RO134192A0 - Procedeu pentru obţinerea unei noi clase de compuşi antracen- imidazolci cu activitate antituberculoasă - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unei clase de compuşi antracen-imidazolici cu activitate antituberculoasă. Procedeul, conform invenţiei, constă în reacţia de N-alchilare a azotului N1 din imidazol, respectiv benzimidazol cu 9-clorometil-antracen, rezultând intermediarii 1-(antracenil-9-metilen)-1H-imidazol şi, respectiv, 1-(antracenil-9-metilen)-1H-benzimidazol, urmată de reacţia de cuaternizare cu omega-bromo-acetofenone Z-substituite a azotului N3 imidazolic/benzimidazolic, rezultând bromura de 1-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-1H-imidazol-3-ium şi, respectiv, bromura de 1-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-1H-benzimidazol-3-ium.

Description

PROCEDEU PENTRU OBȚINEREA UNEI NOI CLASE DE COMPUȘI ANTRACENIMIDAZOLOCI CU ACTIVITATE ANTITUBERCULOASA

Invenția se refera la un procedeu de obținere a unei noi clase de compuși antracenimidazolici cu activitate antituberculoasa, avind ca domeniul de aplicare chimia organica si chimia farmaceutica.

Tuberculoza este o boala infectocontagioasa produsa de bacilul Mycobacterium tuberculosis, si care are o larga raspindire pe glob. Conform Organizației Mondiale a Sanatatii in anul 2017 au fost înregistrate 6,4 milioane de cazuri noi de tuberculoza iar numărul mortilor a fost de circa 1,3 milioane [1], Tratamentul tuberculozei a devenit in zilele noastre extrem de complex si de complicat, necesitind o terapie de durata si costisitoare. Apariția tuberculozei rezistente la medicamente, a tuberculozei rezistente la mai multe medicamente si recent, a tuberculozei total rezistente la medicamente, a complicat foarte mult situația cu privire la tratamentul tuberculozei. Mai mult, asocierea tuberculozei cu HIV / SIDA (dar si cu alte boli contagioase) reprezintă o alta problema dificila, care inrautateste si mai mult situația pacientilor bolnavi, astfel incit tuberculoza a devenit in prezent cauza principala a decesului in rindul pacientilor infectati cu HIV [1], In ultimii 50 de ani, deși cercetările pentru obținerea de noi medicamente antitubercoloase au fost si ramin extrem de intense, au fost introduse in terapia curenta doar 2 (doua) noi medicamente, Bedaquiline si Delamanid, chiar si acestea putând fi utilizate doar pentru tratamentul tuberculozei rezistente la medicamente [1-3]. Din aceste motive exista o cerere presanta de noi compuși biologic activi pentru tratamentul tuberculozei din partea societății, cu precădere din partea medicilor si a pacientilor, dar si a companiilor farmaceutice.

Exista mai multe clase de compuși care se utilizează in tratamentul curent al tuberculozei, una dintre acestea fiind cea a heterociclurilor cu azot de cinci si sase atomi, cele mai cunoscute din clasa fiind tuberculostaticele de prima linie Hidrazida Acidului Izonicotinic (sau Izoniazida, HIN), Pirazinamida si Etionamida. Principalul dezavantaj al medicametelor sus menționate (ca si a celorlalte utilizate in tratamentul tuberculozei), consta in aceea ca, acestea au început sa nu mai dea rezultate in foarte multe cazuri, datorita extraordinarei versatilitati si adaptabilitati la medicamente a bacilului Koch, Mycobacterium tuberculosis. Acest fapt a condus, asa după cum am mai subliniat, la instaurarea tuberculozei rezistente la medicamente, a tuberculozei rezistente la mai multe medicamente si recent a

a ^019 00163

13/03/2019 tuberculozei total rezistente la medicamente, complicând foarte mult situația cu privire la tratamentul tuberculozei. In plus procedeele de obținere a acestor medicamente sunt cel mai adesea costisitoare, necesita multe etape de lucru, un timp îndelungat de obținere, cu randamente nu intodeauna mulțumitoare.

Datorita dezavantajelor sus menționate, grupul nostru de cercetare a întreprins in ultimul deceniu cercetării intense in vederea obținerii de noi copusi din categoria heterociclurilor cu azot de cinci si sase atomi, si care, sa fie biologic activi împotriva Mycobacterium tuberculosis, inclusiv asupra formelor rezistente la medicamente [4-9],

Scopul acestei invenții complexe este acela de a elabora un nou procedeu de sinteza si de a obține o noua clasa de compuși biologic activi antituberculosi cu schelet antracen imidazolic.

