RO127514A2 - Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal - Google Patents
Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal Download PDFInfo
- Publication number
- RO127514A2 RO127514A2 ROA201001158A RO201001158A RO127514A2 RO 127514 A2 RO127514 A2 RO 127514A2 RO A201001158 A ROA201001158 A RO A201001158A RO 201001158 A RO201001158 A RO 201001158A RO 127514 A2 RO127514 A2 RO 127514A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- strain
- usa2
- activity
- plants
- plant growth
- Prior art date
Links
- 239000002689 soil Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims description 23
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 title abstract description 12
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title abstract description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 title abstract description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 claims abstract description 19
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 241001495426 Macrophomina phaseolina Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 claims abstract description 4
- 241001149475 Gaeumannomyces graminis Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 244000038559 crop plants Species 0.000 claims description 6
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 4
- 241000599030 Pythium debaryanum Species 0.000 claims description 4
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 claims 1
- 241001518615 Sclerotium cepivorum Species 0.000 abstract description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract 1
- 241000879804 Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici Species 0.000 abstract 1
- 238000003971 tillage Methods 0.000 abstract 1
- 101100137821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP8 gene Proteins 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 7
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002362 mulch Substances 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000255896 Galleria mellonella Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 5
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000478483 Collaria <Myxogastria> Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000693619 Starmerella bombicola Lactone esterase Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589938 Azospirillum brasilense Species 0.000 description 2
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000775680 Polytaenia Species 0.000 description 2
- 241000918585 Pythium aphanidermatum Species 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000018612 quorum sensing Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUJHZQRRTJXWOT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid;propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O MUJHZQRRTJXWOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTUTXGYGWPTUIY-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanol;chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl.OCCN(CCO)CCO VTUTXGYGWPTUIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001530056 Athelia rolfsii Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000437818 Cercospora vignicola Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 description 1
- 241001529387 Colletotrichum gloeosporioides Species 0.000 description 1
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241001208371 Fusarium incarnatum Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000557833 Hua gabonii Species 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090121 N-acyl homoserine lactonase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000172730 Rubus fruticosus Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 240000004460 Tanacetum coccineum Species 0.000 description 1
- 241000182983 Thielavia basicola Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 241000219975 Vicia villosa Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N [2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-2,2-dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl)cyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OC1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1 ROVGZAWFACYCSP-MQBLHHJJSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098396 barley grain Drugs 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- BKBMACKZOSMMGT-UHFFFAOYSA-N methanol;toluene Chemical compound OC.CC1=CC=CC=C1 BKBMACKZOSMMGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940015367 pyrethrum Drugs 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diethylpyrimidin-3-ide-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCC1(CC)C([O-])=NC(=O)NC1=O RGHFKWPGWBFQLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004162 soil erosion Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Prezenta invenţie se referă la o tulpină deUsa2, număr de depozit DSMZ 23654, pentru combaterea agenţilor patogeni din sol, stimularea creşterii plantelor şi biodegradarea controlată a materialului vegetal din cadrul sistemelor de agricultură conservativă, care exercită acţiuni benefice asupra plantelor de cultură, datorită activităţii de protecţie faţă de ciuperci fitopatogene de sol, a produceriide factori de creştere pentru plante şi a capacităţii de degradare controlată a materialului vegetal, cu formare de poliamine, compuşi care cresc rezistenţa plantelor la stresurile biotice şi abiotice. Aceste acţiuni benefice se concretizează prin sporuri de producţie la floarea-soarelui, realizate în condiţiile unui sistem agricol conservativ, în care sunt reduse costurile de producţie aferente folosirii erbicidelor şi arăturii.
Description
Prezenta invenție se referă la o nouă tulpină de Bacillus subtilis, care este destinată combaterii agenților fitopatogeni din sol, stimulării creșterii plantelor și biodegradării controlate a materialului vegetal în cadrul sistemelor de agricultură conservativă, inclusiv a celor pe bază de muici vegetal provenit din culturi verzi de protecție.
Sunt cunoscute mai multe tulpini de Bacillus subtilis care au activitate de combatere a agenților fitopatogeni. Brevetul WO 2007/043771 se referă la compoziții pentru prevenirea bolilor plantelor pe baza tulpinilor KCCM 10639 sau KCCM 10640 de B. subtilis și un procedeu de aplicare a acestor compoziții. O serie de brevete SUA (6 060 051, 6 103 228, 6 291 426 și 6 417 163) protejează tulpina AQ / QST 713 de B. subtilis (cu număr de depozit NRRL BO-21661) care este înalt producătoare de antibiotice și cu un spectru larg de activitate insecticidă, antifungică și antibacteriană.
De asemenea au fost descrise până în prezent mai multe tulpini de Bacillus subtilis care au concomitent activitate de combatere a agenților fitopatogeni și de stimulare a creșterii plantelor. Cererea de brevet SUA 2008/0152684 descrie o tulpină de B. subtilis WG6-14 (număr de depozit NRRL B-30954), care prezintă atât activitate de stimulare a creșterii plantelor (datorită producerii de metaboliți volatili, ca de ex. acetoină și 2,3 butandiol) cât și activitate antagonistă față de ciuperci fitopatogene (Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solarii, Colletotrichum gloesporoides, Sclerotium rolfsii) și față de bacterii fitopatogene (Xanthomonas axenopodis pv. citri, X. axenopodis pv. vesicatoria, Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Brevetul SUA 7 211 428 expune o tulpină de B. subtilis (număr de depozit MTTC 5130) cu caracteristici de inhibarea a creșterii ciupercilor patogene (Phizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Pythium aphanidermatum, Curvularia andropogonis, Alternaria alternata, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporiodes, Corynespora cassiicola, Thielavia basicola) și care stimulează dezvoltarea plantelor de cultură (de geranium și piretru).
Nu s-au descris până în prezent tulpini de Bacillus subtilis care să aibă concomitent activitate de antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal. Astfel de tulpini sunt necesare sistemelor de agricultură conservativă. In cadrul acestor sisteme lucrările mecanice ale solului sunt reduse, iar solul este acoperit
ORCIUL DE STAT^frwi^^~
Cerere de brevet de ·:?<v..
Nr. ..^....£r?/.2...<? 4 1
Data depozit.... J ^2010-01158-2 ΐ| -11- 2010 'I cu cel puțin 30% resturi vegetale. Sistemele de agricultură conservativă reduc eroziunea solului, și poluarea apelor, de suprafață și din pânza freatică, dar au dezavantajul că mențin solul rece, reducând germinația și dezvoltarea plantelor cultivate, și favorizând dezvoltarea agenților de dăunare, în special ciuperci fitopatogene cu spectru larg de acțiune.
