RO127469B1 - Tulpină de serratia plymuthica cu acţiune antagonică faţă de fitopatogenii plantelor de cultură - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o tulpină de Serratia plymuthica, cu acțiuni benefice multiple asupra plantelor de cultură, izolată din rizosfera de grâu, destinată aplicării ca bioinoculant pentru protecția culturilor agricole și pentru biofortifierea recoltei de cerealeboabe în zonele cu deficit de seleniu.

Sunt cunoscute o serie întreagă de tulpini de Serratia, care sunt utile pentru protecția plantelor de cultură împotriva agenților dăunători. US 5869038 descrie tulpini de Serratia (Serratia plymuthica CL43, depozitată la Național Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria, cu numărul NCIMB 40493, și Serratia liquefaciens CL 80 NCIMB 40492) care protejează legumele frunzoase (salată, varză) împotriva ciupercilor producătoare de putregaiuri (Botrytis cinerea, Alternaria brassicola). US 6660263 prezintă tulpina Serratia martescens MSU-97 (înregistrată la Centraalbureau voor Schimmel Cultures, cu numărul CBS 112860), producătoare de oocidină și care este activă față de o serie de ciuperci fitopatogene din sol. WO/2004/049808 expune tulpina de Serratia marcescens PRI-2A (depozitată la Centraalbureau voorSchimmelcultures, cu numărul CBS 110243), care este activă față de următoarele categorii de agenți dăunători: bacterii fitopatogene din genul Ralstonia; ciuperci fitopatogene (Rhizoctonia solani); insecte (tripși, ca de ex. Frankliniella occidentalis); acarieni (Tetranychus urticae). Cererea de brevet US 2003/0130121 A1 se referă la tulpina A153 de Serratia plymuthica (depozitată la Național Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria NCIMB, cu numărul 40398), care produce haterumalide A, B, E și X (și derivați) și care inhibă creșterea unor ciuperci fitopatogene ca Sclerotinia sclerotiorum și a unor buruieni: Chaenopodium album, Thlapsi arvensis, Stellaria media, Fumaria officinalis.

Nu s-au descris până în prezent tulpini de Serratia care să prezinte concomitent antagonism față de fitopatogeni și capacitate de a stimula preluarea microelementelor de către plante, în special, seleniu.

Niciuna dintre tulpinile de Serratia, revendicate prin brevetele din literatura de specialitate, nu prezintă descrieri privind inocuitatea pentru organisme nețintă, deși o serie de tulpini din genul Serratia s-au dovedit a fi patogeni oportuniști pentru om (Eisenstein, 2009, cap. 225, Enterobacteriaceae, Mandell, G. L., Douglas, R. G., Bennett, J. E., Eds. Phnciples and practice ofinfectious disease, ediția a 7-a, Elsevier Scientific, Oxford, 2009, pg. 1848...1860). Patogenitatea pentru om este datorată producerii de hemolizine (Kurz et al., 2003, The EMBO Journal, 22:1451-1460, Shimuta et al., 2009, BMC Microbiology, 9:261), astfel încât caracterizarea tulpinilor de Serratia, propuse pentru utilizare în agricultură, ar trebui să includă teste de inocuitate pentru organisme - nețintă.

Tulpina de Serratia plymuthica, Ps33, înregistrată la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapesta, cu numărul NCAIM (P) B001366, conform invenției, are acțiune de protecție in vivo a plantelor de cultură față de ciupercile fitopatogene de sol Rhizoctonia solani, Alternaria, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia bataticola, Verticillium dahliae, și acțiunii antagoniste față de bacteriile care afectează pomii fructiferi la înflorit, Erwinia amylovora, pseudomonasuri ice⁺ prezintă mobilitate ridicată și formează biofilme, colonizând suprafețele organelor plantelor și rezistând la factorii adverși de mediu, stimulează dezvoltarea plantelor de grâu, datorită producerii de compuși volatili și solubilizării fosforului, biodisponibilizează seleniul pentru plantele de grâu și porumb, și favorizează acumularea seleniului în boabele de grâu.

Tulpina de Serratia plymuthica Ps33, descrisă în prezenta invenție, prezintă următoarele avantaje:

- creșterea abundentă pe mediile uzual folosite pentru cultivarea proteobacteriilor;

RO 127469 Β1

- mobilitatea ridicată, care permite colonizarea rapidă a diferitelor suprafețe ale 1 organelor plantelor;

- formarea de structuri de tip biofilme pe diferitele suprafețe (inclusiv pe cele 3 delimitate de organele subterane ale plantelor), ceea ce asigură o mai mare rezistență față de factorii de mediu și, implicit, o competență saprofitică superioară în rizosferă; 5

- antagonism pentru o serie de ciuperci fitopatogene de sol, ceea ce permite folosirea, ca bioinoculant, pentru protecția primelor stadii ale plantelor de cultură față de 7 acești agenți fitopatogeni de sol;

- antagonism pentru bacteriile care produc boli în timpul înfloritului (Erwinia 9 amylovora, Pseudomonas ice⁺);

- producerea de compuși volatili care stimulează creșterea plantelor; îmbunătățirea 11 nutriției plantelor prin solubilizarea fosforului insolubil anorganic prin producere de acizi organici, solubilizarea fosforului insolubil organic (săruri ale acidului fitic) prin producere de 13 fitaze, biodisponibilizarea seleniului și stimularea preluării și acumulării acestuia de către plantele de grâu și porumb. 15

Tulpina descrisă în prezenta invenție, înregistrată la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapesta, cu numărul NCAIM (P) B 001366, are acțiuni 17 benefice multiple asupra plantelor de cultură, inclusiv de protecție față de anumiți agenți fitopatogeni și de stimulare a preluării seleniului de către plantele de grâu și porumb, și nu 19 prezintă patogenitate pentru organisme nețintă.

Prezenta invenție se ilustrează cu exemplul prezent mai jos.21

Exemplu. Tulpina Ps33 de Serratia plymuthica a fost obținută la Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București, din rizosferă unor plante de grâu 23 (Triticum aestivum cv. Boema).

Pentru izolare, s-a folosit mediul Nutrient agar, cu următoarea compoziție: peptonă -25 g, beef extract - 3 g, agar-18 g, la 1000 ml apă distilată; pH 6,8...7,2. Purificarea bacteriei s-a realizat pe mediul Luria-Bertani (LB), agarizat cu următoarea compoziție: bactotriptonă -27 g, extract de drojdii - 5 g, NaCI 5 g, agar 15 g, apă distilată până la 1000 ml, pH corectat la 7,4 cu soluții de NaOH 5 M sau HCI 1 M. Pentru cultivare, s-a folosit mediul LB lichid,29 bacteriile fiind crescute 1...2 zile, la temperatura de 28°C.

