RO120343B1

RO120343B1 - POLIPEPTIDĂ c-RET ŞI ACID NUCLEIC CE CODIFICĂ PENTRU ACEASTA

Info

Publication number: RO120343B1
Application number: RO98-01550A
Authority: RO
Inventors: Michele Sanicola-Nadel; Catherine Hession; Richard L. Cate
Original assignee: Biogen Inc.
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2005-12-30
Also published as: BG64907B1; WO1997044356A2; NO985231D0; CZ296516B6; SK152498A3; WO1997044356A3; EP0914339A2; EE9800377A; KR100587556B1; CN1163509C; PT914339E; EA199800990A1; CN1232469A; NO20065528L; ES2270465T3; NO324957B1; ATE335003T1; JP2002515743A; EA002544B1; IS2361B

Abstract

Invenţia se referă la o polipeptidă c-Ret şi la un acid nucleic ce codifică pentru aceasta, cu rol în stimularea creşterii neurale şi renale şi care prezintă aplicabilitate în domeniul terapiei genice. Polipeptida conform invenţiei cuprinde cel puţin 400 aminoacizi, având o secvenţă semnal N-terminală hidrofobă şi o secvenţă C-terminală hidrofobă, cuprinzând un motiv de legare fosfatidilinozitol şi este selectată dintre secvenţele de aminoacizi SEQ ID Nr:17 şi SEQ ID Nr:21.

Description

Invenția se referă la o polipeptidă c-Ret și la un acid nucleic, ce codifică pentru aceasta, cu rol în stimularea creșterii neurale și renale și prezintă aplicabilitate în domeniul terapiei genice.

Unul dintre scopurile cercetării curente, asupra semnalizării celulei și activarea receptorului, este de a face posibilă modularea proceselor implicate în creșterea celulei și supraviețuire. Astfel de procese determină rezultatul în diverse condiții medicale, incluzând, printre altele, căderea de organe, dezvoltarea fetala și creșterea tumorii. Fiecare dintre aceste condiții clinice este de importanță clinică în toată lumea și are opțiuni limitate de tratament eficace.Pierderea de țesut sau căderea de organ în stadiul final, afectează în fiecare an milioane de oameni din întreaga lume și adaugă costuri suplimentare pentru îngrijirea sănătății. Pierderea organului este tratată de obicei prin transplantarea de organe de la donatori, prin reconstrucție chirurgicală sau cu dispozitive mecanice. Fiecare dintre aceste remedii are neajunsuri. Transplantarea este limitată de lipsa donatorului, reconstrucția chirurgicală poate crea alte probleme de lungă durată și dispozitivele mecanice nu pot să efectueze toate funcțiile unui organ și prin urinare nu pot împiedica deteriorarea. Astfel, există o necesitate medicală reală de soluții noi pentru aceste probleme.

Factorii proteici care afectează creșterea, diferențierea și/sau supraviețuirea celulelor pot să fie utili în tratamentul tulburărilor organelor care conțin celule sensibile. Factori sau liganzi care interacționează cu receptorul familiei de proteine tirozin kinază (RPTK) sunt de interes deosebit din acest punct de vedere. Acești receptori sunt implicați în numeroase programe celulare incluzând, creșterea și diferențierea și generare a numeroase neoplazii. Astfel, factorii sau liganzii care interacționează cu acești receptori se pot dovedi utili în tratarea tulburărilor unor organe unde țesutul a fost distrus. Alternativ, poate fi util să se blocheze interacțiunea acestor factori cu receptorii lor în scopul blocării creșterii tumorii.

Proto-oncogena Ret codifică un receptor tirozin kinază care este exprimat în timpul dezvoltării într-o diversitate de țesuturi, inclusiv sistemele nervoase periferic și central și rinichi. Anormalitățile prezente în șoareci nuli Ret sugerează că Ret este critic pentru migrarea și inervarea neuronilor enterici pentru intestinul posterior și proliferarea și ramificarea epiteliului mugurelul renal în timpul dezvoltării rinichiului (Nature 367, 380-383, 1994). Cercetarea pentru un component cheie al căii de semnalizare Ret, ligandul Ret, a fost o zonă de cercetări intensive.

Invenția se referă la o polipeptidă ligand c-Ret ce cuprinde cel puțin 400 aminoacizi, având o secvență semnal N-terminală hidrofobă și o secvență C-terminală hidrofobă cuprinzând un motiv de legare fosfatidilinozitol glican și este selectată dintre secvențele de aminoacizi SEQ ID Nr: 17 și SEQ ID Nr: 21.

Invenția se referă de asemenea, la un acid nucleic izolat care codifică pentru o polipeptidă ligand c-Ret ce prezintă o secvență nucleotidică aleasă din grupul de secvențe SEQ ID Nr: 16 și SEQ ID Nr: 20.

Acidul nucleic codifică pentru o polipeptidă ligand c-Ret, ce constă în aceea că, are o secvență nucleotidică aleasă din grupul de secvențe SEQ ID Nr: 16 și SEQ ID Nr: 20.

De asemenea, acidul nucleic codifică pentru o polipeptidă cu identitate de cel puțin 80% cu o secvență de aminoacizi aleasă din grupul SEQ ID Nr: 17 și SEQ ID Nr: 21, în care respectiva polipeptidă interacționează cu o proteină receptor Ret pentru a declanșa dimerizarea proteinei receptor Ret sau autofosforilarea unui domeniu al tirozin kinazei din proteina receptor Ret.

în altă realizare a invenției, o moleculă ADN purificată și izolată pentru asigurarea expresiei într-o celulă gazdă procariotă sau eucariotă a unui produs polipeptidic are cel puțin o parte a conformației structurale primare și activitatea biologică a RetL; ADN-ul poate fi a)

RO 120343 Β1 o moleculă ADN care cuprinde ADNc retL1 de la șobolan, ADNc retL1 parțial umană, ADNc 1 retL1 umană de lungime întreagă, ADNc retL2 umană, ADNc retL3 murin sau ADNc retL3 uman, sau banda complementară a ADNc retL1 de la șobolan, ADNc retL1 parțial umană, 3 ADNc retL1 umană de lungime integrală, ADNc retL2 umană, ADNc retL3 murină sau ADNc retL3 umană; b) molecule ADN care hibridizează în condiții stringente la moleculele ADN 5 definite în a) sau fragmente ale acestora; sau c) molecule care, doar pentru degenerarea codului genetic, vor hibridiza la moleculele ADN definite în a) și b). O moleculă ADN izolată 7 și purificată care codifică pentru un fragment polipeptidic sau variantă a unei RetL umane având activitate biologică a unei RetL este de asemenea cuprinsă în invenție.9

Orice molecule ADN recombinante ale invenției pot fi legate operabil la o secvență de control al expresiei.11

De asemenea, invenția cuprinde vectori și sisteme de eliberare care cuprind moleculele ADN sau constructele definite oriunde în această descriere. Vectorul poate să 13 cuprindă o moleculă ADN care codifică o RetL sau o variantă a RetL.

Invenția include celule gazdă procariote și eucariote transformate sau transfectate 15 stabil printr-un vector cuprinzând o moleculă ADN care codifică o RetL nativă sau o variantă a acesteia.17

O RetL umană purificată și izolată, substanțial lipsită de alte proteine umane este cuprinsă specific în invenție, așa cum este un procedeu pentru producerea unui produs 19 polipeptidic având în parte sau în totalitate conformația structurală primară și activitatea biologică a unei RetL. Un astfel de procedeu include etapele de creștere, în condiții de cui- 21 tură corespunzătoare, a celulelor gazdă procariote sau eucariote transformate sau transfectate cu orice moleculă ADN a invenției, într-un mod care permite expresia unui astfel de 23 produs polipeptidic și recuperarea unei RetL. Produsul polipeptidic al expresiei într-o celulă gazdă procariotă sau eucariotă a unui ADN este de asemenea inclus. 25

Invenția include proteine sau fragmente de proteine, variante și derivați, fie solubili, fie legați la membrană. De asemenea, proteina are o secvența de aminoacizi care cuprinde 27 RetL1 de la șobolan, RetL1 parțial umană, RetL1 umană de lungime întreagă, RetL2 umană, RetL3 murină, sau RetL3 umană, sau este o variantă a uneia dintre aceste secvențe. în alte 29 realizări, proteina este o proteină de fuziune incluzând Ret sau o RetL, fuzionată la altă moleculă sau fragment molecular, cum arfi o imunoglobulină, toxină, compus care formează 31 imagini sau radionuclid. De asemenea, sunt incluse molecule himerice ale RetL.

Alte realizări ale invenției includ anticorpi monoclonali specifici pentru o RetL a 33 invenției. Un asemenea anticorp poate fi asociat cu o toxină, un compus care poate forma imagini sau radionuclid. Invenția include de asemenea linii de celule hibridoma care produc 35 anticorpi specifici pentru Ret, incluzând AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.BI, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 și BH.G8, precum și subclone ale acestor hibridoma 37 și anticorpi produși de aceste hibridoma sau subclone ale acestor hibridoma.

Invenția include și metode de susținere a creșterii țesutului nou, sau susținerea 39 supraviețuirii țesutului distrus la un subiect, incluzând administrarea la subiect a unei cantități eficiente terapeutic a unui compus care interacționează cu Ret și prin aceasta induce 41 autofosforilarea Ret. Compusul poate fi RetL1, RetL2 sau RetL3, un fragment al unei RetL de lungime întreagă, sau un anticorp care se leagă la Ret. Compusul poate fi administrat 43 concurențial cu o cantitate eficientă terapeutic dintr-un al doilea compus, cum ar fi GDNF, neurturin sau o moleculă înrudită GDNF. Deși țesuturile de interes pentru aceste metode pot 45 să includă orice țesut, țesuturile preferate includ țesut renal, țesut neural, inimă, stomac, intestin subțire, măduva spinării, sau plămân. într-o realizare, RetL este o RetL solubilă. 47

RO 120343 Β1

Subiectul metodelor poate fi omul.

în altă metodă a invenției, semnalul transductiei Ret dintre o primă celulă care exprimă o RetL și o a doua celulă este inhibat prin punerea în contact a primei celule cu o proteină Ret solubilă sau cu un anticorp pentru RetL. Proteina Ret solubilă poate fi o proteină de fuziune.

Invenția include, de asemenea, o metodă pentru țintirea unei toxine, compus care formează imagini sau radionuclid spre o celulă care exprimă Ret, cuprinzând punerea în contact a celulei cu o proteină de fuziune RetL sau anticorp anti-Ret conjugat la o toxină, compus care formează imagini sau radionuclid. RetL poate fi RetL1, RetL2 sau RetL3. în altă metodă, este suprimată creșterea unei celule tumorale care exprimă Ret, o etapă a metodei fiind punerea în contact a celulei cu o proteină de fuziune a unei RetL și o toxină sau radionuclid, sau un anticorp anti-Ret conjugat la o toxină sau radionuclid. Celula poate fi întrun subiect și proteina sau anticorpul conjugat se administrează la subiect.

De asemenea, cuprinsă în invenție este o metodă pentru țintirea unei toxine, compus care formează imagini sau radionuclid spre o celulă care exprimă o RetL, cuprinzând punerea în contact a celulei cu o proteină de fuziune cuprinzând Ret și o toxină, compus care formează imagini sau radionuclid, sau un anticorp anti-RetL conjugat la o toxină, compus care formează imagini sau radionuclid. Altă realizare include metoda de suprimare a creșterii unei celule tumorale care exprimă o RetL, cuprinzând punerea în contact a celulei cu o proteină de fuziune Ret și o toxină sau radionuclid sau cu un anticorp anti-RetL conjugat la o toxină sau radionuclid sau cu un anticorp anti-RetL conjugat la o toxină sau radionuclid; celula poate fi într-un și proteina administrată la subiect.

RetL pentru oricare dintre metodele invenției poate fi RetL1, RetL2 sau RetL3, sau o variantă sau fragment al RetL1, RetL2 sau RetL3.

Metode de terapie genică sunt de asemenea cuprinse în invenție. O realizare este o metodă de tratare a unui subiect cu o tulburare a metabolismului Ret, cuprinzând administrarea la subiect a unui vector cuprinzând o moleculă ADN care codifică o RetL, precum și o metodă de susținere a creșterii de țesut nou la un subiect, cuprinzând administrarea unui asemenea vector la subiect. Altă realizare include o metodă de susținere a supraviețuirii țesutului distrus la un subiect, o etapă a metodei fiind administrarea unei cantități eficiente dintr-un vector care codifică o RetL la subiect.

în continuare, se prezintă pe scurt figurile care însoțesc invenția.

- fig. 1, secvență ADNc (SEQ ID NR:1) și secvența de aminoacizi dedusă (SEQ ID NR;2) a RetL1 de la șobolan. Secvența nucleotidică se întinde de la perechea de baze 201 la perechea de baze 1700 a SEQ ID NR:1 și conține întregul cadru deschis de citire.

- fig. 2 A, secvență ADNc parțială (SEQ ID NR:8) și secvența de aminoacizi dedusă (SEQ ID NR:9) a RetL1 umană. Această secvență este cea a insertului clonei HRL20, depozitată ca ATCC Nr. 97604.

-fig. 2 B, secvență ADNc compozită de lungime întreagă (SEQ ID NR:10)și secvența de aminoacizi (SEQ ID NR:11) a RetL1 umană.

- fig. 3 A, comparație a secvenței nucleotidice a retll umană (linia superioară a secvenței) cu cea a secvenței RetL1 de la șobolan (linia inferioară a secvenței). Liniile verticale dintre nucleotide arată identitatea la o poziție, în timp ce un punct indică un spațiu la acea poziție.

-fig. 3 B, comparație a secvenței de aminoacizi a RetL1 (linia superioară a secvenței) cu cea a secvenței RetL1 de la șobolan (linia inferioară a secvenței). Liniile verticale dintre aminoacizii corespondenți arată identitatea la un rest, în timp ce un punct indică o substituire conservativă la acel reziduu.

RO 120343 Β1

- fig. 4 A, diagramă schematică a unui posibil rol pentru Ret și RetL în interacțiunea 1 dintre o celulă a mezenchimului metanefric și o celulă a mugurelul ureteric.

- fig. 4 B, diagramă schematică a unei metode de căutare a transfectanților unei 3 biblioteci ADNc pentru clone care exprimă o RetL. Prezența RetL exprimate pe transfectanți este detectată prin cercetarea legării printre acei transfectanți fi ei ai proteinei de fuziune 5 Ret/lgG, fie ai proteinei de fuziune Ret/fosfatază alcalină.

- fig. 5, diagramă schematică, ce prezintă construcția plasmidelor folosite pentru a 7 exprima proteina de fuziune Ret de la șobolan/lgG.

- fig. 6, diagramă schematică reprezentând construcția plasmidelor folosite pentru a 9 exprima proteina de fuziune Ret umană/lgG.