In cadrul acestor sisteme de agricultură conservativă tulpinile de Bacillus subtilis care prezintă concomitent activitate de antagonism față de agenții fitopatogeni din sol, de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal ar contribui la înlăturarea dezavantajului menționat mai sus, pentru că ar inhiba agenți fitopatogeni din sol, ar stimula dezvoltarea plantelor de cultură și ar asigura un management durabil al resturilor vegetale.
Tulpina B. subtilis Usa2 (număr de depozit DSMZ 23654) prezintă un spectru larg de acțiune antifungică față de ciupercile de sol fitopatogene, o activitate de stimulare a creșterii plantelor și de biodegradare controlată a materialului vegetal.
Tulpina B. subtilis Usa2 prezintă următoarele avantaje:
- creștere bogată pe mediile uzuale utilizate pentru creșterea bacililor gram pozitivi sporulați;
- formarea de spori cu viabilitate îndelungată;
- capacitate de a modula formarea consorțiilor microbiene de consens cu alte bacterii utilizate în biopreparate mixte datorită activității lactonazice prin care influențează semnalele AHL implicate în realizarea sensibilității de grup;
- spectru larg de acțiune împotriva atacului ciupercilor fitopatogene de sol;
- stimularea creșterii plantelor de cultură
- biodegradare controlată a materialului vegetal, cu formare de compuși care cresc rezistența plantelor la stress-urile biotice și abiotice de tipul poliaminelor.
Prezenta invenție se ilustrează cu exemplul prezent mai jos.
Exemplu. Tulpina Usa2 de Bacillus subtilis a fost obținută la Institutul de Cercetare-Dezvoltare pentru Protecția Plantelor, București, din rizosfera unei plante de usturoi provenita din zona de sud a Olteniei. Pentru izolarea bacteriei s-a utilizat agar nutritiv ( peptona - 5g/l, extract de carne - 3g/l, agar - 20g/l, la 1000 ml apa; pH 6.8-7.2), iar pentru cultivare s-a utilizat mediul Luria-Bertani agarizat (LBA: bactotriptona - 10g/l, extract de drojdie - 5g/l, NaCI - 10g/I, agar - 20g/l, la 1000 ml apa; pH 7.5.), la o temperatura optima de incubare de 28°C.
Această tulpină a fost selectată dintr-o colecție de peste 150 izolate de bacili sporulanți gram-pozitivi. In vederea încadrării taxonomice, tulpina Usa2 a fost (
υ t\-2 Ο 1 Ο - Ο 11 58 - 2 4 -11- 2010 caracterizată pe baza unei taxonomii polifazice, respectiv a combinării caracterelor morfologice (tab. 1), cu cele fiziologice (tab. 2) și cu cele moleculare (secvența
16S rADN, tab. 3).
Tab. 1. Morfologia coloniilor de Bacillus subtilis Usa2 pe diferite medii după cultivare timp de 24 ore.
| Mediul utilizat | Morfologia coloniilor tulpinii Usa2 | |||
| culoare | aspect exterior | dimensiuni (24h) | ||
| Medii gelifiate semisintetice | mediul cu decoct de cartof - glucoza agar (CGA) | brune | rugoase, margini neregulate sub forma de filamente | colonii mari |
| mediu cu extract de carne (beef extract) | crem | rugoase, centrul proeminent, încrețit, margini neregulate | colonii mari | |
| mediul cu decoct de fasole | crembrun | rugoase, margini neregulate | colonii medii | |
| mediul cu extract de sol | crembrun | rugoase, margini neregulate | colonii medii | |
| Medii solide naturale | felii de cartof sterile | brun | rugoase, margini neregulate, centru cu rugozități fine | colonii mari |
| Medii lichide | mediul cu decoct de cartof - glucoza | - | peliculă fină la suprafața, rugoasă, turbiditate slabă | - |
| mediu cu extract de carne | - | peliculă fină la suprafață, rugoasă, turbiditate slabă | - |
Tab. 2. Caracteristicile fiziologice ale tulpinii Usa2.
| Testul biochimic | Usa2 |
| Reacția Gram | + |
| Reacția Voges-Proskauer | + |
| Hidroliza amidonului | + |
| Hidroliza gelatinei | + |
| Reducerea NO3->NO2 | + |
| Creștere anaeroba | - |
| Catalaza | + |
| Sursa de carbon: malonat | + |
| citrat | + |
| propionat | - |
| tartrat | + |
| trehaloza | + |
| glucoza | + |
| Acidifica: xiloza | + |
| glucoza | + |
| arabinoza | ± |
| manitol | + |
| rafinoza | + |
| celobioza | + |
| Toleranta la NaCI 7% | + |
Ț-l 0 10-01158-. ții
4 -11- 2010
Identificarea pe baza secvenței 16S rADN (tab.3) s-a realizat prin aplicarea unui protocol de lucru caracterizat prin următoarele etape: obținerea de culturi pure - colonii izolate, tehnica însămânțării prin epuizarea ansei; extracția ADN-ului bacterian; electroforeză în gel pentru detectarea ADN-ului; amplificarea secvenței 16S rADN prin tehnica PCR și electroforeză în gel; purificarea ADN-ului ribozomal; amplificare enzimatică a acizilor nucleici înainte de secvențializare; precipitarea și uscarea ADN-ului codificând pentru 16sRNA. Secvențierea nucleotidică a fost realizată cu metoda Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer, 1998), folosind un secvențiator automat de tip ABI PRISM 310 (Perkin Elmer). Secvențele au fost analizate folosind programul CHROMAS 2.33 (Technelysium Pty Ltd). Compararea secvențelor 16S rADN obținute cu secvențele existente în Banca de gene NCBI (Național Center for Biotechnology Information), s-a realizat cu ajutorul programului BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
Tab. 3. Identificarea tulpinii pe baza similarității secvenței 16 S rADN cu tulpinile din GenBank
| Tulpina | Lungimea secvenței 16S ’ rADN1 | Compoziția nucleotidică a secvenței 16S rADN | Identificarea tulpinii2 |
| Usa2 | 510 | GCGGACAGAATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGG GATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTT GAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCA CTTACAGATGGACCCGCAACGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAG GGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTT CGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGT TCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTG | Bacillus subtilis străin ZHB4 (FJ263016.1) - similaritate: 99,4% |
Coroborând toate datele obținute, tulpina Usa2 a fost încadrată ca aparținând speciei Bacillus subtilis. încadrarea taxonomică a tulpinii Usa2 a fost confirmată de specialiștii de la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen - Centrul german de microorganisme și culturi celulare) și depozitată în vederea brevetării (DSM 23654).