Problemele pe care o rezolva prezenta invenție constau in:

elaborarea unui nou procedeu de sinteza pentru obținerea de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici;

obținerea unei noi clase de compuși din clasa a heterociclurilor cu azot de cinci atomi, si anume compuși imidazol/benzimidazol-antracenici, cu activitate biologica împotriva Mycobacterium tuberculosis.

Procedeul pentru obținerea noii clase de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici prezintă marele avantaj ca necesita doar 2 (doua) etape de lucru (Schema 1):

1. O prima etapa consta in reacția de N-alchilare a azotului NI din imidazol 1 respectiv benzimidazol 2, cu 9-clorometil-antracen, cind se obțin intermediarii 1-(antracenil-9metilen)-lH-imidazol 4 si respectiv l-(antracenil-9-metilen)-lH-benzimidazol 5;

2. A doua etapa consta in reacția de cuatemizare cu nj-bromo-acetofenone Z-substituite a azotului N3 imidazolic/benzimidazolic din intermediarii 4 si 5, când se obține noua clasa de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici, si anume bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium 6a-e si respectiv bromura de l-(antracenil-9metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-benzimidazol-3-ium 7a-e.

fele credite, la ONOFREI

13/03/2019 a 2019 00163

Noii compuși obținuți sunt substanțe solide stabile, frumos cristalizate, solubile in apa si solventi organici (alcool, acetona, cloroform, acetat de etil, dimetil sulfoxid). Structura noilor compuși revendicati a fost confirmată prin metodele moderne ale analizei structurale organice: analiza elementala, spectroscopie de infrarosu, rezonanta magnetica nucleara monoși bidimensională (1H, 13C RMN și 2D).

Activitatea biologica antituberculoasa in vitro a fost determinata împotriva Mycobacterium tuberculosis H37Rv in condiții aerobe, determinindu-se in acest sens următorii parametri:

- concentrația minima inhibitorie (MIC, μΜ), definita ca cea mai mica concentrație a compusului la care creșterea Mycobacterium tuberculosis a fost complet inhibată;

- concentrația inhibitorie a compusului care determina o inhibare a creșterii bacilului la 50% si respectiv la 90% (IC50 si IC90, μΜ).

Activitatea compușilor noștri s-a dovedit a fi foarte buna, cu un MIC cuprins intre 10-40 μΜ, un IC50 cuprins intre 5-20 μΜ si un IC90 cuprins intre 15-45 μΜ.

Avantajele inventei constau in:

elaborarea unui nou procedeu de lucru eficient si direct pentru obținerea compușilor imidazol/benzimidazol-antracenici, procedeul avind doar 2(doua) etape de lucru, are un timp de lucru redus, prezintă eficienta energetica si randamente bune;

materiile prime utilizate (imidazol, benzimidazol, cu τυ-bromo-acetofenone Zsubstituite) sunt ușor accesibile ca preț;

accesibilitatea economica a clasei de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici revendicate sub aspect eficienta/pret, datorita avantajelor sus menționate;

obținerea unei noi clase de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici si anume: bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium 6a-e si respectiv bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lHbenzimidazol-3-ium 7a-e;

activitate biologica foarte buna a compușilor împotriva Mycobacterittmfukerculosis.

exredite,

ClhioFREI

13/03/2019 a 2019 00163

Subliniem ca, procedeul de lucru pentru obținerea noi clase de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici, noi produși ai clasei tip 6a-e si 7a-e, cit si rezultatele testărilor antituberculoase ale acestor compuși, nu au fost descrise anterior in literatura de specialitate.

