RO126765A2

RO126765A2 - Procedeu de obţinere a unui complex enzimatic hidrolitic cu o tulpină de trichoderma reesei

Info

Publication number: RO126765A2
Application number: ROA200900004A
Authority: RO
Inventors: Ştefana Jurcoane; Camelia Diguţă; Rădoi Florentina Matei; Vasilica Simion; Luminiţa Tcacenco; Alexandru Manoliu; Roming Florentina Israel
Original assignee: Asociaţia Centrul De Biotehnologii Microbiene
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2011-10-28

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un procedeu de obţinere a unui complex enzimatic hidrolitic, utilizat pentru degradarea materialelor lignocelulozice, producerea de combustibili din surse regenerabile etc., prin cultivarea submersă a 10% inocul vegetativ de Trichoderma reesei pe un mediu de cultură conţinând 2% uruială de porumb, 1% şrot de soia, 0,3% azotat de sodiu, 0,2% fosfat acid de potasiu, 0,1% sulfat de magneziu, 0,05% clorură de potasiu, 0,01% sulfat feros, la 30...31°C, sub agitare la 220 rpm, după care biomasa se separă şi lichidul enzimatic se concentrează prin ultrafiltrare, pe un modul cu un randament al activităţii amilolitice de 80...82%, celulozolitice de 88...90% şi xilanazice de 86...88%, rezultând un concentrat enzimatic ce se precipită cu sulfat de amoniu 70%, rezultând un preparat enzimatic brut.

Description

ț Data depozit......0.θ..~.θ1.'.20θΡ.

Invenția se refera la un procedeu de obținere a unui preparat enzimatic cu activitate celulozolitica din culturi de Tricoderma reesei, capabil sa hidrolizeze celuloza, hemiceluloza, amidonul, xilanul si alte polizaharide din plantele energetice(diferite varietati de porumb, griu, paie coceni, tulpini de Miscanthus giganteus etc.utilizate in fermentația anaeroba in producția de biogaz.

In prezent, sunt cunoscute si alte procedee de obținere a preparatelor celulozolitice prin cultivarea microorganismelor, in sistem discontinuu pe medii de cultura cu alte surse de carbon cum ar fi: glucoza, zaharoza, carboximetilceluloză etc. sau de azot: extract de porumb, săruri de amoniu etc., care induc formarea unui anumit tip de complex enzimatic conținând celulaze si hemicelulaze.

Este cunoscut faptul ca hidroliza completa a resturilor celulozice din plante si lemn este un proces dificil, nerezolvat pina in prezent, in special datorita structurii complexe a celulozei, dar si asocierii ei cu alti compuși (in special lignina). Pentu hidroliza acestora exista procedee fizice, chimice, enzimatice sau combinate. In prezent se utilizează diverse preparate enzimatice care, in funcție de enzimele componente, realizează diferite grade de hidroliza a materialelor lignocelulozice.

Problema pe care o rezolva invenția de fata este de a stabili succesiunea etapelor de procedeu, precum si a condițiilor tehnice de realizare a acestora astfel incit sa se obțină un preparat enzimatic hidrolitic complex, capabil sa degradeze componentele existente in plantele energetice, astfel incat, glucidele rezultate in urma hidrolizei sa conducă la marirea randamentului in biogaz, bioetanol.

Procedeul, conform invenției, consta in aceea ca cuprinde următoarele etape:

-cultivarea submersa, in sistem discontinuu a 10% , in volum, de inocul vegetativ de Tricoderma reesei înregistrata in Colecția de Microorganisme a Centrului de Biotehnologii Microbiene-Bucuresti sub nr. 28 pe un mediu de cultura ce conține, 2,0 % uruiala de porumb (știulete de porumb tocat integral pina la dimensiunea particulei de 0,5-1 mm), 1,0% srot de soia, 0,3% azotat de sodiu, 0,2 % fosfat acid de potasiu, 0,1% sulfat de magneziu, 0,05% clorura de potasiu, 0,01% sulfat de feros, procente in volum, in condiții de temperatura: 30-3 l°C, agitare constanta la 220 rpm, aer si presiune variabile, astfel incat conținutul de oxigen dizolvat in mediu sa nu scada sub 50% timp de 96 ore de la inoculare.

-prelucrarea mediului de cultura care include separarea biomasei si concentrarea prin ultrafiltrare a lichidului enzimatic pe un modul cu un randament al activitatii amilolitice de 80-82%, celulozolitice de 88-90% si xilanazice de 86-88%, rezultând un concentrat enzimatic din care la faza de condiționare prin precipitare cu sulfat de amoniu, la 70% saturație, se obține preparatul enzimatic brut de Trichoderma reesei, la un randament de 33% , de culoare alb gri, netoxic, cu activitate celulazica, amilazica si xilanazica după cum urmeaza:

- activitate celulazica specifica de 2,1 U/mg proteina

-activitate xilanazica specifica de 17,35 U/mg proteina

-activitate amilazica specifica de 2,66 U/mg proteina

Preparatul enzimatic obtinut este activ in domeniul de pH 5,5-6,5 si temperatura: 35-50°C.

.- 2 0 0 9 - 0 0 0 0 4 -Ο 6 -01- 2009

Prin aplicarea invenției se obține avantajul sintetizării unui preparat enzimatic complex, ce conține fracțiuni enzimatice active pentru hidroliza concomitenta a celulozei, xilanului si amidonului (pina la maltoza, glucoza) din materiale lignocelulozice (coceni, porumb integral, faina de porumb, paie etc.) utilizate in producția de biogaz (înainte de fermentația anaeroba).

Se prezintă, in continuare, un exemplu de realizare a invenției.

Exemplu

a) Cultivarea submersa in sistem discontinuu a tulpinii de Tricoderma reesei, înregistrata in Colecția de Microorganisme a Centrului de Biotehnologii Microbiene București, sub nr.28.

Intr-un bioreactor de 0,01 m , cu 0,007...0,008 m mediu de cultura care conține, in procente de volum, 2,0 % uruiala de porumb(stiulete de porumb tocat integral pina la dimensiunea particulei de 0,5-1 mm), 1,0% srot de soia, 0,3% azotat de sodiu, 0,2 % fosfat acid de potasiu, 0,1 % sulfat de magneziu, 0,05% clorura de potasiu,0,01% sulfat de feros, cu pH-ul inițial de 5,5, se insaminteaza un inocul vegetativ de Tricoderma reesei, in proporție de 10%(inoculul s-a dezvoltat pe mediu PDB (Potato Dextrose Broth), timp de 48 ore, cu agitare de 220 rpm la 28°C.Cultivarea se efectuează timp de 90-96 de ore (agitare 220 rpm), aerare si presiune variabile pe parcursul bioprocesului si anume: 1,0-1,2 I aer/min, astfel incat, conținutul in oxigen sa nu scada sub 50%.

Preinoculul a constat dintr-o suspensie de spori a tulpinii fungice Tricoderma reesei utilizate, bine dezvoltate pe mediu PDA(Potato Dextrose Agar), timp de 7 zile la 28°C.

b)Prelucrarea mediului de cultura

La sfirsitul bioprocesului după 90-96 ore cultivare a producătorului se efectuează prelucrarea mediului de cultura in următoarele faze:

bl )Separarea biomasei de Tricoderma reesei prin filtrare pe filtru Nutsche, cu adaugare de adjuvant de filtrare 0,1 %(Perlita), viteza medie de filtrare 30 l/m²/h b2)Concentrare prin ultrafiltrare a lichidului de cultura rezultat din faza de separare a biomasei, utilizând un modul Pellicon Standard(Millipore Corpjechipat cu o caseta de membrane polisulfonice de tip PTGC 00005(limita de excludere NMWL10 kDa), realizind o concentrare de pana la 5...10 ori a filtratului cu un randament de

82...90%, rezultând concentratul enzimatic hidrolitic lichid.

b3)Condidonarea concentratului enzimatic hidrolitic lichid se realizează prin precipitare cu sulfat de amoniu, la 70% saturație; precipitatul se separa prin centrifugare si se usucă sub vid, obtinandu-se preparatul enzimatic brut, sub forma unei pulberi de culoare alb- gri, netoxic, cu activitate celulazica specifica(2,lU/mg), amilazica specifica(2,66U/mg) si xilanazica specifica(17,35U/mg) , activ in domeniul de pH 5,5-6,5 si temperatura:35-50°C, lipsit de toxicitate la testele efectuate pe animale de ferma.

Produsul obtinut prin procedeul descris in invenție permite obținerea unor preparate polienzimatice care conțin in principal celulaze, amilaze, xilanaze, care pot fi utilizate la hidroliza plantelor energetice(in vederea obținerii de biocombustibili cum ar fi biogazul sau bioetanolul) si in zootehnie la alcătuirea premixurilor.

Claims

Revendicare

Procedeu de obținere a unui preparat enzimatic hidrolitic (celulaze, amilaze, xilanaze) din culturi de Tricoderma reesei, caracterizat prin aceea ca, cuprinde următoarele etape:

-cultivarea submersa, in sistem discontinuu a 10% , in volum, de inocul vegetativ de Tricoderma reesei înregistrata in Colecția de Microorganisme a Centrului de Biotehnologii Microbiene-Bucuresti sub nr. 28 pe un mediu de cultura ce conține, 2,0 % uruiala de porumb (știulete de porumb tocat integral pina la dimensiunea particulei de 0,5-1 mm), 1,0% srot de soia, 0,3% azotat de sodiu, 0,2 % fosfat acid de potasiu, 0,1% sulfat de magneziu, 0,05% clorura de potasiu, 0,01 % sulfat de feros, procente in volum, in condiții de temperatura: 30-31°C, agitare constanta la 220 rpm, aer si presiune variabile, astfel incat conținutul de oxigen dizolvat in mediu sa nu scada sub 50% timp de 96 ore de la inoculare.

-prelucrarea mediului de cultura care include separarea biomasei si concentrarea prin ultrafiltrare a lichidului enzimatic pe un modul cu un randament al activitatii amilolitice de 80-82%, celulozolitice de 88-90% si xilanazice de 86-88%, rezultând un concentrat enzimatic din care la faza de condiționare prin precipitare cu sulfat de amoniu, la 70% saturație, se obține preparatul enzimatic brut de Trichoderma reesei, la un randament de 33% , de culoare alb gri, netoxic, cu activitate celulazica, amilazica si xilanazica după cum urmeaza:

- activitate celulazica specifica de 2,1 U/mg proteina

-activitate xilanazica specifica de 17,35 U/mg proteina

-activitate amilazica specifica de 2,66 U/mg proteina

Preparatul enzimatic obtinut este activ in domeniul de pH 5,5-6,5 si temperatura: 35-50°C.