- fig. 7, secvență cADN (SEQ ID NR:12) și secvența de aminoacizi dedusă (SEQ ID 11 NR:13) a RetL2 umană, așa cum s-a găsit în clona DSW240. Cadrul de citire al proteinei este conținut în nucleotidele 25 la 1416. 13

- fig. 8, comparație a secvenței de aminoacizi a RetL2 (linia superioară a secvenței) cu cea a secvenței RetL1 (linia inferioară a secvenței). Liniile verticale dintre aminoacizi arată 15 identitatea la o poziție, în timp ce un punct indică un spațiu la acea poziție.

- fig. 9, secvență ADNc (SEQ ID NR:16) și secvența de aminoacizi dedusă (SEQ ID 17 NR:17) a RetL3 murină.

- fig. 10, secvență ADNc (SEQ ID NR:20) și secvența de aminoacizi dedusă (SEQ ID 19 NR:21) RetL3 umană.

Numerele de identificare ale secvențelor21

Secvențele nucleotidice și de aminoacizi, la care s-a făcut referire în descriere, au primit următoarele numere de idenficare ale secvențelor:23

SEQ ID NR:1 - ADNc retL1 de la șobolan

SEQ ID NR:2 - aa RetL1 de la șobolan25

SEQ ID NR:3 - oligomer kid-13

SEQ ID NR:4 - oligomer kid-1427

SEQ ID NR:5 - oligomer kid-15

SEQ ID NR:6 - ADNc ret extracelulară de la șobolan29

SEQ ID NR:7 - aa Ret extracelulară de la șobolan

SEQ ID NR:8 - ADNc retL1 parțial umană31

SEQ ID NR:9 - aa RetL1 parțial umană

SEQ ID NR:10 - ADNc retL1 umană33

SEQ ID NR:11 -aa RetL1 umană

SEQ ID NR:12 - ADNc retL2 umană35

SEQ ID NR:13 - aa RetL2 umană

SEQ ID NR:14 - ADNc retL3 parțial murină (EST AA50083)37

SEQ ID NR:15 - aa RetL3 parțial murină

SEQ ID NR.16 - ADNc retL3 murin39

SEQ ID NR:17 - aa RetL3 murină

SEQ ID NR:18 - ADNc retL3 parțial umană41

SEQ ID NR:19 - aa RetL3 parțial umană

SEQ ID NR:20 - ADNc retL3 umană43

SEQ ID NR:21 - aa retL3 umană

Așa cum s-a definit aici, termenul RetL înseamnă orice proteină, care interacțio- 45 nează specific cu receptorul proteinei Ret, și care, atunci când interacționează cu Ret declanșează dimerizarea Ret și/sau autofosforilarea domeniului tirozin kinază al Ret. Sec- 47 vențele ADN care codifică pentru RetL și pentru Ret sunt denumite RetL și, respectiv ret.

RO 120343 Β1

Un ligand poate fi solubil sau poate fi prezent ca o moleculă legată la membrană pe aceiași sau pe o celulă diferită la fel ca molecula Ret pentru care este declanșată autofosforilarea. în anumite utilizări sau interacțiuni cu Ret, ligandul poate necesita molecule pentru declanșarea autofosforilarii. Liganzii ei includ co-receptori sau cofactori auxiliari ai ligandului. Liganzii invenției includ în plus mAb-uri anti-Ret care acționează ca antagoniști Ret, declanșând dimerizarea și autofosforilarea. De asemenea, ligandul poate fi modificat în diferite moduri, cum ar fi, încorporat ca o porțiune a unei proteine de fuziune, cu o toxină sau radionuclid.

Prin alinierea secvențelor se înțelege poziționarea unei secvențe, fie nucleotidică, aminoacidă, cu cea a alteia, pentru a permite o comparație a porțiunilor relevante ale secvenței una cu cealaltă. Un exemplu al unei metode a acestei proceduri este dat în Needleman et al. J. Mol. Biol. 48:443-453,1970. Metoda poate fi implementată convenabil prin programe de computer, cum ar fi programul Align (DNAstar, Inc.). Așa cum se va înțelege de către specialiștii în domeniu, secvențe omoloage sau funcțional echivalente includ aranjamente echivalente funcțional ale resturilor cisteină în scheletul cisteinei conservate, dar nu deteriorează relația lor în structura pliată a proteinei. Prin urmare, golurile interne și inserțiile de aminoacizi din secvența candidat sunt ignorate pentru scopurile calculării nivelului de omologie al secvenței de aminoacizi sau identității dintre secvențele candidat și secvențele de referință. O caracteristică utilizată frecvent în stabilirea omologiei proteinelor este similaritatea și localizarea resturilor cisteină dintre o proteină și alta.

Prin donare se înțelege folosirea tehnicilor de recombinare in vitro pentru inserarea unei gene anume sau altă secvență ADN într-o moleculă vector. în scopul donării cu succes a unei gene dorite, este necesar să se folosească metode pentru generarea fragmentelor ADN, pentru legarea fragmentelor la molecule vector, pentru introducerea moleculei ADN compozite într-o celulă gazdă în care ea se poate replica și pentru selectarea clonei care are gena vizată dintre celulele gazdă primitoare.

Prin ADNc se înțelege ADN complementar sau copie ADN produsă de la o matriță ARN prin acțiunea ADN polimerazei dependente de ARN transcriptază inversă). Astfel, o clonă ADNc înseamnă o secvență ADN duplex complementară la o moleculă ARN de interes, conținută într-un vector de donare.

Prin bibliotecă ADNc se înțelege o colecție de molecule ADN recombinante conținând inserte ADNc care împreună cuprind o reprezentare a moleculelor ARNm prezente într-un țesut sau organism întreg, depinzând de sursa de matrițe ARNm. O asemenea bibliotecă ADNc se poate prepara prin metode cunoscute celor cu pregătire în domeniu, și este descris, de exemplu, în Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. în general, întâi se izolează ARN de la celulele unui organism de la al cărui genom se dorește să se doneze o genă anume. Preferate pentru scopurile prezentei invenții sunt liniile de celule de la mamifere și în special cele umane. Alternativ, ARN se poate izola de la o celulă tumorală și de preferință de la o tumoare umană. Astfel, se poate prepara o bibliotecă de la, de exemplu, o tumoare adrenală umană, dar se poate folosi orice tumoare umană.

Așa cum s-a folosit aici, termenul polimorfism ADN” se referă la condiția în care 2 sau mai multe secvențe nucleotidice diferite pot să existe la un sit particular în ADN.

Vector de expresie include vectori care sunt capabili să exprime secvențe ADN conținute aici, adică, secvențele de codificare sunt legate operabil la alte secvențe capabile să efectueze expresia lor. Este implicit, deși nu întotdeauna afirmat explicit, că acești vectori de expresie trebuie să fie replicabili în organismele gazdă fie ca epizomi, fie ca o parte integrată a ADN-ului cromozomal. Un element util, dar nu neapărat necesar, al unui vector de expresie eficient este o secvență care codifică un marker, care este o secvență care

RO 120343 Β1 codifică o proteină care rezultă într-o proprietate fenotipică (de exemplu, rezistență la 1 tetraciclină) a celulelor care conțin proteina care permite ca acele celule să fie identificate cu ușurință. în rezumat, vector de expresie este o definiție dată funcțional și orice secvență 3

ADN care este capabilă să efectueze expresia ADN de codificare conținut specific este inclusă în acest termen, așa cum se aplică pentru secvența specificată. Astfel de vectori sunt 5 frecvent sub formă de plasmide, așa că plasmid și vector de expresie sunt folosiți adesea interschimbabil. Cu toate acestea, invenția intenționează să includă și alte astfel de forme 7 ale vectorilor de expresie, inclusiv fag, care servește funcții echivalente și care pot, din timp în timp, să devină cunoscuți în domeniu. 9

Similar, un derivat funcțional” al unei gene al oricăreia dintre proteinele prezentei invenții se înțelege că include fragmente, variante și “analogi” ai genei, care pot fi 11 substanțial similari în secvența nucleotidică și care codifică o moleculă care posedă activitate similară. 13

Moleculă înrudită GDNF înseamnă orice moleculă care este cel puțin 40% omoloagă la fie GDNF, fie la neurturin și este capabilă să lege specific o RetL. 15

Termenul genă” înseamnă o secvență polinucleotidică care codifică o peptidă.

Prin omogenă se înțelege, când se referă la o peptidă sau secvență ADN, că 17 structura moleculară primară (adică, secvența de aminoacizi sau nucleotide) a substanțial tuturor moleculelor prezente în compoziția luată în considerare este identică. 19

Termenul oligonucleotidă, așa cum s-a folosit aici, referindu-se la sonde, fragmente oligomerice, care trebuie să fie detectate, controale oligomerice, oligomeri de blocare ne- 21 marcați și primeri pentru amplificare ai secvențelor, se definește ca o moleculă care cuprinde mai mult decât trei deoxiribonucleotide sau ribonucleotide. Mărimea sa exactă va depinde 23 de numeroși factori, care, în schimb, depind de funcția finală sau utilizarea oligonucleotidei.

Termenul sondă se referă la un ligand cu calități cunoscute capabil de legare 25 selectivă la un antiligand vizat. Așa cum s-a aplicat la acizi nucleici, termenul sondă se referă la o bandă a unui acid nucleic având o secvență de baze complementară la o bandă 27 țintă.

“Celule gazdă recombinante se referă la celule care s-au transformat cu vectori 29 construiți folosind tehnici ADN recombinant. Așa cum s-a definit aici, anticorpul sau modificarea acestuia produsă de o celulă gazdă recombinantă este, în virtutea acestei 31 transformări, mai degrabă decât astfel în cantități mai mici, sau mai comun, în cantități astfel mai mici decât detectabile, decât ar fi produse de gazda netransformată. 33

Așa cum s-a folosit, aici, termenul endonucleaze de restricție și enzime de restricție se referă la enzime bacteriene care fiecare taie ADN cu banda dublă la sau lângă 35 o secvența nucleotidică specifică.

Așa cum s-a folosit aici, termenul polimorfismul lungimii fragmentului de restricție 37 (RFLP) se referă la diferențe dintre indivizi a unui fragment de restricție particular.

O moleculă este numită a fi substanțial similară la altă moleculă dacă secvența 39 aminoacizilor în ambele molecule este substanțial aceiași și dacă ambele molecule posedă o activitate biologică similară. Astfel, cu condiția că două molecule posedă o activitate 41 similară, ele sunt considerate variante așa cum acest termen este folosit aici chiar dacă una dintre molecule conține resturi aminoacide suplimentare care nu se găsesc în cealaltă, sau 43 dacă secvența de resturi de aminoacizi nu este identică. Așa cum s-a folosit aici, o moleculă este numită a fi un derivativ chimic al altei molecule când ea conține radicali chimici supli- 45 mentari care în mod normal nu sunt parte a moleculei. Astfel de radicali pot să îmbunătățească solubilitatea moleculei, absorpția, durata de înjumătățire biologică, etc. Radicalii pot 47 alternativ să scadă toxicitatea moleculei, să elimine sau să atenueze orice efect secundar

RO 120343 Β1 nedorit al moleculei, etc. Radicali capabili să medieze asemenea efecte sunt descriși, de exemplu, în Remington's Pharmaceutical Science, a 16-a ed„, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Prin vector se înțelege o moleculă ADN, derivată de la un plasmid sau bacteriofag, în care fragmentele de ADN pot fi inserate sau donate. Un vector va conține unul sau mai multe situri de restricție unice și poate fi capabil de replicare autonomă într-o gazdă definită sau organism vehicul astfel încât secvența donată este reproductibilă.

Prin substanțial pură se înțelege orice proteină a prezentei invenții, sau orice genă care codifică orice astfel de proteină, care este esențial lipsită de alte proteine sau respectiv gene, sau de alți contaminanți cu care ea poate fi găsită în mod normal în natură și astfel, există într-o formă care nu se întâlnește în natură.

Invenția include ADNc care codifică pentru o RetL, cum ar fi secvența ADNc reL1 de la șobolan, cADN retLI parțial umană, cADN retL1 umană de lungime întreagă, ADNc retL2 umană, ADNc retL3 murină sau ADNc retL3 umană. Suplimentar, compușii invenției includ secvențe care conțin secvențele de mai sus, sau sunt derivați ai acestor secvențe. De asemenea, invenția include vectori, lipozomi și alte vehicule purtător care cuprind una dintre aceste secvențe sau un derivat al uneia dintre aceste secvențe. Invenția include de asemenea, proteine transcrise sau translate de la ADNc retLI de la șobolan, cADN retLI parțial umană, ADNc retLI umană de lungime integrală, cADN retL2 umană, cADN retL3 murină sau ADNc retL3 umană, incluzând dar fără a fi limitat la RetLI de la șobolan, RetLI parțial umană, RetLI umană de lungime întreagă, RetL2 umană, RetL3 murină, sau RetL3 umană și derivații și variantele lor.

O realizare a invenției include variante solubile ale RetL. Variantelor solubile le lipsește cel puțin o porțiune a secțiunii intramembranare a RetL nativă. în unele exemple, variantelor solubile le lipsește legătura fosfatidilinozitol glican a RetL nativă. Variantele solubile includ proteine de fuziune care cuprind derivați ai RetL care au lipsă un motiv fosfatidilinozitol.

Variantele pot să difere de RetL întâlnită în mod natural în secvența de aminoacizi sau în moduri care nu implică secvența, sau ambele. Variante în secvența aminoacidă sunt produse când unul sau mai mulți aminoacizi întâlniți în mod natural în RetL sunt substituiți cu aminoacid natural diferit, un derivat aminoacid, sau un aminoacid care nu se întâlnește în mod nativ. Variante preferate în mod deosebit includ RetL întâlnită în mod natural, sau fragmente biologic active ale RetL care se întâlnesc în mod natural, ale căror secvențe diferă de secvența de tip sălbatic prin una sau mai multe substituții de aminoacizi conservative, care de obicei au influență minimă asupra structurii secundare și naturii hidrofobice a proteinei sau peptidei. De asemenea, variantele pot să aibă secvențe care diferă prin una sau mai multe substituții de aminoacizi neconservative care nu întrerup activitatea biologică a RetL. Substituții de aminoacizi tipice includ substituția unui aminoacid pentru altul cu caracteristici similare cum ar fi substituții în următoarele grupuri: valină, glicină; glicină, alanină; valină, izoleucină; acid aspartic, acid glutamic; asparagină, glutamină; serină, treonină; lizină, arginină; și fenilalanină, tirozină. Aminoacizii nepolari (hidrofobici) includ alanină, leucină, izoleucină, valină, pralină, fenilalanină, triptofan și metionină. Aminoacizii polari neutri includ glicină, serină, treonină, cisteină, tirozină, asparagină și glutamină. Aminoacizi încărcați pozitiv (bazici) includ arginină, lizină și histidină. Aminoacizi încărcați negativ (acid) includ acid aspartic și glutamic.

Alte substituții conservative pot fi luate din tabelul de mai jos și încă altele sunt descrise de către Dayhoff în Atlas of Protein Sequence and Structura (1988).