Exemplu de realizare a invenției

1. Obținerea intermediarilor l-(antracenil-9-metilen)-lH-imidazol 4 si l-(antracenil-9metileri)-lH-benzimidazol 5

Sinteza intermediarilor 4 si 5 a fost realizata prin adaptarea unor metode de literatura prezentate anterior [12,13], Intr-un balon cu fund rotund de 250 ml si prevăzut cu 3 gaturi, se introduc 6 mmoli derivat imidazolic (0.402 g imidazol, respectiv 0.708 g benzimidazol) si se dizolva în 15 ml THF anhidru. Apoi se adaugă treptat, pe baie de gheata, 0.84 g (21 mmoli) NaH 60% (in ulei de mineral) suspendata in prealabil in 15 mL THF anhidru (NaH se spalata anterior cu «-hexan). După ce întreaga cantitate de NaH a fost adaugata, se adaugă lent cu ajutorul unei seringi, in mediu inert de azot, 6.6 mmoli (1.496 g) 9-clorometilantracen solubilizat in prealabil in 25 ml THF. După adaugarea completa a 9-clorometilantracenului, se continua agitarea timp de o ora sub azot, si se continua reacția la reflux, pe baie de ulei, timp de 12 h in cazul benzimidazolului si respectiv 20 h in cazul imidazolului. După terminarea reacției, se filtrează gravitațional, se spala pe filtru cu THF, si se concentrează la sec la rotavapor. Purificarea s-a realizat utilizind cromatografia rapida pe coloana, folosit ca amestec de eluenți CH2C12:CH3OH=(99:l/98:2).

l-(antracenil-9-metilen)-lH-imidazol, 4. Precipitat alb-gălbui (η= 47%), pt 159-160 °C. *HRMN (500 MHz, CDC1₃): 6.08 (2H, s, CH₂₍₆)), 6.85 (1H, s, H₄), 6.99 (1H, s, H₅), 7.48 (1H, s, H₂), 7.51 (2H, t, Hio, H_h, J= 7.5 Hz), 7.57 (2H, t, H₉, H15, J= 8.5 Hz), 8.08 (2H, d, Hi 1, H13, J= 8.5 Hz), 8.20 (2H, d, H₈, Hi₆, J= 9.0 Hz), 8.57 (1H, s, H12). ¹³C-RMN (125 MHz, CDCI3): 43.3 CH₂₍6), 119.0 C₄, 123.0 C₈,C_]6, 124.7 C₇, 125.4 Cio,Ci4, 127.5 C₉,Ci₅, 129.2 C₅, 129.6 C11,C13, 129.7 C12, 130.9 C_7a,Ci₆a, 131.5 Cn_a,Ci2a, 136.8 C₂. IR (KBr, Xcm’¹): 3023, 2928, 1604, 1585, 1430. Anal. Calcd. pentru C18H14N2: C, 83.69; H, 5.46; N, 10.84; Găsit: C, 83.80; H, 5.36; N, 10.54.

l-(antracenil-9-metilen)-lH-benzimidazol, 5. Precipitat galben (η= 41%), pt 177-180 °C. *HRMN (400 MHz, CDCI3): 6.18 (2H, s, CH_2{8)), 7.26 (1H, s, H₂), 7.37 (1H, H₆, J= 7.2 Hz), 7.42 (1H, t, H₅, J= 7.6 Hz), 7.52 (4H, dd, Hn, Ηι₇, H12, Hi₆, J= 6.8 fJ-^^X£^X.71 (1H, /X-/ I \ -prof.

\ L>> \

a ^019 00163

13/03/2019 d, H₄, J= 8.0 Hz), 7.83 (1H, d, H₇, J= 8.0 Hz), 8.10 (4H, dd, Hio, His, H,₃, H15, J= 6.4 Hz, J= 3.2 Hz), 8.62 (1H, s, H|₄). ^,3C-RMN (100 MHz, CDCb): 41.5 CH₂₍₈₎, 109.6 C₄, 120.6 C₇, 122.6 C₆, 123.1 Cio,Ci₈, 123.2 C₅, 123.7 C₉, 125.5 Ci₂,Ci₆, 127.7 Cn,Ci₇, 129.6 Ci₃,Ci₅, 129.8 Ci₄, 131.2 C_9a,Ci_8a, 131.5 Ci_3a,Ci_4a, 134.3 C_3a, 142.3 C₂, 144.0 C_7a. IR (KBr, v(cm-'): 3045, 2930, 1580, 1550, 1442. Anal. Calcd. pentru C₂₂Hi₆N₂: C, 85.69; H, 5.23; N, 9.08; Găsit: C, 85.79; H, 5.13; N, 9.28.

