RO130014A2 - Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale - Google Patents
Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale Download PDFInfo
- Publication number
- RO130014A2 RO130014A2 ROA201300465A RO201300465A RO130014A2 RO 130014 A2 RO130014 A2 RO 130014A2 RO A201300465 A ROA201300465 A RO A201300465A RO 201300465 A RO201300465 A RO 201300465A RO 130014 A2 RO130014 A2 RO 130014A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- vgf
- pancreas
- stomach
- tumor
- small intestine
- Prior art date
Links
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims description 8
- 206010052399 Neuroendocrine tumour Diseases 0.000 title abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 10
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 claims description 22
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 abstract 1
- 101800003344 Vaccinia growth factor Proteins 0.000 description 28
- 101800001863 Variola growth factor Proteins 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000001943 adrenal medulla Anatomy 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 108010000307 VGF peptide Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 2
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 2
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 208000014680 small intestine neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000627 threshold limit value Toxicity 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 1
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000953653 Homo sapiens Neurosecretory protein VGF Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010041329 Somatostatinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 101150004676 VGF gene Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 208000006336 acinar cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019439 energy homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000044639 human VGF Human genes 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000004412 neuroendocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021010 pancreatic neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000010882 preoperative diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la o metodă pentru identificarea unor tumori neuroendocrine, localizate la nivelul pancreasului, stomacului, intestinului subţire şi al glandei suprarenale la un pacient.. Metoda conform invenţiei constă în măsurarea concentraţiei de VGF şi/sau a fragmentelor sale dintr-o probă biologică recoltată de la pacient, după care valoarea concentraţiei obţinute se corelează cu o valoare de referinţă de 0,05 p moli/ml, o concentraţie mai mare indicând prezenţa unei tumori sau a recidivelor.
Description
A. DESCRIEREA INVENȚIEI
1. TITLUL INVENȚIEI
Metodă de diagnosticare și monitorizare a tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale glandei suprarenale.
2. PRECIZAREA DOMENIULUI TEHNIC LA CARE SE REFERĂ INVENȚIA
Invenția se referă la o metodă de diagnosticare și monitorizare a tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale glandei suprarenale, care se poate folosi în domeniul oncologic.
3. PREZENTAREA STADIULUI TEHNICII
Markerii (biomarkerii) sunt substanțe produse de o tumoră sub formă de hormoni, enzime sau alte proteine, iar cantitatea lor este legată de o creștere a tumorii și a numărului de celule tumorale prezente și producătoare de marker. Acești markeri sunt stocați în celulele tumorale și pot ti eliberați în spațiile inter-celulare, trecând apoi în sânge. Interesant, acești marken pot apărea, prin urmare, în sânge, chiar și atunci când dimensiunea tumorii este mică și nu poate da naștere la simptome clinice.
Biomarkerii semnalizează prezența unei tumori (producătoare de markeri) sau a evoluției sale clinice, chiar și în absența simptomelor clinice. Mai mult decât atât, se referă la un diagnostic într-un mod mai specific și precoce sau poate anunța reapariția unei tumori după terapie. în plus, ei pot fi folosiți limitat în studii de screening, deoarece absența markerului oferă dovezi clinice ale absenței tumorii.
Biomarkerii au intrat în practica de rutina clinică, deoarece aceștia pot fi ușor detectați în sânge, ser sau plasma și testele aferente sunt de obicei practicate de fiecare laborator, acestea putând fi repetate de mai multe ori la același pacient
Gena VGF codifica pentru un precursor neuropeptid, care este exprimat într-un sub-grup de neuroni ai sistemului nervos central și periferic și în anumite celule neuro-endocrine ale adenohipofizei, ale medularei suprarenale, ale sistemului gastro-intestinal și ale pancreasului. VGF este un factor de creștere nervos și joacă un rol esențial în homeostazia energetică a organismului. Proteina VGF umană este alcătuită din 615 aminoacizi, iar proteinele VGF la ^2013*00465
0 -06- 2013 &
șoareci și șobolani au 617 aminoacizi. Proteinele umane și de șobolan prezintă similitudini în proporție de aproximativ 85%. Precursorul neuropeptid este dotat cu o secvență de 22 aminoacizi lungime, care promovează translocația reticulului endoplasmatic.