Această tulpină a fost selectată dintr-o colecție de peste 150 izolate de bacili gram- 31 negativi, pe baza:

- acțiunii antagoniste in vitro și a acțiunii de protecție in vivo a plantelor de cultură față 33 de ciupercile fitopatogene de sol (Rhizoctonia solani, Alternaria, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum, 35 Sclerotinia bataticola, Verticillium dahliae);

- acțiunii antagoniste in vitro și in situ față de bacteriile care afectează pomii fructiferi 37 la înflorit (Erwinia amylovora, pseudomonasuri ice⁺);

- producerii de compuși volatili cu acțiune de stimulare a creșterii plantelor;39

- acțiunii de solubilizare a fosforului din formele sale insolubile, organice și anorganice;41

- acțiunii de stimulare a germinației grâului și dezvoltării plantulelor de grâu, ca și de stimulare a preluării și a acumulării seleniului de către plantele de grâu și de porumb;43

- inocuitate în testul pe Galleria mellonella.

în vederea încadrării taxonomice, tulpina Ps33 a fost caracterizată din punct de 45 vedere morfologic (tabelul 1), biochimic-fiziologic (tabelul 2) și pe baza secvenței 16SrADN (tabelul 3).47

RO 127469 Β1

Tabelul 1

Morfologia coloniilor și a celulelor de Serratia plymuthica Ps33 pe mediul LB agarizat, după cultivare timp de 24 h

Caractere morfologice specifice pentru Serratia plymuthica Ps33
Colonia	forma: circulară
aspectul suprafeței: netedă, convexă
transparența: translucidă
culoarea: alb-gălbui
Celule	forma: bastonaș
dimensiuni: 0,5...0,8 x 0,9... 2,0 pm
aranjament flagelar: peritrich

Tabelul 2

Caracteristicile fiziologice ale tulpinii Ps33

Testul biochimic	Ps 33
Reacția Gram	-
Reacția VogesProskauer	+
Hidroliza amidonului	+
Hidroliza gelatinei	+
Reducerea NO3->NO,	+
Creștere anaerobă	-
Chitinază	+
Oxidază	-
Pectinază	-
Catalaza	+
Lecitinază	+
Sursa de carbon: - adonitol
- arabinoză	+
- meliboză	+
- D-arabitol	-
- trehaloza	+
- za ha roza	+
- maltoza	+
- glucoza	+
- xiloza	+
-manoza	+
- fructoza	+
- sorbitol	+
- manitol	+
- inozitol	+
- glicerol	+
- meso-eritritol	-
Acidifică: - adonitol
- glucoza	+
- za ha roza	+
- maltoza	+
- fructoza	+
- arabinoză	+
- manitol	+
- rafinoza	+
- celobioza	+
- ramnoza	-
- sorbitol	-

RO 127469 Β1

Identificarea pe baza secvenței 16S rADN s-a realizat prin aplicarea unui protocol de lucru, caracterizat prin următoarele etape: obținerea de culturi pure - colonii izolate, tehnica însămânțării prin epuizarea ansei; extracția ADN-ului bacterian; electroforeză în gel pentru detectarea ADN-ului; amplificarea secvenței 16S rADN prin tehnica PCR și electroforeză în gel; purificarea ADN-ului ribozomal; precipitarea și uscarea ADN-ului ribozomal. Secvențierea nucleotidică a fost realizată cu metoda Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer, 1998), folosind un secvențiator automat de tip ABI PRISM 310 (Perkin Elmer). Secvențele au fost analizate folosind programul CHROMAS 2.33 (Technelysium Pty Ltd). Compararea secvențelor 16S rADN obținute cu secvențele existente în Banca de gene NCBI (Național Center for Biotechnology Information) s-a realizat cu ajutorul programului BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Pe baza secvenței de 1299 perechi baze din secvența 16S rADN, tulpina Ps33 prezintă o asemănare de 99,92% cu tulpina Serratia plymuthica G3, izolată din rizosfera de grâu, număr de acces EU344964, respectiv, 99,84% cu tulpina Serratia plymuthica AY394724, înalt producătoare de biofilme (Van Houdt et al, 2005, FEMS Microbiol. Lett. 15, 246:265-272). Secvența 16S rADN a tulpinii Ps33 a fost depusă la NCBI, GenBank, cu numărul EU1181134.

Tabelul 3

Secvența 16 S rADN pentru tulpina Ps33 de Serratia plymuthica

Tulpina

Compoziția nucleotidică a secvenței 16S rADN

Ps33

GGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGG AGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCTACGGA CCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACGCCATCAGATGTGCCCAGATGG GATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCT GGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATG CAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCACTTTCA GCGAGGAGGAAGGGTAATGTGTTAATAGCACATTGCATTGACGTTACTCGC AGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTT GTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGCGCTTAACGTGGGAACTGCATTTGAAA CTGGCAAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG GACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCT TGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTA CGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTG ACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGA CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGA ACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTA TACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTC GTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG

RO 127469 Β1

Testarea activității antagoniste in vitro a tulpinii Ps33 a fost efectuată pe mediul cu cartof dextroză agar (CGA). Tulpina Ps33 (dintr-o cultură de 24 h) a fost însămânțată pe mediu prin strierea cu ansa a unei linii drepte o distanță de 3 cm de o rondea calibrată de miceliu (5 mm) din cele opt ciuperci studiate. Plăcile Petri astfel însămânțate au fost incubate la 28°C și analizate în ceea ce privește zona de inhibiție (mm) la 24, 48 și 72 h. Experiența a fost repetată de trei ori. Rezultatele (tabelul 4) au demonstrat că tulpina Ps33 produce metaboliți antifungici, care au inhibat dezvoltarea tuturor ciupercilor luate în studiu. Cea mai mare zonă de inhibiție s-a înregistrat față de ciupercile producătoare de mucegaiuri Botrytis cinerea (7 mm), Sclerotinia sclerotiorum (6 mm) și Sclerotinia bataticola (5 mm). Acțiunea biologică este semnificativă și față de R. solani (4 mm), Verticillium dahliae (4 mm), F. oxisporumf. sp. radicislycopersici (3,5 mm). Bacteria prezintă un antagonism moderat și față de Fusarium graminearum (2,5 mm) și Alternaria spp (1,5 mm).

Tabelul 4

Testarea in vitro a activității antagoniste a tulpinii de Serratia plymuthica Ps33 asupra creșterii miceliene a unor ciuperci fitopatogene (zona de inhibiție la 72 h, mm)*

Ciuperca fitopatogenă	Zona de inhibiție (mm) indusă de tulpina Ps33
Rhizoctonia solani	4
AltQrnaria spp.	1,5
Fusarium graminearum	2,5
Fusarium oxisporum f. sp. radicislycopersici	3,5
Sclerotinia sclerotiorum	6
Sclerotium bataticola	5
Botrytis cinerea	7
Verticillium dahliae	4