Selecția tulpinii usa2 s-a realizat pe baza acțiunii benefice exercitate asupra diferitelor plante de cultură (grâu, porumb, floarea-soarelui) datorită activității de protecție față de ciupercile fitopatogene de sol (Fusarium graminearum, Alternaria spp, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Gaeumannomyces graminis, Pythium debaryanum, Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotium bataticola), producerii in situ de factori de creștere pentru plante și capacității de
<2 Ο 1 Ο - Ο 1 1 5 8 - 2 4 -11- 2010 degradare controlată a materialului vegetal cu formare de poliamine, compuși care cresc rezistența plantelor la stress-urile biotice și abiotice.
Testarea activității antagoniste in vitro a tulpinii Usa2 a fost efectuată pe mediul cu cartof - glucoza - agar (CGA/PDA) utilizându-se metoda culturilor duble. Tulpina Usa2 (dintr-o cultura de 24 ore de creștere pe mediul LBA) a fost însămânțată in placi petri prin strierea cu ansa a unei linii drepte la o distanta de 3 cm de o rondea calibrata de miceliu (5mm) din cele 11 ciuperci testate. Plăcile Petri astfel însămânțate au fost incubate la 28°C si analizate in ceea ce privește zona de inhibiție (mm) la 72 ore. Experiența a fost repetată de trei ori. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.
Tab. 4. Testarea in vitro a activității antagoniste a tulpinii Usa2 de B. subtilis asupra creșterii miceliene a unor ciuperci fitopatogene (zona de inhibiție la 72 h incubare la 28°C).
| Cod tulpina - încadrare taxonomica | Ciuperca fitopatogenă * | |||||||||
| Fg | Alt | Bc | Ss | Sc Gg | Pdb | Vd | Rs | Forl | Sb | |
| Zona de inhibiție (mm) | ||||||||||
| Usa2 - Bacillus subtilis | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ ++ I | ++ | ++ | ++ | +++ | ++ |
Legenda: +++ = zona de inhibiție > 5mm; ++ = zona de inhibiție > 3 mm; + = creștere limitata; *Fg=Fusarium graminearum, Alt=Alternaria spp, Bc=Botrytis cinerea, Ss=Sclerotinia sclerotiorum, Sc=Sclerotium cepivorum, Gg=Gaeumannomyces graminis, Pdb= Pythium debaryanum, Vd=Verticillium dahliae, Rs=Rhizoctonia solani, For! =Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici si Sb=Sclerotium bataticola
Testele efectuate in vitro fata de diferite ciuperci fitopatogene au evidențiat un spectru larg de acțiune antifungică, tulpina Usa2 putând fi astfel utilizată pentru protecția diferitelor culturi amplasate în muici bioactiv provenit din cultura de mazăre / măzăriche de toamnă.
Activitatea biologica in vivo a fost testate in condiții de sera, in ceea ce privește eficacitatea tulpinii Usa2 in combaterea ciupercilor fitopatogene de sol (Rhizoctonia solani, Pythium debaryanum, Fusarium oxisporum, Sclerotinia sclerotiorum și Sclerotium bataticola), care atacă frecvent în stadiul de plantulă și produc pagube.
Operațiunile implicate au constat in pregătirea inoculului bacterian prin împrospătarea in eprubete (incubate la 27°C timp de 2-3 zile) pe mediul cartofglucoza-agar (CGA) si realizarea suspensiilor bacteriene in tampon fosfat cu titrul de 108 ufc/ml. Inoculul fungic s-a obținut in placi Roux, pe mediul natural alcătuit din boabe de ovăz dublu sterilizate la 1 atm. timp de 20 minute, prin inocularea cu miceliu si incubarea la 27°C timp de 3-4 zile. Substratul utilizat in sera a constat din
^-2010-01158-2 4 -11- 2010
1/2 pământ de grădină + 1/4 mraniță + 1/4 nisip. Acesta a fost amestecat uniform cu inoculul fungic ( ~ 2 x 106 spori/ kg sol) si apoi distribuit in tăvi din plastic (32/24 cm) cu 48 ore înainte de semănat.
Materialul vegetal (achene de floarea soarelui cv. Favorit) a fost tratat înainte de semănat prin imersie, timp de 20 minute, in suspensiile bacteriene al căror titru a fost stabilit la 108 ufc/ml. Inocul de fitopatogen aplicat la floareasoarelui a constat in complexul R. solarii + F. oxysporum + P. de baryanum (RFP), S. sclerotiorum si S. bataticola.
Experimentul a fost analizat după 3 săptămâni de la semănat în ceea ce privește eficacitatea tulpinilor în combaterea ciupercilor fitopatogene. Calculul analizei varianței s-a efectuat cu programul ANOVA.
Calculul eficacității (%) tratamentelor cu microorganisme utile la sămânța de floarea-soarelui (cv. Favorit), în prevenirea atacului ciupercilor de sol luate în studiu, a reflectat o foarte bună eficacitate a tulpinii de Bacillus subtilis Usa2, uneori peste etalonul chimic pe bază de tiuram (tab. 5).
Tab. 5. Eficacitatea diferitelor tulpini de microorganisme antagoniste în prevenirea atacului unor ciuperci telurice la cultura florii soarelui (cv. Favorit) în condiții de seră.
| Inocul fungic* | R.F.P.* | S. s. | S.b. | |||
| Varianta tratament | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) | % plante sănătoase răsărite | Eficacitatea (%) |
| 77.3 | 83 | 64 | 90 | 78 | 80 | 60 |
| Td67 | 80 | 57 | 83 | 62 | 79 | 58 |
| Usa2 | 99 | 98 | 97 | 93 | 99 | 98 |
| Bs36 | 73 | 43 | 81 | 58 | 77 | 54 |
| 56.1s | 75 | 47 | 85 | 67 | 80 | 60 |
| Bs 48 | 71 | 38 | 81 | 58 | 98 | 56 |
| Tiradin 70 PU (4g/kg) | 83 | 64 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Mt. Netratat | 53 | - | 55 | - | 50 | - |
* RFP = R. solarii + F. oxysporum + P. de baryanum·, S.s. = S. sclerotiorum; S.s. = S. bataticola.
In variantele infectate cu complexul R.F.P. cea mai mare eficacitate (> 50%) s-a obținut in cazul tratării semințelor cu tulpinile Usa2, 56.1s si 77.3.Tratamentele
//
O 1 0 - 0 1 1 5 8 - 2 4 ”11- 2010 chimice cu Tiradin 70 PU (4g/kg semințe) au avut valori ale eficacității situate între 64 - 100 %, cea mai mică eficacitate înregistrându-se in variantele cu solul infectat cu complexul R.F.P., iar cea mai mare in solul infectat cu S. bataticola si S. sclerotiorum. Tulpinile Usa2 au avut o eficacitate de combatere a atacului ciupercilor fitopatogene de sol în amestec, R. solani + f. oxysporum + P. de baryanum, superioară martorului chimic etalon.