RO 120343 Β1

Tabelul 1 înlocuitori de aminoacizi conservativi

Pentru aminoacid	Cod	înlocuit cu oricare dintre
Alanină	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginină	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagină	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Acid aspartic	D	D-Asp,D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cisteină	C	D-Cys, S-Met-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamină	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Acid glutamic	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn,Gin, D-Gln
Glicină	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucină	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucină	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizină	K	D-Lys_z Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, DMet, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Metionină	M	D-Met, S-Met-Cys, Ile, D-Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenilalanină	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, DTrp, Trans 3,4 sau 5-fenilprolină, cis 3,4 sau 5fenilprolină
Prolină	P	D-Pro, acid L-l-tioazolidin-4-carboxilic, acid Dsau L-l-oxazolidin-4-carboxilic
Serină	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Treonină	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met)O, D-Met(0), Val, D-Val
Tirozină	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valină	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

RO 120343 Β1

Alte variante din invenție sunt cele cu modificări care cresc stabilitatea peptidei. Astfel de variante pot să conțină, de exemplu, una sau mai multe legături nepeptidice (care înlocuiesc legături peptidice) în secvența peptidei. De asemenea includ: variante care includ resturi altele decât ale L-aminoacicizilor întâlniți în mod natural, cum ar fi D-aminoacizi sau aminoacizi care nu se întâlnesc în mod natural sau sintetici cum ar fi aminoacizi beta sau gamma și variante ciclice. încorporarea D- în locul L-aminoacizilor în polipeptidă poate să crească rezistența sa la proteaze. Vezi, de exemplu, brevetul US 5.219.990.

Peptidele acestei invenții pot fi modificate prin diverse schimbări cum ar fi inserții, deleții și substituții, fie conservative, fie neconservative unde asemenea schimbări pot asigura anumite avantaje în utilizarea lor. Variante de îmbinare sunt incluse în mod specific în invenție.

Suplimentar la polipeptidele substanțial de lungime întreagă, prezenta invenție asigură fragmente biologic active ale polipeptidelor. O polipeptidă RetL sau fragment este biologic activă dacă ea prezintă o activitate biologică a RetL întâlnită în mod natural. Astfel de activități includ capacitatea de a lega porțiunea extracelulară a Ret, cu o afinitate care este cel puțin 50% din, și de preferință cel puțin egală cu afinitatea RetL întâlnită în mod natural pentru porțiunea extracelulară a Ret. Altă activitate biologică este capacitatea de a se lega la un anticorp care este dirijat la un epitop care este prezent pe RetL întâlnită în mod natural.

în alte realizări, variante cu substituții de aminoacizi care sunt mai puțin conservative pot avea ca rezultat de asemenea derivații doriți, de exemplu, prin producerea de schimbări în încărcare, conformație și alte proprietăți biologice. Astfel de substituții vor include de exemplu, substituția restului hidrofilic pentru un rest hidrofob, substituția unei cisteine sau praline pentru alt rest, substituția unui rest care are o catenă laterală mai mică pentru un rest având o catenă laterală voluminoasă sau substituția unui rest având o încărcare pozitivă netă pentru un rest având o încărcare negativă netă. Când rezultatul unei substituții date nu poate fi prezis cu certitudine, derivații pot fi analizați cu ușurință conform metodelor descrise aici pentru determinarea prezenței sau caracteristicilor dorite.

în general, substituțiile care pot fi de așteptat să inducă schimbări în proprietățile funcționale ale polipeptidelor Ret sunt cele în care: (I) un rest hidrofilic, de exemplu, serină sau treonină, este substituit printr-un rest hidrofob, de exemplu, leucină, izoleucină, fenilalanină, sau alanină; (ii) un rest cisteină este substituit pentru (sau prin) orice alt rest; (iii) un rest care are o catenă laterală electropozitivă, de exemplu, lizină, arginină sau histidină, este substituit pentru (sau prin) un rest care are o încărcare electronegativa, de exemplu, acid glutamic sau acid aspartic; sau (iv) un rest având o catenă laterală voluminoasă, de exemplu, fenilalanină, este substituit pentru (sau prin) unul care nu are o astfel de catenă laterală, de exemplu, glicină.

Variante din cuprinsul invenției includ proteine și peptide cu secvențe aminoacide având cel puțin 60% omologie cu RetL1 (SEQ ID NR:2), RetL1 parțial umană (SEQ ID NR:9), RetL1 umană de lungime întreagă (SEQ ID NR:11), RetL2 umană (SEQ ID NR:13), RetL3 murină (SEQ ID NR:17), RetL3 parțial umană (SEQ ID NR:19) sau RetL3 umană (SEQ ID NR:21). Mai preferat omologia secvenței este de cel puțin 80%, cel puțin 90%, sau cel puțin 95%. Pentru scopurile determinării omologiei lungimea secvențelor de comparat va fi în general de cel puțin 8 resturi aminoacide, de obicei cel puțin 20 aminoacizi. Variante ale compușilor invenției includ de asemenea orice proteină care 1) are o secvența de aminoacizi care este cel puțin 40% omoloagă la o proteină RetL a invenției, și de asemenea care 2) după ce s-a plasat într-o aliniere optimă cu secvența RetL (cum s-a ilustrat pentru RetL1 și RetL2 din Figura 8), are cel puțin 80% din resturile sale cisteină aliniate cu cisteinele din proteina RetL a invenției.

RO 120343 Β1

Așa cum este posibil să se înlocuiască substituenți de blocare, este de asemenea 1 posibil să se substituie grupările funcționale care sunt legate la blocare cu grupări caracterizate prin trăsături similare. Astfel de modificări nu modifică secvența primară. 3

Acestea vor fi inițial conservative, adică, gruparea de înlocuire va avea aproximativ aceiași mărime, formă, hidrofobicitate și încărcare ca gruparea originală. Modificări care nu sunt la 5 secvență pot să includă, de exemplu, derivatizarea chimică în vivo sau in vitro a porțiunilor RetL întâlnită în mod natural, precum și schimbări în acetilare, metilare, fosforilare, 7 carboxilare sau glicozilare.

De asemenea incluși în invenție sunt agenți care se leagă specific la o proteină a 9 invenției, sau o un fragment al unei asemenea proteine. Acești agenți includ proteine de fuziune lg și anticorpi (incluzând anticorpi cu o singură catenă, catenă dublă, fragmente Fab 11 și altele, indiferent dacă sunt nativi, umanizați, primatizați sau himerici). Descrieri suplimentare ale acestor categorii de agenți sunt în cerere PCT 95/16709, a cărei descriere 13 este încorporată aici prin referire.

în continuare se dau câteva exemple de realizare a invenției: 15

Descriere generală asupra strategiei

Strategia generală folosită pentru a clona RetL1 este prezentată în Figurile 4A și 4B. 17

Strategia noastră s-a bazat pe premiza că cel puțin o RetL este exprimată pe mezenchimul metanefric al rinichiului aflat în dezvoltare ca o proteină a membranei (cu toate că este 19 posibil ca ligandul să fie exprimat într-o formă solubilă; Figura 4A). RetL interacționează cu receptorul Ret pe celula mugurelui ureteric, activând domeniul citoplasmic al tirozin kinazei 21 sale și trimițând un semnal la nucleu, care în schimb activează genele implicate în creșterea și ramificarea mugurelui ureteric. Prin urmare, proteinele care conțin domeniul extracelular 23 al Ret fuzionate fie la porțiunea F_c a imunoglobulinei umane G1 (lgG1), fie la fosfatază alcalină (AP) se pot utiliza ca parte a unei strategii pentru donarea RetL așa cum este 25 prezentat în Figura 4B. Proteinele de fuziune, bibliotecile de expresie și alți reactivi folosiți în donare sunt descrise mai jos. 27

Mai întâi s-a izolat ADNc pentru RetL1 de la șobolan și apoi s-a folosit ca sondă pentru izolarea unui ADNc pentru RetL1 umană. în continuare sunt izolate ADNc-uri pentru 29 RetL2 și RetL3.

Generarea reactivilor necesari pentru expresia donării directe a liganzilor Ret 31

1. Izolarea ADNc-ului care codifică domeniul extracelular al Ret de la șobolan.

Pentru identificarea RetL1 sunt generate proteine de fuziune constând din domeniul 33 extracelular al Ret fie de la șobolan, fie Ret umană fuzionată la o proteină, într-un exemplu porțiunea F_ca lgG1 umană și în alt exemplu, fosfatază alcalină. Ambii parteneri de fuziune 35 pot fi analizați cu ușurință pentru detectarea celulelor care exprimă ligandul așa cum s-a ilustrat în Figura 4B. 37

Deoarece un ADNc care codifică pentru Ret de la șobolan nu a fost niciodată descris, noi am izolat un ADNc care codifică domeniul extracelular al receptorului Ret de la șobolan 39 folosind reacția de polimerizare în lanț prin intermediul unui revers - transcriptaze sau metoda de revers - transcriere (RT - PCR). Noi am comparat cele două secvențe nucleoti- 41 dice pentru ret umană (Genbank cu numerele de acces M57464 și X15262) și murină (Genbank număr de acces X67812) și am desemnat primeri oligonucleotidici de la regiuni 43 de identitate ridicată între cele două secvențe. Un oligomer sens numit kid-013 (SEQ ID NR:3; conține nucleotidele 150-169 ale secvenței Genbank X15262) este ales de la capătul 45

5' al secvenței ADNc ret umană care se suprapune la codonul de inițiere ATG. El include nucleotide la capătul său 5' care codifică un sit de restricție Not 1 pentru scopurile donării. 47

RO 120343 Β1

Doi oligomeri antisens numiți kid-014 (SEQ ID NR:4; conțin complementul nucleotidelor 1819-1839 al secvenței GenBank M57464) și kid-015 (SEQ ID NR:5; conține complementul nucleotidelor 1894-1914 al secvenței GenbankX67812) sunt aleși respectiv, de la secvențele ADNc umane și murine imediat 5' față de secvențele care codifică domeniile transmembranare. Oligomerii și kid-015 conțin nucleotide la capetele lor 5' care.că un sit de restricție Sall pentru scopurile donării.

Se izolează ARN total din rinichi embrionar de șobolan in vârstă de 14 zile și ARNm se purifică folosind cromatografia oligo-dT. Se transformă mARN la ADNc folosind transcriptaza inversă AMV și ADNc-ul se transformă la ADNc cu bandă dublă și se amplifică folosind polimerază Taq într-o reacție de polimerizare în lanț standard cu oligomeri kid-013 și kid-105. Sinteza unui fragment POR de 1942 bp este confirmată prin migrarea unui alicot al reacției PCR pe un gel de agaroză 1%. Restul fragmentului PCR este digerat cu Not1 și Sa11 și donat în pSAB132 digerat anterior cu Not1 și Sa11. Plasmida rezultată este numită pJCO11. întregul insertal plasmidului pJCOII conținut între siturile Not1 și Sa11 este secvențiatși este prezentat ca domeniul extracelular al ADNc ret de la șobolan, SEQ ID NR:6. O translație a acestei secvențe arată secvența peptidei pentru Ret extracelulară de la șobolan. Deoarece oligomerii pentru PCR s-au ales de la secvențele Ret umane și de șoarece, este posibil ca secvența nucleotidică prezentată ca ADNc Ret extracelulară de la șobolan și secvența peptidică prezentată drept Ret extracelulară de șobolan, să poată diferi de secvențele nucleotidice naturale Ret de la șobolan și a peptidei Ret în regiunile secvențelor kid-013 și kid-015. în continuare, sunt izolate clone ADNc Ret de la o bibliotecă ADNc de rinichi embrionar de șobolan de 18 zile și sunt observate câteva schimbări nucleotidice în regiunile primer care rezultă în două schimbări de aminoacizi. O schimbare este în secvența semnal (arginina la poziția 5 pentru treonină) și o schimbare este lângă capătul domeniului extracelular (acid glutamic la poziția 633 pentru alanină). Ambele schimbări nu afectează legarea iigandului.

2. Proteine de fuziune Ret/lgG

Sunt generate proteine de fuziune care constau din domeniile extracelulare ale receptorilor Ret de la șobolan (resturi aa #1-637) și umană (resturi aa #1-636) fuzionate la porțiunea Fca lgG1 umană.

Construcția plasmidelor utilizate pentru exprimarea proteinei de fuziune Ret/lgG este arătată schematic în Figura 5. în scopul de a construi o genă care codifică proteina de fuziune Ret/lgG, s-a digerat pJCO11 (descris mai sus) care conține domeniul extracelular Ret de la șobolan cu Sa11 și s-a ligat la un fragment Sa11 de 700 bp de la plasmida 2-4, pentru a crea plasmida pJC012. Acest fragment Sa11 conține partea domeniului Fc al IgG 1 umane derivată inițial de la plasmid pSAB144. Plasmidul 2.4 s-a creat anterior prin intermediul unei ligări în trei moduri: un fragment Not1-Sa11 generat prin PCR care conține domeniul extracelular al receptorului TGF-beta de tip II de la iepure; un fragment Sa11-Not1 de 693 bp de la SAB144 conținând partea domeniului Fc a lgG1 uman; și pSAB132 digerat Not1. Așa cum s-a arătat în Figura 5, un fragment care conține domeniul Fc poate fi eliberat de la plasmidul 2-4 ca un fragment Sa11 de 700 bp. Se transfectează pJC012 în celule COS și proteina de fuziune Ret/lgG este purificată din mediu 48 h mai târziu folosind cromatografia Protein-A-Sepharose. în scopul de a obține o linie celulară care produce proteina Ret/lgG de la șobolan fragmentul Not1 de 2612 bp de la pJC012 conținând în întregime proteina de fuziune Ret/lgG este izolată și donată în situl Not1 al vectorului de expresie pMDR901. Plasmida care rezultă este numită pJC022. Plasmida pJC022 este transfectată în celule COS pentru generarea liniilor stabile de celule. Linia cea mai bună producătoare este adaptată la suspensie. Randamentele tipice pentru linia CHO Ret/lgG de la șobolan sunt 75 mg/l.