*media a 5 determinări

Tulpina Ps33 a fost testată în condiții controlate, în ceea ce privește eficacitatea în combaterea ciupercilor fitopatogene de sol (Rhizoctonia solani, Pythium ultimum, Fusarium oxisporum, Sclerotinia sclerotiorum și Sclerotium bataticola), care atacă frecvent în stadiul de plantulă și produc pagube. Pentru efectuarea testului, s-au utilizat semințe de tomate (Lycopersicon esculentum), cv. Unirea. Semințele dezinfectate în prealabil cu soluție 4% hipoclorit, au fost imersate într-un amestec constând din suspensie celulară bacteriană cu titrul de 1 x 10⁹ ufc/ ml și 1 % metilceluloză în tampon fosfat (w/v). Ciupercile fitopatogene au fost crescute pe mediul CGA (Difco), în scopul obținerii unei creșteri uniforme a miceliului. După incubare 4...5 zile, la28°C, miceliul a fost mărunții și utilizat pentru inocularea a 200 ml mediu Czapec-Dox(CDA, Difco), distribuit în flacoane Erlenmeyer. Flacoanele însămânțate au fost incubate timp de 4-5 zile la 28°C. Sporii au fost separați de miceliu prin filtrare, utilizând o pânză sterilă. Semințele de tomate bacterizate au fost semănate în pungi din material plastic sterile (cyg - Mega Internațional) și plasate în camera de creștere, în condiții de temperatură și umiditate corespunzătoare (21...23°C, 70% umiditate relativă). Fiecare pungă a fost umectată cu 2 ml soluție nutritivă Hoaghland, infectată cu spori în concentrație de 10⁶ spori/litru soluție. în variantele martor netratat, pentru umectare, s-a utilizat doar soluție nutritivă Hoaghland. Semințele din varianta martor chimic au fost tratate cu Tiradin 70 PU (doză echivalentă a 4 g/kg). Pungile au fost reumectate la fiecare două zile, pe parcursul a patru săptămâni, folosindu-se pentru reumectare soluții nutritive sterile.

RO 127469 Β1

După patru săptămâni, plantele au fost analizate în privința simptomelor caracteristice 1 fiecărei boli, cu precădere brunificarea coletului și a părții superioare a rădăcinilor. Eficacitatea tratamentului cu tulpina Ps33 de Serratia plymuthica în combaterea bolilor 3 complexului de răsărire la tomate este prezentată în tabelul 5.

Tabelul 5

Eficacitatea tulpinii Ps33 în combaterea bolilor complexului de răsărire la cultura de 7 tomate (cv. Unirea)

Varianta de tratament	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitate a (%)	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitatea (%)	% Plante sănătoase răsărite	Eficacitatea (%)
Inocul fungic	R.F.R*	S. s.*	S.b.*
Martor netratat	45	-	50	-	53
Tiradin 70 PU (4 g/kg)	93	87	98	96	90	79
Ps33	95	89	98	96	88	74

R.F.P. - Rhizoctonia solarii- Fusarium oxysporum- Pythium ultimum; S.s.-Sclerotinia sclerotiorum; S.b.- 17

Sclerotium bataticola.

Tratamentul semințelor cu tulpina Ps33 a determinat obținerea unei eficacități mai mari (89%) în varianta infectată cu complexul ciupercilor fitopatogene de sol R.F.P. decât 21 cea obținută în varianta tratată cu Tiradin (87%). Tulpina testată prezintă o semnificativă acțiune de protecție a plantelor de cultură față de ciupercile fitopatogene de sol. 23

S-a demonstrate că bacteriile Ps33 prezintă antagonism in vitro și in situ și față de bacteriile care afectează pomii fructiferi la înflorit (Erwinia amylovora, Pseudomonas ice⁺). 25 Testul in vitro s-a efectuat pe mediul LB agarizat. Tulpinile fitopatogene folosite au fostE. amylovora NCAIM B01108 și Pseudomonas syhngae ATCC 53543. Tulpinile, împros- 27 pătate cu 24 h înainte de efectuarea testului, au fost însămânțate simultan în plăci Petri cu mediu LB agarizat, tulpinile fitopatogene fiind striate pe mijlocul plăcii, iar tulpina Ps33 de 29 Serratia plymuthica perpendicular, la o distanță de 2 mm. Plăcile au fost incubate la 28°C, timp de 24.. .48 h. Testul a fost repetat de cinci ori. Rezultatul pozitiv s-a apreciat prin apariția 31 zonelor de inhibiție. Tulpina Pss 33 a inhibat in vitro creșterea fitopatogenilor care afectează pomii fructiferi la înflorit (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae ice+). 33

Testul in situ s-a realizat prin determinarea interacțiiior microbiene pe flori detașate.

Modelul experimental utilizat a fost cel al florilor izolate (Pusey, 1997). Ramuri de măr cu 35 muguri au fost tăiate din copaci, cu 4...5 zile înainte de înflorit și depuse la4°C, cu baza imersată în apă. La startul experimentelor, ramurile au fost scoase de la frigider și menținute la 37 temperatura camerei (2O...23°C). Mugurii florali s-au deschis în două zile. Conform protocolului, florile deschise (petalele și anterele roșii) au fost prelevate cu pedunculul intact 39 (1,5 cm lungime) și plasate în tuburi de microcentrifugă, cu capătul bazai al pedunculului scufundat într-o soluție sterilă de 20% zaharoză. Peste florile astfel pregătite, au fost pulveri- 41 zate suspensii 10⁶ ufc/ml din tulpinile antagoniste testate. Suspensiile au fost preparate în tampon fosfat 10 mM cu 0,03% Tween 20. Tuburile Eppendorf au fost depuse în rack-uri, iar 43 rack-urile cu flori inoculate au fost transferate în cutii din plastic de 10 I, pe al căror fund era depozitată o soluție de glicerină 40% (pentru menținerea unei umidități de 93...94%). 45

Concomitent cu tratamentul cu bacterii antagoniste (în funcție de varianta testată), peste florile detașate, s-a adăugat o suspensie 10⁶ ufc bacterii fitopatogene (Erwinia amylovora 47

RO 127469 Β1

NCAIM Β 01108 și Pseudomonas syringae ATCC 53543). S-a incubat la 20°C (Envinia amylovora) sau la 0°C (bacteriile care nuclează gheață). După 24 h, s-au făcut notări de eficacitate, conform unei scări de eficacitate, cu note de la 0 la 5, conform următoarei scări: 0-distrugere totală a florilor; 1 - 80...90% dintre flori distruse; 2-60...80% dintre flori distruse; 2 - 40...60% dintre flori distruse; 3 - 20...40% dintre flori distruse; 5 - 0...20% dintre flori distruse.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6, comparativ pentru Serratia plymuthica Ps33 cu alte tulpini din colecția de lucru. Aceste rezultate demonstrează o foarte bună eficacitate in situ a tulpinii Ps33 în combaterea bacteriilor care afectează pomii fructiferi la înflorit.