2, Obținerea noii clase de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici, si anume bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium 6a-e si respectiv bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-benzimidazol-3-ium 7a-e,

Intr-un balon cu fund rotund de 100 mL, se solubilizează 0.38 mmoli (0.1 g derivat de 1(antracenil-9-metilen)-lH-imidazol 4, respectiv 0.117g l-(antracenil-9-metilen)-lHbenzimidazol 5) in 12 mL acetona, apoi se adauga treptat 0.38 mmoli de ro-bromoacei o feno ne Z-substituite (e.g. 0.095 g de uj-bromo-/?ara-nitroacetofenona, etc) solubilizata in prealabil in 12 mL acetona. Reacția are loc sub agitare la temperatura camerei timp de 48 h. După terminarea reacției, se filtrează gravitațional, se spala pe filtru cu acetona si, se filtrează la vid. Produsii obținuți sunt puri si nu necesita alta prelucrare.

Bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-nitrofenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium, 6d. Precipitat galben (η= 59%), pt 232-235 °C. 'H-RMN (500 MHz, DMSO-i/6): 5.99 (2H, s, CH₂₍i )), 6.63 (2H, s, CH₂₍₆₎), 7.62 (2H, t, Hio, Hi₄, J= 7.5 Hz), 7.73-7.70 (3H, m, H₉, Hi₅, H₅), 7.90 (1H, s, H₄), 8.16 (2H, d, 2χΗ₄·, J= 8.5 Hz), 8.23 (2H, d, Hn, Hi₃, J= 8.5 Hz), 8.37 (2H, d, 2xH₅’, J= 8.0 Hz), 8.54 (2H, t, H₈, Hi₆, J= 9.0 Hz), 8.79 (1H, s, H₂), 8.86 (1H, s, Hi₂). ¹³C-RMN (125 MHz, DMSO-î/6): 45.0 CH2(6), 55.8 CH2(r), 122.4 C4, 123.3 C8,Ci6, 123.5 C7, 124.0 2x0’, 124.1 C5, 125.6 Cio,Ci4, 127.8 C9,Ci5, 129.3 0,0, 129.4 2x0, 130.1 Ci2, 130.6 C7a,Ci6a, 131.0 Oa,Ci2a, 136.7 C2, 138.2 C3-, 150.4 O’, 190.5 O. IR (KBr, ν^ιη¹): 3022, 2926, 1712, 1602, 1531, 1444, 1344. Anal. Calcd. pentru C26H₂₀BrN₃O₃: C, 62.16; H, 4.01; N, 8.36; Găsit: C, 62.01; H, 4.11; N, 8.06.

Bromura de 1 -(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-nitrofenil)-2-oxoetil)-lH-benzoimidazol-3-ium, 7d. Precipitat galben (η= 72%), pt 219-220 °C. 'H-RMN (500 MHz, DMSO-î/6): 6.23 (2H, s, CH₂(d), 6.86 (2H, s, CH₂₍8)), 7.63 (2H, t, Hi₂, Hi₆, J= 8.0 Hz), 7.68 (2H, t, Hn, Hi₇, J= 8.0 Hz), 7.79 (1H, t, H₆, J= 8.0 Hz), 7.86 (1H, t, H₅, J= 8.0 Hz), 8.13 (1H, d, H₇, J= 8.5 Hz), 8.17 (2H, d, 2xH₄’, J= 9.0 Hz), 8.26 (2H, d, Hi₃, His, J= 8.0 Hz), 8.37 (2H, d, 2x0, J= 8.5 Hz), 8.44 (2H, d, Hio, Hi₈, J= 8.5 Hz), 8.50 (1H, d, H₄, J= 8.5 Hz), 8.79/^^/¾^ (1H, s,

13/03/2019 a 2019 00163

H14). ¹³C-RMN (125 MHz, DMSO-t/6): 43.5 CH₂₍₈), 53.6 CH₂₍i·), 114.1 C₇, 114.4 C₄, 121.8 C₉, 123.3 Cio,Ci8, 123.9 2xC₅·, 125.7 Ci₂,Ci₆, 126.8 C₅, 127.1 C₆, 128.0 Cn,C₁₇, 129.4 C13,C15, 129.6 2xC₄’, 130.5 Ci₄, 131.0 Ci_3a,Ci_4a, 131.1 C_9a,Ci_8a, 131.3 C_7a, 132.3 C_3a, 138.2 C₃·, 142.1 C₂, 150.4 C₆·, 190.4 C₂’. IR (KBr, v(cm-'): 3051, 2897, 1712, 1602, 1527, 1446, 1342. Anal. Calcd. pentru C₃₀H₂₂BrN3O₃: C, 65.23; H, 4.01; N, 7.61; Găsit: C, 65.03; H, 4.10; N, 7.81.