RO 120343 Β1

Construcția plasmidelor folosite pentru exprimarea proteinei de fuziune Ret/lgG 1 umană este prezentată schematic în Figura 6. în scopul de a construi o genă care codifică proteina de fuziune Ret/lgG umană, noi am obținut un plasmid conținând un ADNc care 3 codifică receptorul Ret uman de la Dr. M. Takahashi (Department of Pathology, Nagoya Universty. Nagoya, Japonia). Se generează un fragment PCR de la acest plasmid folosind 5 oligomerii kid-013 și kid-014. Fragmentul PCR se tratează cu fragment Klenow urmat de digestie cu Not1 pentru a produce un fragment PCR cu un capăt Not1 și un capăt teșit. Acest 7 fragment se donează în vectorul pGEMIIzf (+) digerat anterior cu EcoR1, tratat cu fragment Klenow și digerat cu Not1, în scopul generării unui capăt adeziv Not1 și un capăt drept. 9

Plasmida rezultată este numită pJC013. Fragmentul Not1-Sa11 de la pJC013 este izolat după o digestie completă cu Not1 și o digestie parțială cu Sa11 și s-a ligat la fragmentul 11 Sa11-Not1 de 693 bp de la pSAB144 care conține domeniul Fc al lgG1 umană și vectorul de expresie pSAB132 digerat cu Not1. Plasmida rezultată este numită pJC015. Insertul în 13 plasmidul pJC013 este secvențiat și s-a dovedit a conține o singură diferență nucleotidica care schimbă un aminoacid în domeniul extracelular al Ret umană (secvența Genbank M57 15

64 are o C la poziția 812, în timp pJC013 are o T la poziția corespondentă; aceasta are ca urmare o schimbare în aminoacizi de la alanină la valină la poziția 294 a secvenței proteinei 17 Ret umane). Această nucleotidă corectată înapoi la restul C specificat de secvența Genbank M57464 prin mutageneza specifică de situs a plasmidului pJC013, producând plasmidul 19 pJC023. Un fragment BstE2 de 585 bp de la pJC023 conținând secvența nucleotidica reparată este izolat și donat în plasmidul pJC015 din care s-a îndepărtat fragmentul BstE2 21 de 585 bp. Noul plasmid este numit pJC024. Fragmentul Not1 de 2609 bp de la pJC024 conținând întreaga proteină de fuziune Ret/lgG se izolează și donează în situl Not1 al 23 vectorului de expresie pMDR901. Plasmidul care rezultă este numit pJC025. Plasmidul pJC025 este transfectat în celule CHO pentru generarea liniilor celulare stabile. Linia de 25 celule cea mai bună producătoare este adaptată la suspensie. Randamente tipice pentru linia CHO Ret/lgG umană sunt 6 mg/ml. 27

Detalii suplimentare asupra producerii vectorilor folosiți în metodele invenției sunt descrise în cererile PCT 94/01456 și 92/02050, ale căror descrieri sunt încorporate aici prin 29 referire.

3. Bioactivitatea proteinelor de fuziune Ret/lgG 31

Pentru a determina dacă proteinele de fuziune Ret/lgG care au fost produse sunt bioactive, și prin urmare vor fi reactivi de căutare buni pentru donarea unei RetL, noi am 33 realizat câteva analize de cultură de organ pentru bioactivitate. Analiza de cultură de organ constă din creșterea rinichiului embrionar de șobolan de 13-14 zile în cultură de organ 3-5 35 zile în prezența proteinei de fuziune Ret/lg la o concentrație de 50 pg/ml. De asemenea, rinichii sunt cultivați în prezență de LFA-3TIP/lgG sau tampon vehicul. După perioada de 37 cultură, o parte din rinichi sunt colorați cu lectină fluorescentă Dolichos Biflorus Agglutinin (lectină DB) care colorează țesuturile duetului colector, care sunt celule epiteliale derivate 39 de la mugurele ureteric. Aceste celule DB pozitive marchează celule Ret pozitive, deoarece Ret este exprimată în mugurele ureteric și derivații săi epiteliali. Aceasta asigură o cercetare 41 grosieră a proteinei de fuziune Ret/lgG asupra creșterii și dezvoltării rinichiului embrionar.

Există o diferență dară în morfologia duetului colector și creșterea dintre rinichi care s-au 43 cultivat cu LFA-3TIP și cei cultivați cu proteina de fuziune Ret/lgG. Rinichi tratați Ret/lgG au ducturile de colectare care prezintă semnificativ mai puțină ramificare și în total sunt de 45 obicei mai mici.

S-au preparat secțiuni în parafină de la alți rinichi pentru examinare histologică. 47 Rinichi embrionari sunt tratați cu tampon de control sau cu Ret/lgG, apoi s-au colorat cu

RO 120343 Β1 hematoxilină și eozină. Rinichiul embrionar tratat Ret/lg prezintă ramificare mai mică a duetelor colectoare decât rinichi embrionari tratați cu tampon de control. Suplimentar, rinichi tratați Ret/lgG au câțiva tubuli. De asemenea, noi am observat acest efect cu proteina de fuziune Ret/lgG umană. Aceste observații sunt consecvente cu proteinele de fuziune care blochează semnalul inductiv dintre mezenchim și mugurele ureteric. Prin urmare noi am ajuns la concluzia că proteina de fuziune este un reactiv bun pentru donarea unei RetL.

4. Proteină de fuziune Ret/fosfatază alcalină

Proteinele de fuziune receptor/fosfatază alcalină (AP) s-au folosit cu succes pentru identificarea și donarea liganzilor pentru c-kit (Ce11 63:185,1990), liganzilor pentru familia eph a receptorilor orphan (Ce11 79:157,1994), și recent pentru donarea unui receptor pentru leptină, produsul genei ob (Ce11 83:1263, 1995). Sunt construite plasmide care codifică proteina de fuziune Ret/AP de la șobolan și Ret/AP și proteina Ret/AP de la șobolan este produsă în celule COS7 în unități pentru creșterea celulelor. în continuare, este generată o linie de celule NIH3T3 care exprimă în medie 10 mg/ml proteină de fuziune. Analiza SDSPAGE a proteinei Ret/AP de la șobolan arată că mărimea ei este consecventă cu greutatea moleculară prezisă și analiza de filtrare în gel arată că ea este produsă ca un dimer. Purificarea parțială este obținută prin cromatografie de afinitate pe o coloană anti-AP.

5. Anticorpi anti-Ret

Se generează un anticorp policlonal de iepure împotriva proteinei de fuziune Ret/lgG de la șobolan. Anticorpul lucrează pe pete Western, analiza FACS a liniilor de celule Ret și imunohistochimia secțiunilor rinichiului embrionar.

Se generează un tablou al anticorpilor monoclonali anti-Ret de la șobolan. Proteina de fuziune Ret/lgG de la șobolan, cuplată la Proteină A Sepharose, se folosește pentru imunizarea hamsterilor Armenieni. Sunt obținute 316 clone după fuziune și sunt căutate pentru capacitatea de a lega proteine de fuziune Ret de la șobolan și/sau IgG umană într-un test ELISA. S-au găsit 11 clone care produc anticorpi care se leagă numai la Ret/lgG de la șobolan (și/sau Ret/AP), dar nu IgG umană. Reactivitatea încrucișată față de Ret umană este analizată prin FACS; 4 clone produc anticorpi care se leagă la linia de celule umane Ret pozitive, THP-1. Tabelul care urmează rezumă proprietățile de Ret a 12 anticorpi monoclonali.

Clonă	ELISA Ret/lgG de șobolan	FACS THP-1 umană
AA.FF9.5	4-	-
AA.HE3.7	+	+
AF.E9.5	+	-
BA.B1.16	4-	-
BB.B6	+	-
AA.GE7.3	4-	-
CD.F11.2	4-	-
AH.E3.11	+	4-
CD.G4.2	4-	4-
AG.E7.9	4-	-
BD.G6	4-	4-
BH.G8	-	-

RO 120343 Β1

6. Biblioteci de expresie ADNc 1

Noi am preparat biblioteci ADNc de la rinichi embrionar de șobolan, una în vectorul CDM8 care utilizează originea SV40 pentru amplificare și una într-un vector Vitrogen 3 modificat, pCEP4, care utilizează originea EBV pentru amplificare. Acest vector modificat, CH269, are secvența genei EBNA-1 îndepărtată. Proteina EBNA-1 interacționează cu 5 originea EBV, dar gena nu este necesară pe vector când sunt folosite celule care exprimă stabil proteina EBNA. Biblioteca în vectorul CDM8 conține 1,5 x 10⁶ clone cu un insert de 7 mărime medie de 1,18 kb, deși biblioteca în vectorul CH269 conține aproximativ 1 x 10® clone cu un insert de mărime medie de 1,5 kb. 9

Clonarea cu expresie a Ret ligandului RetL1.

A. Clonarea ligandului Ret de la șobolan, RetL1 11

1. încercări inițiale de donare a expresiei ligandului Ret, RetL1

S-a ales un număr de metode de expresie directă pentru clonarea RetL1. Toate 13 aceste metode sunt bazate pe conceptul ilustrat în Figura 4B. Sunt introduse ADNc-uri de la biblioteca ADNc în celule mamifere; celulele, care primesc RetL1 pot fi identificate folosind 15 proteine de fuziune Ret. Deși cele 3 abordări descrise mai jos au fost fără succes, s-au dobândit cunoștințe și experiență, care s-au folosit într-o abordare ulterioară care s-a soldat 17 cu succes.

a. Metoda panoramării cu ReiZ/gGProteina de fuziune Ret/lgG se folosește într-o 19 încercare de a izola RetL1 prin clonarea directă a expresiei folosind o metodă de panoramare (Aruffoc and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:8753-8757 (1987)). 0 bibliotecă ADNc 21 din rinichi embrionar de 18 zile în CDM8 este folosită în efortul de panoramare. Depozite de ADNc-uri din această bibliotecă (5.000 - 10.000 ADNc-uri per depozit) sunt introduse în 23 celule COS folosind metoda DEAE-dextran. După 48 h, celulele sunt îndepărtate de la plăci cu EDTA, incubate cu proteina de fuziune și în continuare panoramate pe plăci acoperite cu 25 anticorp anti-lgG1 umană. ADN-ul se recuperează de la celule care au aderat, se transformă înapoi în E. coliși în continuare se izolează pentru a doua rundă de panoramare. Noi nu am 27 putut să observăm vreo celulă care se leagă după a treia rundă de panoramare și s-au obținut foarte puține clone după transformarea HirtADN înapoi în E. coli. Un ADNc VCAM, 29 folosit în legătură cu un anticorp monoclonal anti-VCAM drept control pozitiv, diluat la un raport de 1:100 a putut încă să fie detectat, arătând că mărimile depozitului sunt probabil 31 prea mari. Analiza unora dintre clone care s-au obținut după a doua repriză de panoramare, arată că, clonele sunt supuse la rearanjament și deleție. 33

b. Metoda FACS preparativă cu Ret/lgG

Sunt introduse 80.000 clone ADNc de la biblioteca de rinichi embrionar de șobolan 35 de 18 zile (vector CDM8) în celule COS7 și supuse la FACS preparativă folosind proteina Ret/lgG urmată de un anticorp secundar terminat cu fluor. Maximele de 0,5% și 0,9% de 37 celule fluorescente sunt colectate și plasmidul ADN este recuperat prin liză Hirt. ADN-ul se electroporează înapoi în E. coli-, sunt obținute 228 clone pentru depozitul 0,5% și 752 clone 39 pentru depozitul 0,9%. ADN-ul este recuperat de la clonele bacteriene și se realizează o a doua rundă de FACS preparativă. Plasmidele recuperate de la clonele bacteriene la sfârșitul 41 celei de a doua runde s-au analizat și s-au dovedit a conține deleții și rearanjamente mari.

c. Metoda de detectare colorimetrică cu Ret/AP 43

Celule COS sunt transfectate cu 400 depozite ale clonelor ADNc (1000 clone per depozit) de la biblioteca ADNc (vector CDM8) de rinichi embrionar de șobolan în ziua 18 și 45 s-au colorat cu proteină Ret/AP și un substrat colorimetric pentru fosfatază alcalină. Celulele transfectate sunt inspectate sub un microscop pentru semnale pozitive într-un experiment, 47 s-au reanalizat 5 potențiali pozitivi, dar toți au fost negativi.

RO 120343 Β1

Drept control pentru proteina Ret/AP, se produce o proteină VCAM/AP prin fuzionarea primelor 2 domenii ale VCAM la N-terminal placentar AP. (VCAM se leagă la integrina VLA4, care este compusă din 2 catene alfa-4 și beta-1). Transfecțiile tranzitorii ale celulelor COS produc suficientă proteină VCAM/AP pentru experimente de control. Proteina VCAM/AP este comparată la VCAM/lgG cuplată direct la AP și la VCAM/lgG plus un anticorp secundar cuplat la AP, în scopul de a cerceta capacitatea lor de a detecta VLA4 pe celule COS transfectate cu ADNc al catenei alfa-4 (celulele COS exprimă deja catena beta-1). Rezultatele arată că deși proteina VCAM/AP ar putea detecta VLA4 pe celule transfectate, cea mai bună detecție este permisă de către proteina VCAM/lgG în combinație cu un anticorp secundar cuplat AP.

d. Concluzii metodologice

Au apărut 3 concluzii principale din aceste eforturi inițiale de donare:

1) Metode care necesită ca plasmidul ADN să fie recuperat pentru runde ulterioare (adică, panoramare și FACS preparativă) nu sunt corespunzătoare când abundența de ADNc țintă este redusă, deoarece datorită rearanjamentelor și delețiilor care au loc în timpul acestor runde ulterioare. Pe baza expresiei reduse a Ret, există un motiv bun de a suspecta că expresia RetL1 este de asemenea scăzută. Aboradrea preferată este de a folosi o metodăde detecție care permite să fie identificat un depozit pozitiv.Depozitul original poate fi apoi descompus, fără a fi nevoie să se recupereze ADN exprimat tranzitoriu de la celule transfectate.

2) Proteina Ret/lgG când s-a cuplat la un reactiv secundar a permis o capacitate de detectarea mai bună decât proteina Ret/AP.

3) Experimentele de control cu o proteină de control VCAM/lgG (și un anticorp secundar cuplat AP) și ADNc alfa-4 integrină (diluat în vector CDM8 și transfectat în celule COS) arată capacitatea noastră de detecție chiar în jur de 1 într-o mie (adică mărimea depozitului nu poate depăși 1000 clone).Pentru a atinge un nivel îmbunătățit de sensibilitate, noi am schimbat de la o origine bazată pe un vector SV40 (exprimat în celule COS) la o origine bazată pe un vector EBV (exprimat în linii de celule ENBA pozitive). Vectori bazați pe o origine EBV sunt menținuți ca epizomi și nu sunt la fel de toxici pentru celulă ca vectorii bazați pe o origine SV40 după amplificare. Dovada cea mai demnă de luat în considerare este aceea că genele pot fi exprimate la nivele mai ridicate în acești vectori și că ADNc-uri pot fi diluate mult în continuare (adică, până la 1 la 80.000) și pot fi încă detectate.

