolurilor folosite acestea se redau mai jos:

Antiser anti-t-PA IgG de capra contra t-PA din uter uman este produs în capră. Fracțiunea IgG este purificată prin cromatografie pe proteină A-sefaroză. Preparatul este liofilizat și la utilizare este reconstituit din apă.

IgG normal de capră

Fracțiunea IgG din serul unei capre neimunizată este purificată prin cromatografie pe proteină A-sefaroză. Preparatul este liofilizat și la utilizare este reconstituit în apă.

Αηά-t-PA IgG de capră conjugat cu peroxidază de hrean

Anti-t-PA IgG de capra descris mai sus este conjugat cu peroxidază de hrean (MRP Sigma tip VI), prin metoda cu aldehidă glutarică. Conjugatul este purificat de peroxidază liberă prin cromatografie pe proteina A-sefaroză.

Activator de țesut plasminogen (tPA) sub forma sa mono-catenară din celulele de melanomă umană; preparatul liofilizat cu albumină de ser bovin, ca purtător.

Substrat de peroxidază de 1,2-fenilendiamină (O.P.D), calitate pentru sinteze de la Merck Chemical Co., Rahway, New Jereey.

Tampon PBS-TVeen, tampon de fosfat de sodiu 20 mm ol/I, 10O mmol/1 NaCl, 0,1 g/l Tween 20, pH= 7,4.

Tampon PET, tampon de fosfat de sodiu 20 mmol/1, 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 EDTA, 0,1 g/l Tween, pH=7,9.

Tampon de citrat-foefat, 100 mMl/1 fosfat monosodic este ajustat la pH=5,0 cu 100 mMl/1 acid citric.

Tampon de acidulare 1,0 Μ1Λ tampon de acetat de sodiu, pH=3,9.

Tampon pentru ajustarea pH-ului. 50 mMl/1 fosfat de sodiu, 500 mMl/1 Tris (nis-hidroximetilaminometan), pH = 10,4.

plăci microtest cu cavități (Imunoplacă Nune 1, Nune, Danemarca) au fost acoperite cu anti-PA IgG, prin incubarea în cavitățile plăcilor a 200μί dintr-o soluție conținând 10 mg/1 anti-t-PA IgG și 0,1 mol/1 NaNCO3 sub o agitare ușoară, timp de 3 h, la 25°C.

Cavitățile au fost golite, iar conținuturile spălate cu Tween PBS sau tampon PET.

Pentru fiecare probă au fost umplute două cavități, una cu 150 «1 IgG normal, 10 mg/ml și una cu 150 /d anti-t-PA IgG, 10 mg/ml, ambele dizolvate în Tween PBS.

Probele de sânge au fost colectate în mod convențional (citrat de sodiu sau EDTA) și centrifugate la 2000 x g timp de 5 min. Plasma a fost acidulată incubând un volum de plasmă cu un volum de tampon de acidulare timp de 15 min, la 25°C. Plasma acidulată este neutralizată prin adăugarea unui volum de tampon pentru ajustarea pH-ului. Dacă se utilizează tampon PET în acest procedeu, acidularea plasmei nu este necesară.

O alicotă de 20... 50 μΐ (funcție de conținutul de t- PA al probei; rezultatul determinării este independent de volumul adăugat, în acest interval) din fiecare probă de plasma este adusă în cantități preumplute cu IgG normal, respectiv anti-t-PA, la o concentrație de 10 mg/ζ dizolvat in Tween PBS. Proba este incnbată timp de 3 h, la 25°C, sub o agitare ușoară.

Cavitățile sunt golite de conținuturile lor gi sunt spălate cu 'l\veen PBS sau tampon PET.

O alicotă de 200μΐ IgG t-PA conjugat cu HRP, 2 mg/1, dizolvat în Tween PBS sau Tampon PET, este incubată timp de 3 h la 25°C, în cavități.

Cavitățile sunt golite de conținuturile lor și sunt spălate cu Tween PBS.

O alicotă de 200 μ\ de substrat (O.P.D./H2O2) dizolvat în tampon citrat-fosfat, »H=5,0, este incubată apoi în cavități, la 25°C, la întuneric, timp de 30 min.

Reacția de substrat este întreruptă prin adăugarea a 50/îl de H2SO4 4,5 Ml/L

Se înregistrează absoibanța la 492 nm. Diferența de absorbanța între cavitatea umplută cu IgG normal gi cavitatea umplută cu IgG anti-t-PA este calculată pentru respectivele probe de plasmă. Aceasta reprezintă partea t-PA-spedfică a răspunsului și aceasta se compară cu o curbă standard în care t-PA se diluează cu plasmă umană normală.