în precursorul neuropeptid al VGF și în VGF complet matur sunt prezente mai multe fragmente scurte de reziduuri de bază, care sunt potențiale țintă pentru peptidaze, a căror acțiune generează fragmente scurte dc peptide de VGF.
Astfel de peptide au fost detectate la om și șobolan.
Stark et al, 2001, au identificat 3 fragmente N-terminale de aminoacizi cu lungimi de la
- 62 și 26 - 62 (trunchiere la capătul N al peptidului 23-62) și de la 23 la 59 (trunchiere la capătul C al peptidului 23-62) - în lichidul cefalorahidian al pacienților cu tulburări psihice cunoscute. Utilizarea VGF ca marker tumoral serologic pentru tumorile pulmonare a fost propus de către Matsumoto T et al. (Int J Biol Markere 2009; 24:282-5).
4. PREZENTAREA PROBLEMEI TEHNICE
Problema pe care și-o propune să o rezolve prezenta invenție este de a stabili un marker în lichidul biologic examinat, respectiv sânge, ser, plasmă, urină, salivă, secreții sau în extract de țesuturi sau organe, pentru diagnosticarea t umorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale glandei suprarenale, producătoare de VGF, prin detectarea și urmărirea proteinei VGF și a fragmentelor sale, fiind o metodă rapidă și accesibilă care minimalizează sau chiar elimină riscul rezultatelor fals negative
Am observat, spre surprinderea noastra ca fragmentele VGF sunt prezente in sângele pacienților cu tumori primitive neuro-endocrine ale pancreasului, producătoare de VGF. Mai precis, am remarcat că acest marker neuro-endocrin este prezent în tumori mici T1N0M0, ceea ce nu se intampla cu alti markeri tumorali care cresc doar la un volum mare al tumorii. Spre deosebire de toti ceilalți markeri pentru tumorile neuro-endocrine, cum ar fi cromogranina, detectarea fragmentelor VGF în sânge pentru depistarea precoce a tumorii sau a recidivei, nu ar fi expusa riscului de rezultate fals pozitive, deoarece prezența acestui marker peste valorile limită prag ar avea loc numai în prezența unor leziuni cerebrale severe, un eveniment puțin probabil la pacientii cu o tumora neuroendocrina a pancreasului aflata in stadii timpurii.
Invenția este legată de o metodă in vitro de identificare și detectare a prezenței sau de monitorizare a progresiei unei tumori neuroendocrine, producătoare de VGF, localizată la nivelul ^-2 0 1.3 - Ο Ο 465
I Ο -06- 2013 pancreasului, stomacului, intestinului subțire și medularei suprarenale, la un pacient, sau pentru a urmări evoluția bolii și rezultatul terapiei.
De asemenea, prezenta metodă reușește să faciliteze localizarea tumorii primare sau a metastazelor sale, chiar și in tumori mici, greu de detectat, sau palpa. Astfel, demonstrarea faptului ca VGF și/sau fragmentele sale prezente la nivel celular în tumorile neuroendocrine ale pancreasului, stomacului, intestinului subțire și modularei suprarenale, permite odată cu detectarea prezenței peptidelor în ser, plasmă, urină, salivă, secreții și extracte de țesuturi și organe, detectarea localizării tumorii primare sau a metastazelor sale, folosind anticorpi marcați cu substanțe radioactive. Acest lucru permite tratamentul chirurgical sau radio-terapeutic, chiar în tumori mici, greu de detectat sau palpa.
5. EXPUNEREA INVENȚIEI
Descrierea invenției.
