RS100704A - Upotreba inhibitora vazopeptidaze u tretmanu nefropatije - Google Patents

Abstract

Pronalazak opisuje upotrebu inhibitora vazopeptidaze formule (I) za tretman i/ili profilaksu nefropatije kod pacijenata sa dijabetesom ili bez dijabetesa, uključujući dijabetičnu ili ne-dijabetičnu nefropatiju, glomerulonefritis, glumerularnu sklerozu, nefrotični sindrom, hipertenzivnu nefrosklerozu, mikroalbuminouriju ili poslednji stadijum bolesti bubrega, ili rezistenciju na insulin ili metaboličke bolesti povezane sa endoproduktima uznapredovane glikolacije, kao što su dijabetične komplikacije, dijabetična neuropatija, dijabetična nefropatija, dijabetična retinopatija, katarakta, infarkt miokarda i/ili dijabetična kardiomiopatija ili ateroskleroza ili endotelijalna disfunkcija.

Description

UPOTREBA INHIBITORA VAZOPEPTIDAZE U TRETMANU

NEFROPATIJE

Upotreba inhibitora vazopeptidaze u tretmanu bolesti metabolizma, nefropatije i bolesti povezanih sa AGE.

Angiotenzin-konvertujući enzim (ACE) je peptidil dipeptidaza koja katalizuje konverziju angiotenzina I u angiotenzin II. Angiotenzin II je vazokonstriktor koji takođe stimuliše sekreciju aldosterona u adrenalnom korteksu. Inhibicija ACE sprečava i konverziju angiotenzina I u angiotenzin II i metabolizam bradikinina, što za rezultat ima smanjenje koncentracija angiotenzina II u cirkulaciji, aldosterona i povećanje koncentracije bradikinina u cirkulaciji. Kao dodatak ovim neurohormonalnim promenama, dolazi do smanjenja periferne rezistencije i krvnog pritiska, posebno kod pojedinaca sa visokim cirkulatornim reninom. U druge farmakološke efekte u vezi sa inhibicijom ACE spadaju regresija hipertrofije leve ventrikule, poboljšanje kliničkih znakova oštećenja srca i smanjen mortalitet pacijenata sa kongestivnom insuficijencijom srca (CHF) ili disfunkcijom leve ventrikule nakon infarkta miokarda.

Neutralna endopeptidaza (NEP) je enzinm odgovoran za metabolizam atrijalnog natriuretičnog peptida (ANP). Inhibicija NEP dodovi do povećanja koncentracije ANP, što, s druge strane dovodi do natriureze, diureze i do smanjenja intravaskularne zapremine, venskog krvotoka i krvnog pritiska. ANP se oslobađa iz atrijalnih miocita kao odgovor na širenje arterija ili povećanja intravaskularne zapremine. Povećanje koncentracije ANP u plazmi se demonstrira kao potencijalni mehanizam kompenzacije kod različitih bolesnih stanja, uključujući kongestivno oštećenje srca, oštećenje bubrega, esencijalnu hipertenziju i cirozu.

Sekrecija ANP u atrijalnim miocitima dovodi do vazodilatacije, diureze, natriureze i inhibicije oslobađanja renina i sekrecije aldosterona. Nasuprot tome, angiotenzin II dovodi do vazokonstrikcije, reapsorpcije natrijuma i vode i produkcije aldosterona. Ova dva hormonalna sistema međusobno deluju recipročno ili na uravnoteženi način održavajući normalne fiziološke vaskularne i hemodinamične odgovore.

US Patent 5,430,145, evropski patent EP 481522 i WO patentna prijava PCT/EP 02/03668 objavljuju derivate tricikličnih merkaptoacetilamida formule (I) koji su korisni kao ACE i NEP inhibitori, to jest, korisni za tretman i/ili prevenciju insuficijencije srca i hipertenzije.

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenj a formule (I)

pri čemu

A = H, C-Cg-alkil, CH2OCH2CH2OCH3, -(CrC4-alkil)-aril;

Rije vodonik, -CH2OC(0)C(CH3)3ili neka alkil grupa;

R2 je vodonik, -CH20-C(0)C(CH3)3, C,-C4-alkil, aril, -(CrC4-alkil)-aril ili difenilmetil grupa;

X je -(CH2)n, pri čemu je n ceo broj 0 ili 1, -S-, -O-,

pri čemu je R3vodonik, CrC4-alkil, aril ili aril-(CrC4-alkil), a Rt je -CF3, CrC10-alkil, aril ili aril-(Ci-C4-alkil) grupa;

B]i B2su svaki nezavisno vodonik, hidroksi, -OR5 grupa, pri čemu je R5C\-C4—alkil, aril ili -(CrC4-alkil)-ariI ili kada su B, i B2vezani za susedne atome ugljenika, Bji B2mogu zajedno sa pomenutim susednim atomima ugljenika da formiraju benzenski prsten ili metilendioksi grupu, u tretmanu i/ili profilaksi nefropatije kod pacijenata sa ili bez dijabetesa, uključujući dijabetičnu ili ne-dijabetičnu nefropatiju, glomerulonefritis, glomerularnu sklerozu, nefrotični sindrom, hipertenzivne nefroskleroze, mikroalbuminouriju ili poslednju fazu bubrežne bolesti ili na postupak za tretman i/ili profilaksu rezistencije na insulin ili metaboličkih bolesti povezanih sa uznapredovanom glikolacijom krajnjih proizvoda, dijabetičnim komplikacijama, kao što su dijabetična neuropatija, dijabetična nefropatija, dijabetična retinopatija, katarakta, infarkt miokarda i/ili dijabetična kardiomiopatija, ili se odnosi na postupak za tretman i/ili profilaksu ateroskleroze ili endotelijalne disfunkcije.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedene upotrebe jedinjenja formule (I) koje se karakteriše jedinjenjem formule (II)

pri čemu je Rjacetil grupa.

U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (II), pri čemu je R]vodonik. U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (II), pri čemu je R2vodonik. U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (II), pri čemu su Bii/ili B2vodonik. U još jednom od aspekata, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (II), pri čemu je X -CH2grupa.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (I) koja se karakteriše jedinjenjem formule (II-A):

pri čemu je R) acetil grupa ili vodonik.

Struktura preferiranih jedinjenja formula (II-A) je jedmjenje formule (II-B), koje takođe može da bude predstavljeno kao jedinjenje (II-B) ili jed. (II-B) i niže datom formulom (II-C):

U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (I) koja se karakteriše jedinjenjem formule (III) pri čemu jeR\acetil grupa. U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedene upotrebe jedinjenja formule (III), pri čemu jeR\vodonik. U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedene upotrebe jedinjenja formule (III), pri čemu je R2vodonik. U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedene upotrebe jedinjenja formule (III), pri čemu su Bii/ili B2vodonik. U još jednom narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedene upotrebe jedinjenja formule (III), pri čemu je X -CH2grupa.

U narednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu upotrebu jedinjenja formule (I) koja se karakteriše jedinjenjem formule (III-A):

pri čemu je R!acetil grupa ili vodonik.

Struktura preferiranih jedinjenja formula (III-A) su jedinjenja formule (III-B) i (III-C), koje su niže date:

Kako se ovde koristi, naziv "C1-C4-alkiI" se odnosi na zasićeni ravan ili račvast monovalentni ugljovodonični lanac koji čine jedan, dva, tri ili četiri atoma uljenika i obuhvata metil, etil, propil, izopropil, n-butil, izobutil, tercijerni butil i slične grupe. Naziv "Ci-Cio-alkil" se odnosi na zasićen ravan ili račvast monovalentni ugljovodonični lanac sa jednim do deset atoma ugljenika i obuhvata metil, etil, propil, izopropil, n-butil, izobutil, tercijerni butil, pentil, izopentil, heksil, 2,3-dimetil-2-butil, heptil, 2,2-dimetil-3-pentil, 2-metil-2-heksil, oktil, 4-metil-3-heptil i slične grupe.

Kako se ovde koristi, naziv " Ci-C4-alkoksi" se odnosi na monovalentni

supstituent koji se sastoji od ravnog ili račvastog alkil lanaca koji ima od 1 do 4 atoma ugljenika vezanih preko nekog etarskog atoma kiseonika i koji ima slobodne valentne veze od etarskog kiseonika i obuhvata metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi, butoksi, sec-butoksi, terc-butoksi i slične grupe.

Kako se ovde koristi, naziv "aril" se odnosi na fenil ili naftil grupu koje su nesupstituisane ili supstituisane sa jednim do tri supstituenta koji su izabrani iz grupe koja sadrži metilendioksi, hidroksi, Ci-C4-alkoksi, fluoro i hloro grupu. U okvir naziva "-(CrC4-alkil)-aril" su fenilmetil (benzil), feniletil, p-metoksibenzil, p-fluorobenzil i p-hlorobenzil grupa.

Kako se ovde koristi, naziv "halogen" ili "Hal" se odnosi na jedan od članova grupe fluora, hlora, broma ili joda.

Kako se ovde koristi, naziv "acil grupa" se odnosi na alifatične i aromatične

acil grupe i one grupe koje su dobijene od heterocikličnih jedinjenja. Na primer, acil grupa može da bude niža ili (CpGO alkanoil grupa, kao što su formil ili acetil grupa, neka aroil grupa, kao što je benzoil ili heterociklična acil grupa koja uključuje jedan ili više heteroatoma O, N i S, kao što je grupa

Kako se ovde koristi, naziv "stereoizomer" je opšti naziv koji se koristi za sve izomere individualnih molekula koje se razlikuju samo po orijentaciji svojih atoma u prostoru. Naziv stereoizomer obuhvata simetrične izomere (enantiomere), geometrične (cis/trans ili E/Z) izomere i izomerna jedinjenja sa više od jednog asimetričnog centra koji nisu simetrični jedni sa drugim (diastereoizomeri).

Kako se ovde koriste, nazivi "R" i "S" se koriste kao što je to uobičajeno u organskoj herniji za označavanje specifične konfiguracije asimetričnog centra. Naziv "R" (rectus) se odnosi na onu konfiguraciju asimetričnog centra sa prioritetnim grupama gledano prema kretanju kazaljke na satu (najveća do druge najmanje) kada se gleda duž veze prema grupi najmanjeg prioriteta. Naziv "S" (sinister) se odnosi na onu konfiguraciju asimetričnog centra sa prioritetnim grupama gledano suprotno kretanju kazaljke na satu (najveća do druge najmanje) kada se gleda duž veze prema grupi najmanjeg prioriteta. Prioritet grupa se zasniva na nizu pravila, pri čemu se prioritet prvo daje atomskom broju (po redosledu smanjenja atomskog broja). Spisak i komentari prioriteta su dati u Stereochemistrv of Organic Compounds, Ernest L. Eliel, Samuel H. Wilen and Lewis N. Mander, urednici, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994.

Osim (R)-(S) sistema, ovde može takođe da se koristi stariji D-L sistem za označavanje apsolutne konfiguracije, posebno kada su u pitanju amino kiseline. U ovom sistemu, Fišerova projekciona formula je orijentisana tako daje ugljenik glavnog lanca na vrhu označen brojem 1. Prefiks "D" se koristi za predstavljanje apsolutne konfiguracije izomera kod koga je funkcionalna (određujuća) grupa na desnoj strani ugljenika u asimetričnom centru, a "L" označava izomer u kome je ta funkcionalna grupa na levoj strani.

Kako se ovde koristi, nazivi "tretman" ili "lečenje" označavaju bilo koji tretman, uključujući ali se ne ograničavajući samo na, ublažavanje simptoma, eliminaciju uzroka simptoma trenutno ili za stalno, ili na prevenciju ili usporavanje pojave simptoma i progresiju navedene bolesti, poremećaja ili stanja.

Kako je ovde opisano, naziv "pacijent" se odnosi na toplokrvne životinje, kao što su sisari, koji oboljevaju od određenih bolesti, poremećaja ili stanja. Potpuno je jasno da su zamorci, psi, mačke, pacovi, miševi, konji, goveda, ovce i ljudi primeri životinja koje su obuhvaćene značenjem ovog naziva.

Kako se ovde koristi, naziv "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na bilo koju so, bilo daje prethodno poznata ili će biti otkrivena, koju koristi stručnjak sa iskustvom u tehnici, koja je netoksična organska ili neorganska so pogodna za upotrebu kao farmaceutski proizvod. U pogodne baze koje grade odgovarajuće soli spadaju hidroksidi alkalnih ili zemno-alkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hidroksidi; amonijak i alifatični, ciklični ili aromatični amini, kao što su metilamin, dimetilamin, trietilamin, dietilamin, izopropildietilamin, piridin i pikolin. U odgovarajuće kiseline koje formiraju pogodne soli spadaju neorganske kiseline, kao što su, na primer, hidrohloridna, hidrobromidna, sulfatna, fosfatna i slične kiseline i organske karbociklične kiseline, kao što su, na primer, acetatna, propionatna, glikolatna, laktatna, piruviatna, malonatna, sukcinatna, fumaratna, maliatna, tartaratna, citratna, askorbatna, maleatna, hidroksimaleatna i dihidroksimaleatna, benzoatna, fenilacetatna, 4-aminobenzoatna, 4-hidroksibenzoatna, antranilatna, cinamatna, salicilatna, 4-aminosalicilatna, 2-fenoksibenzoatna, 2-acetoksibenzoatna, mandelatna i slične kiseline i organske sulfonatne kiseline, kao što su metansulfonatna i p-toluensulfonatna kiselina.

Kako se ovde koristi, naziv "farmaceutski nosač" se odnosi na poznate farmaceutske ekscipijente koji su pogodni u formulisanju farmaceutski aktivnih jedinjenja pogodnih za primenu i koji su izrazito netoksični i stabilni pod uslovima u kojima se koriste. Tačni odnosi ovih ekscipijenata se određuju prema rastvorljivosti i hemijskim osobinama aktivnog jedinjenja, prema izabranom načinu primene kao i prema standardima farmaceutske prakse.

Kompozicije jedinjenja formule (I) iz ovog pronalaska mogu da se primene na subjektu kome je tretman potreban različitim uobičajenim načinima primene, uključujući oralno, topično, parenteralno, na primer, intravenozno, subkutano ili intramedularno. Dalje, aktivne kompozicije ovog pronalaska mogu da se primene intranazalno, kao rektalne supozitorije ili upotrebom "flash" formulacije, to jest, lek se rastvara u ustima bez korišćenja vode.

Aktivne kompozicije ovog pronalaska mogu da se primene samostalno ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, vehikulumima ili razblaživačima, u pojedinačnoj ili višestrukim dozama. U pogodne farmaceutske nosače, vehikulume i razblaživače spadaju inertni čvrsti razblaživači ili punioci, sterilni vodeni rastvori i različiti organski rastvarači. Farmaceutske kompozicije nastale kombinacijom aktivnih kompozicija ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivih nosača, vehikuluma ili razblaživača se zatim lako primenjuju u različitim doziranim oblicima, kao što su tablete, praškovi, lozenge, sirupi, injekcioni rastvori i slično. Ove farmaceutske kompozicije mogu, u koliko se želi, da sadrže dodatne sastojke, kao što su sredstva za korigovanje ukusa, vezivna sredstva, ekscipijenti i slično. Prema tome, u svrhu oralne primene, tablete sadrže različite ekscipijente, kao što su natrijum citrat, kalcijum karbonat i kalcijum fosfat, koji mogu da se koriste zajedno sa različitim dezintegratorima, kao što su škrob, alginatna kiselina i neki kompleksi silikata, zajedno sa vezivnim sredstvima, kao što su polivinilpirolidon, saharoza, želatin i akacija. Dodatno, u procesu tabletiranja se često dodaju lubrikantna sredstva, kao što su magnezij um stearat, natrijum lauril sulfat i talk. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu takođe da se koriste kao punioci u meko ili čvrsto punjenim želatinskim kapsulama. U preferirane materijale za ovo spadaju laktoza ili mlečni šećer i polietilen glikoli velike molekulske težine. Kada se za oralnu primenu žele vodene suspenzije ili eliksiri, osnovni aktivni sastojci mogu da se kombinuju sa različitim zaslađivačima ili sredstvima za korigovanje ukusa, sredstvima za bojenje ili bojama i, u koliko se želi, emulgatorima ili sredstvima za suspendovanje, zajedno sa razblaživačima kao što su voda, etanol, propilen glikol, glicerol i njihove kombinacije.

Za parenteralnu primenu mogu da se koriste rastvori aktivnih kompozicija iz ovog pronalaska u sezamovom ili kikirikijevom ulju, vodenom rastvoru propilen glikola ili u sterilnim vodenim rastvorima. Ovakvi vodeni rastvori bi trebalo da se puferuju na odgovarajući način, u koliko je potrebno, a tečni razblaživač se prvo izotonizuje sa dovoljnom količinom soli ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. U vezi sa ovim, svi sterilni vodeni medijumi koji se koriste su lako raspoloživi pomoću standardnih tehnika koje su poznate stručnjacima sa iskustvom u tehnici.

Generalno, kompozicija iz ovog pronalaska se primenjuje oralno, parenteralno (na primer, intravenozno, intramuskularno, subkutano ili intramedularno) ili topično. Za intranazalnu primenu ili primenu inhalacijom, jedno ili više jedinjenja iz pronalaska se pogodno oslobađa u obliku rastvora ili suspenzije iz kontejnera sa raspršivačem, koje pacijent istisne ili ispumpa, ili kao aerosol sprej koji se istiskuje iz kontejnera pod pritiskom ili iz nebulizera upotrebom pogodnog propelanta, na primer, dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili nekog drugog pogodnog gasa. Kada je u pitanju aerosol pod pritiskom, dozirana jedinica može da bude određena pomoću ventila koji oslobađa odmerenu količinu. Kontejner pod pritiskom ili nebulizer može da sadrži rastvor ili suspenziju aktivnog jedinjenja. Kapsule i kartridži (izrađeni, na primer, od želatina) za korišćenje u inhaleru ili insuflatoru mogu da se formulišu tako da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja iz pronalaska i odgovarajuće praškaste baze, kao što su laktoza ili škrob. U svrhu transdermalne (na primer, topične) primene, izrađuju se razblaženi sterilni, vodeni ili delimično vodeni rastvori (obično u koncentraciji od približno 0.1% do 5%) koji se izrađuju slično prethodno pomenutim parenteralnim rastvorima. Postupci za izradu različitih farmaceutskih kompozicija sa određenom količinom aktivnog sastojka su poznati, ili će u svetlu ovog otkrića biti jasni stručnjacima sa iskustvom u tehnici. Za primere postupaka za izradu farmaceutskih kompozicija videti Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Companv, Easton, Pa., 19-to izdanje (1995).

NEFROPATIJA:

Nefropatija je hronična bolest koja se definiše kao abnormalna ekskrecija albumina u urinu kod pacijenata sa ili bez dijabetesa. Brzine izlučivanja albumina u urinu su manje od ili jednake sa 40 mg/24 sata kod zdravih ljudi. Klinička stanja nefropatije su mikroalbuminurija, klinička nefropatija (albuminurija) i poslednji stadijum bubrežne bolesti (ESRD).

Čest oblik nefropatije je dijabetična nefropatija. Dijabetička nefropatija se javlja kod 35 do 40% pacijenata sa dijabetes melitusom tip 1 i kod 10 do 60% pacijenata sa dijabetes melitusom tip 2 u zavisnosti od etničke zajednice koja se ispituje i najčešći je uzrok poslednjeg stadijuma bolesti bubrega u Sjedinjenim Državama. Prihvaćeno je daje dijabetična nefropatija rezultat hiperglikemije, bilo same ili u kombinaciji sa drugim faktorima, kao što su hipertenzija i genetička predodređenost za bolest bubrega. Pokazano je da odgovarajuća antihipertenzivna terapija značajno smanjuje mogućnost smrti od renalne i kardiovaskularne bolesti kod pacijenata sa dijabetes melitusom tip 1 sa proteinurijom, kao i da usporava brzinu opadanja brzine glomerularne filtracije kod nekih pacijenata sa oštećenom funkcijom bubrega (Lewis i saradnici, N. Engl. J. Med. 1993., 329, 1456.1462). Prema tome, standardna pažnja za pacijente sa dijabetičnom nefropatijom je intenzivna kontrola glikemije i normalizacija krvnog pritiska prvenstveno upotrebom inhibitora angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), kao što je ramipril.

Pokazano je da neki inhibitori vazopeptidaze ispoljavaju veće nefroprotektivno delovanje nego sami ACE inhibitori (Molinaro i saradnici, Surr. Opin. Pharmacol. 2002., 2, 131.141), kao što je omapatrilat kao jedan od najranije razvijenih i najbolje ispitanih inhibitora vazopeptidaze. Chen i saradnici (Hvpertension 2001., 38, 187-191) su definisali reakciju bubrega na akutni tretman sa omapatrilatom i ACE inhibitorom fosinoprilatom, pri čemu je omapatrilat imao veći natriuretični odgovor nego ACE inhibitor. U drugoj studiji, inhibitor vazopeptidaze CGS 30440 (Novartis, Switzerland) ima veće protektivno delovanje na bubreg od ACE inhibitora benzaperila (Cohen i saradnici, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998., 32, 87-96).

Pokazano je da inhibitori vazopeptidaze formule (I) imaju superiorno nefroprotektivno delovanje na brzinu izlučivanja albumina i zbog toga su korisni za tretman i/ili prevenciju nefropatije kod pacijenata sa ili bez dijabetesa, uključujući dijabetičnu nefropatiju, glomerulonefritis, glomerularnu nefrozu, nefrotični sindrom, hipertenzivnu nefrosklerozu, mikroalbuminouriju i poslednji stadijum bolesti bubrega.

Efekat jedinjenja (II-B) je 6-8 puta veći od efekta koji se dobija sa ACE inhibitorom ramiprilom.

Primer 1: Smanjivanje proteinurije tretmanom sa jedinjenjem formule (II-B)

Određena je ekskrecija proteina i kreatinina u urinu mužjaka ZDF pacova (ZDF Gmi fa/fa) i heterocigotičnih kontrolnih životinja (ZDF Gmi -/+) starosti 10, 17, 27 i 37 nedelja. Određenim grupama pacova sa dijabetesom je duže vreme davan ili ramipril (1 mg/kg/dan, pijaća voda) ili jedinjenje formule (II-B) (30 mg/kg/dan, hrana) u periodu od 10 do 37 nedelja. Životinje su žrtvovane nakon 37 nedelja a njihovi bubrezi su histološki ispitani.

Tabela 1: Urinarna eksrecija albumina i kreatinina kod gojaznih, mršavih, tretiranih ramiprilom i pacova tretiranih sa jedinjenjem formule (II-B)

Histološki rezultati: u priloženim tabelama navedeni su zbirni rezultati nađeni na bubrezima nakon tretmana u toku 6 meseci.

Ispitivane grupe su:

Cl: kontrola mršavi ZDF pacovi

C2: kontrola gojazni ZDF pacovi

Dl: ramipril gojazni ZDF pacovi 1.0 mg/kg D4: jed.(II-B) gojazni ZDF pacovi 30 mg/kg

Registrovana histopatološka otkrića su:

-Armani-Ebstein ćelije u renalnim tubusima ukazuju na stanje metaboličkog dijabetesa. -Glomerulonefroza ukazuje na hronično oštećenje bubrega zbog stanja metaboličkog dijabetesa. -Atrofija: tubus česte spontane degenerativne lezije u bubrezima.

-Cilindri: tubus česte spontane lezije u bubrezima.

-Dilatacija: karlica česte spontane lezije u bubrezima

smatra se da su posledica razvoja nasledne anomalije.

Armani-Ebstein ćelije nisu prisutne kod mršavih ZDF kontrolnih pacova ali su prisutne u svakoj grupi tretiranih gojaznih ZDF pacova.

Glomeruloskleroza nije nađena kod mršavih ZDF kontrolnih pacova i takođe nije prisutna kod životinja tretiranih sa jedinjenjem (II-B). U skladu sa tim, degenerativne lezije, atrofija tubusa i tubularnih cilindara su nađene u malom broju slučajeva kod ovih životinja.

Upoređivanjem sa gojaznim ZDF kontrolnim pacovima koji su tretirani sa ramiprilom ili MDL 100.240, nije primećena razlika u pojavi glomeruloskleroze ili pratećih degenerativnih lezija. Ovi rezultati ukazuju da tretman sa jedinjenjem (II-B) može da spreči razvoj "dijabetične" glomeruloskleroze i pratećih degenerativnih lezija. Lezije kod gojaznih ZDF kontrolnih pacova su bile manje izražene.

Dodatno, pojava velikog broja dilatacije karlice je zabeležena kod životinja koje su tretirane sa jedinjenjem (II-B).

OBJAŠNJENJE KODOVA I SIMBOLA

KODOVI I SIMBOLI PRIMENJENI NA ŽIVOTINJAMA:

KO = završna žrtvovana grupa

Primer 2:

Ekskrecija albumina i kreatinina je određivana kod Goto-Kakizaki (GK) pacova. GK pacovi su model za dijabetes Tip II. Jedna grupa je ostavljena bez tretmana, jedna grupa je tretirana sa ACE/NEP inhibitorom formule (II-B), a jedna grupa je tretirana sa ACE inhibitorom, ramiprilom.

Tabela 4: urinarna ekskrecija albumina i kreatinina kod GK pacova, pacova tretiranih ramiprilom i pacova tretiranih sa jedinjenjem formule (II-B), počevši sa životinjom starom 6 meseci:

Primer 3:

Određivana je ekskrecija albumina i kreatinina kod Wistar pacova. Jedna grupa je ostavljena netretirana, jedna grupa je tretirana sa ACE/NEP inhibitorom formule (II-B), a jedna grupa je tretirana sa ACE inhibitorom ramiprilom. Wistar pacovi nisu imali dijabetes, a do razvoja proteinurije i strukturnih oštećenja bubrega je došlo u toku života odrasle jedinke. Wistar pacovi su zbog toga model za ne-dijabetičnu nefropatiju.

Slika 1 pokazuje ne-dijabetičnu nefropatiju povezanu sa godinama starosti kod placebo-tretiranih Wistar pacova (bubreg placebo pacova pokazuje umerene tubulo-intersticijalne lezije (proteinoza cilindara u tubusima, infiltracija inflamatornih ćelija, bazofilni tubusi)).

Tabela 5: urinarna ekskrecija albumina i kreatinina kod Wistar pacova, pacova tretiranih ramiprilom i pacova tretiranih sa jedinjenjem formule (II-B), počevši sa životinjom starom 6 meseci:

U ne-dijabetičnom modelu, jedinjenje formule (II-B) pokazuje značajno povećano nefroprotektivno delovanje u odnosu na ramipril, kako je određeno vrednostima proteinurije.

BOLESTI KOJE SE JAVLJAJU SA STARENJEM

Inkubacija proteina ili lipida sa aldoza šećerima dovodi do neenzimatične glikolacije i oksidacije amino grupa na proteinima, pri čemu se formiraju Amadori spojevi. U toku vremena, na spojevima dolazi do dodatnih promena, dehidratacije i unakrsnog vezivanja sa drugim proteinima, pri čemu nastaju kompleksi poznati kao Advanced Glycosylation end Products (AGEs) (poodmakla glikolacija i produkti). Formiranje AGEs može takođe da se opiše kao Maillard-ove reakcije. Faktori koji dovode do formiranja AGEs su zakasnela promena proteina (na primer, kao u amiloidozama), akumulacija makromolekula koje imaju visok sadržaj lizina i visoke vrednosti glukoze u krvi (na primer, kao kod dijabetesa) (Hori i saradnici, J. Biol. Chem. 270:25752-761, (1995.)). AGEs su implicirani u različitim oboljenjima, uključujući komplikacije povezane sa dijabetesom i normalnim starenjem.

AGEs pokazuju specifično i zasićeno vezivanje za receptore površinskih ćelija na endotelijalnim ćelijama malih krvnih sudova, monocita i makrofaga, ćelija glatkih mišića, mesengialnih ćelija i neurona. Receptor za endoprodukte poodmakle glikolacije (RAGE) je član familije super imunoglobulina molekula ćelijske_površine.

Povećane vrednosti RAGE su pronađene u starijim tkivima (Schleicher i saradnici, J. Clin. Invest. 1997., 99, 457-468) i retini, krvnim sudovima i bubrezima

dijabetičara (Schmidt i saradnici, Nature Med. 1995., 1002-1004). Aktiviranje RAGE u različitim tkivima i organima dovodi do brojnih patofizioloških konsekvenci. RAGE je impliciran u različita stanja, uključujući: akutnu i hroničnu inflamaciju (Hofmann i saradnici, Cell 1999., 97, 889-901), razvoj kasnijih dijabetičnih komplikacija, kao što je povećanje permeabilnosti krvnih sudova, nefropatija, ateroskleroza i retinopatija zbog akumulacije AGEs u bubrezima i drugim tkivima (Singh i saradnici, Diabetologia 2001, 44, 129.148), kao i kod Alchajmerove bolesti (Yan i saradnici, Nature 1998., 382, 685-691), erektivna disfunkcija, rast tumora i metastaze (Taguchi i saradnici, Nature 2000., 405, 354-357).

Poznato je da ACE inhibitor, ramipril, utiče na vrednosti endoprodukata produžene glikolacije kod visoko rizičnih pacijenata sa oboljenjem koronarne arterije: rezultati iz HOPE studije (B. Kihovd, E.M. Hjerkinn, I. Seljeflot, T.J. Berg, A.A. Reikvam).

U novije vreme je otkriveno da jedinjenja formule (I) značajno smanjuju akumulaciju AGEs u bubrezima i u srcu. Prema tome, jedinjenja formule (I) su korisna za prevenciju i/ili tretman bolesti mebatolizma povezanih sa endoproduktima produžene glikolacije, posebno sa dijabetičnim komplikacijama, kao što su dijabetična neuropatija, dijabetična nefropatija, dijabetična retinopatija, infarkt miokarda, katarakta i dijabetična kardiomiopatija.

Vrednosti AGE u bubrezima se određuju pomoću Dot blot analiza (Stracke i saradnici, Exp. Clin. Endocrinol. Diabets 2002., 109, 330-336) i reverzno-faznom visoko efikasnom tečnom hromatografijom ili RPC-HPLC (Drusch i saradnici, Food Chem. 1999., 65, 547-553).

Tretmanom pacova obolelih od dijabetesa sa jedinjenjem formule (II-B) normalizuju se vrednosti AGE (CML) u bubrezima, a tretmanom sa Ml00.240 značajno se smanjuje vrednost CML.

Primer 4: Dot blot analiza

Uzorci bubrega za dot blot analizu su dobijeni od mužjaka ZDF pacova starih 17 nedelja, kontrolnih pacova i ZDF pacova koji su sedam nedelja tretirani sa 30 mg/kg/dan jedinjenja (II-B) i sa 35 mg/kg/dan MDL 100.240. Po tri životinje iz svake grupe je žrtvovano, bubrezi izvađeni i trenutno zamrznuti u tečnom azotu. Mlevenje bubrega se vrši u tečnom azotu pomoću mlina sa rashladnom komorom (Freezer 6750, C3 Analvsetchnik GmbH). 10 mg uzorka bubrega se rastvori u 1 ml pufera fosfatnih soli (PBS) koji sadrži 0.5 g/l Tvveen 20, 0.5 mM PMSF, 1 ug/ml). Rastvor se tretira dva puta po pet sekundi sa ultrazvučnim prekidačem ćelije (45% snage, Bandolin Sonoplus HD 2070), centrifugira 20 minuta na 4.000 opm i dobijeni supernatant se koristi za dot blot analizu. Nitrocelulozna membrana se postavi na dot blot aparat i ispere dva puta sa 100 ul TBS/otvor. Za svaki uzorak se 10 ug proteina

(koncentracija proteina uzoraka se određuje sa DC Protein analizom, Bio Rad)

razblaži u 100 jul TBS i prenese na nitroceluloznu membranu (Amersham). Membrana se inkubira u toku noći u TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.05% v/v Tvveen 20) sa 5% mleka u prahu bez masti na 4°C i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi koristeći sledeću koncentraciju antitela: anti-CML 011 (Biologo) 0.25 ug/ml, anti-CEL (Biologo) 0.25 ug/ml i anti-pentosidin 0.12 (Biologo) 0.25 ug/ml. Nakon intenzivnog ispiranja u TBST sa 5% bezmasnim mlekom u prahu, membrane se izlože anti-mišijim IgG antitelima obeleže alkalne peroksidaze (Dianova) u toku jednog sata na sobnoj temperaturi. Membrane se ponovo isperu i izlože sistemu povećane hemofluorescentne detekcije (Amersham), u skladu sa uputstvima proizvođača. Relativna fluorescencija se određuje sa Fluor-Imager 595 (Molecular Dvnamics) i kvantifikuje pomoću Image-Quant softvera. Rezultati su iskazani kao relativna fluorescencija (rf) puta IO<5.>

Vrednosti AGE-subtipa CML su znatno veće u bubrezima ZDF pacova u poređenju sa kontrolnim pacovima (P<0.05). Nije pokazana značajna razlika između ZDF i kontrolnih pacova za AGE-subtipove CEL i pentosidin. ZDF pacovi tretirani sa jedinjenjem formule (II-B) pokazuju značajno manje AGE vrednosti za AGE-subtip CML, CEL i pentosidin (PO.05) u poređenju sa netretiranim ZDF pacovima. Niže AGE vrednosti za subtipove CEL i pentosidin mogu takođe da se odrede kod ZDF pacova koji su tretirani sa MDL 100.240 (P<0.01).

Primer 5: reverzno-fazna visoko efikasna tečna hromatografija (RP-HPLC)

Uzorci bubrega i srca za RP-HPLC analize se uzimaju od 17 nedelja starih mužjaka ZDF pacova, kontrolnih pacova i ZDF pacova koji su sedam nedelja tretirani sa 30 mg/kg/dan jedinjenja formule (II-B) i 35 mg/kg/dan MDL 100.240. Ispitivane su po dve životinje iz svake grupe. Mlevenje bubrega i srca se vrši u tečnom azotu pomoću mlina sa rashladnom komorom (Freezer 6750, C3 Analvsetchnik GmbH). Hidroliza uzoraka organa se vrši sa 6 M rastvorom hiđrohloridne kiseline (HC1) na 110°C u toku 12 sati. Razdvajanje uzoraka sa o-Ftaldialdehidom (OPA) i RP-HPLC se izvode na način kako je opisano u Drush i saradnici, Food Chem. 1999., 65, 547-553.

ZDF pacovi pokazuju značajno veću koncentraciju CML u bubrezima 17 i 37 nedelja starih pacova i u srcu 17 nedelja starih pacova, u poređenju sa kontrolnim pacovima (PO.05). Tretmanom sa jedinjenjem formule (II-B) smanjuje se koncentracija CML u bubrezima 17 i 37 nedelja starih ZDF pacova, kao i koncentracija CML u srcu 17 nedelja starih ZDF pacova. MDL 100.240 takođe smanjuje koncentraciju CML u bubrezima i srcu 17 nedelja starih ZDF pacova, ali ne u bubrezima 37 nedelja starih ZDF pacova.

REZISTENCIJA NA INSULIN

Jedinjenja formule (I) takođe pokazuju delovanje na osetljivost na insulin. Profilaktičko delovanje jedinjenja formule (I) nakon nefropatije takođe ukazuje da se može očekivati da sredstvo koje senzibiliše insulin može da spreči, promeni, stabiliše ili uspori napredovanje mikroalbuminurije do albuminurije. Ovo je zbog toga što se smatra da mikroalbuminurija ukazuje na buduću nefropatiju, posebno kod pacijenata sa klinički potvrđenim sindromom pre-dijabetične rezistencije na insulin, alternativno označen kao Sindrom X.

Upotreba ACE ili inhibitora vazopeptidaze za tretman rezistencije na insulin

još uvek nije ispitana.

Sada je otkriveno da jedinjenja formule (I) značajno snižavaju koncentraciju glukoze u krvi i vrednosti HbAlc i na taj način smanjuju rezistenciju na insulin.

HbAlc je mera za dugotrajne vrednosti glukoze. Glicirani HbA]c je rani AGE i takođe

se naziva Amadori produkt.

Delovanje jedinjenja formule (II-B) na HbAici vrednosti glukoze u krvi je

slično kao i delovanje M 100.240, a oba jedinjenja pokazuju niže vrednosti nego ACE inhibitor ramipril.

Primer 6: analiza glukoze u krvi i HbA]Ckod ZDF pacova

Glukoza u krvi i HbAicse mere kod deset i sedamnaest nedelja starih mužjaka Zucker dijabetičnih gojaznih pacova (Genetic Model Inc.), kontrolnih pacova

(Genetic Model Inc.) i mužjaka ZDF pacova koji su sedam nedelja tretirani sa 30 mg/kg/dan jedinjenja formule (II-B), 35 mg/kg/dan MDL 100.240 i 1 mg/kg/dan ramiprila. U svakoj grupi je ispitivano 15 životinja.

Uzorci krvi za određivanje glukoze su od ZDF pacova dobijeni upotrebom standardnih kiveta za uzorke. U toku 30 minuta prikupljeni uzorci se centrifugom razdvoje od ćelija. Kvantitativno određivanje glukoze u serumu se izvodi sa enizmatičnim in vitro testom od Roshe Diagnostics GmbH (Gluco-quant, Roche Diagnostics GmbH) upotrebom automatskog kliničkog hemijskog analajzera

Boehringer Mannheim/Hitachi 912.

Za dobijanje uzoraka krvi za određivanje HbAlc, koriste se kapilarne kivete za jednokratnu upotrebu. HbAlcvrednosti se dobijaju iz hemolizata ukupnog uzorka krvi sa imunoanalizom turbodimetričke inhibicije (Tina-quant, Roche Diagnostics GmbH),

a koncentracija hemoglobina se određuje na drugom kanalu automatskog kliničkog hemijskog analajzera (Boehringer Mannheim/Hitachi 912). Koncentracija HbAJcu procentima se izračunava od HbA]Cza ukupan hemoglobin.

Koncentracija glukoze u krvi i vrednosti HbAicsu značajno niže kod kontrolnih životinja u poređenju sa ZDF pacovima (PO.01). 17 nedelja stari mužjaci ZDF pacova koji su tretirani sa MDL 100.240 ili jedinjenjem (II-B) takođe pokazuju značajno nižu koncentraciju glukoze u krvi i vrednosti HbAicu poređenju sa netretiranim ZDF pacovima. Nema značajne razlike u koncentraciji glukoze u krvi ili HbAlckod 17 nedelja starih ZDF pacova tretiranih sa ramiprilom u poređenju sa netretiranim ZDF pacovima.

ENDOTELIJALNA DISFUNKCIJA IATEROSKLEROTIČNIPLAKOVI

Kod modela aterogeničnih zečeva (White New Zealand zečevi hranjeni sa 0.25% holesterola plus 3% kokosovog ulja) je pokazano da čak kratak period od 6 nedelja sa aterogeničnom ishranom dovodi do odložene endotelijalne disfunkcije, mada su nakon toga životinje 3 meseca dobijale normalnu hranu. U svim do sada poznatim eksperimentima, životinje su za sve vreme konstantno hranjene sa aterogeničnom hranom i imale su fiziološki ekstremno visoke vrednosti holesterola koje nisu uporedive sa situacijom kod ljudi.

Endotelijalna disfunkcija kao i aterogenične promene na krvnim sudovima su sprečene i uklonjene tretmanom sa ACE/NEP inhibitorom jedinjenja formule (II-B), kako je prvi put istraženo i pokazano u direktnom poređenju sa ACE inhibitorom, ramiprilom. Kao mera za endotelijalnu disfunkciju poslužila je endotelijum-zavisna relaksacija na izolovanim aortnim prstenovima zečeva, kao i oslobađanje azot oksida i superoksida iz endotelijalnih ćelija.

Primer 7: efekti dugotrajnog tretmana sa ACE/NEP inhibitorom jedinjenja formule (II-B) na endotelijalnu disfunkciju i aterosklerotične plakove kod zečeva koji su hranjeni aterogeničnom hranom

Grupe:

Standard: 18 nedelja normalne ishrane

Aterogenični: 18 nedelja aterogenične hrane (3% kokosovo ulje + 0.25% holesterol)

Raznolika hrana (raz.): 6 nedelja aterogenične hrane + 12 nedelja normalne ishrane

Raznolika hrana + ramipril: 6 nedelja aterogenične hrane + 12 nedelja normalne hrane + ramipril

Raznolika hrana + jedinjenje (II-B): 6 nedelja aterogenične hrane + 12 nedelja normalne hrane + jed. (II-B)

NO i 02" su markeri za endotelijalnu funkciju: povećanje oslobađanja i vrednosti NO su korisni, dok povećanje 02~ dovodi do inhibicije korisnog delovanja

NO.

Claims (15)

1. Upotreba jedinjenja formule (I) pri čemu A = H, C,-C8-alkil, CH2OCH2CH2OCH3, -(CrC4-alkil)-aril; Rije vodonik, -CH2OC(0)C(CH3)3ili neka alkil grupa; R2 je vodonik, -CH20-C(0)C(CH3)3, C,-C4-alkil, aril, -(C,-C4-alkil)-aril ili difenilmetil grupa; X je -(CH2)n, pri čemu je n ceo broj 0 ili 1, -S-, -O-, pri čemu je R3vodonik, CpC4-alkil, aril ili aril-(Ci-C4-alkil), a R4 je -CF3, CpCio-alkil, aril ili aril-(CrC4-alkil) grupa; B]i B2su svaki nezavisno vodonik, hidroksi, -OR5grupa, pri čemu je R5Cr C4—alkil, aril ili —(C1 -C4—alkil)-aril ili kada su B]i B2vezani za susedne atome ugljenika, Bji B2mogu zajedno sa pomenutim susednim atomima ugljenika da formiraju benzenski prsten ili metilendioksi grupu, za tretman i/ili profilaksu nefropatije kod pacijenata sa dijebetesom, ili za tretman i/ili profilaksu nefropatije kod pacijenata bez dijabetesa, ili za tretman i/ili profilaksu rezistencije na insulin ili metaboličkih bolesti povezanih sa endoproduktima uznapredovane glikolacije, ili za tretman i/ili profilaksu ateroskleroze ili endotelijalne disfunkcije.

2. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (II) a Rije acetil grupa.

3. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što je Rivodonik.

4. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što su Bji/ili B2vodonik.

5. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što je X -CH2grupa.

6. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (II-A): pri čemu je R]acetil grupa ili vodonik.

7. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (II-B)

8. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (II-C)

9. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (III) a Rije acetil grupa.

10. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačena time što jeR{vodonik.

11. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačena time što su B]i/ili B2vodonik.

12. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačena time što je X -CH2grupa.

13. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (III-A): pri čemu je R\acetil grupa ili vodonik.

14. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (III-B):

15. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što se jedinjenje formule (I) karakteriše jedinjenjem formule (III-C):