2. Căutare depozitelor de la biblioteca ADNc bazată pe origine EBV

Noi am căutat depozitele clonelor din biblioteca ADNc din rinichi embrionar de șobolan în vârstă de 18 zile (vector CH269 cu originea EBV) cu proteina de fuziune Ret/lgG de la șobolan. într-un experiment, s-au generat 256 depozite, fiecare conținând 5000 clone din bibliotecă. Pe scurt, un alicot al bibliotecii ADNc este titrat, sunt întinse 5000 de celule (de 256 ori) și sunt lăsate să crească peste noapte. Coloniile sunt raclate în mediu: o parte a culturii se folosește pentru a genera un stoc glicerol pentru depozit (păstrat la -70°C) și o parte este folosită pentru prepararea unui plasmid. ADN-uri de la cele 256 depozite sunt transfectate individual în celule 293/EBNA (8 x 10⁵pe o placă de 60 mM) folosind metoda lipofecției. După 48 h, celulele sunt spălate de 2 ori cu tampon HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1 % NaN₃, 20 mM HEPES (pH 7,0)) și incubate cu 20 pg/ml Ret/lgG în Tris-tampon salin plus 1 mM MgCI₂ și CaCI₂ timp de 60... 90 min la temperatura camerei. După această incubare, celulele sunt spălate de 4 ori cu tampon HBHA și apoi s-au fixat 60% acetonă/3% formaldehidă/20 mM HEPES (pH 7,0) timp de 30 s. După aceste 2 spălări cu tampon HBS (150 mM NaCI, 20 mM HEPES (pH 7,0)), celulele sunt incubate cu un anticorp secundar cuplat AP (capră anti-Fc-gamma specific F(ab')₂ IG umană) (Jackson Immuno Research

RO 120343 Β1

Laboratories; catalog # 109-056-098; diluție 1:5000 în Tris tampon salin plus 1 mM MgCI₂ 1 și CaCI₂) timp de 60 min la temperatura camerei. Apoi celulele sunt spălate de 2 ori cu tampon HBS și tampon substrat AP (100 mM Tris-HCI (pH 9,5), 100 mM MgCI₂) conținând 3 2 X supresor Pierce Immuno Pure® Phosphatase (catalog #35002). Ultima spălare este lăsată timp de 15 min. Apoi sunt adăugate substratele AP NBT (0,33 mg/ml) și BCIP 5 (0,17 mg/ml) în tampon substrat AP conținând inhibitor AP Pierce și s-au incubat cu celulele

5... 20 min. Plăcile sunt spălate apoi de 2 ori cu apă. Plăcile sunt apoi inspectate sub un 7 microscop de disecție pentru prezența celulelor colorate purpuriu.

De la o analiză a 256 depozite, s-au identificat 17 depozite pozitive într-o căutare 9 primară. ADN de la fiecare depozit pozitiv este re-transfectat în celule 293/EBNA și apoi se repetă procedura de mai sus împreună cu câteva experimente de control suplimentare 11 pentru a confirma dacă colorația observată este specifică Ret/lgG. Dintre cei 17 pozitivi numai 10 depozite prezintă colorație cu proteina de fuziune Ret/lgG și nu cu altă proteină de 13 fuziune IgG.

3. Fragmentarea depozitului #230 15

Ca un exemplu, unul dintre depozitele pozitive descrise mai sus, desemnat #230, este fragmentat în subdepozite mai mici în scopul identificării ADNc-ului din depozit care 17 conferă legarea sa la proteina de fuziune. Din stocul glicerol 600 celule pentru depozitul #230 sunt întinse (de 10 ori) și crescute peste noapte. Coloniile de pe aceste plăci sunt 19 raclate în mediu: 1 zecime din cultură se folosește pentru generarea unui stoc gligerol și porțiunea rămasă se folosește pentru o preparare ADN. Zece sub depozite de 600 celule 21 sunt desemnate 230-1A la 230-5A și 230-1B la 230-5B. ADN-urile de la aceste subdepozite sunt transfectate în celule 293/EBNA și procedura descrisă mai sus pentru colorarea 23 proteinei de fuziune Ret/lgG se repetă. Un subdepozit #230-5A este pozitiv pentru colorare cu proteina Ret/lgG. 25

Depozitul #230-5A este fragmentat în continuare în scopul de a identifica ADNc-ul din acest depozit care conferă legarea sa la proteina de fuziune Ret/lgG. Celulele din stocul 27 glicerol al depozitului 230-5A sunt etalate și crescute peste noapte. Coloniile sunt culese în godeurile a 7 Bioblocks® cu 96-godeuri și crescute peste noapte. Din fiecare Bioblock 96- 29 godeuri, se obțin 4 depozite de câte 20 clone și 1 depozit de 16 clone. Astfel sunt generate 35 depozite de la 7 Bioblocks® desemnate 230-5A-71 la 230-5A-105. Sunt preparate de la 31 fiecare dintre aceste depozite și transfectate în celule 293/EBNA și re-analizate cu proteina de fuziune Ret/lgG așa cum s-a descris mai sus. Depozitul #230-5A-86 este pozitiv. 33

Depozitul #230-5A-86 este fragmentat prin întoarcere înapoi la Bioblock și identificând cele 20 clone care s-au amestecat pentru a obține acest depozit. Sunt obținute 35 ADN-uri de la toate cele 20 clone și transfectate individual în celule 293/EBNA și reanalizate pentru Ret/lgG cum s-a descris mai sus. Depozitul #230-5A-86-17 s-a găsit a fi pozitivă. 37

4. Caracterizarea clonei #230-5A-86-17

Clona #230-5A-86-17 (numită RetL 17 sau clona 17 și depozitată ca ATCC 98047) 39 este analizată în continuare prin secvențiere ADN. întreaga secvență nucleotidică a insertului acestei clone este SEQ ID NR:1 (ADNc retL1 de șobolan) și partea secvenței nucleotidice 41 este prezentată în Figura 1. în această secvență nucleotidică, noi am găsit un cadru de citire de codificare pentru o proteină de 468 aminoacizi (RetL1 de la șobolan). Proteina prezisă 43 are o secvență semnal cu un clivaj prezis după aminoacidul 24 (Von Heijne et al., Nuci. Acid Res. 14:14683 (1986)). C-terminal hidrofob arată că proteina poate fi legată la celulă prin 45 intermediul unei legături fosfatidilinozitol glican. Există 3 situri situri de glicozilare N-legate.

Aceste proprietăți sunt consecvente cu cele așteptate pentru un ligand pentru Ret. 47

RO 120343 Β1

Noi putem exprima forme solubile ale proteinei RetL1 prin scurtarea genei înaintea C-terminal hidrofob. De exemplu, aceasta ar putea fi făcută prin scurtare după Lysine 435 (RetL1 de la șobolan). Scurtarea în amonte de acest aminoacid ar putea de asemenea rezulta în expresia unei forme solubile a proteinei RetL1. Proteina solubilă RetL1 de la șobolan poate fi ea însăși exprimată sau ca o parte a unei fuziuni cu imunoglobulină umană, o terminație histidină sau un epitop mic recunoscut de către un anticorp.

8. Clonarea ligandului Ret uman RetL1

O bibliotecă ADNc de rinichi embrionar uman în vectorul gt10 s-a procurat de la Clontech (catalog #HL5004A). Un milion de unități formatoare de placă din stocul de fag sunt întinse pe 10 plăci Nune™. Plăci duplicat ridicate sunt obținute pe filtre Schleicherși Schuell Optitran™.

Se generează o sondă prin digestia plasmideii RetL1 de la cu enzima de restricție Pvull, urmată de izolarea în gel a unui fragment de 1,34 kb care corespunde la nucleotidele 242-1528 ale secvenței nucleotidice RetL de la șobolan (ADNc retL1 de la șobolan). Această sondă a regiunii de codificare este marcată P³² prin inițiere randomică (Feinberg și Vogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267, 1984). Filtrele sunt hibridizate peste noapte în 300 ml tampon de cercetare a plăcii (50 mM Tris pH 7,5, IM NaCI, 0,1% pirofosfat de sodiu, 0,2% PVP și 0,2% Ficoll) conținând 10% sulfat de dextran, 100 ug/ml tARN și 6.7 X IO⁷ CPM a sondei de șobolan la 55“C. Ele sunt spălate de două ori cu tampon de cercetare a plăcii și de 2 ori cu 2XSSC/1% SDS la 55°C și s-a expus la film la -70°C cu un ecran de intensificare.

Duplicatele pozitive sunt grupate de la plăcile principale în SM (100 mM NaCI, 10 mM SO₄,50 mM Tris pH 7,5) plus gelatină. Dintre acești pozitivi, 24 sunt purificați pe placă. ADN miniprep lambda din plăcile candidat purificate este digerat cu Notl, supuse la electroforeză pe gel de agaroză 1% și analizate prin Southern blot. Pata Southem se hibridizează cu sonda regiunii de hibridizare RetL1 de șobolan. Clona HRL20 are insertul cel mai lung (4,4 kb) care hibridizează intens la sonda de la șobolan. Secvența ADN (ADNc retL1 parțial umană; SEQ ID NR:8; Figura 2A) și secvența peptidică dedusă (RetL1 parțial umană; SEQ ID NR:9; Figura 2A) s-au obținut de la acesta clonă, confirmând că ea este omoloagă umană. Această clonă codifică majoritatea regiunii de codificare, inclusiv capătul 3¹ al regiunii de codificare.

Pentru a obține capătul 5' al ADNc uman, s-a procurat o trusă ADNc MarathonReady™ de rinichi fetal uman de la Clontech (catalog #7423-1). Sunt sintetizate oligonucleotide antisens Kid-155, corespunzând la complementul nucleotidelor 62-81 ale SEQ ID NR:8 (ADNc retL1 parțial umană) și Kid-154, corespunzând complementului nucleotidelor 17-43 ale SEQ ID NR:8 (ADNc retL1 parțial umană). Se realizează PCR folosind trusa Advantage™ DNAc PCR (Clontech catalog #8717-1) combinată cu reactivii Marathon™și oligonucleotidele Kid-155 sau Kid-154. Prima reacție PCR reglată după cum urmează:

35,5 pl H₂O; 5,0 μΙ 10 x tampon 1,0 μΙ amestec 10 mM dNTP; 1,0 μΙ 50 x amestec Advantage™ KlenTaq Polymerase. Acești reactivi sunt combinați și amestecați. Apoi, sunt adăugați 5,0 μΙ ADNc rinichi fetal Marathon-Ready™; 1,0 μΙ 10 μΜ primer AP1 și 1,5 μΙ 6,4 μΜ Kid-155 (volum final = 50 μΙ). PCR se realizează într-un Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 cu următoarele condiții pentru ciclu: 1 ciclu de 94°C timp de 1 minut; 30 cicluri de 94°C timp de 30 sec, 55°C timp de 30 sec, 68°C timp de 4 min. Se realizează o amplificare în serie PCR folosind produsul primei reacții PCR. Mai întâi 5 μΙ din produsul PCR #1 se diluează de 50 ori cu TE (volum final 250 μΙ). Reacția PCR în serie conține

35,5 μΙ H₂O; 5,0 μ110 x tampon KlenTaq; 1,0 μΙ amestec 10 mM dNTP; 1,0 μΙ 50X amestec Advantage™ KlenTaq Polymerase. Acești reactivi sunt amestecați ca mai sus. Apoi, sunt

RO 120343 Β1 adăugați 5,0 μΙ produs PCR #1 diluat; 1,0 μΙ primer 10 μΜ AP2 și 1,5 μΙ 6,9 μΜ Kid-154.1

Condițiile ciclului sunt aceleași ca mai sus. Produsul care rezultă de aproximativ 700 bp se purifică pe un gel de agaroză 1% cu punct de topire scăzut și s-a extras cu fenol. ADN-ul3 purificat este donat în situl EcoR5 al pZErO™ (Invitrogen, catalog #K2510-01). Informația secvenței se obține de la izolate multiple, inclusiv clonele numite HRL7G6 și HRL7G8.5

Secvența obținută de la clona HRL7G8 este găsită suprapusă cu secvența clonei HRL20 (ADNc retLI parțial umană) și se folosește pentru generarea unei secvențe de 7 lungime întreagă a RetLI (ADNc retLI umană de lungime întreagă), de asemenea prezentată în Figura 2B. Secvența nucleotidică obținută de la clona HRL7G8 reprezintă nucleotidele 1 9 la 502 ale ADNc RetLI umană de lungime întreagă; secvența nucleotidică de la clona HRL20 reprezintă nucleotidele 460 la 1682 ale ADNc retLI umană de lungime întreagă. Secvența 11 de la clona HRL7G8 este confirmată prin secvențierea altei clone ADNc (GJ102) izolată de la biblioteca ADNc lambda gt10 de rinichi embrionar uman descrisă mai sus folosind o sondă 13 derivată de la clona HRL7G6. Nucleotidele 118 la 1497 cuprind cadrul de citire al proteinei ADNc retLI umană întreagă. 15

Secvența de aminoacizi completă a RetLI este prezentată de asemenea în Figura 2B. Așa cum s-a dovedit prin analiza BESTFIT ilustrată în Figura 3A, ADNc retLI umană 17 este 82% identic la ADNc retLI de șobolan. Comparația peptidei (Figura 3B) arată secvența peptidică probabilă umană ca fiind 93,3% identică și 97,2% similară celei de șobolan. 19

Clonarea ligandului Ret RetL2

A. Clonarea RetL2 umană 21

Secvența peptidei RetLI de șobolan (RetLI de șobolan) se folosește pentru cercetarea bazei de date GenBank cu programul BLAST în scopul identificării proteinelor 23 înrudite (adică, izoloage). BLAST sau Basic Local Alignment Search Tool, folosește metoda lui Altschul et al., (J. Mol. Biol. 215:403-410,1990) pentru cercetarea similarităților dintre o 25 secvență de interogare și toate secvențele din baza de date de secvențe. Secvența de interogare și baza de date pot fi cercetate fie cu peptide sau nucleotide în orice combinație. 27 Când secvența peptidică RetLI de șobolan este verificată în baza de date nucleotidice Expressed Sequence Tag (EST), s-au obținut 2 împerecheri semnificative. Una este cu 29 GenBank cu număr de acces #R02249, o EST de 229 bp de la o bibliotecă combinată ADNc din ficat fetal uman și splină și alta este cu GenBank număr de acces #H12981, o EST de 31 la o bibliotecă ADNc din creier de făt uman. Cele două EST au împreună 99% identitate întro regiune a suprapunerii indicând faptul că ele sunt de la același ADNc. Oligonucleotidele 33 sunt generate de la EST H12981 :KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; care corespund la nucleotidele 38-67 și de asemenea, la nucleotidele 534-563 ale SEQ 35

ID NR:12) și oligonucleotida antisens KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; care corespund la complementul nucleotidelor 156-175 și de asemenea, la complementul 37 nucleotidelor 652-671 al SEQ ID NR:12).

Sunt cercetate 1x10® unități formatoare de placă de la o bibliotecă ADNc Clontech 39 Human Fetal Liver 5'-Stretch Plus lambda (cat# HL5003a) sunt cercetate în duplicat pe filtre OPTITRAN™. Filtrele sunt hibridizate cu oligonucleotidele KID-228 și KID-229 marcate ³²P 41 în 400 ml tampon de cercetare a plăcii ((50 mM Tris pH 7,5, IM NaCI, 0,1% pirofosfat de sodiu, 0,2% Polivinilpirolidină și 0,2% Ficool) care conține 10% Dextran sulfat și 100 pg/ml 43 tARN și 80 pmol fiecare din oligonucleotidele marcate ³²P la 65°C peste noapte. Ele s-au spălat de 2 ori cu 2 X SSC/1% SDS și de 2 ori cu 1 X SSC/1% SDS și s-au expus la film. S- 45 au purificat 11 duplicate pozitive. ADN-ul fiecăreia dintre aceste clone este analizat prin digestia cu enzime de restricție urmată de electroforeză în gel de agaroză și analiză 47 Southern blot.

RO 120343 Β1

Filtrele s-au hibridizat la KID-228 și KID-229 pentru a confirma că insertele hibridizează la sondă. Insertul clonei DSW240 estesecvențiat complet (ADNcretL2 umană, SEQ ID NR: 12) și este prezentată în Figura 7.