Am observat, spre surprinderea noastra ca fragmentele VGF sunt prezente in sângele pacienților cu tumori primitive neuro-endocrine ale pancreasului, producătoare de VGF. Mai precis, am remarcat că acest marker neuro-endocrin este prezent în tumori mici T1N0M0, ceea ce nu se intampla cu alti markeri tumorali care cresc doar la un volum mare al tumorii. Spre deosebire de toti ceilalți markeri pentru tumorile neuro-endocrine, cum ar fi cromogranina, detectarea fragmentelor VGF în sânge pentru depistarea precoce a tumorii sau a recidivei, nu ar fi expusa riscului de rezultate fals pozitive, deoarece prezența acestui marker peste valorile limită prag ar avea loc numai în prezența unor leziuni cerebrale severe, un eveniment puțin probabil la pacientii cu o tumora neuroendocrina a pancreasului aflata in stadii timpurii.
Invenția dc față este, prin urmare, legată de detectarea unor fragmente VGF în sânge pentru un diagnostic precoce al tumorilor neuroendocrine ale pancreasului și ale tumorilor producătoare de VGF ale stomacului, intestinului subțire si ale medularei suprarenale. Mai mult decât atât, aceasta invenție este legată de exploatarea valorii prognostice, în scopul de a detecta (sau exclude), într-un stadiu precoce a unei recidive tumorale.
In plus, demonstrarea faptului că VGF și / sau fragmentele sale sunt prezente la nivel celular în tumorile neuroendocrine ale pancreasului, stomacului, intestinului subțire și medularei suprarenale, permite, odată cu detectarea prezenței peptidelor în sânge, detectarea localizării ari O 1 3 - 0 0 4 6 5
0 -06- 2013 tumorii primare sau a metastazelor sale folosind anticorpi marcați cu substanțe radioactive, ceea ce va permite tratamentul chirurgical sau radio-terapeutic, chiar și în tumori mici, greu de detectat sau palpa.
Prin urmare, invenția se referă la o metodă in vitro de identificare și detectare a prezenței sau de monitorizare a progresiei unei tumori neuroendocrine, producătoare de VGF, localizată la nivelul pancreasului, stomacului, intestinului subti re si medularei suprarenale, la un pacient, sau pentru a urmări evoluția bolii și rezultatul terapiei.
Metoda implică:
a) colectarea și prepararea probelor biologice ale pacientului,
b) măsurarea concentrației de VGF și / sau a fragmentelor sale în proba biologică.
c) corelarea valorii concentrației obținute cu o valoare de referință, unde o concentrare mai mare decît valoarea de referință va indica prezența tumorii sau evoluția bolii.
Se va alege proba biologică ce urmează sa fie analizată dintre sânge, ser, plasmă, urina, salivă, secreții sau extract de țesuturi sau organe. Conform invenției, pot fi analizate fie proteinele mature cu lungime completă sau peptidele generate de acțiunea proteolitică asupra secvenței VGF. Fragmentele sunt în general de cel puțin 4 aminoacizi și, de preferință vor fi alcătuite din 4 la 20 sau mai mulți aminoacizi (până la 614). Concentrația de VGF sau fragmente conexe în proba biologică va fi determinată prin imunodozare, spectrometrie de masă, electroforeză în gel, gel-filtrare, cromatografie sau HPLC, de preferință cu radioimunodozare sau enzimoimunodozare în faza solida de tip competitiv, secvențial sau simultan, și mai precis, cu imunodozare ELISA.
într-o procedură de realizare, metoda invenției se aplică pentru identificarea prezenței unei tumori neuroendocrine a pancreasului, stomacului, intestinului subțire și medularei suprarenale, iar în aceste cazuri vom folosi ca valoare de referință valoarea medie a concentrației VGF sau a fragmentelor sale în probele biologice din populația generală sănătoasă, neafectată de o neoplazie.
într-o altă procedură de realizare, metoda invenției este utilizată pentru a monitoriza evoluția bolii, și, în acest caz, vom folosi ca valoare de referință concentrația de VGF sau a fragmentelor sale în probele biologice, care au fost anterior obținute de la același pacient, într-o altă procedură de realizare, metoda invenției permite urmărirea răspunsului la tratament și, în acest caz, valoarea de referință este legată de concentrația de VGF și / sau or 2 Ο 1 5 - 0 Ο 4 6 5
Ο -Κ- 2013 fragmente sale în una sau mai multe probe biologice obținute anterior de la același pacient în timpul tratamentului.