Evidențierea producerii de lactonază s-a realizat printr-un experiment în trepte. Numeroase bacterii Gram-negative patogene utilizează acil- homoserinlactona (AHL) pentru expresia sensibilității de grup (quorum sensing). O enzimă denumită AHL- lactonaza produsă de numeroase tulpini de Bacillus sp. este capabila sa hidrolizeze inelul moleculei de homoserin-lactona interferând astfel cu sistemul de comunicare al acestor bacterii (quorum quencing). Tulpina biosenzor de Chromobacterium violaceum CV026 (McCIean et al., 1997) a fost utilizată ca indicator. Testul propriu-zis a constat în inocularea tulpinii Usa2 în 2 ml mediu lichid Luria Bertani în care s-a adaugat C6-hexanoil-homoserin- lactonă (C6-HHL) în concentrație finală de 5 μΜ și incubarea peste noapte la 28°C cu agitare la 150 rpm. Simultan, același mediu numai cu C6-HHL a fost utilizat ca martor negativ pentru a vedea dacă mediul induce lactoliza. Testul a fost efectuat pe plăci Petri cu mediul LBA (Luria Bertani cu agar) suplimentat cu 50 pg/ml kanamicină și inoculat în plaja cu CV026 prin distribuția sub formă de plaja a unei cantităti de 250 μΙ dintro cultură de 12 ore. Pe suprafața plăcii astfel inoculate au fost efectuate godeuri cu diametrul de 5 mm în care s-au distribuit 100 μΙ din supernatantul culturii bacteriene de testat. Petriurile au fost incubate peste noapte la 28°C si, ulterior analizate pentru prezența/absenta halourilor violete. Absența halourilor violete a indicat faptul ca, tot C6-HHL din mediul de creștere a fost degradat.
Tulpina Usa2 prezintă capacitate foarte ridicată de producere de lactonază, modulând comunicarea la nivel de grup a altor bacterii. Poate fi deci folosită pentru combaterea bacteriilor fitopatogene care utilizează C6-HHL sau pentru realizarea de consorții microbiene de consens în care este necesară modularea quorum sensing.
Următoarea serie de experimente a urmărit punerea în evidență a acțiunii de favorizare a creșterii si dezvoltării vegetale datorate producerii de fitohormoni in situ de către microorganismul în discuție. S-a urmărit evidențierea activității fitohormonilor giberelici produși de bacteriile gram pozitive sporulate, utile plantelor de cultura, pentru a se verifica calitatea biologică de favorizant de creștere.
Evidențierea si estimarea activității fitohormonilor giberelinici s-a efectuat prin biotestul inducerii α-amilazei din endospermul de orz cuplat cu tehnica difuziei radiale in gel. Etapele procedurii utilizate au fost:
/C
Ο 1 0 - Ο 1 1 5 8 - 2 h -11- 2010
- inducerea biosintezei α-amilazei in endospermul boabelor de orz de către fitohormonii prezenți in extractele de testat;
- difuzia radiala in gelul de agar-amidon a enzimelor sintetizate sub acțiunea fitohormonilor si hidroliza consecutiva a amidonului;
- evidențierea zonei de acțiune a enzimei prin colorarea substratului.
Reactivi folosiți in cadrul acestui test au fost:
Gel de agar - amidon. In 100 ml tampon substrat pH 6,9 diluat cu 100 ml apa s-au dizolvat la cald 2,5 g agar si 1 g de amidon; s-a fiert pana a devenit limpede. Soluție tampon substrat pH 6,9; 590 mg acetat de sodiu + 1,47 g veronal sodic + 1,4 g NaCI + 780 mg CaCI2 s-au dizolvat in apa distilata si apoi s-au adăugat 62 ml HCI 0,1 N si s-a adus la un volum final de 250 ml cu apa distilata.
Soluție de developare: 45 ml iod 0,1 N cu 55 ml etanol absolut Extract de biopreparat realizat prin osmoza inversa.
Endosperm de orz. Boabe de orz s-au curtat de palee si li s-a înlăturat prin taiere partea care conține embrionul.
Modul de lucru a implicat următoarele etape:
- depunerea unui gel de agar - amidon în grosime de 2-3 mm pe suport reprezentat de folii de acetat de celuloza sau lamele microscopice;
- practicarea in gel a unor godeuri cu diametrul de 3 mm;
- depunerea in godeuri a endospermului de orz (jumătate de bob fără embrion) și a extractului de testat (mediu de cultură a microorganismului);
- incubarea 72 h la temperatura camerei in incinta umeda;
- colorarea cu soluție de developare a gelului;
- măsurarea zonei de difuzie.
Fitohormonii giberelinici au fost extrași dintr-un mediu de cultură specific (LB) în care s-a incubat peste noapte o suspensie de 106ufc/ml bacterii. Extracția s-a realizat prin dializă inversa a amestecului incubat peste noapte. Suspensia bacteriană a fost trecută intr-un sac de dializă, care a fost suspendat timp de 24 ore în acetat de etil (dializă inversă). Biotestul s-a lucrat față de martori de reactivi, rezultat din extracția, prin dializă inversă, a mediului LB. Tulpina Usa2 a produs în condițiile date peste 25 pg echivalenți acid giberelic per ml, la peste 2/3 din nivelul produs de o tulpină etalon de Azosprillum brasiliense Sp001, recunoscută pentru capacitatea ridicată de producere de fitohormoni giberelici.
Printr-o altă serie de experimente s-a urmărit biotestarea efectului stimulator a tulpinii Usa2 împreună cu alte tulpin etalon asupra creșterii unor plantule de floarea-soarelui și a avut in total 12 variante in 4 repetiții fiecare. Fiecare repetiție a avut 5 plante, iar fiecare varianta a avut 20 de plante. Tulpinile bacteriene au fost cultivate pe mediu LB lichid la 28°C, aerat și agitat prin amestecare la 150 rpm timp 8
Λ,-2 O 1 O - O 1 1 5 B - 2 A -11- 2010 de 16 ore. Semințele de floarea-soarelui (cv. Favorit) au fost dezinfectate în doua etape. Prima dezinfecție a fost realizata in etanol 70%, timp de 30 de secunde cu agitare la 60 rpm. După înlăturarea etanolului, semințele au fost clătite de trei ori cu apa distilata sterila. Cea de-a doua dezinfecție s-a făcut cu soluție de hipoclorit de sodiu 4 %, timp de 15 minute. Ulterior au fost realizate clătiri cu apa distilata, din 25 in 25 de minute timp de doua ore. Semințele au fost inoculate prin imersie in 3 ml suspensie bacteriana in concentrație de 107 ufc/ml in tampon fosfat si 2 % carboximetil-celuloza, apoi au fost semănate in pungi sterile de creștere “Cyg” (Mega Internațional). Plantele au fost crescute în condiții controlate (temperatură de 22°C± 0,2°C, iluminare 12 ore pe zi cu 250 pmol fotoni m’2s'1). După semănat si pe toata durata experimentului, pungile au fost umectate cu soluție nutritiva Hoagland 0,25%. Creșterea rădăcinuțelor plantelor de floarea-soarelui a fost analizată la 15 zile de la semănat (tab. 6).
