RS20050126A - Imunostimulatorne nukleinske kiseline - Google Patents

Imunostimulatorne nukleinske kiseline

Info

Publication number
RS20050126A
RS20050126A YUP-2005/0126A YUP20050126A RS20050126A RS 20050126 A RS20050126 A RS 20050126A YU P20050126 A YUP20050126 A YU P20050126A RS 20050126 A RS20050126 A RS 20050126A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
phosphodiester
seq
internucleotide
subject
Prior art date
Application number
YUP-2005/0126A
Other languages
English (en)
Inventor
Arthur Krieg
Ulrike Samulowitz
Joerg Vollmer
Eugen Uhlmann
Marion Jurk
Grayson Lipford
Robert Rankin
Original Assignee
Coley Pharmaceutical Group Inc.,
COLEY PHARMACEUTICAL GmbH.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharmaceutical Group Inc.,, COLEY PHARMACEUTICAL GmbH., filed Critical Coley Pharmaceutical Group Inc.,
Publication of RS20050126A publication Critical patent/RS20050126A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Pronalazak se odnosi na klasu mekanih ili polu-mekanih CpG imunostimulatornih oligonukleotida koji su korisni za stimulaciju imunog odgovora.

Description

IMUNOSTIMULATORNE NUKLEINSKE KISELINE
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se generalno odnosi na imunostimulatorne nukleinske kiseline, kao i na imunostimulatorne oligonukleotide sa smanjenim inflamatornim efektima na bubrege, njihove kompozicije i postupke za upotrebu imunostimulatornih nukleinskih kiselina.
OSNOVA PRONALASKA
Bakterijska DNK ima imunostimulatorno dejstvo u vidu aktivacije B ćelija i prirodnih ćelija ubica, ali kičmenjačka DNK nema takvo dejstvo (Tokunaga, T., et al., 1988.Jpn J. Cancer Res.79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984,JNCI72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991,J. Immunol.147:1759-1764; i revidirano u Krieg, 1998, u: Applied Oligonucleotide Technologv, C. A. Stein and A. M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448). Sada se smatra da su ti imunostimulatorni efekti bakterijske DNK rezultat prisustva nemetilovanih CpG dinukleotida u određenim baznim kontekstima (CpG motivi), koji su česti kod bakterijske DNK, ali su metilovani i neadekvatno predstavljeni kod kičmenjačke DNK (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophvs. Acta 93321:1-10). Imunostimulatorni efekti bakterijske DNK mogu se oponašati sa sintetičkim oligodezoksinukleotidima (ODN) koji sadrže ove CpG motive. Takvi CpG ODN imaju visoko stimulatorne efekte na leukocite ljudi i miševa, uključujući proliferaciju B ćelija; citokinsku i imunoglobulinsku sekreciju; litičku aktivnost ćelija prirodnih ubica (NK) i IFN-y sekreciju; i aktivaciju dendritskih ćelija (DCs) i drugih ćelija koje prikazuju antigene, tako da one eksprimiraju kostimulatorne molekule i luče citokine, posebno citokine slične Th1 koji su bitni za potpomaganje razvoja Th1-sličnih T ćelijskih odgovora. Ovi imunostimulatorni efekti prirodne fosfodiestarske osnove CpG ODN su visoko CpG specifični u tome da su efekti suštinski poništeni ako je CpG motiv metilovan, promenjen u GpC, ili na drugi način eliminisan ili izmenjen (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10).
U ranim studijama, smatralo se da je imunostimulatorni CpG motiv sledio formulu purin-purin-CpG-pirimidin-pirimidin (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetskv, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Međutim, danas je jasno da limfociti miša imaju prilično dobar odgovor na fosfodiestarske CpG motive koji ne slede ovu "formulu"
(Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906), a isto važi za humane B ćelije i dendritske ćelije (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Nedavno je opisano nekoliko različitih klasa CpG nukleinskih kiselina. Jedna klasa je potentna u aktivaciji B ćelija, ali je istovremeno relativno slaba u indukciji IFN-a i aktivaciji NK ćelija; ova klasa je označena kao B klasa. B klasa CpG nukleinskih kiselina je u tipičnom slučaju u potpunosti stabilizovana i obuhvata nemetilovani CpG dinukleotid unutar određenog poželjnog baznog konteksta. Pogledati, npr., U.S. Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; i 6,339,068. Sledeća klasa CpG nukleinskih kiselina aktivira B ćelije i NK ćelije i indukuje IFN-a; ova klasa je označena kao C-klasa. C klasa CpG nukleinskih kiselina su, kao što je prvi put opisano, u tipičnom slučaju u potpunosti stabilizovane nukleinske kiseline, obuhvataju sekvencu tipa-B klase i GC-bogat palindrom ili strukturu blisku palindromu. Ova klasa je opisana u U.S. provizornoj prijavi patenta 60/313,273, koja je u istovremenom postupku, a koja je podneta 17. avgusta 2001. i US10/224,523 koja je podneta 19. avgusta 2002. i sa njima povezanom PCT patentnom prijavom PCT/US02/26468 koja je objavljena pod International Publication Number VVO 03/015711.
REZIME PRONALASKA
Iznenađujuće, otkriveno je da se imunostimulatorne osobine B-klase i C-klase CpG nukleinskih kiselina i drugih stabilizovanih imunostimulatornih nukleinskih kiselina mogu zadržati ili čak i unaprediti selektivnim uključivanjem jedne ili više nestabilizovanih veza između određenih nukleotida. Ne-stabilizovane veze su poželjno prirodne veze, tj., fosfodiestarske veze ili veze slične fosfodiestarskim vezama. Ne-stabilizovana veza će u tipičnom slučaju, ali ne neophodno, biti relativno podložna razlaganju nukleazama. Imunostimulatorne nukleinske kiseline ovog pronalaska obuhvataju najmanje jednu ne-stabilizovanu vezu postavljenu između 5' pirimidina (Y) i susednog 3' purina (Z), poželjno guanina (G), gde su i 5'Y i 3'Z unutrašnji nukleotidi.
Kao i potpuno stabilizovane imunostimulatorne nukleinske kiseline, imunostimulatorne nukleinske kiseline ovog pronalaska su korisne za indukciju Th1-sličnog imunog odgovora. Na osnovu toga, imunostimulatorne nukleinske kiseline ovog pronalaska su korisne kao adjuvanti za vakcinaciju i za tretiranje bolesti uključujući kancer, infektivne bolesti, alergiju i astmu. Veruje se da su imunostimulatorne nukleinske kiseline od posebne vrednosti u primeni kod bilo kog stanja kod koga je potrebna produžena ili ponovljena primena imunostimulatorne nukleinske kiseline u bilo koju svrhu.
Pored toga što su korisne za bilo koju svrhu kod koje se koriste u potpunosti stabilizovane imunostimulatorne nukleinske kiseline, imunostimulatorne nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu u nekim oblicima imati prednosti u odnosu na potpuno stabilizovane imunostimulatorne nukleinske kiseline, kao što su povećana potentnost i smanjena toksičnost.
Ovaj pronalazak se delimično odnosi na imunostimulatorne oligonukleotide koji sadrže CpG. U jednom aspektu pronalazak je oligonukleotid koji ima formulu: 5T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2*T*T3' (SEQ ID NO: 296). U oligonukleotidu, ^ je dužine 0-6 nukleotida.a N2je 0-7 nukleotida. Simbol<*>se odnosi na prisustvo stabilizovane internukleotidne veze. Internukleotidne veze koje nisu označene sa<*>mogu biti nestabilizovane ili stabilizovane, sve dok oligonukleotid obuhvata najmanje 2 fosfodiestarske internukleotidne veze. Stabilizovana internukleotidna veza može biti fosforotioatna veza. U nekim oblicima Nije 0-2 nukleotida. Poželjno oligonukleotid je dužine 16-24 nukleotida.
U nekim oblicima oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
5T<*>C<*>G<*>T<*>C<*>G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>GA_N1C<*>G<*>N2<*>T<*>T3' (SEQ ID NO: 296). Znak _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze.
Poželjno oligonukleotid je
Pronalazak se u drugim aspektima odnosi na oligonukleotid koji sadrži: 5'T<*>C<*>G<*>(T7A<*>)TN3CGTTTTN4CGN5<*>T<*>T3' (SEQ ID NO: 301). N3je dužine 0-4 nukleotida. N4je dužine 1-5 nukleotida. N5je dužine 0-7 nukleotida. Znak<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze. Internukleotidne veze koje nisu označene sa<*>mogu biti nestabilizovane ili stabilizovane, sve dok oligonukleotid obuhvata najmanje 2 fosfodiestarske internukleotidne veze. Stabilizovana internukleotidna veza može biti fosforotioatna veza. U nekim oblicima N4 je dužine 1-2 nukleotida. Poželjno oligonukleotid je dužine 16-24 nukleotida.
U jednom obliku oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
Poželjno oligonukleotid je
Na osnovu drugog aspekta dat je oligonukleotid koji sadrži: 5T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 306). N je bilo koji nukleotid. Znak<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze. Internukleotidne veze koje nisu označene sa<*>mogu biti nestabilizovane ili stabilizovane, sve dok oligonukleotid obuhvata najmanje 3 fosfodiestarske internukleotidne veze. Stabilizovana internukleotidna veza može biti fosforotioatna veza. U nekim oblicima oligonukleotid obuhvata 5 fosfodiestarskih internukleotidnih veza. Poželjno oligonukleotid je dužine 16-24 nukleotida.
U jednom obliku oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
jednom obliku oligonukleotid je
Simbol _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze.
U drugim oblicima oligonukleotid obuhvata najmanje jedan C_G motiv sa fosfodiestarskom internukleotidnom vezom. U nekim drugim oblicima oligonukleotid ne obuhvata ni jedan C G motiv sa fosfodiestarskom internukleotidnom vezom.
U drugim aspektima dat je oligonukleotid koji ima strukturu 5T<*>C_G(N6C_GN7)2.3T<*>C_G<*>T<*>T3' (SEQ ID NO: 311-312). N6i N7su nezavisno dužine između 1 i 5 nukleotida i oligonukleotid ima dužinu od 16-40 nukleotida.
U nekim oblicima N6je jedan nukleotid, na primer N6može biti T ili A. N7u nekim oblicima je dužine pet nukleotida, na primer, N7može biti pet pirimidina ili TTTTG.
U nekim oblicima oligonukleotid ima strukturu:
Na osnovu drugih aspekata prtonalaska dat je oligonukleotid koji ima strukturu 5T*CGCGN8CGCGC*GN93' (SEQ ID NO: 315). N8 je dužine između 4 i 10 nukleotida i obuhvata najmanje 1 C_G motiv. N9je dužine između 0 i 3 nukleotida. Oligonukleotid ima dužinu od 15-40 nukleotida.
U nekim oblicima N8obuhvata najmanje 2 ili 3 CG motiva. U drugim oblicima N8je PuCGPyPyCG ili PuCGPyPyCGCG. Izborno N8 je ACGTTCG. N9može da obuhvata najmanje jedan CG motiv, kao što je CCG.
U nekim oblicima oligonukleotid ima strukturu:
U sledećem aspektu je dat oligonukleotid koji ima formulu 5,rT<*>GX1X2TGX3X4T<*>T<*>T<*>T<*>N1oT<*>T<*>T<*>T<*>T<*>T<*>T3,(SEQ ID NO: 318). N10je dužine između 4 i 8 nukleotida i obuhvata najmanje 1 C_G motiv. Xi, X2, X3i X4su nezavisno C ili G. Oligonukleotid je dužine od 24-40 nukleotida.
U nekim oblicima Ni0obuhvata najmanje 2 ili 3 CG motiva. U drugim oblicima oligonuleotid ima jednu od sledećih struktura:
U drugim oblicima, oligonukleotid ima strukturu:
U nekim aspektima ODN je oligonukleotid koji ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine
U sledećem aspektu pronalazak je oligonukleotid koji sadrži oktamernu sekvencu koja sadrži najmanje jedan YZ dinukleotid koji ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i najmanje 4 T nukleotida, gde je Y pirimidin ili modifikovani pirimidin, gde je Z guanozin ili modifikovani guanozin i gde oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
Y može biti nemetilovani C. Z može biti guanozin. U nekim oblicima Y je citozin ili modifikovane citozinske baze izabrane iz grupe koju čine 5-metilcitozin, 5-metil-izocitozin, 5-hidroksi-citozin, 5-halogenocitozin, uracil, N4-etil-citozin, 5-fluoro-uracil i vodonik. U drugim oblicima Z je guanin ili modifikovana baza guanina izabrana iz grupe koju čine 7-deazaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin (kao što je 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin), 7-deaza-8-supstituisani guanin, hipoksantin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, purin, 8-supstituisani guanin kao što je 8-hidroksiguanin i 6-tioguanin, 2-aminopurin i vodonik.
U nekim oblicima oktamerna sekvenca obuhvata dva YZ dinukleotida. Izborno oba YZ dinukleotida imaju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu.
U nekim oblicima oktamerna sekvenca je izabrana iz grupe koju čine T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T, C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>T, G*T*C-G*T*TT*T, T<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G, C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A, T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C-G, T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C-G<*>T, T<*>T<*>G<*>A<*>C-G<*>T<*>T, T<*>G<*>A<*>C-G<*>T<*>T<*>T, G<*>A<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T, A*C-G*T*T*TT*G, C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T, T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C-G, T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C-G<*>T, G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C i T<*>T<*>G<*>T<*>C-G<*>T<*>T, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze.
U drugim oblicima oligonukleotid je dužine od 8-40 nukleotida.
Veza slična fosfodiestarskoj može biti borofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat. Izborno stabilizovane internukleotidne veze su fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosforotioat ili bilo koja njihova kombinacija.
Oligonukleotid može imati 3-3' vezu sa jednim ili dva dostupna 5' kraja. U nekim poželjnim oblicima oligonukleotid ima dva dostupna 5' kraja, gde je svaki od njih 5TCG.
U sledećem aspektu pronalaska dat je oligonukleotid koji sadrži: 5TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO: 368). Najmanje jedan CG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
U drugim aspektima pronalazak je oligonukleotid koji sadrži: 5'GNC3', gde je N nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 4 do 10 nukleotida i najmanje 50% T i ne obuhvata CG dinukleotid i oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu. U jednom obliku N obuhvata TTTT motiv. U drugim oblicima oligonukleotid je izabran iz grupe koju čine G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C i G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze.
U sledećem aspektu pronalazak daje molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline koji ima najmanje jedan pirimidin-purin (YZ) dinukleotid i izborno pirimidin-guanozin (YG) dinukleotid i himerni osnovni lanac, gde najmanje jedan unutrašnji YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde izborno svaki dodatni unutrašnji YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku, njoj sličnu ili stabilizovanu internukleotidnu vezu i gde su sve druge internukleotidne veze stabilizovane. U jednom obliku imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži više unutrašnjih YZ dinukleotida, gde svaki od njih ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu. U jednom obliku svaki unutrašnji YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je izabran iz grupe koju čine: *A*C G*T*C G*T*T*T*T*C G*T*C G*T*T (SEQ ID NO: 1),
T<*>T_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>T_G<*>T<*>T_G<*>T<*>T (SEQ ID NO: 99), gde<*>predstavlja fosforotioat, _ predstavlja fosfodiestar, U predstavlja 2'-dezoksiuracil i 7 predstavlja 7-deazaguanin.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je izabran iz grupe koju čine:
T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>C<*>G<*>G<*>C<*>G<*>G<*>C<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G (SEQ ID NO: 104), gde<*>predstavlja fosforotioat, _ predstavlja fosfodiestar.
U sledećem aspektu pronalazak daje molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline koji sadrži himerni osnovni lanac i najmanje jednu sekvencu N-|YGN2, gde je nezavisno za svaku sekvencu NiYGN2YG unutrašnji pirimidin-guanozin (YG) dinukleotid, svako Nii N2je, nezavisno jedan od drugoga, bilo koji nukleotid i gde je najmanje jedna sekvenca NiYGN2i izborno svaka dodatna sekvenca N1YGN2: YG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, N-ii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid, G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, ili Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid i G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, gde su sve druge internukleotidne veze stabilizovane.
U jednom obliku imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži više sekvenci NiYGN2, gde za svaku sekvencu NiYGN2YG: YG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid, G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, ili Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid i G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je izabran iz grupe koju čine:
gde<*>predstavlja fosforotioat i _ predstavlja fosfodiestar.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran je iz grupe koje se sastoji od:
predstavlja fosforotioat i _ predstavlja fosfodiestar.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran je iz grupe koje se sastoji od:
predstavlja fosforotioat i _ predstavlja fosfodiestar.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran je iz grupe koje se sastoji od:
predstavlja fosforotioat i _ predstavlja fosfodiestar.
U jednom obliku najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid koji ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu je CG. U jednom obliku najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid koji ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu je TG.
U jednom obliku fosfodiestarska ili njoj slična internukleotidna veza je fosfodiestar. U jednom obliku veza slična fosfodiestarskoj vezi je borofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat.
U jednom obliku stabilizovane internukleotidne veze su izabrane iz grupe koju čine: fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosforotioat i bilo koja njihova kombinacija. U jednom obliku stabilizovane internukleotidne veze su fosforotioat.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline B-klase. U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline C-klase.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 4-100 nukleotida. U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 6-40 nukleotida. U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 6-19 nukleotida.
U jednom obliku molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline nije antisens oligonukleotid, oligonukleotid koji formira trostruki heliks ili ribozom.
U sledećem aspektu pronalazak daje oligonukleotid koji sadrži
gde je svako Nii N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 1-20 nukleotida, gde _ označava fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde je N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida i gde G-N2-C obuhvata 1 ili 2 stabilizovane veze.
U sledećem aspektu pronalazak daje oligonukleotid koji sadrži
gde je svako Nii N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 1-20 nukleotida, gde _ označava fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde je N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 4-20 nukleotida i gde G-N2-C obuhvata najmanje 5 stabilizovanih veza.
U sledećem aspektu pronalazak daje oligonukleotid koji sadrži
gde je svako Ni, N2i N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida, gde _ označava fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde oligonukleotid nije antisens oligonukleotid, oligonukleotid koji formira trostruki heliks ili ribozom. U sledećem aspektu pronalazak daje oligonukleotid koji sadrži
gde je svako Nii N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida, gde je n=2 ili n=4-6, gde je svakoX-\i X2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca koja ima fosforotioatne internukleotidne veze od 3-10 nukleotida, gde Nr(GTCGTT)n-N2obuhvata najmanje jednu fosfodiestarsku internukleotidnu vezu i gde 3' i 5' nukleotidi oligonukleotida ne obuhvataju poli-G, poli-A, poli-T, ili poli-C sekvence.
U jednom obliku nukleinska kiselina ima osnovni lanac koji sadrži deoksiribozu ili ribozu.
U jednom obliku oligonukleotid ima osnovni lanac koji sadrži deoksiribozu ili ribozu.
U jednom obliku oligonukleotid je farmaceutska kompozicija koja izborno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
U jednom obliku oligonukleotid dodatno sadrži adjuvant ili citokin.
U jednom obliku oligonukleotid dodatno sadrži antigen, gde je oligonukleotid adjuvant vakcine.
U jednom obliku antigen je izabran iz grupe koju čine: virusni antigen, bakterijski antigen, gljivični antigen, parazitski antigen i tumorski antigen. U jednom obliku antigen kodira nukleinsko kiselinski vektor. U jednom obliku antigen je peptidni antigen. U jednom obliku antigen je kovalentno vezan za oligonukleotid ili molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline. U sledećem obliku antigen nije kovalentno vezan za oligonukleotid ili molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U sledećem aspektu pronalazak daje postupak za identifikaciju relativne potencije ili toksičnosti test molekula imunostimulatorne nukleinske kiseline. Postupak obuhvata izbor referentne imunostimulatorne nukleinske kiseline koja ima referentnu sekvencu, stabilizovani osnovni lanac i referentnu imunostimulatornu potenciju ili toksičnost; izbor test imunostimulatorne nukleinske kiseline koja ima referentnu sekvencu, fosfodiestarsku ili njoj sličnu vezu umesto stabilizovane veze između Y i N najmanje jednog unutrašnjeg YN dinukleotida u referntnoj sekvenci, gde je Y pirimidin i N je bilo koji nukleotid i koja ima referentnu imunostimulatornu potenciju ili toksičnost; upoređivanjem test imunostimulatorne potencije ili toksičnosti sa referentnom imunostimulatornom potencijom ili toksičnošću da bi se identifikovala relativna potencija ili toksičnost test molekula imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U jednom obliku test imunostimulatorna nukleinska kiselina je jači induktor TLR9 signalne aktivnosti od referentne imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U jednom obliku test imunostimulatorna nukleinska kiselina je jači induktor interferona tipa 1 od referentne imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U jednom obliku test imunostimulatorna nukleinska kiselina je jači induktor IP-10 od referentne imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U jednom obliku YN je YG. U jednom obliku najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid je CG. U jednom obliku najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid je TG.
U jednom obliku test imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži više unutrašnjih YG dinukleotida koji svi imaju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu. U jednom obliku najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid je svaki unutrašnji YG dinukleotid.
U jednom obliku fosfodiestarska ili njoj slična veza je fosfodiestar. U jednom obliku veza slična fosfodiestarskoj vezi je borofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat.
U jednom obliku stabilizovani osnovni lanac sadrži više internukleotidnih veza koje su izabrane iz grupe koju čine: fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosfotioat i bilo koja njihova kombinacija. U jednom obliku stabilizovani osnovni lanac sadrži više fosforotioatnih internukleotidnih veza.
U jednom obliku referentni molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline B-klase. U jednom obliku referentni molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline C-klase.
U jednom obliku referentni molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 4-100 nukleotida. U jednom obliku referentni molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 6-40 nukleotida. U jednom obliku referentni molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je dužine 6-19 nukleotida.
U sledećem aspektu pronalazak daje postupak za dizajniranje stabilizovanog molekula imunostimulatorne nukleinske kiseline, dužine manje od 20 nukleotida. Postupak obuhvata izbor sekvence dužine 6-19 nukleotida, gde sekvenca obuhvata najmanje jedan unutrašnji CG dinukleotid; izbor fosfodiestarske ili njoj slične veze između C i G najmanje jednog unutrašnjeg CG dinukleotida; nezavisan izbor fosfodiestarske, njoj slične ili stabilizovane veze između C i G svakog dodatnog unutrašnjeg CG dinukleotida; i izbor stabilizovane veze za sve ostale internukleotidne veze.
U sledećem aspektu pronalazak je postupak za lečenje ili prevenciju alergije ili astme. Postupak se izvodi primenom na subjekta imunostimulatornog CpG oligonukleotida koji je ovde opisan u efikasnoj količini za lečenje ili prevenciju alergije ili astme. U jednom obliku oligonukleotid se primenjuje na mukoznu površinu. U drugim oblicima oligonukleotid se primenjuje u aerosol formulaciji. Izborno oligonukleotid se primenjuje intranazalno.
Postupak za indukciju proizvodnje citokina je dat na osnovu sledećeg aspekta pronalaska. Postupak se izvodi primenom na subjekta imunostimulatornog CpG oligonukleotida koji je ovde opisan u efikasnoj kloličini da bi se indukovao citokin izabran iz grupe koju čine IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-a, hemokini i IFN-y.
U sledećem aspektu pronalazak je kompozicija CpG imunostimulatornih oligonukleotida koji su ovde opisani zajedno sa antigenom ili drugim terapeutskim jedinjenjem, kao što je anti-mikrobijalni agens. Anti-mikrobijalni agens može biti, na primer, anti-virusni agens, anti-parazitski agens, anti-bakterijski agens ili anti-gljivični agens.
Kompozicija sa sistemom sa produženim delovanjem uključujući CpG imunostimulatorne oligonukleotide koji su ovde opisani je data na osnovu sledećeg aspekta pronalaska.
Kompozicija može izborno sadržati farmaceutski nosač i/ili može biti formulisana u sistemu za dopremanje. U nekim oblicima sistem dopremanja je izabran iz grupe koju čine katjonski lipidi, proteini permeabilni za ćeliju i sistemi sa produženim delovanjem. U jednom obliku sistem sa produženim delovanjem je biorazgradljiv polimer ili mikropartikula.
Na osnovu sledećeg aspekta pronalaska dat je postupak za stimulisanje imunog odgovora. Postupak obuhavta primenu CpG imunostimulatornog oligonukleotida na subjekat u količini koja je efikasna da indukuje imuni odgovor kod subjekta. Poželjno se CpG imunostimulatorni oligonukleotid primenjuje oralno, lokalno, u sistemu sa produženim delovanjem, mukozno, sistemski, parentealno ili intramuskularno. Kada se
CpG imunostimulatorni oligonukleotid primenjuje na mukoznu površinu može se primeniti u količini koja je efikasna za indukovanje mukoznog imunog odgovora ili sistemskog imunog odgovora. U poželjnim oblicima mukozna površina je izabrana iz grupe koju čine oralna, nazalna, rektalna, vaginalna i okularna površina.
U nekim oblicima postupak obuhvata izlaganje subjekta antigenu, gde je imuni odgovor antigen-specifičan imuni odgovor. U nekim oblicima antigen je izabran iz grupe koju čine tumor antigen, virusni antigen, bakterijski antigen, parazitski antigen i peptidni antigen.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su sposobni da izazovu širok spektar imunih odgovora. Na primer ovi CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu upotrebiti da preusmere Th2 u Th1 imuni odgovor. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se takođe mogu upotrebiti da aktiviraju imune ćelije, kao što su limfociti (npr., B i T ćelije), dendritske ćelije i NK ćelije. Aktivacija se može izvestiin vivo, in vitro,iliex vivo,tj., izolovanjem imune ćelije iz subjekta, stavljanjem u dodir imune ćelije sa efikasnom količinom da bi se aktivirala imuna ćelija CpG imunostimulatornim oligonukleotidom ili ponovnom primenom aktivirane imune ćelije na subjekta. U nekim oblicima dendritska ćelija eksprimira antigen kancera. Dendritska ćelija se može izložiti antigenu kanceraex vivo.
Imuni odgovor proizveden od strane CpG imunostimulatornih oligonukleotida može takođe imati kao rezultat izazivanje proizvodnje citokina, npr., proizvodnje IL-6, IL-8, IL-12, IL-18 TNF, IFN-a, hemokina i IFN-y.
U daljem obliku, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su korisni u lečenju kancera. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni na osnovu ostalih aspekata pronalaska u prevenciji kancera (npr., smanjenjem rizika za razvoj kancera) kod subjekta kod koga postoji rizik razvoja kancera. Kancer može biti iz grupe koja se sastoji od kancera žučnog trakta, kancera dojke, kancera grlića materice, horiokarcinoma, kancera debelog creva, kancera endometrijuma, kancera želuca, intraepitelijalnih neoplazmi, limfoma, kancera jetre, kancera pluća (npr., sa malim ćelijama i ćelijama koje nisu male), melanoma, neuroblastoma, oralnog kancera, kancera jajnika, kacera pankreasa, kancera prostate, kancera rektuma, sarkoma, kancera tiroidne žlezde i kancera bubrega, kao i ostalih karcinoma i sarkoma. U nekim važnim oblicima, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera kostiju, mozga i kancera CNS-a, kancera vezivnog tkiva, kancera ždrela, kancera oka, Hodgkin-ovog limfoma, kancera grkljana, kancera oralne šupljine, kancera kože i kancera testisa.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se takođe mogu upotrebiti za poboljšanje odgovora ćelije kancera na terapiju kancera (npr., anti-kancer terapija), opciono kada su CpG imunostimulatorni oligonukleotidi primenjeni zajedno sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapija može biti hemoterapija, vakcina (npr.,in vitroprajmovana vakcina dendritske ćelije ili vakcina antigena kancera) ili terapija zasnovana na antitelima. Poslednje navedena terapija može takođe obuhvatiti primenu antitela koje je specifično za antigen ćelijske površine, na primer, ćelije kancera, gde imuni odgovor kao rezultat ima antigen zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). U jednom obliku, antitelo može biti izabrano iz grupe koja obuhvata Ributaxin, Herceptin, Ouadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolvm, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LvmphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA.
Stoga, prema nekim od aspekata pronalaska, na subjekta sa kancerom ili na istog kod koga postoji rizik od pojavljivanja kancera primenjuje se CpG imunostimulatorni oligonukleotid i anti kancer terapija. U nekim oblicima, anti-kancer terapija je izabrana iz grupe koja se sastoji od hemoterapeutskog agensa, imunoterapeutskog agensa i vakcine za kancer.
U daljem obliku postupaka koji su usmereni na prevenciju ili lečenje kancera, subjektu je moguće dalje primenjivati interferon-a.
Pronalazak se u ostalim aspektima odnosi na postupke za prevenciju bolesti kod subjekta. Postupak obuhvata redovnu primenu na subjekta CpG imunostimulatornog oligonukleotida da bi se poboljšao odgovor imunog sistema u sprečavanju bolesti kod
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (pg/ml) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa A naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 1A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 242. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 1B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je 5' TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3') (SEQ ID NO: 329). Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost šest donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo interferon-alfa (pg/ml) izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum).
Slika 2 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo IL-10 (pg/ml) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa A naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 2A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrole je SEQ ID NO: 242. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 2B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost šest donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo IL-10 (pg/ml) izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum).
Slika 3 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo TNF-alfa (pg/ml) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa A naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 3A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 3B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost tri donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo TNF-alfa (pg/ml) izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom i sa LPS.
Slika 4 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo IL-6 (pg/ml) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa A naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 4A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329 (sa kompletnim fosofortioat modifikovanim osnovnim lancem). Test oligonukleotidi prikazani na Slici 4B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost tri donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo IL-6 (pg/ml) izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum) i sa LPS.
Slika 5 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-gama (pg/ml) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa ▲ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 5A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 5B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost tri donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo interferon-gama (pg/ml) izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum) i sa LPS.
Slika 6 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD69 (MFI) na NK ćelijama kao indikator NK aktivnosti posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima koji su označeni brojevima duž X-ose grafikona i označeni sa A naspram pozitivne subjekta. Primeri bolesti ili stanja koja mogu biti sprečena korišćenjem profilaktičkih postupaka pronalaska obuhvataju mikrobijalne infekcije (npr., bolesti koje se prenose seksualnim putem) i anafilaktički šok izazvan alergijom na hranu.
U ostalim aspektima, pronalazak je postupak za indukovanje prirodnog imunog odgovora primenom na subjekta CpG imunostimulatornog oligonukleotida u količini koja je efikasna u aktivaciji prirodnog imunog odgovora.
Na osnovu sledećeg aspekta pronalaska dat je postupak za lečenje ili prevenciju viralne ili retroviralne infekcije. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije viralnu ili retroviralnu infekciju, efikasne količine za lečenje ili prevenciju viralne ili retroviralne infekcije bilo koje od kompozicija pronalaska. U nekim oblicima virus je uzrokovan hepatitis virusom, npr., hepatitisom B, hepatitisom C, HIV, herpes virusom, ili papilomavirusom.
Dat je postupak za lečenje ili prevenciju bakterijske infekcije na osnovu sledećeg aspekta pronalaska. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije bakterijsku infekciju, efikasne količine za lečenje ili prevenciju bakterijske infekcije bilo koje od kompozicija pronalaska. U jednom obliku bakterijska infekcija je posledica unutarćelijskih bakterija.
U sledećem aspektu pronalaska je postupak za lečenje ili prevenciju infekcije parazitima primenom na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije infekciju parazitima, efikasne količine za lečenje ili prevenciju infekcije parazitima bilo koje od kompozicija pronalaska. U jednom obliku infekcija parazitima je nastala usled intracelularnog parazita. U drugom obliku infekcija parazitom je nastala usled ne-helmintskih parazita.
U nekim oblicima subjekt je čovek, a u ostalim oblicima subjekt je kičmenjak izuzev čoveka izabran iz grupe koja se sastoji od psa, mačke, konja, krave, svinje, koze, ribe, majmuna, kokoške i ovce.
U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak za izazivanje TH1 imunog odgovora primenom na subjekta bilo koje od kompozicija pronalaska u efikasnoj količini da bi se proizveo TH1 imuni odgovor.
U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak za izazivanje imunog odgovora, primenom na subjekta, kome je potrebno, efikasne količine imunostimulatornog oligonukleotida 5T<*>C<*>G<*>T<*>Xi<*>T<*>T3' gde je X-i dužine 3-30 nukleotida, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde oligonukleotid sadrži najmanje 2 fosfodiestarske internukleotidne veze.
U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak za tretiranje autoimune bolesti primenom na subjekta koji je u riziku da dobije autoimunu bolest efikasne količine bilo koje kompozicije pronalaska za lečenje ili prevenciju autoimune bolesti.
U drugim oblicima oligonukleotid se primenjuje na subjekta u efikasnoj količini da bi se indukovala ekspresija citokina. Izborno je citokin izabran iz grupe koju čine IF-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10. U drugim oblicima oligonukleotid se primenjuje na subjekta u efikasnoj količini da bi se imuni odgovor pomerio od imunog odgovora koji je zasnovan na Th2 ka odgovoru koji je zasnovan na Th1.
Pronalazak u nekim aspektima je postupak za tretiranje remodelovanja vazdušnih puteva, koji obuhvata: primenu na subjekta oligonukleotida koji sadrži CG dinukleotid, u efikasnoj količini za tretiranje remodelovanja vazdušnih puteva kod subjekta. U jednom obliku subjekt ima astmu, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, ili je pušač. U drugim oblicima subjekat nema simptome astme.
Primena oligonukletida pronalaska za stimulisanje imunog odgovora je takođe data kao aspekat pronalaska.
Takođe je dat i postupak za proizvodnju leka oligonukleotida iz pronalaska za stimulisanje imunog odgovora.
U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak za stimulisanje imunog odgovora, primenom na subjekat oligonukleotida dužine najmanje 5 nukleotida u efikasnoj količini da bi se stimulisao imuni odgovor, gde oligonukleotid obuhvata najmanje jedan imunostimulatorni dinukleotidni motiv, gde internukleotidna veza između nukleotida dinukleotida ima R hiralitet i gde najmanje 70% drugih internukleotidnih veza oligonukleotida ima S hiralitet.
Svako od ograničenja pronalaska može obuhvatati različite oblike pronalaska. Stoga je predviđeno da se svako od ograničenja pronalaska koje obuhvata bilo koji element ili kombinaciju elemenata može uključiti u svaki aspekt pronalaska. oligonukleotidne kontrole označene sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 6A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 6B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i pozitivna oligonukleotidna kontrola je SEQ ID NO: 329. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost tri donatora. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo ekspresije CD69 na NK ćelijama koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum) i sa LPS.
Slika 7 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a) (7A) i IL-10 (7B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 313 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 8 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a) (8A) i IL-10 (8B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 314 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Negativna ODN kontrola je SEQ ID NO: 330: tccaggacttctctcaggtt. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 9 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a) (9A) i IL-10 (9B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 319 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 10 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a)
(10A) i IL-10 (10B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 316 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 11 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a)
(11 A) i IL-10 (11B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 317 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 12 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a)
(12A) i IL-10 (12B) koji izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja oligonukleotidu SEQ ID NO: 320 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 13 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (13A) i ekspresije CD80 na monocitima (13B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 313 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 14 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (14A) i ekspresije CD80 na monocitima (14B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 314 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa •. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 15 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (15A) i ekspresije CD80 na monocitima (15B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 319 i označeni su sa ■ naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole SEQ ID NO: 242 označene sa ♦ . Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 16 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (16A) i ekspresije CD80 na monocitima (16B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 316 u poređenju sa pozitivnom oligonukleotidnom kontrolom SEQ ID NO: 242 i oligonukleotidom 5' TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT 3'
(SEQ ID NO: 330). Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 17 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo interferona-alfa (IFN-a)
(17A) i IL-10 (17B) koji izlučuju humane PBMC posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 321 u poređenju sa kontrolnim oligonukleotidom SEQ ID NO: 242 i oligonukleotidom SEQ ID NO: 330. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 18 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (18A) i ekspresije CD80 na monocitima (18B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 321 u poređenju sa pozitivnom oligonukleotidnom kontrolom SEQ ID NO: 242 i oligonukleotidom SEQ ID NO: 330. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 19 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (19A) i ekspresije CD80 na monocitima (19B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 317 u poređenju sa pozitivnom oligonukleotidnom kontrolom SEQ ID NO: 242 i oligonukleotidom SEQ ID NO: 330. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 20 je skup grafikona na kojima je prikazan nivo ekspresije CD86 na B ćelijama (20A) i ekspresije CD80 na monocitima (20B) posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidu SEQ ID NO: 320 u poređenju sa pozitivnom oligonukleotidnom kontrolom SEQ ID NO: 242 i oligonukleotidom SEQ ID NO: 330. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Slika 21 je grafički prikaz dela molekula nukleinske kiseline, gde su predstavljena strukturna svojstva uključujući baze (B), šećere, osnovni lanac sa fosfodiestarskom vezom (zaokružena) između 5' citidina i 3' guanozina i susednim fosforotioatnim vezama.
Slika 22 je bar grafikon na kome su prikazane relativne količine u tkivu fosforotioata (SEQ ID NO: 242), mekanih (SEQ ID NO: 294) i polu-mekanih (SEQ ID NO: 241) oligonukleotida u bubrezima, slezini i jetri 48 časova posle subkutanog injektiranja miševa. Oligonukleotidi SEQ ID NO: 242 i SEQ ID NO: 241 imaju iste bazne sekvence i razlikuju se po sastavu njihovog osnovnog lanca.
Slika 23 prikazuje stimulaciju humanih imunih ćelijain vitroindukcijom citokina IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
Slika 24 prikazuje stimulaciju ćelija slezine kod miševa povećanjem efikasnosti i/ili induktorskog potencijala TLR9-povezanih citokina IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10, bez detektabilnog izlučivanja IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 ili GM-CSF.
Slika 25 prikazuje indukovanu ekspresiju TLR-povezanih gena (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10) u plućima sa ODN pronalaska (SEQ ID NO: 313).
Slika 26 pokazuje efekte CpG ODN na antigen-indukovani razvoj limfnog čvora kod miševain vivo.
Slika 27 pokazuje da CpG ODN suprimira Th2 odgovor na senzitizaciju antigenom.
Slika 28 pokazuje efekte antigen-indukovane proizvodnje IgE kod miševain vivo.
Slika 29 pokazuje da je imunizacija antigenom izazvala povećanje ukupnog broja leukocita, pretežno eozinofila, u lumenu disajnih puteva.
Slike 30 i 32 pokazuju da je imunizacija antigenom izazvala povećanje ukupnog broja leukocita, pretežno eozinofila, u lumenu disajnih puteva i da je ovo suprimirano sa ODN pronalaska (SEQ ID NO: 313) u zavisnosti od doze.
Slika 31 i 32 pokazuju da je imunizacija antigenom izazvala hiperreaktivnost disajnih puteva i da se ovo suprimira sa ODN pronalaska (SEQ ID NO: 313) u zavisnosti od doze.
Slika 33 prikazuje koncentracije ODN u plazmi pacova posle IV & IT primene od 5 mg/kg. Podaci za plazmu pokazuju da se SEQ ID NO: 313 mnogo brže izbacuje iz plazme u poređenju sa SEQ ID NO: 329 posle i IV i IT primene.
Slika 34 prikazuje koncentracije ODN u plućima pacova posle IV & IT primene u 5 mg/kg. Posle IV primene u istoj dozi, koncentracije u plućima SEQ ID NO: 313 su bile niže od SEQ ID NO: 329 koncentracija. Posle IT primene razlika je manja. Podaci iz pluća za SEQ ID NO: 329 su dostupni samo do 48 časova posle doziranja.
Slika 35 prikazuje koncentracije ODN u bubrezima pacova posle IV & IT primene od 5 mg/kg. Podaci iz bubrega pokazuju da su apsolutni nivoi SEQ ID NO: 313 u bubrezima niži od odgovarajućih SEQ ID NO: 329 koncentracija posle i IV i IT primene.
Izlaganje bubrega SEQ ID NO: 313 posle IT primene je posebno značajno-smanjeno u poređenju sa izlaganjem SEQ ID NO: 329 u istoj dozi.
Slika 36 prikazuje ODN koncentracije u bubrezima pacova posle IV primene od 5 mg/kg.
Slika 37 prikazuje ODN koncentracije u bubrezima pacova posle IT primene u 5 mg/kg.
Slika 38 prikazuje koncentracije SEQ ID NO: 313 i njegovog 8-mernog metabolita (jednog ili više) u bubrezima pacova posle IV primene SEQ ID NO: 313 od 5 mg/kg.
Slika 39 prikazuje koncentracije SEQ ID NO: 313 i njegovog 8-mernog metabolita (jednog ili više) u bubrezima pacova posle IT primene SEQ ID NO: 313 od 5 mg/kg.
Slika 40 je grafikon koji prikazuje stimulacioni indeks grupe polu-mekanih ODN u poređenju sa potpuno fosforotioatnim ODN koji imaju istu sekvencu.
Slika 41 je grupa bar grafikona koji prikazuju indukciju citokina A & B (IP-10), C (IFN) i D & E (TNF) kao odgovor na primenu mekanih (SEQ ID NO: 294), polu-mekanih (SEQ ID NO: 241) potpuno fosforotioatnih ODN (SEQ ID NO: 242).
Slika 42 je grupa grafikona koji prikazuju aktivnost antitela i citotoksičnih T limfocita kao odgovor na primenu mekanih (SEQ ID NO: 294), polu-mekanih (SEQ ID NO: 241) i potpuno fosforotioatnih ODN (SEQ ID NO: 242).
Slika 43 je grupa grafikona koji prikazuju antitumor terapiju kod miševa primenom polu-mekanih (SEQ ID NO: 241) ili potpuno fosforotioatnih ODN (SEQ ID NO: 242). Slike 43A i B prikazuju rezultate modela karcinoma bubrežnih ćelija. Slike 43C i D prikazuju rezultate modela neuroblastoma kod miševa. Slike 43E i F prikazuju rezultate modela kancera pluća sa ćelijama koje nisu male kod miševa.
DETALJAN OPIS
Na osnovu pronalaska date su mekane i polu-mekane imunostimulatorne nukleinske kiseline. Ovde opisani imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska, u nekim oblicima imaju poboljšane osobine uključujući slični ili pojačani potencijal, smanjeno sistemsko izlaganje bubrezima, jetri i slezini, a mogu imati smanjenu reaktivnost na mestima injektiranja. lako se prijavilac ne vezuje za određeni mehanizam delovanja, veruje se da su ove poboljšane osobine povezane sa strateškim postavljanjem unutar imunostimulatornih oligonukleotida fosfodiestarske ili njoj slične "internukleotidne veze". Termin "internukleotidna veza" kao što je ovde korišćeno se odnosi na kovalentnu vezu osnovnog lanca koja povezauje dva susedna nukleotida u molekulu nukleinske kiseline. Kovalentna veza osnovnog lanca će u tipičnom slučaju biti modifikovana ili nemodifikovana fosfatna veza, ali moguće su druge modifikacije. Prema tome, linearni oligonukleotid koji je dugačak n nukleotida ima ukupno n-1 internukleotidnih veza. Ove kovalentne veze osnovnog lanca mogu biti modifikovane ili nemodifikovane u imunostimulatornim oligonukleotidima na osnovu uputstava pronalaska.
Posebno, fosfodiestarske ili njoj slične internukleotidne veze obuhvataju "unutrašnje dinukleotide". Unutrašnji dinukleotid će u opštem slučaju označavati bilo koji par susednih nukleotida koji su povezani internukleotidnom vezom, gde je bilo koji nukleotid iz para nukleotida terminalni nukleotid, tj., bilo koji nukleotid u paru nukleotida je nukleotid koji određuje 5' ili 3' kraj oligonukleotida. Prema tome, linearni oligonukleotid koji je dugačak n nukleotida ima ukupno n-1 dinukleotida i samo n-3 unutrašnjih dinukleotida. Svaka internukleotidna veza u unutrašnjem dinukleotidu je unutrašnja internukleotidna veza. Prema tome, linearni oligonukleotid koji je dugačak n nukleotida ima ukupno n-1 internukleotidnih veza i samo n-3 unutrašnjih internukleotidnih veza. Strateški postavljene fosfodiestarske ili njoj slične internukleotidne veze, prema tome se odnose na fosfodiestarsku ili njoj slične internukleotidne veze koje su postavljene između bilo kog para nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline. U nekim oblicima fosfodiestarska ili njoj slične internukleotidne veze nisu postavljene između para nukleotida koji su najbliži 5' kraju niti para nukleotida koji su najbliži 5' kraju.
Pronalazak je zasnovan najmanje u nekim aspektima na iznenađujućem otkriće da mekane i polu-mekane nukleinske kiseline koje su ovde opisane imaju najmanje istu ili u mnogim slučajevima veću imunostimulatornu aktivnost, u mnogim slučajevima, od odgovarajućih potpuno stabilizovanih imunostimulatornih oligonukleotida koji imaju istu nukleotidnu sekvencu. Ovo je bilo neočekivano zbog toga što je bilo široko rašireno mišljenje da su fosforotioatni oligonukleotidi generalno imunostimulatorniji od nestabilizovanih oligonukleotida. Rezultati su bili iznenađujući zbog toga što se očekivalo da ako je "omekšavajuća" veza postavljena između kritičnog imunostimulatornog motiva, tj., CG da nukleinska kiselina može imati smanjenu aktivnost zbog toga što bi nukleinska kiselina mogla lako bitiin vivorazgrađena u fragmente koje ne sadrže CG. Nasuprot očekivanjima mnoge od ovih nukleinskih kiselina stvarno imaju istu ili bolju aktivnostin vitroiin vivo.Čini se da su mekani i polu-mekani oligonukleotidi najmanje potentni kao, ako ne i potentniji od, potpuno stabilizovanih delova: neto imunostimulatorni efekat mekanih i polu-mekanih oligonukleotida predstavlja ravnotežu između aktivnosti i stabilnosti. U visokim koncentracijama, izgleda da ravnoteža daje prednost aktivnosti, tj., potencijal dominira. U niskim koncentracijama, izgleda da ova ravnoteža daje prednost stabilnosti, tj., dominira relativna nestabilnost povezana sa podložnšću nukleazama.
Pronalazak se u jednom aspektu odnosi na mekane oligonukleotide. Mekani oligonukleotid je imunostimulatorni oligonukleotid koji ima delimično stabilizovani osnovni lanac, kod koga se fosfodiestarska ili njoj slične veze javljaju samo unutar ili neposredno pored najmanje jednog unutrašnjeg pirimidin-purin dinukleotida (YZ). Poželjno YZ je YG, pirimidin-guanozin (YG) dinukleotid. Najmanje jedan unutrašnji YZ dinukleotid sam ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu. Fosfodiestarska ili njoj slična internukleotidna veza koja se nalazi neposredno pored najmanje jednog unutrašnjeg dinukleotida može biti 5', 3', ili i 5' i 3' u odnosu na najmanje jedan unutrašnji YZ dinukleotid. Poželjno fosfodiestarska ili njoj slična internukleotidna veza koja se nalazi neposredno pored najmanje jednog unutrašnjeg YZ dinukleotida je sama po sebi unutrašnja internukleotidna veza. Prema tome, za sekvencu NiYZ N2, gde su svako Nii N2, nezavisno jedan od drugog, bilo koji pojedinačan nukleotid, YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i pored toga (a) Nii Y su povezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid, (b) Z i N2su povezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, ili (c) Nii Y su povezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid i Z i N2su povezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid.
Neograničavajući primeri mekanih oligonukleotida obuhvataju one koji su opisani sa SEQ ID NO: 105-231, SEQ ID NO: 232-234, SEQ ID NO: 235-237 i SEQ ID NO: 238-240.
Veruje se da su mekani oligonukleotidi na osnovu ovog pronalaska realtivno podložni cepanju nukleazama u poređenju sa kompletno stabilizovanim oligonukleotidima. Bez vezivanja za neku određenu teoriju ili mehanizam, veruje se da se mekani oligonukleotidi iz pronalaska mogu iscepkati u fragmente sa redukovanom ili bez imunostimulatorne aktivnosti u odnosu na cele mekane oligonukleotide. Ugrađivanje najmanje jedne internukleotidne veze koja je osetljiva na nukleaze, posebno blizu sredine oligonukleotida, veruje se da obezbeđuje "stop prekidač" koji menja farmakokinetiku oligonukleotida tako da se smanjuje trajanje maksimalne imunostimulatorne aktivnosti oligonukleotida. Ovo može biti od posebne važnosti u tkivima i u kliničkim primenama kod kojih je poželjno da se izbegnu povrede povezane sa hroničnim lokalnom inflamacijom ili imunostimulacijom, npr., bubrega.
Pronalazak se u sledećem aspektu odnosi na polu-mekane oligonukleotide. Polu-mekani oligonukleotid je imunostimulatorni nukleotid koji ima delimično stabilizovan osnovni lanac, kod koga se fosfodiestarska ili njoj slične internukleotidne veze javljaju samo unutar jednog unutrašnjeg pirimidin-purin (YZ) dinukleotida. Polu-mekani oligonukleotidi generalno poseduju povećan imunostimulatorni potencijal u odnosu na odgovarajuće potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukleotide. Na primer, imunostimulatorni potencijal polu-mekanih SEQ ID NO: 241 je 2-5 puta veći od imunostimulatornog potencijala u celini fosforotioatnog SEQ ID NO: 242, gde dva oligonukleotida dele istu nukelotidnu sekvencu i razlikuju se samo po unutrašnjim YZ internukleotidnim vezama kao što je dato u sledećem tekstu, gde<*>označava fosforotiaot i _ označava fosfodiestar:
SEQ ID NO: 241 obuhvata unutrašnje fosfodiestarske internukleotidne veze koje obuhvataju CG i TG (oba YZ) dinukleotide. Kao posledica većeg potencijala polu-mekanih oligonukleotida, polu-mekani oligonukleotidi se mogu korisititi u nižim efektivnim koncentracijama i imaju niže efektivne doze od konvencionalnih potpuno stabilizovanih imunostimulatornih oligonukleotida da bi se postigao željeni biološki efekat.
Dok potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotidi mogu dati maksimalan odgovor na dozu, izgleda da polu-mekani oligonukleotidi ovog pronalaska imaju monotono rastuće krive doza-odgovor (kao što je analizirano TLR9 stimulacijom) prelazeći u više koncentracije iznad optimalne koncentracije za odgovarajuće potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukleotide. Prema tome, veruje se da polu-mekani oligonukleotidi ovog pronalaska mogu indukovati veću imunostimulaciju od potpuno stabilizovanih imunostimulatornih oligonukleotida.
Na osnovu pronalaska je otkriveno da se imunostimulatorna aktivnost slabo imunostimulatornih potpuno stabilizovanih oligonukleotida može povećati ugrađivanjem najmanje jednog YZ dinukleotida sa fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom. Prema tome, moguće je početi sa slabo imunostimulatornim oligonukleotidom, koji ima potpuno stabilizovani osnovni lanac, i poboljšati njegovu imunostimulatornu aktivnost zamenom fosfodiestarske ili njoj slične internukleotidne veze sa internukleotidnom vezom najmanje jednog unutrašnjeg YG dinukleotida. Na primer, nađeno je da SEQ ID NO: 243 ima imunostimulatorniju aktivnost od njegovog potpuno stabilizovanog parnjaka SEQ ID NO: 244, gde je SEQ ID NO: 244 relativno slab imunostimulatorni oligonukleotid u poređenju sa SEQ ID NO: 242:
Dok potpuno stabilizovane imunostimulatorne nukleinske kiseline dužine manje od 20 nukleotida mogu imati umerenu imunostimulatornu aktivnost u poređenju sa dužim (npr., dužine 24 nukleotida) potpuno stabilizovanim oligonukleotidima, otkriveno je da polu-mekani oligonukleotidi dužine 16 nukleotida imaju imunostimulatornu aktivnost najmanje jednaku imunostimulatornoj aktivnosti potpuno stabilizovanih oligonukleotida dužine preko 20 nukleotida. Na primer, SEQ ID NO: 245 i 5602 (oba 16-meri sa delimičnom sličnošću sekvenci sa SEQ ID NO: 242) pokazuju imunostimulatornu aktivnost koja se može porediti sa imunostimulatornom aktivnošću SEQ ID NO: 242 (24-mer).
U nekim slučajevima gde izgleda da 6-mer fosforotioatni oligonukleotid nema imunostimulatornu aktivnost, nađeno je da zamena čak jedne fosforodiestarske unutrašnje YZ internukleotidne veze sa fosforotioatnom vezom proizvodi odgovarajući 6-mer sa imunostimulatornom aktivnošću.
Takođe se veruje da se prethodno navedene osobine polu-mekanih oligonukleotida generalno povećavaju sa povećanjem "doze" fosfodiestarskih ili njoj sličnih internukleotidnih veza koje obuhvataju unutrašnje YZ dinukleotide. Prema tome, veruje se, na primer, da je generalno za datu oligonukleotidnu sekvencu sa pet unutrašnjih YZ dinukleotida, oligonukleotid sa pet unutrašnjih fosfodiestarskih ili njoj sličnih YZ internukleotidnih veza imunostimulatorniji od oligonukleotida sa četiri unutrašnje fosfodiestarske ili njoj slične YG internukleotidne veze, koji je zauzvrat imunostimulatorniji od oligonukleotida sa tri unutrašnje fosfodiestarske ili njoj slične YZ internukleotidne veze, koji je zauzvrat imunostimulatorniji od oligonukleotida sa dve unutrašnje fosfodiestarske ili njoj slične YZ internukleotidne veze, koji je zauzvrat imunostimulatorniji od oligonukleotida sa jednom unutrašnjom fosfodiestarskom ili njoj sličnom YZ internukleotidnom vezom. Važno je napomenuti da se veruje da je uključivanje čak jedne unutrašnje fosfodiestarske ili njoj slične YZ internukleotidne veze povoljnije u odnosu na slučaj bez unutrašnje fosfodiestarske ili njoj slične YZ internukleotidne veze. Pored broja fosfodiesatrskih ili njima sličnih internukleotidnih veza, na potencijal ima uticaja i položaj u odnosu na dužinu nukleinske kiseline.
Neograničavajući primeri polu-mekanih oligonukleotida obuhvataju one opisane sa SEQ ID NO: 1-99 i 241 i SEQ ID NO: 100-104.
Imunostimulatorni oligonukleotidi ovog pronalaska su generalno zaštićeni od brze razgradnje u serumu. Imunostimulatorni oligonukleotidi ovog pronalaska su takođe generalno zaštićeni od brze razgradnje u većini tkiva, osim određenih tkiva sa specifičnom ili prevelikom aktivnošću nukleaze koja je sposobna da razgradi imunostimulatorne oligonukleotide. Ovo ima za rezultat redukciju imunostimulatornih oligonukleotida u tim određenim tkivima, čija akumulacija može inače dovesti do
neželjenih efekata od dugotrajne terapije primenom oligonukleotida koji su otporni na
- razgradnju. Oligonukleotidi ovog pronalaska će u opštem slučaju obuhvatati, pored fosfodiestarskih ili njima sličnih internukleotidnih veza u poželjnim unutrašnjim pozicijama, 5' i 3' krajeve koji su otporni na razgradnju. Takvi krajevi koji su otporni na razgradnju mogu obuhvatati pogodnu modifikaciju koja ima za rezultat povećanu otpornost na razlaganje egzonukleazama u odnosu na odgovarajuće nemodifikovane krajeve. Na primer, 5' i 3' krajevi se mogu stabilizovati uključivanjem najmanje jedne fosfatne modifikacije osnovnog lanca. U poželjnom obliku, najmanje jedna fosfatna modifikacija osnovnog lanca na svakom kraju je nezavisno fosforotioatna, fosforoditioatna, metilfosfonatna, ili metilfosforotioatna internukleotidna veza. U sledećem obliku, kraj koji je otporan na razgradnju obuhvata jednu ili više nukleotidnih jedinica koje su povezane peptidnim ili amidnim vezama na 3' kraju. Još neki stabilizovani krajevi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one koji su dodatno opisani u daljem tekstu, bi trebalo da su obuhvaćeni pronalaskom. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, oligonukleotidi ovog pronalaska obuhvataju fosforodiestarsku ili njoj slične internukleotidne veze unutar i izborno pored unutrašnjih YG dinukleotida. Takvi YG dinukleotidi su često deo imunostimulatornih motiva. Nije neophodno, međutim, da oligonukleotid sadrži fosfodiestarsku ili njoj slične internukleotidne veze unutar svakog imunostimulatornog motiva. Na primer, oligonukleotid kao što je
sa četiri CpG dinukleotida može imati fosfodiestarske veze između C i G drugog, trećeg i četvrtog CpG dinukleotida i njihovih kombinacija. Dodatne fosfodiestarske ili njoj slične veze se takođe mogu održavati za čak bržu bubrežnu razgradnju ovih inače "stabilizovanih oligonukleotida". Na primer, SEQ ID NO: 242 dodatno sadrži dva unutrašnja TG dinukleotida, gde bilo koji od njih ili oba sami ili zajedno sa bilo kojim ili kombinacijom unutrašnjih CG dinukleotida, može imati fosfodiestarske ili njima slične internukleotidne veze.
Fosfodiestarska internukleotidna veza je tip veze koja je karakteristična za nukleinske kiseline koje se nalaze u prirodi. Kao što je pokazano na Slici 20, fosfodiestarska internukleotidna veza obuhvata atom fosfora između dva premošćujuća atoma kiseonika i koji je takođe vezan sa dva dodatna atoma kiseonika, od kojih je jedan naelektrisan i drugi nenaelektrisan. Fosfodiestarska internukleotidna veza je posebno poželjna kada je važno da se smanji polu-život oligonukleotida u tkivu.
Internukleotidna veza slična fosfodiestarskoj vezi je premošćujuća grupa koja sadrži fosfor i koja je hemijski i/ili diastereoizomerno slična fosfodiestru. Mere sličnosti sa fosfodiestrom obuhvataju podložnost razgradnji nukleazama i sposobnost da aktiviraju RNK-azu H. Prema tome, na primer fosfodiestarski, ali ne i fosforotioatni, oligonukleotidi su podložni razgradnji nukleazama, dok i fosforodiestarski i fosforotioatni oligonukleotidi aktiviraju RNK-azu H. U poželjnom obliku internukleotidna veza slična fosfodiestarskoj je borofosfatna (ili ekvivalentno, borofosfonatna) veza. U.S. Patent No. 5,177,198; U.S. Patent No. 5,859,231; U.S. Patent No. 6,160,109; U.S. Patent No. 6,207,819; Sergueev et al., (1998)J Am Chem Soc120:9417-27. U sledećem poželjnom obliku internukleotidna veza koja je slična fosfodiestarskoj je diastereoizomerno čist Rp fosforotioat. Veruje se da je diastereoizomerno čist Rp fosforotioat podložniji razlaganju nukleazama i bolji je u aktivaciji RNK-aze H od mešanog ili diastereoizomerno čistog Sp fosforotioata. Stereoizomeri CpG oligonukleotida su predmet U.S. prijave patenta 09/361,575 podnete 27 jula 1999 i objavljene PCT prijave PCT/US99/17100 (WO 00/06588) koje su u istovremenom postupku. Potrebno je naglasiti za svrhe ovog pronalska, da termin "internukleotidna veza slična fosfodiestarskoj" specifično isključuje fosforotioatne i metilfosfonatne internukleotidne veze.
Molekuli imunostimulatornih nukleinskih kiselina ovog pronalaska imaju himerni osnovni lanac. Za svrhe ovog pronalaska, himerni osnovni lanac se odnosi na delimično stabilizovani osnovni lanac, gde je najmanje jedna internukleotidna veza fosfodiestarska ili njoj slična i gde je najmanje jedna druga internukleotidna veza stabilizovana internukleotidna veza, gde se najmanje jedna fosfodiestarska ili njoj slična veza razlikuje od najmanje jedne stabilizovane veze. S obzirom da se smatra da su borofosfonatne veze stabilizovane u odnosu na fosfodiestarske veze, zbog himerne prirode osnovnog lanca, borofosfonatne veze se mogu klasifikovati bilo kao veze slične fosfodiestarskim ili kao stabilizovane, u zavisnosti od konteksta. Na primer, himerni osnovni lanac na osnovu ovog pronalaska može u jednom obliku obuhvatati najmanje jednu fosfodiestarsku (fosfodiestarsku ili njoj sličnu) vezu i najmanje jednu borofosfonatnu (stabilizovanu) vezu. U sledećem obliku himerni osnovni lanac na osnovu ovog pronalaska može obuhvatati borofosfonatne (fosfodiestarske ili njima slične) i fosforotioatne (stabilizovane) veze. "Stabilizovana internukleotidna veza" označava internukleotidnu vezu koja je relativno otporna nain vivorazgradnju (npr., egzo- ili endonukleazom), u poređenju sa fosfodiestarskom internukleotidnom vezom. Poželjne stabilizovane internukleotidne veze obuhvataju, bez ograničenja, fosforotioatne, fosforoditioatne, metilfosfonatne i metilfosforotioatne. Druge stabilizovane internukleotidne veze obuhvataju, bez ograničavanja: peptidne, alkil, defosfo i druge kao što je opisano u prethodnom tekstu.
Modifikovani osnovni lanci kao što su fosforotioati se mogu sintetisati korišćenjem automatizovanih tehnika koje koriste bilo herniju fosforoamidata ili herniju H-fosfonata. Aril- i alkil-fosfonati se mogu formirati, npr., kao što je opisano u U.S. Patent No. 4,469,863; i alkilfosfotriestri (kod kojih je naelektrisana kiseonična grupa alkilovana kao što je opisano u U.S. Patent No. 092,574) se mogu pripremiti automatskom sintezom čvrste faze korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa. Opisani su postupci za pripremanje drugih modifikacija i supstitucija osnovnog lanca DNK. Uhlmann E et al. (1990)Chem Rev90:544; Goodchild J (1990)Bioconjugate Chem1:165. Takođe su poznati postupci za pripremanje himernih oligonukleotida. Na primer patenti koje su dali Uhlmann et al opisuju ove tehnike.
Pomešani ODN sa modifikovanim osnovnim lancima se mogu sintetisati korišćenjem komercijalno dostupnog DNK sintetizatora i standardne hernije fosforoamidita. (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford. UK. 1991, i M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett, 21, 719 (1980)). Posle spajanja, PS veze su uvedene sulfurizacijom korišćenjem Beaucage-ovog reagensa (R. P. Iver, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0.075 M u acetonitrilu) ili fenilacetildisulfida (PADS) posle kaptaže sa anhidridom sirćetne kiseline, 2,6-lutidinom u tetrahidrofuranu (1:1:8, v:v:v) i A/-metilimidazola (16% u tetrahidrofuranu). Ovaj korak kaptaže je izveden posle reakcije sulfurizacije da bi se minimizovalo formiranje neželjenih fosfodiestarskih (PO) veza na pozicijama gde bi trebalo da se nalazi fosforotioatna veza. U slučaju uvođenja fosfodiestarske veze, npr. na CpG dinukleotidu, intermedijerni fosfor-lll se oksiduje tretiranjem sa rastvorom joda u vodi/piridinu. Posle odvajanja od čvrste podloge i konačne deprotekcije tretiranjem sa koncentrovanim amonijakom (15 časova na 50°C), ODN se analiziraju pomoću HPLC na Gen-Pak Fax koloni (Milipore-vVaters) korišćenjem NaCI gradijenta (npr. pufer A: 10 mM NaH2P04u acetonitrilu/vodi=1:4/v:v pH 6.8; pufer B: 10 mM NaH2P04, 1.5 M NaCI u acetonitrilu/vodi=1:4, v:v; 5 do 60% B za 30 minuta sa 1 ml/min) ili kapilarnom gel elektroforezom. ODN se može prečistiti pomoću HPLC ili pomoću FPLC na Source High Performance koloni (Amersham Pharmacia). HPLC-homogene frakcije su spojene i destilovane preko C18 kolone ili ultrafiltracijom. ODN je analiziran pomoću MALDI-TOF masene spektrometrije da bi se potvrdila izračunata masa.
Nukleinske kiseline pronalaska mogu takođe obuhvatati druge modifikacije. One obuhvataju nejonske DNK analoge, kao što su alkil- i aril-fosfati (kod kojih je naelektrisani fosfonatni kiseonik zamenjen alkil ili aril grupom), fosfodiestar i alkilfosfotriestri, kod kojih je naelektrisana kiseonična grupa alkilovana. Takođe je pokazano da su nukleinske kiseline koje sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na jednom ili oba terminusa značajno otporne na razgradnju nukleazama.
Veličina (tj., broj nukleotidnih ostataka duž nukleinske kiseline) imunostimulatornog oligonukleotida takođe može doprineti stimulatornoj aktivnosti oligonukleotida. Da bi se olakšao unos u ćelije imunostimulatornih oligonukleotida oni poželjno imaju dužinu od najmanje 6 nukleotidnih ostataka. Nukleinske kiseline bilo koje veličine iznad 6 nukleotida (čak i puno kb dužine) su sposobne da indukuju imuni odgovor na osnovu pronalaska ako je prisutno dovoljno imunostimulatornih motiva, s obzirom da se veće nukleinske kiseline razgrađuju unutar ćelija. Verujemo da polu-mekani oligonukleotidi dužine 4 nukleotida takođe mogu biti imunostimulatorni ako se mogu dopremiti u unutrašnjost ćelije. U određenim poželjnim oblicima na osnovu ovog pronalaska, imunostimulatorni oligonukleotidi su dužine između 6 i 40 nukleotida. U izvesnim poželjnim oblicima na osnovu ovog pronalaska, imunostimulatorni oligonukleotidi su dužine između 6 i 19 nukleotida.
Oligonukleotidi ovog pronalaska su nukleinske kiseline koje sadrže specifične sekvence za koje je nađeno da izazivaju imuni odgovor. Ove specifične sekvence koje izazivaju imuni odgovor označavaju se kao "imunostimulatorni motivP, a oligonukleotidi koji sadrže imunostimulatorne motive se označavaju kao "molekuli imunostimulatornih nukleinskih kiselina" i ekvivalentno, "imunostimulatorne nukleinske kiseline" ili "imunostimulatorni oligonukleotidi". Imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska prema tome obuhvataju najmanje jedan imunostimulatorni motiv. U poželjnom obliku imunostimulatorni motiv je "unutrašnji imunostimulatorni motiv". Termin " unutrašnji imunostimulatorni motiv" se odnosi na položaj motiv sekvence unutar duže nukleinsko kiselinske sekvence, koja je duža od motiv sekvence najmanje za jedan nukleotid vezan i za 5' i 3' kraj imunostimulatorne motiv sekvence.
U nekim oblicima pronalaska imunostimulatorni oligonukleotidi obuhvataju imunostimulatorne motive koji su "CpG dinukleotidi". CpG dinukleotid može biti metilovan ili nemetilovan. Imunostimulatorna nukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan nemetilovan CpG dinukleotid je molekul nukleinske kiseline koji sadrži nemetilovanu citozin-guanin dinukleotidnu sekvencu (tj., nemetilovan 5' citidin praćen 3' guanozinom i koji su vezani fosfatnom vezom) i ona aktivira imuni sistem; takva imunostimulatorna nukleinska kiselina je CpG nukleinska kiselina. CpG nukleinske kiseline su opisane u čitavom nizu objavljenih patenata, objavljenih prijava patenata i ostalih publikacija, uključujući U.S. Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; i 6,339,068. Imunostimulatorna nukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan metilovani CpG dinukleotid je nukleinska kiselina koja sadrži metilovanu citozin-guanin dinukleotidnu sekvencu (tj., metilovan 5' citidin praćen 3' guanozinom i koji su vezani fosfatnom vezom) i koja aktivira imuni sistem. U drugim oblicima imunostimulatorni oligonukleotidi su bez CpG dinukleotida. Ovi oligonukleotidi koji su bez CpG dinukleotida označavaju se kao ne-CpG oligonukleotidi i imaju ne-CpG imunostimulatorne motive. Pronalazak, prema tome, takođe obuhvata nukleisnke kiseline sa drugim tipovima imunostimulatornih motiva, koji mogu biti metilovani ili nemetilovani. Imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska, dalje, mogu da obuhvataju bilo koju kombinaciju metilovanih ili nemetilovanih CpG i ne-CpG imunostimulatornih motiva.
Što se CpG nukleinskih kiselina tiče, nedavno je otkriveno da postoje različite klase CpG nukleinskih kiselina. Jedna klasa je potentna u aktivaciji B ćelija, ali je realtivno slaba u indukciji IFN-a i aktivaciji NK ćelija; ova klasa je označena kao B-klasa. CpG nukleinske kiseline B klase su tipično stabilizovane i obuhvataju nemetilovane CpG dinukleotide unutar određenih poželjnih konteksta baza. Pogledati, npr., U.S.
Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; i 6,339,068. Sledeća klasa ima potencijal za indukciju IFN-a i aktivaciju NK ćelija, ali je realtivno slaba u stimulaciji B ćelija; ova klasa je označena kao A klasa. A klasa CpG nukleinskih kiselina tipično ima stabilizovane poli-G sekvence na 5' i 3' krajevima i palindromsku fosfodiestarsku sekvencu koja sadrži CpG dinukleotid od najmanje 6 nukleotida. Pogledati, na primer, objavljenu prijavu patenta PCT/US00/26527 (WO 01/22990). Sledeća klasa CpG nukleinskih kiselina aktivira B ćelije i NK ćelije i indukuje IFN-a; ova klasa je označena kao C-klasa. CpG nukleinske kiseline C-klase, kao što je prvobitno opisano, su tipično potpuno stabilizovane, obuhvataju sekvencu tipa-B i palindrom ili skoro-palindrom bogat sa GC. Ova klasa je opisana u U.S. provizornoj prijavi patenta 60/313,273, podnešena 17. avgusta 2001 i US10/224,523 podnešena 19. avgusta 2002 koje su u istovremenom postupku, pri čemu je celokupan njihov sadržaj uključen ovde na osnovu reference. Neki neograničavajući primeri nukleinskih kiselina C-klase obuhvataju:
Prema tome, pronalazak u jednom aspektu obuhvata nalaz da su specifične podklase CpG imunostimulatornih oligonukleotida koji imaju himerne osnovne lance visoko efikasne u prenošenju imunostimulatornih efekata. Ove CpG nukleinske kiseline su korisne terapeutski i profilaktički za stimulisanje imunog sistema za lečenje kancera, infektivne bolesti, alergije, astme, autoimune bolesti i drugih poremećaja i za pomoć u zaštiti protiv oportunističkih infekcija posle hemoterapije kancera. Snažni ali i uravnoteženi, ćelijski i humoralni imuni odgovori koji nastaju CpG stimulacijom reflektuju prirodni sistem odbrane tela protiv napada patogena i kanceroznih ćelija.
Pronalazak obuhvata, u jednom aspektu, otkriće da podgrupa CpG imunostimulatornih oligonukleotida ima poboljšana imunostimulatorna svojstva i smanjeni inflamatorni efekat na bubrege. U nekim slučajevima, primećena je bubrežna inflamacija kod subjekata koji su primali potpuno fosforotioatni oligonukleotid. Veruje se da ovde opisane himerne nukleinske kiseline proizvode manju bubrežnu inflamaciju od potpuno fosforotioatnih oligonukleotida. Pored toga, ovi oligonukleotidi su visoko efikasni u stimulaciji imunog odgovora. Prema tome, fosfodiestarski region molekula ne smanjuje njegovu efikasnost.
Poželjni CpG imunostimulatorni oligonukleotidi potpadaju pod jednu od sledećih 6 opštih formula:
U ovim formulama N je bilo koji nukleotid, Nije dužine 0-6 nukleotida, N2je dužine 0-7 nukleotida, N3je dužine 0 do 4 nukleotida, N4je dužine 1-5 nukleotida, N5je dužine 0-7 nukleotida, N6i N7su nezavisno dužine između 1 i 5 nukleotida, N8je između 4 i 10 nukletida dužine, N9je između 0 i 3 nukleotida dužine i gde je N10dužine između 4 i 8 nukleotida. Xi, X2, X3i X4su nezavisno C ili G. Formule određuju podgrupe klase CpG oligonukleotida koji su pokazali odlične imunostimulatorne osobine i koji su bili osetljiviji na razgradnju unutar tela od oligonukleotida koji sadrže potpuni fosforotioat. U formuli 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Simbol<*>upotrebljen u formulama se odsnosi na prisustvo stabilizovane internukleotidne veze. Internukleotidne veze koje nisu označene sa<*>mogu biti stabilizovane ili nestabilizovane, sve dok oligonukleotid sadrži najmanje 2-3 fosfodiestarske internukleotidne veze. U nekim oblicima je poželjno da oligonukleotidi obuhvataju 3-6 fosfodiestarskih veza. U nekim slučajevima veze između CG motiva su fosfodiestarske, a u drugim slučajevima one su fosforotioatne ili druge stabilizovane veze.
Druge formule obuhvataju 5TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO: 368), gde najmanje jedan CG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i oligonukleotid sadrži najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu i 5'GNC3\ gde je N nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 4-10 nukleotida i najmanje je 50% T i ne sadrži CG dinukleotid i oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
U nekom obliku oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
Simbol _ u ovim strukturama označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze.
Neki poželjni primeri struktura obuhvataju sledeće:
Imunostimulatorni oligonukleotidi generalno imaju dužinu u opsegu između 4 i 100 i u nekim oblicima 10 i 40. Dužina može biti u opsegu između 16 i 24 nukleotida.
Termini "nukleinska kiselina" i "oligonukleotid" takođe obuhvataju nukleinske kiseline ili oligonukleotide sa supstitucijama ili modifikacijama, kao što su supstitucije ili modifikacije u bazama i/ili šećerima. Na primer, oni obuhvataju nukleinske kiseline koje imaju osnovni lanac od šećera koji su kovalentno vezani za organske grupe niže molekulske težine osim hidroksil grupe na 2' poziciji i osim fosfatne grupe ili hidroksi grupe na 5' poziciji. Prema tome, modifikovane nukleinske kiseline mogu da sadrže 2'-O-alkilovanu grupu riboze. Pored toga, modifikovane nukleinske kiseline mogu da sadrže šećere kao što je arabinoza ili 2'-fluoroarabinoza umesto riboze. Prema tome, nukleinske kiseline mogu biti heterogene što se tiče sastava osnovnog lanca, što znači da mogu da sadrže bilo koju moguću kombinaciju polimernih jedinica koje su vezane međusobno kao što su pepti-nukleinske kiseline (koje imaju aminokiselinski osnovni lanac sa bazama nukleinskih kiselina).
Nukleinske kiseline takođe obuhvataju supstituisane purine i pirimidine kao što su C-5 propinpirimidin i 7-deaza-7-supstituisane purin modifikovane baze. VVagner RW et al. (1996)Nat Biotechnol 14:840-4.Purini i pirimidini obuhvataju, ali nisu ograničeni na, adenin, citozin, guanin, timin, 5-metilcitozin, 5-hidroksicitozin, 5-fluorocitozin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2,6-diaminopurin, hipoksantin i druge prirodne ili sintetičke nukleobaze, supstituisane i nesupstituisane aromatične grupe. Druge takve modifikacije su dobro poznate u tehnici.
Imunostimulatorni oligonukleotidi ovog pronalaska mogu obuhvatati različite hemijske modifikacije ili supstitucije, u poređenju sa prirodnom RNK i DNK, uključujući fosfodiestarski internukleotidni most, jedinicu B-D-riboze i/ili prirodnu nukleotidnu bazu (adenin, guanin, citozin, timin, uracil). Primeri hemijskih modifikacija su dobro poznati u tehnici i opisani su, na primer, u Uhlmann E et al. (1990)Chem Rev90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Svnthesis and Properties & Svnthesis and Analvtical Tehniques, S. Agravval, Ed, Humana Press, Totovva, USA 1993; Crooke ST et al. (1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129;i Hunziker J et al. (1995)Mod Synth Methods7:331-417. Oligonukleotid na osnovu pronalaska može imati jednu ili više modifikacija, gde je svaka modifikacija locirana na određenom fosfodiestarskom internukleotidnom mostu i/ili na određenoj jedinici B-D-riboze i/ili na određenom položaju prirodne nukleotidne baze u poređenju sa oligonukleotidom iste sekvence koja se sastoji od prirodne DNK ili RNK.
Na primer, pronalazak se odnosi na oligonukleotid koji može da sadrži jednu ili više modifikacija i gde je svaka modifikacija nezavisno izabrana od: a) zamena fosfodiestarskog internukleotidnog mosta koji se nalazi na 3' i/li 5' kraju nukleotida sa modifikovanim internukleotidnim mostom, b) zamena fosfodiestarskog mosta koji se nalazi na 3' i/ili 5' kraju nukleotida sa defosfo mostom, c) zamena šećerno-fosfatne jedinice iz šećerno-fosfatnog osnovnog lanca sa drugom jedinicom,
d) zamena jedinice B-D-riboze sa modifikovanom šećernom jedinicom i
e) zamena prirodne nukleotidne baze sa modifikovanom nukleotidnom bazom.
Detaljniji primeri za hemijske modifikacije oligonukleotida su dati u daljem tekstu.
Fosfodiestarski internukleotidni most koji se nalazi na 3' i/ili 5' kraju nukleotida se može zameniti sa modifikovanim internukleotidnim mostom, gde je modifikovani internukleotidni most izabran na primer od fosforotioatnih, fosforoditioatnih, NR<1>R<2->fosforoamidatnih, borofosfatnih, a-hidroksibenzilfosfonatnih, fosfat-(Ci-C2i)-0-alkilestarskih, fosfat-[(C6-Ci2)aril-(C1-C2i)-0-alkil]estarskih, (C-i-C8)alkilfosfonatnih i/ili (C6-Ci2)arilfosfonatnih mostova, (C7-Ci2)-a-hidroksimetil-aril (npr., dat u WO 95/01363), gde su (C6-Ci2)aril, (C6-C20)aril i (C6-Ci4)aril izborno supstituisani sa halogenom, alkil, alkoksi, nitro, cijano i gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, vodonik, (Ci-C18)-alkil, (C6-C2o)-aril, (C6-C14)-aril-(Ci-C8)-alkil, poželjno vodonik, (CrC8)-alkil, poželjno (CrC4)-alkil i/ili metoksietil, ili R<1>i R<2>formiraju, zajedno sa atomom azota koji ih nosi, 5-6-člani heterocikličan prsten koji može dodatno da sadrži dodatni heteroatom iz grupe O, S i N.
Zamena fosfodiestarskog mosta koji se nalazi na 3' i/ili 5' kraju nukleotida sa defosfo mostom (defosfo mostovi su opisani, na primer, u Uhlamnn E and Peyman A in "Methods in Molecular Biologv", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agravval, Ed., Humana Press, Totovva 1993, Chapter 16, pp. 355 ff), gde je defosfo most na primer izabran od defosfo mostova formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroksilamin, oksim, metilendimetilhidrazo, dimetilensulfon i/ili silil grupe.
Šećerno-fosfatna jedinica (tj., p-D-riboza i fosfodiestarski internukleotidni most zajedno formiraju šećernofosfatnu jedinicu) iz šećerno-fosfatnog osnovnog lanca (tj., šećerno-fosfatni osnovni lanac je sastavljen od šećerno-fosfatnih jedinica) može se zameniti sa drugom jedinicom, gde je druga jedinica na primer pogodna za izgradnju "morfolino-derivata" oligomera (kao što je opisano, u Stirchak EP et al. (1989)Nucleic Acids Res17:6129-41), to jest, npr., zamena morfolino-derivat jedinice; ili za izgradnju poliamidne nukleinske kiseline ("PNA"; kao što je opisano na primer, u Nielsen PE et al.
(1994)Bioconjug Chem5:3-7), to jest, npr., zamena sa jedinicom PNA osnovnog lanca, npr., sa 2-aminoetilglicinom.
Jedinica p-riboze ili jedinica p-D-2'-dezoksiriboze se može zameniti sa jedinicom modifikovanog šećera, gde je jedinica modifikovanog šećera na primer izabrana od p-D-riboze, a-D-2'-dezoksiriboze, L-2'-dezoksiriboze, 2'-F-2'-dezoksiriboze, 2'-F-arabinoze, 2'-0-(Ci-C6)alkil-riboze, poželjno 2'-0-(C1-C6)alkil-riboza je 2'-0-metilriboza, 2'-0-(C2-C6)alkenil-riboza, 2'-[0-(C1-C6)alkil-0-(Ci-C6)alkil]-riboza, 2'-NH2-2'-dezoksiriboza, p-D-ksilofuranoza, a-arabinofuranoza, 2,4-dideoksi-P-D-eritro-hekso-piranoza i karbociklični (opisani, na primer, u Froehler J (1992)Am Chem Soc14:8320) i/ili šećerni analozi sa otvorenim lancem (opisani, na primer, u Vandendriessche et al. (1993)Tetrahedron49:7223) i/ili biciklošećerni analozi (opisani, na primer u Tarkov M et al. (1993)Helv ChimActa76:481).
U nekim poželjnim oblicima šećer je 2'-0-metilriboza, koja je za jedan ili oba nukleotida^vezana fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom.
Nukleinske kiseliene takođe obuhvataju supstituisane purine i pirimidine kao što su C-5 propinpirimidin i 7-deaza-7-supstituisane purin modifikovane baze. Wagner RW et al. (1996)Nat Biotechnol 14:840-4.Purini i pirimidini obuhvataju, ali nisu ograničeni na, adenin, citozin, guanin i timin, kao i druge prirodne ili sintetičke nukleobaze, supstituisane i nesupstituisane aromatične grupe.
Modifikovana baza je bilo koja baza koja se hemijski jasno razlikuje od prirodnih baza koje se tipično mogu naći u DNK i RNK kao što su T, C, G, A i U, ali koje imaju istu osnovnu hemijsku strukturu sa ovim prirodnim bazama. Modifikovana nukleotidna baza može biti, na primer, izabrana od hipoksantina, uracila, dihidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5-(Ci-C6)-alkiluracila, 5-(C2-Ce)-alkeniluracila, 5-(C2-C6)-alkiniluracila, 5-(hidroksimetil)uracila, 5-hlorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-hidroksicitozina, 5-(Ci-C6)-alkilcitozina, 5-(C2-C6)-alkenilcitozina, 5-(C2-C6)-alkinilcitozina, 5-hlorocitozina, 5-fluorocitozina, 5-bromocitozina, N<2->dimetilguanina, 2,4-diaminopurina, 8-azapurina, supstituisanog 7-deazapurina, poželjno 7-deaza-7-supstituisanog i/ili 7-deaza-8-supstituisanog purina, 5-hidroksimetilcitozina, N4-alkilcitozina, npr., N4-etilcitozina, 5-hidroksidezoksicitidina, 5-hidroksimetildezoksicitidina, N4-alkildezoksicitidina, npr., N4-etildezoksicitidina, 6-tiodezoksiguanozina i dezoksiribonukleotida nitropirola, C5-propinilpirimidina i diaminopurina, npr., 2,6-diaminopurina, inozina, 5-metilcitozina, 2-aminopurina, 2-amino-6-hloropurina, hipoksantina ili drugih modifikacija prirodnih nukleotidnih baza. Ovaj spisak je dat radi primera i nije ograničavajuć.
U određenim formulama koje su ovde opisane definisana je grupa modifikovanih baza. Na primer slovo Y je upotrebljeno za označavanje nukleotida koji sadrži citozin ili modifikovani citozin. Modifikovani citozin kao što je ovde korišćeno je prirodna ili sintetička pirimidinska baza analog citozina koji može da zameni ovu bazu bez smanjenja imunostimulatorne aktivnosti oligonukleotida. Modifikovani citozini obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 5-supstituisane citozine (npr. 5-metil-citozin, 5-fluoro-citozin, 5-hloro-citozin, 5-bromo-citozin, 5-jodo-citozin, 5-hidroksimetil-citozin, 5-difluorometil-citozin i nesupstituisani ili supstituisani 5-alkinil-citozin), 6-supstituisani citozini, N4-supstituisani citozini (npr. N4-etil-citozin), 5-aza-citozin, 2-merkapto-citozin, izocitozin, pseudo-izocitozin, analozi citožfna sa kondenzovanim sistemima prstenova (npr. N,N'-propilencitozin ili fenoksazin) i uracil i njegovi derivati (npr. 5-fluoro-uracil, 5-bromo-uracil, 5-bromovinil-uracil, 4-tio-uracil, 5-hidroksi-uracil, 5-propinil-uracil). Neki od poželjnih citozina obuhvataju 5-metil-citozin, 5-fluoro-citozin, 5-hidroksi-citozin, 5-hidroksimetil-citozin i N4-etil-citozin. U sledećem obliku pronalaska, citozinska baza je supstituisana sa univerzalnom bazom (npr. 3-nitropirol, P-baza), aromatičnim sistemom prstena (npr. Fluorobenzen ili difluorobenzen) ili atomom vodonika (dSpacer).
Slovo Z je upotrebljeno za označavanje guanina ili modifikovane guaninske baze. Modifikovani guanin kao što je ovde korišćeno je prirodna ili sintetička purinska baza analog guanina koja može da zameni ovu bazu bez smanjenja imunostimulatorne aktivnosti oligonukleotida. Modifikovani guanini obuhvataju, ali nisu ograničeni na 7-deazaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin (kao što je 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin), 7-deaza-8-supstituisani guanin, hipoksantin, N2-supstituisani guanini (npr. N2-metil-guanin), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-dion, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, purin, indol, adenin, supstituisani adenini (npr. N6-metil-adenin, 8-okso-adenin), 8-supstituisani guanin (npr. 8-hidroksiguanin i 8-bromoguanin) i 6-tioguanin. U sledećem obliku pronalaska, guaninska baza je supstituisana sa univerzalnom bazom (npr. 4-metil-indol, 5-nitro-indol i K-baza), aromatičnim sistemom prstena (npr. Benzimidazol ili dihlorobenzimidazol, amid 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-karboksilne kiseline) ili vodonikovim atomom (dSpacer).
Oligonukleotidi mogu imati jedan ili više dostupnih 5' krajeva. Moguće je da se formiraju modifikovani oligonukleotidi koji imaju dva takva 5' kraja. Ovo se može postići, na primer vezivanjem dva oligonukleotida 3'-3' vezom da bi se stvorio oligonukleotid koji ima jedan ili dva dostupna 5' kraja. 3'3'-veza može biti fosfodiestarski, fosforotioatni ili bilo koji drugi modifikovani internukleotidni most. Postupci za dobijanje takvih veza su poznati u tehnici. Na primer, takve veze su opisane u Selinger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-intemucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression. Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 and Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
Pored toga, 3'3'-vezane nukleinske kiseline kod kojih veza između 3'terminalnih nukleotida nije fosfodiestarski, fosforotioatni ili drugi modifikovani mošt, se mogu pripremiti korišćenjem dodatnog spejsera, kao što je tri- ili tetra-etilenglikolfosfatna grupa (Durand, M. Et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glvcol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, US Patent No. 5658738 i US Patent No. 5668265). Alternativno, ne-nukleotidni linker se može izvesti od etandiola, propandiola, ili od dezoksiribozne (dSpacer) jedinice bez baze (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) korišćenjem standardne hernije fosforamidita. Ne-nukleotidni linkeri se mogu ugraditi jednom ili više puta, ili se mogu kombinovati sa drugima omogućavajući vezivanje dva ODN na bilo kojoj udaljenosti između dva 3'.
Nedavno je objavljeno da se čini da CpG oligonukleotidi ispoljavaju njihov imunostimulatorni efekat kroz interakciju sa Toll-sličnim receptorom 9 (TLR9). Hemmi H et al. (2000)Nature408:740-5. TLR9 signalna aktivnost se prema tome može meriti kao odgovor na CpG oligonukleotid ili drugu imunostimulatornu nukleinsku kiselinu merenjem NF-kB, NF-KB-povezanih signala i pogodnih događaja i intermedijera koji slede nakon NF-kB.
Za primenu u ovom pronalasku, oligonukleotidi pronalaska se mogu sintetisatiće novokorišćenjem bilo kog od postupaka koji su dobro pozanti u tehnici. Na primer, b-cijanoetilfosforoamiditni postupak (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H.,Tet. Let.22:1859, 1981); nukleotid H-fosfonatni postupak (Gareggera/., Tet. Let.27:44051-4054,1986; Froehleret al., Nucl. Acid Res.14:5399-5407, 1986; Garegget al., Tet. Let.27:4055-4058, 1986, Gaffneyet al., Tet. Let.29:2619-2622, 1988). Ove hemijske reakcije se mogu izvesti pomoću različitih automatizovanih sintetizatora nukleinskih kiselina koji su komercijalno dostupni. Ovi oligonukleotidi se označavaju kao sintetički oligonukleotidi. Izolovani oligonukleotid uopšteno označava oligonukleotid koji je odvojen od komponenti koje su normalno sa njim spojene u prirodi. Na primer, izolovani oligonukleotid može biti onaj koji je izdvojen iz ćelije, iz jedra, iz mitohondrije ili iz hromatina.
Oligonukleotidi- su delimično otporni na razgradnju (npr., stabilizovani su). "Stabilizovani oligonukleotidni molekul" označava oligonukleotid koji je relativno otporan nain vivorazgradnju (npr. egzo- ili endo-nukleazom). Stabilizacija nukleinske kiseline se može postići modifikacijama osnovnog lanca. Oligonukleotidi koji imaju fosforotioatne veze imaju maksimalnu aktivnost i štite oligonukleotid od razgradnje unutarćelijskim egzo- ili endo-nukleazama. Drugi modifikovani oligonukleotidi obuhvataju fosfodiestarski modifikovane nukleinske kiseline, kombinacije fosfodiestarskih i fosoforotioatnih nukleinskih kiselina, metilfosfonat, metilfosforotioat, fosoforoditioat, p-etoksi i njihove kombinacije.
Modifikovani osnovni lanci kao što su fosforotioati se mogu sintetisati korišćenjem automatizovanih tehnika koje koriste bilo herniju fosforoamidata ili herniju H-fosfonata. Aril- i alkil-fosfonati se mogu formirati, npr., kao što je opisano u U.S. Patent No. 4,469,863; i alkilfosfotriestri (kod kojih je naelektrisana kiseonična grupa alkilovana kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,023,243 i European Patent No. 092,574) se mogu pripremiti automatizovanom sintezom čvrste faze korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa. Opisani su postupci za pripremanje drugih modifikacija i supstitucija osnovnog lanca DNK (npr., Uhlmann, E. and Pevman, A.,Chem. Rev.90:544, 1990; Goodchild, J.,Bioconjugate Chem. 1:165,1990).
Drugi stabilizovani oligonukleotidi obuhvataju: nejonske DNK analoge, kao što su alkil- i aril-fosfati (kod kojih je naelektrisani fosfonatni kiseonik zamenjen sa alkil ili aril grupom), fosfodiestre ili alkilfosfotriestre, kod kojih je naelektrisana kiseonična grupa alkilovana. Takođe je pokazano da su nukleinske kiseline koje sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na bilo kom ili oba kraja značajno otporne na razgradnju nukleazama.
Dok su CpG efekti kod miševa dobro opisani, informacije koje se odnose na humani sistem su ograničene. CpG fosforotioatni oligonukleotidi sa snažnom imunostimulatornom aktivnošću u sistemu miša pokazuju nižu aktivnost na humanim ili drugim ne-glodarskim imunim ćelijama. U primerima je opisan razvoj potentnog humanog CpG motiva i karakterizacija njegovih efekata i mehanizama delovanja na humane PBMC, npr., B-ćelije i NK-ćelije. DNK koja sadrži ove CpG motive i delimično modifikovane osnovne lance snažno stimuliše humane ćelije periferne krvi da proizvode IL-6, IL-10, IP-10, TNF-a, IFN-a i IFN-y. IFN-y je bio povećan u odnosu na kontrolne nivoe. NK ćelije i T ćelije su takođe indukovane na ekspresiju povišenih nivoa CD69.
Otkriveno je na osnovu pronalaska da podgrupe CpG imunostimulatornih oligonukleotida imaju značajne imunostimulatorne efekte na humane ćelije kao što su NK ćelije, sugerišući da su ovi CpG imunostimulatorni oligonukleotidi efikasni terapeutski agensi za humanu vakcinaciju, imunoterapiju kancera, imunoterapiju astme, opšte poboljšanje imunih funkcija, poboljšanje hematopoetskog oporavka posle radijacije ili hemoterapije, autoimune bolesti ili ostale imunomodulirajuće primene.
Prema tome, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su korisni u nekim aspektima pronalaska kao vakcina za tretman subjekta koga postoji rizik da se razvije alergija ili astma, infekcija sa infektivnim organizmom ili za kancer kod koga je identifikovan specifičan kancer antigen. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi takođe se mogu dati bez antigena ili alergena za zaštitu protiv infekcije, alergije ili kancera i u ovim slučajevima će ponovljene doze obezbediti dugoročnu zaštitu. Subjekat pod rizikom kao što je ovde korišćeno je subjekat koji ima bilo kakav rizik od izlaganja infekciji koju izaziva patogen ili kanceru ili alergenu ili rizik od razvoja kancera. Na primer, subjekat pod rizikom može biti subjekat koji planira putovanje na prostor gde je pronađen određen tip infektivnog agensa ili to može biti subjekat koji je svojim načinom života ili medicinskim postupcima izložen telesnim tečnostima koje mogu sadržati infektivne organizme ili direktno organizmu ili čak subjekat koji živi na prostoru gde je identifikovan infektivni organizam ili alergen. Subjekti koji su pod rizikom da razviju infekciju takođe obuhvataju opšte populacije kojima medicinske organizacije preporučuju vakcinaciju sa određenim antigenom infektivnog organizma. Ako je antigen alergen i subjekat razvije alergijske odgovore na taj određeni antigen i subjekat može biti izložen antigenu, tj., tokom sezone polena, tada je subjekat pod rizikom od izlaganja antigenu. Subjekat pod rizikom da razvije alergiju na astmu obuhvata one subjekte sa identifikovanom alergijom ili astmom, ali koji nemaju aktivnu bolest tokom tretmana CpG imunostimulatornim oligonukleotidom, kao i subjekti za koje se smatra da su pod rizikom da razviju ove bolesti zbog genetičkih ili sredinskih faktora.
Subjekat kod koga postoji rizik da se razvije kancer je onaj kod koga postoji visoka verovatnoća razvoja kancera. Ovi subjekti obuhvataju, na primer, subjekte koji imaju genetičku abnormalnost; za čije prisustvo je pokazano da je u korelaciji sa većom verovatnoćom razvoja kancera i subjekte izložene kanceru koji izazivaju agensi kao što su duvan, azbest, ili neki drugi hemijski toksini, ili subjekte koji su ranije lečeni od kancera i koji je u očiglednoj remisiji. Kada se subjekt kod koga postoji rizik da se razvije kancer tretira sa antigenom specifičnim za tip kancera za koji postoji rizik da se pojavi kod subjekta i CpG imunostimulatornim oligonukleotidom, subjekat može biti sposoban da ubija ćelije kancera kako se one razvijaju. Ako tumor počinje da se formira u subjektu, subjekat će razviti specifičan imuni odgovor protiv antigena tumora.
Kao dodatak upotrebi CpG imunostimulatornih oligonukleotida u prevenciji, pronalazak takođe obuhvata upotrebu CpG imunostimulatornih oligonukleotida za lečenje subjekta koji ima infekciju, alergiju, astmu, ili kancer.
Subjekat koji ima infekciju je subjekat koji je bio izložen infektivnom patogenu i ima akutno ili hronično detektabilne nivoe patogena u telu. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu koristiti sa ili bez antigena da bi se stvorio antigen specifičan sistemski ili mukozni imuni odgovor koji je sposoban da redukuje nivo ili da potpuno uništi infektivnog patogena. Infektivna bolest, kao što je ovde upotrebljeno, je bolest koja nastaje zbog prisustva stranog mikroorganizma u telu. Posebno je važno da se razviju efikasne strategije vakcinisanja i tretmani da bi se zaštitile površine sluzokože tela, koje su primarno mesto ulaska patogena.
Subjekat koji ima alergiju je subjekat koji ima ili je pod rizikom da razvije alergijsku reakciju kao odgovor na alergen. Alergija se odnosi na stečenu hipersenzitivnost na supstancu (alergen). Alergijska stanja obuhvataju, ali nisu ograničena na ekcem, alergijski rinitis ili prehlada, akutni alergijski rinitis, konjuktivitis, bronhijalna astma, urtikarija (koprivnjača) i alergije na hranu i ostala atopička stanja.
Alergije su obično izazvane stvaranjem IgE antitela protiv bezopasnih alergena. Citokini koji su indukovani sistemskom ili mukozalnom primenom CpG imunostimulatornih oligonukleotida su pretežno klase nazvane Th1 (primeri su IL-12, IP-10, IFN-a i IFN-y) i izazivaju i humoralni i ćelijski imuni odgovor. Drugi glavni tip imunog odgovora, koji je povezan sa proizvodnjom IL-4 i IL-5 citokina, je označen kao Th2 imuni odgovor. Uopšteno, čini se da su alergijske bolesti posredovane Th2 tipom imunih odgovora. Na osnovu sposobnosti CpG imunostimulatornih oligonukleotida da menjaju imuni odgovor od Th2 (koji je povezan sa proizvodnjom IgE antitela i alergijom) u ravnotežan Th2/Th1 odgovor (koji štiti protiv alergijskih reakcija), efikasna doza za indukovanje imunog odgovora CpG imunostimulatornog oligonukleotida se može primeniti na subjekta za lečenje ili prevenciju alergije.
Prema tome, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi imaju značajnu ulogu u lečenju alergijskih i ne-alergijskih stanja kao što je astma. Th2 citokini, posebno IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putevima subjekta sa astmom. Ovi citokini potpomažu važne aspekte astmatičnog inflamatornog odgovora, uključujući zamenu IgE izotopa, hemotaksiju eozinofila i aktivaciju i rast mastocita. Th1 citokini, posebno IFN-y i IL-12, mogu suprimirati formiranje Th2 klonova i proizvodnju Th2 citokina. Astma se odnosi na poremećaj respiratornog sistema koji karakteriše zapaljenje, sužavanje disajnih puteva i povećana reaktivnost disajnih puteva na inhalirane agense. Astma je često, iako ne isključivo povezana sa atopičnim ili alergijskim simptomima.
Subjekat koji ima kancer je subjekat koji ima detektabilne kancerozne ćelije. Kancer može biti maligni ili ne-maligni kancer. Kanceri ili tumori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kancer žučnog kanala; kancer mozga; kancer dojke; kancer grlića materice; horiokarcinom; kancer debelog creva; kancer endometrijuma; kancer jednjaka; kancer želudca; intraepitelijalne neoplazme; limfomi; kancer jetre; kancer pluća (npr. male ćelije i ne-male ćelije); melanom; neuroblastomi; oralni kancer; kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; rektalni kancer; sarkomi; kancer kože; kancer testisa; tireoidni kancer; i renalni kancer, kao i ostali karcinomi i sarkomi. U jednom obliku kancer je leukemija sa pojavom cilijatnih ćelija, hronična mijelogena leukemija, leukemija kutanih T ćelija, multipni mijelom, folikularni limfom, maligni melanom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom prostate, karcinom ćelija bešike, ili karcinom debelog creva.
Subjekat će označavati čoveka ili kičmenjačku životinju uključujući, ali ne ograničavajući se na psa, mačku, konja, kravu, svinju, ovcu, kozu, kokošku, primata, npr., majmuna, ribu (vrste akvakulture), npr. pastrmku. Prema tome, pronalazak se takođe može koristiti za tretiranje kancera i tumora, infekcija i alergije/astme kod ne-humanih subjekata. Kancer je jedan od vodećih uzroka smrti domaćih životinja (tj., mačaka j pasa).
Kao što je ovde korišćeno, termin tretirati, tretiran ili tretman kada je korišćen u odnosu na poremećaj kao što je infektivna bolest, kancer, alergija, ili astma označava profilaktički tretman koji povećava otpornost subjekta na razvoj bolesti (npr.,na infekciju sa patogenom) ili, drugim rečima, smanjuje verovatnoću da će se kod subjekta razviti bolest (npr., koji je inficiran patogenom) kao i tretman nakon što se kod subjekta razvila bolest da bi se izborio sa bolešću (npr., da bi se ublažila ili eliminisala infekcija) ili da bi se sprečilo njeno pogoršanje.
U slučajevima kada se CpG oligonukleotid primenjuje sa antigenom, subjekat može biti izložen antigenu. Kao što je ovde upotrebljeno, termin izložen se odnosi bilo na aktivan korak stupanja u kontakt subjekta sa antigenom ili pasivno izlaganje subjekta antigenuin vivo.Postupci za aktivno izlaganje subjekta antigenu su dobro poznati u tehnici. Uopšteno, antigen je direktno primenjen na subjekta bilo kojim putem kao što je intravenozna, intramuskularna, oralna, transdermalna, mukozalna, intranazalna, intratrahealna, ili subkutana primena. Antigen se može primeniti sistemski ili lokalno. Postupci za primenu antigena i CpG imunostimulatornog oligonukleotida su detaljnije opisani u daljem tekstu. Subjekat je pasivno izložen antigenu, ako je antigen postao dostupan za izlaganje imunim ćelijama u telu. Subjekat može biti pasivno izložen antigenu, na primer, ulaskom stranog patogena u telo ili razvojem ćelije tumora koja eksprimira strani antigen na svojoj površini.
Postupci u kojima je subjekat pasivno izložen antigenu mogu biti posebno zavisni od vremena primene CpG imunostimulatornog oligonukleotida. Na primer, kod subjekta kod koga postoji rizik od razvoja kancera ili infektivne bolesti ili alergijskog ili astmatičnog odgovora, moguće je redovno primenjivati CpG imunostimulatorni oligonukleotid kada je rizik najveći, tj., tokom sezone alergija ili posle izlaganja agensu koji može izazvati kancer. Dodatno, CpG imunostimulatorni oligonukleotid se može primeniti na putnike pre njihovog putovanja u strane zemlje gde postoji rizik njihovog izlaganja infektivnim agensima. Slično tome, CpG imunostimulatorni oligonukleotid se može primeniti na vojnike ili civile kod kojih postoji rizik od izlaganja biološkom ratu da bi se izazvao sistemski ili mukozni imuni odgovor na antigen kada i ako je subjekat bio izložen njemu.
Antigen kao što se ovde koristi je molekul sposoban da izazove imuni odgovor. Antigeni obuhvataju, ali nisu ograničeni na ćelije, ćelijske ekstrakte, proteine, polipeptide, peptide, polisaharide, polisaharidne konjugate, peptidne i ne-peptidne mimetike polisaharida i ostalih molekula, male molekule, lipide, glikolipide, ugljene hidrate, viruse i viralne ekstrakte i višećelijske organizme kao što su paraziti i alergene. Termin antigen obuhvata bilo koji tip molekula koji prepoznaje imuni sistem domaćina kao strani. Antigeni obuhvataju, ali nisu samo na njih ograničeni, antigene kancera, mikrobijalne agense i alergene.
Antigen kancera kao što je ovde korišćeno je jedinjenje, kao što je peptid ili protein, vezan za površinu ćelija kancera ili tumora i koje je sposobno da izazove imuni odgovor kada je eksprimiran na površini antigen prikazujućih ćelija u kontekstu MHC molekula. Antigeni kancera se mogu pripremiti od ćelija kancera bilo pripremanjem sirovih ekstrakata od ćelija kancera, na primer, kao što je opisano u Cohen, et al., 1994,Cancer Research,54:1055, delimičnim prečišćavanjem antigena, rekombinantnom tehnologijom, ilide novosintezom poznatih antigena. Antigeni kancera obuhvataju, ali nisu ograničeni na antigene koji su rekombinantno eksprimirani, imunogeni deo, ili ceo tumor ili kancer. Takvi antigeni se mogu izolovati ili pripremiti rekombinantno ili bilo kojim načinima poznatim u tehnici.
Mikrobijalni agens kao što je ovde korišćeno je antigen mikroorganizma i obuhvata, ali nije ograničen na virus, bakteriju, parazite i gljive. Takvi antigeni obuhvataju intaktni mikroorganizam kao i prirodne izolate i fragmente ili njihove derivate i takođe sintetička jedinjenja koja su identična ili slična antigenima prirodnih mikroorganizama i indukuju imuni odgovor specifičan za taj mikroorganizam. Jedinjenje je slično antigenu prirodnog mikroorganizma ako isto indukuje imuni odgovor (humoralni i/ili ćelijski) na antigen prirodnog mikroorganizma. Takvi antigeni se rutinski koriste u tehnici i dobro su poznati stručnjacima.
Primeri virusa koji su pronađeni kod čoveka uključuju, ali nisu ograničeni na:Retroviridae(npr. virusi imunodeficijencije kod čoveka, kao što je HIV-1 (takođe označen kao HTLV-III, LAV ili HTLV-III/LAV, ili HIV-III; i drugi izolati kao stoje HIV-LP;Picornaviridae(npr. polio virusi, hepatitis A virus; enterovirusi, humani Koksaki virusi, rinovirusi, ehovirusi);Calciviridae(npr. sojevi koji izazivaju gastroenteritis);Togaviridae(npr. virusi encefalitisa kod konja, rubeola virusi);Flaviridae(npr.- denga virusi, encefalitis virusirvirusi žute groznice);Coronoviridae(npr. koronavirusi);Rhabdoviradae(npr. virusi vezikularnog stomatitisa, virusi besnila);Filoviridae(npr. ebola virusi);Paramyxoviridae(npr. parainfluenca virusi, virus parotoitisa, virus malih boginja, respiratorni sincicijalni virus);Orthomyxoviridae(npr. influenza virusi);Bungaviridae(npr. Hantaan virusi, bunga virusi, flebovirusi i Nairo virusi); Arena viridae (virusi hemoragične groznice);Reoviridae(npr. reovirusi, orbivirusi i rotavirusi);Birnaviridae; Hepadnaviridae(Hepatitis B virus);Parvovirida(parvovirusi);Papovaviridae(papilloma virusi, polioma virusi);Adenoviridae(većina adenovirusa);Herpesviridae(herpes simplex virus (HSV) 1 i 2, varičela zoster virus, citomegalovirus (CMV), herpes virus;Poxviridae(variola virusi, vakcinia virusi, pox viruses); iIridoviridae(npr. virus afričke svinjske groznice); i neklasifikovani virusi (npr. agens delta hepatitisa (smatralo se da je defektni satelit virusa hepatitisa B), agensi ne-A, ne-B hepatitisa (klasa 1 = interno se prenosi; klasa 2 = parenteralno se prenosi (t. j. hepatitis C); Norvvalk i srodni virusi i astrovirusi).
Gram negativne i gram pozitivne bakterije imaju ulogu antigena kod kičmenjaka. Takve gram pozitivne bakterije uključuju, ali nisu ograničeni na,Pasteurellavrste,Staphylococcivrste iStreptococcusvrste. Gram negativne bakterije uključuju, ali nisu ograničeni na,Escherichia coli, Pseudomonasvrste iSalmonellavrste. Specifični primeri infektivnih bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na,Helicobacterpyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteriavrste (npr.M. tuberculosis, M.
avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocylogenes, Streptococcus pyogenes
(Grupa A Streptococcus),Streptococcus agalactiae(Grupa B Streptococcus),Streptococcus(viridans grupa),Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus(anaerobne vrste),Streptococcus pneumoniae,patogeniCampylobacter
sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium
diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers,
Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella
multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis,
Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia,iActinomyces
israelli.
Primeri gljiva uključujuCryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida
albicans.
Drugi infektivni organizmi (tj., protozoe) uključujuPlasmodium spp.kao što jePlasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovaleiPlasmodiumvivax iToxoplasma gondii.Krvni i/ili tkivni paraziti uključujuPlasmodiumspp.,Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmaniaspp.,Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambienseiTrypanosoma rhodesiense(Afrička bolest spavanja),Trypanosoma cruzi(Chagas bolest) iToxoplasma gondii.
Drugi medicinski relevantni mikroorganizmi detaljno su opisani u literaturi npr., pogledati C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall, Great Britain 1983, čiji je celokupni sadržaj uključen ovde na osnovu reference.
Alergen označava supstancu (antigen) koja može izazvati alergijski ili astmatični odgovor osetljivog subjekta. Spisak alergena je ogroman i može obuhvatiti polene, otrove insekata, perut životinja, spore gljiva i lekove (npr. penicilin). Primeri prirodnih, životinjskih i biljnih alergena uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine specifične za sledeće rodove:Canine ( Canis familiaris) ; Dermatophagoides(npr.Dermatophagoides farinae) ; Felis ( Felis domesticus) ; Ambrosia ( Ambrosia artemisifolia; Lolium(npr.Lolium
perenneiliLolium multiflorum) ; Cryptomeria ( Cryptomeria japonica) ; Alternaria
( Alternaria alternata) ; Alder; Alnus ( Alnus gultinoasa) ; Betula ( Betula verrucosa) ;
Quercus ( Quercus alba) ; Olea ( Olea europea) ; Artemisia ( Artemisia vulgaris) ; Plantago
(npr.Plantago lanceolata) ; Parietaria(npr.Parietaria officinalisiliParietaria judaica) ; Blattella(npr.Blattella germanica) ; Apis(npr.Apis multiflorum) ; Cupressus(npr.
Cupressus sempervirens, Cupressus arizonicaiCupressus macrocarpa) ; Juniperus
(npr.Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communisiJuniperus ashei) ; Thuya(npr.Thuya orientalis) ; Chamaecyparis(npr.Chamaecyparis obtusa) ; Periplaneta(npr.Periplaneta americana) ; Agropyron(npr.Agropyron repens) ; Secale
(npr.Secale cereale) ; Triticum(npr.Triticum aestivum) ; Dactylis(npr.Dactylis glomerata) ; Festuca(npr.Festuca elatior) ; Poa(npr.Poa pratensisiliPoa compressa) ; Avena(npr.Avena sativa) ; Holcus(npr.Holcus lanatus) ; Anthoxanthum(npr.Anthoxanthum odoratum) ; Arrhenatherum(npr.Arrhenatherum elatius) ; Agrostis(npr.Agrostis alba) ; Phleum(npr.Phleum pratense) ; Phalaris(npr.Phalaris arundlnacea) ; Paspalum(npr.Paspalum notatum) ; Sorghum(npr.Sorghum halepensis) ;iBromus(npr.Bromus inermis).
Termin značajno prečišćen kao što je ovde korišćeno se odnosi na polipeptid koji je značajno oslobođen od ostalih proteina, lipida, ugljenih hidrata ili ostalih materijala sa kojima je obično povezan. Stručnjak može prečistiti viralne ili bakterijske polipeptide korišćenjem standardnih tehnika za prečišćavanje proteina. Značajno čist polipeptid će često proizvesti jednu glavnu traku na ne-redukujućem poliakrilamidnom gelu. U slučaju delimično glikozilovanih polipeptida ili onih koji imaju nekoliko start (početnih) kodona, može biti nekoliko traka na ne-redukujućem poliakrilamidnom gelu, ali će one formirati određeni obrazac za taj polipeptid. Čistoća viralnog i bakterijskog polipeptida se takođe može odrediti analizom amino-terminalne amino kiselinske sekvence. Ostali tipovi antigena koji nisu kodirani nukleinsko kiselinskim vektorom kao što su polisaharidi, mali molekuli, mimetici itd. su opisani u prethodnom tekstu i obuhvaćeni su pronalaskom.
Oligonukleotidi pronalaska se mogu primeniti na subjekta sa anti-mikrobijalnim agensom. Anti-mikrobijalni agens, kao što se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje koje se javlja u prirodi ili sintetičko jedinjenje koje je sposobno da ubija ili inhibira infektivne mikroorganizme. Tip anti-mikrobijalnog agensa koji se može koristiti na osnovu pronalaska će zavisiti od tipa mikroorganizma sa kojim je subjekat inficiran ili postoji rizik da bude njime inficiran. Anti-mikrobijalni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na anti-bakterijske agense, anti-viralne agense, anti-gljivične agense i anti-parazitske agense. Izrazi kao što su "anti-infektivan agens", "anti-bakterijski agens", "anti-viralni agens", "anti-gljivični agens", "anti-parazitski agens" i "paraziticid" imaju jasna značenja za stručnjake i definisani su u standardnoj medicinskoj literaturi. Ukratko, anti-bakterijski agensi ubijaju ili inhibiraju bakterije, a obuhvataju antibiotike kao i ostala sintetička ili prirodna jedinjenja koja imaju slične funkcije. Antibiotici su molekuli male molekulske težine koje kao sekundarne metabolite proizvode ćelije, kao što su mikroorganizmi. Uopšteno, antibiotici utiču na jednu ili više bakterijskih funkcija ili struktura koje su specifične za mikroorganizam i koje nisu prisutne kod ćelija domaćina. Anti-viralni agensi se mogu izolovati iz prirodnih izvora ili se mogu sintetisati i korisni su za ubijanje ili inhibiranje virusa. Anti-gljivični agensi se koriste za lečenje gljivičnih infekcija kao i oportunih i primarnih sistemskih gljivičnih infekcija. Anti-parazitski agensi ubijaju ili inhibiraju parazite.
Primeri anti-parazitskih agenasa, takođe označenih kao paraziticidi, koji su korisni za primenu na ljude obuhvataju, ali nisu ograničeni na albendazol, amfotericin B, benznidazol, bitionol, hlorohin HCI, hlorohin fosfat, klindamicin, dehidroemetin, dietilkarbamazin, diloksanid furoat, eflornitin, furazolidaon, glukokortikoidi, halofantrin, jodohinol, ivermektin, mebendazol, meflohin, meglumin antimoniat, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklozamid, nifurtimoks, oksamnihin, paromomicin, pentamidin izetionat, piperazin, prazikvantel, primahin fosfat, proguanil, pirantel pamoat, pirimetanminsulfamidi, pirimetanmin-sulfadoksin, hinakrin HCI, hinin sulfat, hinidin glukonat, spiramicin, stiboglukonatnatrijum (natrijumantimoniglukonat), suramin, tetraciklin, doksiciklin, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoksazol i triparzamid od kojih se neki koriste sami ili u kombinaciji sa drugima.
Antibakterijski agensi ubijaju ili inhibiraju rast ili funkciju bakterija. Velika klasa antibakterijskih agenasa su antibiotici. Antibiotici, koji su efikasni u ubijanju ili inhibiranju velikog broja bakterija, označavaju se kao antibiotici širokog spektra. Ostali tipovi antibiotika su pretežno efikasni protiv klase gram-pozitivnih ili gram-negativnih bakterija. Ovi tipovi antibiotika se označavaju kao antibiotici uskog spektra. Ostali antibiotici koji su efikasni protiv pojedinačnog organizma ili bolesti, a nisu efikasni protiv ostalih tipova bakterija, označavaju se kao antibiotici ograničenog spektra. Antibakterijski agensi su nekad klasifikovani na osnovu njihovog primarnog načina delovanja. Uopšteno, antibakterijski agensi su inhibitori sinteze ćelijskog zida, inhibitori ćelijske membrane, inhibitori sinteze proteina, inhibitori sinteze nukleinskih kiselina ili funkcionalni inhibitori i kompetitivni inhibitori.
Antivirusni agensi su jedinjenja koja sprečavaju infekciju ćelija virusima ili replikacijom virusa unutar ćelije. Postoji mnogo manje antiviralnih lekova od antibakterijskih lekova zbog toga što je proces viralne replikacije blisko vezan za DNK replikaciju unutar ćelije domaćina, te bi stoga ne-specifični antiviralni agensi često bili toksični za domaćina. Postoji nekoliko stupnjeva u procesu viralne infekcije koji se mogu blokirati ili inhibirati antiviralnim agensima. Ovi stadijumi obuhvataju, vezivanje virusa za ćeliju domaćina (imunoglobulin ili vezujući peptidi), oslobađanje virusa od omotača (npr. amantadin), sinteza ili translacija viralne mRNK (npr. interferon), replikacija viralne RNK ili DNK (npr. nukleozidni analozi), sazrevanje novih proteina virusa (npr. inhibitori proteaze) i pupljenje i oslobađanje virusa.
Nukleotidni analozi su sintetička jedinjenja koja su slična nukleotidima, ali koja imaju nekompletnu ili abnormalnu deoksiriboza ili riboza grupu. Kada su nukleotidni analozi nađu u ćeliji, oni se fosforilišu, proizvodeći trifosfatnu formu koja je u kompeticiji sa normalnim nukleotidima za inkorporaciju u viralnu DNK ili RNK. Kada je trifosfatna forma nukleotidnog analoga inkorporisana u rastući lanac nukleinske kiseline, ona uzrokuje ireverzibilno spajanje sa viralnom polimerazom i time dovodi do završetka lanca. Nukleotidni analozi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, aciklovir (korišćen za lečenje herpes simpleks virusa i varičela zoster virusa), ganciklovir (koristan za lečenje citomegalovirusa), idoksuridin, ribavirin (koristan za lečenje respiratornog sincicijalnog virusa), dideoksinozin, dideoksicitidin i zidovudin (azidotimidin), imihimod i rezimihimod.
Interferoni su citokini koje izlučuju ćelije inficirane virusom kao i imune ćelije. Interferoni funkcionišu vezivanjem za specifične receptore na ćelijama koje su susedne inficiranim ćelijama, uzrokujući promenu u ćeliji koja je štiti od infekcije virusom, a i p-interferon takođe indukuju ekspresiju Klase I i Klase II MHC molekula na površini inficiranih ćelija, rezultirajući u povećanom prikazivanju antigena za prepoznavanje sa imunim ćelijama domaćina, a i p-interferoni su dostupni kao rekombinantni oblici i korišćeni su za lečenje hronične infekcije hepatitisa B i C. U dozama koje su efikasne za anti-viralnu terapiju, interferoni imaju snažne neželjene efekte kao što su groznica, slabost i gubitak telesne težine.
Antiviralni agensi korisni u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na imunoglobuline, amantadine, interferon, nukleotidne analoge i inhibitore proteaze. Specifični primeri antiviralnih agenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na Acemannan; Acvclovir; Acvclovir Sodium; Adefovir; Alovudine; Alvicept Sudotoks; Amantadine Hvdrochloride; Aranotin; Arildone; Ateviridine Mesvlat; Avridine; Cidofovir; Cipamfvlline; Cvtarabine Hvdrochloride; Delaviridine Mesylate; Desciclovir; Didanosine; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; Enviroxime; Famciclovir; Famotine Hvdrochloride; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilate; Foscarnet Sodium; Fosfonet Sodium; Ganciclovir; Ganciclovir Sodium; ldoxuridine; Kethoxal; Lamivudine; Lobucavir; Memotine Hvdrochloride; Methisazone; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin; Rimantadine Hvdrochloride; Saquinavir Mesvlate; Somantadine Hydrochloride; Sorivudine; Statolon; Stavudine; Tilorone Hydrochloride; Trifluridine; Valacvclovir Hydrochloride; Vidarabine; Vidarabine Phosphate; Vidarabine Sodiium Phosphate; Viroxime; Zalcitabine; Zidovudine; i Zinviroxime.
Anti-gljivični agensi su korisni za lečenje i prevenciju infekcije gljivicama. Anti-gljivični agensi su ponekad klasifikovani na osnovu mehanizma njihovog delovanja. Neki anti-gljivični agensi funkcionišu kao inhibitori ćelijskog zida inhibiranjem glukoza sintaze. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na, basiungin/ECB. Ostali anti-gljivični agensi funkcionišu tako što destabilizuju integritet membrane. Ovi agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, imidazole, kao što su klotrimazol, sertakonzol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol i vorikonazol, kao i FK 463, amfotericin B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin i terbinafin. Ostali anti-gljivični agensi funkcionišu razlaganjem hitina (npr. hitinaza) ili imunosupresijom (501 krema).
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu kombinovati sa drugim terapeutskim agensima kao što su adjuvanti da bi se pojačali imuni odgovori. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i drugi terapeutski agens se mogu primeniti istovremeno ili postepeno. Kada se drugi terapeutski agensi primenjuju istovremeno moguće ih je primeniti u istim ili posebnim formulacijama, ali se primenjuju u isto vreme. Drugi terapeutski agensi se primenjuju postepeno jedni u odnosu na druge i sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidima, kada je primena drugih terapeutskih agenasa i CpG imunostimulatornog oligonukleotida vremenski odvojena. Vremenska razlika između primene ovih jedinjenja može biti u minutima ili duže. Drugi terapeutski agensi obuhvataju ali nisu ograničeni na adjuvante, citokine, antitela, antigene itd.
Kompozicija pronalaska se takođe može primeniti sa ne-nukleinsko kiselinskim adjuvantima. Ne-nukleinsko kiselinski adjuvant je bilo koji molekul ili jedinjenje osim CpG imunostimulatornih oligonukleotida koji su ovde opisani koji mogu stimulisati humoralni i/ili ćelijski imuni odgovor. Ne-nukleinsko kiselinbski adjuvanti obuhvataju, na primer, adjuvante koji stvaraju depo efekat, imunostimulirajuće adjuvante i adjuvante koji stvaraju depo efekat i stimulišu imuni sistem.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni kao mukozni adjuvanti. Ranije je otkriveno da mukozno oslobađanje CpG nukleinskih" kiselina indukuje i sistemski i mukozni imunitet. Prema tome, oligonukleotidi se mogu primeniti zajedno sa drugim mukoznim adjuvantima.
Imuni odgovori se takođe mogu izazvati ili pojačati ko-administracijom ili ko-linearnom ekspresijom citokina (Bueler & Mulligan, 1996; Chowef al.,1997; Geissleret al.,1997; Ivvasakief al.,1997; Kimer al.,1997) ili B-7 ko-stimulatornih molekula (Ivvasakier al.,1997; Tsujier al.,1997) sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidima. Termin citokin je upotrebljen kao zajednički naziv za raznoliku grupu rastvorljivih proteina i peptida koji se ponašaju kao humoralni regulatori u nano- do pikomolarnim koncentracijama i koji, pod normalnim ili patološkim uslovima, moduliraju funkcionalne aktivnosti pojedinačnih ćelija i tkiva. Ovi proteini takođe direktno posreduju u interakcijama između ćelija i regulišu procese koji se odvijaju u ekstraćlijskoj sredini. Primeri citokina, obuhvataju, ali nisu ograničeni na IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, stimulirajući faktor kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), stimulirajući faktor kolonije granulocita (G-CSF), interferon-y (y-IFN), IFN-a, faktor tumorske nekroze (TNF), TGF-p, FLT-3 ligand i CD40 ligand.
Oligonukleotidi su takođe korisni za preusmeravanje imunog odgovora od Th2 imunog odgovora u Th1 imuni odgovor. Ovo ima za rezultat stvaranje relativno uravnoteženog Th1/Th2 okruženja. Preusmeravanje imunog odgovora od Th2 u Th1 imuni odgovor se može proceniti merenjem nivoa citokina koji su proizvedeni kao odgovor na nukleinsku kiselinu (npr., indukovanjem monocita i ostalih ćelija da proizvode Th1 citokine, uključujući IL-12, IFN-y i GM-CSF). Preusmeravanje ili ponovno uspostavljanje ravnoteže imunog odgovora iz Th2 u Th1 odgovor je posebno korisno za lečenje ili prevenciju astme. Na primer, efikasna količina za lečenje astme može biti ona količina korisna za preusmeravanje Th2 tipa imunog odgovora koji je povezan sa astmom u Th1 tip odgovora ili uravnoteženo Th1/Th2 okruženje. Th2 citokini, posebno IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putevima astmatičnih subjekata. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska izazivaju povećanje Th1 citokina, što pomaže uravnoteženju imunog sistema, sprečavajući ili smanjujući štetne efekte povezane sa predominantnim Th2 imunim odgovorom.
Oligonukleotidi pronalaska mogu takođe biti korisni za lečenje remodeliranja vazdušnih puteva. Remodeliranje vazdušnih puteva nastaje usled proliferacije glatkih mišićnih ćelija i/ili zadebljavanja submukoze u disajnim putevima, što za krajnji ishod ima sužavanje disajnih puteva i smanjenje protoka vazduha. Oligonukleotidi pronalaska mogu sprečiti dalje remodelovanje i čak dovesti do smanjenja stvaranja tkiva u procesu remodelovanja.
Oligonukleotidi su takođe korisni za poboljšanje preživljavanja, diferencijacije, aktivacije i sazrevanja dendristkih ćelija. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poseduju jedinstvenu sposobnost da potpomažu preživljavanje ćelija, diferencijaciju, aktivaciju i sazrevanje dendritskih ćelija.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi takođe povećavaju litičku aktivnost ćelija prirodnih ubica i antitelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). ADCC se može izvesti korišćenjem CpG imunostimulatornog oligonukleotida zajedno sa antitelom specifičnim za ciljne ćelije, kao što je kancerozna ćelija. Kada se CpG imunostimulatorni oligonukleotid primenjuje na subjekta zajedno sa antitelom, imuni sistem subjekta je izazvan da ubija ćelije tumora. Antitela korisna u ADCC proceduri obuhvataju antitela koja interaguju sa ćelijom u telu. Mnoga takva antitela specifična za ciljne ćelije su opisana u tehnici i mnoga su komercijalno dostupna.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se takođe mogu primeniti zajedno sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapije obuhvataju lekove za kancer, zračenje i hirurške zahvate. Kao što je ovde korišćeno, "lek za kancer" se odnosi na agens koji je primenjen na subjekta radi lečenja kancera. Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje kancera" obuhvata prevenciju razvoja kancera, umanjivanje simptoma kancera, i/ili inhibiranje rasta postojećeg kancera. U ostalim aspektima, lek za kancer je primenjen na subjekta kod koga postoji rizik od razvoja kancera radi smanjivanja rizika da se razvije kancer. Ovde su opisani različiti tipovi lekova za lečenje kancera. Za potrebe ove specifikacije, lekovi za kancer su klasifikovani kao hemoterapeutski agensi, imunoterapeutski agensi, vakcine za kancer, hormonska terapija i modifikatori biološkog odgovora.
Dodatno, namera je bila da postupci pronalaska obuhvate korišćenje više od jednog leka za kancer zajedno sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidima. Kao primer, gde je to odgovarajuće, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu primeniti i sa hemoterapeutskim agensima i sa imunoterapeutskim agensima. Alternativno, lek za kancer može obuhvatiti imunoterapeutski agens i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutski agens i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutski agens, imunoterapeutski agens i vakcinu za kancer, pri čemu su svi primenjeni na jednog subjekta radi lečenja subjekta koji ima kancer ili kod koga postoji rizik da se razvije kancer.
Hemoterapeutski agens može biti izabran iz grupe koja obuhvata metotreksat, vinkristin, adriamicin, cisplatin, hloroetilnitrozouree koje ne sadrže šećer, 5-fluorouracil, mitomicin C, bleomicin, doksorubicin, dakarbazin, taksol, fragilin, Meglamine GLA, valrubicin, karmustain i poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor RAS famezil transferaze, inhibitor famezil transferase, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hvcamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroxantrone, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, lncelA/X-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32A/alrubicin, Metastron/strontium derivate, Temodal/Temozolomide, Evacet/lipozomalni doksorubicin, Yewtaxan/Placlitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabine, Furtulon/Doxifluridine, Cyclopax/oralni paklitaksel, Oral Taxoid, SPU-077/Cisplatin, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358
(774)/EGFR, inhibitor CP-609(754)/RAS onkogena, BMS-182751/oralna platina, UFT(Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisole, Eniluracil/776C85/5FU enhanser, Campto/Levamisole, Camptosar/lrinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribine, Paxex/Paclitaxel, Doxil/lipozomalni doksorubicin, Caelyx/lipozomalni doksorubicin, Fludara/Fludarabine, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCvt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimide, LU 103793/Dolastain, Caetyx/lipozomalni doksorubicin, Gemzar/Gemcitabine, ZD 0473/Anormed, YM 116, granule joda, CDK4 i CDK2 inhibitore, PARP inhibitore, D4809/Dexifosamide, lfes/Mesnex/lfosamide, Vumon/Teniposide, Paraplatin/Carboplatin, Plantinol/cisplatin, Vepeside/Etoposide, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, profarmak guanin arabinozida, Taxane Analog, nitrozouree, alkilujuće agense kao što su melfelan i ciklofosfamid, Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatirf, Chlorombucil, Cytarabine HCI, Dactinomycin, Daunorubicin HCI, Estramustine phosphate sodium, Etoposide (VP16-213), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetat (analog LHRH-releasing faktora), Lonuistine (CCNU), Mechlorethamine HCI (nitrogen mustard), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HC1, Octreotide, Plicamycin, Procarbazine HC1, Streptozocin, Tamoxifen citrat, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfat, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erithropoietin, Hexamethylmelamine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (metil-GAG; metil glioksal bis-guanilhidrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoksikoformicin), Semustine (metil-CCNU), Teniposide (VM-26) i Vindesine sulfat, ali nije na njih ograničen.
Imunoterapeutski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od Ributaxin, Herceptin, Ouadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA, ali nije na njih ograničen.
Vakcina za kancer može biti izabrana iz grupe koja obuhvata EGF, Anti-idiotipske kancer vakcinu, Gp75 antigen, GMK melanom vakcinu, MGV konjugovanu gangliozidnu vakcinu, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, 0-Vax, L-Vax, STn-KHL theratope, BLP25 (MUC-1), lipozomalnu idiotipsku vakcinu, Melacine, vakcinu sa peptidnim antigenom, toksin/antigen vakcine, MVA-zasnovanu vakcinu, PACIS, BCG vakcinu, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus and lmmuCyst/TheraCys, ali nije na njih ograničen.
Upotreba CpG imunostimulatornih oligonukleotida zajedno sa imunoterapeutskim agensima kao što su monoklonalna antitela može povećati dugoročno preživljavanje kroz izvestan broj mehanizama uključujući značajno povećanje ADCC (kao što je razmatrano u prethodnom tekstu), aktivaciju ćelija prirodnih ubica (NK ćelija) i povećanje nivoa IFNa. Nukleinske kiseline kada se koriste zajedno sa monoklonalnim antitelima služe da smanje dozu antitela koja je potrebna da bi se postigao biološki rezultat.
Kao što je ovde korišćeno, termini "antigerr kancera" i "antigen tumora" su naizmenično korišćeni da bi označili antigene koje diferencijalno eksprimiraju kancerozne ćelije i koji se otuda mogu koristiti da bi se ciljale kancerozne ćelije. Antigeni kancera su antigeni koji mogu potencijalno da stimulišu verovatno tumor-specifične imune odgovore. Neki od ovih antigena su kodirani, iako nisu neophodno eksprimirani, od strane normalnih ćelija. Ovi antigeni se mogu okarakterisati kao oni antigeni koji su noramlno tihi (tj., nisu eksprimirani) kod normalnih ćelija, oni antigeni koji su eksprimirani samo u određenim stupnjevima diferencijacije i oni antigeni koji su privremeno eksprimirani kao embrionalni i fetalni antigeni. Ostale antigene kancera kodiraju mutantni ćelijski geni, kao što su onkogeni (npr., aktivirani ras onkogen), supresor geni (npr., mutant p53), fuzioni proteini nastali unutrašnjim delecijama ili hromozomskim translokacijama. Ostale antigene kancera mogu kodirati viralni antigeni kao što su oni koje nose RNK i DNK tumor virusi.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni za lečenje ili prevenciju autoimune bolesti. Autoimuna bolest je klasa bolesti kod koje sopstvena antitela subjekta reaguju sa tkivom domaćina ili kod koje su imune efektorne T ćelije autoreaktivne na endogene sopstvene peptide i izazivaju razaranje tkiva. Prema tome, imuni odgovor je usmeren na sopstvene antigene subjekta, koji se označavaju kao sopstveni antigeni. Autoimune bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, reumatoidni artritis, Kronovu bolest, multiplu sklerozu, sistemski lupus ervthematosus (SLE), autoimuni encefalomijelitis, mvasthenia gravis (MG), Hashimoto-ov tireoiditis, Goodpasture-ov sindrom, pemphigus (npr., pemphigus vulgaris), Grave-ovu bolest, autoimunu hemolitičku anemiju, autoimunu trombocitopeničnu purpuru, sklerodermu sa antikolagenim antitelima, kombinovanu bolest vezivnog tkiva, polimiozitis, perniciozna anemija, idiopatsku Addison-ovu bolest, sterilnost povezanu sa autoimunim poremećajem, glomerulonefritis (npr., srpasti glomerulonefritis, prol iterativni glomerulonefritis), bulozni pemfigus, Sjogren-ov sindrom, rezistenciju na insulin i autoimuni dijabetes melitus. "Sopstveni antigen" kao što je ovde korišćeno odnosi se na antigen normalnog tkiva domaćina. Normalno tkivo domaćina ne uključuje ćelije kancera. Stoga, imuni odgovor na sopstveni antigen, u kontekstu autoimune bolesti, predstavlja neželjeni imuni odgovor i doprinosi razaranju i oštećenju normalnog tkiva, pri čemu je imuni odgovor na antigen kancera poželjni imuni odgovor i doprinosi razaranju tumora ili kancera. Stoga, u nekim aspektima pronalaska koji su usmereni na lečenje autoimunih bolesti nije preporučljiva primena CpG imunostimulatornih nukleinskih kiselina sa sopstvenim antigenima, naročito onih koji su ciljne strukture u autoimunom poremećaju.
U drugim slučajevima CpG imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu primeniti sa malim dozama sopstvenih antigena. Određen broj studija na životinjama pokazao je da primena malih doza antigena na mukozu može dovesti do stanja imune hiperosteljivosti ili "tolerancije". Izgleda da je aktivni mehanizam citokin posredovana imuna devijacija od Th1 ka predominantno Th2 i Th3 (tj., TGF-B dominantnog) odgovora. Aktivna supresija sa malim dozama antigena takođe može potisnuti nevezani imuni odgovor (posredna supresija) koji je od značaja u terapiji autoimunih bolesti, npr., reumatoidnog artritisa i SLE. Posredna supresija uključuje sekreciju Th1-suprotno regulišućih, supresornih citokina u lokalnom okruženju gde su proinflamatorni i Th1 citokini oslobođeni na antigen specifični ili antigen nespecifični stimulus. "Tolerancija" kao što je ovde korišćena označava ovaj fenomen. Zaista, oralna tolerancija bila je efikasna u lečenju određenog broja autoimunih bolesti kod životinja uključujući : eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE), eksperimentalnu autoimunu mvasthenia gravis, kolagen-indukovani artritis (CIA) i insulin-zavisni dijabetes melitus. U ovim modelima prevencija i supresija autoimune bolesti povezana je sa pomeranjem u antigen specifičnim humoralnim i celularnim odgovorima od Th1 do Th2/Th3 odgovora.
Pronalazak takođe obuhvata postupak za indukovanje antigen ne-specifične urođene imune aktivacije i širokog spektra otpornosti na infektivnu imunizaciju korišćenjem CpG imunostimulatornih oligonukleotida. Termin antigen ne-specifična urođena imuna aktivacija kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na aktivaciju imunih ćelija, a da to nisu B ćelije i da je na primer moguće obuhvatiti aktivaciju NK ćelija, T ćelija ili ostalih imunih ćelija koje mogu da odgovore na antigen nezavistan način, ili neku kombinaciju ovih ćelija. Široki spektar otpornosti na infektivnu imunizaciju je indukovan zbog toga što su imune ćelije u aktivnom obliku i pripremljene su da odgovore na bilo koje invazivno jedinjenje ili mikroorganizam. Ćelije ne moraju biti specifično pripremljene na određeni antigen. Ovo je posebno korisno u biološkom ratu, kao i u ostalim situacijama koje su opisane u prethodnom tekstu, kao kod putovanja.
Pronalazak se takođe odnosi na oligonukleotide koji imaju hiralne internukleotidne veze. Kao što je opisano u prethodnom tekstu meki i polu-meki oligonukleotidi pronalaska mogu imati veze slične fosfodiestarskim između C i G. Jedan primer veze koja je slična fosfodiestarskoj je fosforotioatna veza u Rp konformaciji.
Najmanje jedna studija se bavila proučavanjem efekta p-hiraliteta na imunostimulatorne efekte CpG oligonukleotida. Yu et al., su poredili stereo-obogaćene (ne stereo-čiste) fosforotioatne (PS)-oligonukleotide na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju ćelija jetre (Yu et al., 2000). U toj studiji, nađeno je da 19-merna sekvenca koja sadrži jedan CpG motiv indukuje visok nivo proliferacije ćelija jetre kod miševa ukoliko je oligonukleotid sintetisan sa randomiziranim p-hiralitetom ili je obogaćen sa Sp internukleotidnim vezama, ali je proliferacija značajno smanjena ako je oligonukleotid obogaćen sa Rp internukleotidnim vezama (Yu et al., 2000). Međutim, ova studija se ne bavi proučavanjem specifične uloge p-hiralnosti na CpG dinukleotidu, niti određuje da li bi Rp CpG oligonukleotidi imali dejstvo u kratkotrajnim analizama stimulacije.
Na osnovu pronalaska je otkriveno da oligonukleotidna p-hiralnost može verovatno imati suprotne efekte na imuno dejstvo CpG oligonukleotida, u zavisnosti od vremenske tačke u kojoj se delovanje meri. U vremenu od 40 minuta, Rp, ali ne i Sp, stereoizomer fosforotioatnog CpG oligonukleotida indukuje JNK fosforilaciju u ćelijama jetre kod miša (razmatrano u primerima). Nasuprot tome, kada se analiza vrši kasnije u vremenu od 44 časa, Sp, ali ne i Rp, stereoizomer je aktivan u stimulaciji proliferacije ćelija jetre. Pokazali smo da ova razlika u kinetici i biodelovanju Rp i Sp stereoizomera nije rezultat razlika u ćelijskom usvajanju, već je verovatnije posledica dve suprotne biološke uloge p-hiralnosti. Prvo, pojačano delovanje Rp stereoizomera u poređenju sa Sp u stimulisanju imunih ćelija u ranijim vremenskim tačkama ukazuje na to da Rp može biti efikasniji u interakciji sa CpG receptorom, TLR9, ili indukciji nishodnih signalnih puteva. S druge strane, brže razlaganje Rp PS-oligonukleotida u poređenju sa Sp ima za rezultat mnogo kraće trajanje signalne aktivnosti, tako da izgleda da su Sp PS-oligonukleotidi biološki aktivniji kada se testiranje vrši u kasnijim vremenskim tačkama.
Pronalazak je u nekim aspektima zasnovan na novom pronalasku da je prethodno registrovan nedostatak imune stimulacije od strane Rp PS-oligonukleotida posledica samo njihove neotpornosti na nukleazu, a ne stvarne nesposobnosti da stimulišu CpG receptor i nishodne puteve. Kada se vrši testiranje na njegovu sposobnost stimulacije JNK fosforilacije, koja ukazuje na aktivaciju ovog mitogenom aktiviranog puta protein kinaze, izgleda da je Rp oligonukleotid najaktivniji, a posle njega odmah i stereo-randomizirani oligo, ali bez detektabilne aktivnosti Sp oligonukleotida. Međutim, kada su ovi oligonukleotidi upoređivani u odnosu na njihovu sposobnost aktiviranja NF-kB puteva, kao što se meri preko razgradnje inhibitornog proteina kB-a, svi CpG oligonukleotidi su bili aktivni, iako ne-CpG kontrola nije uspela da indukuje razgradnjuKB-a. Prema tome, Sp oligonukleotid je i dalje biološki aktivan. Njegov neuspeh da indukuje JNK put bi se mogao opovezati sa razlikama u kinetici aktivacije JNK i NF-kB puteva, ali kao posledica ograničenih količina stereo-specifičnog oligonukleotida koji je dostupan za testiranje nismo bili u mogućnosti da potvrdimo ovu hipotezu.
Eksperimenti opisani u Primerima otkrivaju iznenađujuće snažan efekat p-hiralnosti na samom CpG dinukleotidu. U poređenju sa stereo-randomiziranim CpG oligonukleotidom, srodni oligonukleotid u kome je jedan CpG dinukleotid vezan u Rp je malo aktivniji, dok je srodni oligonukleotid koji sadrži Sp vezu bio skoro neaktivan u indukciji proliferacije ćelija jetre. Gubitak aktivnosti Sp srodnog oligonukleotida je u saglasnosti sa našom hipotezom da TLR9 receptor ne mora biti indiferentan prema hiralnosti CpG dinukleotida u DNK sa kojom interaguje, ali se može bolje stimulisati Rp stereoizomerom. Prema tome, stimulatorni efekat stereo-randomiziranog oligo verovatno nije posledica samo prisustva 50% Sp veza koje zaustavljaju razgradnju, već takođe i činjenice da će polovina oligo molekula imati Rp hiralnost na CpG dinukleotidu, što čini se povećava imunostimulatorne efekte.
Osetljivost Rp PS veza na nukleazu ima važne implikacije za interpretaciju farmakokinetičkih (PK) i metaboličkih studija PS-oligonukleotida kod ljudi ili životinja. Poznato je da je predominanta aktivnost serum nukleaze 3' egzonukleaza. U tipičnom stereo-randomiziranom PS-oligo rastvoru očekuje se da je poslednja 3' internukleotidna veza Rp hiralnosti kod jedne polovine molekula. Prema tome kod ovih 50% PS-oligo molekula, terminalna 3' baza će se otcepiti prilično brzo posle intravenozne infuzije. Druga internukleotidna veza sa 3' kraja bi trebalo da je Rp hiralnosti kod jedne polovine ovih molekula i prema tome kod 25% početnih PS-Oligo molekula može se očekivati da 3' kraj bude realtivno brzo skraćen za 2 baze. Može se očekivati da se ovajin vivoproces odsecanja baza koji obuhvata 3' Rp internukleotidne veze nastavlja sve dok 3' internukleotidna veza nije Sp konfiguracije. Prema tome, ako su PS-oligonukleotidi sintetisani tako da imaju Sp 3' terminalnu vezu, onda bi trebalo da imaju mnogo sporiju razgradnju i različit PK profil u poređenju sa stereo-randomiziranim PS-oligonukleotidima. Ovo bi trebalo da omogući upotrebu nešto kraćih oligonukleotida zain vivoprimene. Kod dizajniranja optimizovanih oligonukleotida za antisens primene, pojačano RNK vezivanje Rp stereoizomera ukazuje na preferenciju ka Rp konfiguraciji unutrašnjeg jezgra oligonukleotida u što je većem mogućem stepenu. S druge strane, optimizovani CpG oligonukleotid za imunostimulatorne primene može biti onaj kod koga će sve internukleotidne veze osim CpG biti Sp hiralnosti.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu direktno primeniti na subjekta ili se mogu primeniti zajedno sa kompleksom za dostavljanje nukleinske kiseline. Kompleks za dostavljanje nukleinske kiseline će označavati molekul nukleinske kiseline spojen sa (npr., jonskom ili kovalnentnom vezom za; ili inkapsuliran unutar) sredstvima za ciljanu upotrebu (npr. molekul koji rezultuju u većem afinitetu vezivanja za ciljnu ćeliju. Primeri kompleksa za dostavljanje nukleinske kiseline obuhvataju nukleinske kiseline povezane sa sterolom (npr. holesterol), lipidom (npr. katjonski lipid, virozom ili lipozom), ili vezujućim agensom specifičnim za target ćeliju (npr. ligand koji prepoznaje receptor specifičan za target ćeliju). Poželjni kompleksi mogu biti dovoljno stabilniin vivoda bi sprečili značajno razdvajanje pre internalizacije od strane target ćelije. Međutim, kompleks se može razgraditi pod odgovarajućim uslovima unutar ćelije, tako da se nukleinska kiselina oslobađa u funkcionalnom obliku.
Opisani su prenosioci za dostavljanje ili sistemi za dostavljanje za dopremanje antigena i oligonukleotida do određenih površina. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i/ili antigen i/ili ostali terapeutici se mogu primeniti sami (npr., u slanom rastvoru ili puferu) ili korišćenjem bilo kojih prenosioca za dostavljanje poznatih u tehnici. Na primer, opisani su sledeći prenosioci za dostavljanje: kohleati (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); emulzozomi (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); lipozomi (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); živi bakterijski vektori
(npr.,Salmonella, Escherichia coli, Bacilus calmatte- guerin, Shigella, Lactobacillus)
(Hone et al., 1996, Pouvvels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); živi viralni vektori (npr., Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex)
(Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrovv et al., 1999); mikrosfere (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); vakcine nukleinskih kiselina (Fynan et I., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); polimeri (npr. karboksimetilceluloze, hitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); polimerni prstenovi (Wyatt et al., 1998); proteozomi (Vancott et al., 1998, Lovvell et al., 1988, 1996, 1997); natrijumfluorid (Hashi et al., 1998); transgene biljke (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virozomi (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); partikule slične virusu (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Ostali prenosioci za dostavljanje su poznati u tehnici, a u daljem tekstu u kome se razmatraju vektori dati su neki dodatni primeri.
Termin efektivna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida se odnosi na količinu koja je neophodna ili dovoljna da bi se postigao željeni biološki efekat. Na primer, efikasna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida primenjena sa antigenom za indukovanje mukoznog imuniteta je količina koja je neophodna da bi se izazvao razvoj IgA kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu, s obzirom da je količina potrebna za izazivanje sistemskog imuniteta ona količina koja je neophodna da bi se izazvao IgG kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu. Zajedno sa razmatranjima koja su ovde data, biranjem među različitim aktivnim jedinjenjima i merljivim faktorima kao što su potencijal, relativna biodostupnost, telesna težina pacijenta, jačina štetnih sporednih efekata i poželjan način primene, može se planirati efikasan profilaktički ili terapeutski režim tretiranja koji ne izaziva značajnu toksičnost, a još je u potpunosti efikasan u lečenju određenog subjekta. Efikasna količina za bilo koju određenu primenu može varirati u zavisnosti od takvih faktora kao što su bolest ili stanje koje se tretira, određenog CpG imunostimulatornog oligonukleotida koji se primenjuje, veličina subjekta, ili težina bolesti ili stanja. Stručnjak može empirijski odrediti efikasnu količinu određenog CpG imunostimulatornog oligonukleotida i/ili antigena i/ili nekog drugog terapeutskog agensa bez potrebe za suvišnim eksperimentisanjem.
Doze jedinjenja za primenu na subjekta koja su ovde opisana za mukozno ili lokalno dostavljanje se u tipičnom slučaju kreću u opsegu od oko 0.1\ xgdo 10 mg po primeni, što zavisi od toga da li je moguće primenu izvršiti jednom dnevno, jednom nedeljno, ili jednom mesečno ili u nekom drugom vremenskom periodu između. Tipičnije, mukozne ili lokalne doze se kreću u opsegu od oko 10 ng do 5 mg po primeni, a najtipičnije od oko 100 (ig do 1 mg, sa 2-4 primene između kojih je vremenski period od nekoliko dana ili sedmica. Tipičnije, doze imunostimulanta se kreću u opsegu od oko 1 |xg do 10 mg po primeni, a najtipičnije 10 |ag do 1 mg, sa primenama jednom dnevno ili jednom nedeljno. Doze jedinjenja za primenu na subjekta koja su ovde opisana za parenteralnu dostavu u svrhu izazivanja antigen-specifičnog imunog odgovora, gde su jedinjenja dostavljena sa antigenom, ali ne i sa drugim terapeutskim agensom, su u tipičnom slučaju 5 do 10,000 puta više od efikasne mukozne doze za adjuvant vakcine ili primene imunostimulanta, a tipičnijelO do 1,000 puta više, a natipičnije 20 do 100 puta više. Doze jedinjenja koja su ovde opisana za parenteralnu dostavu u svrhu izazivanja urođenog imunog odgovora ili za povećanje ADCC ili za izazivanje antigen specifičnog imunog odgovora kada su imunostimulatorne nukleinske kiseline primenjene zajedno sa ostalim terapeutskim agensima ili u specijalnim prenosiocima za dostavu se tipično kreću u opsegu od oko 0.1^g do 10 mg po primeni, što zavisi od toga da li se primena daje dnevno, sedmično, ili mesečno ili u bilo kom vremenskom periodu između. Tipičnije, parenteralne doze za ove svrhe se kreću u opsegu od oko 10\ xgdo 5 mg po primeni, a najtipičnije od oko 100^g do 1 mg, sa 2-4 primene između kojih je period od nekoliko dana ili nedelja. U nekim oblicima, međutim, parenteralne doze za ove svrhe se mogu koristiti u opsegu od 5 do 10,000 puta višim od tipičnih doza koje su opisane u prethodnom tekstu.
Za bilo koje jedinjenje koje je ovde opisano moguće je inicijalno odrediti efikasnu količinu na osnovu animalnog modela. Terapeutski efikasna doza se takođe može primeniti iz podataka dobijenih za CpG oligonukleotide koji su testirani kod ljudi (započeta su humana klinička ispitivanja) i za jedinjenja za koje je poznato da pokazuju slične farmakološke aktivnosti, kao što su ostali adjuvanti, npr., LT i ostali antigeni u svrhu vakcinisanja. Za parenteralnu primenu potrebne su više doze. Primenjena doza se može podesiti na osnovu relativne jačine primenjenog jedinjenja. Podešavanje doze da bi se postigla maksimalna efikasnost na osnovu postupaka koji su opisani u prethodnom tekstu i ostalih postupaka koji su u tehnici već rutinski, dobro su poznati stručnjacima.
Formulacije pronalaska su primenjene u farmaceutski prihvatljivim rastvorima, koji mogu obično da sadrže farmaceutski prihvatljive koncentracije soli, puferujućih agenasa, zaštitnih supstanci, kompatibilnih nosača, adjuvanata i opciono ostalih terapeutskih sastojaka.
Za korišćenje u lečenju, efikasna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida se može primeniti na subjekta bilo kojim načinom koji dostavlja oligonukleotid željenoj površini, npr., mukozno, sistemski. Primena farmaceutske kompozicije datog pronalaska se može postići bilo kojim sredstvima poznatim stručnjacima. Poželjni putevi primene obuhvataju, ali nisu ograničeni na oralno, parenteralno, intramuskularno, intranazalno, intratrahealno, inhalacijom, okularno, vaginalno i rektalno.
Za oralnu primenu, jedinjenja (tj., CpG imunostimulatorni oligonukleotidi, antigeni i ostali terapeutski agensi) se mogu lako formulisati spajanjem aktivnog jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim nosačima dobro poznatim u tehnici. Takvi nosači omogućavaju jedinjenjima pronalaska da se formulišu kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, taloži, suspenzije i tome slično, za oralno uzimanje od strane subjekta koji se tretira. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu se mogu dobiti kao čvrsti inertni punioc, opciono mlevenjem dobijene smeše i obrađivanjem smeše granula, posle dodavanja odgovarajućih pomoćnih sredstava, ukoliko se želi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Pogodni inertni punioci su, posebno, punioci kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol, ili sorbitol; celulozni preparati kao što su kukurzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob, krompirov škrob, želatin, tragakant guma, metilceluloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijumkarboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP). Ako se želi, moguće je dodati dezintegrante, kao što su unakrsno vezani polivinilpirolidon, agar, ili alginska ksielina ili njena so kao što je natrijumalginat. Opciono oralne formulacije se takođe mogu formulisati u slanom rastvoru ili puferima, tj., EDTA za neutralizovanje unutrašnjih kiselih uslova, ili se mogu primeniti bez bilo kog nosača.
Posebno su razmatrani oralni oblici dozaže komponente ili komponenata iz prethodnog teksta. Komponenta ili komponente se mogu hemijski modifikovati tako da oralna primena derivata bude efikasna. Uopšteno, razmatrana hemijska modifikacija je veza najmanje jedne grupe za sam molekul komponente, gde pomenuta grupa omogućava (a) inhibiciju proteolize; i (b) prenos u krvni sistem iz želudca ili creva. Takođe je poželjno povećanje opšte stabilnosti komponente ili komponenata i povećanje vremena u cirkulaciji u telu. Primeri takvih grupa obuhvataju: polietilenglikol, kopolimere etilenglikola i propilenglikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinilalkohol, polivinilpirolidon i poliprolin. Abuchowski and Daviš, 1981, "Soluble Polvmer-Enzime Adducts" u:Enzymes as Drugs,Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Nevvmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Drugi polimeri koji se mogu upotrebiti su poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksan. Poželjni za farmaceutsku upotrebu, kao što je naznačeno u prethodnom tekstu, su polietilenglikolne grupe.
Za komponentu (ili derivat) mesto oslobađanja može biti želudac, tanko crevo (duodenum, jejunum, ili ileum), ili debelo crevo. Tehničar ima dostupne formulacije koje se neće rastvoriti u želudcu, već će se materijal rastvoriti u debelom crevu ili na nekom drugom mestu u crevima. Poželjno, oslobađanje će izbeći štetne efekte želudačne sredine, bilo zaštitom oligonukleotida (ili derivata) ili oslobađanjem biološki aktivnog materijala izvan želudačne sredine, kao na primer u crevima.
Da bi se osigurala otpornost na želudačnu sredinu najvažniji je omotač koji je nepropustljiv najmanje na pH 5.0. Primeri uobičajenih sastojaka koji se koriste kao enterički omotači su celulozaacetattrimelitat (CAT), hidroksipropilmetilcelulozaftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinilacetatftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celulozaacetatftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S i Shellac. Ovi omotači se mogu koristiti kao pomešani filmovi.
Omotač ili smeša omotača se takođe može koristiti na tabletama, koji nisu namenjeni za zaštitu protiv želudačne sredine. Oni mogu da obuhvataju šećerne omotače, ili omotače koji olakšavaju gutanje tableta. Kapsule se mogu sastojati od tvrdog omotača (kao što je želatin) za primenu suvog terapeutika, tj., praška; za tečne oblike se može koristiti mekani želatinski omotač. Materijal omotača za pljosnate kapsule može biti gust škrob ili drugi jestivi papir. Za pilule, lozenge, kalupljene tablete ili mlevene tablete mogu se koristiti tehnike vlažnog zgušnjavanja.
Terapeutik se može uvrstiti u formulaciju kao fini multi-partikularni u obliku granula ili kuglica, veličine čestica od oko 1 mm. Formulacija materijala za primenu kapsula takođe može biti u obliku praška, slabo kompresovanih čepića ili čak u obliku
tableta. Terapeutik se može pripremiti kompresijom.
Takođe se mogu uključiti agensi za bojenje i aromatizeri. Na primer, oligonukleotid (ili derivat) se može formulisati (kao što je inkapsuliranjem u lipozom ili mikrosferu) i zatim se može dodatno uskladištiti unutar jestivog proizvoda, kao što su hlađeni napici koji sadrže agense za bojenje i aromatizere.
Moguće je da se terapeutik razblaži ili da mu se poveća zapremina sa inertnim materijalom. Ovi razblaživači mogu obuhvatati ugljene hidrate, posebno manitol, a-laktozu, anhidrovanu laktozu, celulozu, saharozu, modifikovane dekstrane i škrob. Određene neorganske soli se takođe mogu upotrebiti kao punioci uključujući kalcijumtrifosfat, magnezijumkarbonat i natrijumhlorid. Neki komercijalno dostupni razblaživači su Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.
Dezintegrant takođe može biti uključen u formulaciju terapeutika u čvrstom obliku dozaže. Materijali koji su upotrebljeni kao dezintegratori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, skorb, uključujući komercijalni dezintegrator zasnovan na škrobu, Explotab. Natrijumskrobglikolat, Amberlite, natrijumkarboksimetilceluloza, ultramilopektin, natrijumalginat, želatin, kora narandže, kisela karboksimetilceluloza, prirodni sunđer i bentonit se mogu koristiti. Drugi oblik dezintegratora su nerastvorljive katjonsko izmeljivačke smole. Smole u prahu se mogu koristiti kao dezintegratori i kao vezujuća sredstva i mogu obuhvatati smole u prahu kao što su agar, Karava ili tragant. Alginska kiselina i njena natrijumova so su takođe korisni kao dezintegratori. - Vezujuća sredstva se mogu koristiti da bi erapeutski agens bio kompaktan za formiranje tvrde tablete i obuhvataju materijale iz prirodnih proizvoda kao što su akacija,'tragant, škrob i želatin. Drugi obuhvataju metilcelulozu (MC), etilcelulozu (EC) i karboksimetilcelulozu (CMC). I polivinilpirolidon (PVP) i hidroksipropilmetilceluloza (HPMC) se mogu koristiti u alkoholnim rastvorima da bi se terapeutik granulisao.
Anti-frikcioni agens može biti uključen u formulaciju terapeutika da bi se sprečilo lepljenje u toku procesa formulacije. Lubrikanti se mogu koristiti kao sloj između tearpeutika i zida posude i mogu uključiti, ali nisu ograničeni na, stearinsku kiselinu uključujući njene soli sa magnezijumom i kalcijumom, politetrafluoroetilen (PTFE), tečni parafin, biljna ulja i voskove. Rastvorljivi lubrikanti se takođe mogu koristiti kao što je natrijumlaurilsulfat, magnezijumlaurilsulfat, polietilenglikol različitih molekulskih težina, Carbowax 4000 i 6000.
Mogu se dodati klizajuća sredstva koja mogu poboljšati protočne karakteristike leka tokom formulacije i pomoći rearanžmanu tokom kompresije. Klizajuća sredstva mogu uključivati škrob, talk, pirogeni silicijum dioksid i hidratisani silicijum aluminat.
Da bi se potpomoglo rastvaranje terapeutika u vodenoj sredini kao sredstvo za vlaženje se može dodati površinski aktivno sredstvo. Surfaktanti mogu uključivati anjonske deterdžente, kao što su natrijumlaurilsulfat, dioktilnatrijumsulfosukcinat i dioktilnatrijumsulfonat. Mogu se koristiti katjonski deterdženti koji mogu obuhvatati benzalkonijumhloride ili benztomijumhloride. Spisak potencijalnih nejonskih deterdženata koji se mogu uključiti u formulaciju kao površinski aktivna sredstva su lauromacrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerolmonostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, saharozni estar masne kiseline, metilceluloza i karboksimetilceluloza. Ovi surfaktanti mogu biti prisutni u obliku oligonukleotida ili derivata bilo pojedinačno ili kao smeša u različitim proporcijama.
Farmaceutske preparacije koje se mogu koristiti oralno uključuju kapsule od želatina, kao i mekane, zatvorene kapsule od želatina i plastifikatora, kao što je glicerol ili sorbitol. Kapsule mogu sadržati aktivni sastojak u smeši sa puniocem kao što je laktoza, vezujućim sredstvima kao što su škrobovi, i/ili lubrikantima kao što su talk ili magnezijumstearat i izborno stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovcana u odogvarajućim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin ili tečni polietilenglikoli. Dodatno, mogu se dodati stabilizatori. Takođe se mogu koristiti mikrosfere formulisane za oralnu primenu. Takve mikrosfere su dobro definisane u tehnici. Sve formulacije za oralnu primenu bi trebalo da budu u pogodnim dozama za takvu primenu.
Za bukalnu primenu kompozicije mogu biti u obliku tableta ili lozengi formulisanih na konvencionalan način.
Za primenu inhalacijom jedinjenja koja se koriste prema pronalasku mogu se konvencionalno primeniti u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz korišćenje pogodnog propelenta, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljendioksid ili drugi pogodni gas. U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica se može odrediti obezbeđivanjem ventila za primenu određene količine. Kapsule i kertridži od npr. želatina za korišćenje u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže praškastu smešu jedinjenja i pogodnu praškastu osnovu kao što je laktoza ili škrob.
Ovde je takođe predviđena primena nukleotida (ili njihovih derivata) na plućni sistem. Oligonukleotid (ili derivat) primenjuje se na pluća sisara prilikom inhalacije i prolazi kroz epitelnu membranu pluća u krvotok. Drugi radovi o inhaliranim molekulima uključuju Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (leuprolidacetat); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacologv, 13(suppl. 5):143-146 (endotelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. IM, pp. 206-212 (a1-antitripsin); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-1-proteinaza); Osvvein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Svmposium on Respiratorv Drug Deliverv II, Kevstone, Colorado, March, (rekombinanti humani hormon rasta); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (interferon-g i alfa faktor nekroze tumora) i Platz et al., U.S. Patent No. 5,284,656 (faktor stimulacije kolonija granulocita). Postupak i kompozicija za plućnu primenu lekova za sistemski efekat su opisani u U.S. Patent No. 5,451,569, objavljen 19. septembra 1995 od strane Wong et al.
Za korišćenje pronalaska u praksi predviđen je širok spektar mehaničkih uređaja za primenu terapeutskih proizvoda na pluća, uključujući, ali ne ogranilavajući se na nebulizatore, inhalatore sa određenom dozom, koji su svi poznati stručnim licima.
Neki specifični primeri komercijalno dostupnih uređaja pogodnih za praktičnu primenu pronalaska su Ultravenz nebulizator, proizveden od strane Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri: Acom II nebulizator proizveden od strane Marquest Medical Products, Englevvood, Colorado: Ventolin dozni inhalator, proizveden od strane Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i Spinhaler inhalator za prašak, proizveden od strane Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Svi takvi uređaji zahtevaju korišćenje formulacija pogodnih za disperziju oligonukleotida (ili njihovih derivata). U tipičnom slučaju, svaka formulacija je specifična za tip korišćenog uređaja i može uključivati korišćenje odgovarajućeg propelentnog materijala, kao dodatka uobičajenim razređivačima, adjuvantima i/ili nosačima korisnim u terapiji. Predviđeno je takođe korišćenje lipozoma, mikrokapsula i mikrosfera, inkluzionih kompleksa ili drugih tipova nosača. Hemijski modifikovani oligonukleotid se takođe može pripremiti u različitim formulacijama u zavisnosti od tipa hemijske modifikacije ili tipa upotrebljenog uređaja.
Formulacije pogodne za korišćenje sa nebulizatorom, bilo jet ili ultrazvučnim, u tipičnom slučaju bi sadržale oligonukleotide (ili derivate) rastvorene u vodi u koncentraciji od oko 0.1 do 0.25 mg biološki aktivnog oligonukleotida po ml rastvora. Formulacije takođe mogu sadržati i pufer i prost šećer (npr., za stabilizaciju oligonukleotida i regulaciju osmotskog pritiska). Formulacija za primenu u nebulizatoru takođe može sadržati površinski aktivno sredstvo za smanjenje ili sprečavanje površinski indukovane agregacije oligonukleotida izazvane atomizacijom rastvora prilikom pripremanja aerosola.
Formulacije za korišćenje sa doznim inhalatorom bi u opštem slučaju obuhvatale fini prašak koji sadrži oligonukleotide (ili derivate) suspendovan u propelentu uz pomoć površinski aktivnog sredstva. Propelent može biti bilo koji konvencionalni materijal upotrebljen za ovu svrhu, kao što je hlorofluorougljovodonik, hidrofluorougljovodonik ili ugljovodonik, uključujući trifluorometan, dihlordifluorometan, dihlortetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, ili njihove kombinacije. Pogodna površinski aktivna sredstva uključuju sorbitan trioleat i lecitin soje. Oleinska kiselina takođe može biti korisna kao surfaktant.
Formulacije za primenu u inhalatoru sa praškom bi obuhvatale fini suvi prašak koji sadrži oligonukleotide (ili derivate) i takođe može uključiti agens koji povećava masu, kao što je laktoza, sorbitol, saharoza, ili manitol u količinama koje olakšavaju disperziju praška iz uređaja, npr., 50 do 90% po težini formulacije. Oligonukleotid (ili derivat) bi pogodno bio pripremljen u čestičnom obliku, sa prosečnom veličinom čestice manje od 10 mm (ili mikrona), najpogodnije 0.5 do 5 mm, za najefikasniju primenu na distalne delove pluća.
Predviđena je takođe nazalna primena farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Nazalna primena omogućava direktan prolaz farmaceutske kompozicije pronalaska u krvotok odmah nakon primene na nos, bez potrebe da se proizvod deponuje u plućima. Formulacije za nazalnu primenu uključuju one sa dekstranom ili ciklodekstranom.
Za nazalnu primenu, koristan uređaj je mala boca od tvrdog materijala na koju je montiran mehanizam za raspršivanje određene doze formulacije. U jednom obliku, određena doza je primenjena putem uvlačenja rastvora farmaceutske kompozicije pronalaska u komoru definisane zapremine koja poseduje apreturu dimenzioniranu da pretvori u aerosol formulaciju stvaranjem spreja kada je tečnost u komori pod pritiskom. Komora je pod pritiskom da bi se primenila farmaceutska kompozicija pronalaska. U specifičnom obliku, komora je organizovana kao ventil. Takvi uređaji su komercijalno dostupni.
Alternativno, može se koristiti plastična boca sa apreturom ili otvorom dimenzioniranim da u aerosol pretvori aerosol formulaciju putem formiranja spreja po pritiskanju. Otvor se najčešće nalazi na vrhu boce, koji je u opštem slučaju zašiljen da bi se mogao smestiti u nosnu duplju za efikasnu primenu aerosolne formulacije. Poželjno, nazalni inhalator bi obezbeđivao doznu primenu aerosolne formulacije za administraciju određene doze leka.
Kada je poželjno da se primenjuju sistemski jedinjenja se mogu formulisati za parenteralnu primenu injektiranjem, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekciju mogu biti u jediničnim oblicima dozaže, npr., u ampulama ili u više-doznim kontejnerima, sa dodatim zaštitnim sredstvom. Kompozicije mogu biti u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u ulju ili vodenim nosačima i mogu sadržati formulišuće agense kao što su suspendujući, stabilizujući i/ili disperzujući agensi.
Farmaceutske formulacije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji je rastvorljiv u vodi. Pored toga, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripremiti kao odgovarajuće uljane suspenzije za injekciju. Pogodni lipofilni rastvarači ili prenosioci obuhvataju masna ulja kao što je sezamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etiloleat ili trigliceridi, ili lipozomi. Vodene suspenzije za injekciju mogu sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijumkarboksimetilceluloza, sorbitol ili dekstran. Izborno, suspenzija može takođe sadržati pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi se omogućilo pripremanje visoko koncentrovanih rastvora.
Alternativno, aktivna jedinjenja mogu biti u obliku praška za pripremanje sa pogodnim prenosiocem, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.
Jedinjenja mogu takođe biti formulisana u rektalnim ili vaginalnim kompozicijama kao što su supozitorije ili retencioni klistiri, npr., mogu sadržati konvencionalne osnove supozitorija kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.
Pored formulacija koje su opisane u prethodnom tekstu, jedinjenja se takođe mogu formulisati kao depo preparati. Takve formulacije sa dugotrajnim delovanjem mogu se formulisati sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili sa jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati pogodne nosače ili inertne punioce u čvrstoj ili gel fazi. Primeri takvih nosača ili inertnih punilaca obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kalcijumkarbonat, kalcijumfosfat, različite šećere, škrobove, derivate celuloze, želatin i polimere kao što su polietilenglikoli.
Pogodni tečni ili čvrsti oblici farmaceutskih preparata su, na primer, vodeni ili slani rastvori za inhalaciju, mikroinkapsulirani, inkohleirani, kao omotač mikroskopskih zlatnih partikula, sadržani u lipozomima, nebulizovani, aerosoli, granule za implantaciju u kožu, ili sušeni na oštrom objektu za primenu na kožu. Farmaceutske kompozicije takođe obuhvataju granule, praškove, tablete, tablete sa omotačem, (mikro)kapsule, supozitorije, sirupe, emulzije, suspenzije, kreme, kapi ili preparate sa produženim oslobađanjem aktivnih jedinjenja, pri čijem se pripremanju uobičajeno koriste, kao što je opisano u prethodnom tekstu, inertni punioci i aditivi i/ili pomoćna sredstva kao što su dezintegratori, vezujuća sredstva, agensi za oblaganje, agensi za bubrenje, lubrikanti, aromati, zaslađivači ili rastvarači. Farmaceutske kompozicije su pogodne za upotrebu u različitim sistemimima za dostavljanje leka. Za kratak pregled postupaka za dostavu leka, pogeldati Langer,Science249:1527-1533, 1990, što je ovde uvršćeno referencom.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i izborno ostali terapeutici i/ili antigeni se mogu primenitiper se(čisto) ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Kada se koriste u medicini soli bi trebalo da budu faramaceutski prihvatljive, ali se farmaceutski neprihvatljive soli mogu konvencionalno upotrebiti za pripremanje njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Takve soli obuhvataju, ali nisu ograničene na, one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, p-toluensulfo kiseline, vinske, limunske, metansulfo, mravlje, malonske, ćilibarne, naftalen-2-sulfo i benzensulfo kiseline. Takođe, takve soli se mogu pripremiti kao soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove, kalijumove ili kalcijumove soli karboksilne kiseline.
Pogodni puferujući agensi obuhvataju: sirćetnu kiselinu i so (1-2% w/v); limunsku kiselinu i so (1-3% w/v); bornu kiselinu i so (0.5-2.5% w/v); i fosfornu kiselinu i so (0.8-2% w/v). Pogodna zaštitna sredstva obuhvataju bezalkonijumhlorid (0.003-0.03% w/v); hlorobutanol (0.3-0.9% w/v); parabene (0.01-0.25% w/v) i timerozal (0.004-0.02% w/v).
Farmaceutske kompozicije pronalaska sadrže efikasnu količinu CpG imunostimulatornog oligonukleotida i izborno antigena i/ili ostalih terapeustkih agenasa izborno uključenih u farmaceutski prihvatljiv nosač. Termin farmaceutski prihvatljiv nosač označava jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci koje su pogodne za primenu na ljude ili ostale kičmenjake. Termin nosač označava organski ili neorganski sastojak, prirodni ili sintetički, sa kojim je spojen aktivan sastojak da bi se olakšala primena. Sastavni delovi farmaceutskih kompozicija su takođe sposobni da se pomešaju sa jedinjenjima datog pronalaska i jedni sa drugima, na takav način da se ne javlja interakcija koja bi značajno uticala na željenu farmaceutsku efikasnost.
Dati pronalazak je dalje ilustrovan sledećim Primerima, koje ne bi trebalo shvatati kao dodatno ograničavajuće. Celokupan sadržaj svih referenci (uključujući literaturne reference, publikovane patente, objavljene prijave patenata i prijave patenata koje su istovremeno u postupku) citiranih kroz ovu prijavu su ovim eksplicitno uvršćene referencom.
PRIMERI
Materijal i metode:
Oligodezoksinukleotidi(ODN)
Svi ODN su kupljeni u biospring (Frankfurt, Germanv) ili Sigma-Ark (Darmstadt, Germanv) i kontrolisani na identičnost i čistoću u Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Germany). ODN su razblaženi u fosfatno puferovanom slanom rastvoru (Sigma, Germanv) i čuvani na -20°C. Sva razblaženja su pripremljena korišćenjem reagenasa bez pirogena.
Prečišćavanje ćelija
Preparati periferne krvi su dobijeni od zdravih muškaraca i žena iz Blood Bank of the University of Dusseldorf (Germanv) i od njih su PBMC prečišćene centrifugiranjem preko Ficoll-Hypaque (Sigma). Prečišćene PBMC su ili upotrebljene sveže (za većinu analiza) ili su suspendovane u ledeni mediju, i čuvane na -70°C. Kada je potrebno, alikvote ovih ćelija su otopljene, ispirane i resuspendovane u RPMI 1640 podlozi (BiovVhittaker, Belgium) i dodat im je 5% (v/v) humani AB serum koji je inaktiviran toplotom (BioVVhittaker, Belgium) ili 10% (v/v) FCS koji je inaktiviran toplotom, 2mM L-glutamin (BioVVittaker), 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina (Invitrogen (Karlsruhe, Germany)).
Detekcija citokina
Otopljene ili sveže PBMC su zasejane na 48-komorne ploče sa ravnim dnom, ili 96-komorne ploče sa okruglim dnom i inkubirane su sa ODN u koncentracijama koje su naznačene u ovlaženom inkubatoru na 37°C. Supernatanti kultura su sakupljeni i ukoliko nisu odmah iskorišćeni, zamrzavaju se na -20°C do upotrebe. Količine citokina u supernatantima su procenjene korišćenjem komercijalno dostupnih ELISA Kitova (Diaclone, USA) ili „in-house" ELISA koje su razvijene korišćenjem komercijalno-dostupnih antitela (iz Becton Dickinson/Pharmingen ili PBL).
Kulture za analizu aktivacije NK ćelija protočnom citometrijom
Monoklonalna antitela fluorhromom konjugovana sa CD3 (T ćelijski marker), CD56 (NK ćelijski marker) i CD69 (marker rane aktivacije na NK ćelijama i T ćelijama) su nabavljeni u Becton Dickinson. PBMC su inkubirane 24 časa sa ili bez dodavanja različitih koncentracija ODN u 96-komorne ploče sa okruglim dnom. Protočnom citometrijom NK ćelije su identifikovane kao CD56-pozitivne i CD3-negativne ćelije. Podaci protočne citometrije su dobijeni na FACSalibur (Becton Dickinson). Podaci su analizirani korišćenjem komjuterskog programa Cellquest (Becton Dickinson).
Analize aktivacionih markera ćelijske površine protočnom citometrijom
Za merenje ekspresije ko-stimulatornog molekula CD86 kao aktivacionog markera na B ćelijama, PBMC su inkubirane 48 časova sa ODN u naznačenim koncentracijama i ćelije su bojene sa mAb za CD19 i CD86 (Pharmingen, Germanv). CD86 ekspresija na CD19 pozitivnim B ćelijama je merena protočnom citometrijom.
Za merenje ekspresije ko-stimulatornog molekula CD80 kao aktivacionog markera na monocitima, PBMC su inkubirane 48 časova sa ODN u naznačenim koncentracijama i ćelije su bojene sa mAb za CD14, CD19 i CD80 (Pharmingen, Germanv). CD80 ekspresija na CD 14 pozitivnim i CD 19 negativnim monocitima je merena protočnom citometrijom. Rezultati oba merenja su data kao Mean Fluorescence Intensitv - srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI).
Primer 1:
Na Slikama 1-5 su prikazani nivoi interferona-alfa (IFN-a), IFN-y, IL-10, IL-6 i TNF-a koje izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja CpG oligonukleotidima koji su ovde opisani. Ispitivani test oligonukleotidi su prikazani na slikama sa A. Oligonukleotid koji služi kao pozitivni kontrolni oligonukleotid je označen sa ■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slikama 1A, 2A, 3A, 4A i 5A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324. Test oligonukleotidi prikazani na Slikama 1B, 2B, 3B, 4B i 5B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM). Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo citokina izlučen od strane ćelija koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum) i u nekim slučajevima sa LPS.
Kao što je prikazanao na Slikama 1-5 oligonukleotidi testirani u analizama su sposobni da proizvedu izlučivanje citokina u približno istom ili većem nivou od pozitivnih kontrolnih oligonukleotida koji imaju potpuno fosforotioatni osnovni lanac. Negativna kontrola je izazvala proizvodnju značajno manje citokina.
Primer 2:
Ispitivani su nivoi CD69 ekspresije (MFI) na NK ćelijama kao odgovor na tretman sa test oligonukleotidima nasuprot kontrolnih oligonukleotida. CD69 ekspresija je indikator aktivacije T ćelija i NK ćelija. Ćelije su bile izložene test oligonukleotidima koji su prikazani na Slici 6 sa A naspram pozitivne oligonukleotidne kontrole označene sa
■. Test oligonukleotidi koji su prikazani na Slici 6A obuhvataju SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324. Test oligonukleotidi prikazani na Slici 6B obuhvataju SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Pozitivna oligonukleotidna kontrola koja je upotrebljena u ovim studijama je SEQ ID NO: 329. Ispod grafikona je za svaki eksperiment prikazan nivo CD69 ekspresije na T i NK ćelijama koje su tretirane sa negativnom kontrolom (medijum) i sa LPS.
Kao što je prikazano na Slici 6 oligonukleotidi testirani u analizama su bili sposobni da indukuju ekspresiju CD69 u približno istom ili na višem nivou od oligonukleotida pozitivne kontrole koji imaju u potpunosti fosforotioatni osnovni lanac. Negativna kontrola je izazvala proizvodnju značajno manje CD69.
Primer 3:
Na Slikama 7-12 i 17 su prikazani nivoi interferona-alfa (IFN-a) i IL-10 koje izlučuju humane PBMC posle njihovog izlaganja CpG oligonukleotidima koji su ovde opisani. Ispitivani test oligonukleotidi su prikazani na slikama sa ■. Oligonukleotid koji služi kao- pozitivni kontrolni oligonukleotid SEQ ID NO: 242 je označen sa •. Oligonukleotid koji služi kao negativan kontrolni oligonukleotid je označen sa ♦ SEQ ID NO: 330. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 7A i 7B je SEQ ID NO: 313. Test oligonukleotid koji je prikazana na slikama 8A i 8B je SEQ ID NO: 314. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 9A i 9B je SEQ ID NO: 319. Test oligonukleotid koji je prikazan na slikama 10A i 10B je SEQ ID NO: 316. Test oligonukleotid prikazan na Slikama 11A i 11B je SEQ ID NO: 317. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 12A i 12B je SEQ ID NO: 320. Test oligonukleotid prikazan na Slikama 17A i 17B je SEQ ID NO: 321. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Kao što je prikazano na Slikama 7-12 i 17 svaki od oligonukleotida koji su testirani u analizama je sposoban da proizvede različite nivoe i obrasce izlučivanja citokina. Na primer, u približno istim ili nižim koncentracijama većina testiranih ODN daju bolju indukciju jednog ili više citokina od pozitivnog kontrolnog oligonukleotida koja ima kompletno fosforotiatni osnovni lanac. Negativna kontrola je izazvala proizvodnju značajno manje citokina.
Posle inkubacije sa EQ ID NO: 313 PBMC izlučuju slične nivoe interferona-alfa (IFNa) i interleukina-10 (IL-10) kao posle inkubacije sa SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 314 ima slične efekte na količinu izlučenog IL-10 iz humanih PBMC, kao SEQ ID NO: 242, dok je izlučivanje IFNa veoma povećano. Nasuprot SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 319 indukuje samo niske nivoe izlučivanja IFNa iz humanih PBMC, dok se količina izlučenog IL-10 može upoređivati između dva oligonukleotida. SEQ ID NO: 316 je bio sposoban da indukuje nekoliko puta veće nivoe IFNa iz humanih PBMC od SEQ ID NO: 242. Zapaženo je povećanje ukupne količine izlučenog IL-10. SEQ ID NO: 317 je pokazao slične osobine sa SEQ ID NO: 316, sa veoma povećanim izlučivanjem IFNa iz humanih PBMC u poređenju sa SEQ ID NO: 242. Nivoi izlučivanja IL-10 su neznatno povišeni, lako je SEQ ID NO: 320 doveo do indukcije IFNa i IL-10 iz humanih PBMC indukcija je bila manja nego kod SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 321 je sposoban da indukuje više od deset puta više nivoe IFNa iz humanih PBMC od SEQ ID NO: 242 (Slika 17A). U poređenju sa SEQ ID NO: 242, izlučivanje IL-10 iz humanih PBMC koje je indukovano sa SEQ ID NO: 321 je neznatno povećano kod većih koncentracija ovog oligonukleotida (Slika 17B).
Primer 4:
Na Slikama 13-15, 16 i 18-20 su prikazani nivoi aktivacije B ćelija i monocita posle izlaganja ovih ćelija CpG oligonukleotidima koji su ovde opisani. Ispitivani test oligonukleotidi su prikazani na slikama sa ■. Oligonukleotid koji služi kao pozitivni kontrolni oligonukleotid SEQ ID NO: 242 je označen sa •. Oligonukleotid koji služi kao negativan kontrolni oligonukleotid je označen sa ♦ SEQ ID NO: 330. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 13A i 13B je SEQ ID NO: 313. Test oligonukleotid koji je prikazana na slikama 14A i 14B je SEQ ID NO: 314. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 15A i 15B je SEQ ID NO: 319. Test oligonukleotid koji je prikazan na slikama 16A i 16B je SEQ ID NO: 316. Test oligonukleotid prikazan na Slikama 18A i 18B je SEQ ID NO: 321. Test oligonukleotid koji je prikazan na Slikama 19A i 19B je SEQ ID NO: 317. Test oligonukleotid prikazan na Slikama 20A i 20B je SEQ ID NO: 320. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da bi se dobila određena vrednost je prikazana duž X-ose (uM).
Kao što je prikazano na Slikama 13-15, 16 i 18-20 svaki od oligonukleotida koji su testirani u analizama je sposoban da proizvede različite nivoe i obrasce ekspresije markera ćelijske površine. Na primer, u približno istim ili nižim koncentracijama većina testiranih ODN daju bolju indukciju markera ćelijske površine od pozitivnog kontrolnog oligonukleotida koja ima kompletno fosforotiatni osnovni lanac.
Nivo ekspresije CD86 na B ćelijama i CD80 ekspresije na monocitima koji je indukovan sa SEQ ID NO: 313 se može uporediti sa istim kod SEQ ID NO: 242. Nasuprot SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 313 stimuliše ćelije u nižim koncentracijama u poređenju sa SEQ ID NO: 242 sugerišući povećani potencijal. Nivoi ekspresije CD86 na B ćelijama i CD80 ekspresije na monocitima koji indukuje SEQ ID NO: 314 se mogu porediti. Efekti SEQ ID NO: 314 se primećuju korišćenjem nižih koncentracija SEQ ID NO: 314 u poređenju sa SEQ ID NO: 242, demonstrirajući povećani potencijal SEQ ID NO: 314. Na B ćelijama površinaska ekspresija CD86 je snažno ushodno regulisana sa SEQ ID NO: 319, sa jačinom signala koja se može uporediti sa istom kod SEQ ID NO: 242. Na monocitima, sa SEQ ID NO: 319 mogu se detektovati samo slabo povišeni nivoi ekspresije CD80. Potencijal SEQ ID NO: 319 da indukuje ushodnu regulaciju CD86 na B ćelijama je neznatno smanjen u poređenju sa SEQ ID NO: 242. U poređenju sa SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 316 indukuje veće nivoe aktivacionog markera CD86 na B ćelijama (Slika 16A) i aktivacionog markera CD80 na monocitima (Slika 16B). B ćelije postaju snažno aktivirane posle inkubacije humanih PBMC sa SEQ ID NO: 321 kao što je pokazano sa CD86 ekspresijom (Slika 18A). Nivo CD86 je veći nego nivo CD86 indukovan sa SEQ ID NO: 242. Takođe je aktivacija monocita, kao što je određena sa CD80 ekspresijom, jača sa SEQ ID NO: 321 nego sa SEQ ID NO: 242 (Slika 18B). SEQ ID NO: 317 indukuje CD86 ekspresiju na B ćelijama u poređenju sa SEQ ID NO: 242 (Slika 19A), dok je ekspresija aktivacionog markera CD80 na monocitima povećana u poređenju sa SEQ ID NO: 242 (Slika 19B). SEQ ID NO: 320 indukuje ekspresiju CD86 na B ćelijama do sličnog nivoa kao i SEQ ID NO: 2426 (Slika 20A).
Primer 5:
Polu- mekani oligonukleotidi su imunostimulatorni za humane PBMCin vitro
U ovom primeru procenjivana je sposobnost polu-mekanih oligonukleotida da indukuju citokine i hemokinein vitro.Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su dobijene od zdravih humanih donatora i kultivisane su u prisustvu različitih koncentracija (0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 i 5.0 uM) potpuno stabilizovanog CpG SEQ ID NO: 242 ili polu-mekanog SEQ ID NO: 241. Posle 6, 16 ili 48 časova, supernatanti kulture su sakupljeni i pomoću ELISA su u supernatantima mereni različiti citokini (IFNa, TNFa, IL-10) i hemokin IP-10. Pri niskim koncentracijama oligonukleotida, polu-mekani i potpuno stabilizovani oligonukleotidi su indukovali IFN-a do sličnog nivoa posle 16 časova ili 48 časova u kulturi. Međutim, maksimalna indukcija IFN-a sa ODN 5476 je dostignuta na oko polovini koncentracije oligonukleotida koja je potrebna za SEQ ID NO: 242. Pri intermedijernim koncentracijama, SEQ ID NO: 242 je indukovao više IFN-a od SEQ ID NO: 241, a pri visokim koncentracijama, ni SEQ ID NO: 242 ni SEQ ID NO: 241 nisu indukovali mnogo IFN-a. Hemokin IL-10 je stimulisan do sličnog stepena i sa sličnom zavisnošću od koncentracije sa polu-mekim i potpuno stabilizovanim oligonukleotidima. U oba slučaja oko 700 pg/ml je registrovano na nižim koncentracijama oligonukleotida, a manje IP-10 je indukovano na višim koncentracijama oligonukleotida. Šema slična onoj kod IP-10 uočena je za IL-10, osim što jepolumeki oligonukleotid na 0.05 uM indukovao značajnu količinu IL-10, dok je potpuno stabilizovani oligonukleotid na 0.05 uM indukovao malo ili nimalo IL-10. Polu-meki i potpuno stabilizovani oligonukleotidi bili su slični po sposobnosti indukovanja TNF-a, tj., oba tipa oligonukleotida snažno su indukovala TNF-a naročito na visokim koncentracijama.
Primer 6:
In vitrostimulacija makrofaga miša sa polu- mekim SEQ ID NO: 241 nasuprot potpuno
stabilizovanim ODN.
Ćelijska linija makrofaga miša (RAVV264) inkubirana je 16 časova sa polu-mekim oligonukleotidom SEQ ID NO: 241, potpuno stabilizovanim oligonukleotidom SEQ ID
NO: 242, potpuno stabilizovanim ODN 1826, lipopolisaharidom (LPS) ili PBS. Polu-meki i potpuno stabilizovani ODN ispitivani su na koncentracijama od 0.02, 0.05 i 0.1 uM.
Supernatanti su sakupljeni i p40 subjedinice IL-12 (IL-12p40, pg/ml) su merene
. sa ELISA. Rezultati su prikazani u Tabeli 2. Polu-meki oligonukleotid SEQ ID NO: 241 je bio značajno potentniji u indukciji sekrecije IL-12p40 od strane makrofaga od bila kog potpuno stabilizovanog ODN.
Primer 7:
Polu- mekani oligonukleotidi B- klase sa sekvencom koja ie optimizovana za stimulaciju
humanih imunih ćelija su snažni stimulatori imunih ćelija miševa.
Objavljeno je da humane i imune ćelije miševa odgovaraju na različite CpG ODN.
Potpuno stabilizovane CpG SEQ ID NO: 242 se smatraju "optimalnim" za stimulaciju humanih imunih ćelija, ali se ne smatraju "optimalnim" za stimulaciju imunih ćelija miševa. Suprotno tome, potpuno stabilizovan CpG ODN 5890 (5,T<*>C<*>A<*>A<*>C<*>G<*>T<*>T3') smatra se da je "optimalan" za stimulaciju humanih imunih ćelija. Objavljeno je da i humane i B ćelije miševa eksprimiraju TLR9. HEK293 ćelije slezine miševa koje eksprimiraju TLR9 su kultivisane u prisustvu različitih koncentracija potpuno stabilizovanog CpG SEQ ID NO: 242, potpuno stabilizovanog CpG ODN 5890, ili polu-mekanog SEQ ID NO: 241 i aktivacija TLR9 je merena na sledeći način. Ćelije koje su upotrebljene za ovu analizu su eksprimirale TLR9 miša i sadržale su konstrukt reporter gena. Ćelije su inkubirane sa ODN 16 časova na 37°C u ovlaženom inkubatoru. Za svaki podatak je izvedeno tri ponavljanja. Ćelije su lizirane i analizirane na aktivnost reporter gena. Indeksi stimulacije su izračunavani u odnosu na aktivnost reporter gena medijuma bez dodavanja ODN. Polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 i potpuno stabilizovani oligonukleotid SEQ ID NO: 242 imaju istu baznu sekvencu. Rezultati su prikazani u Tabeli 3. Pri najnižim koncentracijama, SEQ ID NO: 241 i SEQ ID NO: 242 imaju minimalan imunostimulatorni efekat. Međutim, kako se koncentracija povećava do 14 nM i preko, SEQ ID NO: 241 je jasno imunostimulatorniji od SEQ ID NO: 242. Pri najvišim koncentracijama koje su analizirane u eksperimentu, SEQ ID NO: 241 je najmanje bio stimulatoran koliko i optimizovan potpuno stabilizovan oligonukleotid ODN 5890 miševa.
Primer 8- 9:
Polu- mekani oligonukleotidi indukuiu aktivaciju NK ćelija.
Polu-mekani i potpuno stabilizovani oligonukleotidi su takođe upoređivani u odnosu na njihovu sposobnost da stimulišu aktivaciju NK ćelija. Korišćenjem standardne analize oslobađanja hroma, 10x10<6>BALB/c ćelije slezine su kultivisane u 2 ml RPMI kome je dodato 10% U/ml penicilina, 100 pg/ml streptomicina i 2 mM L-glutamata, sa ili bez polu-mekanog SEQ ID NO: 241 ili potpuno stabilizovanog SEQ ID NO: 242, gde je svaki ODN dodat u krajnjoj koncentraciji od 1, 3 ili 10 pg/ml, za 48 časova. Ćelije su ispirane i zatim upotrebljene kao efektorne ćelije u kratkotrajnoj analizi oslobađanja<51>Cr sa YAC-1 i 2C11, dve ciljne ćelijske linije osetljive na NK ćelije (Ballas ZK et al. (1993)J Immunol150:17-30). Efektorne ćelije su dodavane u različitim koncentracijama u 10<4>ciljne ćelije obeležene sa<51>Cr u mikrotitarske ploče sa dnom oblikar slova V u 0.2 ml i inkubirane u 5% C024 časa na 37°C. Analizirane proporcije efektorne ćelije:ciljne ćelije (E:T) su bile 6.25:1, 25:1, 50:1 i 100:1. Ploče su zatim centrifugirane i alikvota supernatanta je merena na radioaktivnost. Procenat specifične lize je određen izračunavanjem odnosa oslobođenog<51>Cr u prisustvu efektornih ćelija umanjen za oslobođeni<51>Cr kada su ciljne ćelije same kultivisane, kroz ukupan broj oslobođenih radioaktivnih signala posle ćelijske lize u 2% sirćetnoj kiselini (100 procentna liza) umanjen za cpm oslobođenog<51>Cr kada su ćelije same kultivisane. Rezultati su prikazani u Tabeli 5 u daljem tekstu. Ukratko, poli-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 i potpuno stabilizovani SEQ ID NO: 242 su indukovali suštinski uporedljive nivoe aktivacije NK ćelija kod svih ispitivanih ODN koncentracija i E:T odnosa.
Primer10:
Polu- mekani oligonukleotidi su u opštem slučaju imunostimulatorniji od oligonukletoida
iste ili slične sekvence koji su potpuno fosforotioatni.
Sve testirane polu-mekane verzije su aktivnije u analizi humanog TLR9 od odgovarajućeg uniformno fosforotioatnog molekula (Tabela 6). Prosečan indeks stimulacije je izračunat pomoću vrednosti za četiri koncentracije (0.1 uM, 0.5 uM, 2 uM i 8 uM). U Tabeli, U predstavlja 2'-dezoksiuracil.
Primer 11:
Poboljšaniin vitropotencijal polu- mekanih verzija slabo imunostimulatornih potpuno
stabilizovanih oligonukleotida
je potpuno stabilizovan, potpuno fosforotioatni CpG oligonukleotid sa niskim imunostimulatornim potencijalom u poređenju sa SEQ ID NO: 242. Srodni polu-mekani oligonukleotidi
Primer 12:
Polu- mekani oli<g>onukleotidi smanjene dužine su imunostimulatorniin vitro
Polu-mekani 16-mer, SEQ ID NO: 283, 16-mer, SEQ ID NO: 245, 17-mer, SEQ ID NO: 284 i 24-mer, SEQ ID NO: 241 su upoređivani sa potpuno stabilizovanim ODN 24-mernim SEQ ID NO: 242 i 18-mernim SEQ ID NO: 285 u odnosu na njihovu sposobnost da stimulišu TLR9 signalizaciju. Svaki oligonukleotid je dodat u HEK293 ćelije koje su transinficirane sa humanim TLR9 i konstruktom reporter gena u koncentracijama od 1, 6,12 ili 24 pg/ml i merena je aktivacija TLR9 kao što je opisano u prethodnom tekstu.
Dok je 18-merni potpuno stabilizovani oligonukleotid ODN SEQ ID NO: 285 manje imunostimulatoran od 24-mernog potpuno stabilizovanog oligonukleotida SEQ ID NO: 242 u svim ispitivanim koncentracijama, 16-merni i 17-merni polu-mekani oligonukleotidi su bili stimulatorni bar isto kao 24-merni SEQ ID NO: 242 u koncentracijama od 6 pg/ml i preko. Pored toga, 16-merni i 17-merni polu-mekani oligonukleotidi su bili skoro isto stimulatorni kao 24-merni polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241.
Primer 13:
Polu- mekani oligonukleotidi su imunostimulatorniin vivo .
BALB/c miševi su podeljeni u grupe i subkutano im je dato 400 pg polu-mekanog oligonukleotida SEQ ID NO: 241, potpuno stabilizovanog imunostimulatornog oligonukleotida SEQ ID NO: 242, potpuno stabilizovanog negativnog kontrolnog oligonukleotida (TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT, SEQ ID NO: 286), ili ekvivalentna zapremina fosfatno puferisanog slanog rastvora (PBS). Životinjama je uzimana krv 3 časa posle injekcije i određivani su nivoi IP-10, IFN-y i TNF-a u serumu korišćenjem odgovarajuće citokin-specifične ELISA. Nivo IP-10 u serumu je bio oko dva puta veći kod životinja koje primaju polu-mekani SEQ ID NO: 241 (8,000-12,000 pg/ml) od potpuno stabilizovanog imunostimulatornog oligonukleotida SEQ ID NO: 242 (3,500-8,000 pg/ml). Nivo IP-10 u serumu kod životinja koje su primale kontrolni SEQ ID NO: 286 je bio nizak kao i nivo IP-10 kod životinja koje su primale PBS. Polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 i potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotid SEQ ID NO: 242 su indukovali slične količine IFN-y, oko 150 pg/ml. Polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 je indukovao 30-45 procenata više TNF-a od potpuno stabilizovanog imunostimulatornog oligonukleotida SEQ ID NO: 242 (oko 1,550 pg/ml nasuprot oko 1,175 pg/ml u jednom eksperimentu i oko 710 pg/ml naspram 490 pg/ml u sledećem eksperimentu).
U sledećoj postavciin vivoeksperimenta, ispitivani su polu-mekani i potpuno stabilizovani oligonukleotidi na njihovu sposobnost da leće tumore kod BALB/c miševa. Tri grupe BALB/c miševa su injektirane i.p. sa bubrežnim adenokarcinomom miševa sa ćelijama spontanog porekla (Renca), korišćenjem uspostavljenog modela tumora. Salup RR et al. (1985)J Immunopharmacol 7:417-36.Svaka grupa miševa je takođe primila bilo 100 mg polu-mekanog oligonukleotida SEQ ID NO: 241, 10 mg potpuno stabilizovanog imunostimulatornog oligonukleotida SEQ ID NO: 242 ili istu zapreminu PBS. Miševi koji su primali lažni tretman sa PBS su imali srednju vrednost za preživljavanje od 44 dana i preživljavanje od 20% za 50 dana. Nasuprot tome, miševi koji su primili polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 su imali preživljavanje od 80% za 50 dana, a miševi koji su primali potpuno stabilizovani imunostimultorni oligonukleotid SEQ ID NO: 242 su imali preživljavanje od 70% za 50 dana. Što se tiče veličine tumora (u kubnim milimetrima), posle 52 dana miševi koji su primali PBS su imali zapreminu tumora od približno 1200 mm<3>, dok su miševi koji su primali polu-mekani oligonukleotid SEQ ID NO: 241 ili postupno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotid SEQ ID NO: 242 imali tumore od oko 250 mm<3>i 180 mm<3>, respektivno. Prema tome, i polu-mekani oligonukleotid i potpuno stabilizovani oligonukleotid su visoko efikasni u smanjenju veličine tumora i povećanju preživljavanja u ovom model eksperimentu.
Primer 14:
Mekani ili polu- mekani oligonukleotidi su smanjili nefrotoksičnost.
Primećeno je da primena potpuno stabilizovanih imunostimulatornih oligonukleotida na majmune može biti povezana sa razvojem glomerulonefritisa, tj., inflamacije bubrega. Glomerulonefritis se može dijagnostifikovati i pratiti preko prisustva crvenih krvnih zrnaca i proteina u urinu, koje je često praćeno smanjenom stopom glomerularne filtracije (sa azotemijom), zadržavanjem vode i soli, hipertenzijom i edemom. Normalno je urin u suštini bez krvnih ćelija i proteina plazme. Dijagnoza se takođe može dati na osnovu histološkog ispitivanja bubrežnog tkiva. Poznato je da je bubrežno tkivo bogato u nukleazama, za koje se očekuje da su aktivnije na mekanim oligonukleotidima nego na potpuno stabilizovanim imunostimulatornim oligonukleotidima.
Majmuni su podeljeni u dve grupe, jedna grupa je primila mekane oligonukleotide, a druga je primila potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukleotide. Mekani oligonukleotidi i potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotidi su identični po sekvenci i razlikuju se samo po njihovim internukleotidnim vezama. Obe grupe majmuna su primile istu dozu imunostimulatornog oligonukleotida. Vrše se merenja pre tretmana (osnovni nivo) i periodična merenja tokom tretmana najmanje jednog parametra koji je koristan za procenu prisustvo glomerulonefritisa, uključujući, na primer, analizu urina štapićem na prisustvo proteinurije i/ili hematurije, mikroskopsku analizu urina na prisustvo crvenih krvnih ćelija i/ili izbacivanje crvenih krvnih ćelija, koncentraciju proteina u urinu, azot uree u krvi (BUN), kreatinina u serumu, krvni pritisak, telesnu težinu i biopsiju bubrega sa analizom tkiva na svetlosnom i/ili elektronskom mikroskopu. Klinički nalazi su u korelaciji sa tipom imunostimulatornog oligonukleotida koji je primenjen na svakog majmuna i rezultati su upoređivani između grupa radi statističke značajnosti.
Izborno, takođe su uključene sparene grupe majmuna koji su primili bilo mekane ili polumekane oligonukleotide ili potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukleotide kao u prethodnom tekstu, ali korišćenjem viših ili nižih oligonukleotidnih doza (doze), da bi se rezultati dodatno procenili kao funkcija doze oligonukleotida.
Majmuni koji primaju mekane oligonukleotide su značajno manje podložni razvoju glomerulonefritisa od majmuna koji primaju potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukleotide.
Primer 15:
Mekani oligonukleotidi imaju povećani imunostimulatorni potencijal pri visokim
koncentracijama.
Mekani oligonukleotidi su upoređivani sa SEQ ID NO: 242 u odnosu na njihovu sposobnost da indukuju aktivnost TLR9. Mekani ODN i kontrolni SEQ ID NO: 242 su upoređivani pri svakoj od četiri koncentracije, 1 pg/ml, 6 pg/ml, 12 pg/ml i 24 pg/ml. Proporcije aktivacije, pri svakoj od koncentracija, koju vrše mekani oligonukleotidi su upoređivane sa aktivacijom sa SEQ ID NO: 242 i prikazane su u Tabeli 9 u daljem tekstu. Ovi rezultati ukazuju na to da su mekani oligonukleotidi imunostimulatorniji od SEQ ID NO: 242 pri višim koncentracijama.
Primer 16:
Oli<g>onukleotidna stabilnost u serumu i u tkivima.
Miševi su subkutano injektirani sa 25 mg/kg polu-mekanog oligonukleotida SEQ ID NO: 241, mekanog oligonukleotida
(T<*>C<*>G<*>T<*>C<*>G<*>T<*>T<*>T<*>T_G_T_C_G_T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C<*>G<*>T<*>T; SEQ ID NO: 294), ili potpuno stabilizovanog oligonukleotida SEQ ID NO: 242. Uzorci tkiva i seruma su dobijeni posle izabranog broja časova i analizirani su na intaktni oligonukleotid ili njegove fragmente.
Uzorci tkiva i seruma su „obeleženi" sa poznatim količinama unutrašnjeg standardnog ODN (1.25 pg poliT) i ODN su izolovani iz tkiva i uzoraka plazme pomoću postupaka ekstrakcije čvrste faze (SPE) koji su opisani u daljem tekstu. Dobijeni rastvori koji sadrže analit, metabolite i unutrašnji standard su analizirani pomoću kapilarne gel elektroforeze (CGE) i MALDI-TOF postupaka koji su takođe opisani u daljem tekstu. Određene su ukupne količine regenerisanih ODN (tj., analit plus metaboliti) iz bubrega, jetre, slezine i uzoraka seruma koje su analizirane pomoću CGE. Izračunata je standardna devijacija. Svakom metabolitu je dodeljena relativna količina u procentima od ukupne površine pika.
SPE. Za izolaciju ODN iz seruma, 100 pg uzorka je „obeleženo" sa 1.25 pg unutrašnjeg standardnog ODN, pomešano i rastvoreno u 5 ml SAX-pufera. Ovaj rastvor je primenjen na anjon izmenjivačkoj koloni (SAX, Agilent), kolona je ispirana i ODN je eluiran sa puferom povećane jonske snage. Dobijeni eluat je oslobođen soli korišćenjem kolone reverzne faze (RP) (Glen Research) ili slične kolone (HLB, VVaters). Eluati iz RP kolone, koji sadrže samo vodu i acetonitril su osušeni i solubilizovani u istoj epruveti u 60 pl dejonizovane vode. Za dalje odstranjivanje soli uzoraka izvedena je membranska dijaliza. Uzorci su analizirani direktno kapilarnom gel elektroforezom. Za MALDI-TOF MS, upotrebljeni su uzorci bilo nerazblaženi ili koncentrovani, tj., 50 pl ODN uzorka je osušeno u vakuumu i rastvoreno u dejonizovanoj vodi i analizirano kao što je opisano u daljem tekstu.
ODN iz tkiva je izolovan na osnovu sličnog SPE protokola. 100 mg tkiva je homogenizovano korišćenjem FastPrep uređaja. Dodata je proteinaza K i proteini su hidrolizovani 2 časa. Fenolna ekstrakcija je izvedena pre započinjanja SPE postupka koji je opisan u prethodnom tekstu sa frakcijom koja je rastvorljiva u vodi.
CGE. Uzorci oslobođeni soli koji sadrže analit, njegove metabolite i određenu količinu unutrašnjeg standardnog ODN su elektrokinetički injektirani u gelom napunjenu kapilarnu cev (neutralna, 30 cm, kapilarna eCAP DNA, Beckman # 477477) sa strane uzorka sa prethodnim injektiranjem vode. Primenjena je voltaža od 300 V/cm dok je detekcija praćena na 260 nm. Razdvajanje je izvedeno na 25°C u Tris/bornoj kiselini/7M urea koja sadrži EDTA pufer. Analit je identifikovan po njegovom realtivnom vremenu migracije (MTongo/MTintstd.) u poređenju sa istim kod standarda koji je pripremljen na sličan način i istovremeno analiziran. Beleženo je relativno vreme migracije i relativan procenat površine bilo kog elektroforetskog pika koji je >3x signahbuka (S:N) proporcije. Pikovi veličine između 3x i 10x registrovani su kao nekvantifikujući.
% Oligo=(površina pika/ukupna površina pika >3xS:N)x100%
MALDI-TOF. Uzorci oslobođeni soli koji sadrže analit i njegove metabolite su analizirani na Applied Biosvstems MALDI-TOF masenom spektrometru sa odloženim ekstrakcionim izvorom, azotovim laserom na 337 nm talasne dužine i tubusom od 1.2 metra. Instrumenti su podešeni na sledeći način: voltaža 25 kV; grid voltaža 95.4%; vodeća žica 0.1%; latencija 1200 nsek. Kao matriks je upotrebljena 3-hidroksipikolinska kiselina sa diamonijumcitratom. Spektri ODN uzoraka su kalibrisani spolja na istoj ploči pod identičnim uslovima korišćenjem grupe standardih ODN poznatih molekulskih težina.
Rezultati dobijeni posle 48 časova su prikazani na Slici 20. Slika 20 pokazuje da su u bubregu polu-mekani SEQ ID NO: 241 i mekani SEQ ID NO: 294 veoma smanjeni (za 93 procenata i za 87 procenata, respektivno) u poređenju sa potpuno fosforotioatnim SEQ ID NO: 242.
Primer 17:
C oligonukleotidi su imunostimulatorniin vitro .
Polu-mekani oligonukleotidi C-klase su pripremljeni sa fosfodiestarskim vezama unutar 5' ne-palindromskog dela (ODN SEQ ID NO: 255), 3' palindromskog dela (ODN SEQ ID NO: 251) i unutar i 5' ne-palindromskog dela i 3' palindromskog dela (ODN SEQ ID NO: 295). Pored toga, ODN SEQ ID NO: 252 je pripremljen sa vezama kao ODN SEQ ID NO: 295, ali sa 2'-0-Me riboza šećerima u nukleotidima koji grade 3' palindromski deo (podvučeno u daljem tesktu). Ovi oligonukleotidi su zatim procenjeni korišćenjem TLR9 analize koja je opisana u daljem tekstu.
Oligonukleotidi C-klase sa potpuno stabilizovanim osnovnim lancem u opštem slučaju pokazuju relativno nisku aktivnost TLR9 u poređenju sa oligonukleotidima B-klase. Kao što je prikazano u Tabeli 10 u daljem tekstu, ugrađivanje polu-mekane sekvence samo u 5' ne-palindromski deo (ODN SEQ ID NO: 255) je značajno pojačalo aktivnost TLR9 u poređenju sa ugrađivanjem polu-mekane sekvence samo u 3' palindromski deo (ODN SEQ ID NO: 251). Ugrađivanje polu-mekane sekvence i u 5' ne-palindromski deo i u 3' palindromski deo (ODN SEQ ID NO: 295) je imalo za rezultat pojačanu aktivnost TLR9 u poređenju sa ugrađivanjem polu-mekane sekvence samo u 3' palindromski deo (ODN SEQ ID NO: 251).
Polu-mekani oligonukleotidi C-klase ne samo da zadržavaju svoju sposobnost da indukuju IFN-a od strane PBMC, već su takođe značajno potentniji na niskim koncentracijama. Pojačana potencija je najizraženija kod onih oligonukleotida C-klase kod kojih je polu-mekana sekvenca uključena u 5' ne-palindromski deo (ODN SEQ ID NO: 255 i ODN SEQ ID NO: 295). ODN SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 251 i SEQ ID NO: 295 su procenjivani pomoću ELISA i upoređivani sa SEQ ID NO: 242, potpuno stabilizovanim oblikom ova tri polu-mekana oligonukleotida i oligonukleotidom C-klase potentnim induktorom IFN-a. Rezultati su prikazani u Tabeli 11.
Tabela 11. Indukcija IFN-a (pg/ml) polu-mekanim verzijama oligonukleotida C-klase
Primer 18:
Fizičkohemiiske osobine SEQ ID NO: 313
Postupci:
Šema dobijena difraktometrijom X-zracima praha SEQ ID NO:313 je pokazala halo koji je karakterističan za amorfnu fazu. Analiza sorpcije vodene pare je pokazala daje SEQ ID NO: 313 vrlo higroskopan. Tendencija leka da razmenjuje vlažnost može rezultirati u promenjivim koncentracijama vlažnosti u zavisnosti od vlažnosti sredine. Jedinjenje pokazuje visoku rastvorljivost u vodi (>100 mg/ml) i prema tome ima adekvatnu rastvorljivost u upotrebljivom opsegu pH. Analize vodenih rastvora leka pri povišenim temperaturama pokazuju da se on brzo razlaže u blago kiselim do kiselim sredinama, ali rastvori koji su puferisani preko pH 6 izgleda da imaju adekvatnu stabilnost rastvora.
Rezultati
Nađeno je da je SEQ ID NO: 313 amorfne prirode i da je vrlo higroskopan. Jedinjenje pokazuje visoku rastvorljivost u vodi (>100 mg/ml) i prema tome ima adekvatnu rastvorljivost u upotrebljivom opsegu pH. ODN se brzo razlaže u blago kiselim do kiselim sredinama. Rastvori koji su puferisani iznad pH 6 izgleda da imaju adekvatnu stabilnost rastvora.
Primer 19:
In vitrostimulacija ćelija koje su transinficirane sa TLR9
Postupci:
HEK 293 ćelije transinficirane sa humanim TLR9 su inkubirane sa SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329 16 časova. Signal je određen očitavanjem luciferaze.
Rezultati
U poređenju sa SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 je bio potentniji stimulator ciljnog receptora TLR9.
Primer 20:
In vitrostimulacija humanih imunih ćelija
Postupci:
Humane mononukleane ćelije periferne krvi dobijene od 6 donatora su inkubirane sa SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329 24 ili 48 časova. Mereno je izlučivanje citokina.
Rezultati
Rezultati su prikazani na slici 23. U poređenju sa SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 je pokazao povećanu ili u najmanjem slučaju sličnu efikasnost i/ili potencijal kao induktor TLR9-vezanih citokina IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
Primer 21:
In vitrostimulacija ćelija slezine kod miševa
Postupci
Ćelije slezine miševa (BALB/c) su inkubirane sa SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329 48 časova. Mereno je izlučivanje citokina i IP-10.
Rezultati
U poređenju sa SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 je pokazao povećanu ili u najmanjem slučaju sličnu efikasnost i/ili potenciju kao induktor citokina IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10. Podaci su prikazani na Slici 24. Ovi podaci ukazuju na to da se aktivnost SEQ ID NO: 313 na imunim ćelijama miševa može uporediti sa istom na humanim ćelijama (prethodni tekst) i na sličan način je u saglasnosti sa aktivacijom preko TLR9.
Primer 22:
In vivoindukcija gena za citokin kod miševa
Postupci:
Ova studija procenjuje ekspresiju citokina u plućima miševa posle doziranja SEQ ID NO: 313 u disajne puteve. Da bi se ispitivala izloženost bubrega, takođe je procenjivana indukcija istih citokina (kao što je opisano u Primerima 10 i 21) u ovom organu. Miševima (mužjaci, BALB/c) je doziran SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329 (svaki 1 mg/kg) bilo intranazalnom instalacijom ili bolus intravenoznom injekcijom. Pluća i bubrezi su uklonjeni 8 ili 15 časova posle doziranja. RNK je ekstrahovan i reverzno transkribovan u cDNK. Ciljni fragmenti cDNK su amplifikovani i detektovani sa PCR u realnom vremenu (Roche LightCvcIer korišćenjem SYBR Green detekcionog postupka). Prajmeri za GAPDH, IFN gama, IL-6, IP-10 i TNF-alfa su dizajnirani korišćenjem LC PROBE DESIGN softvera iz Roche (Verzija 1.0 Roche katalog br. 3 139 174). Prajmeri za IFN alfa su dizajnirani korišćenjem PRIMER 3 softvera. Prinos proizvoda je normalizovan kao proporcija ekpresije kontrolnog gena (GAPDH).
Rezultati
Kada se dopzira u disajne puteve, SEQ ID NO: 313 indukuje ekspreiju TLR9-povezanih gena (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10) u plućima. Rezultati su prikazani na Slici 25. Međutim, sa izuzetkom IP-10, ovi geni se ne eksprimiraju u bubrezima miševa koji su dozirani ovim putem. S obzirom da se IP-10 tipično indukuje interferonima, ekspresija ovog hemokina bi se mogla javiti indirektno kao rezultat interferona koji su izlučeni u sistemsku cirkulaciju iz pluća. Kada se SEQ ID NO: 313 primenjuje intravenozno, svaki od ovih gena osim IFNy je indukovan u bubrezima. Prema tome, nedostatak uticaja na bubrege SEQ ID NO: 313 posle doziranja u disajne puteve je verovatno posledica malog sistemskog izlaganja.
CpG ODN mogu da izazovu bubrežne efekte kroz čitav niz mehanizama. Akutna bubrežna granulomatozna inflamacija izazavana TLR9-zavisnim mehanizmima je primećena posle sistemskog izlaganja nekim CpG ODN. Naši rezultati sugerišu da sistemsko izlaganje SEQ ID NO: 313 koji se primenjuje u disajne puteve nije dovoljno da direktno indukuje TLR9-povezane gene u bubrezima.
Primer 23:
Efekti nain vivorazvoj limfnog čvora koji ie indukovan antigenom kod miševa
Postupci:
Ovom studijom je ispitivana sposobnost SEQ ID NO: 313 da indukuje imuno odstupanje od Th2-tipa odgovora u drenažnim limfnim čvorovima miševa. Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzitizovani sa antigenom (ovalbumin, 100 pg) u kompletnom Freund-ovom adjuvantu injekcijom u zadnje desno stopalo. Miševi su istovremeno injektirani u isto stopalo sa SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329 (1.5 mg/kg) ili nosačem (slani rastvor). Šest dana posle injekcije u stopalo, uklonjen je drenažni poplitealni limfni čvor. T ćelije (CD3<+>) i B ćelije (B220<+>) su prebrojavane protočnom citometrijom.Ex vivotest prepoznavanja antigena izveden je na sledeći način - 1X10<6>ćelija (iz drenažnog poplitealnog limfnog čvora) je inkubirano u 220 ul medijuma RPMI 1640+10% goveđi fetalni serum koji sadrži ili ovalbumin (100 ug/ml) ili razblaživač. Posle 36 časova medijum je uklonjen i merene su koncentracije IL-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, GM-CSF, IFN gama i TNF alfa korišćenjem kompleta iz LINCO Research, Inc. Research Park Drive, st charles, Missouri 63304 i analizirane na Luminex multipleks sistemu (Luminex Corporation, 12212 Technologv Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Rezultati
Broj ćelija u poplitealnim limfnim čvorovima.Senzitizacija je izazvala nakupljanje T ćelija i B ćelija u drenažnim poplitealnim limfnim čvorovima. Ove antigen-indukovane akumulacije se nisu značajno povećale kod miševa koji su takođe primili CpG ODN. Međutim, svaki CpG ODN koji je sam injektiran nesenzitizovanim miševima je izazvao nakupljanje i T ćelija i B ćelija. Ovi podaci su prikazani na Slici 26.
Test prepoznavanja antigena.Ćelije drenažnih limfnih čvorova uzete od miševa koji su senzitizovani antigenom izlučivale su IL-4, IL-5, IL-10 i IFNy kada su ponovo stimulisane sa antignomex vivo.Kod miševa koji su primili takođe i CpG ODN, izlučivanje IL-4, IL-5 i IL-10 je bilo smanjeno, pri čemu je izlučivanje Th1-tipa citokina IFNy bilo povećano. Naši podaci, prikazani na Slici 27, podržavaju hipotezu da SEQ ID NO: 313, kao i SEQ ID NO: 329, suprimira Th2 odgovor na senzitizaciju antigenom. Rezultati su srednja vrednost ± s.e.m. (n=9-10).<*>P<0.05 u poređenju sa senzitizovanom, grupom koja je tretirana sa nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja).
Primer 24:
Efektiin vivoproizvodnje IgE koja je indukovana antigenom
Postupci:
Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzitizovani antigenom nultog i 7-og dana studije (ovalbumin, 100 pg, i.p.) sa aluminijumhidroksidnim adjuvantom. Miševi su primili SEQ ID NO: 313 (0.15 ili 1.5 mg/kg, i.p.) ili SEQ ID NO: 17 (1.5 mg/kg, i.p.) dva dana pre svake senzitizacije i na dan svake senzitizacije. Serum je sakupljen 18-og dana studije. Titar antigen (ovalbumin)-specifičnog IgE i lgG2 su mereni pomoću ELISA. Rezime protokola je prikazan u Tabeli 12.
Rezultati
Kod miševa koji su tretirani SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329, proizvodnja antigen-specifičnog IgE je u potpunosti sprečena. Nasuprot tome, proizvodnja lgG2 je povećana. S obzirom da je proizvodnja IgE i lgG2 karakteristična za Th2-tip i Th1-tip odgovora respektivno, ovaj efekat je dodatni dokaz da SEQ ID NO: 313 može suprimirati Th2-tip odgovora na senzitizaciju antigenom. Alternativno CpG ODN mogu direktno indukovati T-beta ekspresiju i pramenu klase iz IgE u B ćelijama. Podaci su prikazani na Slici 28. Rezultati su srednja vrednost ± s.e.m. (n=10-12, osim 5 za SEQ ID NO: 329 grupu).<*>P<0.05 u poređenju sa senzitizovanom, grupom koja je tretirana sa nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja).
Primer 25:
In vivoefekti protiv antigen- indukovane inflamaciie disajnih puteva kod miševa
Postupci:
Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzitizovani antigenom nultog i 7-og dana studije (ovalbumin, 100 pg, i.p.) sa aluminijumhidroksidnim adjuvantom. Miševi su imunizovani antigenom izlaganjem ovalbumin aerosolu koji se udiše, dva puta nedeljeno, dve uzastopne nedelje. Prva imunizacija je bila 21.-og dana studije. SEQ ID NO: 313 (0.1-1000 pg/kg), SEQ ID NO: 329 (1-1000 pg/kg) ili nosač (slani rastvor, 20 pl) su primenjeni u disajne puteve intranazalnom instalacijom jednom deleljno, dva dana pre prve imunizacije antigenom te nedelje. Kraj je dostignut 48 časova posle poslednje imunizacije antigenom. Ćelije u disajnim putevima su rekuperovane bronhoalveolarnom lavažom i ćelije su diferencijalno izbrojane. Broj eozionofila (gustina zapremine eozinofila) i izlučivanje sluzi (PAS bojenje) u plućnom tkivu su određeni histopatološkom procenom. Protokol je prikazan u Tabeli 13.
Rezultati
Imunizacija antigenom je izazvala povećanje ukupnog broja leukocita, pretežno eozinofila, u lumenu disajnih puteva. Podaci su prikazani na Slici 29. Eozinofilija je značajno suprimirana na način koji je povezan sa dozom sa SEQ ID NO: 313 ili SEQ ID NO: 329. ED50vrednosti protiv eozinofilije su bile: SEQ ID NO: 313: 23 pg/kg; SEQ ID NO: 329: 47 pg/kg. Imunizacija je takođe izazvala nakupljanje CD4<+>T ćelija (CD3<+>CD4<+>ćelije) koje je značajno suprimirano sa SEQ ID NO: 313. SEQ ID NO: 313 je takođe značajno suprimirao antigen-indukovano nakupljanje eozinofila u plućnom tkivu i izlučivanje epitelijalnog mukusa. Rezultati na Slici 29 su srednja vrednost + s.e.m.
(n=15).<*>P<0.05 u poređenju sa grupom koja je imunizovana antigenom i tretirana sa nosačem (Kruskal-vVallis test višestrukog poređenja). Rezultati na Slici 30 su srednja vrednost ± s.e.m. (n=6).<*>P<0.05,<**>P<0.001 u poređenju sa grupom koja je imunizovana antigenom i tretirana sa nosačem (ANOVA, Dunnett-ov test višestrukog poređenja).
Primer 26:
In vivoefekti protiv antigen- indukovane hiperreaktivnosti disajnih puteva kod miševa
Postupci:Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzitizovani antigenom nultog i 7-og dana studije (ovalbumin, 100 pg, i.p.) sa aluminijumhidroksidnim adjuvantom. Miševi su imunizovani antigenom izlaganjem ovalbumin aerosolu koji se udiše, dva puta nedeljeno, dve uzastopne nedelje. Prva imunizacija je bila 19.-og dana studije. SEQ ID NO: 313 (10-1000 pg/kg) ili nosač (slani rastvor, 20 pl) su primenjivani intranazalno jednom nedeljno, dva dana pre prve imunizacije antigenom te nedelje. Hiperreaktivnost disajnih puteva je procenjena 24 časa posle poslednje imunizacije antigenom merenjem bronhokonstrikcije (povećanje otpornosti u disajnim putevima) na intravenozni metaholin. Za svaku životinju je dobijena kriva doze-odgovora na metaholin i reaktivnost disajnih puteva je izračunata kao površina ispod krive. Protokol je prikazan u Tabeli 14.
Rezultati
Imunizacija antigenom je izazvala hiperreaktivnost. SEQ ID NO: 313 je suprimirao razvoj antigen-indukovane hiperreaktivnosti disajnih puteva na način koji je povezan sa dozom. Podaci su prikazani na slikama 31 i 32 u obliku kriva doze-odgovora na metaholin da bi se prikazao efekat SEQ ID NO: 313 (1000 pg/kg). Krive doze-odgovora na metaholin su kvantifikovane kao površina ispod krive. Rezultati su srednja vrednost ± s.e.m. (n=6-8).<*>P<0.05 u poređenju sa grupom koja je imunizovana antigenom i tretirana sa nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja).
Analiza kriva puna doza-odgovor (RL) između miševa koji su imunizovani antigenom, tretirani sa nosačem i svih odgovarajućih miševa koji su imunizovani antigenom, tretirani sa SEQ ID NO: 313 izvedena je korišćenjem ponovljenih merenja MANOVA. Dok je s jedne strane postojala značajna razlika između kriva doza-odgovor
sa 100 i 1000 ug/kg SEQ ID NO: 313 tretman grupa, istovremeno nije postojala značajna razlika između miševa koji su imunizovani antigenom, tretirani sa nosačem i slično tretiranih životinja kojima je dozirano 10 ug/kg SEQ ID NO: 313.
Primer 27:
In vivofarmakokinetička ( PK) studija kod pacova
Farmakokinetička studija je izvedena kod pacova da bi se odredilo da li je SEQ
ID NO: 313, "polu-mekani" ODN, izbačen iz plazme i tkiva, posebno iz bubrega, sa bržom stopom od SEQ ID NO: 329, potpuno fosforotioatnog ODN, koji je identičan po baznoj sekvenci sa SEQ ID NO: 313.
Postupci
56 pacova je intravenozno (IV) & intratrahealno (IT) primilo 5 mg/kg (i za IT i IT) SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329. Sakupljeni su plazma, pluća i bubrezi. Studija je trajala 5 dana, sa 14 vremenskih tačaka po doznoj grupi. Upotrebljeno je 3 pacova/vremenskoj tački za IV grupu (Ukupno=42 pacova) i 4 pacova/vremenskoj tački za IT grupu.
Rezultati
Slika 33 pokazuje koncentracije ODN u plazmi pacova posle IV&IT primene u dozi od 5 mg/kg. Podaci za plazmu pokazuju da se SEQ ID NO: 313 mnogo brže izbacuje iz plazme u poređenu sa SEQ ID NO: 329 posle i IV i IT primene.
Slika 34 pokazuje koncentracije ODN u plazmi pacova posle IV&IT primene u dozi od 5 mg/kg. Posle IV primene u istom nivou doze, koncentracije SEQ ID NO: 313 u plućima su niže od koncentracija SEQ ID NO: 329. Posle IT primene razlika je manje naznačena. Podaci za pluća za SEQ ID NO: 329 su dostupni samo do 48 časova posle doziranja.
Slika 35 pokazuje koncentracije ODN u bubrezima pacova posle IV&IT primene u dozi od 5 mg/kg. Podaci za bubrege ukazjuju da su apsolutni nivoi SEQ ID NO: 313 u bubrezima niži od odgovarajućih koncentracija SEQ ID NO: 329 posle i IV i IT primene. Izlaganje bubrega SEQ ID NO: 313 posle IT primene je posebno smanjeno u poređenju sa izlaganjem SEQ ID NO: 329 u istom nivou doze. Ovo se može jasnije videti na Slikama 36 & 37.
Slika 36 pokazuje koncentracije ODN u bubrezima pacova posle IV primene u dozi od 5 mg/kg. Slika 37 pokazuje koncentracije ODN u bubrezima pacova posle IT primene u dozi od 5 mg/kg. Posle IT primene i SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329 su ispod donje granice kvantifikacije (0.4-0.6 pg/g) u bubrezima do 1 čas posle doziranja. Posle 1 časa, SEQ ID NO: 329 se može detektovati u svim uzorcima bubrega koji su sakupljeni u toku studije (48 časova). SEQ ID NO: 313, sa druge strane, je prisutan samo u merljivom nivou do 7 časova posle doziranja.
Nađeno je da je sistemsko i bubrežno izlaganje SEQ ID NO: 313 značajno niže od izlaganja SEQ ID NO: 329 posle primene 2 ODN bilo intravenozno (IV) ili intratrahealno (IT).
AUC u plazmi za SEQ ID NO: 313 posle IT primene u 5 mg/kg je bila 2.7 č pg/ml.
Odgovarajuća vrednost za SEQ ID NO: 329 je bila 9.0 č.pg/ml. Prema tome, sistemsko izlaganje SEQ ID NO: 313 je treći deo izlaganja kod SEQ ID NO: 329.
AUC u bubrezima za SEQ ID NO: 313 posle IT primene u 5 mg/kg je bila 2.35 č.pg/ml. Odgovarajuća vrednost za SEQ ID NO: 329 je bila 134 č.pg/ml. Prema tome, za isti nivo doze, bubrežno izlaganje SEQ ID NO: 313 je samo oko 2% izlaganja kod
SEQ ID NO: 329.
Nasuprot slučajevima kod plazme i bubrega, izlaganje pluća SEQ ID NO: 313
posle IT primene nije bilo smanjeno do tako velikog stepena kao izlaganje SEQ ID NO: 329. Plućna AUC za SEQ ID NO: 313 je bila približno 70-80% plućne AUC za SEQ ID
NO: 329 pri istoj dozi. S obzirom da su pluća ciljno tkivo, povoljno je da klirens ODN u plućima nije povećan do istog stepena kao iz plazme i bubrega.
Slika 38 pokazuje koncentracije SEQ ID NO: 313 i njegovog 8-mernog metabolita (jednog ili više) u bubrezima pacova posle IV primene SEQ ID NO: 313 u dozi od 5 mg/kg.
Slika 39 pokazuje koncentracije SEQ ID NO: 313 i njegovog 8-mernog metabolita (jednog ili više) u bubrezima pacova posle IT primene SEQ ID NO: 313 u dozi od 5 mg/kg. Usled metodoloških problema podaci za 8-merni metabolit SEQ ID NO: 313 u plazmi & tkivima su nekomplentni. Međutim, podaci za 8-mer su dostupni za neke IV i sve IT uzorke bubrega. Ovi podaci pokazuju da su kod većine ovih uzoraka bubrega kod kojih su koncentracije 8-mera uspešno izmerene, nivoi metabolita prevazišli nivoe SEQ ID NO: 313, ukazjujući na to daje endonukleazna aktivnost važan metabolički put za SEQ IDNO: 313.
Uvođenje određenog broja fosfodiestarskih veza (SEQ ID NO: 313) u potpuno fosforotioatni osnovni lanac (SEQ ID NO: 329) izgleda da je povećalo stopu razgradnje ODN, što rezultira u bržem klirensu, posebno iz bubrega.
Primer 28:
Aktivacija TLR9 korišćenjem polu- mekanog ODN u poređenju sa potpuno
fosforotioatnim ODN
Postupci
Stabilno transinficirane HEK293 ćelije koje eksprimiraju humani TLR9 su ranije opisane [Bauer et al.; PNAS; 2001], Ukratko, HEK293 ćelije su transinficirane elektroporacijom sa vektorima koji eksprimiraju humani TLR9 i reporter plazmid 6xNFicB-luciferaze. Stabilne transficirane ćelije (3x10<4>ćelija/komorici) su inkubirane sa ODN 16 časova na 37°C u ovlaženom inkubatoru. Svaka vrednost je izvedena u tri ponavljanja. Ćelije su lizirane i analizirane na aktivnost gena za luciferazu (korišćenjem Brightlite kompleta iz Perkin-EImer, Ueberlingen, Germanv). Izračunati su indeksi stimulacije s obzirom na aktivnost reporter gena medijuma bez dodavanja ODN.
Rezultati
TLR9 se lako aktivira sa ODN koje sadrže optimalne imunostimulatorne CpG sekvence. Inkubirali smo ćelijsku liniju koja stabilno eksprimira humani TLR9 sa panelom polu-mekanog ODN i panelom potpuno fosforotioatnog ODN koji ima istu ODN sekvencu kao i polu-mekani ODN. Rezultati su prikazani na Slici 40.
Rezultati pokazuju da je svaki polu-mekani ODN koji je prikazan u donjoj tabeli, SEQ ID NO. 376, 378, 380, 382, 384, 241 aktivirao veće nivoe TLR9 od iste sekvence ODN koja ima potpuno fosforotioatni osnovni lanac, SEQ ID NO: 377, 379, 381, 383, 385 i 242 respektivno.
Primer 29:
Rp internukleotidne veze kao veze slične fosfodiestarskim u polu- mekanim
oligonukleotidima
Postupci
Uslovi i reagensi ćelijske kulture
Za analizu proliferacije B ćelija, ćelije slezine iz BALB/c miševa (starosti 4-18 nedelja) su kultivisane na 2-5 x 10<5->10<6>ćelija/ml u RPMI u toku 44 časa u 96-komornim mikrotitarskim pločama i zatim su radioaktivno obeležene sa 1 pCi<3>H timidina u toku 4-6 časova, pre nego što su sakupljene i pre nego što je određen cpm scincilacionim brojanjem kao što je prethodno opisano (Krieg et al., 1995). Za VVestern blotove, WEHI-231 ćelije (American Type Culture Collection, Rockville, MD) su kultivisane na 37°C u 5% C02ovlaženom inkubatoru i održavane u RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) kome je dodat 10% FCS inaktiviran toplotom (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 1.5 mM L-glutamin, 50 pM 2-ME, 100 U/ml penicilina i 100 pg/ml streptomicina.
0//go/7i//c/eof/d/'
Oligodezoksinukleotidi (PO-Oligos) i stereo-randomizirani oligo(dezoksinukleozidfosforotioat)i [Mix-PS]-Oligos su nabavljeni u Operon Technologies (Alameda, CA) ili su pripremljeni standardnim fosforoamiditnim postupkom (Caruthers, 1985) (Stec et al., 1984). Oligonukleotid [Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT) ([Mix-PS]-SEQ ID NO: 386) je upotrebljen kao pozitivna kontrola s obzirom da je utvrđeno da on ima snažne imunostimulatorne efekte na ćelije miša (Yi et al., 1996). Za CpG PS-Oligo sa minimalnim stimulatornim motivom, sekvenca PS-d(TCAACGTT)-2066 je izabrana za ispitivanje kao tipičnog CpG motiva sa širokim imunostimulatornim efektima koji su reprezentativni za veliku familiju CpG DNK. Ova sekvenca je nazvana [Mix-PS]-2066 kada se gradi sa stereo-randomiziranim osnovnim lancem. Kada je ova oktamerna sekvenca pripremljena sa kompletno ili stereo-određenim osnovnim lancem, PS-Oligo se označava ili kao [Potpuno-Rp-PS]-2066 ili [Potpuno-Sp-PS]-2066 kada je ceo osnovni lanac stereo-određen, ili kao [CG-Rp-PS]-2066 ili [CG-Sp-PS]-2066 kada je samo CpG dinukleotid stereo-određen. Drugi upotrebljeni PS-Oligos koji su korišćeni obuhvataju CpG PS-d(TCAACGTTGA) ([Mix-PS]-SEQ ID NO: 387) i njegove Potpuno-Rp- i Potpuno-Sp- stereo-određene parnjake i kontrolu ne-CpG PS-d(TCAAGCTTGA) [Mix-PS]-SEQ ID NO: 388.
Stereo-određeni fosfdorotioatni oligodezoksinukleotidi su pripremljeni pomoću oksatiafosfolanskog postupka kao što je opisano (Stec et al., 1995) (Stec et al., 1998). Sinteze su izvedene ručno. Prve nukleozidne jedinice od 3' kraja su vezane za čvrstu podlogu sa DBU-otpornim sarkozinil linkerom (Brown et al., 1989). Odgovarajuće zaštićeni dezoksinukleozidil monomeri koji poseduju 3'-0-(2-tio-"spiro"-4,4-pentametilen-1,3,2-oksatiafosfolan) grupu su sintetisani i hromatografski razdvojeni u čiste P-diastereomere. Za sintezu [CG-Rp-PS]-2066 i [CG-Sp-PS]-2066, upotrebljene su nerazdvojene smeše oba P-diastereomera (u Rp:Sp odnosu oko 1:1) (Stec et al., 1998) za stvaranje internukleotidnih veza sa randomiziranom konfiguracijom P atoma. Svi sintetisani oligomeri su prečišćeni pomoću RP-HPLC:DMT-aktivan u dva koraka (vreme zadržavanja u opsegu 23-24 minuta) i DMT-neaktivan (vreme zadržavanja 14-16 minuta); hromatografskog sistema: ODS Hvpersil kolona, 5 pm, 240x4.6 mm, 0-40% CH3CN u 0.1 M trietilamonijumbikarbonatom, pH 7.5, gradijent 1%/min. Njihova čistoća je procenjena elektroforezom na poliakrilamidnom gelu.
Za studije usvajanja PS-Oligo, fluorescein konjugovani stereoregularni PS-Oligos su pripremljeni elongacijom čvrste faze ručno sintetisanih stereo-određenih PS-oligomera. Posle koraka detritilacije, fluoresceinfosforoamidit (ChemGenes Corporation, Ashland, MA; radne koncentracije 125 mg/ml) i 1-H-tetrazol su rutinski dodati (vreme spajanja 120 s), a zatim je izvršeno uvođenje atoma sumpora sa S-Tetra reagensom (Stec et al., 1993). Odvajanje od podloge i deprotekcija su izvedeni sa konc. amonijumhidroksidom 1 čas na sobnoj temperaturi i 4 časa na 55°C, respektivno. Dobijeni oligomeri su prečišćeni pomoću RP-HPLC u jednom koraku (gorenavedeno). Zbog izuzetne hidrofobnosti fluorescein grupe, Rp- i Sp-oligomer je eluiran sa vremenima zadržavanja 14.5, 14.8 i 14.7, 15.0 min, respektivno, tj., na kraju neuspelih sekvenci. U oba slučaja dva P-diastereomera su eluirana zahvaljujući ne-stereospecifičnosti fosforosamiditnog/sumporizacionog postupka elongacije sa fluoresceinskim monomerom.
Western Blot analiza
Ćelije su su sakupljene i resuspendovane u svežem medijumu u koncentraciji od 2<*>10<6>ćelija/ml. Ćelije su ostavljene da odstoje 4 časa pre 40-minutne stimulacije. Ćelije su sakupljene i ispirane tri puta sa hladnim PBS. Ćelije su lizirane u .05 M Tris (pH 7.4),
.14 M NaCI, 1% NP-40, .001 M Na3V04, .01 M NaF, 4.3 mg/ml B-glicerofosfata, .002 M DTT, 50 pg/ml PMSF, 12.5 pg/ml antipain, 12.5 pg/ml aprotinina, 12.5 pg/ml leupeptina, 1.25 pg/ml pepstatina, 19 pg/ml bestatina, 10 pg/ml fosforamidona, 12.5 pg/ml inhibitora tripsina zamrzavanjem i otapanjem, a zatim inkubiranjem na ledu od 30 minuta. Uzorci su zatim .centrifugirani na 10,000 x g 10 minuta na 4°C. Supernatanti su sačuvani kao lizati celih ćelija radi dodatne analize. Iste količine lizata celih ćelija (20 pg) su kuvane u uzorku SDS pufera 5 minuta pre njihovog podvrgavanja elektroforezi na 11% denaturišućem poliakrilamidnom gelu. Posle elektroforeze, proteini su premešteni u
nitrocelulozne membrane korišćenjem polusuvog blotera (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blotovi su blokirani sa 5% mlekom bez masti pre hibridizacije sa fosfo-SAPK/JNK (Cell Signaling Technologv, Beverlv, MA), kB-a i JNK1 (Santa Cruz Biotechnologv, Inc., Santa Cruz, CA). Blotovi su vizuelizovani korišćenjem pojačanih hemiluminiscentnih reagenasa (ECL, Amersham International) na osnovu protokola proizvođača.
Rezultati
Indukcija ugrađivanja<3>H timidina u ćelije slezine Sp stereoizomerom CpG PS-Oligos.
Da bi se odredila stereo-specifičnost imunostimulatornih efekata CpG DNK, BALB/c ćelije slezine su kultivisane sa stereo-određenim oktanukleotidima PS-d(TCAACGTT)-2066 u kome su sve internukleotidne veze bilo Rp ili Sp konfiguracije pri koncentracijama koje su naznačene u Tabeli 17. Ćelije su kultivisane 48 časova, što daje dovoljno vremena da se B ćelije CpG motivima indukuju da proliferišu (Krieg et al., 1995). Stereo-randomizirani [Mix-PS]-2066, koji poseduje CpG motiv, indukovao je snažnu proliferaciju ćelija slezine koja je zavisna od doze (Tabela 17). Sp izomer je takođe indukovao proliferaciju i izgleda da je marginalno potentniji od [Mix-PS]-2066. Nasuprot tome, Rp stereoizomer nije indukovao detektabilnu proliferaciju, što je u saglasnosti sa nalazima Yu et al., (Yu et al., 2000).
Naše ranije studije su pokazale da dekamer CpG PS-Oligos ima poboljšane imuno stimulatorne efekte u poređenju sa oktamerima koji su upotrebljeni u prvim eksperimentima. Prema tome, ovi eksperimenti su ponovljeni korišćenjem konstrukta PS-SEO ID NO: 387, koji je sintetisan bilo kao stereo-random [Mix-PS]-SEQ ID NO: 387 ili kao Potpuno-Rp- ili Potpuno-Sp- oblik. Ponovo, i [Mix-PS]-SEQ ID NO: 387 i [Potpuno-Sp-PS]-SEQ ID NO: 387 su indukovali snažnu inkorporaciju<3>H timidina na način koji je zavistan od doze. Međutim, u ovom slučaju, [Potpuno-Rp-PS]-SEQ ID NO: 387 je bio takođe sposoban da indukuje značajno povećanje ćelijske proliferacije pri višim koncentracijama, što ukazuje na to da je zadržao u najmanju ruku delimičnu stimulatornu aktivnost.
Preferencija za Rp hiralnosti na CpG dinukleotidu u oktamernim PS- Oligos.
Ostalo je nejasno da li je verovatna preferencija za Sp stereoizomer u početnim eksperimentima nastala kao posledica efekta unutar samog CG dinukleotida, ili da li ovaj efekat može biti izvan sa CG. Da bi se ovo odredilo, sintetisana su dva oktamera PS-2066 u kojima je osnovni lanac stereo-randomiziran osim veze između centralnog CG, koja je određena ili kao Sp ili kao Rp. Iznenađujuće, ovaj eksperiment je izgleda dao suprotan rezultat od eksperimenata gde su se koristili PS-Oligos u kojima je ceo osnovni lanac bio stereoregularan s obzirom da [CG-Rp-PS]-2066 izaziva povećanje inkkorporacije<3>H timidina u ćelije slezine iste jačine kao i kontrolni stereorandomizirani PS-Oligo. Nasuprot tome, PS-Oligos [CG-Sp-PS]-2066 je bio suštinski neaktivan. - -Inhibicija inkorporacije<3>H timidina u ćelije slezine R stereoizomerom CpG PS-Oligo.
Nivo inkorporacije<3>H timidina u komorice tretirane sa Rp stereoizomerom je bio niži nego kod kontrolnih komorica, što je sugerisalo moguću inhibitornu aktivnost, iako mikroskopskim ispitivanjem ćelija nije bila vidljiva citotoksičnost. Zaista, kada su ćelije kultivisane sa ekvimolarnom smešom [Mix-PS]-2066 i Potpuno-Rp stereoizomera, tada se javljalo 50% smanjenje nivoa ugrađivanja<3>H timidina u poređenju sa ćelijama koje su kultivisane samo sa [Mix-PS]-2066 (Tabela 17).
Preferencijalna imuna stimulacija sa [ Rp- PS]- Oligos u ranim vremenskim
tačkama.
Analize inkorporacije<3>H timidina koje su izvedene u prethodnim eksperimentima su osetljive na artefakt koji nastaje razgradnjom PS-Oligo, uz oslobađanje hladnog timidina koji je u kompeticiji sa obeleženim materijalom, koji veštački suprimira njegovu inkorporaciju (Matson et al., 1992). Ranije studije su pokazale da su [Rp-PS]-Oligos mnogo podložniji razgradnji nukleazama od Sp delova. Prema tome, bilo je moguće da je verovatni nedostatak stimulatornog efekta [Rp-PS]-Oligo u našim analizama inkorporacije<3>H timidina bio artefakt koji ne odražava prave efekte [Rp-PS]-Oligo. Da bi se detektovali stimulatorni efekti [Rp-PS]-Oligo u ranoj tački vremena, pre razgradnje PS-Oligo, i kao nezavisna biološka analiza za CpG-indukovanu stimulaciju, testirali smo sposobnost ovih PS-Oligos da indukuju brzu fosforilaciju protein kinaze, JNK, aktivirane regulatornim mitogenom. iznenađujuće, našli smo da je usled tretmana sa CpG sekvencama PS-SEO ID NO: 386 i PS-SEO ID NO: 387, u okviru četrdeset minuta fosforilacija JNK bila snažno indukovana, ali ne sa [Sp-PS]-izomerima, već samo sa stereorandomizovanim [Mix-PS]- i sa [Rp-PS]-izomerima. Kontrolni ne-CpG [Mix-PS]-SEQ ID NO: 388 nije indukovao detektabilnu fosforilaciju JNK. Svi uzorci su sadržali slične količine ukupnog JNK proteina.
lako nije detektovan efekat CpG [Sp-PS]-Oligo u analizi fosforilacije JNK, oligo je bio biološki aktivan u ovom eksperimentu zbog toga što je nivo inhibitornog proteina kB-a bio smanjen sa svim CpG PS-Oligos, bez obzira koji je stereoizomer, ali ne i sa kontrolnim ne-CpG PS-SEO ID NO: 388.
Stereo- nezavisnost vezivanja i usvajanja PS- Oligo na ćelijskoj membrani.
Potencijalno objašnjenje koje bi moglo doprineti primećenim razlikama u bioaktivnosti PS-Oligo stereoizomera je da ćelijsko vezivanje ili unos PS-Oligos može biti stereo-zavisno. Da bi se testirala ta mogućnost, P-stereo-određeni PS-Oligos su sintetisani sa fluorescentnim markerima i inkubirani sa ćelijama. U saglasnosti sa ranijim studijama, PS-Oligos su pokazali obrazac ćelijskog unosa koji je zavistan od koncentracije i temperature. Važno je istaći da nije bilo detektabilne razlike u vezivanju ili unosu Rp ili Sp PS-Oligos.
Primer30:
Polu- mekani oligonukleotid C klase ODN 316 i polu- mekani oligonukleotid B klase ODN
313 smanjujuin vivoinflamaciju disajnih puteva indukovanu antigenom
Ova studija je procenjivalain vivoefekat ODN 316 u modelu inflamacije disajnih puteva koja je indukovana antigenom kod miševa. ODN 313 B klase je uključen u studiju radi poređenja.
Postupci.Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzitizovani nultog i 7.-og dana studije sa antigenom (ovalbumin, 10 pg, i.p.) sa aluminijumhidroksidnim adjuvantom (Pierce Alum).
Miševi su imunizovani sa antigenom izlaganjem aerosulu ovalbumina koji se udiše, dva puta svake nedelje, dve uzastopne nedelje. Prva imunizacija je primenjena 21.-og dana studije. Aerosol je pripreman 1 čas od 1% rastvora ovalbumina u PBS korišćenjem DeVilbiss Ultraneb nebulizatora. Odvojeni miševi su se ponašali kao neimunizovana kontrola.
ODN 316 ili ODN 313 (1-100 pg/kg) ili nosač (slani rastvor, 20 pl) su primenjivani intranazalno jednom nedeljeno, dva dana pre prve imunizacije te nedelje.
Krajnje tačke su procenjene 33.-eg dana studije (tj., 48 časova posle poslednje imunizacije antigenom). Ćelije u disajnim putevima su rekuperovane bronholalveolarnom lavažom. Diferencijalno brojanje ćelija izvršeno je pomoću Advia automatskog brojača ćelija gde se uzorci izabrani po slučajnom izboru proveravaju vizualnim brojanjem ćelija na citocentrifugalnim preparatima koji su bojeni sa VVright-Giemsa bojom. Broj CD4<+>T ćelija (CD3<+>CD4<+>ćelija) je izbrojan protočnom citometrijom. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SEM za svaku grupu. Značajnost je merena korišćenjem Kruskall-vVallis testova višestrukog poređenja.
Rezultati.Imunizacija antigenom je izazvala povećanje ukupnog broja leukocita u lumenu disajnih puteva. Povećanje je pretežno bilo posledica nakupljanja eozinofila (npr., 3x10<5>eozinofila/ml kod miševa imunizovanih antigenom, koji su tretirani nosačem nasuprot <1x10<4>eozinofila/ml kod neimunizovanih miševa). Eozinofilija je značajno suprimirana sa ODN 316 ili ODN 313 (npr., oko 5x10<4>eozinofila/ml (P<0.05) kod miševa imunizovanih antigenom koji su tretirani sa 100 pg/ml bilo kog ODN).
Imunizacija antigenom je takođe izazvala nakupljanje CD4<+>T ćelija koje se značajno suprimiraju bilo kojim ODN (npr., oko 2x10<4>CD4<+>T ćelija/ml kod miševa imunizovanih antigenom koji su tretirani sa 100pg/ml bilo kog ODN, naspram oko 1.3x10<5>CD4<+>T ćelija/ml (P<0.05) kod miševa imunizovanih antigenom, tretiranih sa nosačem).
Zaključci.Svaki polu-mekani ODN 316 klase-C i polu-mekani oligonukleotid ODN 313 klase B suprimiraju eozinofiluju disajnih puteva koja je indukovana antigenom i nakupljanje CD4<+>T ćelijain vivo.
Primer 31:
Poređenie polu- mekanih ODN klase B, C i T:in vivoindukcija izlučivanja citokina iz
ćelija slezine kod miševa
Ovom studijom je ispitivana sposobnosti polu-mekanih ODN B, C i T klase dain vivoindukuju izlučivanje citokina iz ćelija slezine kod miševa.
Postupci.Ćelije slezine iz BALB/c miševa su sakupljene i obrazovan je pul ćelija. Ćelije slezine su inkubirane u 48-komornim pločama za kulturu u 1x10<7>ćelija/1 ml u RPMI 1640+10% fetalnog goveđeg seruma koji sadrži pojedinačne ODN (0.001, 0.01, 0.1, 1 ili 10 pg/ml). Testirani ODN obuhvataju polu-mekani ODN 20674 klase B, polu-mekani ODN 316 klase C i polu-mekane ODN 319 i ODN 320 klase T.
Posle inkubacije od 48 časova (37°C, 5% C02), medijum kulture je uklonjen i merene su koncentracije IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-y i TNF-a korišćenjem Luminex citokin multipleks sistema. Koncentracije IL-12p40, IFN-a i IP-10 su merene pomoću ELISA. Donje granice tačne detektabilnosti su 3.2-10 pg/ml. Aktivacioni status ćelija je procenjivan merenjem ekspresije CD40, CD69 i CD89 na CD3+ i B220+ ćelijama protočnom citometrijom.
Rezultati.Svaki ODN indukuje aktivaciju B ćelija (B220+ ćelije) kao što je izmereno povećanom ekspresijom CD40, CD69 i CD886 i aktivaciju T ćelija (CD3+ ćelije) kao što je izmereno povećanom ekspresijom CD69.
ODN su indukovali izlučivanje IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN-a, TNF-a i IP-10. Titar drugih citokina koji je meren nije bio povećan. Na primer, u koncentraciji ODN od 1 pg/ml, nađeno je da su nivoi izlučivanja citokina sledeći (izraženo u pg/ml):
U poređenju sa polu-mekanim ODN 313 klase B, dva polu-mekana ODN klase C su indukovali veće titre IL-10, IL-12p40, IFN-a, TNF-a i IP-10, ali nisu izazvali izraženiju aktivaciju B ćelija. Izgleda da su dva polu-mekana ODN T klase manje efikasna od polu-mekanih ODN B i C klase kao induktori citokina.
Zaključci.Svaki ODN klase B i C ostvaruje profil indukcije citokina koji je u saglasnosti sa aktivacijom TLR9 i svaki je izazvao aktivaciju B ćelija. ODN T klase su bili manje efikasni kao induktori citokina.
U poređenju sa polu-mekanim ODN 313 klase B, polu-mekani ODN 316 i 317 klase C su indukovali veće koncentracije imuno-modifikujućih citokina, ali bez indukovanja veće aktivacije B ćelija. Ovi podaci sugerišu terapeutsku korisnost ODN C klase.
Primer 32:
In vivoindukcija citokina, antitela i CTL kao odgovor na CpG ODN
Merenja citokina: BALB/c miševi su primili 400 mg ODN (SEQ ID NO: 294 (mekani), 241 (polu-mekani), 242 i 286) SC injekcijom. Životinjama je uzimana krv 3 časa posle injekcije i mereni su nivoi IP-10, IFN-gama i TNF-alfa u plazmi pomoću ELISA. Rezultati su prikazani na Slici 41A & B (IP-10), C(IFN) i D & E (TNF).
Odgovor antitela: BALB/c miševi su imunizovani sa 1 mg samog HBsAg ili zajedno sa CpG ODN 1M injekcijom. Životinje su naknadno imunizovane 4.-te nedelje posle prve imunizacije. Titar antitela je meren sa ELISA krajnje tačke. Titar IgG izotipa je meren druge nedelje posle naknadne imunizacije sa ELISA krajnje tačke. Rezultati su prikazani na Slikama 42A i B.
Odgovor citotoksičnih T limfocita: BALB/c miševi su imunizovani sa 1 mg samog HBsAg, ili zajedno sa CpG ODN 1M injekcijom. Životinje su naknadno imunizovane 4 - te nedelje posle prve imunizacije. CTL aktivnost je merena 4.-te nedelje posle naknadne imunizacije analizom 51 Cr oslobađanja. Rezultati su prikazani na Slici 42 C.
Prema tome, mekani i polu-mekani ODN imaju sličnu ili bolju aktivaciju imunog sistema miševa, kao što se moglo videti i uin vitroi uin vivostudijama i mogu povećati antigen specifične imune odgovore.
Primer33:
Primena CpG ODN uin vivoanti- kancer terapiji
ODN ovog pronalaska su testirani na efikasnost kao mono-terapije u tri modela kancera. Na početku su ODN primenjene na miševe koji imaju karcinom bubrežnih ćelija (renca). Postupci su izvedeni na sledeći način: Tumori su indukovani injektiranjem 2x10<5>renca ćelija SC u levu slabinu miševa nultog dana. Zatim sledi tretman koji je obuhvatao SC injekcije PBS, CpG ODN 241 i 242 jednom nedeljno 5 nedelja počevši 10.-og dana posle injekcije ćelija tumora. Rezultati su prikazani na Slici 43 A i B.
Drugi testirani model je bio kancer pluća sa ćelijama koje nisu male ćelije kod miševa (Lewis-ov karcinom pluća). Tumori su indukovani injektiranjem 2x10<6>ćelija Lewis-ovog karcinoma pluća SC u levu slabinu miševa nultog dana. Zatim sledi tretman koji je obuhvatao SC injekcije PBS, 100 mg CpG ODN 241 i 242 na dane 1, 3, 7 & jednom nedeljno 2 meseca. Rezultati su prikazani na Slici 43 E i F.
Treći testirani model je bio neuroblastom miševa. Nultog dana je 1x10<6>Neuro2a ćelija injketirano SC u levu slabinu. SC injekcije sa PBS, 100 mg CpG ODN 241 ili 242 su davane jednom dnevno od 10.-og do 15.-og dana. Rezultati su prikazani na Slici 43 CiD.
Prema tome, polu-mekani ODN mogu kontrolisati rast kancera (renca, LLC, neuroblastom miševa) i povećati preživljavanje miševa koji nose ove kancere.
Primer 34:
Peri- bubrežna inflamaciia koja nastaje kao posledica primene mekanih, polu- mekanih i
tvrdih ODN kodBALB / c TLR - 9 knockout miševa
Peri-bubrežna inflamacija je procenjivana kod BALB/c TLR-9 knockout miševa. Rezultati su prikazani u Tabeli 19 i 20, respektivno. Polu-mekani ODN (241) su indukovali manju inflamaciju na mestu injekcije, nisu indukovali (u dozi od 100 mg) ili su indukovali malu (u dozi od 250 mg) peri-bubrežnu inflamaciju i bolje se podnose posle višestrukih primena ODN.
Smatra se da je specifikacija data u prethodnom tekstu dovoljna da omogući upotrebu ovog pronalaska u praksi. Ovaj pronalazak nije ograničen datim primerima, s obzirom da su primeri samo pojedinačne ilustracije jednog aspekta pronalaska, a u okviru pronalaska se nalaze i drugi funkcionalno ekvivalentni oblici. Različite modifikacije pronalaska pored onih koje su ovde prikazane tehničarima će postati očigledne iz prethodnog opisa, a one su uvršćene i u pridružene patentne zahteve. Prednosti i ciljevi pronalaska nisu nužno obuhvaćeni svakim oblikom pronalaska.
Imunostimulatorv nucleic acids - imunostimulatorne nukleinske kiseline Artificial sequence - sintetička sekvenca
Oligodeoxynucleotide - oligodezoksinukleotid
N is a, c, g or t with phosphorothioate link, 3-10 nucleotides - N je a, c, g ili t sa fosfotioatnom vezom, 3-10 nukleotida
misc_feature - ostale karakteristike
2'-deoxyuracil - 2'-dezoksiuracil

Claims (103)

1. Molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline koji ima najmanje jedan unutrašnji pirimidin-purin (YZ) dinukleotid i himerni osnovni lanac, gde najmanje jedan unutrašnji YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde izborno svaki dodatni unutrašnji YZ dinukletoid ima fosfodiestarsku, njoj sličnu, ili stabilizovanu internukleotidnu vezu i gde su sve ostale internukleotidne veze stabilizovane.
2. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 1, gde imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži više unutrašnjih YZ dinukleotida koji imaju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu.
3. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 2, gde svaki unutrašnji YZ dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu.
4. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 1, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline bilo koji od SEQ ID NO: 55-99 i SEQ ID NO: 241, gde znak<*>koji je prikazan u SEQ ID NO u specifikaciji predstavlja fosforotioat, _ predstavlja fosfodiestar, U predstavlja 2'-deoksiuracil i 7 predstavlja 7-deazaguanin.
5. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 1, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran iz grupe koju čine:
6. Oligonukleotid, koji sadrži: molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline koji sadrži himerni osnovni lanac i najmanje jednu sekvencu NiYGN2, gde je nezavisno za svaku sekvencu NiYGN2YG unutrašnji pirimidin-guanozin (YG) dinukleotid, svako Nii N2je, nezavisno jedan od drugoga, bilo koji nukleotid i gde je najmanje jedna sekvenca NiYGN2i izborno svaka dodatna sekvenca NiYGN2: YG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i (a) Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid, (b) G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, ili (c) Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je Niunutrašnji nukleotid i G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, gde su sve druge internukleotidne veze stabilizovane.
7. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 6, gde imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži više sekvenci NiYGN2, gde za svaku sekvencu NiYGN2YG: YG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i (a) Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N-i unutrašnji nukleotid, (b) G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid, ili (c) Nii Y su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N-iunutrašnji nukleotid i G i N2su vezani fosfodiestarskom ili njoj sličnom internukleotidnom vezom kada je N2unutrašnji nukleotid.
8. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 6, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline bilo koji od SEQ ID NO: 105-231, gde oznaka<*>koja je prikazana u SEQ ID NO u specifikaciji predstavlja fosforotioat i _ predstavlja fosfodiestar.
9. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 6, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran iz grupe koju čine:
10. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 6, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran iz grupe koju čine:
11. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 6, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline izabran iz grupe koju čine:
12. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde je najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid, koji ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, CG.
13. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde je najmanje jedan unutrašnji YG dinukleotid, koji ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, TG.
14. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline B klase.
15. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline C klase.
16. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline dužine 4-100 nukleotida.
17. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-7, gde molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline nije antisens oligonukleotid, oligonukleotid koji formira trostruki heliks ili ribozom.
18. Oligonukleotid koji sadrži gde je svako Nii N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 1-20 nukleotida, gde _ označava unutrašnju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde je N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida i gde G-N2-C obuhvata 1 ili 2 stabilizovane veze.
19. Oligonukleotid koji sadrži gde je svako Nii N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 1-20 nukleotida, gde _ označava unutrašnju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde je N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 4-20 nukleotida i gde G-N2-C obuhvata 5 stabilizovanih veza.
20. Oligonukleotid koji sadrži gde je svako Ni, N2i N3nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida i gde _ označava unutrašnju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu, gde oligonukleotid nije antisens oligonukleotid, oligonukleotid koji formira trostruki heliks ili ribozom.
21. Oligonukleotid koji sadrži gde je svako Nii N2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca dužine 0-20 nukleotida, gde je n=2 ili n= 4-6, gde je svako Xi i X2nezavisno nukleinsko kiselinska sekvenca koja ima fosforotioatne internukleotidne veze od 3-10 nukleotida, gde Nr (GTCGTT)n-N2obuhvata najmanje jednu fosfodiestarsku internukleotidnu vezu i gde 3' i 5' nukleotidi oligonukleotida ne obuhvataju poli-G, poli-A, poli-T ili poli-C sekvencu.
22. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde nukleinska kiselina ima osnovni lanac koji sadrži dezoksiribozu ili ribozu.
23. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde oligonukleotid dodatno sadrži adjuvant ili citokin, ili antigen.
24. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde je fosfodiestarska ili njoj slična internukleotidna veza fosfodiestar.
25. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde je veza slična fosfodiestarskoj vezi borofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat.
26. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde su stabilizovane internukleotidne veze izabrane iz grupe koju čine: fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosforotioat i bilo koja njihova kombinacija.
27. Oligonukleotid bilo kog od patentnih zahteva 1-21, gde su stabilizovane internukleotidne veze fosforotioat.
28. Oligonukleotid koji sadrži: 5T<*>C<*>G<*>T<*>CGTTTTGANiCGN2<*>T<*>T3' (SEQ ID NO: 296) gde je Nidužine 0-6 nukleotida i izborno je 0-2 nukleotida, gde je N2dužine 0-7 nukleotida, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde oligonukleotid obuhvata najmanje 2 fosfodiestarske internukleotidne veze i izborno oligonukleotid je dužine 16-24 nukleotida.
29. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 28, gde je stabilizovana internukleotidna veza fosforotioatna veza.
30. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 28, gde oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
31. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 28, gde oligonukleotid obuhvata najmanje jedan C_G motiv sa fosfodiestarskom internukleotidnom vezom.
32. Oligonukleotid koji sadrži: gde je Nidužine 0-4 nukleotida, gde je N4dužine 1-5 nuleotida i izborno 1-2 nukleotida, gde je N5dužine 0-7 nukleotida, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde oligonukleotid obuhvata najmanje 3 fosfodiestarske internukleotidne veze i izborno oligonukleotid je dužine 16-24 nukleotida.
33. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 32, gde je stabilizovana internukleotidna veza fosforotioatna veza.
34. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 32, gde oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
35. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 32, gde oligonukleotid obuhvata najmanje jedan C_G motiv sa fosfodiestarskom internukleotidnom vezom.
36. Oligonukleotid koji sadrži: gde je N bilo koji nukleotid, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde oligonukleotid obuhvata najmanje 3 fosfodiestarske internukleotidne veze i izborno 5 fosfodiestarskih internukleotidnih veza i gde je oligonukleotid dužine 16-24 nukleotida.
37. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 36, gde je stabilizovana internukleotidna veza fosforotioatna veza.
38. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 36, gde oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
39. Oligonukleotid koji sadrži: gde je N8dužine između 4 i 10 nukleotida i obuhvata najmanje 1 C_G motiv i izborno najmanje 2 ili 3 CG motiva, gde je Ng dužine između 0 i 3 nukleotida, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze i gde je oligonukleotid dužine 15-40 nukleotida.
40. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 39, gde je N8PuCGPyPyCG, PuCGPyPyCGCG ili ACGTTCG.
41. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 39, gde N8obuhvata najmanje jedan CG motiv.
42. 40. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 39, gde je N8CCG.
43. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 39, gde oligonukleotid ima sledeću strukturu:
44. Oligonukleotid koji sadrži: gde su N6i N7nezavisno dužine između 1 i 5 nukleotida i izborno N6je jedan nukleotid, poželjno T ili A i izborno N7je dužine pet nukleotida, poželjno pet pirmidina ili TTTG, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze i gde je oligonukleotid dužine 16-40 nukleotida.
45. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 44, gde oligonukleotid ima sledeću strukturu:
46. Oligonukleotid koji sadrži: gde je N10dužine između 4 i 8 nukleotida i obuhvata najmanje 1 C_G motiv i izborno obuhvata najmanje 2 ili 3 CG motiva, gde su X-i, X2, X3i X*nezavisno C ili G, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze i gde je oligonukleotid dužine 24-40 nukleotida.
47. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 46, gde oligonukleotid ima sledeću strukturu:
48. Oligonukleotid koji sadrži: gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze i izborno gde je oligonukleotid dužine 21-40 nukleotida.
49. Oligonukleotid koji sadrži: oktamernu sekvencu koja sadrži najmanje jedan YZ dinukleotid koj ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i najmanje 4 T nukleotida, gde je Y pirimidin ili modifikovani pirimidin, gde je Z guanozin ili modifikovani guanozin i gde oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
50. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde oktamerna sekvenca obuhvata TTTT motiv.
51. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde oktamerna sekvenca obuhvata . dva YZ dinukleotida.
52. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 51, gde oba YZ dinukleotida imaju fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu.
53. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je Y nemetilovani C.
54. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je Z guanozin.
55. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je oktamerna sekvenca izabrana iz grupe koju čine T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T, C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>T, G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T, T<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G, C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A, T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C-G, T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C-G<*>T, T<*>T<*>G<*>A<*>C-G<*>T<*>T, T<*>G<*>A<*>C-G<*>T<*>T<*>T, G<*>A<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T, A<*>C-G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G, C-G*T*T*TT*G*T, T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C-G, T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C-G<*>T, G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C i T<*>T<*>G<*>T<*>C-G<*>T<*>T, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze i gde _ označava prisustvo fosfodiestarske internukleotidne veze.
56. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde oligonukleotid ima dužinu od 8-40 nukleotida.
57. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je veza slična fosfodiestarskoj, borofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat.
58. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde su stabilizovane internukleotidne veze izabrane iz grupe koju čine: fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosforotioat i bilo koja njihova kombinacija.
59. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je Y citozin ili modifikovane baze citozina izabrane iz grupe koju čine 5-metilcitozin, 5-metil-izocitozin, 5-hidroksi-citozin, 5-halogenocitozin, uracil, N4-etil-citozin, 5-fluoro-uracil i vodonik.
60. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je Z guanin ili modifikovana baza guanina izabrana iz grupe koju čine 7-deazaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin (kao što je 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin, 7-deaza-8-supstituisani guanin, hipoksantin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, purin, 8-supstituisani guanin kao što je 8-hidroksiguanin i 6-tioguanin, 2-aminopurin i vodonik.
61. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde oligonukleotid ima 3'-3' vezu sa jednim ili dva dostupna 5' kraja.
62. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde oligonukleotid ima dva dostupna 5' kraja, gde je svaki od njih 5TCG.
63. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je oligonukleotid sekvenca izabrana iz grupe koju čine
64. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je oligonukleotid sekvenca izabrana iz grupe koju čine
65. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 49, gde je oligonukleotid sekvenca izabrana iz grupe koju čine
66. Oligonukleotid koji sadrži: gde najmanje jedan CG dinukleotid ima fosfodiestarsku ili njoj sličnu internukleotidnu vezu i oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
67. Oligonukleotid koji sadrži: 5'GNC3', gde je N nukleinsko kiselinska sekvenca dužine od 4-10 nukleotida i najmanje 50% T i ne obuhvata CG dinukleotid i oligonukleotid obuhvata najmanje jednu stabilizovanu internukleotidnu vezu.
68. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 67, gde N uključuje TTTT motiv.
69. Oligonukleotid iz patentnog zahteva 68, gde je oligonukleotid izabran iz grupe koja se sastoji iz G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>T<*>C I G<*>T<*>T<*>T<*>T<*>G<*>A<*>C, gde<*>označava prisustvo stabilizovane internukleotidne veze.
70. Postupak moduliranja imunog odgovora, koji obuhvata primenu na subjekta oligonukleotida iz bilo kog od patentnih zahteva 1-69, u efikasnoj količini da bi se modulirao imuni odgovor.
71. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečila astma kod subjekta.
72. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečila alergija kod subjekta.
73. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečio kancer kod subjekta.
74. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečila infektivna bolest kod subjekta.
75. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečila autoimuna bolest kod subjekta.
76. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen subjektu da bi se lečilo remodelovanje vazdušnih puteva kod subjekta.
77. Postupak iz patentnog zahteva 70, koji dalje obuhvata primenu sa ili bez antigena na subjekta.
78. Postupak iz patentnog zahteva 70, koji dalje obuhvata primenu terapeutskog protokola na subjekta.
79. Postupak iz patentnog zahteva 78, gde je terapeutski protokol hirurška intervencija.
80. Postupak iz patentnog zahteva 78, gde je terapeutski protokol radijacija.
81. Postupak iz patentnog zahteva 78, gde je terapeutski protokol medikament.
82. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid formulisan.
83. Postupak iz patentnog zahteva 82, gde je oligonukleotid povezan sa ciljnim molekulom.
84. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde je oligonukleotid dopremljen putem izabranim iz grupe koja se sastoji od oralno, nazalno, sublingvalno, intravenski, subkutano, mukozno, respiratorno, direktna injekcija i dermalno.
85. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde se oligonukleotid primenjuje na subjekta u količini koja je efikasna u indukciji ekspresije citokina.
86. Postupak iz patentnog zahteva 85, gde je citokin izabran iz grupe koju čine IL-6, TNFa, IFNa, IFNyi IP-10.
87. Postupak iz patentnog zahteva 70, gde se oligonukleotid primenjuje na subjekta u količini koja je efikasna da promeni imuni odgovor od Th2 zasnovanog odgovora u Th1 zasnovani odgovor.
88. Postupak za tretiranje remodelovanja vazdušnih puteva, koji obuhvata: primenu na subjekta oligonukleotida koji sadrži CG dinukleotid, u količini koja je efikasna za lečenje remodelovanja vazdušnih puteva kod subjekta.
89. Postupak iz patentnog zahteva 88, gde subjekat ima astmu.
90. Postupak iz patentnog zahteva 88, gde subjekat ima hroničnu opstruktivnu bolest pluća.
91. Postupak iz patentnog zahteva 88, gde je subjekat pušač.
92. Postupak iz patentnog zahteva 88, gde subjekat nema simptome astme.
93. Postupak iz patentnog zahteva 88, gde je oligonukleotid oligonukleotid iz bilo kog od patentnih zahteva 1-66.
94. Primena oligonukleotida bilo kog od patentnih zahteva 1-69 za stimulaciju imunog odgovora.
95. Postupak za proizvodnju leka oligonukleotida iz bilo kog od patentnih zahteva 1-69 za stimulaciju imunog odgovora.
96. Primena oligonukleotida bilo kog od patentnih zahteva 1-69 u proizvodnji leka za modulaciju imunog odgovora kod subjekta.
97. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima astmu.
98. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima alergiju.
99. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima kancer.
100. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima infektivnu bolest.
101. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima autoimunu bolest.
102. Primena patentnog zahteva 96, gde subjekat ima remodelovanje vazdušnih puteva.
103. Primena patentnog zahteva 96, gde medikament obuhvata ili ne obuhvata antigen.
YUP-2005/0126A 2002-08-19 2003-08-19 Imunostimulatorne nukleinske kiseline RS20050126A (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40447902P 2002-08-19 2002-08-19
US40482002P 2002-08-19 2002-08-19
US42970102P 2002-11-27 2002-11-27
US44737703P 2003-02-14 2003-02-14
PCT/US2003/025935 WO2004016805A2 (en) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostimulatory nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050126A true RS20050126A (sr) 2007-06-04

Family

ID=31892263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0126A RS20050126A (sr) 2002-08-19 2003-08-19 Imunostimulatorne nukleinske kiseline

Country Status (27)

Country Link
US (2) US8283328B2 (sr)
EP (2) EP1538904B1 (sr)
JP (2) JP5414961B2 (sr)
KR (2) KR20080011247A (sr)
AR (1) AR040996A1 (sr)
AU (2) AU2003259916B2 (sr)
BR (1) BR0313414A (sr)
CA (1) CA2493753C (sr)
DK (2) DK1538904T3 (sr)
EC (1) ECSP055687A (sr)
ES (2) ES2600553T3 (sr)
HU (2) HUE035336T2 (sr)
IL (1) IL166376A (sr)
MA (1) MA27468A1 (sr)
MX (1) MXPA05002014A (sr)
NO (1) NO20051469L (sr)
NZ (2) NZ538001A (sr)
OA (1) OA12906A (sr)
PE (2) PE20040900A1 (sr)
PL (2) PL227938B1 (sr)
PT (2) PT1538904T (sr)
RS (1) RS20050126A (sr)
SI (1) SI2290078T1 (sr)
SV (1) SV2008001602A (sr)
TW (1) TW200412981A (sr)
UY (1) UY27945A1 (sr)
WO (1) WO2004016805A2 (sr)

Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU733310C (en) * 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
AU760549B2 (en) * 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
JP2002514397A (ja) * 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
ES2572834T3 (es) 1999-02-17 2016-06-02 Csl Limited Complejos inmunogénicos y métodos relacionados con los mismos
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
NZ517929A (en) * 1999-09-25 2004-02-27 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
EP1296714B1 (en) * 2000-06-22 2009-08-26 University Of Iowa Research Foundation Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer.
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
JP2005500806A (ja) * 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
ES2307568T3 (es) * 2000-12-08 2008-12-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos.
EP2423335B1 (en) * 2001-06-21 2014-05-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
ATE411054T1 (de) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
EP1441763A2 (en) * 2001-11-07 2004-08-04 Inex Pharmaceuticals Corp. Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
EP3006043B1 (en) * 2002-04-04 2019-05-29 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004005476A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
CN1753687A (zh) * 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
CA2502015A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
AU2004226605A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
MXPA05012421A (es) * 2003-05-16 2006-02-22 Hybridon Inc Tratamiento sinergistico de cancer usando inmunomeros junto con agentes quimioterapeuticos.
MXPA05013922A (es) * 2003-06-20 2006-02-24 Coley Pharm Group Inc Antagonistas de receptor tipo toll de molecula pequena.
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
AU2004275876B2 (en) * 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
CA2542099A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
EP1678303A2 (en) 2003-10-30 2006-07-12 Coley Pharmaceutical GmbH C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
JP2007526253A (ja) * 2004-02-19 2007-09-13 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性ウイルスｒｎａオリゴヌクレオチド
JP2007531746A (ja) * 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
US20080113929A1 (en) * 2004-06-08 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic Oligonucleotide as Carrier Platform for Antigen and Immunostimulatory Agonist and Antagonist
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US20080009455A9 (en) * 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
JP2008535859A (ja) * 2005-04-08 2008-09-04 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 感染症によって悪化した喘息を治療するための方法
AU2006241149A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
KR20080030656A (ko) * 2005-07-07 2008-04-04 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 암 치료를 위한 항-ＣＴＬＡ-4 항체 및 ＣｐＧ-모티프-함유합성 올리고데옥시뉴클레오티드의 조합 요법
US20090214578A1 (en) * 2005-09-16 2009-08-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory Single-Stranded Ribonucleic Acid with Phosphodiester Backbone
CN101321868A (zh) * 2005-09-16 2008-12-10 科利制药公司 通过核苷酸修饰调节短干扰核糖核酸(siRNA)的免疫刺激特性
JP4538522B2 (ja) * 2005-11-25 2010-09-08 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド
WO2007089051A1 (en) * 2006-02-01 2007-08-09 Eyegene Inc. Composition for treating cancer comprising oligonucleotide and non-toxic lps
DK2405002T3 (en) 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Compositions and methods for oligonukleotidformuleringer
US20080026986A1 (en) * 2006-06-05 2008-01-31 Rong-Fu Wang Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
PT2078080E (pt) 2006-09-27 2015-09-18 Coley Pharm Gmbh Análogos dos oligonucleotídeos cpg que contêm análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulante potenciada
US8377898B2 (en) * 2006-10-12 2013-02-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
WO2009027105A2 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Neurimmune Therapeutics Ag Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
CN101820908A (zh) * 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
WO2009105641A2 (en) 2008-02-20 2009-08-27 New York University Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity
WO2010053435A2 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Index Pharmaceuticals Ab Compounds and methods for the treatment of inflammatory diseases of the cns
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
CN103800906B (zh) 2009-03-25 2017-09-22 德克萨斯大学系统董事会 用于刺激哺乳动物对病原体的先天免疫抵抗力的组合物
RU2612521C2 (ru) 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
JP2013520498A (ja) 2010-02-25 2013-06-06 デューク ユニバーシティー 防御的抗ｈｉｖ−１抗体の産生を誘導する方法
MX337040B (es) 2010-09-09 2016-02-09 Pfizer Moleculas de union a 4-1bb.
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
WO2012084991A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Index Pharmaceuticals Ab Biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system ii
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
EP2858722B8 (en) 2012-06-08 2018-02-21 Aduro BioTech, Inc. Compostions and methods for cancer immunotherapy
AR091569A1 (es) 2012-06-28 2015-02-11 Intervet Int Bv Receptores de tipo toll
CA2879066C (en) * 2012-07-13 2019-08-13 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
US9695212B2 (en) 2012-12-13 2017-07-04 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
ES2878749T3 (es) 2013-02-20 2021-11-19 Innate Pharma Un compuesto que se une específicamente a KIR3DL2 para el uso en el tratamiento de linfoma de células T periférico
US9840533B2 (en) 2013-04-29 2017-12-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
WO2014179760A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
PE20160080A1 (es) 2013-05-18 2016-02-21 Aduro Biotech Inc Composiciones y metodos para activar la senalizacion que depende del estimulador del gen de interferon
US9549944B2 (en) * 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
US20160130346A1 (en) 2013-05-29 2016-05-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Kir3dl2 is a biomarker and a therapeutic target useful for respectively preventing and treating a subset of cutaneous and non-cutaneous peripheral t-cell lymphomas
US10176292B2 (en) 2013-07-31 2019-01-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center STING crystals and modulators
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
JPWO2015108048A1 (ja) * 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
BR112016016400A2 (pt) 2014-01-16 2017-10-03 Wave Life Sciences Ltd Composições de oligonucleotídeos quiralmente controlados, seu uso, sua composição farmacêutica, e métodos
TR201908550T4 (tr) 2014-06-04 2019-07-22 Exicure Inc Profilaktik veya terapötik uygulamalar için lipozomal sferik nükleik asitler tarafından immün modülatörlerin çok değerlikli teslimi.
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
US11213593B2 (en) 2014-11-21 2022-01-04 Northwestern University Sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
PL3240801T3 (pl) 2014-12-31 2021-06-14 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Skojarzona immunoterapia nowotworów
US10449212B2 (en) 2015-07-09 2019-10-22 National Institute For Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
JP2019520339A (ja) * 2016-06-03 2019-07-18 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド、その組成物および方法
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
US12460208B2 (en) 2017-04-18 2025-11-04 Parr Biotechnology Co., Ltd. Immunomodulatory polynucleotides and uses thereof
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
CR20200260A (es) * 2017-12-15 2020-08-01 Bayer Animal Health Gmbh Composiciones inmunoestimulantes
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019160866A2 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor immunotherapy
BR112020020479A2 (pt) 2018-04-09 2021-01-12 Checkmate Pharmaceuticals Empacotamento de oligonucleotídeos em partículas similares a vírus
SG11202009877XA (en) * 2018-04-12 2020-11-27 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
US12391942B2 (en) 2018-05-11 2025-08-19 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
MX2020012607A (es) 2018-05-23 2021-01-29 Pfizer Anticuerpos especificos para gucy2c y sus usos.
KR102602329B1 (ko) 2018-05-23 2023-11-16 화이자 인코포레이티드 Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도
US20220370606A1 (en) 2018-12-21 2022-11-24 Pfizer Inc. Combination Treatments Of Cancer Comprising A TLR Agonist
CA3164623A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Pfizer Inc. Antibodies specific for cd47, pd-l1, and uses thereof
IL294621A (en) * 2020-01-10 2022-09-01 Sbi Biotech Co Ltd Tlr9 agonist oligonucleotides, compositions comprising same and uses thereof
EP4559477A3 (en) 2020-05-13 2025-08-13 Adagene AG Compositions and methods for treating cancer
WO2022034555A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
JP2022161046A (ja) * 2021-04-08 2022-10-21 グラドコフ・アレクセイ Ｎｋ細胞能力アップ方法

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
DE3280400D1 (de) 1981-10-23 1992-06-04 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
ATE162198T1 (de) 1992-07-27 1998-01-15 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) * 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
EP1003531B1 (en) 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999001154A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
JP4663113B2 (ja) 1997-09-05 2011-03-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 抗原刺激顆粒球媒介炎症を予防または軽減するための免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用
JPH11209289A (ja) 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
EP1071753A2 (en) 1998-04-20 2001-01-31 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
CA2328602A1 (en) 1998-05-06 1999-11-11 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
JP2002514397A (ja) 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
JP2002521489A (ja) 1998-07-27 2002-07-16 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体および関連する方法
HK1042706A1 (zh) 1998-08-03 2002-08-23 东卡罗来纳大学 低腺苷反义寡核苷酸制剂、组合物、试剂盒及处理
WO2000014217A2 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1177439B1 (en) 1999-04-29 2004-09-08 Coley Pharmaceutical GmbH Screening for immunostimulatory dna functional modifiers
EP1377554A1 (en) 1999-06-16 2004-01-07 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
EP2314693A3 (en) 1999-08-13 2012-11-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
NZ517929A (en) 1999-09-25 2004-02-27 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids
AU783118B2 (en) * 1999-09-27 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
AU2001227889A1 (en) 2000-01-14 2001-07-24 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20010044416A1 (en) 2000-01-20 2001-11-22 Mccluskie Michael J. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a Th2 immune response
CA2398432C (en) 2000-01-26 2012-06-19 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
EP1267618A1 (en) 2000-03-28 2003-01-02 The Regents Of The University Of California Methods for increasing a cytotoxic t lymphocyte response in vivo
DE10016079A1 (de) * 2000-03-31 2001-10-04 Alstom Power Nv Verfahren zum Entfernen von Kohlendioxid aus dem Abgas einer Gasturbinenanlage sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
RU2413520C2 (ru) 2000-06-08 2011-03-10 Интерселл Аг Вакцинная композиция, содержащая иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды
EP1296714B1 (en) 2000-06-22 2009-08-26 University Of Iowa Research Foundation Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer.
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
JP2005500806A (ja) 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
AU2001294750C1 (en) 2000-09-26 2008-09-18 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
ES2307568T3 (es) 2000-12-08 2008-12-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos.
WO2002053141A2 (en) 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
EP2423335B1 (en) 2001-06-21 2014-05-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
US20030148316A1 (en) 2001-08-01 2003-08-07 Lipford Grayson B. Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
US20030133988A1 (en) 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
WO2003020884A2 (en) 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
ATE411054T1 (de) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
WO2003027313A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SUPPRESSORS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE
CN1633598A (zh) 2001-10-05 2005-06-29 科勒制药股份公司 Toll样受体3信号传导的激动剂和拮抗剂
US20050238660A1 (en) * 2001-10-06 2005-10-27 Babiuk Lorne A Cpg formulations and related methods
US20030139364A1 (en) 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003054161A2 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
EP3006043B1 (en) 2002-04-04 2019-05-29 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
KR101092043B1 (ko) 2002-04-22 2011-12-12 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도
US20040009949A1 (en) 2002-06-05 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory CpG nucleic acids
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
CN1753687A (zh) 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
US20040248837A1 (en) 2002-11-01 2004-12-09 Eyal Raz Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
WO2004058159A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
CA2512484A1 (en) 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
AU2004226605A1 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
EP1631687A2 (en) 2003-04-22 2006-03-08 Coley Pharmaceutical GmbH Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
MXPA05012421A (es) 2003-05-16 2006-02-22 Hybridon Inc Tratamiento sinergistico de cancer usando inmunomeros junto con agentes quimioterapeuticos.
MXPA05013922A (es) 2003-06-20 2006-02-24 Coley Pharm Group Inc Antagonistas de receptor tipo toll de molecula pequena.
MXPA06000619A (es) 2003-07-15 2006-04-11 Hybridon Inc Estimulacion sinergistica del sistema inmune usando oligonucleotidos inmunoestimuladores y/o compuestos inmunomeros en conjunto con citocinas y/o agentes quimioterapeuticos o terapia de radiacion.
AU2004275876B2 (en) 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
EP1678303A2 (en) 2003-10-30 2006-07-12 Coley Pharmaceutical GmbH C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
CA2549173A1 (en) 2003-12-08 2005-07-07 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
JP2007526253A (ja) 2004-02-19 2007-09-13 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性ウイルスｒｎａオリゴヌクレオチド
CN101217973A (zh) 2004-03-12 2008-07-09 海布里顿公司 使用第二代免疫调节寡核苷酸增强的hiv疫苗活性
JP2007531746A (ja) 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
US20080113929A1 (en) 2004-06-08 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic Oligonucleotide as Carrier Platform for Antigen and Immunostimulatory Agonist and Antagonist
US7498425B2 (en) 2004-06-15 2009-03-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
JP4942646B2 (ja) 2004-06-15 2012-05-30 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫賦活オリゴヌクレオチドマルチマー
US7283209B2 (en) * 2004-07-09 2007-10-16 Carl Zeiss Smt Ag Illumination system for microlithography
EP1776105A2 (en) 2004-07-18 2007-04-25 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Methods and compositions for inducing innate immune responses
US20060287263A1 (en) 2004-07-18 2006-12-21 Csl Limited Methods and compositions for inducing antigen-specific immune responses
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US20080009455A9 (en) 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
JP2008535859A (ja) 2005-04-08 2008-09-04 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 感染症によって悪化した喘息を治療するための方法
AU2006241149A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
KR20080030656A (ko) 2005-07-07 2008-04-04 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 암 치료를 위한 항-ＣＴＬＡ-4 항체 및 ＣｐＧ-모티프-함유합성 올리고데옥시뉴클레오티드의 조합 요법
US7490795B2 (en) * 2005-08-31 2009-02-17 Goodrich Corporation Aircraft evacuation slide with primary gas relief valve
US20090214578A1 (en) 2005-09-16 2009-08-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory Single-Stranded Ribonucleic Acid with Phosphodiester Backbone
CN101321868A (zh) 2005-09-16 2008-12-10 科利制药公司 通过核苷酸修饰调节短干扰核糖核酸(siRNA)的免疫刺激特性
WO2007038720A2 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Coley Pharmaceutical Gmbh Modulation of tlr-mediated immune responses using adaptor oligonucleotides
US7776834B2 (en) 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
JP4538522B2 (ja) 2005-11-25 2010-09-08 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド
DK2405002T3 (en) 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Compositions and methods for oligonukleotidformuleringer
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
MX2009003403A (es) 2006-09-27 2009-04-09 Coley Pharm Group Inc Composiciones de ligandos de tlr y antivirales.
PT2078080E (pt) 2006-09-27 2015-09-18 Coley Pharm Gmbh Análogos dos oligonucleotídeos cpg que contêm análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulante potenciada
AU2007353120A1 (en) 2006-10-26 2008-11-20 Coley Pharmaceutical Gmbh Oligoribonucleotides and uses thereof
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
CA2687441A1 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Class a oligonucleotides with immunostimulatory potency
CN101820908A (zh) 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2290078B1 (en) 2017-04-26
KR20080011247A (ko) 2008-01-31
AR040996A1 (es) 2005-04-27
DK2290078T3 (en) 2017-07-31
MA27468A1 (fr) 2005-08-01
WO2004016805A9 (en) 2004-08-19
EP1538904A2 (en) 2005-06-15
WO2004016805A3 (en) 2005-02-17
US8304396B2 (en) 2012-11-06
HUE030347T2 (en) 2017-05-29
HUE035336T2 (en) 2018-05-02
EP2290078A2 (en) 2011-03-02
EP1538904B1 (en) 2016-07-27
AU2003259916A1 (en) 2004-03-03
CA2493753A1 (en) 2004-02-26
UY27945A1 (es) 2004-03-31
US20070224210A1 (en) 2007-09-27
AU2009251186B2 (en) 2013-05-30
PL232260B1 (pl) 2019-05-31
EP2290078A3 (en) 2013-02-13
AU2003259916B2 (en) 2010-01-21
IL166376A (en) 2012-10-31
DK1538904T3 (en) 2016-11-21
ECSP055687A (es) 2005-05-30
JP2011004746A (ja) 2011-01-13
NZ538001A (en) 2008-05-30
ES2600553T3 (es) 2017-02-09
ES2634328T3 (es) 2017-09-27
MXPA05002014A (es) 2005-10-19
PL375398A1 (en) 2005-11-28
BR0313414A (pt) 2007-07-31
AU2009251186A1 (en) 2010-01-28
US20050059619A1 (en) 2005-03-17
EP1538904A4 (en) 2008-03-05
PE20040900A1 (es) 2004-12-29
IL166376A0 (en) 2006-01-16
KR100969727B1 (ko) 2010-07-13
OA12906A (en) 2006-10-13
KR20050034738A (ko) 2005-04-14
PL227938B1 (pl) 2018-01-31
WO2004016805A2 (en) 2004-02-26
SV2008001602A (es) 2008-02-27
JP2006508693A (ja) 2006-03-16
US8283328B2 (en) 2012-10-09
NZ560722A (en) 2009-10-30
SI2290078T1 (sl) 2017-08-31
PT2290078T (pt) 2017-07-31
JP5414961B2 (ja) 2014-02-12
PE20081155A1 (es) 2008-08-15
PL414814A1 (pl) 2016-03-14
PT1538904T (pt) 2016-11-08
TW200412981A (en) 2004-08-01
CA2493753C (en) 2014-07-08
NO20051469L (no) 2005-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8304396B2 (en) Immunostimulatory nucleic acids
KR101251707B1 (ko) 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
US20180171338A1 (en) Compositions and methods for oligonucleotide formulations
US20060211644A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
EP1578954A2 (en) 5&#39; cpg nucleic acids and methods of use
ZA200500963B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1154903A (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1154903B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226A (en) Immunostimulatory nucleic acids