Pentru a rezolva adsorbția nespecifică a conjugatului la dezvoltarea metodei ELISA pentru activatorul plasminogen al țesutului de enzimă (t-PA), s-a studiat efectul anticorpilor solubili în prima treaptă de incubare, adică atunci când proba testată este expusă la o fază solidă acoperită cu anticorp și s-a obținut ca: la concentrații relativ mici de anticorpi anti-t-PA, având aceeași specificitate ca cea utilizată pentru a acoperi suprafața fazei solide, a fost suficientă pentru a bloca rezultatul specific t-PA. Rezultatul scontat era acela că anticorpii specifici în faza lichidă (faza de probă) să dea o distribuție de antigen t-PA între cele două faze, în conformitate cu cantitățile relative de anticorpi în cele două faze. De exemplu, dacă 0,2 pg anticorp erau asociate cu faza solidă și 2 /rg cu faza lichidă, antigenul ar trebui să fie distribuit în raportul 1:10 între fazele solidă și lichidă, respectiv în practică, distribuția este 1:99 în asemenea cazuri. Această descoperire permite realizarea mei metode în care anticorpul solubil este plasat mai întâi în cavitatea (sau tubul) de măsurare și proba este apoi adăugată în acest tub. Când anticorpi de la animale neimunizate (așanumiții anticorpi normali) se includ în prima incubare, rezultatul estete general redus când activatorul deplasminogen de țesut (t-PA) în plasma sanguină a fost determinat prin tehnica ELISA în unele cazuri, reducerea a fost mai mare de 50%, dar, de obicei, de aproximativ 10%. Numai într-un singur caz din 45 au a fost constatată o asemenea reducere. în prealabil, era de așteptat o reducere numai în cazuri rare, anume în probe conținând așa numiții factori reumatoizL (Nu era de așteptat un efect de proteină, din cauză că cele 10 /îg'ml anticorpi normali care au fost adăgați au fost complet ecranați de cele 3000 /<g/ml proteină provenite de Ia proba de plasmă sanguina).

S-au efectuat testări pentru a studia modul de corectare într-o metodă de analiză a unui rezultat incorect obținut din cauza efectelor de legare nespecifică, când se utilizează metodologia ELISA spre a determina concentrațiile dc antigen cavități cu Tween PBS. în 31% din cazuri ¢13/34) diferența este mai mare de 100 unități de miliâbsorbantă. Probele individuale manifestă o absorbantă ridicată,

Probe de plasmă de la 34 de pacienți sunt analizate prin ELISA, acestea fiind plasate în cavități umplute cu Tween PBS, IgG normal sau IgG anti-t-PA. Rezultatele sunt prezentate astfel în legătură cu figura, ce reprezintă o comparație a rezultatelor de măsurătoare în cursul determinării de t-PA prin metode ELISA în 43 probe de plasmă sanguină. Pentru fiecare probă, măsurătoarea s-a făcut în trei determinări pe cavități cu pre umplere de 150 ță Tween PBS (0), 150 μ\ 10 mg/1 normal IgN (N) și 150 /rl 10 mg/ml anti-t-PA IgG (A) în cursul treptei de incubare a probei. Rezultatele de la aceeași probă sunt legate printr-o linie.

Răspunsul ELISA total, Rîot, se prezintă ca fiind compus din trei părți: (a) partea antigen-specifică, Ra& case poate fi imobilizată prin adăugare de imunoglobulinc antigen-specifice la probă; (b) o parte antigen- nespecifică, care poate fi imobilizată adăugând imunoglobuline neimune la probă și astfel poate fi denumita răspunsul imunoglobulin-specific,Rfe și (c) o parte reziduală nespe cifică, io/r, care nu este efectuată și nu este legată de prezența imunoglobuline10 lor. Astfel:

Rtot⁼ RAg+ Rig+ RUr

Când proba este adăugată la o cavitate de plăcuță micro-test conținând anticorpi antigen-epecifict (cavitate preumplere A), atât Ra& cât și Ri_& se elimina din răspuns, care este numit aici Ra, astfel: RA=RUr. Când proba este testată în cavități conținând anticorpi de la animale neimunizate (cavități preumplere N), numai Rh este eliminat din răspunsul numit aici R.n:Rn= Rlir. Diferența dintre Rn §i Ra este astfel partea antigen-specifică a răspunsului de test, adică ținta procedeului de test: Rn - RA~RAg.

Probele așezate în cavități umplute cu IgG normal manifestă o absoibanță mul mai mică decât probele aduse în chiar în prezență de IgG anti-t-PA Astfel, este necesar să se utilizeze metodologia conform invenției, atât cu anticorpi normali, câlși cu anticorpi anti-t-PA, pentru a evita un rezultat în mod fals pozitiv, datorită adsoibției nespecifice în timpul determinărilor de concentrații de antigen prin tehnica ELISA (sau prin tehnici similare).

Pentru a studia în continuare frecvența probelor de plasmă care produc legătură nespecifica ridicată, sunt analizate probe de la 519 indivizi, in privința concentrației de t-PA. Probele de plasma sunt plasate în cavități umplute cu IgG anti-t-PA, așa cum s-a descris mai sus. Aceste cavități sunt desemnate Cavități preumplere A. Rezultatele sunt date în tabelul de mai jos:

Răspunsul de test (A 492) măsurat în cavități A preumplute cu 519 probe de plasmă testate cu privire la antigen t-PA prin prezenta invenție

A492 peste 75........................ 454

75-100 ···· ·····*«*·***«**·*····«·»·«·»·**··««··*«···* 46

101-125.............................................10

126-150...............................................6 peste 150. ····*·*·»«*·»<**···«·«**··**·········*«*·· 3

V este numărul de probe. Conținutul normal de t-PA este de aprox 6 pg/l, ceea ce în această analiză corespunde la un rezultat de măsurătoare specifică de aprox. 20° unități de miliabsorbanța (mA). Tabelul arată că, fara a utiliza prezenta invenție, conținutul de antigen la aprox 2% din probe va fi supraestimat cu cel puțin 40%.

Metoda conform invenției prezintă următoarele avantaje:

- elimină sau reduce problema adsorbțici nespecifice;

- îmbunătățește substanțial posibilitățile de obținere de rezultate sigure (scad erorile de analiză);

- se poate măsura cu precizie cantitatea de anticorpi antigen- specific dintr-o probă de imunologie;

- se poate aplica cu rezultate foarte bune în special la o metodă imunologică nccompctitivă în faza solida, cum este tehnica ELISA.

Claims

Revendicări

1. Metodă de analiză calitativă și cantitativă a antigenelor și anticorpilor în faza solidă, prin tehnica ELISA, utilizând două faze solide, care pot fi constituite din tuburi de testare, plăci microlitru sau material plastic sub formă de sfere și în care aceste faze sunt tratate pentru adsorbție la suprafață cu anticorpi (antigene) specifici și apoi cu antigenul (anticorpul) detectat în amestec cu anticorp (antigen) marcat cu o enzima, caracterizată prin aceea că, în scopul reducerii la minimum a influenței componenților legați nespecific și fazele solide și, deci, la scăderea erorilor de analiză, înaintea expunerii celor două faze solide la anticorpul (antigenul) specific conjugat cu enzima se prevede: acoperirea primei faze solide și a celei de-a doua faze solide cu un anticorp (antigen) - antigen (anticorp) specific, anticorpul fiind ales din grupele de anticorpi monoclonali sau policlonali și conține imunoglobine, suprafețele solide fiind spălate după acoperire, urmata de expunerea primei faze la aceeași soluție de anticorp (antigen) pentru blocarea completa a legăturii specifice a antigenului (anticorpului) ce urmează a fi testat și expunerea celei de-a doua faze solide la o soluție conținând un anticorp (antigen) nespecific, dar care să derive de la aceeași specie ca și anticorpul (antigenul) - antigen (anticorp) specific de mai sus și să fie preparat în mod similar cu acesta și apoi aducerea în soluțiile de anticorp (antigen) specific și nespecific, ce acoperă cele două faze solide ale antigenului (anticorpului) de testat, iar determinarea cantificată a antigenului (anticorpului) se face prin scăderea cantității de antigen (anticorp), legat în prima probă din cantitatea de antigen (anticorp) legat în a doua probă.
2 Metodă de analiză, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, expunerea la soluțiile de anticorp (antigen) - antigen (anticorp) specific și de anticorp (antigen) nespecific se poate executa și simultan cu aducerea antigenului (anticorpului) de testat peste acestea, prin prepararea unui amestec a antigenului (anticorpului) de testat cu soluțiile de anticorp (antigen).

<s6)Referințe bibliografice

Imunoenzymatic Assay Techniques /1980 Enzyme - Imunoassay /1981 Brevete SUA nr. 4569919; 4661445