Tab. 6 Lungimea totala (mm) a rădăcinilor plantelor de floarea soarelui (cv.
favorit) la 15 zile de la semănat.
| Varianta | Lungimea totala a rădăcinii (mm) | |
| Martor neinoculat | 184.29 | b |
| WCS 365 | 219.05 | a |
| B49 b | 187.5 | b |
| FL400 | 174.54 | b |
| Ps 33 | 173.5 | b |
| 56. 1s | 184.75 | b |
| Hm s1 | 200.86 | ab |
| Cn s2 | 214.38 | a |
| Sp s2 | 181.93 | b |
| Tm s2 | 187 | b |
| Usa2 | 225.79 | a |
| 77.3 | 292.6 | b |
| Cp b5 | 199.28 | ab |
Tulpina Usa2 a prezentat cea mai mare capacitate de a stimula dezvoltarea plantulelor de floarea-soarelui, asigurată statistic față de martorul neinoculat.
A fost testata și capacitatea tulpinii Usa2 pentru producerea de enzime cu rol in mineralizarea materialului vegetal, determinându-se activitatea celulazică, cea proteazică și cea amilazică.
Activitatea celulazică a fost determinată prin însămânțarea pe mediu minimal, fără sursă de carbon, repartizat în placi petri, în care s-a adăugat 1% carboxi-metil-celuloză. Acestea au fost incubate la 28°C timp de 5 zile după care au fost colorate timp de 30 minute cu 0,3% roșu de Congo, urmata de clătire cu apă de robinet si fixarea colorantului prin incubare timp de 15 minute cu 10% acid acetic. Descompunerea substratului carboxi-metil-celuloză și, deci, producerea de
A.S.A.S.
Gh. lonescu o Sisești tf. CEaCfy2 O 1 O - O 1 1 5 8 - 2 Ί -11- 2010 celulază a fost indicată de apariția unei zone clare in jurul creșterii bacteriene. Tulpina Usa2 produce celulază.
Producerea de amilază s-a pus in evidenta prin însămânțarea sub forma de striu pe nutrient agar (NA) suplimentat cu 0,4% amidon solubil. Plăcile au fost incubate la 28°C timp de 48 -72 ore, apoi inundate cu soluție de iod în iodură de potasiu. Zonele clare din jurul creșterii bacteriene, după adăugarea soluției de iod au indicat descompunerea amidonului din mediu deci, producerea de amilază. Testele au indicat faptul că tulpina Usa2 produce amilază.
Producerea de proteaze s-a testat pe mediu minimal mineral, suplimentat cu cazeină 5%. S-au inoculat tulpinile de bacterii de test și plăcile au fost incubate la 28°C timp de 48 -72 ore. După incubare s-a tratat plăcile de agar au fost fixate cu o soluție de 50% metanol, 10% acid acetic glacial, 40% apă distilată, iar halo-urile din jurul coloniilor bacteriene au fost colorate cu o soluție de 60 mg/l Coomasie Blue R-250 în acid acetic 10%. Rezultatele au stabilit faptul că tulpina Usa2 este producătoare de proteaze.
Pentru că rezultatele au evidențiat faptul că tulpina Usa2 de B. subtilis produce enzime implicate în degradarea materialului vegetal, a fost testată și pentru capacitatea de mineralizare a substratului organic (prin determinarea respirației, folosind ca substrat material vegetal și a eliberării de glucide și fosfor solubile din materialul vegetal).
Pentru evidențierea capacității de degradare a materialului vegetal, s-a realizat un experiment prin care s-a urmărit consumul de oxigen și eliberarea diferiților compuși din material vegetal tratat cu tulpini de microorganisme. Materialul vegetal (fân de măzăriche păroasă în cazul bacteriilor sporulate gram pozitive) a fost măcinat in blender și trecut apoi pe sita de 0,250 mm. S-au ambalat câte 10 g de pulbere in pungi de polietilena, care s-au sterilizat prin iradiere garrima (la IRASM, IFIN, București). Din pulberea sterilizată s-au luat aseptic câte 0,1 g care s-au adus aseptic într-un Erlenmayer de 50 ml steril. Peste pulberea fin măcinată, s-au adăugat aseptic 19 ml tampon fosfat steril. Conținutul a fost omogenizat prin agitare și inoculat apoi cu 1 ml suspensie microbiană, normalizată la 108 ufc/ml. S-a menținut la agitator timp de 24 ore, la temperatura de 28°C, după care, s-a trecut aseptic într-un vas de respirație Strathox (Strathkelvin Instrumente Limited, Glasgow, Marea Britanie). S-au efectuat determinările de respirație / producere de bioxid de carbon timp de 12 ore. După efectuarea determinărilor de respirație, s-a separat prin filtrare supernatantul, în care s-a determinat Carbonul Organic Total (TOC) cu un aparat Formacs HT (Skalar Analytical B.V., Breda Olanda), glucidele reducătoare (cu reactiv DNS) și fosforul solubil total (cu molibdat de amoniu și reactiv clorostanic).
io α- 2 Ο 1 Ο - ο 1 1 5 8 - 2 4 -11- 2010
Pentru determinarea capacității de mineralizare a substratului vegetal au fost testate 7 tulpini bacteriene: 56.1s; 77.3; 58.2, 77.1s si 82.1s din probe de sol provenite din Bărăganul de sud; Usa2 izolat din rizosferă de usturoi (Oltenia de Sud) și Mz.sl izolat din sol cultivat cu mazăre (Dobrogea de sud) și 3 tulpini de Trichoderma: Td67 și Td85 izolate din Bărăganul de Sud și Tm, izolat din Oltenia de Sud. Probele au fost analizate comparativ cu doi martori respectiv, martor fără inocul bacterian și martor în care bacteria a fost cultivată in mediu uzual de creștere (Luria Bertani lichid).
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 7. Aceste rezultate demonstrează existența unei activități ridicate de hidroliză a materialului vegetal de către majoritatea tulpinilor de microorganisme testate (care anterior, în testele de screening au prezentat activitate celulazică, proteazică, amilazică).