Tabelul 6

Acțiunea biologică in situ față de bacteriile care afectează pomii fructiferi la înflorit

Codificare	Tulpina	Eficacitate in situ față de E. amylovora3	Eficacitate în situ față de P. syringae ice+b
P10	Pseudomonas sp. (posibil P. aeruginosa)	3	2
P11	Pseudomonas sp.	2	2
P14	Pseudomonas sp. (posibil P. aeruginosa)	1	3
P18	Pseudomonas sp.	2	4
P20	Pseudomonas fluorescens	3	1
P22	Pseudomonas fluorescens ATCC 13525	4	3
P23	Pseudomonas putida ATCC 49128	4	1
Bw	Bacillus sp.	2	3
BCPC	Bacillus sp.	3	4
B40	B. licheniformis	4	1
B2R	B. subtilis	4	2
B005	B. subtilis	3	2
B30	B. subtilis	4	5
Loblb	B. subtilis	2	1
Sal1	B. subtilis	3	3
R3P5M	Bacillus sp.	3	2
R6P4G	Bacillus sp.	2	1
R9P7M	Bacillus sp.	1	2
R11P5M	Bacillus sp.	0	2
R3P5P	Bacillus sp.	1	2
Ps33	Serratia plymuthica	5	4

a, b) notări de la 0 la 5, conform următoarei scări: 0 - distrugere totală a florilor; 1 - 80... 90% dintre flori distruse;

2- 60 ... 80% dintre flori distruse; 3 - 40,. 60% dintre flori distruse; 4 - 20...40% dintre flori distruse; 5 - 0...20% dintre flori distruse.

Rezultatele prezentate mai sus demonstrează o activitate superioară în cadrul testelor in vivo și in situ față de testele in vitro. Această caracteristică este explicată de capacitatea ridicată a bacteriilor din genul Serratia de a forma biofilme pe organele subterane ale plantelor (Liu et al, 2007, FEMS Microbiol. Lett. 270, 299...305). Capacitatea de a forma biofilme este dependentă de sensibilitatea de grup, mediată de semnalele AHL (Van Houdt et al., 2007, FEMS Microbiol. Rev. 31, 407-424). S-au realizat diferite teste, pentru a se determina producerea de semnale QS (AHL) de către bacteriile Serratia plymuthica Ps33 și producerea de biofilme pe diferite suprafețe.

RO 127469 Β1

Pentru evidențierea moleculelor implicate în sensibilitatea de grup (quorum sensing), 1 s-au folosit două tulpini biosenzor, Chromobacterium violaceum CV026 și A. tumefaciens NT1. 3

Tulpina mutantă CV026 a fost obținută din tulpina sălbatică Chromobacterium violaceum ATCC 31532 și este folosită ca biosenzor pentru detectarea moleculelor de tip 5 AHL. Chromobacterium violaceum CV026 produce pigmenți de culoare violetă, numiți violesceină, doar atunci când în mediu sunt prezente molecule de N-acil-homoserin-lactonă 7 (AHL), care au lungimea grupei de acil între C₄ și C₈.

Agrobacterium tumefaciens NT1 este o bacterie mutantă, obținută din tulpina 9 sălbatică, prin fuzionarea genei Tra cu gena LacZ. Astfel gena LacZ nu mai poate sintetiza molecule de AHL și astfel nu poate fi activată enzima B-galactozidază. Prin urmare, X-galul 11 prezentă în mediu nu poate fi descompusă de către Agrobacterium tumefaciens NT1, și astfel mediul nu se decolorează. Dacă AHL este prezent în mediu (de exemplu, fiind 13 sintetizată de alte bacterii), atunci apare o culoare albastru-verzui. Tulpina biosenzor de A. tumefaciens NT 1 produce pigmenți de culoare verzuie-albăstruie, doar atunci când în mediu 15 sunt detectate molecule de N-acil-homoserin-lactonă (AHL), care au lungimea grupei de acil între C₄ și C₁₂. 17

Tulpina Ps33 de Serratia plymuthica și tulpinile biosenzor CV026 și NT1 au fost împrospătate pe mediul agarizat Luria-Bertani (10 g bacto-triptonă, 5 g extract de drojdii, 10 19 g NaCI, 20 g agar-agar, pH 7,2, sterilizat 20 min, la 121°C), cu 24 h înainte de utilizare. în cazul tulpinilor biosenzor, mediul LB s-a suplimentat cu cloramfenicol (concentrație finală de 21 pg/ml) sau kanamicină (concentrație finală de 50 pg/ml).

Testul propriu-zis a constatîn trasarea unui striu, în centrul unei plăci Petri, cu tulpina 23 biosenzor CV026 sau NT1,apoi, perpendicular pe aceasta, s-a striat tulpina Ps33, la o distanță de 3 mm față de tulpina martor. Plăcile s-au incubat la 28°C și au fost analizate la 25 24 h. Apariția culorii violet în zona de creștere a tulpinii Cv026, respectiv, a culorii verzi în zona de creștere a tulpinii NT1, a indicat prezența moleculelor de acil-homoserin-lactonă, 27 produse de tulpina Ps33. Testul a fost repetat de trei ori, cu ambele tulpini biosenzor. De fiecare dată, s-a evidențiat apariția culorii specifice diferitelor tulpini biosenzor, fapt care 29 demosntrează producerea de către tulpina Ps33 de molecule de N-acil-homoserin-lactonă (AHL), care au lungimea grupei acil între C₄ și C₁₂. 31

Capacitatea de formare de biofilme in vitro a fost analizată prin metoda spectrofotometrică. Bacteriile Ps33 au fost crescute pe mediul lichid LB, la 28°C, până la atingerea unei 33 densități optice OD₅₉₅=2.0. Aceste culturi s-au transferat apoi aseptic pe plăci de microtitrare cu 96 de godeuri, cu opt repetiții din fiecare tip de tulpină testată. 35

Plăcile s-au incubat la 25°C, pentru 24 h. Turbiditatea celulelor se determină folosind un reader de plăci de microtitrare. După perioada de incubare de 24 h, mediul lichid s-a 37 spălat de trei ori cu apă sterilă, pentru a se îndepărta bacteriile slab asociate. Plăcile s-au uscat la temperatura camerei, timp de 45 min, după care s-a colorat fiecare godeu cu o 39 soluție de 0,1 % de verde de malachit, timp de 20 min. S-a spălat colorantul de trei ori cu apă sterilă și s-a observat biofilmul colorat în verde. Analiza cantitativă s-a realizat prin spălarea 41 colorantului cu etanol și cuantificarea prezenței verdelui de malachit cu reader de plăci de microtitrare la 630 nm (verdele de malachit având absorbantă maximă la 620 nm). 43

Rezultatele obținute pentru diferite tulpini testate sunt prezentate în tabelul 7, comparativ pentru tulpina Ps33 și pentru alte izolate testate. Se remarcă faptul că tulpina Ps33 produce 45 o cantitate semnificativă de biofilm in vitro.