Un aspect al invenției este legat de existența unui kit pentru a realiza metoda descrisă aici, un astfel de kit incluzând, în cutii separate, anticorpi anti-VGF și / sau anticorpii secundari marcați cu un marker trasabil și / sau VGF sau fragmente marcate cu un marcator urmăribil și după caz, reactivi si tampoane.
Un alt aspect al invenției se referă la utilizarea VGF a unui fragment imunogen ca marker de tumori neuro-endocrine producătoare de VGF ale pancreasului, stomacului si intestinului subțire si a medulosuprarenalei, pentru testarea in vivo sau in vitro.
Descrierea detaliata a invenției
Un exemplu non-exhaustiv al metodei biologice este reprezentat de un dozaj imuno enzimatic de tip competitiv, secvențial sau simultan în fază solidă, în care un ligand este în concurență cu un trasor pentru interacțiunea cu un obiectiv specific.
Aceasta metodă poate fi utilizată cu molecule de VGF sau peptidele rezultate alcătuite din secvențe de 4 până la 20 de aminoacizi. Aceste dimensiuni ale peptidelor nu vor permite interacțiunea în același timp a doi liganzi specifici cu diferite situsuri ale aceleiași peptide (procedura celor 2 situsuri).
Ligandul este alcătuit, în acest caz, de peptida moleculei de VGF prezentă în lichidul biologic examinat, cc va intra m competiție cu marcatorul (trasorul) m interacțiunea cu situsul de legare, astfel inhibând legarea proporțional cu cantitatea sa. Trasorul este o peptidă marcată cu biotină la capătul N-terminal, marcarea fiind realizată prin legare directă sau utilizând un conector spațial. Situsul de legare este reprezentat de o moleculă capabilă să interacționeze într-o modalitate stabilă și specifică cu o peptidă și care este absorbit într-o faza solidă reprezentată în general de o suprafața de polistiren.
Un situs înalt selectiv este un anticorp, monoclonal sau policlonal, obținut prin imunizarea unui animal cu un ligand imunogenic, conform unor protocoale standardizate. In faza de început a testului, anticorpul purificat este absorbit pe o faza solidă ce a fost anterior activată astfel încât să maximizeze numărul de molecule ce pot fi legate. După saturarea pe suprafața libera cu albumina, faza solidă este expusă la o mixtură de reacție ce conține proba ce va fi
Ο 1 3 - Ο Ο 4 6 5
Ο -06- 2013
testată și ο cantitate dată de trasor. în timpul incubației, peptidul prezent în proba de testare intră în competiție cu trasorul biotinilat pentru legarea de anticorpul corespunzător, astfel încât cantitatea de trasor legat la faza solidă este invers proporțională cu cantitatea de peptid a trasorului din proba de testare. La sfârșitul reacției, moleculele libere, nelegate sunt îndepărtate prin spălare. O cantitate hiperstoichiometrică de streptavidin peroxidaza este apoi adaugată, dând naștere unui complex insolubil polistiren-anticorp-peptidă biotinilată-streptavidin peroxidaza.
După spalare și îndepărtarea reactivilor nelegați, enzima (peroxidaza) prezentă în faza solidă este evidențiată prin adugarea unei cantități constante de substrat/cromogen, care este în final citită printr-o procedură de tip fotometric.
Deoarece activitatea enzimatică este invers proporțională cu cantitatea de peptide prezentă în proba de testare, poate fi stabilită o curbă de calibrare, corelând intensitatea semnalului fotometric cu doza de peptide, și va permite astfel, prin interpolare, stabilirea unui conținut analitic al peptidei din proba de testare.