Tab. 7. Activitatea de degradare a materialului vegetal de către tulpinile de microorganisme testate*.
| Tulpina | Respirație (mg/l O2 consumați, medie orară) | Conținut de carbon organic total în supernatant (mcg/l) | Glucide solubile (mcg/l) | Fosfor solubil (mcg/l) |
| 56.1s | 0,12±0,03c | 0,24±0,02c | 1,67±0,06c | 0,02+0,01c |
| 77.3 | 1,56±0,32b | 3,87± 1,17b | 12,24±0,28b | 17,87± 2,17b |
| 58.2 | 1,51±0,05b | 4,54±1,05b | 12,64±0,41b | 16,54±1,25b |
| 77.1S | 1,54±0,24b | 4,54±1,25b | 12,64±0,41b | 18,42+1,54b |
| 82.1s | 1,85±0,18ab | 5,87±3,17ab | 22,24±0,28ab | 27,87±4,17ab |
| Usa2 | 2,15±0,04a | 7,24+2,52a | 29,87±0,36a | 35,24±3,52a |
| Mz.sl | 1,62±0,12b | 3,24±1,12b | 11,87±0,63b | 15,24±2,27b |
| Td67 | 1,58±0,28b | 3,87± 1,72b | 12,24±0,28 | 17,87+ 3,23b |
| Td85 | 2,24±0,14a | 7,54±1,25a | 27,64±0,81a | 36,44±4,07a |
| Tm | 1,87±0,16ab | 5,24±2,85ab | 16,72±0,74b | 15,42±2,23b |
*valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05.
Martorul negativ conferă informații în timp real, referitoare la comportamentul unor probe ideale, fără activitate biologica de degradare a substratului vegetal, în condițiile de desfășurare a testului. în această variantă, substratul vegetal nu a fost inoculat cu microorganisme și a fost menținut in condiții identice de incubare cu cele ale probelor test. Acesta oferă informații referitoare la cantitatea maximă de oxigen care ar putea fi regăsită în probe fără activitate de biodegradare. Martorul pozitiv oferă informații cu privire la capacitatea 11
/<-2 0 1 0 - 0 1 1 5 8 -2 4 -11- 2010 de dezvoltare a tulpinii analizate, în condițiile unei cultivări pe mediu uzual de creștere. Acest mediu permite multiplicarea microorganismului datorita unei hrăniri corespunzătoare si în condițiile de incubare oferite pe parcursul desfășurării testului.
Tulpina Usa2 prezintă o foarte ridicată capacitate de degradare a materialului vegetal, la nivelul ciupercilor din genul Trichoderma, ciuperci larg utilizate pentru accelerarea dezvoltării materialului vegetal.
A fost testată și capacitatea de producere de poliamine de către bacteriile selecționate. Mecanismul de acțiune prin care mulciul vegetal de leguminoase, și în special de măzăriche păroasă își exercită acțiunea de stimulare a creșterii plantelor este cel de modulare a nivelului de poliamine din plante (compuși cu acțiune de reglare a proceselor metabolice din plante recunoscuți în ultimul deceniu). Modularea se realizează prin aportul de poliamine endogene și precursori, compuși formați datorită descompunerii materialului vegetal de leguminoase, cu un conținut ridicat de proteine. Bacteriile gram pozitive sporulate care sunt cele mai potrivite pentru formarea mulciului bioactiv sunt deci acele microorganisme care au capacitatea cea mai ridicată de a produce poliamine din materialul vegetal de măzăriche păroasă. S-a lucrat cu pulbere de măzăriche păroasă, obținută conform metodei descrise deja. Din pulberea sterilizată s-au luat aseptic câte 0,1 g de pulbere de material vegetal, care s-au adus aseptic într-un Erlenmayer de 50 ml, steril. Peste pulberea fin măcinată s-au adăugat aseptic 19 ml tampon fosfat steril. S-a omogenizat prin agitare și s-a inoculat apoi cu 1 ml suspensie bacteriană, provenită din cultură de 12 ore pe mediu LB, normalizată la 108 ufc/ml. S-a menținut la agitator timp de 72 ore, la temperatura de 28°C, după care s-a separat cultura bacteriană prin centrifugare la 5000xg pentru 20 min la 4°C. Supernatantul a fost acidifiat cu acid percloric, până la obținerea unei soluții de concentrație finală 5%. Supernatantul acidifiat a fost derivatizat prin dansilare (Smith și Meeuse, 1996, Garcia-Moruno et al., 2005, Cassan et al., 2009). Poliaminele au fost sperate și identificate prin cromatografie în strat subțire, folosind amestecuri cloroform-trietanolamină (9:1) și n-hexan- acetat de etil (2:1) și comparându-le cu valorile compușilor standard dansilați. Plăcile de siliciu au fost observate în lumină UV, spoturile selectate au fost trecute cantitativ de pe placă într-o eprubetă. Din silicagel s-au eluat poliaminele dansilate cu soluție de metanoltoluen (9:1). Fluorescența a fost măsurată prin spectrofluorimetrie, folosind lumină de excitare de 415 nm și lumină de emisie de 510 nm.
Rezultatele au demonstrat faptul că tulpina Usa2 are cea mai mare capacitate de producere de poliamine (compuși implicați mai ales în răspunsul plantelor la diferite forme de stres) din materialul vegetal de măzăriche păroasă.
CV 2010-01158-2 4 -11- 2010
Capacitatea sa este mai ridicată decât a tulpinii etalon Az39 de Azospirillum brasiliense, citată în literatura de specialitate ca fiind producătoare de poliamine.
(Cassana et al., 2009, Cadaverine production by Azospirillum brasilense and its role in plant growth promotion and osmotic stress mitigation. Eur J. Soil Biology 45:
12-19).
Tulpina Usa2 a fost analizata in ceea ce privește inocuitatea pe larve de Galleria mellonella in conformitate cu protocolul descris de Seed et al. in 2008. Pentru aceasta, tulpina Usa2 de Bacillus subtilis a fost cultivata pe mediul LB la 28°C cu agitare la 150 rpm timp de 48 ore, după care a fost centrifugată la 4000 rpm, iar sedimentul a fost resuspendat in 10mM MgSO4 suplimentat cu 1,2 mg/ml ampicilina. Concentrația inoculului utilizat pentru tratarea larvelor a fost măsurată cu spectrofotometrul la OD 600 (cunoscându-se ca OD600 = 1 reprezintă 108 ufc/ml). Larvele de G. mellonella au fost crescute pe mediul Haydak la 30°C. Pentru testul de inocuitate, larvele in ultimul stadiu au fost ținute la 4°C timp de 5 minute, după care au fost injectate cu 5μΙ suspensie bacteriana, utilizând o seringă Hamilton. Fiecare varianta de diluție a cuprins 30 larve, iar zece larve au fost utilizate pentru fiecare repetiție. Varianta martor a constat in larve injectate cu 5μΙ 10mM MgSO4 si 1,2 mg/ml ampicillin in scopul analizării efectelor fizice letale determinate de injecții. Larvele inoculate au fost menținute apoi pe mediul Haydak la 30°C în întuneric. La 24, 48 si 72 ore după infecție larvele au fost analizate, iar cele moarte au fost numărate. Larvele care nu au prezentat semne vitale la atingerea cu vârful pipetei au fost considerate moarte. Rezultatele au evidențiat faptul că tulpina Usa2, nici atunci când a fost aplicată nediluată, nu a determinat o mortalitate mai mare de 50%, iar la diluția de 103 ufc/mL'1 nu s-a determinat mortalitatea larvelor de G. mellonella (tabel 8).