RO 127469 Β1

Tabelul 7

Valorile absorbantei colorantului verde de malachit, eliberat din biofilmele formate pe pereții godeurilor din placa de microtitrare

Nr.	Martor	112	116	115	KG16	Ps33	Ps23	Ps43	B60	B92	B34	B52
1	0,05	0,17	0,09	0,23	0,13	0,48	0,16	0,32	0,33	0,12	0,45	0,37
2	0,04	0,12	0,07	0,18	0,08	0,54	0,05	0,35	0,32	0,15	0,42	0,39
3	0,07	0,1	0,13	0,21	0,09	0,56	0,11	0,22	0,3	0,13	0,27	0,38
4	0,05	0,12	0,09	0,11	0,1	0,52	0,07	0,31	0,29	0,13	0,42	0,4
5	0,08	0,09	0,1	0,14	0,09	0,47	0,12	0,29	0,26	0,12	0,37	0,33
6	0,06	0,05	0,07	0,18	0,07	0,55	0,07	0,21	0,33	0,1	0,25	0,26
7	0,07	0,13	0,1	0,15	0,09	0,54	0,12	0,2	0,31	0,12	0,34	0,33
8	0,08	0,2	1,12	0,25	0,1	0,58	0,19	0,33	0,29	0,22	0,39	0,33
medie	0,06	0,12	0,22	0,18	0,09	0,53	0,11	0,28	0,30	0,14	0,36	0,35

Pentru testarea producerii in situ de biofilme, s-a lucrat pe varianta determinării biofilmului format pe nisip. într-o placă cu 24 godeuri, s-au adăugat 0,5 ml de nisip steril (granulațiefină, 0,2...0,4 mm). Peste acest nisip, s-au adus 0,5 ml suspensie bacteriană, preparată ca mai jos. Bacteriile Ps33 s-au crescut pe mediul LB, până la atingerea unei D0₆₀₀ = 2,0. S-a spălat și s-a resuspendat în același mediu. S-a incubat la 28°C. După 48 h, s-au prelevat aseptic 0,1 ml de amestec nisip - mediu de cultură, s-au adus într-un tub de centrifugă steril, cu masă cunoscută, s-a centrifugat și s-a îndepărtat aseptic supernatantul. S-a cântărit nisipul depus centrifugal în fiecare dintre cele 24 tuburi de centrifugă. S-au adăugat apoi 0,15 ml soluție 10 mM MgSO₄ în toate tuburile și s-a vortexat. Din supernatantul în care s-au reluat bacteriile, s-a determinat numărul de ufc, prin tehnica diluțiilor.

Tulpina Ps33 de Serratia plymuthica a fost comparată din punct de vedere al capacității de formare biofilme cu tulpina HRO-C48 (= DSMZ 12502), tulpină recunoscută pentru capacitatea de protecție a rizosferei plantelor prin formare de biofilme (Liu et al, 2007, FEMS Microbiol. Lett. 270, 299...305). Din tulpina Ps33, s-au recuperat 7,5.10⁸± 1,1.10⁷ ufc g^_1 de nisip, comparativ cu 2,8 .10⁸ ± 5,2.10⁷ ufc, pentru tulpina HRO-C48.

Pentru testarea capacității de formare de biofilme in situ pe organele plantei, s-a lucrat cu testul reizolării de pe rădăcinuțele plantulelor de grâu. Bacteriile au fost cultivate peste noapte, pe mediul lichid LB. S-a normalizat suspensia la 2.10⁸ ufc/ml cu mediu LB steril, iar din această suspensie, s-au depus 10 μΙ pe rădăcinuțele unor plante de grâu gnotobiotice (provenite din substanțe de grâu dezinfectate la suprafață, germinate timp de 5 zile, în condiții aseptice). Depunerea s-a realizat pe colet, la marginea dintre rădăcinuță și cotiledon. S-a incubat timp de 24 h, după care rădăcinuță a fost detașată steril din plantulă și depusă aseptic într-un tub de centrifugă. Peste rădăcinuță, s-au adăugat 0, 15 ml soluție 10 mM MgSO₄ și s-a vortexat pentru 5 min. Supernatantul s-a reluat prin sucțiune, iar rădăcinuța a fost extrasă din tubul de centrifugă și fost uscată prin depunere aseptică pe hârtie de filtru sterilă. Rădăcinuță uscată a fost depusă aseptic pe mediul semisolid CM-agaroză (10 g/l casaminoacizi, 10 g/l manitol, 3 g/l agaroză), suplimentat cu 10 ml soluție sterilă nutritivă. Soluția sterilă nutritivă a fost obținută prin diluarea de 100 ori a unei soluții stoc (H metal) și sterilizarea prin filtrare. Pentru obținerea a 200 ml de soluție stoc H metal, s-a procedat după cum urmează. S-au obținut 100 ml soluție de lucru prin diluare de 500 ori a unei soluții stoc care conținea: 1,5 g CaCI₂ · ₂H₂O, dizolvată mai întâi, 50 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0.5 g MnSO₄ · H₂O, 100 mg CoCI₂ · 6H₂O, 100 mg Na₂MoO₄ · 2H₂O, 50 mg CuSO₄ · 5H₂O, 50 mg ZnSO₄ · 7H₂O și 20 mg H₃BO₃. La cei 100 ml din această soluție, s-au adăugat 50 mg FeSO₄ · 7H₂O și 50 mg acid ascorbic.

RO 127469 Β1

Din rădăcinuțe, s-au obținut colonii dendritice, al căror aspect specific demonstrează 1 existența unor caracteristici de mobilitate asociate formării de biofilme pe organele subterane ale plantelor de cultură. 3

Tulpina Ps33 a fost testată în ceea ce privește mobilitatea de migrare la suprafața agarului (swimming) și de agregare (swarming). Ca martor, a fost utilizată o tulpină 5 modificată genetic pentru a fi imobilă, P. putida PCL1760 (Validov, 2007). Bacteria a fost împrospătată pe mediul LB suplimentat cu 1,8% agar și crescută peste noapte la 28°C. Vase 7 Petri cu 25 ml de mediu LB suplimentat cu 0,3% agar, pentru swimming și cu 0,5% agar pentru swarming, au fost preparate și lăsate să se usuce pentru 20...30 min, în hota cu flux 9 laminar, înainte de utilizare. Tulpina de analizat a fost inoculată, prin înțepare, în centrul mediului, cu betișoare sterile din lemn. După 18 h de incubare la 28°C, plăcile au fost anali- 11 zate în ceea ce privește mobilitatea. Rezultatele au reflectat, în cazul tulpinii Ps33, prezența ambelor tipuri de mobilitate. Mobilitatea are un rol major în colonizarea rădăcinilor plantelor 13 și este factorul direct implicat în mecanismul de combatere biologică prin competiție, pentru nutrienți și spațiu. 15

Producerea de compuși volatili cu rol în fitostimulare a fost demosntrată prin determinarea producerii de acetoină. Acetoina (3-hidroxi-2-butanona, HB) este un metabolit 17 fiziologic important, excretat de microorganisme atunci când sunt crescute într-un mediu de cultură conținând glucoză sau alte surse de carbon degradabile pe calea Embden - 19

Meyerhof. Formarea acetoinei este pusă în evidență prin reacția Voges-Proskauer și servește drept marker în clasificarea microbiană, având un rol important în reglarea ratei 21 NAD/NADH și în stocarea carbonului. Producerea de acetoină demonstrează și capacitatea respectivelor tulpini de a produce 2,3-butandiol, compus volatil, cu rol în stimularea creșterii 23 plantelor, tulpina Ps33 a fost crescută 24 h în LB (incubată la 28°C, cu agitare), apoi 100 μΙ de cultură au fost inoculați în 5 ml mediu lichid cu glucoză (proteoză - peptonă - 7 g, glucoză 25

- 5 g, NaCI - 5 g, apă distilată - 1000 ml), distribuit în eprubete, sterilizat 15 min, la 1 atm. Cultura a fost preparată în trei repetiții și testată pentru producerea de acetoin la 3, 5 și 7 zile 27 după inoculare, și incubare la 28°C. Ca reactiv, s-a utilizat o soluție 10% NaOH, câte 1 ml distribuit în fiecare eprubetă și, ulterior, adăugarea, în fiecare eprubetă, a 1 mg de creatină, 29 mixtura fiind agitată viguros. Apariția culorii roșii, după 30...60 min, la temperatura camerei, a indicat prezența acetil-metil-carbinolului, deci o reacție pozitivă. 31 într-o altă serie de experimente, s-a testat capacitatea bacteriilor Ps33 de a solubiliza fosforul din compușii săi insolubili. Pentru determinarea capacității de solubilizare a fosforului 33 mineral, s-a utilizat mediul agarizat Pikovskaya, care conține (per litru): 0,5 g extract drojdie, 10 g glucoză, 5 g Ca₃(PO₄)2, 0,5 g (NH₄)₂SO₄, 0,2 g KCI, 0,1 g MgSO₄-7H₂O, 0,0001 g 35 MnSO₄-H₂O, 0,0001 g FeSO₄-7H₂Oși 15 g agar. Pe acest mediu, bacteriile tulpinii Ps33au produs halou în jurul coloniilor, deci au solubilizat fosforul mineral. Capacitatea de a 37 solubiliza fosforul organic s-a testat pe mediul PSM (phytate screening medium), care conține (per litru): 10 g glucoză, 4 g fitat de sodiu, 2 g CaCI₂, 5 g NH₄NO₃, 0,5 g KCI, 0,5 g 39 MgSO₄-7H₂O, 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,01 g MnSO₄ -H₂O, 15 g agar. Și pe acest mediu, bacteriile tulpinii Ps33 au produs halou în jurul coloniilor, deci au solubilizat și fosforul organic 41 din fitați.

Activitatea de stimulare a creșterii plantelor a tulpinii Ps33 a fost pusă în evidență prin 43 efectuarea de experimente în condiții controlate, folosind plantule de grâu, Triticumaestivum, cv. Alex. în vederea inoculării, cariopsele de grâu au fost dezinfectate în două etape. Prima 45 dezinfecție a fost realizată în etanol 70%, timp de 30 sec, cu agitare la 60 rpm. După înlăturarea etanolului, semințele au fost clătite de trei ori cu apă distilată sterilă. 47

RO 127469 Β1

Cea de-a doua dezinfecție s-a făcut cu soluție de hipoclorit de sodiu 4 %, timp de 15 min. Ulterior, au fost realizate clătiri cu apă distilată, din 25 în 25 min, timp de două ore. Cariopsele astfel dezinfectate au fost păstrate la 4°C, la întuneric, pe hârtie de filtru umectată. Tulpina Ps33 a fost cultivată pe mediul LB lichid la 28°C și 150 rpm, timp de 16 h. Inocularea semințelor s-a realizat la două concentrații, de 10⁶ sau de 10⁸ ufc/ml. Bacterizarea cariopselor a fost efectuată prin imersare în suspensie bacteriană timp de 15 min, la temperatura camerei și agitare la 20 rpm. Ca martor, au fost folosite cariopse de grâu, sterilizate ca mai sus și imersate în apă distilată sterilă.

Cariopsele de grâu, inoculate conform metodei descrise mai sus, au fost puse la germinat în plăci Petri (cu diametrul de 9,4 cm), pe apă agarizată 0,8%, în număr de 20 de cariopse/placă, în cinci repetiții. Fiecare variantă a constat în 100 de cariopse. Temperatura de incubare a fost de 28°C. S-au făcut observații în ceea ce privește numărul semințelor germinate la 24, 48 și 72 h.

Pentru determinarea influenței bacteriilor Ps33 asupra dezvoltării plantulelor de grâu, cariopsele de grâu inoculate cu suspensie bacteriană în concentrație de 10⁶ sau 10⁸ ufc/ml au fost distribuite în vase Petri (cu apă agarizată, diametrul plăcilor de 9,4 cm), câte 10 semințe/placă, în trei repetiții (30 cariopse per variantă). Peste apa agarizată, au fost adăugați câte 5 ml de mediu mineral nutritiv pentru plante, cu formula: 0,4 g NH₄H₂PO₄, 2,4 g KNO₃, 1,6 g Ca(NO₃)₂, 0,8 g MgSO₄, agarizat cu 2 g la litru. Plăcile au fost incubate la întuneric, la 28°C. S-au efectuat observații în ceea ce privește efectul de stimulare a creșterii rădăcinuțelor și a plantulelor de grâu după 72 h, determinându-se lungimea rădăcinuței și înălțimea plantulei.

Determinările referitoare la influența tulpinii asupra germinării și a dezvoltării plantulelor au fost realizate comparativ față de un martor reprezentat de apă distilată sterilă, și față tulpini de bacili cu activitate fitostimulatorie dovedită. Rezultatele prezentate în tabelele 8 și 9 susțin existența unui efect fitostimulator, exercitat de bacteriile Ps33 asupra plantulelor de grâu și, în special, asupra sistemului radicular.

Tabelul 8

Influența inoculului bacterian asupra capacității de germinare a cariopselor de grâu (cv. Alex)

Tulpină bacteriană	Încadrare taxonomică	Concentrație inocul (ufc/ml)	% de cariopse germinate după
24 h	48 h	72 h
Mt	Apă distilată sterilă	-	75	88	92
B49b	Bacillus subtilis	10®	79	89	98
FL400	Paenibacillus graminis	10®	71	88	88
Ps 33	Serratia plymuthica	10®	84	89	98

Tabelul 9

Testarea efectului de stimulare a creșterii plantelor de grâu (cv. Alex) de către tulpinile de bacterii testate (72 h postinoculare)

Tulpină bacteriană	Concentrație inocul ufc/ml)	Germinație	Nr. răd. (cm.)	Lungime răd. (cm)	înălțime plantulă (cm)
Din 30 semințe	%
B49b	Ϊ05	24	80	4	3,79	2,02
B49b	10®	29	96,7	4	3,05	1,89
FL400	10®	26	86	3	3,93	2,27

RO 127469 Β1

Tabelul 9 (continuare) 1

Tulpină bacteriană	Concentrație inocul ufc/ml)	Germinație	Nr. răd. (cm.)	Lungime răd. (cm)	înălțime plantulă (cm)
Din 30 semințe	%
Ps 33	Ϊ05	29	96,7	4	4,05	2,52
Ps 33	108	29	96,7	4	3,87	2,43
Mt	-	25	83,3	4	3,68	2,54

DL 5% 0,38 0,27 9

Pentru a se determina influența tulpinii Ps33 asupra biodisponibilității seleniului 11 pentru plantele de grâu și de porumb, au fost realizate experimente de seră și de câmp. în cadrul experimentelor de seră, s-a lucrat cu substrat de creștere (preluvosol roșcat: m raniță: 13 nisip-2:1:1, repartizat în vase de vegetație cu suprafața de 0,050 m² și cu un volum de 151), la care s-au aplicat tratamente ale solului la locul de însămânțare (în brazdă) în raport de 15 ml per vas de vegetație (corespunzând la 200 l/ha).