Procedura descrisă mai sus poate fi utilizată pentru a cuantifica una sau mai multe peptide, fiecare necesitând un anticorp specific și un trasor. Trasorul trebuie să fie preparat împreună cu producerea sintetică a peptidei, prin biotinilarea rezidurilor N-terminale, în timp ce anticorpul ar trebui preparat în conformitate cu procedura descrisă la punctul 8 din prezenta Descriere, adaptată la dimensiunile și caracteristicile structurale ale peptidei VGF ce va fi utilizată.
6. PREZENTAREA AVANTAJELOR procedura mai rapidă, în vederea diagnosticării tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale glandei suprarenale;
permite identificarea prezenței unei tumori neuroendocrine a pancreasului, stomacului, intestinului subțire și medularei suprarenale in stadiu precoce, utilizând probe biologice;
invenția poate fi utilizată și pe piese de rezecție chirurgicală;
necesită cantități reduse de lichide biologice sau extract de țesuturi sau organe facilitează monitorizarea evoluției bolii;
^-2 Ο 1 3 - 0 0 4 65
Ο <06- 2013 permite urmărirea răspunsului la tratament;
introducerea în practica a utilizării unui kit pentru a realiza metoda descrisă, incluzând, în cutii separate, anticorpi anti-VGF și / sau anticorpii secundari marcați cu un marker trasabil și / sau VGF sau fragmente marcate cu un marcator urmăribil și după caz, reactivi si tampoane;
este o procedură repetabilă și de înaltă precizie a rezultatului
7. PREZENTAREA PE SCURT A FIGURILOR DIN DESENE
Față de invenția prezentată, nu sunt desene sau figuri.
8. PREZENTAREA ÎN DETALIU A CEL PUȚIN UNUI MOD DE REALIZARE A INVENȚIEI REVENDICATE
Exemplul 1
Au fost imunizați iepuri de Noua Zeelandă prin administrarea de 2 mg de peptidă dizolvată în soluție salină și adiționată cu adjuvant complet Freund. Au fost efectuate două stimulări la interval de 20 zile utilizând aceeași cantitate de peptida dizolvata în soluție salină. La sfârșitul programului de imunizare, sângele animalului este obținut iar imunoglobulinele din ser sunt purificate prin absorbția proteinei A. Cantitatea lor este măsurată prin fotometrie utilizând coeficientul de absorbție ε28Ο = 1,38 (mg / ml). 150 microlitri de anti-ser policlonal (5 micrograme / ml în tampon fosfat de 50 mM, pH 7,5), sunt adăugate în microgodeurile unei plăci Maxisorp NUNC C8, se incubează peste noapte și imunoglobulinele neabsorbite sunt apoi spălate cu o soluție tampon. Situsurile nesaturate sunt apoi blocate folosind o soluție tampon care conține albumină serică bovină 0,5%, care este lăsata să reacționeze timp de 30 min.
După spălări suplimentare cu soluție salină tamponată, 50 microlitri de ser care urmează să fie analizat (a se vedea mai jos) sau, alternativ, a unei concentrații cunoscute de peptidă, și 100 microlitri de peptidă trasor, dizolvată în ser fiziologic, se adaugă în godeun. După 2 ore de incubare, godeurile sunt spălate intens și, în final se adaugă în godeuri 150 microlitri de streptavidin-peroxidază (Jackson Immunosearch, cod. 016-030-084), diluată într-o soluție HRP c<- 2 Ο 1 3 - Ο Ο 4 6 5
1 -06- 2013
StabilPlus (Kem-En-Tec Diagnostics, cod. 4530). Se lasă să reacționeze timp de 60 min. la temperatura camerei, apoi enzima nelegată se spală cu soluție salină. Se adaugă substrat / cromogen (150 microlitri), cu ajutorul unei soluții ready to use TMB One (Kem-En-Tec Diagnostics, cod. 4380), care conține un amestec de peroxid de hidrogen si tetrametilbenzidină. Reacția este oprită după 20 min., prin adăugarea a 100 microlitri de acid sulfuric 2N.