Tab. 8. Mortalitate larvelor de Galleria mellonella injectate cu suspensii bacteriene de 106 ufc/ml din tulpinile de testat.
Varianta
Martor mM MgSO4+ 1.2 mg/ml ampicilina (DO 0,000) ore post- 48 ore post- 72 ore postRepetiția infecție infecție ' infecție
| vii | moarte | vii | moarte | vii | moarte | crisalide | |
| R1 | 10 | 0 | 10 i | 0 | 10 | 0 | 2 |
| R2 | 10 | 0 | 10 | 0 | 9 | 1 | 1 |
| R3 | 10 | 0 | 10 | 0 | 9 | 1 | - |
| R1 | 10 | 0 | 9 | 1 | 8 | 2 | - |
| R2 | 8 | 2 | 8 | 2 | 8 | 2 | - |
| R3 | 10 | 0 | 10 | 0 | 9 | 1 | 1 |
Oj 2 D 1 0 - 0 ' 5 6 - 2 4 -11- <1010
Datele din tab. 8 demonstrează faptul că tulpina testată, Usa2, nu prezintă practic patogenitate față de larvele de Galleria mellonella, neavând capacitatea de a se multiplica în corpul larvelor și de a produce bacteremii, deși au fost injectate în limfa larvelor. Seriile de experimente întreprinse in scopul verificării activității biologice a tulpinii Usa2 de Bacillus subtilis au demonstrat prezența unui spectru larg de acțiune antifungică față de diferite ciuperci fitopatogene, o capacitate semnificativă de stimulare a creșterii plantelor și o activitate mărită de producere a unor exohidrolaze implicate în mineralizarea materialului vegetal. Tulpina Usa2 nu prezintă patogenitate pentru organisme ne-țintă.
Toate aceste caracteristici prezintă complementaritate cu tehnologiile agricole conservative, inclusiv cu cele care implică conversia culturilor verzi de protecție în timpul iernii în muici. In aceste tipuri de tehnologii conservative, sunt reduse lucrările solului și se menține peste 30% din teren acoperit cu resturi vegetale. In aceste condiții, semințele plantelor de cultură germinează mai greu și este creat un cadrul favorabil atacului agenților fitopatogeni. Aplicarea tulpinilor cu calități biologice menționate anterior peste resturile vegetale de pe sol, compensează aceste dezavantaje ale tehnologiilor agricole conservative.
Pentru a verifica în practică modul în care caracteristicile favorabile ale tulpinii Usa2 compensează o serie din dezavantajele sistemelor de agricultură conservativă s-a realizat un experiment de câmp.
Experimentele de cultivare au fost realizate pe un cernoziom cambie, la Amzacea (Dobrogea). Cultura de măzăriche de toamnă (păroasă) Vicia villosa, cv. Welta, a fost semănată direct în miriștea de grâu, la sfârșitul lunii septembrie. S-a folosit o mașină de semănat direct în miriște și s-a semănat la o densitate de 120 ...140 boabe germinabile de măzăriche/m2, corespunzând unei cantități de 40...45 kg/ha. Adâncimea de semănat a fost de 5...6 cm.
In primăvară s-a transformat cultura de măzăriche în muici bioactiv prin tăvălugire, și tratare cu 900 ... 1000 litri de suspensie care include un erbicid total pe bază de glifosat, aplicat în doză de 1,25 ... 1,5 kg s.a./ha și o suspensie de 105 ufc/ml Bacillus subtilis Usa2. La 5 zile după tratamentul cu bacterii s-a însămânțat o cultură de floarea-soarelui (cv. Rumbasol Or), la o densitate de 50 ... 55000 semințe germinabile/ha, direct în mulciul vegetal, prin folosirea unei mașini de semănat direct în miriște. In continuare cultura de floarea-soarelui s-a întreținut conform tehnologiei uzuale până la recoltare. S-a lucrat față de o variantă martor intensiv, la care s-a realizat arătură de toamnă adâncă, tratarea cu erbicide premergente și post-emergente. De asemenea s-a folosit și o variantă la care nu s-a realizat bioactivarea mulciului vegetal cu bacterii Usa2. Fiecare variantă a fost realizată în 4 repetiții.
<2 010-01158-2 4 -11- 2010
In stadiul apariției primelor calatidii înflorite în cadrul dezvoltării florii soarelui s-a determinat vigoarea plantelor, înălțimea și biomasa aeriană. Vigoarea plantelor s-a diferențiat semnificativ în stadiul apariției primelor calatidii. Pe o scară de la 1 la 9, la sistemul intensiv vigoarea plantelor a fost de doar 7, în pofida condițiilor climatice foarte favorabile pentru floarea-soarelui în anul de experimentare. La sistemul în care s-a folosit muici vegetal vigoarea a crescut la 7,5. La sistemul cu muici bioactivat, tratament al mulciului cu suspensie de bacterii Usa2 plantele de floarea-soarelui au prezentat o vigoare sporită de 8,5. înălțimea plantelor nu a fost influențată semnificativ de sistemul tehnologic, dar la mulciul bioactiv(at) cu Usa2 plantele au acumulat o semnificativ mai multă biomasă. In final vigoarea suplimentară a plantelor de floarea-soarelui cultivate în muici bioactivat s-a concretizat într-un spor de producție de aprox.10%. Rezultatele experimentului de câmp sunt prezentate în tab. 9.
Tab. 9. Influența diferitelor sisteme tehnologice asupra creșterii și producției florii-soarelui1.
Amzacea, 2010
| Varianta | Vigoarea2 medie a plantelor | înălțimea plantei2 (cm) | Biomasă aeriană uscată2 (g) | Producția kg/ha |
| Martor intensiv, arat | 7 | 96,6a | 8,85a | 2820a |
| Muici vegetal | 7,5 | 98,3a | 9,08a | 2920a |
| Muici vegetal bioactivat cu Usa2 | 8,5 | 94,5a | 9,87b | 3270b |
1 - valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05.