3. Testarea in vitro a activitatii antituberculoase

Testarea activitatii antituberculoase a fost efectuata prin realizarea unui screening primar standard in vitro împotriva Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). Metoda se bazeaza pe masurarea creșterii in mediu lichid a unei tulpini fluorescente de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, iar citirea rezultatelor se face cu ajutorul unui cititor de placi BioTek™ Synergy 4, determinindu-se fie densitatea optica (OD), fie fluorescenta [10, 11], Se utilizează doua citiri pentru a minimiza problemele cauzate de autofluorescenta. Pe baza unui aparat matematic fundamentat, a fost stabilita o relație de dependenta liniara intre OD si fluorescenta cititia de aparat, care justifica utilizarea fluorescentei ca măsură a creșterii bacteriene. MIC pentru fiecare compus a fost determinat prin masurarea creșterii bacteriene după 5 zile in prezenta compusului testat. Compușii testati au fost preparati in 10 dilutii seriale, doua serii succesive, in mediu 7H9-Tw-OADC si DMSO, pe placi cu 96 de godeuri, cu o concentrație finala de DMSO de 2%. Cea mai mare concentrație utilizata pentru compus a fost 200 μΜ, cind compușii au fost solubilizati in DMSO la concentrația 10 miliM. Fiecare placa a inclus si martori/control de testare, rifampicina. Plăcile au fost inoculate cu Mycobacterium tuberculosis H37Rv si apoi incubate timp de 5 zile, iar creșterea a fost măsurată prin ODs₉o si fluorescența (Ex 560 / Em 590) folosind un cititor de placi BioTek ™ Synergy 4. Pentru a calcula MIC, curba de răspuns obtinuta prin reprezentarea grafica a celor 10 dilutii seriale, a fost reprezentata grafic ca % procent de creștere, si fitata la modelul Gompertz folosind programul GraphPad Prism 5. MIC a fost definita ca cea mai mica concentrație a compusului la care creșterea Mycobacterium tuberculosis a fost complet inhibată, si a fost calculata din punctul de inflexiune al curbei fitate la asimptota cea mai mica unde creșterea este zero (Figura IA).

Pentru a calcula concentrațiile inhibitorii IC50 si IC₉o ale compusului, curba de răspuns obtinuta prin reprezentarea grafica a celor 10 dilutii seriale a fost fitata folosind algoritmul

a ^019 00163

13/03/2019

Levenberg-Marquardt, si s-au determinat concentrațiile care au condus la 50% si respectiv 90% inhibarea a creșterii Mycobacterium tuberculosis (Figura 1B).

Claims (1)

1. REVENDICĂRI

   1. Procedeu de sinteza pentru obținerea de compuși imidazoVbenzimidazol-antracenici [bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium si bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-benzimidazol-3-ium)], caracterizati prin aceea ca intermediarii l-(antracenil-9-metilen)-lh-imidazol si l-(antracenil9-metilen)-lH-benzimidazol se obțin prin reacția de N-alchilare a azotului NI din imidazol, respectiv, benzimidazol.

   ^Procedeu de sinteza pentru obținerea de compuși imidazol/benzimidazol-antracenici [bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-imidazol-3-ium si bromura de l-(antracenil-9-metilen)-3-(2-(4-Z-fenil)-2-oxoetil)-lH-benzimidazol-3-ium)], caracterizati prin aceea ca se folosește o cantitate de 0.38 mmoli (0.1 g derivat de 1 -(antracenil9-metilen)-lH-imidazol, respectiv 0.117g l-(antracenil-9-metilen)-lH-benzimidazol, dizolvate in 12 mL acetona, la care apoi se adauga treptat 0.38 mmoli de w-bromo-acetofenone Zsubstituite (e.g. 0.095 g de w-brorno-para-nitroacetofenona, etc) solubilizata in prealabil in 12 mL acetona, reacția avind loc sub agitare la temperatura camerei timp de 48 h iar, după terminarea reacției, se filtrează gravitațional, se spala pe filtru cu acetona si, se filtrează la vid, obtinindu-se produși puri care nu necesita alta prelucrare.