Nucleotidele 25-1416 cuprind cadrul de citire al proteinei ADNc retL2 umană, care codifică o proteină de 464 aminoacizi (RetL2 umană; SEQ ID NR:13) și este prezentat în Figura 7. Așa cum s-a dovedit prin analiza BESTFIT ilustrată în Figura 8, proteina RetL2 umană este 49,1% identică și 63,7% similară la proteina RetL2 umană. Ea are în comun cu RetL1 uman un capăt N-terminal hidrofob care indică o secvență semnal și un C-terminal hidrofob care indică un motiv de legătură fosfatidilinozitol glican. Suplimentar, 30 cisteine din cele 31 care sunt prezente în fiecare proteină sunt conservate.

8. Demonstrarea că RetL2 este un ligand pentru Ret

Noi am demonstrat că RetL2 este un ligand pentru Ret prin transfectarea celulelor 293/EBNA cu un plasmid de expresie care conține insertul clonei DSW240 și arătând că celulele pot lega o proteină de fuziune Ret/lgG solubilă.

Insertul DSW240 este îndepărtat folosind Notl și donat în vectorul de expresie CH269 care conține o origine EBV și permite expresia ridicată în linii de celule EBNA pozitive. Digestia enzimatică s-a realizat pentru identificarea clonelor care au orientarea corectă. Se prepară ADN plasmidial de la o clonă care are orientare corectă.

Plasmidele ADN (plasmida de expresie retL2, o plasmidă de expresie retL1 pentru un control pozitiv și o plasmidă de expresie care conține o proteină neînrudită pentru un control negativ) sunt transfectate în celule 293/EBNA (8 x 10⁵ pe o placă de 60 iran) folosind metoda lipofecției. După 48 h, celulele sunt spălate de 2 ori cu tampon HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1 NaN₃, 20 mM HEPES (pH 7,0)) și s-au incubat cu 20 pg/ml Ret/lgG de șobolan în Tris tamponat salin plus 1 mM MgCI₂ și CaCI₂ timp de 60... 90 min la temperatura camerei. După această incubare, celulele s-au spălat de 4 ori cu tampon HBHA și apoi s-au fixat cu 60% acetonă/3% formaldehidă/20 mM HEPES (pH 7,0) timp de 30 s. După 2 spălări cu tampon HBS (150 mM NaCI, 20 mM HEPES (pH 7,0)), celulele s-au incubat cu un anticorp secundar cuplat AP (anti-lgG de capră Fc-gamma specific F(ab')₂ (Jackson Immuno Research Laboratories: catalog #109-056-098; diluție 1:5000 în Tris tamponat salin plus mM MgCI₂ și CaCI₂) timp de 60 min la temperatura camerei. Celulele sunt apoi spălate de ori cu tampon substrat AP (100 mM Tris-HCI (pH 9,5), 100 mM NaCI, 5 mM MgCI₂) care conține 2 X supresor Pierce Immuno PureCDPhosphatase (catalog #35002). Ultima spălare este lăsată 15 min. Apoi s-au adăugat NBT (0,33 mg/ml) și BCIP (0,17 mg/ml) în tampon substrat conținând inhibitorul Pierce AP și s-au incubat cu celulele timp de 5... 20 min. Plăcile sunt apoi spălate de 2 ori cu apă, în continuare plăcile sunt inspectate sub un microscop de disecție pentru prezența celulelor colorate purpuriu. Prezența celulelor colorate purpuriu arată că Ret/proteină de fuziune s-a legat la celule și că proteina RetL2 este un ligand pentru Ret. Celule colorate purpuriu sunt observate de asemenea după transfecție cu vectorul de expresie retL1 dar nu cu vectorul de control negativ.

Clonarea ligandului Ret, RetL3 A.

RetL3 murin

O cercetare a bazei de date EST cu secvența de aminoacizi RetL1 descrie două EST-uri murine cu omologie la liganzi Ret. Aceste EST-uri sunt AA049894 și AA050083 (care este ADNc retL3 parțial murină; SEQ ID NR:14). Plasmidele care codifică aceste EST-uri sunt obținute de la Genome Systems Inc. (Catalog# 475791 și #475497) ca înțepări bacteriene. Plasmidul ADN este preparat de la colonii singulare obținute prin strierea înțepăturilor pe plăci LB Amp. Insertele de la aceste plasmide sunt secvențiate în întregimea lor.

RO 120343 Β1

Comparația celor 2 secvențe demonstrează că AA049894, care are un insert de 1,4 kb este 1 conținut în AA50083, care are un insert de 1,9 kb. Translarea secvenței ADN de la AA50083 arată că există un cadru de citire deschis cotinuu de la NT205 la NT1242 (RetL3 parțial 3 murină; SEQ ID NR:15). Acest ORF a avut 37,5% identitate la cel al retL1 de la șobolan și 40,2% identitate la retL2 de la șobolan. Cu toate acestea, cadrul de citire deschis nu codifică 5 o Met sau o secvența semnal la capătul 5'. Noi am examinat ORF-urile în amonte de capătul 5' de acesstă regiune și am găsit o Met în contextul unei secvențe consens Kozak pentru 7 inițierea translației și o potențială secvență semnal pentru expresia/secreția la suprafață.

Acest ORF este în afara cadrului cu ORF din aval indicând că EST AA050083 conține o9 mutație potențială, cum ar fi o inserție, deleție, intron sau artefact de donare, la capătul său 5.11 în scopul obținerii capătului 5' corect, noi am folosit Marathon RACE. S-au procurat de la Clontech ADNc embrionar de șoarece din ziua 11 Marathon-Ready™ (cat. #7458-1)13 și otrusă Advantage™ (cat.#8417-1). S-au sintetizat oligonucleotide antinsens Kid-366, care corespund la complementul nucleotidelor 847-866 al SEQ ID NR:14 și Kid-365, care 15 corespund la complementul nucleotidelor 589-615 ale SEQ ID NR;14. Se realizează PCR folosind și o trusă ADNc Avantage™ PCR (Clontech cat.#8417-1) combinată cu reactivii 17 Marathon™ și oligonucleotidă Kid-366. Prima reacție PCR se realizează după cum urmează:

35,5 pl H₂0; 5,0 pl 10 X tampon Klen Taq; 1,0 μΙ amestec 10 mM dNTP; 1,0 μΙ 50 X amestec 19 Avantage™KlenTaq Polymerase. Acești reactivi sunt combinați și amestecați. în continuare se adăugă 5,0 μΙ ADNc de șoarece embrionar în ziua 11 Marathon-Ready™; 1,0 μΙ primer 21 10 mM AP1 și 1,7 μΙ 5,88 μΜ Kid-366 (volum final = 50 μΙ). PCR se realizează într-un Perkin-

Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 cu următoarele condiții de ciclu: 1 ciclu de 94C timp 23 de 1 minut; 5 cicluri la 94’C timp de 30 s, 72’C timp de 4 min; 5 cicluri la 94’C timp de 30 s, 70’C timp de 4 min; 25 cicluri la 94’C timp de 30 s, 68’C timp de 4 min. S-a realizat un PCR 25 în serie folosind produsul primei reacții PCR. Mai întâi, 5 μΙ din produsul PCR #1 este diluat de 50 ori cu TE (volum final 250 ui). Reacția PCR în serie conține 35,5 μΙ H₂O; 5,0 μΙ tampon 27 KlenTaq; 1,0 μΙ amestec 10 mM dNTP; 1,0 pl amestec 50 X Advantage™KlenTaq Polymerase. Acești reactivi sunt amestecați ca mai sus. După aceea s-au adăugat 5,0 μΙ 29 produs PCR #1 diluat; 1,0 pl primer 10 μΜ AP2 și 3,6 μΙ 2,8 μΜ Kid-365. Condițiile sunt aceleași ca mai sus. Produsul rezultat de aproximativ 665 bp se purifică pe un gel de31 agaroză 1% cu punct de topire scăzut și s-au extras Qiaex II (Qiagen cat#20021). ADN-ul purificat este donat în pNoTA/T7™ folosind sistemul de donare PRIME PCR CLONER™ (533

Prime-> 3 Prime cat.#1-725029). Informația de secvență este izolată, incluzând clonele DSW252 și DSW253.35

Secvența DSW252 este găsită suprapusă cu SEQ ID NR:14 cu excepția unei T suplimentare prezentă între NT 252 și NT 253 ale SEQ ID NR:14. Această T este prezentă 37 de asemenea în alte izolate DSW251 și DSW253. Inserția acestei baze suplimentare corectează ORF-ul astfel că se obține un ORF unic de 1191 bp (numărând de la prima Met) 39 care codifică 397 aminoacizi. Acest ORF codifică o Met în contextul unei inițieri a translației canonice a secvenței consens (Kozak) și include o secvență semnal pentru expresie/ 41 secreție.

Pentru a obține o clonă murină de lungime întreagă care este capabilă să fie 43 exprimată, s-a purificat un fragment Not1-BamH1 de 630 bp al DSW252 și un fragment BamH1-Not1 de 1308 bp al 50083 și s-a ligat la un vector de expresie CH269 digerat Not. 45 Ligarea este transformată în E.co//XL-1-Blue (Stratagene cat.#200236). S-au realizat minipreps Qiawell Ultra asupra transformantilor rezultați. Aceștia sunt analizați prin digestie 47 enzimatică și electroforeză în gel de agaroză pentru mărimea și orientarea corectă.

RO 120343 Β1

Acest construct este numit DSW254. Insertul DSW254 este secvențiat în întregimea sa (retL3 murină; SEQ ID NR:16) și ORF-ul este confirmat codificând o proteină de 397 aminoacizi (RetL3 murină; DEQ ID NR:17). Aceste secvențe sunt prezentate de asemenea în Figura 9. C-terminusul RetL3 și indicator al unui motiv de legare fosfatidilinozitol glican.

B. RetL3 umană în scopul găsirii unei surse candidat de țesut pentru donarea RetL3 umană, noi am utilizat pete Northern ale țesuturilor de șoarece pentru determinarea imaginii expresiei RetL3 murină. Dintre țesuturile examinate, expresia cea mai ridicată este în țesutul inimii. O bibliotecă ADNc din inimă de adult uman în vectorul lambda gt 10 s-a procurat de la Clontech (catalog# HL3026a). S-au întins 1 milion unități formatoare de placă din stocul de fag pe plăci Nune 10. Plăci duplicat rezultate sunt obținute pe filtre Schuell Optitran™.

Se generează o sondă prin PCR cu primeri Kid-366 și Kid-367, corespunzând nucleotidelor 397-420 ale secvenței AA50083. Reacția PCR este realizată după cum urmează: se amestecă, 10 μ110 X tampon PFU, 2,0 μΙ amestec 10 mM dNTP, 72,1 μΙ H₂0, 3,1 μ113,2 μΜ Kid-367, 6,8 μΙ 5,88 μΜ Kid-366, 5,0 μΙ 0,1 pg/μΙ ADN AA050083 și 2,0 μΙ 2,5 Unități/ul PFU (Stratagene catalog #600154). Se realizează PCR în Perkin-ElmerCetus DNA Thermal Cycler 480 cu următoarele condiții: 25 cicluri la 94’C timp de 1 minut, 53°C timp de 1 minut, 72°C timp de 4 min. Produsul este purificat prin extracție cu fenol, cloroform, alcool izoamilic 50:49:1 urmat de electroforeză în gel de agaroză cu punct de topire scăzut și purificare Qiaexll a fragmentului excizat. Această sondă a regiunii de codificare este marcată de ³²P prin inițiere random srg și Vogelstein). Filtrele sunt hibridizate peste noapte ml tampon de căutare Plaque () conținând 10 sulfat de dextran, 100 pg/ tARN și 1,8 X10®CPM al sondei de șoarece la 65’C. Ele sunt spălate de 2 ori cu tampon de căutare placă, de 2 ori cu 2 X SSC/1% SDS, de 2 ori cu 1 X SSC/1% SDS la 65°C și expuse la film la -70’C cu un ecran de intensificare. Sunt purificați pozitivi duplicat. ADN lambda miniprep de la plăcile candidat purificate se digeră cu EcoR1, se supun la electroforeză pe gel de agaroză 1% și la analiză Southern blot. Pata Southern se hibridizează cu sonda de la șoarece. Clona GJ128, care are un insert de 1,3 kb, hibridizează intens la sonda regiunii de codificare de la șoarece. Secvența ADN (ADNc retL3 parțial umană; SEQ ID NR:18) și secvența peptidică dedusă (RetL3 parțial umană; SEQ ID NR:19) sunt obținute de la această clonă, confirmând că aceasta este omoloaga cu secvența umană. Această clonă codifică cea mai mare parte a regiunii de codificare, inclusiv capătul 3' al regiunii de codificare.

Insertul de 1,3 kb de la GJ128 este purificat, marcat cu ³²P și folosit pentru căutarea biliotecii Clontech de inimă adultă umană în scopul obținerii unei clone cu capătul 5'. Nu s-a obținut nici o clonă care să conțină capătul 5' într-o căutare de 2 X 10^& plăci din această bibliotecă. Analiza Northern a petelor ARNm de țesut adult uman (Clontech catalog # 77 601, 7759-1 și 7767-1) hibridizate cu aceiași sondă, folosind protocoalele furnizate de către producător, arată că RetL3 umană este exprimată în măduva spinării de adult uman, stomac, inimă, pancreas, intestin subțire, colon, prostată și testicul. O bibliotecă Clontech ADNc din măduva spinării de adult uman (catalog # 5001a) este cercetată cu insert GJ128. Sunt purificate 3 clone independente și cea mai lungă GJ135 este secvențiată. Secvența insertului GJ135 se suprapune cu insertul GJ128, permițând generarea unei secvențe ADNc retL3 umane de lungime întreagă (SEQ ID NR:20) și determinarea RetL3 umane de lungime întreagă (SEQ ID NR:21). Aceste secvențe sunt prezentate de asemenea în Figura 10. Retl3 umană este 34,3% și 34,9% identică la RetL1 umană și respectiv, RetL2 umană. Ea are 76,8% identitate cu RetL3 murină.

Utilizări terapeutice ale compușilor invenției

RetL-uri native și variante, anticorpi anti-RetL, anticorpi anti-Retși proteine de fuziune ale Ret și RetL-urilor pot avea utilitate terapeutică în situații unde este de dorit să se

RO 120343 Β1 blocheze sau activeze calea de semnalizare Ret, să se stimuleze creșterea celulei renale 1 și/sau neuronale sau supraviețuirea în situații de boală unde aceste celule sunt pierdute sau distruse, sau să se suprime creșterea sau să se omoare celule nedorite cum ar fi celule 3 tumorale care exprimă Ret sau o RetL.