Boabele de porumb (PR36D79 Pioneer) și de grâu (cv. Boema) au fost dezinfectate 17 prin menținere 5 min în hipoclorit 5% și spălări repetate cu apă distilată. Boabele astfel dezinfectate au fost plasate în vasele de vegetație (2 boabe de porumb într-un singur cuib, 19 boabe de grâu uniform distribuite). La locul de însămânțare a fiecărui bob, s-au aplicat tratamente cu soluția de aplicare, 1 ml pentru cele două boabe de porumb, câte 50 μΙ pentru 21 fiecare bob de grâu. Soluția de aplicare conținea 10⁷ sau 10⁸ ufc tulpină Ps33, 3,0 g/l zaharoză, 0,5 g/l K₂HPO₄, 0,2 g/l MgSO₄x7H₂O, 0,1 g/l NaCI, 7 g/l plasmolizat de drojdie 23 suplimentat cu 100±5 mg Se/100 plasmolizat 0,5 g/l glutamat de sodiu și 0,2 g/l K₂MoO₄. Bacteriile au fost introduse, ca suspensie concentrată, în soluția obținută prin dizolvarea, pe 25 rând, a fiecărui ingredient în apă dură standard (considerată în literatura de specialitate ca fiind un etalon pentru apa de fântână). 27

Apa dură standard s-a obținut prin amestecarea a 68,5 ml soluție A cu 17 ml soluție B, într-un Berzelius de 1000 ml. S-a diluat apoi cu circa 800 ml apă distilată și s-a adus pH-ul 29 la 6...7, prin adăugare de NaOH 0,1 N. S-a transferat într-un vas cotat de 1000 ml și s-a adus la semn cu apă distilată. 31

Soluția A s-a preparat astfel: s-au cântărit 4 g carbonat de calciu și s-au transferat într-un flacon conic de 50 ml, cu o cantitate minimă de apă distilată. S-au adăugat încet 33 82 ml HCI 1 N, agitând conținutul. Când tot carbonatul de calciu s-a dizolvat, s-a diluat soluția la circa 400 ml cu apă distilată și s-a fiert pentru eliminarea CO₂. S-a răcit soluția și 35 apoi s-au adăugat două picături soluție roșu de metil și s-a neutralizat cu soluție de amoniac 1 N până la culoarea intermediară portocalie. S-a transferat cantitativ într-un balon cotat de 37 1000 ml.

Soluția B s-a preparat astfel: s-au cântărit exact 1,613 g oxid de magneziu și s-au 39 transferat într-un flacon de 500 ml cu o cantitate minimă de apă distilată. S-au adăugat 82 ml HCI 1 N. S-a reîncălzit încet până la dizolvare, s-a diluat la circa 400 ml cu apă distilată și 41 s-a fiert pentru eliminarea CO₂. S-a răcit soluția și apoi s-au adăugat două picături soluție roșu de metil și s-a neutralizat cu o soluție de amoniac 1 N, până la o culoare intermediară 43 portocalie. S-a transferat cantitativ într-un balon cotat de 1000 ml, s-a adus la semn cu apă distilată și s-a transvazat pentru păstrare într-un flacon din polietilenă. 45

Variantele experimentale care au fost realizate sunt:

V.J - martor netratat cu (semințe/sol); 47

V₂ - martor tratat în brazdă cu soluția de aplicare seleniată, nebacterizat;

RO 127469 Β1

V₃ - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33 1 0⁷, în soluția de aplicare;

V₄ - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33 1 0⁸, în soluția de aplicare;

V₅ - martor tratament foliar ziua a 14-a de la răsărire (5 ml soluție 0,1 mg% Se sub formă de selenat de sodiu, echivalent a 10 g/ha seleniu).

Din experimentele realizate, s-au recoltat circa 2...3 g de material vegetal, atunci când grâul a ajuns la faza de înfrățire, respectiv, când porumbul a ajuns în faza de 8 frunze complete. Materialul vegetal s-a cântărit cu o precizie de 1 mg și s-a adus într-un balon cu dop rodat de 250 cm³. S-au adăugat 20 cm³ de acid azotic concentrat și s-a lăsat două zile la temperatura camerei. După aceea, s-au adăugat 2 cm³ acid percloric concentrat, iar la balon, s-a atașat un refrigerent cu spirală. S-a pus pe baie de nisip cu temperatura de 180°C, la nișă chimică și s-a fiert timp de 16 h. S-a demontat refrigerentul, s-au adăugat 1 cm³ de acid sulfuric concentrat, după care s-a continuat evaporarea sub nișă, circa trei ore, până la un volum de 1...2 cm³. Soluția s-a răcit, s-a adăugat 1 cm³ de acid azotic concentrat și s-a ținut pe baia de apă, timp de 10 min. Mineralizatul astfel obținut s-a transvazat cantitativ întrun pahar Berzelius de 100 cm³. La proba astfel dezagregată, s-au adăugat 5 cm³ soluție de mascare, după care pH-ul soluției s-a adus la 2, cu soluție de hidroxid de amoniu. S-au adăugat 5 cm³ de soluție 0,1% 2,3-diamino-naftalină, după care s-a lăsat în întuneric, două ore. După formarea complexului, soluția s-a transvazat cantitativ într-o pâlnie de separare. Complexul piazselenolic format a fost extras repetat cu ciclohexan 2x5 cm³, agitând intens două minute. Fazele organice s-au reunit și s-a determinat fluorescența la o lumină de excitare de 380 nm și la o emisie de 519 nm. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul

10. Acestea demonstrează că tulpina Ps33 este o tulpină care are o capacitate ridicată de a biodisponibiliza seleniul, pentru plantele de grâu și de porumb.