Densitatea optică a microgodeuriior se determină prin măsurarea absorbanței ia 450 nm în 10 min. de la oprirea reacției. Cu valorile obținute prin utilizarea unor concentrații cunoscute ale peptidei este posibil să se stabilească o curbă de calibrare monotonă ce corelează densitatea optică a godeului cu concentrația de peptidă care urmează să fie măsurată. Prin verificarea pe această curbă a valorii intensității optice obținute dintr-un eșantion necunoscut (ser de șobolan) este posibil să se obțină concentrația de peptide. Eliberarea în sânge a peptidelor VGF de la o tumoră experimentală neuroendocrine medulosuprarenaliene (PCI 2 feocromocitom transplantabil Ia șobolani) a fost verificata cu procedura de mai sus. Celulele PC12 (RCB009) au fost cultivate în vase de 75 cm2 într-un mediu Dulbecco Eagle modificat (de MDEM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Statele Unite ale Americii), care conține 10% ser fetal bovin (Gibco BRL). într-o atmosferă umedă cu CO2 5% - 0295 % la 37 ° C. Celule (5x 106 au fost transplantate subcutanat la femele Sprague-Dawley (8 săptămâni, 250 g). La intervale de timp de 15, 30, 45 și 60 zile, au fost obținute probe de sânge din coada. La 60 de zile masa tumora subcutanată a ajuns la o dimensiune palpabilă. S-a stabilit o valoare prag pe baza datelor obținute din probele de sânge de îa 10 șobolani de control. în animalele transplantate cu celule PCI2 derivate dintr-un feocromocitom a medulosuprarenalei, valorile pozitive s-au obținut deja după 30 de zile de la implantare și au continuat să crească până la 60 de zile. Aceste date dau dovezi experimentale ca peptidele VGF sunt eliberate din celule tumorale în sânge.
Exemplul 2
Au fost investigați 40 de pacienți ce au prezentat o masă tumorală de 3-5 cm detectată în zona pancreatică Ia CT si ecografie. Natura leziunii nu a putut fi clarificată înainte de operație. Probe de sânge obținute de la acești pacienți au fost investigate cu procedura ELISA mai sus menționată pentru fragmente VGF. Au fost recoltate probe de sânge de la pacienți cu gastrită ca probe control. Datele obținute au arătat că 10 pacienți cu o tumoare pancreatică au avut valori ^20 1 3 - 0 0 465
0 *ffi* 2013 mai mari decât valorile prag ale VGF - o valoare mai mica de 0,05p moli/ml este considerata negativa., în timp ce toate cele 10 controale și 30 dintre cei 40 de pacienti au avut valori sub valoarea prag.
Rezultatele au fost comparate cu examenul histologic al tumorilor pancreatice după operație. Tumorile aparținând celor 30 de pacienții VGF-negativi corespundeau cu adenocarcinoameie de pancreas exocrin (26 de cazuri) și cu carcinoarneie cu celule acinice (2 cazuri) și un caz cu o tumoră neuroendocrina producătoare de somatostatină. Cele 10 cazuri VGF-pozitive au corespuns tumorilor neuroendocrine ale pancreasului dovedite prin teste imunohistochimice positive pentru markeri neuroendocrine (cromogranină A și sinaptofizina). Ele au fost, de asemenea, VGF-pozitive prin imunohistochimie. Rezultatele indică faptul că procedurile EL1SA pentru fragmente VGF permit un anumit diagnostic preoperator de tumori neuro-endocrine ale pancreasului, permițând astfel o planificare adecvată clinică.
9. INDICAREA, DACĂ NU REZULTĂ ÎN MOD EVIDENT DIN CELE DE MAI SUS, A MODULUI ÎN CARE INVENȚIA ESTE SUSCEPTIBILĂ DE APLICARE INDUSTRIALĂ.
Față de cele expuse deja, apreciem că invenția noastră este susceptibilă de aplicare pe scară largă, atât timp cât poate duce la identificarea precoce a tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale glandei suprarenale precum și la monitorizarea eficienta a evoluției acestora înainte și după aplicarea tratamentului.