în general, compușii invenției care se leagă la Ret, inducând dimerizarea și/sau 5 autofosforilarea Ret, sunt utili pentru stimularea creșterii sau limitării distrugerii țesuturilor care exprimă Ret. Compușii invenției sunt utili pentru stimularea țesutului renal și/sau 7 supraviețuirea, sprijinirea funcției renale și reducerea distrugerilor țesutului renal în diverse condiții. Condiții speciale care pot fi tratate benefic cu compușii invenției includ căderea 9 renală acută, nefrita acută, căderea renală cronică, sindrom nefrotic, defecte ale tubului renal, transplante de rinichi, leziuni toxice, leziuni hipoxice și traumatisme. Defectele tubului 11 renal le includ pe cele fie de natură ereditară, fie dobândite, cum ar fi boala policistică a rinichiului, boala cistică medulară și rinichi spongios medular. Această listă nu este limitată 13 și poate să includă numeroase alte boli renale (vezi, de exemplu, Harrison's Principles of Internai Medicine, a 13-a ed., 1994, care este încorporată aici prin referire). 15 în alte aplicații, genele și proteinele invenției se pot folosi pentru tratarea codițiilor unde este dorită creșterea și regenerarea neurală. Aceasta va include orice condiții care 17 implică tulburări de degenerare neurală, cum ar fi boala lui Alzheimer, Parkinson, Huntington, Tourette, scleroză amiotrofică laterală, precum și boala neuronului motor, boli de 19 demielinizare cum ar fi scleroza multiplă, boli bacteriene cum ar fi meningită, sau empiem, boli virale cum ar fi mielopatie asociată HIV, Creutzfeldt-Jakob. Sunt incluse de asemenea 21 tulburări de distrugere ale țesutului neural, cauzate de restricții neoplastice, traumatisme, sau evenimente cerebrovasculare cum ar fi hemoragie sau embolii. Boli ale nervilor cranieni și 23 ale măduvei spinării, incluzând tulburări traumatice, inflamatorii, de etiologie congenitală sau vasculară, sunt incluse specific, deoarece sunt tulburări care afectează sistemul nervos 25 autonom. De asemenea sunt incluse tulburări de dezvoltare neurală cum ar fi retardarea mentală, autismul, sindromul de alcolism fetal, sindromul Down și atonia cerebrală. Aceste 27 tulburări le includ pe cele cauzate de oricare dintre factorii listați anterior și includ specific boala Lyme, neuropatii asociate HIV, polimiositis, distrofie musculară și miastenia gravis. 29

Anticorpi anti-RetL și proteine de fuziune Ret ale invenției, care se leagă specific la proteina RetL de la șobolan, RetL parțial umană, RetL umană de lungime întreagă, RetL2 31 umană, RetL3 murină sau RetL3 umană, sau fragmente ale acestor proteine sunt utile în câteva metode. Compușii pot fi folosiți terapeutic pentru a inhiba sau bloca semnalizarea 33 receptorului Ret, cum ar fi pentru blocarea creșterii tumorilor care depind de activarea semnalizării Ret pentru creștere. Acești agenți pot fi de asemenea fuzionați la markeri 35 detectabili, cum cum ar fi substanțe opace fluoroscopic sau radiografie și administrate la un subiect pentru a permite formarea de imagini ale țesuturilor care exprimă o RetL. De 37 asemenea, agenții pot fi legați la substanțe cum ar fi peroxidază de hrean, care se poate folosi drept colorări imunocitochimice pentru a permite vizualizarea zonelor de celule RetL 39 pozitive pe secțiuni histologice. Un anticorp specific ar putea fi folosit singur în această manieră și siturile unde el este legat pot fi vizualizate într-o analiză sandwich folosind 41 anticorp anti-imunoglobulină care este legat la rândul său la un marker detectabil. Anticorpi specifici față de orice RetL sunt utili de asemenea în imunoanalize pentru cuantificarea 43 substanței pentru care un anticorp dat are citate. Anticorpi specifici față de o RetL pot fi de legați la suporturi solide, cum ar fi granule sau discuri și folosiți pentru îndepărtarea 45 ligandului din soluție, fie pentru utilizare în purificarea proteinei, fie în eliminarea ei din soluție. Fiecare dintre aceste tehnici este de rutină pentru cei cu pregătire în domeniile 47 imunologiei.

RO 120343 Β1

Alte metode ale invenției includ modularea semnalizării Ret-RetL prin punerea în contact a Ret cu un anticorp monoclonal anti-Ret. Efectul unui astfel de contact mAb-Ret poate să fie pentru fie blocarea, fie stimularea activării căii de semnalizare Ret, depinzând de caracteristicile interacțiunii fiecărui mAb cu Ret. Unii mAb-uri interacționează cu Ret ca agoniști, legarea agonistului mAb-Ret declanșând dimerizarea autofosforilării Ret. Alți mAb acționează ca antagoniști Ret. Interecțiunea Ret cu un mAb antagonist previne activarea semnalizării de către alte RetL-uri, sau prin complexe care cuprind RetL-uri, care ar putea activa în alt fel calea de semnalizare Ret.

O RetL și/sau anticorpi pentru Ret sau pentru o proteină de fuziune Ret se pot folosi pentru a permite formarea de imagini ale țesuturilor care exprimă Ret, sau în metode imunohistologice sau preparative decrise mai sus pentru anticorpi față de o RetL.

Proteinele de fuziune care cuprind o RetL și/sau anticorpi anti-Ret pot fi folosiți pentru terapii medicale țintite specific împotriva cancerelor și tumorilor care exprimă Ret. Asemenea tumori pot include cele câteva fenotipuri diferite de tumori care au fost asociate cu mutații în Ret (N. Engl. J. Med. 335:943-951,1996; Nature 367:319-320,1996; Trends Gen. 12:138144, 1996). Intervenții terapeutice împotriva neoplaziilor care exprimă o RetL utilizează proteine de fuziune care încorporează Ret și/sau un anticorp anti-RetL. Anticorpul anti-Ret sau anticorpul anti-Ret L pot fi eficiente prin ele însăși prin citoliza dependentă de anticorp și citoliza dependentă de complement mediate de către domeniul Fc. Astfel de liganzi hibrizi și anticorpi pot fi obținuți mai eficienți ca terapeutice ale cancerului prin folosirea lor ca vehicule de eliberare a medicamentelor antineoplastice, toxine și radionuclide citocidale, cum ar fi 90. Celule citotoxice efectoare pot fi țintite la celule tumorale folosind anticorpi heteroconjugați, unde un anticorp specific pentru fie Ret, fie pentru o RetL exprimată de către o tumoare este cuplat covalent la un anticorp îndreptat împotriva unei proteine de suprafață sau celulă citotoxică efectoare, cum ar fi celule NK sau CTL-uri.

Un exemplu al unui anticorp anti-Ret sau terapie Ret este să se conjuge catena toxică A a ricinului sau o formă de lungime întreagă modificată a ricinului (care nu mai poate lega celulele) la o RetL sau la un anticorp îndreptat împotriva polipeptidei Ret exprimată pe suprafața celulelor maligne. în altă realizare, o toxină este conjugată la Ret sau la un anticorp anti-RetL pentru țintirea selectivă și omorârea celulelor RetL pozitive, cum ar fi o tumoare care exprimă o RetL. 0 astfel de abordare s-a dovedit de succes cu ricin blocat conjugat la un anticorp monoclonal împotriva antigenului CD19 exprimat pe majoritatea celulelor neoplastice (Grossbard et al., Blood 79:576,1992). Alte toxine sunt la fel de utile, așa cum se cunoaște de către cei cu pregătire în domeniu. Astfel de toxine includ, dar nu sunt limitate la, exotoxina pseudomonas, toxina difteriei și saporina. Această abordare s-ar putea dovedi chiar mai de succes folosind o RetL sau anticorp anti-RetL, deosebindu-se de abordarea cunoscută anti-antigen CD19, deoarece este exprimată într-un număr foarte limitat de țesuturi.

Abordările de mai sus, folosind fuziuni ale ricinului sau alte toxine, sunt în mod egal aplicabile la conjugate toxice ale RetL sau ale unui anticorp anti-Ret; acestea sunt utile pentru țintirea selectivă și omorârea celulelor Ret pozitive, cum ar fi celule tumorale care exprimă Ret.

Altă abordare pentru asemenea terapii medicale este să se folosească RetL marcat cu izotop sau anticorpi anti-Ret. Compuși astfel radiomarcați vor ținti preferențial radioactivitatea spre situri ale tumorii în celule care exprimă Ret, cruțând țesuturile normale. Depinzând de radioizotopul folosit, radiația emisă de la un anticorp radiomarcat legat la o celulă tumorală poate, de asemenea, să omoare celule tumorale maligne apropiate care nu exprimă Ret. Se pot folosi o diversitate de radionuclide. Izotopi care emit particule (β (de exemplu, ¹³¹l)

RO 120343 Β1 s-a folosit cu succes cu anticorpi monoclonali împotriva CD20 prezent pe limfoame ale 1 celulei-B (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329:459 (1993); Press et al., N. Engl. J. Med. 329:1219 (1993). Radionuclide care generează particule (5 generează emisii radioactive 3 care sunttumoricide pe distanțe de câteva diametre celulare, permițând eradicarea celulelor antigen negative și diminuând consecințele depunerii neomogene ale anticorpului sau 5 ligandului în tumori.

De asemenea, pot fi folosite radionuclide care emit particule a. Iradierea la o rată 7 redusă a dozei generată de RetL marcat cu radionuclid poate fi mai eficientă terapeutic decât iradierea eliberată instantaneu în terapia convențională de iradiere. Iradierea la o rată redusă 9 a dozei poate induce apoptoza (moartea programată a celulei) în anumite linii de celule (Macklis et al., Radiat. Res. 130:220 (1992); Macklis et al., Radiopharm. 5:339 (1992). 11

Compușii invenției sunt administrați în cantități eficiente terapeutic, care înseamnă o cantitate dintr-un compus care produce un rezultat medical dorit sau exercită o influență 13 asupra unei condiții particulare de tratat.

Termenul subiect” folosit aici este luat în înțelesul oricărui mamifer la care ligandul 15 Ret sau gena poate fi administrată. Subiecte avute în vedere în mod specific pentru tratament cu metoda invenției includ oameni, precum și primate nonumane, oi, cai, vite, 17 capre, porci, câini, pisici, iepuri, cobai, hamsteri, gerbili, șobolani și iepuri, precum și organe, tumori și celule derivate sau originare de la aceste gazde. 19

Utilizarea compușilor invenției în terapia genică

Genele RetL ale invenției sunt introduse în țesut distrus pentru stimularea producerii 21 unei RetL de către celulele infectate, pentru susținerea creșterii celulei și/sau supraviețuirea celulelor care exprimă Ret. 23 într-o realizare specifică a unei metode de terapie a genei,o genă RetL poate fi introdusă într-un țesut renal sau neural țintă la alegere. O RetL va putea fi apoi exprimată 25 stabil și să stimuleze celule pozitive receptor Ret să crească, să se diferențieze și/sau să potențeze supraviețuirea celulei. Mai mult, gene RetL pot să fie introduse într-o celulă țintă 27 folosind o diversitate de metode bine cunoscute care utilizează fie strategii virale, fie strategii care nu se bazează pe virus. 29

Metode nevirale includ electroporarea, fuziunea membranei cu lipozomi, bombardament cu viteză ridicată cu microproiectile acoperite cu ADN, incubare precipitat ADN-fosfat 31 de calciu, transfecție mediată DEAE-dextran și microinjectarea directă în celule singulare.

De exemplu, o genă RetL poate fi introdusă într-o celulă prin coprecipitare fosfat de calciu 33 (Pillicer et al., Science, 209:1414-1422 (1980); microinjectare mecanică și/sau particule accelerate (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403 (1980); transfer ADN 35 bazat pe lipozom (de exemplu, transfecție mediată LIPOFECTIN - Fefgneret al., Proc, nat.

Acad. Sci., USA, 84:471-477,1987; GaoșiHuang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179:280- 37

285, 1991; transfecție mediată DEAE Dextran; electroporare (brevet SUA 4.956.288); sau metode bazate pe polilizină în care ADN este conjugat pentru a elibera preferențial ADN la 39 hepatocitele din ficat (Wolff et al., Science, 247:465-468, 1990; Curiei et al., Human Gene Therapy 3:147-154, 1992). 41

Celulele țintă pot fi transfectate cu genele invenției prin transfer direct de genă. Vezi, de exemplu, Wolff et al., Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo, Science 43

247:1465-68, 1990. în numeroase cazuri, va fi de dorit transfecția mediată de vector. Se poate folosi oricare dintre metodele cunoscute în domeniu pentru inserția secvențelor 45 polinucleotidice într-un vector. Vezi, de exemplu, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) și 47 Ausubel etal., Current Protocolsin Iar Biology, J. Wiley &sons, NY (1992), ambele care sunt

RO 120343 Β1 incluse aici prin referire. Activarea promotorului poate fi specifică țesutului sau poate fi indusă printr-un produs metabolic sau substanță administrată. Astfel de promotori/ intensificatori includ dar nu sunt limitați la, promotorul RetL nativ, promotorul/intensificatorul timpuriu-imediat al citomegalovirusului (Karasuyama et al., J. Exp. Med.. 169:13 (1989)); promotorul beta-actinei umane (Gunning etal., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84:4831 (1987); promotorul care se poate induce al glucorticoidului prezent în repetiția terminală lungă a virusului tumorii mamare de la șoarece (MMTV LTR) (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4:1354 (1984)); secvențele repetiției terminale lungi ale virusului leucemiei murine Moloney (MulV LTR) (Weiss etal., RNATumorViruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); promotorul regiunii timpurii SV40 (Bernoist și Chambon, Nature, 290:304 (1981)); promotorul virusului Sarcoma Rous (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787 (1980)); promotorul timidin kinazei de la virusul herpes simplex (HSV) (Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78:1441 (1981)); promotorul adenovirusului (Yamada etal., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82:3567(1985)).

De asemenea, genele RetL pot să fie introduse prin vectori virali specifici pentru utilizare în sisteme de transfer al genei care acum sunt bine stabilite. Vezi, de exemplu: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73:1533-36,1992 (papovirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-61, 1992 (adenovirus) Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10099-10103, 1995 (baculovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:25-38, 1992 (virus vaccinia); Muzyczka,Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-123, 1992 (virus asociat adeno); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 157:67-93 (virus herpes simplex (HSV) și virus Epstein-Barr (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24, 1992 (retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4:749-754, 1984 (retrovirus); Miller et al., Nature, 357:455-450, 1992 (retrovirus); Anderson,

Science,:2.56:808-813,1992 (retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology. Sections

9.10-9.14 (Ausubel et al., Ed.), Greene Publishing Associates, 1989, toate care sunt încorporate aici prin referire.

Vectori preferați sunt virusuri ADN care includ adenovirusuri (de preferință vectori bazați pe Ad-2 sau Ad-5), baculovirus, virusuri herpes (de preferință vectori bazați pe virusul herpes simplex și parvovirusuri (de preferință vectori bazați pe parvovirusuri deficiente sau neautonome, mai preferat vectori bazați pe virusul asociat adeno, cel mai preferat vectori bazați pe AAV-2). Vezi, de exemplu, Aii et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994; brevete US 4.797.368 și 5.399.346 și discuția de mai jos.