Tabelul 10

Nivelurile de seleniu total (pg/kg) în țesuturile plantelor provenite din semințe tratate în brazdă cu o soluție seleniată și tulpină Ps33

Varianta experimentală	Grâu	Porumb
V1 - martor netratat (semințe/sol);	44,3±5,2C	46,3±4,5C
V2 - martor tratat în brazdă cu soluția de aplicare seleniată,	54,6±4,6b	56,7±3,7b
nebacterizat
V3 - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33 107 în soluția	62,2±4,8ab	64,6±6,3ab
de aplicare
V4 - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33 108 în soluția	71,6±4,4a	72,5±4,3a
de aplicare
Vs - martor tratament foliar ziua a 14	68,8±7,1a	71,2±5,6a

Tulpina Ps33 a fost testată și în cadrul unui experiment de câmp, amplasat în Dobrogea, pe suprafețe mari. Bacteriile au fost aplicate în brazdă concomitent cu semănatul, prin utilizarea de echipamente agricole specifice de aplicare soluții în brazdă, la presiuni de lucru cuprinse între 0,5 și 3 bari ale echipamentului de aplicare prin pulverizare în brazdă și la o viteză medie de deplasare a agregatului de semănat de 7 km/h. Soluția de aplicare a inclus aceleași componente, care însă au fost dizolvate în apă de fântână. Experimentul a fost realizat în pătrat latin, cu patru variante în patru repetiții. Cele patru variante au fost:

V.J - martor netratat cu (semințe/sol);

V₂ - martor tratat în brazdă cu soluția de aplicare seleniată, nebacterizat;

V₃ - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33, 10⁸ în soluția de aplicare;

RO 127469 Β1

V₄ - martor tratament foliar ziua, la faza de spic în burduf (500 litri soluție 2 mg % Se, 1 sub formă de selenat de sodiu, echivalent a 10 g/ha seleniu).

Din experiment, au fost prelevate probe în fenofaza de formare a boabelor și la 3 recoltare, probe de boabe. în aceste probe, s-a determinat nivelul de seleniu total, prin digestia umedă a probelor de sol cu un amestec de acizi azotic, sulfuric, percloric pentru 5 transformarea tuturor speciilor moleculare Se în seleniat (SeO₄ ² ), reducerea acestuia cu NaBH₄ la H₂Se și dozarea lui prin HG-AAS (generare de hidrură cu dozarea seleniului prin 7 spectroscopie de absorbție atomică în flacără). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 11.

Tabelul 11

Influența tratamentului de inoculare în brazdă cu tulpina Ps33 de Serratia plymuthica asupra preluării și acumulării de seleniu (pg/kg)

Varianta experimentală	Material vegetal	Grâu boabe
V! - martor netratat (semințe/sol);	39,5±5,2C	106,3+4,5C
V2 - martor tratat în brazdă cu soluția de aplicare seleniată,	53,6±4,6bc	116,7±5,7b
nebacterizat V3 - sol tratat în brazdă cu Serratia plymuthica Ps33 108 în	77,6+4,4®	136,5±7,3a
soluția de aplicare V4 - martor tratament foliar ziua a 14	62,8+7,1b	121 ,±7,9b

Tulpina Ps33 de Serratia plymuthica stimulează acumularea și preluarea seleniului 21 de către plantele de grâu în condiții de câmp și poate fi utilizată pentru ameliorarea proceselor de biofortifiere cu seleniu a recoltei de grâu. 23

Testarea inocuității tulpinilor bacteriene s-a realizat prin utilizarea larvelor de insecte de Galleria mellonella. Larvele au fost crescute pe substrat de cultură, la 30°C, substratul 25 având următoarea compoziție: mălai 400 g, făină 200 g, tărâțe de grâu 200 g. Toate aceste componente s-au ținut în congelator, timp de 7...10 zile, după care s-au sterilizat prin 27 menținere la 70°C, timp de două ore. La aceste componente sterilizate, s-au adăugat drojdie uscată măcinată 100 g și lapte praf 200 g. La acest amestec pulverulent, s-au adăugat 700 29 ml de amestec lichid, compus din 350 ml miere și 350 ml glicerină, în care s-a dizolvat ceară de albine (1:1). Compoziția finală s-a omogenizat la mixer și s-a păstrat în cutie de plastic, 31 la 4°C.

Larvele de vârsta a treia au fost păstrate la 4°C pe substratul menționat mai sus. 33 Pentru infectare, s-a folosit o seringă Hamilton de 5 μΙ. S-au injectat câte 5 μΙ de suspensie bacteriană prin partea stângă a ultimului segment. După injectare, larvele au fost plasate în 35 incubator, la întuneric, la 30°C, temperatura optimă pentru creșterea și dezvoltarea acestora.

A fost realizată o serie de 10 diluții seriale, combinând concentrații bacteriene între 37 10⁶ și 0, în soluție 10 mM MgSO₄ +1,2 mg/ml ampicilină, cu care s-au injectat larvele de Galleria melonella. Concentrația inoculului start a corespuns unei densități optice (DO 600 39 nm) de 1,435. Larvele martor au fost injectate cu câte 5 μΙ soluție 10 mM MgSO₄+ 1,2 mg/ml ampicilină, pentru a evalua orice potențial efect letal al procesului de injectare. Din fiecare 41 diluție, s-au injectat câte 10 larve, fiind efectuate câte trei repetiții/diluție. Monitorizarea larvelor (moarte, vii) s-a făcut la 48...72 h după infecție, la 30°C (tabelul 12). 43

RO 127469 Β1

Tabelul 12

Mortalitatea larvelor de Galleria mei Ionel la, injectate cu suspensii 10⁶ ufc/ml din tulpina de testat

Varianta	Repetiția	24 h postinfecție	48 h postinfecție	72 h postinfecție
vii	moarte	vii	moarte	vii	moarte	crisalide
Martor 10 mM MgSO4 + 1 2 mg/ml ampicilină (DO 0,000)	R1	10	0	10	0	10	0	2
R2	10	0	10	0	9	1	1
R3	10	0	10	0	9	1	-
Ps33 106 ufc/ml	R1	10	0	9	1	8	2	-
R2	8	2	8	2	8	2	-
R3	10	0	10	0	9	1	1

Datele din tabelul 12 demonstrează faptul că tulpina testată, Ps33, nu prezintă practic patogenitate față de larvele de Galleria mellonella, neavând capacitatea de a se multiplica în corpul larvelor și de a produce bacteremii, deși au fost injectate în limfa larvelor. Aceste tulpini au o activitate biologică ridicată (antagonism, stimulare a creșterii plantelor, capacitate de biodisponibilizare a seleniului) și nu prezintă caracteristici de patogenitate pentru organisme nețintă. în concluzie, această tulpină are potențial de utilizare în practică, atât pentru protecția plantelor împotriva atacului fitopatogeni, cât și pentru biofortifierea recoltei de grâu cu seleniu.

Claims (1)

1. Tulpină de Serratia plymuthica, Ps33, înregistrată la Național Collection of Agricultural 3 and Industrial Microorganisms, Budapesta, cu numărul NCAIM (P) B001366, caracterizată prin aceea că are acțiune de protecție in vivo a plantelor de cultură față de ciupercile 5 fitopatogene de sol Rhizoctonia solani, Alternaria, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia bataticola, 7 Verticillium dahliae, și acțiunii antagoniste față de bacteriile care afectează pomii fructiferi la înflorit, Erwinia amylovora, pseudomonasuri ice⁺, prezintă mobilitate ridicată și formează 9 biofilme, colonizând suprafețele organelor plantelor și rezistând la factorii adverși de mediu, stimulează dezvoltarea plantelor de grâu, datorită producerii de compuși volatili și solubilizării 11 fosforului, biodisponibilizează seleniul pentru plantele de grâu și de porumb, și favorizează acumularea seleniului în boabele de grâu. 13