Claims (1)
- B. REVENDICĂRILEMetodă pentru diagnosticarea și monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului și intestinului subțire și cele ale suprarenalei, caracterizată prin aceea că după colectarea și prepararea probelor biologice ale pacientului, se procedează la masurarea concentrației <lc VGÎ și/sau a fragmentelor sate in prooa oioiogica, iar valoarea concentrației obținute se corelează cu valoarea de referință, unde o valoare mai mica de 0,05p moli/ml este considerata negativa, astfel, o concentrare mai mare decât valoarea de referință va indica prezența tumorii sau a recidivelor (evoluție nefavorabilă).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201300465A RO130014A2 (ro) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201300465A RO130014A2 (ro) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO130014A2 true RO130014A2 (ro) | 2015-01-30 |
Family
ID=52424271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA201300465A RO130014A2 (ro) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO130014A2 (ro) |
-
2013
- 2013-06-20 RO ROA201300465A patent/RO130014A2/ro unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6095702B2 (ja) | 線維症バイオマーカアッセイ | |
| CN107255726B (zh) | 定量检测人甲状旁腺激素的荧光免疫层析试纸及其制备方法 | |
| RU2014123987A (ru) | Анализ адромедуллина и способы определения зрелого адромедуллина | |
| ES2409058T3 (es) | Método para someter a prueba la enfermedad de Alzheimer midiendo la tasa de degradación de beta-amiloide en sangre y reactivo de diagnóstico | |
| BRPI0909672B1 (pt) | método de imunoensaio in vitro para detecção da presença de células de câncer de fígado em um indivíduo, método para classificação de células de câncer de fígado presentes em um indivíduo, método in vitro para determinação de administrar ou não um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 a um indivíduo, e método in vitro para determinação de uma dose de um agente anticâncer contendo um anticorpo anti-glipicano 3 no tratamento de câncer de fígado em um indivíduo | |
| JPWO2012141285A1 (ja) | 乳癌のバイオマーカー | |
| JP2012530725A (ja) | ソリシジン由来ペプチドならびにｔｒｐｖ−６がんの検出および薬剤送達のための方法 | |
| KR20150036111A (ko) | 혈청 및 조직 생화학 마커로서 bag3 | |
| US20130295689A1 (en) | Method for detection of basic peptide and reagent for detection of basic peptide | |
| JP2011503620A (ja) | リン酸化脂肪酸シンターゼ及び癌 | |
| ES2394925T3 (es) | Uso de N-miristoiltransferasa en tejido no tumoral para el diagnóstico de cáncer | |
| CN102803968A (zh) | 食道癌标志物 | |
| BR112020014205A2 (pt) | Método e reagente para detecção de câncer renal | |
| US8114607B2 (en) | Type IV collagen-like immunoreactive peptide | |
| ES3059953T3 (en) | Autoantibodies as biomarker of paraneoplastic encephalitis associated with testicular cancer | |
| JP2009536327A (ja) | 薬剤誘導肝臓損傷及び中毒性物質誘導肝臓損傷の同定及び早期同定並びに治療の同時観察のためのｉｎｖｉｔｒｏ方法 | |
| CN104330570B (zh) | 人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用 | |
| WO2003104806A1 (ja) | 検出キット、それに用いられる測定プレート、検出方法、評価方法、カエルビテロジェニンのポリクローナル抗体及びその製造方法 | |
| RO130014A2 (ro) | Diagnosticul şi monitorizarea tumorilor neuroendocrine ale pancreasului, stomacului şi intestinului subţire şi cele ale glandei suprarenale | |
| JP4560314B2 (ja) | 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット | |
| US9809837B2 (en) | Method for evaluating suitability of duodenal fluid sample as sample for detecting pancreatic fluid-derived components | |
| JP7267527B2 (ja) | 新規肝癌マーカー | |
| ES2259290T3 (es) | Deteccion del cancer de prostata midiendo la relacion psa/igf-1. | |
| CN108318688B (zh) | 外周血外泌体中Smad3蛋白作为分子标记的应用、肝癌检测试剂盒 | |
| CN105842461A (zh) | 子宫肉瘤早中期快速诊断试剂盒及其制备方法 |