Alegerea unui sistem particular de vector pentru transferarea, de exemplu, o secvență RetL va depinde de o diversitate de factori. Un factor important este natura populației de celule țintă. Cu toate că vectorii retrovirali au fost studiați extensiv și s-au folosit în numeroase aplicații de terapie a genei, ei sunt în general necorespunzători pentru infectarea celulelor care nu se divid dar pot fi utili în terapia cancerului și exprimă genele lor în celule care se replică. Ei sunt utili pentru abordări ex vivo și sunt atractivi din această considerație datorită integrării lor stabile în genomul celulei țintă.

Adenovirusurile sunt virusuri ADN eucariotice care pot fi modificate pentru a elibera eficient un terapeutic sau o transgenă raportor la o diversitate de tipuri de celule. în general, adenovirusurile tipurile 2 și 5 (Ad2 și respectiv, Ad5), care cauzează boli respiratorii la oameni, dezvoltate curent pentru terapia genei distrofiei musculare Duchenne (DMD) și fibrozei cistice (CF). Ambele Ad2 și Ad5 aparțin la o subclasă de adenovirus care nu sunt asociate cu malignități umane. Vectorii adenovirus sunt capabili să asigure niveluri extrem de ridicate ale eliberării transgenei la virtual toate tipurile de celule, indiferent de starea mitotică. Titruri ridicate (10¹³ unități formatoare de placă/mî) de virus recombinant pot fi cu

RO 120343 Β1 ușurință generate în celule 293 (o linie de celule renale embrionice umane de comple- 1 mentare, transformate cu adenovirus: ATCC CRL1573) și păstrate prin frig pentru perioade extinse fără pierderi apreciabile. Eficacitatea acestui sistem în eliberarea unei transgene 3 terapeutice in v/Vocare complementează un dezechilibru genetic s-a demonstrat în modele animale cu diverse tulburări. Vezi, Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. 5

Tanzawa et al, FEBS Letters, 118(1): J.L. Golasten et al, New Engl. J. Med.. 309 (11983): 288-296 (1983); S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest.. 92:883-893 (1993); și S. Ishibashi et al,7

J. Clin. Invect.. 93:1889-1893 (1994)., toate care sunt încorporate aici prin referire. întradevăr, adenovirusul recombinant deficient în replicare care codifică un ADNc pentru9 regulatorul transmembranar al fibrozei cistice (CFTR) a fost aprobat pentru utilizare în cel puțin două experimente clinice CF umane. Vezi, de exemplu, J. Wilson, Nature, 365:691-69211 (21 oct. 1993). Sprijin suplimentar al siguranței adenovirusurilor recombinante pentru terapia genică este experiența extensivă a vaccinurilor vii de adenovirus în populații umane.13

Adenovirusurile umane cuprind un genom ADN linear dublu catenar de aproximativ 36 kb, care este împărțit în 100 unități de hartă (u.h.), fiecare fiind în lungime de 360 bp. 15 ADN-ul conține repetiții terminale scurte inversate (ITR) la fiecare capăt al genomului care sunt necesare pentru replicarea ADN-ului viral. Produsele genei sunt organizate în regiuni 17 timpurii (El la E4) și târzii (LI la L5), bazat pe expresia înainte sau după inițierea sintezei ADN-ului viral. (Vezi, de exemplu, Horwitz, Virology, a 2-a ed., B.N. Fields, Raven Press Ltd., 19

New York (1990)).

Prima generație recombinantă, de adenovirusuri deficiente în replicare care s-a 21 dezvoltat pentru terapia genei a DMD și alte tulburări moștenite conține deleții ale regiunilor E1a în întregime și în parte E1b. Acest virus deficient în replicare este crescut în celule 293 23 care conțin o genă E1a funcțională a virusului care asigură o proteină E1a de transacțiune. Virusurile deletate E1 sunt capabile de replicare și să producă virus infecțios în celule 293, 25 care furnizează produsele genei regiunii E1 a și E1 b în trans. Virusul rezultat este capabil să infecteze numeroase tipuri de celule și poate exprima gena introdusă (asigurând că ea 27 poartă propriul său promotor), dar nu se poate replica într-o celulă gazdă care nu conține ADN-ul regiunii E1 numai dacă celula este infectată la o multiplicare foarte ridicată a infecției. 29 Adenovirusurile au avantajul că ele au o gamă largă de gazde, pot infecta celule în repaus sau celule diferențiate terminal cum ar fi neuroni și par în principal neoncogene. 31 Adenovirusurile nu par să se integreze în genomul gazdei. Deoarece ele există extracromozomal, riscul mutagenezei inserționale este mult redus. Aii et al., supra_r la 373. 33

Adenovirusurile recombinante (rAdV) produc titruri foarte ridicate, particulele virale sunt moderat stabile, nivelurile expresiei sunt ridicate și poate fi infectată o gamă extinsă de 35 celule. Celulele lor gazdă naturală sunt cele ale epiteliului căilor respiratorii, astfel că ele sunt utile pentru terapia cancerelor pulmonare. 37

Transferul mediat de baculovirus are câteva avantaje. Transferul genei baculovirale poate avea loc în celule care se replică și care nu se replică și se poate întâlni în celule 39 renale, precum și în hepatocite, celule neurale, celule ale splinei, ale pielii și musculare. Baculovirusul nu se replică și este nepatogen în celule mamifere. Oamenii sunt lipsiți de 41 anticorpi preexistenți față de baculovirus recombinant care ar putea bloca infecția. Suplimentar, baculovirusul este capabil să încorporeze și să transducă inserte ADN foarte 43 mari.

Adenovirusurile asociate adeno (AAV) au fost de asemenea folosite ca vectori pentru 45 terapia genei somatice. AAV este un virus ADN cu catenă unică (ss), mic cu o organizare genomică simplă (4,7 kb) care îl face un substrat ideal pentru inginerie genetică. Două cadre 47 de citire deschise codifică o serie de polipeptide rep și cap. Polipeptidele rep (rep78, rep68,

RO 120343 Β1 rep62 și rep40)sunt implicate în replicare, salvare și integrarea genomului AAV. Proteinele cap (VP1, VP2 și VP3) formează capsida virionului.Flancarea cadrelor deschise de citire rep și cap la capetele 5' și 3' sunt repetiții terminale inversate (ITR-uri) de 145 bp, din care primele 125 sunt capabile să formeze structuri de formă Y-sau T-. De importanță pentru dezvoltarea vectorilor AAV, domeniile rep și cap în întregime pot fi excizate și înlocuite cu o transgenă terapeutică sau raportor. Vezi,8.J. Carter,în Handbook of Parvoviruses, ed., P.Tijsser, CRC Press, p. 155-168 (1990). S-a dovedit că ITR-urile reprezintă secvența minimă necesară pentru replicare, salvare, împachetare și integrarea genomului AAV.

Ciclul de viață AAV este bifazic, compus atât din episoade latente cât și litice. în timpul unei infecții latente, virionii AAV pătrund într-o celulă ca un ADNss (mono-catenar) încapsulat și la scurt timp după aceea sunt eliberați la nucleu unde ADN AAV se integrează stabil în cromozomul gazdei fără nevoia aparentă pentru diviziunea celulei gazdă. în absența unui virus helper, genomul AAV integrat rămâne latent dar capabil să fie activat și salvat. Faza litică a ciclului de viață începe când o celulă care adăpostește un provirus AAV este provocată cu o infecție secundară printr-un herpesvirus sau adenovirus care codifică funcțiuni helper care sunt recrutate de către AAV pentru a ajuta în excizia sa din cromatina gazdei (B.L. Carter, supra). Infecția ADNss parental este extinsă la forma duplex de replicare a ADN-ului (RF) într-un mod dependent de rep. Genomurile AAV salvate sunt împachetate în proteinele capsidelor realizate (simetrie icosaedrală de aproximativ 20 nm în diametru) și eliberate ca virioni infecțioși care au fost împachetați ca genom ssADN fie +, fie - după liza celulei.

Virusurile asociate adeno (AAV) au potențial semnificativ în terapia genei. Particulele virale sunt foarte stabile și AAV-urile recombinante (RAAV) au caracteristici “asemenea medicamentului”, prin aceea că AAVr poate fi purificat prin formare de pelete sau prin depunere în gradient CsCI. Ele sunt stabile termic și pot să fie liofilizate ca o pulbere și rehidratate la activitatea deplină. ADN-ul lor se integrează stabil în cromozomii gazdei astfel încât expresia este de lungă durată. Domeniul lor de gazde este larg și aav nu produce nici o boală cunoscută astfel că vectorii recombinanți nu sunt toxici.

O dată introduse într-o celulă țintă, secvențele de interes pot fi identificate prin metode convenționale cum ar fi hibridizarea acidului nucleic folosind sonde care cuprind secvențe care sunt omoloage/complementare la secvențele genei inserate a vectorului. în altă abordare, secvența(le) pot fi identificate prin prezența sau absența unei funcțiuni de genă marker (de exemplu, activitate timidin kinazică, rezistență la antibiotic și altele) produsă prin introducerea vectorului de expresie în celula țintă.

Formulări și administrare

Compușii invenției pot fi administrați în orice mod care este acceptabil medical. Aceasta poate să includă injectări, pe căi parenterale cum ar fi intravenos, intravascular, intraarterial, subcutanat, intramuscular, imtratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, sau altele precum și oral, nazal, oftalmic, rectal sau topic. Administrarea cu eliberare susținută este de asemenea inclusă specific în invenție prin mijloace cum ar fi eliberarea prin intermediul unui cateter la una sau mai multe artere, ca artera renală sau un vas care alimentează o tumoare localizată.

Termenul purtător acceptabil farmaceutic înseamnă unul sau mai multe ingrediente organice sau anorganice, natural sau sintetic, cu care proto-oncogena mutantă sau oncoproteina mutantă este combinată pentru facilitarea aplicării sale. Un purtător corespunzător include soluție salină sterilă cu toate că și alte soluții sterile izotonice apoase și neapoase și suspensii sterile cunoscute ca fiind acceptabile farmaceutic sunt cunoscute celor cu pregătire obișnuită în domeniu. în această considerație, termenul purtător cuprinde lipozomi

RO 120343 Β1 și proteina tat a HIV-1 (vezi Chen., Anal. Biochem. 227:168-175, 1995) precum și orice 1 plasmid și vectori de expresie virală. O cantitate eficientă se referă la acea cantitate care este capabilă să amelioreze sau să întârzie progresarea condiției de îmbolnăvire, 3 degenerative sau de distrugere. O cantitate eficientă poate fi determinată pe o bază individuală și va fi bazată, în parte, pe cosiderația simptomelor care trebuie tratate și rezul- 5 țațelor observate. O cantitate eficientă poate fi determinată de către un specialist cu pregătire obișnuită în domeniu folosind factori și utilizând nu mai mult decât experimentarea de rutină. 7

Sistemul de lipozomi poate fi oricare dintr-o varietate de vezicule unilamelare, vezicule multilamelare, sau vezicule plurilamelare stabile și se poate prepara și administra 9 conform metodelor bine cunoscute celor cu pregătire în domeniu, de exemplu, în conformitate cu expunerile din brevetele US 5.169.637, US 4.762.915, US 5.000.958sau 11

US 5.185.154. Suplimentar, se poate dori să se exprime polipeptidele noi ale acestei invenții, precum și alte polipeptide selectate, ca lipoproteine, în scopul de a spori legarea lor la 13 lipozomi. Ca un exemplu, tratamentul căderii renale umane cu RetL încapsulată în lipozomi poate fi realizată in vivo prin introducerea unei RetL în celule care au nevoie de astfel de 15 tratament folosind lipozomi. Lipozomii pot fi eliberați prin intermediul cateterului la artera renală. Proteina RetL recombinantă este purificată, de exemplu, de la celule CHO prin 17 cromatografie de imunoafinitate sau orice altă metodă convenabilă, apoi amestecată cu lipozomi și încorporată în ei cu eficiență înaltă. Proteina încapsulată poate fi testată in vitro 19 pentru orice efect privind stimularea creșterii celulare.

Invenția are de asemenea în vedere că polipeptida nouă a acestei invenții se poate 21 administra la un animal prin intermediul sistemului de eliberare lipozomi în scopul de a intensifică stabilitatea și/sau imunogenicitatea lor. Eliberarea polipeptidelor noi prin inter- 23 mediul lipozomilor poate fi deosebit de avantajoasă deoarece lipozomii pot fi internalizați prin celule fagocitice în animalul tratat. Astfel de celule, după ingerarea membranei lipozomale 25 prezintă în continuare polipeptidele la sistemul imun în legătură cu alte molecule necesare pentru a provoca un răspuns imun puternic. Oricare dintre noile polipeptide RetL ale acestei 27 invenții se pot folosi sub forma unei sări acceptabilă farmaceutic. Acizi și baze adecvate care sunt capabile să formeze săruri cu polipeptidele prezentei invenții sunt bine cunoscute pentru 29 cei cu pregătire în domeniu și includ acizi și baze anorganice și organice.

Cu toate că invenția anterioară a fost descrisă în câteva detalii pe calea ilustrării și 31 exemplului pentru scopurile clarității și înțelegerii, va fi evident pentru un specialist cu pregătire în domeniu că anumite schimbări și modificări pot fi practicate în cuprinsul invenției, 33 fiind astfel limitată numai prin cuprinsul revendicărilor anexate.

Claims

35 Revendicări

1. Polipeptida ligand c-Ret, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde cel puțin

400 aminoacizi, având o secvență semnal N-terminală hidrofobă și o secvență C-terminală 39 hidrofobă, cuprinzând un motiv de legare fosfatidilinozitol glican și este selectată dintre secvențele de aminoacizi SEQ ID Nr:17 și SEQ ID Nr:21. 41
2. Polipeptidă definită la revendicarea 1, caracterizată prin aceea că este prelucrată prin îndepărtarea secvenței semnal N-terminală hidrofobe. 43
3. Acid nucleic izolat, care codifică pentru o polipeptidă ligand c-Ret, caracterizat prin aceea că are o secvență nucleotidică aleasă din grupul de secvențe SEQ ID Nr:16 și 45 SEQ ID Nr:20.

RO 120343 Β1

1
4. Acid nucleic, definit în revendicarea 3, caracterizat prin aceea că acesta codifică pentru o polipeptidă cu identitate de cel puțin 80% cu o secvență de aminoacizi aleasă din 3 grupul SEQ ID Nr:17 și SEQ ID Nr:21, în care respectiva polipeptidă interacționează cu o proteină receptor Ret pentru a declanșa dimerizarea proteinei receptor Ret sau auto5 fosforilarea unui domeniu al tirozin kinazei din proteina receptor Ret.
5. Acid nucleic, definit în revendicarea 3, caracterizat prin aceea că acesta codifică
7 pentru o polipeptidă cu identitate de cel puțin 90% cu o secvență de aminoacizi aleasă din grupul SEQ ID Nr:21, în care respectiva polipeptidă interacționează cu o proteină receptor
9 Ret pentru a declanșa dimerizarea proteinei receptor Ret sau autofosforilarea unui domeniu al tirozin-kinazei din proteina receptor Ret.