2- stadiul apariției calatidiilor înflorite, vigoarea 1 - plante mici cu frunze mici; 9 - plante mari cu frunze robuste
Creșterile de producție s-au realizat în condițiile unui sistem conservativ, în care sunt reduse costurile de producție aferente folosirii erbicidelor și arăturii, iar folosirea unei culturi de protecție de măzăriche în timpul iernii este încurajată prin plățile compensatorii asociate măsurilor de agro-mediu.
Claims (1)
1. Tulpina B. subtilis Usa2, număr de depozit DSMZ 23654, caracterizată prin aceea că exercită acțiuni benefice asupra diferitelor plante de cultură, datorită activității de protecție față de ciupercile fitopatogene de sol Fusarium graminearum, Alternaria spp, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Gaeumannomyces graminis, Pythium debaryanum, Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Fusarium oxisporum f. sp. radicis-lycopersici, Sclerotium bataticola, producerii in situ de factori de creștere pentru plante și capacității de degradare controlată a materialului vegetal cu formare de poliamine, compuși care cresc rezistența plantelor la stress-urile biotice și abiotice, care se concretizează prin sporuri de producție la floarea-soarelui, realizate în condițiile unui sistem agricol conservativ, în care sunt reduse costurile de producție aferente folosirii erbicidelor și arăturii.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001158A RO127514B1 (ro) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001158A RO127514B1 (ro) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO127514A2 true RO127514A2 (ro) | 2012-06-29 |
| RO127514B1 RO127514B1 (ro) | 2015-02-27 |
Family
ID=46319368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA201001158A RO127514B1 (ro) | 2010-11-24 | 2010-11-24 | Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO127514B1 (ro) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2495119C1 (ru) * | 2012-11-29 | 2013-10-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 8A В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ |
| EP2765185A3 (en) * | 2013-02-11 | 2014-08-27 | SC Euro Bio SRL | Strain of Brevibacillus parabrevis and controlled release composition based on it |
| CN112877258A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-01 | 南京吉星生物技术开发有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌jx-20菌株及其应用 |
| CN116004466A (zh) * | 2023-01-07 | 2023-04-25 | 内蒙古农业大学 | 防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用 |
-
2010
- 2010-11-24 RO ROA201001158A patent/RO127514B1/ro unknown
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2495119C1 (ru) * | 2012-11-29 | 2013-10-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 8A В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ |
| EP2765185A3 (en) * | 2013-02-11 | 2014-08-27 | SC Euro Bio SRL | Strain of Brevibacillus parabrevis and controlled release composition based on it |
| CN112877258A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-01 | 南京吉星生物技术开发有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌jx-20菌株及其应用 |
| CN116004466A (zh) * | 2023-01-07 | 2023-04-25 | 内蒙古农业大学 | 防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用 |
| CN116004466B (zh) * | 2023-01-07 | 2024-06-04 | 内蒙古农业大学 | 防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO127514B1 (ro) | 2015-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | Inoculation of siderophore producing rhizobacteria and their consortium for growth enhancement of wheat plant | |
| KR101569737B1 (ko) | 벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발 | |
| Malfanova et al. | Characterization of Bacillus subtilis HC8, a novel plant‐beneficial endophytic strain from giant hogweed | |
| Kulimushi et al. | Efficacy of Bacillus amyloliquefaciens as biocontrol agent to fight fungal diseases of maize under tropical climates: from lab to field assays in south Kivu | |
| Radovanović et al. | Biocontrol and plant stimulating potential of novel strain Bacillus sp. PPM3 isolated from marine sediment | |
| Tabli et al. | Plant growth promoting and inducible antifungal activities of irrigation well water-bacteria | |
| KR20230105465A (ko) | 고추 탄저병과 세균병 방제 및 생육촉진 효과를 가진 다기능 천연식물보호제 개발 | |
| Khalil et al. | Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by plant growth promoting rhizobacteria in inhibiting the soilborne pathogens in Faba Bean Plants | |
| KR101677513B1 (ko) | 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가지는 페니바실러스 폴리믹사 균주 및 이의 이용 | |
| Vida et al. | Characterization of biocontrol bacterial strains isolated from a suppressiveness-induced soil after amendment with composted almond shells | |
| AU2004284329B2 (en) | Fungus capable of controlling poaceous plant disease damage, and utilizing the same, controlling agent, method of controlling and biomaterial | |
| KR101005484B1 (ko) | 식물병원균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 ｃｊｓ－49 ｋｃｔｃ 11109ｂｐ 및 이를 포함하는 생물농약 | |
| KR100812649B1 (ko) | 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 속ｖｓｖ-12 ｋｃｔｃ１０９３６ｂｐ 및 이를 이용한 식물병원균 방제제 | |
| RO127514B1 (ro) | Tulpina de bacillus subtilis cu activitate de combatere a agenţilor fitopatogeni din sol, stimulare a creşterii plantelor şi biodegradare controlată a materialului vegetal | |
| KR20180091598A (ko) | 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ａｋ―０ 균주 및 이를 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제 | |
| Chebotar et al. | The effect of endophytic bacteria Bacillus thuringiensis W65 and B. amyloliquefaciens P20 on the yield and the incidence of potato rhizoctoniosis and late blight | |
| RO127468A2 (ro) | Tulpină de bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum cu acţiuni benefice diverse asupra plantelor de cultură | |
| KR100735572B1 (ko) | 주요 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는스트렙토마이세스 파다누스 ｖｓｐ－32 및 이를 이용한식물 병원균 방제용 미생물 제제 | |
| KR20130041530A (ko) | 바실러스 섭틸리스 ｐｂｓ-5 및 이를 이용한 토양개량용 미생물 제제 | |
| KR101107330B1 (ko) | 인삼 근부병을 억제하는 신규한 스트렙토마이세스 스포로클리바투스 균주 | |
| KR101027082B1 (ko) | 식물 병원균에 대한 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 미조넨시스 ｃｊｓ-70 균주 및 이를 이용한 식물 병원균방제용 미생물 제제 | |
| AU2019347770B2 (en) | Methods and compositions for bioprotection of potatoes from Streptomyces scabies | |
| KR100646597B1 (ko) | 농작물의 생장을 돕는 슈도모나스 에스피 ＲＲｊ228 및이를 함유하는 미생물 제제 | |
| KR100726864B1 (ko) | 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스그리세오푸스쿠스 ｖｓｇ―１６ ｋｃｔｃ 10930ｂｐ 및이를 이용한 식물 병원균 방제제 | |
| RO127467A2 (ro) | Tulpina de brevibacillus laterosporus antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene |