RS20050129A - Antagonisti nogo receptora - Google Patents

Antagonisti nogo receptora

Info

Publication number
RS20050129A
RS20050129A YUP-2005/0129A YUP20050129A RS20050129A RS 20050129 A RS20050129 A RS 20050129A YU P20050129 A YUP20050129 A YU P20050129A RS 20050129 A RS20050129 A RS 20050129A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nogo receptor
antibody
polypeptide
antigen
amino acid
Prior art date
Application number
YUP-2005/0129A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel Lee
Blake Pepinsky
Weiwei Li
Sylvia Rabacchi
Jane Relton
Dane Worley
Stephen Strittmatter
Dinah Sah
Original Assignee
Yale University,
Biogen Idec Ma Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yale University,, Biogen Idec Ma Inc., filed Critical Yale University,
Publication of RS20050129A publication Critical patent/RS20050129A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Opisani su imunogeni polipeptidi Nogo receptora-1, antitela protiv Nogo receptora-1‚ njihovi antigen-vezujući fragmenti, rastvorljivi Nogo receptori i fuzioni proteini i nukleinske kiseline koje kodiraju navedene. Takodje, opisani su preparati koji sadrže, kao i postupci za dobijanje i korišćenje antitela protiv Nogo receptora, njihovi antigen - vezujućih fragmenata, rastvorljivih Nogo receptora, kao i njihovih fuzionih proteina i nukleinske kiseline koje ih kodiraju.

Description

ANTAGONISTI NOGO RECEPTORA
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na neurobiologiju i molekularnu biologiju. Specifično predmetni pronalazak se odnosi na imunogene polipeptide Nogo receptora - 1, antitela protiv Nogo receptora - 1, na njihove antigen - vezujuće fragmente, na rastvorljive Nogo receptore i njihove fuzione proteine kao i na nukleinske kiseline koje ih kodiraju. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na preparate koji sadrže, kao i postupke za dobijanje i korišćenje antitela protiv Nogo receptora, njihovih antigen - vezujućih fragmenata, na imunogene polipeptide Nogo receptora - 1, rastvorljive Nogo receptore i njihove fuzione proteine, kao i na nukleinske kiseline koje ih kodiraju.
Pozadina pronalaska
Aksoni i dendriti neurona su dugački ćelijski nastavci nervnih ćelija. Distalni kraj aksona ili neurita sadrži specijalizovani region koji je poznat kao konus rasta. Konusi rasta detektuju signale iz svog okruženja i usmeravaju rast aksona ka ciljnoj ćeliji neurona. Konusi rasta reaguju na nekoliko signala iz spoljašnje sredine, npr., na površinsku athezivnost, na prisustvo faktora rasta, neurotransmitera i električnih polja. Usmeravanje rasta u konusu uključuje različite klase athezivnih molekula i intercelularnih signala, kao faktora koji stimulišu i inhibiraju rast konusa. Konus rasta neurita koji raste, napreduje različitim brzinama, ali tipično brzinom od 1 do 2 mm na dan. Konusi rasta imaju oblik šake sa širokim ravnim prstastim nastavcima (mikrošiljci ili filopodije) koji diferencijalno prijanjaju za površine u embrionu. Filopodije su konstantno aktivne a neke filopodije se retrahuju unazad ka konusu rasta, dok druge nastavljaju da se produžavaju kroz supstrat. Elongacije između različitih filopodija formiraju lamelopodije.
Konus rasta istražuje područje koje se nalazi ispred njega kao i na njegovim stranama, svojim lamelopodijama i filopodijama. Kada elongacija stupi u kontakt sa površinom koja nije pogodna za rast ona se povlači. Kada elongacija stupi u kontakt sa površinom koja je pogodna za rast, ona nastavlja da se produžava i vodi konus rasta u tom pravcu. Konus rasta može biti vođen posredstvom malih varijacija u svojstvima površine supstrata. Kada konus rasta dopre do odgovarajuće ciljne ćelije, formira se sinaptička konekcija.
Funkcija nervne ćelije u mnogome zavisi od neurona i drugih ćelija u njegovom okruženju (U. Rutishauser, T. M. Jessell, Phvsiol. Rev. 1988, 68, p. 819). Navedene ćelije obuhvataju specijalizovane glialne ćelije, oligo dendrocite u centralnom nervnom sistemu (CNS) i Švanove ćelije u perifernom nervnom sistemu (PNS), koje obmotavaju akson sa milinom (struktura sa više slojeva koja izoluje neuron) (G. Lemke, u An Introduction to Molecular Neurobiologv, Z. Hali, Ed. (Sinauer, Sanderlend, Mass., 1992), p. 281).
Iako neuroni u CNS imaju kapacitet da se regenerišu nakon povrede, ovo njihovo svojstvo je inhibirano prisustvom inhibitornih proteina koji se nalaze u milinu i moguće, takođe, usled prisustva drugih tipova molekula koji se normalno nalaze u njihovom okruženju (Brittis i Flanagen, Neuron 2001. 30, pp. 11 - 14; Jones et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp. 2792
- 2803; Grimpe et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp. 3144 - 3160).
Nekoliko inhibitornih proteina milina koji su nađeni na oligodendrocitima je do sada karakterizovano, npr., NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434 - 439; Grandpre et al., Nature, 2000, 403, 439 - 444), glikoprotein koji je udružen sa milinom (MAG, McKerracher et al., Neuron 1994, 13, 757 - 767) i glikoprotein oligodendrocita (OM - gp, Mikol i Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106, 1273 - 1279). Svaki od navedenih proteina je pokazano daje ligant neuronskih Nogo receptora - 1 (Wang et al., Nature 2002, 417, 941 - 944; Liu et al., Science, 2002, 297, 1190 - 93; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434 - 439; Grandpre et al., Nature, 2000, 403, 439 - 444; Domeniconi et al., Neuron, 2002, 35, 283 - 90).
Nogo receptor - 1 je GPI - usidreni membranski protein koji sadrži osam leucinom bogatih repetitivnih sekvenci (Fournier et al., Nature 2001, 409, 341 - 346). Nakon interakcije sa inhibitornim proteinom (npr., NogoA, MAG i OM - gp), Nogo receptor - 1 kompleks prevodi signale koji dovode do kolapsa konusa rasta i do inhibicije rasta neurita.
Postoji urgentna potreba za pronalaženjem molekula koji inhibiraju vezivanje Nogo receptora - 1 sa svojim ligandima i koji umanjuju kolaps konusa rasta koji je posredovan mijelinom i koji ublažavaju inhibiciju rasta neurita.
Suština pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na rastvorljive polipeptide Nogo receptora - 1 i na fuzione proteine koji ih sadrže, kao i na antitela i njihove antigen - vezujuće fragmente koji su usmereni protiv specifičnih imunogenih regiona Nogo receptora - 1. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na imunogene polipeptide Nogo receptora - 1 koji se vezuju sa antitelima, prema predmetnom pronalasku. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide prema predmetnom pronalasku, vektore i ćelije - domaćine koje sadrže navedene nukleinske kiseline, kao i na postupke za dobijanje ovih peptida. Antitela, rastvorljivi receptori i receptorski fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku antagonizuju ili blokiraju, Nogo receptor - 1 i korisni su za inhibiciju vezivanja Nogo receptora - 1 sa njegovim Ugandom, inhibiciju kolapsa konusa rasta u neuronu i za smanjenje inhibicije rasta neurita kod neurona.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje imunogeni polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine sekvence Čiji su ID br. 1, ID br. 2, ID br.3, ID br.4 i sekvenca čiji je ID br.5.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju navedene imunogene polipeptide, vektore koji sadrže navedene nukleinske kiseline, kao i ćelije - domaćine koje sadrže navedene nukleinske kiseline ili vektore. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina je operativno povezana sa sekvencom koja kontroliše ekspresiju.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju imunogenog polipeptida koji sadrži korake: a) kultivacije ćelije - domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni peptid ili vektor sa datom nukleinskom kiselinom;
b) dobijanje polipeptida iz ćelije - domaćina ili podloge kulture. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje antitela koja se specifično vezuje za
Nogo receptor - 1 i koji sadrži sledeće korake: a) imunizacije domaćina sa polipeptidom koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji su ED br.l, ID br.2, ID br.3, i ID br.5, ili ćelije domaćina koja eksprimira navedene polipeptide i b) dobijanje tog antitela. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment se dobijaju na ovaj način. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment se specifično vezuju za polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine polipeptidi sekvenci čiji su ID brojevi: ID br.l, ID br.2, ID br.3, ID br.4, ID br.5. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment: a) inhibira kolaps konusa rasta neurona; b) smanjuje inhibiciju rasta neurita i njegovog izrastanja iz neurona i c) inhibira vezivanje Nogo receptora - 1 za odgovarajući ligand. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment pospešuju preživljavanje neurona koji se nalazi u rizku da umre. U nekim rešenjima, neuron koji se nalazi u riziku da umre jeste neuron neke životinje, npr., neuron sisara. U nekim rešenjima, rast neurita i njegovo izrastanje iz njega jeste aksonski rast. U nekim rešenjima, neuron je neuron centralnog nervnog sistema
(CNS).
U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment je monoklonskog porekla. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment jeste antitelo miša. U nekim rešenjima, antitelo je humanizovano antitelo, himerično antitelo ili jednolančano antitelo.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijsku liniju hibridoma koja je izabrana iz grupe koju čine HB 7E11 (ATCC<®>pristupni br. PTA - 4587), HB 1H2 (ATCC<®>pristupni br. PTA - 4584), HB 3G5 (ATCC<®>pristupni br. PTA - 4586), HB 5B10 (ATCC<®>pristupni br. PTA - 4588), HB 2F7 (ATCC<®>pristupni br. PTA - 4585). U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment se dobija pomoću ćelijske linije hibridoma.
U nekim rešenjima, antitelo ili njegov - antigen vezujući fragment sadrže laki lanac, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine: a) aminokiselinska sekvenca čija sekvenca ima ID br. 15; b) aminokiselinska sekvenca čija sekvenca ima ID. br 16; c) aminokiselinska sekvenca koja sadrži CDR1, CDR2, CDR3 čije su aminokiselinske sekvence, sekvence čiji su ID brojevi 22, ID br. 23, ID br. 24. U nekim rešenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine: a) aminokiselinska sekvenca koja ima ID br. 17; b) aminokiselinska sekvenca koja ima ID br. 18; i c) aminokiselinska sekvenca koja sadrži CDR1, CDR2, CDR3, čije su aminokiselinske sekvence imaju ID brojeve 19, 20 i 21. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina je operativno povezana sa sekvencom koja kontroliše ekspresiju. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju - domaćina koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim rešenjima, antitelo ili antigen - vezujući faktor se kompetitivno inhibiraju vezivanjem antitela dobijenog posredstvom ćelijske linije hibridoma za Nogo receptor - 1 ili neki imunogeni polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine sekvence čiji su ID brojevi 1, 2, 3, 4 i 5.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak inhibicije vezivanja Nogo receptora - 1 za ligand, pri čemu se postupak sastoji od koraka uspostavljana kontakta Nogo receptora - 1 sa antitelom ili antigen - vezujućim fragmentom prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, ligand je izabran iz grupe koju čine NogoA, NogoB, NogoC, MAG i OM - gp.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju kolapsa konusa rasta u neuronu koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta neurona sa antitelom ili njegovim antigen - vezujućim fragmentom prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje inhibicije rasta neurita ili njegovog izrastanja iz neurona, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta neurona sa antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, neuron je neuron CNS. U nekim od navedenih postupaka, rast neurita ili njegovo izrastanje jeste aksonsko izrastanje. U nekim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, obezbeđen je postupak pospešivanja preživljavanja neurona koji se nalazi u riziku od umiranja, koji obuhvata uspostavljanje kontakta neurona sa efikasnom količinom: a) anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njegovog antigen - vezujućeg fragmenta ili b) rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida. U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid je fuzioni protein, npr., to je Fc fuzioni protein. U nekim rešenjima, fuzioni protein je sNogoR344 - Fc protein. U nekim rešenjima neuron raste uin vitrouslovima normalno. U nekim rešenjima, neuron je neuron sisara, koji pokazuje znake ili simptome npr., multiple skleroze, ALS, Hantingtonove bolesti, Alchajmerove bolesti, Parkinskonove bolesti, dijabetične neuropatije, moždanog udara, traumatskih povreda mozga i povreda kičmene moždine.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pospešivanje preživljavanja neurona koji se nalazi u riziku od umiranja, pri čemu je neuron poreklom .iz organizma sisara, koji obuhvata: a) obezbeđivanje kulture ćelije - domaćina koja eksprimira (i) anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment; ili (ii) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid i b) uvođenje ćelije - domaćina u organizam sisara u blizini ili na samom mestu oštećenog neurona.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak genske terapije za pospešivanje preživljavanja neurona u organizmu sisara, pri čemu se neuron nalazi u riziku od umiranja, koji obuhvata korak primene u blizini ili na samom mestu oštećenog neurona, virusnog vektora koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira (a) anti. - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment ili (b) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid , pri čemu su anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen - vezujući fragment, ili rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid eksprimirani od strane nukleotidne sekvence u ćeliji sisara u količini koja je dovoljna da pospeši preživljavanje neurona.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid koji se sastoji praktično od N - terminalnog domena (NT), od osam leucinom bogatih repetitivnih domena (LRR) i LRR C - terminalni domena (LRRCT) Nogo receptora - 1. U nekim rešenjima, navedeni rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid je spojen sa signalnom sekvencom. U nekim rešenjima, LRR sadrži heterologi LRR. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine: aminokiseUnski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 6; aminokiselinski ostaci 26-319 sekvence čiji je ID br.7; aminokiselinski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; aminokiselinski ostaci 26-310 sekvence čiji je ID br.9; aminokiselinski ostaci 27 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; aminokiselinski ostaci 27-310 sekvence čiji je ID br.9. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira navedeni rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju - domaćina koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu ili vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida, prema predmetnom pronalasku i sastoji se od koraka: a) kultivacije ćelije - domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid ili vektor koji sadrži tu nukleinsku kiselinu i b) dobijanje polipeptida iz ćelije - domaćina ili podloge kulture.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje Nogo receptor - 1 fuzioni protein koji sadrži rastvorljivi Nogo receptor - 1 i heterologi polipeptid. U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor -1 polipeptid se sastoji praktično od N - terminalnog domena (NT), od osam leucinom bogatih repetitivnih domena (LRR) i od LRR C - terminalnog domena (LRRCT) Nogo receptora - 1. U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid je povezan sa signalnom sekvencom. U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 fuzioni protein sadrži heterologi LRR. U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 fuzioni protein je izabran iz grupe koju čine: aminokiselinski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 6; aminokiselinski ostaci 26-310 sekvence čiji je ID br.7; aminokiselinski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; aminokiselinski ostaci 26-310 sekvence čiji je ID br.9; aminokiselinski ostaci 27 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; aminokiselinski ostaci 27-310 sekvence čiji je ID br.9. U nekim rešenjima, heterologi polipeptid sadrži imunoglobulinski konstantni region. U nekim rešenjima, imunoglobulinski konstantni region je region teškog lanca imunoglobulina. U nekim rešenjima, konstantni region teškog lanca imunoglobulina je konstantni region teškog lanca IgG. U nekim rešenjima, heterologi polipeptid je Fc region. U nekim rešenjima, Nogo receptor -1 fuzioni protein je dimer.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju - domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje Nogo receptor - 1 fuzionog proteina, koji obuhvata korake: a) kultivacije ćelije - domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein, ili vektor koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu; i b) dobijanje Nogo receptor - 1 fuzionog proteina iz ćelije domaćina ili podloge kulture.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak inhibicije vezivanja Nogo receptora - 1 za njegov ligand, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa Nogo receptor - 1 fuzionim proteinom, prema predmetnom pronalsku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak modulisanja, aktivnosti Nogo receptora - 1 koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa Nogo receptor - 1 fuzionim proteinom, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju kolapsa konusa rasta kod neurona koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta Nogo receptor - l liganda sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa Nogo receptor - 1 fuzionim proteinom, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje inhibicije rasta neurita ili njegovog izrastanja iz neurona, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili Nogo receptor - 1 fuzionim proteinom, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, neuron je neuron CNS. U nekim rešenjima, ligand je izabran iz grupe koju čine NogoA, NogoB, NogoC, MAG i OM - gp. U nekim rešenjima, rast neurita ili njegovo izrastanje je aksonski rast.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje preparat koji sadrži farmaceutski prihvatljivi nosilac i sastojak koji je izabran iz grupe koju čine: a) antitelo ili antigen - vezujući fragment, prema predmetnom pronalasku; b) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid prema predmetnom pronalasku; c) Nogo receptor - 1 fuzioni protein, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, preparat prema predmetnom pronalasku dalje sadrži jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava.
Kratki opis crteža
Slika 1. predstavlja šematski prikaz strukture Nogo receptora - 1, humani NogoR310, sadrži ostatke 26 - 310, a sNogoR344 sadrži ostatke 27 - 344. Pacovski sNogoR310 sadrži ostatke 27 - 310, a sNogoR344 sadrži ostatke 27 - 344.
Slika 2. prikazuje dijagram antigenosti za Nogo receptor - 1, korišćenjem softvera Vector Nti ™. Pacovski P-617 poseduje sekvencu čiji je ID broj 10, a pacovski P - 618 poseduje sekvencu čiji je ID broj 11.
Slika 3a. predstavlja grafikon koji opisuje anti - Nogo receptor - 1 antitelo, označeno kao 7E11. Grafikon predstavlja efekat koncentracije antitela 7E11 na vezivanje Nogo66 liganda za Nogo receptor - 1. Slika 3b. pokazuje vezivanje anti - Nogo receptor - 1 antitela označenog kao 1H2. Grafikon predstavlja efekat koncentracije antitela 1H2 na vezivanje Nogo66 liganda za sNogoR344 - Fc (koje je ovde takođe označeno kao i u U. S. Patentnoj prijavi 60/ 402,866 kao Fc - sNogoR344 ili Ig - sNogoR344). Fc - MAG nije u kompetitivnom odnosu sa Ugandom Nogo66 pri vezivanju za sNogoR344 - Fc.
Slika 4. prikazuje rezultate ELISA za anti - Nogo - R - 1 antitela 1H2, 3G5 i 2F7. Efekat antitela je određivan na OD450u prisustvu imobilisanih antigena. Imobilisani antigeni su sNogoR310 - Fc (ovde takođe označen kao i u U.S. patentnoj prijavi 60/ 402,866, kao Fc - sNogoR310 ili Ig sNogoR310), sNogoR344 - Fc, p- 617, p - 618, p - 4, p - 5 i ovalbumin i
BSA.
Slika 5. predstavlja grafikon koji opisuje efekter monoklonskog antitela, ozančenog kao 7E11 na rast pacovskog DRG neurita u prisustvu različitih količina mijelina.
Slika 6a. je slika koja pokazuje efekat vezivanja sNogoR310 za I25I - Nogo 66 i za 125I - Nogo40 u prisustvu sledećih kompetitora: Nogo66, Nogo40 i supernatanta anti - Nogo receptor - 1 monoklonskog antitela. Slika 6b. Prikazuje veziva<n>je12<5>I - Nogo 66 za sNogoR310.
Slika 7. je grafikon koji prikazuje efekat sNogoR310 - Fc na<l25>I - Nogo40 vezivanje za sNogoR310.
Slika 8. je grafikon koji prikazuje vezivanje sNogoR310 - Fc za<125>I - No<g>o40.
Slika 9a. je grafikon koji predstavlja efekat sNogoR310 na rast neurita po ćeliji u prisustvu ili odsustvu mijelina. Slika 9b. je grafikon koji prikazuje efekat sNogoR310 na rast neurita u prisustvu ili odsustvu mijelina.
Slika 10a. je grafikon koji prikazuje efekat sNogoR310 - Fc na rast p - 4 pacovskog DRG neurita u u prisustvu ili odsustvu povišenih količina mijelina. Slika10bpokazuje broj neurita po ćeliji nakon tretmana sa PBS, PBS + sNogoR310 - Fc, sa 20 ng mijelina i sa mijelinom + sNogoR310 - Fc.
Slika 11. je grafikon koji prikazuje efekat monoklonskog antitela 5B10 na rast DRG neurita po ćeliji u prisustvu povišenih količina mijelina.
Slika 12. je grafikon koji prikazuje efekat sNogoR310 - Fc na BBB rezultat sve do 30 dana nakon indukcije povrede u pacovskom modelu transekcije kičmene moždine.
Slike 13a. i 13b. prikazuju lokomotornu BBB ocenu u funkciji vremena nakon dorzalne hemisekcije kod WT ili transgenih miševa iz linije 08 ili linije 01. Slika 13c. je grafikon ugla maksimalno tolerisanog nagiba ravni u funkciji vremena od povrede kod WT ili transgenih miševa. Slika 13d. Prikazuje poremećaje u pokretanju zadnjih ekstremiteta tokom penjanja po žičanoj mreži pod nagibom u funkciji vremena nakon povrede. Na svim navedenim grafikonima, prikazane su srednje vrednosti ± standardna greška merenja za po 7 - 9 miševa u svakoj od grupa. Vrednosti grupe transgenih miševa su statistički značajno različite u odnosu na vrednosti ze WT miševe (<**>p < 0,01; studentov t - test).
Slika 14a. pokazuje lokomotornu BBB ocenu u funkciji vremena nakon dorzalne hemisekcije kod životinja koje su tretirane vehikulumom ili sa sNogoR310 - Fc. Slika 14b. prikazuje poremećaje u pokretanju zadnjih ekstremiteta, tokom kretanja po nagnutoj žičanoj mreži u funkciji vremena nakon povrede. Slika 14c. Prikazuje analizu otiska stopala kojom se otkriva manja dužina koraka i veća širina koraka kod kontrolnih miševa u odnosu na pacove bez povreda ili u odnosu na pacove koji su povređeni i tretirani sa sNogoR310 - Fc. Na svim ovim grafikonima, rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± standardna greška merenja za 7-9 pacova u svakoj od grupa. Vrednosti grupe koja je tretirana sa sNogoR310 - Fc su statistički znatno različite od vrednosti u kontrolnoj grupi (Slike 14a. - b.). Vrednosti kontrolne grupe su statistički značajno različite od grupe pacova bez povrede kičmene moždine ili od grupe pacova sa povredom kičmene moždine koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc, što je prikazano na slici 14c. (<*>p < 0,05;<**>p < 0,01; studentov t - test).
Detaljni opis pronalaska
Definicije i opšte tehnike
Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao i ono koje je uobičajeno od strane stručnjaka, kojima je ovaj pronalazak i namenjen. U slučaju konflikta, predmetna prijava, uključujući definicije ima prednost, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, pojmovi u jednini obuhvataju i množinu istih pojmova, a pojmovi u množini obuhvataju i oblike u jednini. Sve publikacije, patenti i druge reference inkorporirani su po referenci u celosti u bilo koju svrhu da se koriste.
Iako se u praksi ili ispitivanju prema predmetnom pronalasku mogu upotrebiti postupci ili materijali koji su slični ili ekvivalentni onim koji su opisani ovde, odgovarajući postupci i materijali su opisani u tekstu koji sledi. Materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativne prirode i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska. Druge karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska biće jasne na osnovu detaljnog opisa i na osnovu pridodatih patentnih zahteva.
U predmetnoj specifikaciji i pridodatim patentnim zahtevima, reč "obuhvatati" ili njene varijacije "obuhvata" ili "obuhvatajući", označavaju uključivanje navedene varijable ili grupe varijabli, ali ne i isključivanje navedene varijable ili grupe varijabli. Kako bi se dalje definisao predmetni pronalazak, ovde su obezbeđeni sledeći pojmovi i definicije.
Kao što se ovde koristi, pojam "antitelo", označava intaktni molekul imunoglobulina ili njegov antigen - vezujući fragment. Antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu biti bilo kog izotipa ili klase (npr., klase M, D, G, E i A) ili bilo koje subklase (npr., Gl - 4, Al - 2), a mogu imati ili kapa (k) ili lambda (X) laki lanac.
Kao što se ovde koristi, pojam "Fc" označava deo konstantnog regiona teškog lanca nekog antitela, koji se dobija razgradnjom pomoću papajina.
Kao što se ovde koristi, pojam "NogoR fuzioni protein" označava protein koji sadrži kao podjedinicu Nogo receptor - 1, koja je fuzionisana sa heteterologim polipeptidom.
Kao što se ovde koristi, pojam "humanizovano antitelo", označava antitelo u kome je barem jedan deo ne - humanih sekvenci zamenjen humanim sekvencama. Primeri za dobijanje humanizoavanih tela mogu se naći u U. S. Patentnim prijavama 6,054,297; 5,886,152 i 5,877,293.
Kao što se ovde koristi pojam, "himerično antitelo", označava antitelo koje sadrži jedan ili više regiona iz prvog antitela ijedan ili više regiona iz najmanje jednog drugačijeg antitela. Prvo antitelo i dodatna antitlela, mogu biti poreklom iz iste ili iz različitih vrsta.
Kao što se ovde koristi, i kao što se koristi u U. S. Patentnoj prijavi 60/ 402, 866, "Nogo receptor", "NogoR", "NogoR - 1", "NgR" i "NgR - 1" označavaju Nogo receptor - 1.
Imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptidi
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje Nogo receptor - 1 polipeptide koji su imunogeni. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku imunogeni polipeptid se sastoji praktično od aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz grupe koju čine:
U nekim rešenjima predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid čija je sekvenca ID brojeva 1 do 5. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, molekul nukleinske kiseline je povezan sa sekvencom za kontrolu ekspresije (npr., pCDNK (I)).
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira imunogeni polipetid, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, vektor je vektor za kloniranje. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, vektor je ekspresioni vektor. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, vektor sadrži makar jedan selektabilni marker.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćelije - domaćine koje sadrže gore opisanu nukleinsku kiselinu ili vektor.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak dobijanja imunogenog polipeptida prema predmetnom pronalasku, koji obuhvata korak kultivacije ćelije - domaćina. U nekim rešenjima ćelija - domaćin je prokariotska ćelija. U nekim rešenjima ćelija - domaćin je eukariotska ćelija. U nekim rešenjima ćelija - domaćin je ćelija gljivice.
Antitela
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela ili na njihove antigen - vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju za imunogene Nogo receptor - 1 polipeptide, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, antitelo ili antigen - vezujući fragment se vezuje za polipeptid koji se praktično sastoji od aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz grupe koju čine sekvence čiji su ID brojevi od 1 do 5. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, može da se proizvede uin vivoiliin vitrouslovima. Proizvodnja antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta, je opisana u tekstu koji sledi.
Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, inhibira vezivanje Nogo receptora - 1 za odgovarajući ligand (npr., NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM- gp) i umanjuje inhibiciju rasta i izrastanja neurita koja je posredovana mijelinom, posebno aksonskog rasta, i umanjuje kolaps konusa rasta koji je posredovan mijelinom.
U nekim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili odgovarajući antigen - vezujući fragment je poreklom iz miša. U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 je poreklom iz pacova. U drugim rešenjima, Nogo receptor - 1 je poreklom od čoveka. U nekim rešenjima prema predmetnom pronalasku, anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili odgovarajući antigen - vezujući fragment je rekombinantno konstruisano genetskim inžinjeringom, humanizovano i/ili himerično.
U nekim rešenjima, antitelo je izabrano iz grupe koju čine: monoklonsko 7E11 antitelo (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4587); monoklonsko 1H2 antitelo (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4584); monoklonsko 2F7 antitelo (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4585); monoklonsko 3G5 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4586); i monoklonsko 5B11 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4588). U nekim rešenjima, antitelo je poliklonsko antitelo 46.
Primeri antigen vezujućih fragmenata su Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb, i fragmenti koji sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR - Complementaritv Determining Region), jednolančana antitela (scFv), himerična antitela, dvostruka antitela i polipeptidi koji sadrže barem jedan deo imunoglobulina koji je dovoljan za ispoljavanje vezivanja za specifični antigen (npr., imunoathezini).
Kao što se ovde koristi Fd označava fragment koji se sastoji od Vhi Cm domena; Fv označava fragment koji se sastoji od VL i VHdomena jedne grane antitela; a dAb označava fragment koji se sastoji od VHdomena (Ward et al., Nature 341: 5444 - 546, 1989). Kao što se ovde koristi, jednolannčano antitelo (scFv) predstavlja antitelo u kome su Vli Vhregioni upareni tako da se formiraju monovalentni molekuli posredstvom sintetskog veznika, koji omogućava da ovi molekuli budu u formi jedno lančanog proteina (Bird et al, Science 242: 423 - 426, 1988 i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883, 1988). Kao što se ovde koristi, dvostruko antitelo, označava bispecifično antitelo u kome su VHi VLdomeni eksprimirani najednom polipeptidnom lancu, s tim da se koristi veznik koji je suviše kratak da bi omogućio uparivanje ova dva domena na istom lancu, čime se ovi domeni primoravaju da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i čime nastaju dva antigen - vezujuća mesta (videti npr., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448, 1993, i Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121 - 1123, 1994). Kao što se ovde koristi, imunoathezin koji se specifično vezuje za antigen koji je od interesa, označava molekul u kome jedan ili više CDR - ova može biti inkorporirano , bilo kovalentno, bilo ne kovalentno.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje podjedinicu polipeptida, Nogo receptor - 1 antitela prema predmetnom pronalasku, pri čemu je od podjedinica polipeptida izabrana iz grupe koju čine: a) teški lanac ili njegov varijabilni region; b) laki lanac ili njegov varijabilni region.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca ili laki lanac i varijabilni region lakog lanca, podjedinice polipeptida Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje hipervarijabilni region (CDR) Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku ili nukleinsku kiselinu koja kodira CDR.
Imunizacija
Antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju imunizacijom odgovarajućeg domaćina (npr., kičmenjaka, uljučujući čoveka, miša, pacova, ovce, koze, svinje, krave, konje, reptile, ribe, vodozemce, kao i jaja ptica, reptila i riba). Takva antitela mogu biti monoklonska i poliklonska.
U nekim rešenjima, domaćin se imunizuje sa imunogenim Nogo receptor - 1 polipeptidom, prema predmetnom pronalasku. U drugim rešenjima, domaćin se imunizuje sa Nogo receptor - 1 koji je udružen sa ćelijskom membranom intaktne ili razorene ćelije, a antitela prema predmetnom pronalasku, se identifikuju vezivanjem za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 antigen se primenjuje sa adjuvansom kako bi se stimulisao imuni odgovor. Često je neophodno da se adjuvansi primene uz antigen kako bi se izazvao imuni odgovor na antigen. Pomenuti adjuvansi su obučno nerastvorljive ili nerazgradljive supstance, koje pospešuju nespecifičnu infiamatornu reakciju, sa regrutovanjem mononuklearnih fagocita na mestu imunizacije. Primeri adjuvanasa uključuju, bez ograničenja Freundov adjuvans, RIBI (muramil dipeptidaze), ISCOM (imunostimulišuće komplekse) ili njihove fragmente.
Za revijski pregled postupaka za dobijanje antitela, videti npr., Harlow & Lane (1988), Antibodies, A Laboratorv Manual; Yelton, D. E. Et al., (1981), Ann. Rev. Of Biochem., 50, pp. 657 - 80., i Ausubel et al., (1989), Current Protocols in Molecular Biologv (Nju Jork: John Wiley & Sons). Određivanje imunoreaktivnosti sa imunogenim Nogo receptor - 1 polipetidom, prema predmetnom pronalasku, može da se izvede korišćenjem bilo kog poznatog postupka u struci, uključujući, npr., imunoblot test i ELISA.
Proizvodnja antitela i ćelijske linije za proizvodnju antitela
Monoklonska antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju standardnim postupcima koji su opisani u npr., Harlow i Lane (1988.), navedeno gore.
Ukratko, u odgovarajućem vremenskom trenutku životinaja se žrtvuje, a njen linfhi čvor i/ili B- ćelije iz slezine, se imortalizuju korišćenjem jedne od tehnika koje su dobro poznate u struci, uključujući bez ograničenja, transformaciju, kao što je transformacija sa EBV ili uključujući fuziju sa imortalizovanom ćeljskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma. Tako se ćelije klonski izdvajaju a supernatanti svakog od klonova se ispituju na proizvodnju antitela koje je specifično za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku. Postupci selekcije, kloniranja i ekspanzije hibridoma su dobro poznate u struci. Slično tome, postupci za identifiklaciju nukleotidne i aminokiselinske sekvence gena za imunoglobulin, takođe, poznatih u struci.
Druge pogodne tehnike za proizvodnju antitela, prema predmetnom pronalasku, obuhvatajuin vitroizlaganje limfocita Nogo receptom - 1 ili imunogenom polipeptidu prema predmetnom pronalasku ili alternativno, izborom iz biblioteke sekvenci antitela u fagu ili u sličnim vektorima. Videti, Huse et al, Science, 246, pp. 1275 - 81 (1989). Antitela koja su korisna za korišćenje u postupku prema predmetnom pronalasku, mogu da se upotrebe uz ili bez dalje identifikacije.
Antigeni, (Nogo receptor - 1 ili imunogeni polipeptid prema predmetnom pronalasku) i antitela, mogu biti obeleženi spajanjem, bilo kovalentno, bilo ne kovalentno sa supstancom koja obezbeđuje signal za detekciju. Struci su poznate različite oznake i tehnike konjugacije koje se mogu upotrebiti u praksi predmetnog pronalaska. Pogodne oznake obuhvataju, bez ograničenja, radionukleotide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluoroscentna sredstva, hemiluminoscentna sredstva, magnetne čestice i slično. Patenti koji opisuju korišćenje takvih oznaka obuhvataju U. S. Patente broj 3,817,837; 3,850,752; 3,393,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Takođe, mogu se dobiti i rekombinantni imunoglobulini (videti U. S. patent broj 4, 816,567).
U nekim rešenjima predmetnog pronalaska, antitelo poseduje višestruke specifičnosti vezivanja, kao stoje to slučaj sa bifunkcionalnim antitelom dobijenom korišćenjem jedne od brojnih tehnika koje su poznate stručnjacima, uključujući, proizvodnju hibridnih hibridoma, bisulfidnu izmenu, hemijsko ukrštanje, dodavanje peptidnih veznika između dva monoklonska antitela, uvođenje dva seta imunoglobulinskih teških i lakih lanaca u odgovarajuću ćelijsku liniju i tome slično (videti tekst ispod za dalje detalje ove diskusije).
Antitela prema predmetnom pronalasku, takođe mogu biti monoklonska antitela, npr., ona antitela koja su dobijena pomoću imortalizovanih humanih ćelija, pomoću SCID - hu miševa ili pomoću drugih životinja koje su sposobne za proizvodnju "humanih" antitela.
Biblioteke faga
Anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu biti izolovana, ispitivanjem biblioteka rekombinantnih kombinatornih antitela. Primeri kombinatornih biblioteka su dati za vezivanje za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku, i to su scFv fag biblioteka, koja je pripremljena korišćenjem cDNK od VLi VHkoje su dobijene putem iRNK izvedene iz životinja koje su imunizovane sa imunogenim Nogo receptor - 1 polipeptidom, prema predmetnom pronalasku. U struci su poznati postupci za dobijanje i za pretragu navedenih biblioteka. Postoje komercijalno dostupni postupci i materijali za dobijanje biblioteka faga (npr., Pharmacia Recombinant Phage Antibodv Svstem, kataloški broj 27 - 9400 - 01; the Stratagene SurfZAP™ komplet za prikazivanje faga, kataloški broj 240612; i drugi kompleti koje proizvodi MorphoSvs). Takođe, postoje drugi postupci i reagensi koji mogu da se koriste za dobijanje i pretragu biblioteka antitela (videti, npr., Lander et al. U. S. Patentni broj 5,223,409; Kang et al. PCT publikacija br. WO 92/18619; Dower et al. PCT publikacija br. WO 91/17271; Winter et al. PCT publikacija br. WO 92/20791; Markland et al. PCT publikacija br. WO 92/15679; Breitling et al. PCT publikacija br. WO 93/01288; McCaffertv et al. PCT publikacija br. WO92/01047; Garrard et al. PCT publikacija br. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/ Technology 9: 1370 - 1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hvbridomas 3: 81 - 85; Huse et al. (1989)Science 246: 1275 - 1281; McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552 - 554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725 - 734; Havvkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889 - 896, Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624 - 628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576 - 3580; Garrad et al.
(1991) Bio/ Technology 9: 1373 - 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4133
- 4137; i Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978 - 7982.
Nakon pretrage i izolacije anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, iz biblioteka rekombinantnih imunoglobulina, iz paketa za prikazivanje, mogu da se dobiju nukleinske kiseline koje kodiraju izabrano antitelo (npr., iz genoma faga) i da se subkloniraju u druge ekspresione vektore korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK. Ukoliko je to poželjno, sa nukleinskom kiselinom je moguća dalja manipulacija kako bi se dobili drugi oblici antitela, prema predmetnom pronalasku, kao što je opisano u tekstu koji sledi. Da bi se eksprimiralo antitelo koje je izolovano ispitivanjem kombinatorne biblioteke, DNK koja kodira teški lanac i laki lanac ili varijabilne regione ovih lanaca odgovarajućeg antitela se klonira u rekornbinantni vektor za ekspresiju i uvodi se u ćeliju domaćina sisarskog porekla kao što je opisano u prethodnom tekstu.
Promena klase antitela
Anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu biti bilo kog izotipa. Antitelo bilo kog poželjnog izotipa može da se dobije promenom klase. Da bi došlo do promene klase nukleinske kiseline koje kodiraju VLili Vh, a koje ne sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju CLili Ch, se izoluju korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci. Nakon toga nukleinske kiseline koje kodiraju VLili VHse operativno špovezuju sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju Clili Chželjene klase imunoglobulinskog molekula. Ovo može da se postigne korišćenjem vektora ili nukleinske kiseline koja sadrži Clili Chlanac, kao što je opisano u tekstu iznad. Na primer, anti - Nogo receptor - 1 antitelo, prema predmetnom pronalasku, koje je orginalno IgM klase može da promeni klasu u IgG. Dalje, promena klase može da se iskoristi za prevođenje jedne IgG podklase u drugu, npr., za promenu iz IgGl klase u IgG2 klasu.
Mutirana antitela
U drugim rešenjima, antitela ili antigen vezujući fragmenti, prema predmetnom pronalasku, mogu biti mutirani u svojim varijabilnim domenima teškog i/ili lakog lanca, u cilju izmene vezujućih svojstava antitela. Na primer, moguće je napraviti mutaciju u jednom ili u više CDR domena, kako bi se povećala ili smanjila KDantitela za Nogo receptor - 1, kao bi se povećala ili smanjila Koff, ili kako bi se promenila specifičnost vezivanja antitela. U struci su dobro poznate tehnike za mesto - usmerene - mutageneze. Videti, npr., Sambrook et al. i Ausubel et al. navedeno iznad. U poželjnom rešenju, mutacije se prave na aminokiselinskom ostatku za koji je poznato da će biti promenjen u poređenju sa originalnim aminokiselinskim ostatkom u varijabilnom regionu anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, mutacije se prave na jednom ili na više aminokiselinskih ostataka za koje je poznato da će biti promenjene u poređenju sa originalnim aminokislinskim ostacima u varijabilnom ragionu anti Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku. U drugom rešenju, nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region teškog ili lakog lanca antitela se mutira u jednom ili u više okvirnih regiona. Moguće je napraviti mutaciju u okvirnom regionu ili u konstantnom domenu molekula u cilju povećanja poluživota molekula. Mutacija u okvirnom regionu ili u konstantnom domenu, takođe može da se napravi u cilju izmene imunogenosti antitela, u cilju obezbeđivanja mesta za kovalentno ili ne kovalentno vezivanje za drugi molekul ili u cilju izmene svojstava kao što je fiksacija komplementa. Mutacije je moguće napraviti u svakom od okvirnih regiona u svakom konstantnom domenu i u svakom varijabilnom regionu pojedinačnog mutiranog antitela. Alternativno, moguće je napraviti mutacije samo u jednom okvirnom regionu, samo u jednom varijabilnom regionu ili samo u jednom konstantnom domenu pojedinačnog mutiranog antitela.
Fuziona antitela i imunoathezini
U drugom rešenju, fuziono antotelo ili imunoathezin mogu biti napravljeni tako da sadrže sve ili samo neki deo nekog anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, koje je povezano sa drugim polipeptidom. U nekim rešenjima, samo je varijabilni region anti - Nogo receptor - 1 antitela povezan sa polipeptidom. U drugim rešenjima VHdomen anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, je povezan sa prvim polipeptidom, dok je VLdomen antitela povezan sa drugim polipeptidom koji se udružuje sa prvim polipeptidom, na takav način da je omogućeno da Vli Vhdomeni interaguju jedan sa drugim, kako bi se formiralo vezujuće mesto antitela. U drugim rešenjima, VHdomen je razdvojen od VLdomena veznikom koji omogućava da Vli Vhdomen interaguju jedan sa drugim (videti tekstispod naslova Jednolančana antitela).Antitelo konfiguracije Vh- veznik - VLse zatim povezuje sa polipeptidom od interesa. Fuziono antitelo je korisno za usmeravanje polipeptida ka određenoj ćeliji ili tkivu koje eksprimira ligand za Nogo receptor - 1. Polipeptid od interesa može biti terapijsko sredstvo, npr., toksin ili može biti dijagnostičko sredstvo, npr., enzim koji lako može da se vizualizuje, npr., peroksidaza rena. Dodatno, fuziona antitela mogu da se sastoje od dva (ili više ) pojedinačnih antitela koja su povezana jedno sa drugim. Ovo je korisno ukoliko se želi napraviti bivalentno ili polivalentno antitelo sa jednim polipeptidnim lancem ili ukoliko je poželjno da se napravi bispecifično antitelo.
Jednolančana antitela
Predmetni pronalazak obezbeđuje jednolančano antitelo (scFv) koje se vezuje za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku. Da bi se dobilo scFv, DNK, koja kodira Vli VH, domene se operativno povezuje sa DNK koja kodira fleksibilni veznik, npr., sa DNK koja kodira aminokiselinsku sekvencu (GIV4-Sefb (sekvenca čiji je ID broj 10), tako da VLi VHsekvence mogu da se eksprimiraju kao kontinuirani jednolančani protein u kome su Vli Vhregioni spojeni posredstvom fleksibilnog veznika, (videti, npr., Bird et al., 1988; Science 242: 423 - 426; Huston et al., 1988, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 85: 5879 - 5883; McCaffertv et al., Nature (1990), 348: 552 - 554). Jednolančano antitelo može biti monovalentno, kada se koristi samo jedan Vli Vhdomen; bivalentno kada se koriste dva VLi Vhdomena, ili može biti polivalentno kada se koristi više od dva VLi Vhdomena.
Himerična antitela
Predmetni pronalazak dalje obuhvata, bispecifična antitela ili njihove antigen - vezujuće fragmente, koja su specifična za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku. U jednom rešenju, moguće je napraviti himerično antitelo koje se specifično vezuje za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku, preko jednog vezujućeg domena, a koje se vezuje i za drugi molekul preko drugog vezujućeg domena. Himerično antitelo je moguće dobiti korišćenjem tehnika molekularne biologije za rekombinantnu DNK, ili se može dobiti fizičkom konjugacijom antitela. Dodatno, moguće je dobiti jednolančano antitelo koje sadrži više od jednog Vli VHdomena, koje se specifično vezuje za imunogeni polipeptid, prema predmetnom pronalasku, i za drugi molekul koji je udružen sa ublažavanjem kolapsa konusa rasta posredovanog mijelinom i sa inhibicijom izrastanja neurita i njegovog rasta. Ovakva bispecifična antitela mogu da se dobiju korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci, npr., koje su opisane u npr., Fanger et al., Immunol. Methods 4: 72 - 81 (1994) i Wright i Harris, gore navedeno, a u vezi sa (iii) videti, npr., Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51 - 52 (1992).
U nekim rešenjima, himerična antitela se dobijaju korišćenjem jednog ili više varijabilnih regiona antitela, prema predmetnom pronalasku. U drugom rešenju himerično antitelo se dobija korišćenjem jednog ili više CDR - ova poreklom iz navedenog antitela.
Izvedena i obeležena antitela
Antitelo ili antigen vezujući fragment prema predmetnom pronalasku, mogu biti izvedeni i povezani sa drugim molekulom (npr., sa drugim peptidom ili proteinom). Generalno, antitelo ili antigen vezujući fragment je izveden na takav način da ne dodje do negativnog uticaja na vezivanje za imunogeni polipeptid prema predmetnom pronalasku, zbog derivacije ili obeležavanja. Na primer, antitelo ili deo antitela, prema predmetnom pronalasku mogu biti funkcionalno povezani (hemijski povezani, povezani genetski fuzijom, nekovalentno udruženi ili povezani na neki drugi način), za jedan ili za više drugih molekula kao što su drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo i/ili antitelo), sredstvo za detekciju, cititoksično sredstvo, farmaceutsko sredstvo, i/ili kroz protein ili polipeptid koji služi kao posredndik pri udruživanju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta sa drugim molekulom (kao što je osovinski region streptavidina ili polihistidinska oznaka).
U nekim rešenjima, izvedeno antitelo se dobija ukrštanjem dva ili više antitela (istog tipa ili različitih tipova, npr., kako bi nastalo bispecifično antitelo). Odgovarajuća sredstava za ukršteno vezivanje obuhvataju ona koja su heterobifunkcionalna, koja poseduju dve različite reaktivne grupe koje su razdvojene odgovarajućim sredstvom za razdvajanje (npr., sa m - maleimidobenzoil - N - hidroksisukcinimid estrom) ili koja su homobifunkcionalna (npr., disukcinimidil suberat). Ovakvi veznici se mogu pribaviti od Pierce Chemical Companv, Rockford, 111.
U nekim rešenjima, izvedeno antitelo je obeleženo antitelo. Na primer, sredstva za detekciju sa kojima antitelo ili deo antitela, prema predmetnom pronalasku, može biti derivirano su fluorescentna jedinjenja, uključujući fluoroscein, fluoroscein izotiocijanat, rodamin, 5 - dimetilamin - 1 - naftalen sulfonil hlorid, fikoeritin, lantanid fosfori i slični. Određeno antitelo takođe može biti obeleženo enzimima koji služe za detekciju kao što su peroksidaza rena, p - galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, oksidaza glukoze i slični. U rešenjima u kojima je antitelo obeleženo sa detektibilnim enzimom, antitelo se detektuje dodavanjem određenih sredstava koje enzim koristi za proizvodnju detektabilnih proizvoda reakcije. Na primer, peroksidaza rena se koristi sa hidrogen peroksidom i diaminobenzidinom. Antitelo, takođe, može biti obeleženo biotinom i detektovano putem indirektnih merenja vezivanja avidina ili streptavidina. Antitelo, takođe, može biti obeleženo sa prethodno određenim polipeptidnim epitomima koje prepoznaju sekundarni reporteri, (npr., leucin ziper parna sekvenca, vezujuća mesta za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake).
Anti Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen vezujući fragment ovog antitela, takođe može biti obeleženo sa radioaktivnom amino kiselinom. Radioaktivna oznaka može da se koristi i u dijagnostičke i u terapijske svrhe. Radioaktivno obeleženo anti - Nogo receptor - 1 antitelo može biti upotrebljeno za dijagnostikovanje, npr., za određivanje nivoa Nogo receptor - 1 kod subjekta. Dalje, radioaktivno obeleženo anti - Nogo receptor - 1 antitelo može da se koristi kao terapijsko sredstvo u lečenju povreda kičmene moždine. Primeri radioaktivnih oznaka za polipeptide obuhvataju, bez ograničenja , sledeće radioizotope ili radionukleotide:<3>H,<14>C, I5N, 35S, 90Y, "Tc,inIn, ,25I, 13lI.
Anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, takođe mogu biti derivirani sa hemijskom grupom kao što je polietilenglikol (PEG), metil ili etil grupa ili ugljenohidratna grupa. Ove grupe mogu biti korisne za poboljšavanje bioloških karakteristika antitela, npr., za povećavanje poluživota u serumu ili za povećanje vezivanja u tkivu.
Klasa i podklasa anti - Nogo receptor - 1 antitela
Klase i podklase anti - Nogo receptor - 1 antitela mogu da se odrede pomoću bilo kog postupka poznatog u struci. Generalno, klasa i podklasa antitela može biti određena korišćenjem antitela koja su specifična za određenu klasu i podklasu antitela. Takva antitela su dostupna komercijalno. Klase i podklase antitela mogu biti određene pomoću ELISA, Vestern blot analize, kao i putem drugih tehnika. Alternativno, klasa i podklasa antitela mogu biti određene sekvencioniranjem svih ili određenog dela konstantnih domena, teškog ili lakog lanca antitela, upoređivanjem ovih aminokiselinskih sekvenci sa poznatim aminokiselinskim sekvencama različitih klasa i podklasa imunoglobulina, kao i određivanjem klase i podklase antitela na osnovu navedenog poređenja.
Afinitet vezivanja anti - Nogo receptor - 1 antitela za Nogo receptor - 1
Afinitet vezivanja i brzina disocijacije anti - Nogo receptor - 1 antitela, prema predmetnom pronalasku, sa imunogenim Nogo receptor - 1 polipeptidom, prema predmetnom pronalasku, mogu biti određene korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci. Na primer, afinitet vezivanja može biti meren kompetitivnim ELISA, RJAs, BIAcore ili KinExA tehnologijama. Brzina disocijacije takođe može biti merena pomoću BIAcore ili KinExA tehnologije. Afinitet vezivanja i brzina disocijacije se mere pomoću rezonance površinskih membrana korišćenjem, npr., BIAcore aparata.
Kd7E11 i 1H2 antitela je određena kao 1 x 10 "<7>M i 2 x 10 "<8>M, respektivno.
Inhibicija aktivnosti Nogo receptora - 1 pomoću anti - Nogo receptor - 1 antitela
U nekim rešenjima, anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen - vezujući fragment, prema predmetnom pronalasku, inhibira vezivanje Nogo receptora - 1 za ligand. IC50takve inhibicije može da se meri korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci, npr., korišćenjem ELISA, RJA ili funkcionalnog antagonizma. U nekim rešenjima, IC50se nalazi u opsegu između 0,1 i 500 nM. U nekim rešenjima, IC50se nalazi u opsegu između 10 i 400 nM. U još nekim rešenjima, antitelo ili njegov deo poseduje IC50koje se nalaze u opsegu između 60 nM i 400 nM. IC50antitela 7E11 i 1H2 je određeno kao 400 nM i 60 nM, respektivno u testu vezivanja. Videti, takođe, Tabelu 3, navedenu ispod.
Sažeto rečeno, stručnjak uz pomoć specifikacije predmetnog pronalaska ima na raspolaganju mnoštvo postupaka koji mogu biti upotrebljeni za izmenu bioloških svojstava antitela, prema predmetnom pronalasku, uključujući postupke kojima se povećava ili smanjuje stabilnost ili poluživot molekula, imunogenost, toksičnost, afinitet ili prinos datog molekula antitela, ili kojima se može na neki drugi način izmeniti svojstvo molekula, tako da se on učini pogodnijim za određenu primenu.
U tekstu koji sledi opisani su preparati koji sadrže, kao i upotrebe antitela, prema predmetnom pronalasku.
Rastvorljivi Nogo receptor- 1polipeptidi
Protein
Nogo receptor - 1 polipeptid pune dužine se sastoji od signalne sekvence N - terminalnog regiona (NT), osam leucinom bogatih repetitivnih sekvenci (LRR), od LRRCT regiona (C - terminalni domen osam leucinom bogatih repetitivnih delova), od C - terminalnog regiona (CT) i od GPI sidrenog regiona (videti Sliku 1).
Neka rešenja, prema predmetnom pronalasku, obezbeđuju rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid. Rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi, prema predmetnom pronalasku, sadrže NT domen, osam LRR - ova i jedan LRRCT domen i nemaju signalnu sekvencu kao ni funkcionalni GPI sidreni region (tj. nemaju GPI sidreni region ili imaju GPI sidreni region kome nedostaje sposobnost da se efikasno veže za ćelijsku membranu).
U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid sadrži heterologi LRR. U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid sadrži dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam heterologih LRR - ova. Pojam "heterologi LRR" označava LRR koji je dobijen iz proteina koji se razlikuje od Nogo receptora - 1. Primeri proteina iz kojih se heterologi LRR može dobiti su toli - like receptori (TLR 1.2); T - ćelijski aktivacioni protein bogat u leucinskim repetitivnim domenima; deceorin; OM - gp; slit i robo podjedinica, labilna u kiseloj sredini, vezujućeg proteina za insulinu sličan faktor rasta i toli - slični receptor 4.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid od 319 amino kiselina (rastvorljivi Nogo receptor - 1 344, sNogoRl - 344 ili sNogoR344) (ostaci 26 - 344 sekvence čiji su ID brojevi 6 i 8, ili ostaci 27 - 344 sekvence čiji je ID broj 8). U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje rastvorljivi Nogo receptor
- 1 polipeptid od 285 amino kiselina (rastvorljivi Nogo receptor - 1 310, sNogoRl - 310 ili sNogoR310) (ostaci 26-310 sekvence čiji su ID brojevi 7 i 9 ili ostaci 27 - 310 sekvence čiji je ID broj 9). Videti Sliku 1.
U nekim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi, prema predmetnom pronalasku, se koriste da inhibiraju vezivanje liganda za Nogo receptor - 1 i da deluju kao antagonisti liganada Nogo receptora - 1. U nekim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, rastvorljivi polipeptidi Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku, se koriste za smanjenje inhibicije rasta i pupljenja neurita u neuronu, npr., aksonskog rasta i za inhibiciju mijelinom posredovanog kolapsa konusa rasta u neuronu. U nekim rešenjima, neuron je neuron centralnog nervnog sistema.
sNogoR310 i sNogoR344, iznenađujuće blokiraju verzivanje liganada NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM - gp za Nogo receptor - 1.
U nekim rešenjima, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku, je komponenta fuzionog protema koji dalje sadrži heterologi polipeptid. U nekim rešenjima, heterologi polipeptid je konstantni domen imunoglobulina. U nekim rešenjima, konstantni domen imunoglobulina je konstantni domen teškog lanca. U nekim rešenjima, heterologi polipeptid je Fc fragment. U nekim rešenjima, Fc je povezan sa C - terminalom rastvorljivog polipeptida Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, fuzioni Nogo receptor - 1 protein je dimer.
Molekuli nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku
Predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid, prema predmetnom pronalasku, uključujući polipeptide čije sekvence imaju ID brojeve 1 - 9. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina kodira polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 26 - 344 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj 6 i 8, ili aminokiselinski ostacici 27 - 344 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj 8. U nekim rešenjima, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji je izabran iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 26-310 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji su ID brojevi 7 i 9, ili aminokiselinski ostaci 27 - 310 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj 9. Kao što se ovde koristi pojam "nukleinska kiselina" označava genomsku DNK, cDNK, iRNK i molekule koji su komplementarni navedenim, kao i nukleinske kiseline koje se zasnivaju na alternativnim molekulskim osnovama ili koje uključuju alternativne baze, bilo da su one izvedene iz prirodnih izvora ili da su sintetisane. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina dalje sadrži promoter transkripcije i opciono signalnu sekvencu, koje su operativno povezane sa sekvencom nukleotida koja kodira polipeptide prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina kodira, Nogo receptor - 1 fuzioni protein, prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzioni protein koji sadrži polipeptid izabran iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 26 - 344 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj 6 i 8 ili aminokiselinski ostaci 27 - 344, sekvence čiji je ID broj 8 i aminokiselinski ostaci 26-310 Nogo receptora - 1, koji je prikazan kao sekvenca čiji je ID broj 7 i 9 ili aminokiselinske sekvence 27 - 310, sekvence čiji je ID broj 9. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina koja kodira Nogo receptor - 1 fuzioni protein, dalje sadrži promoter transkripcije i opciono signalnu sekvencu. U nekim rešenjima, nukleotidna sekvenca dalje kodira konstantni region imunoglobulina. U nekim rešenjima, konstantni region imunoglobulina je konstantni region teškog lanca. U nekim rešenjima, nukleotidna sekvenca, dalje, kodira konstanti region teškog lanca imunoglobulina koji je ligiran za region šarke. U nekim rešenjima, nukleinska kiselina, dalje, kodira Fc. U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 fuzioni protein sadrži Fc fragment.
Kodirajuće nukleinske kiseline, prema predmetnom pronalasku, mogu, dalje, biti tako modifikovane da sadrže detektabilnu oznaku koja služi za dijagnostičke svrhe i za ispitivanja. U struci je poznato mnoštvo ovakvih oznaka i sve one mogu lako da se upotrebe sa ovde opisanim kodirajućim molekulima. Odgovarajuće oznake obuhvataju, bez ograničenja, biotin, radioaktivne nukleotide i slične. Iskusni stručnjak može da upotrebi bilo koju oznaku koja je poznata u struci kako bi dobio obeleženi kodirajući molekul nukleinske kiseline.
Preparati
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje preparate koji sadrže imunogene polipeptide izabrane iz grupe koju čine sekvenca čiji je ID broj 1, sekvenca čiji je ID broj 2, sekvenca čiji je ID broj 3, sekvenca čiji je ID broj 4, sekvenca čiji je ID broj 5.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje preparate koji sadrže anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen - vezujući fragment ovog tela, ili rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid ili fuzioni protein, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obuhvata preparate sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosiocima, uključujući ekscipijente i pomoćna sredstva koja potpomažu obrađivanje aktivnih jedinjenja pri dobijanju preparata, a koja mogu da se farmaceutski upotrebe za dopremanje preparata do mesta na kome treba da deluje. Odgovarajuće formulacije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja tj. aktivnih jedinjenja koja se nalaze u obliku koji je rastvorljiv u vodi, npr., u obliku soli koje su rastvorljive u vodi. Dodatno, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja u obliku odgovarajućih uljastih suspenzija za injektiranje. Odgovarajući liofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju ulja koja sadrže masne kiseline, npr., ulje sušama ili sintetske estre masnih kiselina npr., etil oleat ili triglicerde. Suspenzije u vodi koje služe za injektiranje mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije kao što su npr., natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol i dekstran. Opciono suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Za enkapsulaciju molekula, prema predmetnom pronalasku, i za njihovo dopremanje u ćeliju takođe mogu da se upotrebe lipozomi. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosilaca, obuhvataju sve rastvarače, podloge za disperziju, obloge, antibakterijska i antifungusna sredstva, sredstva za održavanje izotoničnost i sredstva za odlaganje apsorbcije i koja su kao takva fiziološki kompatibilana; priineri obuhvataju i vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferovan fosfatom, dekstrozu, glicerol, etanol, i slične kao i njihove kombinacije. U nekim rešenjima, preparati sadrže sredstva za održavanje izotoničnosti, npr., šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. U nekim rešenjima, preparati sadrže farmaceutski prihvatljive supstance kao što su sredstva za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za emulgaciju, konzervansi ili puferi , koja produžavaju rok upotrebe ili efikasnost antitela, antigen vezujućih fragmenata, rastvorljivih Nogo receptora - 1 ili fuzionih proteina, prema predmetnom pronalasku.
Preparati, prema predmetnom pronalasku, mogu da se nalaze u brojnim oblicima uključujući npr., tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su rastvori tečnosti (npr., rastvori za injektiranje i primenu u vidu infuzije), disperzije ili suspenzije. Poželjni oblik zavisi od načina primene i od terapijske primene. U jednom rešenju, preparati se nalaze u obliku rastvora za injekcije ili infuzije kao što su to preparati koji su slični onima koji se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi ili koji su slični drugim preparatima antitela.
Preparati mogu biti formulisani kao rastvori, mikroemulzije, disperzije, lipozomi ili kao druge uređene strukture koje su pogodne za primenu visokih koncentracija leka. Sterilni rastvori za injekcije mogu da se dobiju uključivanjem anti - Nogo receptor - 1 antitela u željenoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka koji su gore nabrojani, po potrebi nakon čega sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se dobijaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovnu podlogu za dispergovanje i druge željene sastojke izabrane među onima koji su gore nabrojani. U slučaju sterilnih praškova koji se korista za dobijanje sterilnih rastvora za injektiranje, poželjni postupci dobijanja su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija aktivni sastojak u obliku praška i još neki dodatni željeni sastojak koji se nalazio u njegovom sterilnom filtriranom rastvoru. Odgovarajuća fluidnost rastvora može da se održava, npr., korišćenjem obloga kao što su lecitin, održavanjem poželjne veličine čestica u slučaju disperzija i korišćenjem surfaktanata. Produžena apsorbcija se može postići uključivanjem u preparat nekog sredstva koje odlaže apsorbciju, npr., monostearat soli i gelatina.
U nekim rešenjima, aktivno jedinjenje može da se pripremi sa nosiocem koji će štititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je to slučaj sa formulacijama sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroenkapsulirane sisteme za dopremanje supstanci. Mogu se koristiti biološki razgradljivi, biološki kompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i poliaktinska kiselina. Stručnjacima su poznati brojni postupci za dobijanje takvih formulacija i oni su patentirani ili su generalno poznati. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nju Jork, 1978.
Takođe, u sastav preparata mogu da se uvedu dodatna aktivna jedinjenja. U nekim rešenjima, Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen - vezujući fragmenti ovih antitela ili rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi ili fuzioni proteini, prema predmetnom pronalasku, se ko - formulišu sa i/ili ko - administriranjem sa jednim ili sa više dodatnih terapisjkih sredstava.
Farmaceutski preprati, prema predmetnom pronalasku, mogu da sadrže "terapijski efikasnu količinu" ili "profilaktički efikasnu količinu" antitela, antigen - vezujućeg fragmenta antitela, polipeptida ili fuzionog proteina prema predmetnom pronalasku. Pojam "terapijski efikasna količina" označava količinu koja je efikasna u dozama i tokom perioda koji su potrebni za postizanje željenog terapijkog rezultata. Terapijski efikasna količina Nogo receptor - 1 antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta ovog antitela, rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida, ili Nogo receptor - 1 fuzionog proteina, može da varira što zavisi od činilaca kao što su samo oboljenje, starosna dob, telesna masa i pol pojedinca. Terapijski efikasna količina je takođe ona količina pri kojoj su toksični ili oštećujući efekti antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta ovog antitela, rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida, ili Nogo receptor - 1 fuzionog proteina, premašeni od strane terapijski poželjnih efekata. Pojam "profilaktički efikasna količina" označava količinu koja je efikasna pri dozama i tokom perioda vremena koji su potrebni za dostizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, s obzirom da se profilaktička doza koristi kod subjekata neposredno pred pojavu bolesti ili u ranim stadijumima bolesti, profilaktički efikasna količina je manja od terapijski efikasne količine preparata.
Režimi doziranja mogu da se podese tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus preparata, nekoliko podeljenih doza tokom određenog vremena ili doza može proporcionalno da se smanjuje ili povećava, prema promenama u terapijskoj situaciji. Posebno je poželjno da se preparati za parenteralnu primenu formulišu u obliku jedinične doze kako bi se olakšala njihova primena i kako bi se postigla uniformnost oblika jedinične doze; pojam "oblik jedinične doze" ovde označava fizički diskretne jedinice pogodne za primenu kao jedna doza kod subjekata sisara koji treba da se tretiraju, pri čemu svaka jedinica doze sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja, koje je tako izračunata da izazove željeni terapijski efekat kada se primeni sa željenim farmaceutskim nosiocem. Karakteristike oblika jedinične doze prema predmetnom pronalasku diktirane su i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta ovog antitela, rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida, ili Nogo receptor - 1 fuzionog proteina, kao i od određenog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji treba da bude postignut i (b) od ograničenja inherentnih samoj pripremi takvog antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta ovog antitela, rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida, ili Nogo receptor - 1 fuzionog proteina, koje služi za tretman senzitivnosti kod pojedinca. U nekim rešenjima, opseg terapijski efikasne doze za anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihove antigen - vezujuće fragmente iznosi od 0,1 - 4 mg/kg/dan. U nekim rešenjima, opseg terapijski efikasne doze za anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihove antigen - vezujuće fragmente iznosi od 0,2 - 4 mg/kg/dan. U nekim rešenjima, opseg terapijski efikasne doze za anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihove antigen - vezujuće fragmente je 0,2 mg/kg/dan.
Korišćenje antitela, antigen - vezujućih fragmenata, rastvorljivih receptora i fuzionih
proteina
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za inhibiciju aktivnosi Nogo receptora - 1 primenom anti - Nogo receptor - 1 antitela, antigen - vezujućih fragmenta takvih antitela, rastvorljivih Nogo receptor - 1 polipeptida ili fuzionih proteina koji sadrže takve polipeptide, kod sisara kojima je takav tretman potreban.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju vezivanja'Nogo receptora - 1 za ligand, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta Nogo receptora- 1 sa antitelom ili antigen - vezujućim fragmentom, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, ligand je izabran iz grupe koju čine NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM - gp.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju kolapsa konusa rasta u neuronu, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta neurona sa antitelom ili antigen - vezujućim fragmentom, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje inhibicije rasta neurita ili izrastanja neurita u neuronu, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta sa antitelom ili antigen - vezujućim fragmentom, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, neuron je neuron CNS. U nekim od ovih postupaka, rast neurita ili izrastanje neurita je aksonski rast.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za produžavanje preživljavanja neurona kod sisara, pri čemu se neuron nalazi u riziku od umiranja, koji obuhvata (a) obezbeđivanje kulture ćelije - domaćina koja eksprimira (i) anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili antigen - vezujući fragmenti ovog antitela; ili (ii) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid; i (b) uvođenje ćelije - domaćina u organizam sisara na ili u blizinu mesta pomenutog neurona. Alnudena Ramon - Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F Santos, Benito & Jesus Avila (2000); Functional recoverv of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by ilfactory ensheasting cells. Neuron 25, 425 - 435.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak genske terapije za produžavanje preživljavanja neurona koji se nalazi u riziku od umiranja, pri čemu je neuron neuron sisara, koji obuhvata primenu na ili u blizini mesta pomenutog neurona virasnog vektora koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira (a) anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen - vezujući fragmenti ili (b) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid, pri čemu su anti - Nogo receptor - 1 antitelo, antigen - vezujući fragmenti ili rastvorljivi Nogo receptor
- 1 polipeptid eksprimirani od strane navedene nukleotidne sekvence u organizmu sisara u količini koja je dovoljna da produži preživljavanje neurona. Virusni vektori i postupci koji su korisni u ovim rešenjima su opisani u npr., Noel et al., Human Gene Therapy, 13, 1483 - 93
(2002).
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak inhibicije vezivanja Nogo receptora - 1 za ligand, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili fuzionim proteinom Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak modulacije aktivnosti liganda Nogo receptora - 1, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju kolapsa konusa rasta u neuronu, koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje inhibicije rasta neurita ili izrastanja neurita u neuronu, , koji obuhvata korak uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1, prema predmetnom pronalasku. U nekim rešenjima, neuron je neuron CNS. U nekim rešenjima, ligand je izabran iz grupe koju čine NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM - gp. U nekim rešenjima, rast neurita ili izrastanje neurita iz neurona predstavlja aksonski rast.
Svi tipovi antitela ili receptora koji su ovde opisani mogu da se upotrebe u terapijske svrhe. U nekim rešenjima, anti - Nogo receptor - 1 antitelo je humano antitelo. U nekim rešenjima, sisar je humani pacijent. U nekim rešenjima, antitelo ili antigen - vezujući fragment ovog antitela se primenjuju kod ne - humanog sisara koji eksprimira Nogo receptor - 1 sa kojim antitelo reaguje (npr., kod primata, Cvnomologous ili Rhesus majmuna) u cilju postizanja efekta u veterinarskoj medicini ili u cilju ispitivanja na životinjskom modelu humane bolesti. Pomenuti životinjski modeli mogu biti od koristi za procenu terapijske efikasnosti antitela, prema predmetnom pronalasku.
U nekim rešenjima, primena anti - Nogo receptor - 1 antitela ili antigen - vezujućeg fragmenta ovog antitela ili rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida ili fuzionog proteina se koristi u tretmanu povrede kičmene moždine u cilju pospešivanja rasta aksona kroz mesto koje je povređeno.
Anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihovi antigen - vezujući fragmenti, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi ili fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku, mogu da se obezbede sami, u kombinaciji ili u sekvencionalnoj kombinaciji sa drugim sredstvima koja moduliraju određeni patološki proces. Na primer, anti - inflamatorna sredstva mogu da se primenjuju zajedno sa sredstvima, prema predmetnom pronalasku, kod moždanog udara, u cilju blokiranja daljeg oštećenja neurona i inhibicije aksonske regeneracije. Kao što se ovde koristi anti - Nogo receptor - 1 antitela, njihovi antigen - vezujući fragmenti, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi i fuzioni proteini Nogo receptora - 1 se primenjuju u kombinaciji jednog ili više dodatnih terapijskih sredstava pri čemu se navedeni aktivni sastojci primenjuju simultano, konsekutivno, ili nezavisno.
Anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihovi antigen - vezujući fragmenti, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi ili fuzioni proteini prema predmetnom pronalasku, mogu da se primenjuju parenteralno, subkutano, intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, transdermalno, putem inhalacije ili preko sluzokože usne duplje. Na primer, određeno sredstvo može da se primenjuje lokalno na mestu povrede putem mikro infuzije . Tipična mesta obuhvataju, bez ograničenja, područja kičmene moždine koja su oštećenja kao posledica povrede. Doza koja se primenjuje zavisi od starosne dobi, zdravstvenog stanja, kao i od telesne mase recipijenta, od vrste tretmana koji se već primenjuje (ukoliko takav postoji), od učestalosti tretmana i od prirode željenog efekti.
Jedinjenja prema predmetnom pronalasku, mogu da se koristein vivo,obično kod sisara, kao što su ljudi, ovce, konji, goveda , svinje, psi, mačke, pacovi i miševi iliin vitro.
Vektori prema predmetnom pronalasku
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje molekule rekombinantne DNK (rDNK) koji sadrže kodirajuću sekvencu. Kao što se ovde koristi pojam "rDNK molekul" jeste DNK molekul koji je podvrgnut molekulskim manipulacijama. Postupci za dobijanje rDNK molekula su dobro poznati u struci, videti npr., Sambrook et al, 1989; Molecular Cloning - A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour Laboratorv Press. U nekim rDNK molekulima kodirajuća DNK sekvenca je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije i sa sekvencom vektora.
U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide, prema predmetnom pronalasku. Izbor vektora i sekvenci za kontrolu ekspresije sa kojima su nukleinske kiseline, prema predmetnom pronalasku, operativno povezane, zavisi direktno, kao što je dobro poznato u struci, od funkcionalnih svojstava koja su poželjna (npr., od ekspresije proteina i od ćelije - domaćina koja treba da se transformiše). Vektor, prema predmetnom pronalasku, je sposoban za direktnu replikaciju ili inserciju u hromozom ćelije - domaćina, a poželjno takođe i za ekspresiju strukturnog gena koji je uključen u sastav molekula rDNK.
Elementi za kontrolu ekspresije koji se koriste za regulaciju ekspresije operativno povezane sekvence koja kodira protein su dobro poznati u struci i obuhvataju, bez ograničenja inducibilne promotere, konstitutivne promotere, signale za sekreciju i druge regulatorne elemente. Poželjno, inducibilni promoter je već kontrolisan, npr., sposoban je da svojom aktivnošću reaguje na određeni hranljivi sastojak u podlozi kulture ćelije - domaćina.
U jednom rešenju, vektor koji sadrži kodirajući molekul nukleinske kiseline obuhvata prokariotski replikon, tj., DNK sekvencu koja ima sposobnost direktne autonomne replikacije i održavanja rDNK ekstra hromozomski u prokariotskoj ćeliji - domaćinu, kao što je bakterijska ćelija - domaćin, pri čemu dovodi do transformacije ćelije - domaćina. Pomenuti replikoni su dobro poznati u struci. Dodatno, vektori koji sadrže prokariotski replikon mogu takođe da sadrže određeni gen čija ekspresija rezultuje parenjem detektibilnog ili selektibilnog markera, kao što je rezistencija prema određenom leku. Tipični bakterijski geni za rezistenciju prema lekovima su oni koji dovode do ispoljavanja rezistencije na ampicilin ili tetraciklin.
Vektori koji sadrže prokariotski replikon mogu dalje da sadrže prokariotski promoter ili promoter bakteriofaga koji je sposoban za usmeravanje ekspresije (transkripcije i translacije), kodirajuće genske sekvence u bakterijskoj ćeliji - domaćinu kao što jeE. Coli.Promoter je element za kontrolu ekspresije koji je sačinjen od DNK sekvence koja omogućava vezivanje RNK polimeraze i koji omogućava početak transkripcije. Promoterske sekvence koje su kompatibilne sa bakterijskim ćelijama - domaćinima obično se nalaze u obliku plazmidnih vektora koji sadrže pogodna restrikciona mesta za inserciju DNK segmenta, prema predmetnom pronalasku. Primeri takvih vektora plazmida su pUC8, pUC9, pBR322 i pBR329 (Bio - Rad Laboratories), pPL i pKK223 (Pharmacia). Svaka pogodna prokariotska ćelija - domaćin može da se upotrebi za ekspresiju rekombinantnog DNK molekula koji kodira protein prema predmetnom pronalasku.
Ekspresioni vektori koji su kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno, oni koji su kompatibilni sa ćelijama kičmenjaka, takođe mogu da se upotrebe za dobijanje rDNK molekula koji sadrže kodirajuću sekvencu. Ekspresioni vektori za eukariotske ćelije su dobro poznati u struci i dostupni su komercijalno iz nekoliko izvora. Tipično, takvi vektori sadrže pogodna restrikciona mesta za inserciju željenog DNK segmenta. Primeri takvih vektora su pSVL i pKSV - 10 (Pharmacia), pBPV - 1, pML2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC 31255) a mogu se upotrebiti i drugi eukariotski ekspresioni vektori.
Ekspresioni vektori za eukariotsku ćeliju koji se koriste za konstrukciju rDNK molekula, prema predmetnom pronalasku, mogu dalje da sadrže selektibilni marker koji je efikasan u eukariotskoj ćeliji kao što je to poželjno, selkcioni marker za otpornost prema leku. Poželjni marker za otpornost prema leku je onaj gen čija ekspresija dovodi do rezistencije prema neomicinu, tj., to je gen za neomicin fosfotransferazu (Southern et al., 1982; J. Mol. Anal. Gent. 1, 327 - 341). Alternativno, selektibilni marker može biti prisutan na drugom plazmidu pri čemu se dva vektora uvode pomoću ko - transfekcije u ćeliju - domaćina, a transficirane ćelije se selkcioniraju kultivacijom na podlozi koja sadrži lek, prema kome transficirani mutanti poseduju rezistenciju.
Kako bi se eksprimirala antitela ili delovi antitela, prema predmetnom pronalasku, DNK molekuli koji kodiraju delove ili lake i teške lance pune dužine se uvode u ekspresione vektore, tako da su ovi geni operativno povezani sa sekvencama za kontrolu transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori obuhvataju plazmide, retroviruse, kozmide, YAC - ove, epizome izvedene iz EBV, i slične. Gen za antitelo je ligiran u vektor tako da sekvence za kontrolu transkripcije i translacije u okviru vektora služe za regulaciju transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije se tako biraju da budu kompatibilne sa ekspresionim sistemom ćelije - domaćina, koja se koristi. Gen za laki lanac antitela i gen za teški lanac antitela mogu da se uvedu u različite vektore. U nekim rešenjima, oba gena se uvode u isti ekspresioni vektor. Geni za antitela se uvode ekspresioni vektor korišćenjem standardnih postupaka (npr., ligacija komplementarni restrikcionih mesta na fragmentu gena za antitelo i na vektoru ili korišćenjem ligacije za slepi kraj ukoliko restrrikciona mesta ne postoje).
Pogodni vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu Chili Climunoglobulinsku sekvencu, na odgovarajućim restrikcionim mestima koja su tako konstruisana da bilo koja VHili VLsekvenca može lako da se ubaci ili eksprimira, kao što je već opisano. U takvim vektorima obično dolazi do isecanja između mesta koje predstavlja donora za isecane u ubačenom J regionu i mestu akceptoru za isecanje koje se nalazi ispred humanog C regiona, a takođe i na regionima za isecanje koji se javljaju unutar humanih Chegzona. Poliadenilacija i terminacija transkripcije se javljaju na nativnim liromozomskim mestima, distalno od kodirajućih regiona. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe, može da kodira signalni peptid koji pospešuje sekreciju lanca antitela iz ćelije - domaćina. Gen za lanac antiela može da se klonira u vektor tako da je signalni peptid povezan u istom ramu očitavanja sa amino terminalom gena za lanac antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid, (tj., signalni peptid iz ne - imunoglobulinskog proteina).
Kao dodatak imunogenim polipeptidima, Nogo receptor - 1 antitelima, antigen - vezujućim fragmentima, rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidima i rastvorljivim Nogo receptor - 1 fuzionim proteinima, prema predmetnom pronalasku, rekombinantni ekspresioni vektori prema predmetnom pronalasku, sadrže regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju navedenih gena u ćeliji - domaćinu. Stručnjacima je jasno da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, zavisi od činilaca kao što su izbor ćelije domaćina koja treba da bude transformirana, nivo ekspresije željenog proteina itd. Poželjne sekvence za regulaciju ekspresije kod sisarskih ćelija - domaćina obuhvataju virusne elemente koji dovode do izražene ekspresije proteina u ćeljama sisara kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz retrovirusnih LTR - ova, citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promoter/pojačivač), Simian virusa 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter/pojačivač), adenovirusa (npr., glavni adenovirusni kasni promoter (AdMLP)), polioma virusa, kao što su i jaki sisarski promoteri npr., nativni promoteri imunoglobulina i aktina. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci videti npr., U. S. Patent broj 5, 168, 062 od Stinskog, U. S. Patent broj 4,510,245 od Bell et al., i U. S. Patent broj 4,968,615 od Shaffner et al.
Kao dodatak heterologim genima i regulatornim sekvencama, rekombinantni ekspresioni vektor, prema predmetnom pronalasku, može da sadrži dodatne sekvence kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji - domaćinu (npr., počeci replikacije) i gene za selektabilni marker. Gen za selektibilni marker olakšava selekciju ćelija - domaćina u koje je vektor ekspresije ubačen (videti npr., U. S. Patent broj 4,399,216; 4,634,665 i 5,179,017 svi od Alex et al.). Na primer, tipično je da gen za selektibilni marker dovodi do ispoljavanja rezistencije prema lekovima, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, od strane ćelije domaćina u koju je vektor uveden. Poželjni geni za selektibilne markere obuhvataju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (koji se koristi kod DHFR negativnih ćelija - domaćina za selekciju/amplifikaciju metotreksatom) i neo gen (za selekciju sa G418).
Ćelije - domaćini i postupci za dobijanje rekombinantnog proteina prema predmetnom
pronalasku
Molekuli nukleinskih kiselina koje kodiraju anti - Nogo receptor - 1 antitela, imunogene peptide, rastvorljive Nogo receptor - 1 polipeptide, rastvorljivi Nogo receptor - 1 fuzione proteine, prema predmetnom pronalasku, i vektori koji sadrže ove molekule nukleinskih kiselina, mogu da se koriste za transformaciju, pogodne ćelije domaćina. Transformacija može da se izvede korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci, koji se odnosi na uvođenje polinukleotida u ćeliju - domaćina. Postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u struci i obuhvataju, transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroforaciju, enkapsulaciju polinukleotida u okviru lipozoma, kao i direktno mikro injektiranje DNK u jedro ćelije. Dodatno molekuli nukleinske kiseline mogu biti uvedeni u ćelije sisara posredstvom virusnih vektora.
Transformacija odgovarajućih ćelija - domaćina sa rDNK molekulima, prema predmetnom pronalasku, se izvodi korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci i čija vrsta tipično zavisi od tipa vektora koji se koristi i od sistema ćelije - domaćina koji se koristi. Prilikom transformacije prokariotskih ćelija - domaćina, mogu se koristiti elektroforacija i tretmani solima (videti, npr., Sambrook et al., 1989; Molecular Cloning - A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour Laboratorv Press; Cohen et al., 1972; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 - 2114). Prilikom transformacije ćelije kičmenjaka sa vektorima koji sadrže rDNK, mogu se koristiti elektroforacija ili tretmani katjonima lipida ili solima (videti, npr., Graham et al., 1973; Virology 52, 456 - 467; Wigler et al., 1979; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373 - 1376).
Uspešno transformirane ćelije, tj., ćelije koje sadrže molekule rDNK, prema predmetnom pronalasku, mogu da se identifikuju korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci, uključujući selekciju ćelija sa odgovarajućim markerom, npr., ćelije koje se dobijaju uvođenjem rDNK, prema predmetnom pronalasku, mogu da se kloniraju kako bi se dobile kolonije klonova. Ćelije poreklom iz ovih kolonija mogu da se prikupe, liziraju, a DNK iz ovih ćelija može da se ispita na prisustvo određene rDNK korišćenjem postupka koji je opisao (Southern, 1975; J. Mol. Biol. 98, 503 - 517), ili mogu da se ispitaju proteini koji se proizvode u ovim ćelijama, korišćenjem imunoloških postupaka.
Linije sisarskih ćelija koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju, su dobro poznate u struci i obuhvataju mnoge imortalizovane ćelijske linije koje se mogu dobaviti iz američke kolekcije tipskih kultura (ATCC<®>; American Type Culture Colection). U navedene ćelijske linije spadaju između ostalih i ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije i brojne druge ćelijske linije. Posebno su poželjne one ćelijske linije kod kojih je određen visok nivo ekspresije željenog proteina. Druge ćelijske linije koje mogu da se koriste su insekatske ćelijske linije kao što su Sf9 ćelije. Kada se rekombinantni vektori ekspresije, koji kodiraju imunogene polipeptide, anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihove antigen - vezujuće fragmente, rastvorljive Nogo receptor - 1 polipeptide ili rastvorljive Nogo receptor - 1 fuzione proteine, prema predmetnom pronalasku, uvedu u ćelije domaćine sisarskog porekla, navedeni polipeptidi se dobijaju kultivacijom ćelija - domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da se obezbedi ekspresija antitela, peptida i fuziono polipeptida u ćelijama - domaćinima ili što je poželjnije sekrecija imunogenih polipeptida, Nogo receptor - 1 antitela ili antigen - vezujućih fragmenata ovih antitela, rastvorljivih Nogo receptor - 1 polipeptida, rastvorljivih Nogo receptor - 1 fuzionih proteina, prema predmetnom pronalasku u podlogu kulture u kojoj se ćelije - domaćini uzgajaju. Imunogeni polipeptidi, Nogo receptor - 1 antitela, njihovi antigen - vezujući fragmenti, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptidi, i rastvorljivi Nogo receptor - 1 fuzioni proteini, prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju iz podloge kulture korišćenjem standardnih postupaka za prečišćavanje proteina.
Dalje, ekspresija imunogenih polipeptida, Nogo receptor - 1 antitela, njihovih antigen - vezujući fragmenti, rastvorljivih Nogo receptor - 1 polipeptida, i rastvorljivih Nogo receptor - 1 fuzionih proteina, prema predmetnom pronalasku, ili drugih podjedinica ovih peptida, u ćelijskim linijama koje ih proizvode, može da se poveća upotrebom brojnih poznatih tehnika, na primer, uobičajeni pristup za povećavanje ekspresije u određenim uslovima, jeste upotreba ekspresionog sistema gena glutamin sintetaze (GS sistema). GS sistem je opisan u potpunosti ili delimično u Evropskim patentima brojevi 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 i Evropskoj patentnoj prijavi br. 89303964, 4.
Ćelije - domaćini
Predmetni pronalazak, dalje obezbeđuje ćelije - domaćine koje su transformirane molekulom nukleinske kiseline koji kodira anti - Nogo receptor - 1 antitelo, antigen - vezujući fragmenti ovog antitela, rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid i/ili rastvorljivi Nogo receptor - 1 fuzioni protein, prema predmetnom pronalasku. Ćelija - domaćin može biti prokariotska ili eukariotska ćelija Eukariotske ćelije koje su korisne za ekspresiju proteina, prema predmetnom pronalasku, nisu ograničene posebnim ćelijama, sve dok je ćelijska linija koja se upotrebljava kompatibilna sa postupcima kultivacije ćelije - domaćina i sa propagacijom ekspresionih vektora i sa ekspresijom proizvoda određenih gena. Poželjne eukariotske ćelije - domaćini obuhvataju, bez ograničenja, ćelije gljivica, insekata i sisara, poželjno, ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miša, pacova, majmuna ili humane ćelijske linije. Primeri korisnih eukariotskih ćelija - domaćina obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje su dostupne kod ATCC<®>pod pristupnim brojem CCL61; NIH - 3T3 ćelije mišijeg embriona, ćelije embriona NIH švajcarskog miša koje su dostupne pod ATCC<®>pristupnim brojem CRL658, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), kao i slične eukariotske ćelijske linije kulture tkiva.
Proizvodnja rekombinantnih proteina korišćenjem rDNK molekula
Predmetni pronalazak, dalje obezbeđuje postupke za proizvodnju anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njihovih antigen - vezujućih fragmenata, rastvorljivih Nogo receptor - 1 polipeptida i /ili rastvorljivih Nogo receptor - 1 fuzionih proteina, korišćenjem molekula nukleinske kiseline koji su ovde opisani. Generalno, proizvodnja rekombinantnog oblika proteina, tipično obuhvata sledeće korake: Prvo, dobija se molekul nukleinske kiseline koji kodira protein, prema predmetnom pronalasku. Ukoliko kodirajuća sekvenca sadrže introne, ona je neposredno odgovarajuća za ekspresiju u bilo kom domaćinu.
Zatim se molekuli nukleinske kiseline opciono postavljaju u operativnu vezu sa odgovarajućim kontrolnim sekvencama, kako je opisano gore, kako bi se formirala ekspresiona jedinica koja sadrži otvoreni ram očitavanja proteina. Ekspresiona jedinica se koristi za transformaciju pogodnog domaćina, a transformirani domaćin se kultiviše u uslovima koji omogućavaju proizvodnju rekombinantnog proteina. Opciono, rekombinantni protein se izoluje iz podloge ili iz ćelije; izdvajanje i prečišćavanje proteina ne mora biti potrebno u nekim slučajevima kada je moguće tolerisati prisustvo nečistoća.
Svaki od gore navedenih koraka može biti sproveden na različite načine, na primer, željene kodirajuće sekvence mogu da se dobiju iz genomskih fragmenata i da se koriste direktno u odgovarajućim domaćinima. Konstrukcija ekspresionih vektora, koji su operativni u različitim domaćinima se postiže korišćenjem odgovarajućih replikona i kontrolnih sekvenci, kao što je ranije već opisano. Kontrolne sekvence, ekspresioni vektori i postupci transformacije zavise od tipa ćelije - domaćina koji se koristi za ekspresiju gena, što je detaljno opisano ranije. Na krajeve kodirajuće sekvence, mogu biti dodata odgovarajuća restrikciona mesta ukoliko ona normalno nisu prisutna, kako bi se dobio gen koji može da se iseče i da se nakon toga ubaci u ove vektore. Iskusni stručnjak može lako da prilagodi bilo koji ekspresioni sistem ćelije - domaćina, koji je poznat u struci za upotrebu sa molekulima nukleinske kiseline, prema predmetnom pronalasku, u cilju proizvodnje rekombinantnog proteina.
U cilju boljeg razumevanja predmetnog pronalaska, navedeni su, u tekstu koji sledi, primeri. Ovi primeri služe isključivo radi ilustracije i ni na koji način ne ograičavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.
Primeri
Primer 1: Dobijanje mišijih monoklonskih anti -Nogoreceptor- 1antitela
Anti - Nogo receptor - 1 antitela koja se specifično vezuju za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku, su dobijena krišćenjem sledećih postupaka i procedura.
Imunizacija
Korišćena su dva načina imunizacije:
1. COS - 7 ćelije ili ćelijske membrane koje sadrže Nogo receptor - 1 ( NgoR - 1) kao
imunogen
Pacovski gen za Nogo receptor - 1 (GenBank™ br. AF 462390) je subkloniran u sisarski ekspresioni vektor pEAG1256 (Biogen<®>) koji sadrži promoter CMV i gen za rezistenciju prema geneticinu, kao markere za selekciju. Rekombinantni plazmid je transficiran u COS - 7 ćelije korišćenjem Superfect (Qiagen<®>). Transfektanti su selekcionirani korišćenjem geneticina (Gibco™, 2mg/ml) klonirani su i verifikovano je prisustvo površinske ekspresije Nogo receptor - 1 proteina, korišćenjem FACS. COS - 7 membrane su izolovane iz ovih ćelija korišćenjem postupaka koji su poznati u struci (Wang et al., J. Neurochem., 75: 1155 - 1161; 2000.), nakon čega slede dva ispiranja, i uskladištene su u koncentraciji od 1 mg/ml (koncentracija proteina) u 10% glicerolu na temperaturi od -70 °C.
Ženke RBF miševa starosne dobi od osam nedelja (Jackson Labs, Bar Harbour, Merilend) su imunizovane intraperitonealno, emulzijom koja sadrži 50 ug pacovskih Nogo receptor - 1 COS - 7 membrana ili sa čitavim COS - 7 ćelijama koje eksprimiraju Nogo receptor - 1 na svojoj površini i sa 50 ul RIBI MPL + TDM + CWS adjuvansa (Sigma<®>Chemical Co. St. Luis, MO) jednom na svake dve nedelje (Lipman et al., 1992.). Pre prve imunizacije su prikupljeni serumi imunizovanih miševa, a potom i nakon sedam dana od druge i treće imunizacije, kao i 38 dana nakon treće imunizacije, pa su određivani titrovi anti - Nogo receptor - 1 antitela, upotrebom ELISA, kao što je opisano ispod.
2. Specifični No<g>o receptor - 1 polipeptidi kao imunogeni
Sekvenca pacovskog gena Nogo receptora- 1 je podvrgnuta analizama antigenosti, korišćenjem Vector NTi™ softvera (Slika 2). Antigeni peptidi koji su identifikovani ovim analizama su konjugovani sa Kevhole Limpet hemocijaninom (KLH) korišćenjem standardnih glutaldehid postupaka.
Ženke RBF miševa starosne dobi od osam nedelja (Jackson Labs, Bar Harbour, Merilend) su imunizovane intraperitonealno, emulzijom koja sadrži 50 ug peptida konjugovaih sa KLH i 50 ul kompletnog Freundovog adjuvansa (Sigma<®>Chemical Co., St. Luis, MO) jednom u svake dve nedelje. Serum imunizovanih miševa je prikupljen pre prve imunizacije kao i nedelju dana nakon druge i treće imunizacije, pa su određivani titrovi anti - Nogo receptor - 1 antitela. Nakon treće imunizacije data je doza za pospešivanje imunogenosti. Tri dana nakon davanja ove doze, započeti su fuzioni eksperimenti.
Dobijanje hibridoma i njihovo ispitivanje
Serumi dobij eni od miševa imunizovanih sa Nogo receptor - 1 polipeptidima su ispitivani korišćenjem ELISA dok su serumi iz miševa imunizovanih sa COS - 7 ćelijama koje eksprimiraju Nogo receptor - 1 ispitivane korišćenjem protočne citometrije. Miševi kod kojih su pronađena antitela koja se specifično vezuju za Nogo receptor - 1 - COS - 7 ćelije su identifikovane protočnom citometrijom i žrtvovani su. Splenociti su izolovani iz miševa i fuzionisani sa FL653 mijelomom (APRT - derivat Ig - /HGPRT - Balb/c mišiji mijelom, održavan u DMEN koji sadrži 10% FBS, 4500 mg/l glukoze, 4mM L - glutamina i 20 mg/ml 8 - azaguanina). Kao stoje opisano u literaturi (Kennett et al., 1993; Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analvsis; Plenum Press, Nju Jork). Fuzionisane ćelije se postavljaju na ploče za mikrotitraciju sa 24 ili 48 polja (Corning Glass Works, Corning, Nju Jork), i dodaje im se podloga sa adeninom, aminopterinom i timidinom. Kulture koje su rezistentne prema AAT su ispitivane korišćenjem ELISA ili protočne citometrije na vezivanje sa Nogo receptor - 1 - COS - 7 ćelijama ili sa Nogo receptor - 1 antigenim peptidom, kao što je opisano ispred. Ćelije u pozitivnim poljima su dalje subklonirane ograničavanjem razblaženja.
Da bi se ispitalo vezivanje antitela za Nogo receptor - 1 antigeni peptid, peptidi koji su korišćeni kao imunogeni su konjugovani sa BSA. U svako od polja na MaxiSorp ™ ploči
(Nunc ™), od 96 polja, je dodato po 0,5 ug konjugovanog peptida u 50 ul 0,1M natrijm bikarbonatnom puferu, pH vrednosti 9,0. Ploča je potom inkubirana na temperaturi od 37 °C ili na temperaturi od 4 °C tokom 16 časova, nakon čega su nespecifična mesta za vezivanje blokirana korišćenem 25 mM HEPES-a, pH vrednosti 7,4, koji sadrži 0,1% BSA, 0,1% ovalbumina, 0,1% bloto i 0,001% azida. Supematant hibridoma je dodat pa je smeša inkubirana na 25 %C tokom jednog časa. Nakon tri ispiranja sa PBS, u svako od polja je dodato po 50 uL 1: 10000 razblaženja kozijeg anti - mišijeg sekundarnog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch Inc.), pa je ploča inkubirana tokom još jedno časa. Nakon tri ispiranja, razvijena je boja upotrebom TMB (Pierce), pa je reakcija prekinuta dodavanjem 2M sumporne kiseline. Intenzitet boje je meren upotrebom spektrofotometra na 450 nm.
Ispitivano je vezivanje antitela za Nogo receptor -1 pune dužine na sledeći način. COS - 7 ćelije su obeležene sa 0,1 uM CellTracker ™ Green CMFDA (Molecular Probes, Eugene, Oregon), kao što je opisano od strane proizvođača. Jednake zapremine CellTracker ™ obeleženih kontrolnih ćelija su pomešane sa ispranim Nogo receptor - 1 - COS - 7 ćelijama pre inkubacije sa anti - Nogo receptor - 1 test serumima. U svako od polja ploče od 96 polja sa V dnom od polistirena (Costar<®>) 3877, Corning, Nju Jork) dodato je 59 \ x\ ćelijske smeše i 100 ul supernatanta hibridoma ili kontrolnog anti - Nogo receptor - 1 antitela. Nakon inkubacije na temperaturi od 4 °C tokom 30 minuta, ćelije su isprane i inkubirane sa 50 ul afinitetno čistog F(ab')2 fragmentom kozijeg anti - mišijeg IgG Fc gama specifičnog sekundarnog antitela, konjugovanog sa R - fikoeritrinom (1: 200, Jackson ImmunoResearch Inc.) u PBS. Na kraju inkubacije ćelije su dva puta isprane u PBS i suspezovane u 200 ul PBS koji sadrži 1% FBS, nakon čega su podvrgnute FACS analizama. Alternativno, Nogo receptor - 1 - COS - 7 ćelije su pomešane sa supernatantom hibridoma, a potom su tretirane sa kozijim anti - mišijim sekundarnim antitelom koje je konjugovano sa R - fikoeritrinom i direktno su podvrgnute standardnim FACS analizama.
Generisano je 25 anti - Nogo receptor - 1 antitela korišćenjem različitih imunogena. Generisana su dva antitela, 7E1 i 5B10, korišćenjem peptidne sekvence koja odgovara ostacima 110 - 125 paovskog Nogo receptora - 1, kao imunogena. Generisana su tri antitela, 1H2, 3G5 i 2F7, korišćenjem kao imunogena, membrana dobijenih iz COS - 7 ćelija transficiranih sa pacovskim Nogo receptorom - 1 pune dužine. Generisano je 13 antitela korišćenjem, kao imunogena sNogoR310 - Fc (1D9.3; 1E4.7; 1B4.3; 2C4.3; 1F10.3; 2H1.4; 1H3.3; 1G4.1; 1E4.1; 2G7.1; 2C4.1; 2F11.1; i 1H4.1) i sedam antitela korišćenjem peptidne sekvence koja odgovara ostacima 423 - 434 pacovskog Nogo receptora - 1 kao imunogena (2E8,.l;2G11.2i 1B5.1).
Analiza sekvence monoklonskih antitela 7E11 i 5B10
Ekstrahovana je ukupna RNK korišćenjem Qiagen<®>RNeasv<®>mini komleta, a iz izolovane RNK je generisana cDNK. Amplifikovana je sekvenca lakog lanca pomoću PCR
čiji je ID broj 14). Ovi prajmeri sadrže degenerisane nukleotide kao što sledi: S predstavlja G ili C; M pretstavlja A ili C; R predstavlja G ili A; W predstavlja A ili T; K predstavlja G ili T i Y predstavlja T ili C. PCR fragmenti su klonirani u vektor za sekvencioniranje, pa je određenena DNK sekvenca CDR - ova, dideoksi - lančanom terminacijom korišćenjem prajmera specifičnih za sekvencionirajući vektor. Konceptualno su translirane DNK sekvence i parcijalne aminokiselinske sekvence CDR - ova teškog i lakog lanca monoklonskih antitela 7E11 i 5B10 su prikazane u Tabeli 2. U Tabeli 2 podvučene su tri CDR - a iz teškog i lakog lanca monoklonskih antitela. Laki lanac 7E11 i 5B10 poseduje identičnost aminokiselinske sekvence od 94%, a teški lanci poseduju identičnost aminokiselinske sekvence od 91%. Monoklonska antitela 7E11, 5B10 i 1H2 su IgGl izotipa, a monokllonska antitela 3G5 i 2F7 su IgG2a izotipi. Svako od ovih monoklonskih antitela poseduje laki lanac kapa izotipa. Ovim pristupom su analizirane sekvence i drugih monoklonskih antitela.
Inhibicija vezivanja liganda za rastvorljivi Nogo receptor - 1 pomoću monoklonskog
anti-Nogo receptor - l antitela
Testirana je sposobnost anti - Nogo receptor - 1 monoklonskih antitela, dobijenih na gore opisan način, da inhibiraju vezivanje liganda za Nogo receptor - 1.
0,5 ug rastvorljivog Nogo receptor - 1 fuzionog proteina koji sadrži aminokiselinske ostatke 26 - 344, pacovskog Nogo receptora - 1 i region šarke i Fc region pacovskog IgGl molekula (sNogoR344 - Fc), koji je dobijen na gore opisani način, imobilisano je na 250 ug proteina A ili aglutinina pšeničnih klica koji je konjugovan sa SPA perlama (Amersham Pharmacia Biotech) tokom 2 časa na temperaturi od 25 °C. U svakom od polja sa uzorkom su dodate SPA perle povezane sa Fc - sNogoR - 1, anti - Nogo receptor - 1 monoklonskm antitelom, i 1ul12<5>I - Nogo 66 (Amersham, 2000 Ci/mmol, 1 nM) u 50ul podloge za inkubaciju puferovane sa HEPES (10 nM HEPES, pH vrednosti 7,4; 0,1 % goveđeg seruma albumina, 0,1 % ovalbumina, 2mM MgC^, 2 mM CaCl2i inhibitori proteaze). Nakon 16 časova, radioaktivnost je izmerena u uzorcima u četiri primerka korišćenjem TopCount (Packard). IC50vrednosti su izračunate na osnovu analize fitovanja krive (Slika 3) (PRISM, GraphPad Sofhvare). U nekim eksperimentima, takođe su korišćeni konjugati liganda sa AP (AP - Nogo66) a vezivanje je detektovano, praćenjem aktivnosti alkalne fosfataze. Takođe je ispitivana sposobnost monoklonskih antitela da blokiraju vezivanje liganda MAD - Fc i AP - PM - gp za Nogo receptor - 1.
Monoklonska antitela 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 i 2F7 inhibiraju vezivanje Nogo66, MAG i OM - gp za sNogoR344 - Fc. Izračunata IC50vrednost za Nogo66 i antitela 7E11 i 1H2 je 400 nM i 60 nM, respektivno. Podaci ELISA praćenje inhibicije posredovane sa monoklonskim antitelima, vezivanja ova tri liganda za Nogo receptor - 1 su sažeto prikazana u Tabeli 3.
Procenat pomeranja je pokazan pri koncentraciji antitela od 30 nM, a EC50je određena na osnovu analize fitovanja krive, kao što je opisano ranije. Oznaka " -" ukazuje da ne postoji detektabilna aktivnost, a oznaka "ND" označava neodređene rezultate.
Primer 2: Proizvodnja Fab - faga anti- Nogoreceptor- 1antitela
Anti - Nogo receptor - 1 Fab- fag antitela koja se specifično vezuju za imunogeni Nogo receptor - 1 polipeptid, prema predmetnom pronalasku, su takođe dobijena korišćenjem postupka pretrage biblioteke Fab - faga, an sledeći način.
Pretraživana je MorphoSvs Fab - Phage biblioteka HuCAL<®>GOLD, da bi se otkrio rekombinantni pacovski rastvorljivi sNogoR344 - Fc protein i COS7 ćelije koje eksprimiraju pacovski Nogo receptor - 1. Fab - fagi koji se specifično vezuju za Nogo receptor - 1 su prečišćeni i karakterizovani. Teški lanac iz 14D5 je izveden iz Vh2 gena a laki lanac je izveden iz V^l gena. Aminokiselinske sekvence CDR - ova teškog i lakog lanca, jednog od ovih Fab - faga 14D5, su prikazane u Tabeli 4.
14D5 se vezuje za pacovski Nogo receptor - 1 u monovalentnoj i bivalentnoj formi. Dodatno, 14D5 se vezuje za misiji i humani Nogo receptor - 1 i za humani Nogo receptor - 2, ali se ne vezuje za misiji Nogo receptor - 3.
Primer 3: Imunoprecipitacija Nogo receptora - 1 pomoću anti - Nogo receptor - 1 monoklonskih antitela
Da bi se izvela imunoprecipitacija 100 ul liziranih ćelija ili 50 ul PiPLC tretiranih ćelija je pomešano sa 400 ili 450 ul pufera za ekstrakciju (10 mM Tris - HC1, pH vrednosti 7,2; 0,5% Tween - 20 ™, 0,2 mM PMSF) ili sa RIPA puferom, respektivno u prisustvu 30 ul proteina A ili G i 1 do 2 ug antitela. Smeša je inkubirana u šejkeru na temperaturi od 4 °C tokom 16 časova.
Uzorci su polako izliveni kako bi se dobila sitna sačma povezana sa proteinom A ili G. Čestice su tri puta isprane sa 1 ml pufera za ispiranje (10 mM Tris - HC1, pH vrednosti 7,2; 0,1% Tween - 20 ™). Zadnje ispiranje je izvedeno korišćenjem 10% originalnog pufera za ispiranje.
Sačma je resuspenzovana u lOOul 2X SDS sa 10% p - merkaptoetanola. Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi, pre nego što su nanešeni na 4 - 20 % Tris - Glicin gel, radi SDS - PAGE analize. Na osnovu SDS - PAGE gel analize, određeno je da monoklonska antitela 3G5 i 2F7 imunoprecipitiraju Nogo receptor - l.
Primer 4: Određivanje specifičnosti antitela pomoću ELISA
Da bi se odredila specifičnost monoklonskih i Fab - fag antitela, dobij enih u Primerima 1 i 2, izvedena je ELISA korišćenjem panela Nogo receptor - 1 polipeptida. Panel se sastoji od sNogoR310 - Fc (fuzioni protein koji sadrži aminokiseline 26-310 pacovskog Nogo receptor - 1 i pacovskog Fc fragmenta), sNogoR344 - Fc (videti iznad), polipeptid p - 617
(sekvenca čiji je ID broj 1), polipeptida p - 618 (polipeptid od 19 aminokiselina poreklom iz LRR7 regiona pacovskog Nogo receptora - 1; Slika 2; sekvenca čiji je ID broj 11) i polipeptida p - 4 i p - 5 (polipeptidi poreklom iz LRR - 5 i LRRCT regiona Nogo receptora - 1, respektivno). Kao kontrole su korišćeni ovalbumin i BSA. Kao što je prikazano na Slici 4, monoklonska antitela 1H2, 3G5 i 2F7 se specifično vezuju za sNogoR344 - Fc. U sličnim eksperimentima, ova antitela se specifično vezuju za polipeptid koji sadrži amino kiseline 310 - 344 pacovskog Nogo receptora - 1 (sekvenca čiji je ID br. 3), a monoklonska antitela 7E11 i 5B10 se specifično vezuju za polipeptid p - 617 (sekvenca čiji je ID broj 1).
Deset ovih antitela (1D9.3; 1E4.7; 1B4.3; 2C4.3; 1F10.3; 2H1.4; 1H3.3; 1G4.1; 1E4.1; i 2G7.1) koja su dobijena sNogoR310 - Fc imunizacijom, sprečavaju vezivanje jedno drugom, što ukazuje da ova antitela prepoznaju slične ili preklapajuće epitope na sNogoR310- Fc. Druga tri antitela dobijena sNogoR310 - Fc imunizacijom (2C4.1; 2F11.1; i 1H4.1) prepoznaju različite epitope locirane na aminokiselinskim ostacima 26 - 310.
Takođe su izvedeni ELISA testovi vezivanja korišćenjem Fab - faga 14D5. Kada je dozvoljeno vezivanje liganada AP - Nogo66, AP - OM - gp i MAG - Fc za imobilisani sNogoR344 - Fc, koncentracija 14D5 od 1 uM u potpunosti inhibira vezivanje Nogo i MAG. Za potpunu inhibiciju vezivanja OM - gp za sNogoR344 - Fc bilo je potrebno 10 uM 14D5.
Primer 5: Ispitivanje rasta neurita
U cilju ispitivanja svojstva monoklonskih i Fab - fag antitela, dobijenih na gore navenedi način, da smanjuju inhibitorni efekat mijelina iz CNS na neurone, pločice sa Lab - Tek<®>kulturom (četiri polja) su obložene sa poli - D - lisinom (Sigma<®>) u koncentraciji od 0,1 mg/ ml. Mijelin CNS ili PBS je nanet na pločice u vidu kapljica zapremine 3 ul. Na pločice sa mijelinom ili PBS - om su dodate fluorescentne mikrosfere (Polvsciences), kako bi se omogućila kasnija identifikacija kapljica (Grandpre et al., Nature 403, 2000). Nakon toga su Lab - Tk® pločice isprane i obložene lamininom (Gibco ™) u koncentraciji od 10 ug /ml. Neuroni iz gangliona dorzalnih korenova kičmenih nerava ekstrahovanih iz mladunaca P3 - 4 Sprague Dawley pacova su disocirani pomoću kolagenaze tipa 1 (Wortinghton), u koncentraciji od 1 mg/ ml, potom su agregati ćelija usitnjeni i preneti na ploče korišćenjem pasterovih pipeta (ovim korakom je povećan broj pojedinačnih neuronskih ćelija u kulturi), da bi na kraju na prethodno obložene pločice sa Lab - Tek<®>kulturom bilo naneto po 23000 ćelija po polju. Korišćena je podloga F12 koja sadrži 5% donorski konjski serum koji je inaktiviran toplotom, 5% fetalni goveđi serum inaktiviran toplotom i mNGF u koncentraciji od 50 ng/ml, nakon čega je smeša inkubirana na temeraturi od 37 °C u atmosferi od 5% CO2tokom 6 časova. Neposredno nakon postavljanja na ploče dodato je i 15 ug/ml monoklonskog antitela 7E11.
Pločice su fiksirane tokom 20 minuta korišćenjem 4% paraformaldehida koji sadrži 20% sukrozu, nakon čega su obojene reagensom specifičnim za neuronski marker anti beta - III - tubulin (Covance TUJ1) u razblaženju 1:500. Kao sekundarno antitelo anti - mišiji Alexa Fluor<®>594 antitelo (Molecular Probes) je razblaženo do razblaženja od 1:300, nakon čega su pločice pokrivene pokrovnim staklom koje je obloženo sa Gel/Mount ™ (Biomeda ™). Napravljene su digitalne fotografije sa uvećanjem od 5x korišćenjema OpenLab ™ softvera, koje su analizirane korišćenjem MetaMorph ™ softvera u cilju kvantifikacije neuronskog rasta.
Monoklonsko antitelo 7E11 obezbeđuje zaštitu DRG neurona od inhibicije rasta neurita koja je posredovana mijelinom (Slika 5). Slični rezultati su primećeni pri korišćenju monoklonskih antitela 1H2 i 3G5.
U testu zaštite rasta neurita u kome su pacovski P7 DRG neuroni kultivisani na supstratu sa mijelinom iz CNS, bivalentno 14D5 antitelo je takođe efikasno pospešivalo rast neurita.
Primer 6: Imunohistohemijska ispitivanja sa antitelom 7E11 na ćeljama koje su transficirane sa Nogo receptorom - 1
U cilju dalje karakterizacije svojstava vezivanja anti - Nogo receptor - 1 monoklonskih antitela, dobijenih kao što je opisano u Primeru 1, vršeno je upoređivanje vezivanja za fiksirane i za žive COS7 ili 293 ćelije koje eksprimiraju pacovski ili humani Nogo receptor - 1.
Fiksirane ćelije
Ćelije koje su transficirane sa Nogo receptor - 1 i ćelije koje nisu transficirane su postavljene na pločice od 8 polja sa Lab - Tek<®>kulturom, fiksirane su sa 4% paraformaldefidom tokom 15 minuta, nakon čega su blokirane sa 10% normalnim kozijim serumom i 0,1 % Triton X - 100 u PBS tokom jednog časa. U rastvor za blokiranje je dodato monoklonsko antitelo 7E11 u koncentraciji od 15 ug/ ml i 1,5 ug/ ml nakon čega je kultura
inkubirana tokom 2 časa na sobnoj temperaturi; u rastvoru za blokiranje je inkubirano i Alexa<®>konjugovano sekundarno anti - misije - antitelo (Molecular Probes) tokom jednog časa; na kraju dodat je DAPI u koncentraciji od 5 ug/ ml u rastvor sekundarnog antitela u cilju obeležavanja svih jedara.
Žive ćelije
Transficirane i netransficirane ćelije su postavljene na pločice od osam polja sa Lab - Tek<®>kulturom, blokirane su sa FACS puferom ( sadrži 4% donorski konjski serum) tokom 30 minuta na temperaturi od 4 °C, zatim su inkubirane sa 7E11 antitelom u koncentraciji od 15 ug/ ml i 1,5 ug/ ml u FACS puferu tokom jednog časa na 4 °C, zatim su isprane i inkubirane sa sekundarnim anti - mišijim - antitelom konjugovanim sa Alexa<®>(razblaženje 1:300 u FACS puferu), tokom 30 minuta na temperaturi od 4 °C.
Eksperimenti sa imunohistohemijskim bojenjem su pokazali da se sva monoklonska antitela vezuju za ćelije koje eksprimiraju pacovski Nogo receptor - 1. Monoklonska antitela 7E11, 2G7.1 i 2C4.1 se vezuju i za fiksirane i za žive ćelije koje eksprimiraju humani Nogo receptor - 1.
Primer 7: Misiji model kontuzione povrede kičmene moždine
U cilju ispitivanja efekta anti - Nogo receptor - 1 monoklonskih antitela dobijen postupkom koji je opisan u Primeru 1 na neuronein vivo,korišćen je model kontuzione povrede kičmene moždine miša.
Ženke miševa (telesne mase od 18 - 22 g) su profilaktički tretirane analgeticima i antibioticima. Miševi su anestezirani i postavljeni na stereotaksički aparat koji poseduje fiksator kičmenog stuba pod stereomikroskopom. Trauma kičmene moždine je proizvedena korišćenjem modifikovane verzije postupka sa ispuštanjem opterećenja (M. Li et al., Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase -2 and -3 in a mouse model of traumatic spinal cord injurv; Neuroscience Vol. 99, pp. 333 - 342, 2000).
Ukratko, načinjena je T9 i T10 laminektomija, a kičmeni stub je stabilizovan korišćenjem transferzalnih klema za miševe kojima se bilateralno podržavaju T9 - T10 transferzalni nastavci kičmenih pršljenova. Štapić od nerđajućeg čelika za nanošenje povreda čiji je dijametar 1,4 mm a težina 2 g, podignut je 2,5 cm iznad tvrde moždane opne i ispušten je na kičmenu moždinu u nivou T10. Tokom intervencije, miševi su držani na temperaturi od 37 °C korišćenjem pokrivača za utopljavanje, a nakon intervencije u cilju izbegavanja dehidracije, subkutano je svakom mišu ubrizgano po 1 ml toplog sterilnog fiziološkog rastvora. Bešika miša je manuelno pražnjena jednom dnevno sve do uspostavljanja refleksne kontrole sfingtera mokraćne bešike. Sve životinje su postoperativno dobijale analgeziju svakih 8 do 12 časova, kao i antibiotski tretman 2x dnevno tokom 7 dana nakon intervencije. Životinjama je omogućen slobodan pristup hrani i vodi tokom trajanja ispitivanja. Anti - Nogo receptor - 1 antitela su primenjivana na mestu povrede putem intratekalnih injekcija, tokom 28 dana kao stoje opisano u pacovskom modelu transekcije kičmene moždine koji je opisan ispod.
Primer 8: Karakterizacija rastvoljivih Nogo receptor - 1 fuzionih proteina
U cilju karakterizacije rastvorljivih Nogo receptor - 1 polipeptida (sNogoR - 1) i fuzionih proteina (Fc - sNogoR - 1), izveden je sledeći eksperiment: Količina od 3 mg rastvorljivih Nogo receptora (sNogoR - 1 - Fc i sNogoR344 - Fc) je imobilisana na 2500 ug WGA - SPA perlicama, nakon čega je primenjeno 0,5 ug radioktivnog liganda (krajnja koncentracija 0,5 nM) u krajnjoj zapremini od 100 ml pufera za vezivanje (20 mM HEPES, pH vrednosti 7,4, 2mM Ca, 2 mM Mg, 0,1% BSA, 0,1% ovalbumina i inhibitori proteaze). U svakom setu liganda se nalazi po 10 uM Nogo66, 10 uM<125>I - Nogo40 (amino kiseline 1-40 NogoA) i po 10 ul anti - Nogo receptor - 1 antitela. Tri tirozinska ostatka proteina Nogo40 su zasebno jodinirana i označeni su kao Nogo40 - A, Nogo40 -B, Nogo40 -C, respektivno. Srednje vrednosti uzoraka u triplikatu su predstavljene kao normalizovana vrednost izražena u procentima vezane radioaktivnosti (Slike 6, 7, 8). Prečke ukazuju na standardnu grešku u merenju. Vezana radioaktivnost u odsustvu inhibitora je uzeta kao 100% vrednost a najmanja vezana radioaktivnost u prisustvu 10 uM Nogo40 je uzeta kao 0% vrednost prilikom normalizacije podataka.
Primer 9: Inhibicija vezivanja liganda za rastvorljivi Nogo receptor - 1 fuzioni protein
Za ispitivanje sposobnosti dva monoklonska antitela koja su dobijena u Primeru 1, da inhibiraju I - Nogo66 vezivanje za sNogoR344 - Fc, korišćen je test vezivanja koji je sličan tesu vezivanja koji je opisan u Primeru 8. Monoklonska antitela 2F7 i 3G5 inhibiraju vezivanje125I - Nogo66 za sNogoR344 - Fc.
Primer 10: Ispitivanje rasta neurita
Pločice sa Lab - Tek<®>kulturom (4 polja) su obložene sa poli - D - užinom (Sigma ®) u koncentraciji od 0,1 ug/ml. Na pločice je zasebno naneto u vidu kapljica zapremine od 3 ul sam mijelin iz CNS ili mijelin iz CNS u smeši sa sNogoR310, sNogoR310 - Fc fuzionim proteinom, monoklonskim antitelom 5B10 ili sa PBS kao kontrolom. Na pločice sa mijelinom ili PBS - om su dodate fluorescentne mikrosfere (Polvsciences), kako bi se omogućila kasnija identifikacija kapljica (Grandpre et al., Nature 403, 2000). Nakon toga su Lab - Tek<®>pločice isprane i obložene sa lamininom (Gibco™) u koncentraciji od 10 u.g/ml.
Neuroni iz gangliona dorzalnih korenova kičmenih nerava (DRG - ovi) iz mladunaca P3 - 4 Sprague Dawley pacova su disocirani korišćenjem kolagenaze tipa 1 (Worthington), u koncentraciji od 1 ug/ml, zatim su grupe neurona usitnjene u cilju povećanja broja neuronskih ćelija, korišćenjem pasterovih pipeta koje su sterilisane vatrom, da bi se konačno ćelije postavile na prethodno obložene pločice za kultivaciju u koncentraciji od 23000 ćelija po polju. Korišćena je F12 podloga za kultivaciju koja sadrži 5% donorski konjski serum inaktiviran toplotom, 5% fetalni goveđi serum inaktiviran toplotom i 50 ng/ml mNFG, nakon čega su ploče inkubirane na temperaturi od 37 °C u atmosferi sa 5% CO2.
Pločice su fiksirane nakon 20 minuta sa 4% paraformaldehidom koji sadrži 20% sukrozu, nakon čega su obojene upotrebom neuronskog markera anti - P - III - tubulina (Covance TUJ1) u razblaženju 1: 500. Kao sekundarno antitelo korišćeno je anti - mišije Alexa Fluor<®>594 antitelo (Molecular Probes) u razblaženju 1: 300, nakon čega su pločice prekrivene pokrovnim staklom sa Gel /Mount™ (Biomeda). Napravljene su digitalne fotografije sa uvećanjem 5x korišćenjem OpenLab™ softvera koje su analizirane korišćenjem MetaMorph ™ softvera u cilju kvantifikacije rasta neurita.
sNogoR310, sNogoR310 - Fc i monoklonsko antitelo 5B10 zaštićuju DRG neurone od inhibicije rasta neurita koja je posredovana mijelinom (Slike 9-11). sNogoR310 je korišćen u sličnom testu, korišćenjem neurona pileta, pri čemu je primećeno da obezbeđuje navedenu zaštitu.
Takođe, ispitivan je neuroprotektivni efekat rastvorljivih Nogo receptora u eksperimentima sa ćelijama koje su uzgajane u prisustvu ili odsustvu laminina. Rast neurona u podlozi bez laminina je slab i predstavlja model uslova stresa neuronskih ćelija.
DRG - ovi su ekstrahovani iz mladunaca starih 6 -7 dana (P6 - 7), zatim su disocirani u pojedinačne ćelije i postavljeni na ploče od 96 polja koje su prethoodno obložene sa poli - D - lizinom, kao što je opisano gore. U neka polja je dodato po 2 ug/ml laminina tokom 2 do 3 časa koji je ispran pre dodavanja ćelijama. Nakon inkubacije od 18 do 20 časova, ploče su fiksirane sa 4% paraforrnaldehidom, obojene su sa zečijim anti - p - III - tubulinskim antitelom u razblaženju 1: 500 (Covance<®>) i sa anti - HuC/D antitelom u razblaženju 1:100 (Molecular Probes), nakon čega je dodato fluorescentno sekundarno antitelo (Molecular Probes) u razblaženju od 1: 200. Za dobijanje digitalnih slika sa uvećanjem od 5x korišćenje ArravScan<®>II (Cellomics<®>) što je poslužilo za kvantifikaciju rasta neurita koji izražen u obliku prosečne vrednosti rasta neurita/neuronu/polju korišćenjem softvera koji je ranije naveden. Analizirano je 9 slika sa uvećanjem 5x dobijenih iz 3 polja po stanju.
U nekim eksperimentima, korišćen je subklon PC 12 ćelija (Neuroscreen ™) od (Cellomics<®>). Neuroscreen ™ ćelije su prethodno diferencirane tokom 7 dana korišćenjem NGF u koncentraciji od 200 ng/ml, zatim su razdvojene od podloge i ponovo postavljene na ploču od 96 polja koja je prethodno obložena sa poli - D - lizinom. U neka polja je tokom 2 do 3 časa dodat laminin u koncentraciji od 5u.g/ml, koji je ispran pre dodavanja ćelija. Nakon inkubacije tokom 2 dana, ploče su fiksirane sa 4% paraforrnaldehidom, obojene su zečijim anti - P - III - tubulinskim antitelom u razblaženju od 1:500 (Covance<®>) i sa Hoechst (boja za jedra). Za kvantifikaciju rasta neurona korišćenje ArravScan<®>II, koji je korišćen i kod DRG ćelija.
U vreme postavljanja rastvora P6 - 7 neurona i diferenciranih Neuroscreen ™ ćelija na ploče dodat je sNogoR344 - Fc ili pacovski IgG. Neuroprotektivni efekat sNogoR344 - Fc je primećen pri koncentracijama od luM i 10 uM, u slučaju kada su P6 DRG neuroni uzgajani u odsustvu mijelina. Kvantifikacija rasta neurita je pokazala dozno zavisni porast koji prati dodavanje sNogoR344 - Fc. Dodavanje sNogoR344 - Fc u istim koncentracijama DRG neuronima koji seuzgajaju na lamininu nije dovelo do pojave neuobičajenog efekta, što ukazuje da je sNogoR344 - Fc isključivo aktivan kod ćelija pod stresom. Neuroprotektivni efekat sNogoR344 - Fc u istim koncentracijama, ali u odsestvu laminina, takođe je primećen kod Neuroscreen ™ ćelija.
Primer11: Proizvodnja i prečišćavanje F - sNogoR - 1 fuzionog proteina
cDNK konstrukt koji kodira amino kiseline 1-310 pacovskog Nogo receptora - 1 je fuzionisan sa Fc regionom pacovskog IgGl imunoglobulina koji se nalazi u sastavu sisarskog ekspresionog vektora koji je elektroforacijom ubačen u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO)
(DG44) ćelije. Ćelije su održavane u podlozi a - MEM, kojoj je dodat 10% dijalizirani fetalni goveđi serum, 2 mM glutamina i antibiotska i antimikotska sredstva. Dva dana nakon transfekcije, kondicionirana podloga je prikupljena i analizirana korišćenjem Western blot analize u redukujućim uslovima. Korišćenjem poliklonskog zečijeg anti - Nogo receptor - 1 antitela, detektovana je traka proteina molekulske mase od oko 60 kDa. Ćelije su ekspandirane i sortirane korišćenjem kozijeg anti - pacovskog IgG antitela koje je konjugovano sa R - PE. Nakon drugog sortiranja ćelije su postavljene na ploče za mikrotitraciju od 96 polja u gustini od jedne ćelije po polju. Ispitivani su nivoi sekretovanog rastvorljivog Nogo receptor - 1 proteina iz pojedinačnih polja i upoređivani su korišćenjem Sandvvich ELISA. Ploče podvrgnute ovoj analizi su obložene sa kozijim anti - pacovskim IgG antitelom specifičnim za Fckregion. Dodata je kondicionirana podloga. Vezani rastvorljivi Nogo receptor - 1 protein je detektovan korišćenjem magarećeg anti - pacovskog IgG Fab fragmenta specifičnog za Fc domen koji je konjugovan sa HRP. Klon 4C12 poseduje najviši nivo sekrecije. Navedeni klon je ekspandiran i uzgajan u flašici za mućkanje u kojoj se nalazi CHO - M7 podloga. Koncentracija sekretovanog proteina je oko 10 mg/l na temperaturi od 37 °C.
CHO ćelije koje eksprimiraju sNogoR310 - Fc fuzioni protein su kultivisane u većoj količini. Po ciklusu u bioreaktoru zapremine 10 litara dobija se 1,7 1 koncentrovane kondicionirane podloge. pH vrednost je podizana dodavanjem jedne desetine zapremine 1,0M Tris - HC1, pH vrednosti 8,9. Dodat je natrijum hlorid u čvrstom stanju i glicin do koncentracije od 3,0 Mi 1,0 M, respektivno. Pripremljena je protein A - Sepharose ™ kolona od 60 ml koja je ekvilibrisana sa 10 mM Tris - HC1, 3 M natrijum hloridom, 1,5 M glicinom, čija je pHvrednost 8,9. Na kolonu je naneta koncentrovana kondicioniorana podloga pri brzini protoka od 1,5 ml/min korišćenjem peristaltičke pumpe. Kolona je isprana sa 300 ml, 10 mM Tris - HC1, 3 M natrijum hlorida, 1,5 M glician , čija je pH vrednost 8,9 a nakon toga sa 120 ml 5mM Tris - HC1, 3 M natrijum hlorida čija je pHvrednost 8,9. Protein je eluiran sa 25 mM natrijum fosfata, 100 mM natrijum hlorida, čija je pH vrednost 2,8. U kivetama koje sadrže 1,0 ml l,OM HEPES, su prikupljene frakcije od po 10 ml. Proteinske frakcije su objedinjene i dijalizirane nasuprot 3x2 litara 5 mM natrijum fosfata, 300 mM natrijum hlorida, pH = 7,4.
Primer 12: Test transekcije kičmene moždine
U cilju ispitivanja njihove sposobnosti da pospeše funkcionalni oporavakin vivo,sNogoR - 1 fuzioni protein je ispitivan u testu transekcije kičmene moždine pacova.
Alzet<®>osmotske pumpe su napunjene sa rastvorom koji se ispituje (sNogoR310 - Fc u PBS) koji je sveže napravljen na dan upotrebe. Koncentracija za punjenje je izračunata kao 5 i 50 uM. Pumpe su radile tokom više od 40 časova na temperaturi od 37 °C pre njihove inplantacije u organizam životinja. Ženkama Long Evans pacova je data preoperativna analgezija i sedativ, nakon čega su anestezirane korišćenjem izoflurana (3% u O2).
Pacovi su postavljeni u stereotaktični okvir, nakon čega je njihov motorni korteks izložen infuziji BDA (sredstvo za praćenje neuronskih puteva; molekulska masa oko 10000) bilateralno. Nakon toga pacovima je učinjena dorzalna hemisekcija kičmene moždine na segmentu T5 - T6 nakon čega je implantiran kateter i sistem pumpe za dopremanje jedinjenja koje se ispituje (n = 11 po grupi).
Omogućeno je da se pacovi oporave i prežive sve do 28 dana nakon intervencije. Sve do 28 dana od indukcije povrede, beležene su ocene ponašanja korišćenjem BBB sistema, praktično sve do terminacije zaživotne faze ispitivanja. Nakon perfuzije i fiksacije, kičmene moždine su uklonjene, zaleđene, napravljeni su preseci koji su obojeni i na kojima su brojni aksoni.
Kod pacova i miševa je nakon povrede praćeno ponašanje korišćenjem Basso - Beattie - Bresnahan (BBB) lokomotorne skale za ocenjivanje (Basso et al, 1996, Neurotrauma 13, 343
- 359), test sa ravni pod nagibom i test hodanja po žičanoj mreži pod nagibom (Li & Strittmatter, 2003, J. Neurosci. 2003, 23, 4219 - 27). U testu sa ravni pod nagibom meren je maksimalni ugao pod kojim ploča dimenzija 50 * 60 cm, može da bude nagnuta tokom 5 sekundi, a da miš ne sklizne. Tokom testa hodanja po žičanoj ravni pod nagibom, miševi su obučavani da se penju po žičanoj mreži (dugačka 35 cm sa kvachatnim okcima veličine 2,54 cm) pri nagibu od 45°. Broj slučajeva u kojima zadnja šapa pada ispod ravni žičane mreže je beležen kao ocena za svaki od pokušaja pri kretanju od dna do vrha. Prilikom ispitivanja ponašanja pacova korišćena je BBB lokomotorna skala, kretanje po žičanoj mreži i analiza otisaka stopala. U ispitivanju kretanja po žičanoj mreži, pacovi su trenirani da šetaju po
žičanoj mreži (70 cm dugačke, sa kvadratnim okcima od 2,54 cm), nakon čega su brojani slučajevi u kojima je zadnja šapa pala ispod ravni žičane mreže. Kod analize otiska stopala obrazac hodanja zadnjih šapa pacova je obeležen korišćennjem mastila tokom kontinuiranog kretanja preko staze od 90 cm, pa je proračunavana dužina koraka na svakoj strani i širina koraka (Metz et al., 2000, Brain Res., 883, 165 - 177). Svi od navedenih testova ponašanja su izvođeni na najmanje dve jedinke. U toku čitavog postupka koji obuhvata intervenciju, testiranje obrazaca ponašanja i histološku analizu tkiva, istraživači nisu znali identitet jedinjenja sadržanog u minipumpi.
sNogoR310 - Fc pospešuje funkcionalni oporavak (Slika 12).
Primer 13: Test kontuzije kičmene moždine pacova
U testu kontuzije kičmene moždine pacova je ispitivan efekat rastvorljivih Nogo receptor -1 polipeptida i fuzionih proteina na neuronein vivo.
Ženke Long Evans pacova (telesne mase 170 - 190 g) su tretirane profilaktički analgetikom i antibiotikom. Deset minuta pre intervencije životinje su intrapeirtonealno sedirane sa Midazolamom u koncentraciji 2,5 mg/kg, nakon čega su anestezirane sa 2 - 3 % izoflurana u O2. Pacovi su zatim obrijani, koža im je obrisana alkoholom i betadinom, a na konjuktive je primenjen okularni lubrikant. Sledeće, u središnjoj liniji je napravljen rez i prikazani su pršljenovi T7 - T12.
Na polovini T9 i T10 je načinjena dorzalna laminektomija u cilju izlaganja kičmene moždine. Pacovi su postavljeni na aparat Impactor. Segmenti T7 i T8 su prvi klemovani a zatim su segmenti Tll i T12 prikačeni za klauzalnu klemu. Ispod grudi pacova je postavljen meki materijal. Štapić aparata Impactor postavljen je u položaj 0, nakon čega je klema sa uzemljenjem prikačena na ivicu rane. Nakon toga je štapić Impaactora podignu na 25,2 mm i podešen na odgovarajući način neposredno iznad prikazane kičmene moždine. Štapić Impactora je otpušten kako bi pogodio izloženu kičmenu moždinu nakon čega je odmah podignut.
Nakon ovoga, pacovi su uklonjeni sa aparata Impactor, a na ranu je postavljen Gelfoam<®>. Mišići iznad rane su ušiveni a incizija na koži je hirurški zatvorena. Životinje su postavljene u inkubator sve dok se nisu povratile iz anestezije. Pacovima su dati antibiotici, analgetici i fiziološki rastvor po potrebi. Bešike životinja su pražnjene svako jutro i svako veče od momenta intervencije sve dok funkcija svingtera nije uspostavljena.
Rastvorljivi Nogo receptor - 1 fuzioni protein (npr., sNogoR310 - Fc) je primenjen intratekalno kao što je opisano u modelu transekcije kičmene moždine pacova navedenom gore. Ocenjivano je ponašanje pacova korišćenjem BBB sistema ocenjivanja jedan dan nakon intervencije, a potom svake nedelje sve do četvrte ili do šeste nedelje.
Primer 14: Ekspresija sNogoR310 u transgenim miševima
Proizvedeni su transgeni miševi koji eksprimiraju rastvorljivi Nogo receptor - 1 protein u cilju ispitivanja efekta ovog proteina kada je eksprimiranin vivo.
Klonirana je mišija cDNK koja kodira sNogoR310 (odgovara amino kiselinama 1-310 Nogo receptora - 1) uNotimestovektora C - 3123. U ovom vektoru, eksprisija sNogoR310 se nalazi pod kontrolom regulatornih elemenata gena za glialni fibrilarni kiseli protein( gfap -glial fibliarv acidic protein), koji omogućava visok nivo ekspresije uz pojačanu sekreciju iz reaktivnih atrocita na mestu povrede. Sekvencionalno je razgrađen nastali vektor korišćenjemAatlliSflI,agfap:: sNogoR310konstrukt je izolovan na fragmentu od 3,4 kb. Ovaj fragment je mikroinjektiran u embrione kako bi se dobili transgeni miševi. Upotrebom PCR je verifikovana integracija transgena i identifikovano je 5 linija koje nose ovaj vektor. Ukršteni su heterozigotni mužjaci dve osnovne linije koje poseduju najviše stepene ekspresije sa ženkama C57BL/6J miševa. Pomoću Western blot analize korišćenjem antitela protiv Nogo receptora - 1 potvrđeno je dagfappozitivne ćelije eksprimiraju i sekretuju sNogoR310 kod heterozigotnih transgenih miševa.
Moždana kora i kičmena moždina transgenih miševa su homogenizovane u fiziološkom rastvoru koji je puferovan sa Tris i u kome se nalaze inhibitori proteaze (Roche), i homogenat je centrifugiran na 40000 o/minutu tokom 20 minuta na 4 °C. Supernatant je tretiran sa 4% paraforrnaldehidom tokom 20 minuta u cilju povećavanja specifičnosti antitela, nakon čega je smeša dijalizirana neposredno pre imunoblot analize. Poželjna frakcija je homogenizovana korišćenjem ultra zvuka u RIPA puferu (1% Triton<®>X-100, 0,5% natrijum deoksiholata, 0,1% SDS u PBS), dobijeni homogenat je centrifugiran a supernatant (frakcija koja je rastvorljiva u detergentu) je tretiran kao što je navedeno gore. Analizirano je 20 ug proteina mozga ili kičmene moždine upotrebom imunoblot tehnike uz pomoć zečijeg anti seruma specifičnog za Nogo receptor - 1 u razblaženje 1:2000. Imunoreaktivnost je vizuellizovana inkubacijom sa anti - zečiji IgG antitelom konjugovanim sa AP i sa NBT/BCIP AP supstratom.
U rastvorljivim ekstraktima koji ne sadrže detergent moždane kore i kičmene moždine iz dve transgene linije Tg08 i TgOl, detektovan je sekretovani sNogoR310 molekulske mase od 37 kDa, dok je kod kontrolnih životinja divljeg tipa prisutna veoma mala količina (ukoliko se uopšte može detektovati), rastvorljivog Nogo receptor - 1 molekulske mase 37 ili 81 kDa. Ispitivanje navedenih frakcija je pokazalo da postoje komparabilni nivoi endogenog Nogo receptora - 1 u miševima divljeg tipa i u transgenim miševima.
Primer 15: Ekspresija sNogoR310 kod transgenih miševa nakon povrede
Ispitivanje efekat povrede CNS na ekspresiju sNogoR310 kod transgenih miševa nakon izvođenja dorzalne hemisekcije kičmene moždine. sNogoR310 transgeni miševi i ne transgene kontrolne životinje su dobijene ukrštanjem heterozigotnih mužjaka sa ženkama C57/BL6 miševa, kao što je opisano u Primeru 14.
Odrasle ženke heterozigotnih transgenih miševa ili odgovarajućih miševa divljeg tipa (starosne dobi 10 - 26 nedelja) su uvedene u duboku anesteziju nakon čega je izvedena kompletna laminektomija, kojoj se u potpunosti izlaže dorzalni deo kičmene moždine u nivoima T6 i T7. Učinjena je dorzalna hemisekcija u nivou T6 korišćenjem igle veličine 30 G i para mikrimakaza kojim se dovršilo presecanje dorzalnih i dorzolateralnih kortikospinalnih puteva. Kroz dorzalni deo kičmene moždine nekoliko puta je probodena navedena igla kako bi se osiguralo daje lezija napravljena u dubini od 1, 0 mm. Iznad laminektomija su ušiveni mišićni slojevi i zatvorena je koža leđa korišćenjem hirurških kopči. U cilju praćenja kortikospinalnih puteva, napravljena je rupa u lobanji na mestu koje prekriva korteks velikog mozga sa desne strane, 14 dana nakon povrede kičmene moždine. Nakon toga je primenjena boja za praćenje puta BDA (molekulska masa 10000, 10% u PBS) (Molecular Probes, Eugene, OR) na četiri injekciona mesta u dubini od 0,7 mm u odnosu na kortikalnu površinu. Nakon 4 nedelje od povrede, kroz srce miševa je perfundovan PBS a potom 4% paraformaldehid. Miševi koji su korišćeni u eksperimentima ekspresije sNogoR310 nisu dobijali injekcije sredstva za praćenje nervnog puta.
Kod miševa koji su korišćeni za Western blot analizu, prikupljena je kičmena moždina u nivou između T3 i L3 bez perfuzije, 14 dana nakon povrede. Miševi koji su korišćeni u eksperimentima sa imunohistohemijskim bojenjem na Nogo receptor - 1 su perfundovani sa 4% paraforrnaldehidom 10 dana nakon hemisekcije, a povređena kičmena moždina im je uklonjena radi imunohistohemijskih ispitivanja. U cilju ispitivanja ekspresije sNogoR310 u povređenom mozgu transgenih miševa i miševa divljeg tipa, načinjena je ubodna povreda moždane kore korišćenjem skalpela veličine 11 koji se nalazi u stereotaktičkom aparatu (David Kopf, Tujunga, CA). Načinjen je parasagitalni rez dužine 4 mm, 2,5 mm posteriorno od Bregme, 1,5 mm laterlno od središnje linije, čija je dubina 3,5 mm.
Detektovani su povišeni nivoi sNogoR310 u rastvorljivim ekstraktima kičmene moždine 10 dana nakon povrede kod transgenih miševa, ali ne i kod miševa divljeg tipa što odgovara povećanju broja receptora nakon povrede GFAP koji se nalaze oko lezije. Kako bi se potvrdilo da ova pojava nije posledica kompenzatomog povećanja ekspresije NogoA, ispitivana je ekspresija ovog proteina i pronađeno je daje nivo ekspresije sličan u intaktnim i u povređenim korteksima i kičmenoj moždini i kod miševa divljeg tipa i kod miševa divljeg tipa.
Ispitivana je ćelijska ekspresija sNogoR310 u centralnom nervnom sistemu koji je povređen korišćenjem imunološkog bojenja povređenog mozga i kičmene moždine uz pomoć antitela protiv Nogo receptora - 1 i GFAP. Opšte morfološke karakteristike reaktivne astrocitne glie se ne razlikuju od miševa divljeg tipa i transgenih miševa, ali je gustina bojenja za Nogo receptor - 1 u intra i u ekstra celularnom prostoru izraženo veća kodgfap:: sNogoR310transgenih miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa, što ukazuje na povećanu ekspresiju sNogoR310 oko mesta lezije kod transgenih miševa. Nogo receptor - 1 protein je kolokalizovan sa astrocitnim marketom GFAP samo kod transgenih miševa. Takođe, detektovano je veoma pojačano difuzno ne ćelijsko bojenje u uzorcima iz transgenih miševa, što ukazuje na prisustvo sNogoR310 u ekstracelulamom prostoru. Nogo receptor - 1 je detektovan na telu neurona i kod miševa divljeg tipa i kod transgenih miševa.
Primer 16: Sekretovani sNogoR310 indukuje rast neurita u sastavu
kortikospinalnih puteva kod trangenih miševa
Ispitivano je da li povećana ekspresija sNogoR310 oko lezije kod transgenih miševa dovodi do regeneracije povređenih aksona.
Ispitivan je integritet descedentnih kortikospinalnih puteva (CST - corticospinal tracts) injektiranjem anterogradnog sredstva za praćenje biotin dekstranamina (BDA) u desni motorni korteks, kao što je opisano u Li & Strittermatter, 2003, J. Neurosci., 23, 4219 - 27. Kod kontrolnih miševa divljeg tipa izraženi dorzalni kortikospinalni putevi su tesno upetljani rostralno od mesta lezije, a ipsilateralno su viđena samo retka dorzolateralna vlakna kortikospinalnih puteva. Mali broj sa BDA obeleženih kratkih, kolateralnih izdanaka se projektuje do sive mase, posebno u ventralnom delu kičmene moždine, ali je pojava izdanaka u njvećoj meri prisutna na strani kičmene moždine koja se nalazi kontralateralno od mesta davanja injekcije sredstva za praćenje. Međutim, ispitivanje isečaka iz područja koje je rostralno u odnosu na mesto dorzalne hemisekcije kod povređenih sNogoR310 transgenih miševa, ukazuju na potpuno drugačiji obrazac obeležavanja sa BDA. Velika gustina sa BDA obeleženih vlakana kortikospinalnog puta, je primećena van izraženog dorzalnog kortikospinalnog puta kod svih transgenih miševa iz linije Tg08 ili iz linije TgOl. Ektopična vlakna se protežu kroz područje sive mase a neka vlakna dospevaju do lateralne i dorzo - lateralne bele mase. Neka vlakna (4 - 12 izdanaka po transferzalnom preseku) su primećena na suprotnoj strani od povrede kičmene moždine (ipsilateralno sa mestom injektiranja sredstva za praćenje). Mikro denzitometarska merenja kolateralnih izdanaka ukazuju na postojanje otprilike desetostrukog povećanja gustine izdanaka kod sNogoR310 transgenih miševa. Ispitivanjem parasagitalnih longitudinalnih preseka načinjenih 1 do 4 mm rostralno u odnosu na leziju je otkriveno da vlakna dorzalnog kortikospinalnog puta pružaju veliki broj razgranatih izdanaka u područje ventralne sive mase kod sNogoR310 transgenih miševa u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa. Generalno, obrazac i stepen stvaranja izdanaka rostralno u odnosu na leziju kod transgenih miševa su slični kod onih koji su primećeni kod miševa sistemski tretiranih sa antagonistom Nogo receptora - 1 koji je označen kao NEP1 - 40 (Li & Strittmatter, 2003).
Ovi rezultati pokazuju da sekretovani sNogoR310 indukuje stvaranje izdanaka kortikospinalnog puta kod transgenih miševa.
Primer 17: Aksoni kortikospinalnog puta koji regenerišu prelaze kroz mesto lezije u distalni deo kičmene moždine kod sNogoR310 transgenih miševa
Izolovana je kičmena moždina u segmentu 4 mm rostralno i 4 mm kauzalno od mesta lezije ( ukupne dužine od 8 mm) iz transgenih miševa, koja je nakon toga uronjena u podlogu albumina koji je polimerizovao sa glutaraldehidom, i napravljeni su parasagitalni preseci korišćenjem vibratome (debljina preseka 30 um). Prikupljeni su transverzalni preseci (debljine 50 \ im) kičmene moždine iz segmenta koji se prostire 5-7 mm rostralno i 5 - 7 mm kaudalno od mesta povrede. Kod eksperimenata na pacovima u kojima je injektiran sNogoR310 - Fc, korišćenjem vibrirajućih mikrotoma napravljeni su parasagitalni preseci (50 um debljine) na segmentu kičmene moždine koji se prostire 10 mm rostralno i 10 mm kaudalno od mesta lezije. Napravljeni su transferzalni preseci na segmentu kičmene moždine koji se proteže 11-16 mm rostralno, 11-16 mm kaudalno od mesta povrede. Isečci su inkubirani sa kompleksom avitin - biotin - peroksidaza, a BDA sredstvo za praćenje protezanja vlakana je vizuelizovano korišćenjem diaminobenzidin HRP reakcije pospešene niklom (Grandpre, 2002, Nature, 417, 547 - 551). Neki isečci su imunohistohemijski analizirani na prisustvo serotonina (upotrebljeno je anti - 5 - HT antitelo) korišćenjem indirektne imunoflorescencije. U cilju vizuelizacije područja sa povredom, neki preseci su dvostruko obojeni upotrebom antitela specifičnih za GFAP (Sigma, St. Louis, MO). Isečci su naneti na pločice, dehidrirani i prekriveni podlogom za prekrivanje.
Ispitivano je da li vlakna čiji je rast indukovan sa sNogoR310 koji je ekspeimiran kod transgenih miševa, nakon povrede (videti Primer 16) prelaze kroz mesto povrede u kaudalni deo kičmene moždine, čime omogućavaju funkcionalni oporavak.
Na serijskim parasagitalnim presecima kroz region kičmene moždine na kome je načinjena povreda ispitivan je opšti obrazac distribucije regenerišućih vlakana kortikospinalnog puta, pri čemu posebnu važnost imaju preseci načinjeni na samo nekoliko milimetara od mesta lezije. Preseci kičmene moždine miševa divljeg tipa pokazuju da ne postoji prostiranje vlakana kortikospinalnog puta distalno od mesta lezije. Slični preseci kičmene moždine kod sNogoR310 transgenih miševa pokazuju da postoje brojna vlakna kortikospinalnog puta koja prolaze kroz područje lezije i koja se projektuju distalno do sive i bele mase, pri čemu njihovo projektovanje pokazuje obrazac izraženog razgranatog prostiranja. U području koje je neposredno rostralno od mesta hemisekcije postoji pupljenje vlakana kortikospinalnog puta koja su obeležena sa BDA, čija je gustina velika i koja potiču iz izraženih projekcija vlakana distalnog kortikospinalnog puta u područje lezije, pri čemu najveći broj izdanaka ne može da prođe područje transekcije usled formiranja ožiljka i kavitacije tkiva, koji su izraženi. Mali, ali veoma značajni deo aksona koji regenerišu prelazi kroz mesto lezije, kroz preostale tkivne mostove ventralne i ventrolateralne sive mase, kao i bele mase. Dodatno, manji broj vlakana kortikospinalnog puta izgleda da prolazi kroz područje transekcije putem koji ide kroz dorzalne i dorzolateralne regione kičmene moždine koji su oštećeni sve do distalnih područja. U blizini lezije prostiranje regenerišućih vlakana je tipično izvijugano i dosta različito od prostiranja normalnih pravih vlakana u rostalnim delovima kortikospinalnog puta. Kolateralna i razgranate vlakna se najčešće viđaju u sivoj masi distalnih regiona kičmene moždine. Rekonstrukcijom je pokazano 5-15 regenerišućih vlakana obeleženih sa BDA koja se protežu duž rostro - kaudalne ose u svakom od nivoa na presecima 1 - 4 mm kaudalno od mesta lezije u svakom od transgenih miševa. Kod transferzalnih preseka načinjenih 5-7 mm kaudalno od mesta dorzalne hemisekcije, aksoni kortikospinalnog puta obeleženi sa BDA su viđeni i u sivoj i u beloj masi, kod svih transgenih miševa. Broj vlakana viđenih kod transgenih miševa pokazuje da postoji približno isti broj vlakana kortikospinalnog puta obeleženog sa BDA u proksimalnim nivoima od mesta povrede na sagitalnim presecima.
Kao dodatak vlaknima kortikospinalnog puta lokomotornoj funkciji kod miševa doprinose i druga vlakna u sastavu descedentriih puteva, na primer vlakna rafe - spinalnog puta. U ovom modelu dorzalne hemisekcije kičmene moždine kod miša, transekcija oštećuje većinu protonergičkih vlakana i umanjuje gustinu ovih vlakana za odprilike 80% u odnosu na njihov broj u ventralnom rogu. Analiza ukupne dužine serotoninskih vlakana u ventralnom rogu kaudalne kičmene moždine ukazuje na prisustvo mnogo većeg broja ovih vlakana kod transgenih miševa u odnosu na miševe divljeg tipa, što pokazuje da efekti promocije rasta izazvani sa sNogoR310, kod transgenih miševa nisu ograničeni na jedan descedentni aksonski put.
Primer 18: Transgena ekspresija sNogoR310 poboljšava oporavak lokomotornih
funkcija
Praćenje prostiranja aksona kortikospinalnog puta i analiza serotoninergičkih vlakana ukazuju da sNogoR310 koji se otpušta iz atrocita kod transgenih miševa stimuliše ekstenzivnu anatomsku regeneraciju povređenih descedentnih aksona u kičmenoj moždini. Kao što je opisano u Primeru 12, izvedeno je nekoliko testova obrazaca ponašanja u cilju određivanja da li ova regenerisana vlakna imaju povoljan uticaj na funkcionalni oporavak.
Na osnovu procene BBB testom miševi divljeg tipa delimično uspostavljaju lokomotomu funkciju tokom perioda od 4 nedelje preživljavanja. Nakon 4 nedelje od povrede, oporavak miševa divljeg tipa se nalazi na nivou koji se karakteriše konzistentnim plantarnim koračanjem uz konzistentno podržavanje telesne mase, ali ove životinje pokazuju samo povremeno prisutnu koordinaciju prednjih i zadnjih ekstremiteta uz rotaciju predominantne pozicije šape kada prave inicijalni kontakt sa površinom. Nasuprot tome ocene u BBB testu kod sNogoR310 transgenih miševa iz sojeva Tg08 i TgOl su značajno veće u odnosu na kontrolnu grupu u periodu opservacije u periodu od 7 do 28 dana (Slike 13a i 13b). 28 dana nakon povrede, većina transgenih miševa pokazuje konzistentnu koordinaciju prednjih i zadnjih ekstremiteta, a predominantni položaj šape je paralelan u odnosu na telo.
Da bi se dalje okarakterisala lokomotorna aktivnost kod sNogoR310 transgenih miševa, korišćena su još dva dodatna testa. Prvo, meren je maksimalni ugao pri kome podloga može biti nagnuta bez gubitka oslonca miša tokom 5 sekundi. Pre izvođenja dorzalne hemisekcije i transgeni i miševi divljeg tipa mogu da održe oslonac na podlozi koja je nagnuta 55°. U danima od 7 - 28 nakon povrede, veličina ovog ugla se smanjuje kod svih miševa, ali je ugao održavanja značajno veći od onog u kontrolnoj grupi (Slika 13c). U drugom testu lokomotorne funkcije miševi se uspinju uz žičanu mrežu koja je postavljena pod uglom od 45° u odnosu na vertikalu i broje se ispadanja zadnjih ekstremiteta ispod ravni žičane mreže (Metz et al., 2000). Miševi nisu pravili greške tokom ovog testa u treningu pre povređivanja. Kod miševa divljeg tipa u periodu od 2 do 6 nedelja nakon povrede, primećuju se brojne greške pri uspinjanju uz minimalna poboljšanja tokom vremena. Nasuprot tome sNogoR310 transgeni miševi pokazuju progresivno poboljšanje u penjanju po žičanoj mreži tokom navedenog perioda, pri čemu se najveće povećanje javlja u periodu od 1 do 3 nedelje nakon povrede (Slika 13d). Na osnovu toga, jasno je da transgeni miševi kod kojih se sNogoR310 sekretuje iz astrocita pokazuju regeneraciju kortikospinalnog puta, stvaranje izdanaka u rafe - spinalnom putu i poboljšanje motorne funkcije nakon hemisekcije torakalne kičmene moždine.
Primer 19: Intratekalna primena sNogoR310 - Fc proteina indukuje stvaranje
izdanaka aksona u kortikospinalnom putu.
Kao drugi test promocije rasta akona nakon traume kičmene moždine usled primene rastvorljivog Nogo receptora - 1, intratekalno je primenjivan pročišćeni navedeni protein.
Domen koji vezuje ligand (27 - 310) pacovskog Nogo receptora - 1 je fuzionisan sa Fc domenom pacovskog IgGl u cilju pospešivanja stabilnosti i olakšavanja pročišćavanja proteina. Protein je prečišćen iz stabilno transficiranih CHO ćelija. Ovaj protein blokira Nogo66, MAG i dejstvo mijelinain vitrokao stoje prethodno pokazano za mišiji sNogoR310
- Myc His (Fournier et al., 2002, J. Neurosci., 22, 8876 - 883; Liu et al., 2002, Science, 297, 1190 - 1193). Pomoću osmotske mini pumpe intratekalno je primenjen sNogoR310 - Fc kod pacova kojima je načinjena dorzalna hemisekcija u središnjem torakalnom regionu kičmene moždine. Tokom četvoronedeljnog perioda preživljavanja nakon nanošenja povrede, na
svakom pacovu je lokalno primenjivano 1,2 mg sNogoR310 - Fc proteina. Kod pacova koji su primali tretman isključivo vehikulumom (1,2 mg pacovskog IgG) preseci rostralno od mesta hemisekcije ukazuju izrazito upetljane brojne aksone kortikospinalnog puta, dorzalno i veoma mali broj ektopičnih vlakana kortikospinalnog puta obeleženog sa BDA iznad mesta povrede. Isečci rostralno od mesta povrede kod pacova koji primaju sNogoR310 - Fc protein primećen je veoma različiti obrazac prostiranja obeleženih vlakana. Na transferzalnim i parasagitalnim presecima primećeni su izdanci brojnih ektopičnih vlakana kortikospinalnog puta obeleženih sa BDA. U nekim slučajevima, njihove projekcije prolaze iz područja dorzalnog kortikospinalnog puta u blizini središnje linije cirkumferencije kičmene moždine, i mešaju se sa vlaknima dorzo - lateralnog kortikospinalnog puta. Izdanci aksona se protežu kroz sivu masu u većem stepenu nego kroz belu masu. Broj ektopičnih izdanaka vlakana (>100um u transferzalnim presecima, >200um u sagitalnim presecima) u neposrednoj blizini dorzalnog dela kortikospinalnog puta pokazuju veći porast kod pacova tretiranih sa sNogoR310 - Fc.
Primer 20: Aksoni kortikospinalnog puta regenerišu u distalni deo kičmene moždine kod pacova koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc
Ženke Sprague - Dawley pacova (190 - 250 g) su duboko anestezirane i na njima je izvedena laminektomija u nivou kičmene moždine T6 - T7, čime je kičmena moždina izložena. Presečena je dorzalna polovina kičmene moždine upotrebom igle veličine 30G i mikromakaza u cilju presecanja dorzalnih delova CSGT puteva, a debljina lezije (1,8 mm) je osigurana prevođenjem oštrog dela skalpela br. 11 preko dorzalne polovine kičmene moždine.
(Grandpre et al., 2002, Nature, 417, 547 - 551). Za mišiće ispod kože na leđima životina je ušivena osmotska mini pumpa (Alzet<®>2ML4, zapremina 2 ml, 2,5 ul/času, trajanje dopremanja od 28 dana) koja je ispunjena sa 1,2 mg pacovskog IgG u PBS sa 1,2 mg sNogoR310 - Fc fuzionog proteina u PBS. Kateter koji povezan sa izlaznim delom minipumpe je uveden u intratekalni prostor kičmene moždine u nivou T7 - 8 kroz malu rupu na tvrdoj moždanoj opni.
Infuzija antagoniste Nogo receptor - 1 proteina indukuje ekstenzivno stvaranje izdanaka rostralno od područja hemisekcije kod pacova, ali je kritičniji podatak je da li se navedeni izdanci kortikospinalnog puta projektuju distalno u kičmenu moždinu i da li doprinose funkcionalnom oporavku. Na longitudinalnim presecima kroz mesto povrede kod pacova koji su tretirani vehikulumom nije moguće detektovati li je primećen samo mali broj vlakana kortikospinalnog puta obeleženih sa BDA ispod nivoa lezije (Grandpre et al, 2002; Weidner et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3513 - 3518). Na sličnim presecima kod pacova koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc su viđena mnoga vlakna obeležena sa BDA koja prolaze kroz mesto transekcije i projektuju se u kaudalni deo kičmene moždine najvećim delom kroz tkivne mostove ventralne i ventrolateralne kičmene moždine. Imunološkim bojenjem na astrocitni marker GFAP je pokazano da je stepen transekcije bio dublji od područja centralnog kanala. Suprotno od linearnog profila prostiranja rostralnih vlakana u okviru izraženog dorzalnog kortikospinalnog puta, vlakna koja regenerišu obično imaju veoma razgranatu trajektoriju u distalnom delu kičmene moždine, posebno u sivoj masi. Ova vlakna se mogu videti u mnogim regionima kičmene moždine, ali se najlakše mogu vizuelizovati u centralnom delu i u dorzalnoj polovini čitave kičmene moždine. Broj vlakana kortikospinalnog puta na sagitalnim presecima je oko 20 aksona obeleženih sa BDA u području 1 - 2 mm kaudalno od mesta lezije i 15 aksona obeleženih sa BDA u području 7-8 mm distalno od mesta lezije, kod svih pacova koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc.
Generalno, obrazac grananja ovih vlakana je sličan onome koji se primećuje kod životinja koje su lokalno tretirane sa NEP 1-40 peptidom, s tim da je primećeno više kolateralnih grana kod svakog izdanka na presecima kod životinja koje su tretirane sa sNogoR310 - Fc proteinom. Merenje izdanaka u distalnom delu kičmene moždine pokazuje da je ukupna kolateralna dužina svakog izdanka kod pacova tretiranih sa sNogoR310 - Fc dvostruko veća od one koja se vidi kod životinja koje su tretirane sa NEP 1-40. Broj izdanaka (>200um u dužinu) na preseku u području 1-10 mm kaudalno od povrede kičmene moždine u obe grupe životinja koje su tretirane sa antagonistom Nogo receptora - 1 je oko 20 - 40 puta veća u odnosu na kontrolne grupe. Više izdanaka je primećeno kod kod pacova tretiranih sa sNogoR310 - Fc nego kod pacova koji su lokalno tretirani sa NEP 1-40 (približno 50 naspram 25 izdanaka/pacovu), ali ova razlika nije statistički značajna (p= 0,1713, t - test).
Na transferzalnim presecima kičmene moždine u područjima 11-15 mm kaudalno od hemisekcije kod pacova koji su primali tretman sa sNogoR310 - Fc, primećeni su regenerišući aksoni kortikospinalnog puta. Ova vlakna su detektovana i u sivoj i u beloj masi kičmene moždine. Vlakna koja su primećena u sivoj masi često pokazuju više kolateralnih grana od onih u beloj masi. Nasuprot tome na transferzalnim presecima kod životinja tretiranih vehikulumom, mali broj vlakana obeleženih sa BDA je viđen u ventralnoj beloj masi, što je konzistentno sa brojem ne povređenih aksona u sastavu ventralnog kortikospinalnog puta. U ovom nivou distalnog dela kičmene moždine, prosečan broj vlakana kortikospinalnog puta obeleženih sa BDA kod obe grupe životinja koje su tretirane antagonistima Nogo receptor - 1 (sNogoR310 - Fc i NEP 1-40) je otprilike 20 puta veći od broja vlakana kod životinja tretiranih vehikulumom. Posmatrano zajedno, oba antagonista Nogo receptora (sNogoR310 - Fc i NEP 1-40) dovode do dramatične regeneracije aksona kortikospinalnog puta u distalnom delu kičmene moždine, s tim da stvaranje izdanaka koje je indukovano sa sNogoR310 - Fc pokazuje obrazac za koji karakteristično stvaranje izdanaka sa većim brojem grana.
Primer 21: Lokalni sNogoR310 - Fc indukuje stvaranje izdanaka aksona rubospinalnog serotoninergičkog puta u povređenoj kičmenoj moždini pacova
Nakon 24 dana od izvođenja hemisekcije, na svakoj strani lobanje pacova u regionu koji prekriva senzomotomi korteks za donje ekstremitete napravljena je rupa u cilju praćenja vlakana kortikospinalnog puta. Na s edam injekcionih mesta u dubini od 1,5 mm od dure na svakoj strani primenjen je anterogradno neuronsko sredstvo za praćenje aksona BDA (10% u PBS, 3, 5 ul po korteksu) (Grandpre, 2002). Radi praćenja vlakana rubospinalnog puta, sredstva za praćenje BDA (lul: molekulska masa 10000, 10% u PBS) je injektiran u nc. ruber, na levoj strani (5,8 mm posteriorno od bregme, 0,7 mm lateralno, 7,0 mm ventralno od površine lobanje). Dve nedelje nakon davanja BDA injekcije, životinje su perfundovane sa PBS, a nakon tog sa $% paraforrnaldehidom, nakon čega je tkivo prikupljeno radi histoloških analiza.
Oporavak povređenih vlakana rubospinalnog puta (RST) doprinosi funkcionalnom oporavku nakon povrede kičmene moždine (Liu et al., 1999, J. Neurosci. 19, 4370 - 4387). Široka rasprostranjenost Nogo receptora - 1 u neuronima CNS (Wang et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5505 - 5515) omogućava da inhibicija Nogo receptora- 1, upotrebom antagoniste ovog proteina dovodi do ponovnog rasta aksona rubospinalnog puta nakon povrede. Da bi se ispitali efekti sNogoR310 - Fc na povređena vlakna rubospinalnog puta, integritet ovog puta je praćen injektiranjem BDA u levi nc. ruber. U nivou kičmene moždine, vlakna rubospinalnog puta su normalno locirana u dorzolateralnoj beloj masi i ona bivaju presečena nakon dorzalne hemisekcije u ovom ispitivanju. Na transferzalnim presecima u području 11-15 mm rostalno od mesta lezije, kod kontrolnih životinja, može se videti mali broj kratkih BDA obeleženih vlakana između izraženog rubospinalnog puta i sive mase dorzalnog roga. Na presecima u istom nivou kod životinja tretiranih sa sNogoR310 - Fc mogu se videti brojna povezujuća vlakna između glavnog rubospinalnog puta i sive mase dorzalnog roga. Transferzalni preseci u području 11-15 mm distalno od povrede kičmene moždine, nisu primećena BDA obeležena vlakna rubospinalnog puta, kod životinja koje su tretirane vehikulumom. Nasuprot tome, na presecima na istom nivou kod životinja koje su primale sNogoR310 - Fc tretman, mogu se videti brojna BDA obeležena vlakna rubospinalnog puta i u sivoj i u beloj masi, kontralatetralno u odnosu na mesto davanja injekcije sredstva za praćenje. Neki izdanci sa izraženim grananjem su viđeni u sivoj masi ipsilateralno sa mestom davanja BDA injekcije.
Kod pacova sa povređenom kičmenom moždinom koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc su takođe ispitivana vlakna rafespinalnog puta. Imunološkim bojenjem je pokazano da je gustina serotoninetičkih vlakana u području 11-15 mm rostralno od mesta lezije, slična kod životinja koje su tretirane vehikulumom i sNogoR310 - Fc. Na presecima 11-15 mm ispod mesta lezije serotoninergička vlakna kod pacova tretiranih sa sNogoR310 - Fc su dva puta brojnija u odnosu na vlakna kod kontrolnih životinja. Navedeni rezultati ukazuju da poželjni odgovor na inhibiciju Nogo receptora- 1 korišćenjem sNogoR310 - Fc nije ograničena samo na vlakna u okviru kortikospinalnog puta i da drugi descedentni putevi kao što su rubospinalni i rafespinalni putevi takođe pozitivno reaguju na primenu antagonista Nogo receptora - 1.
Primer 22: Lokalni tretman sa sNogoR310 - Fc poboljšava funkcionalni oporavak kod pacova
Intratekalna primena sNogoR310 - Fc proteina stimuliše regeneraciju aksona u sastavu nekoliko descedentnih puteva nakon traumatske povrede kičmene moždine. Ispitivano je da li ovaj protein takođe poboljšava funkcionalni oporavak u povređenoj kičmenoj moždini.
Dve nedelje nakon hemisekcije, lokomotorna ocena primenom BBB testa kod pacova koji su tretirani vehikulumom dostiže stabilni nivo 12 (Slika 14a). Četiri nedelje nakon povrede, većena kontrolnih životinja (6 od 7) pokazuje frekventno - konzistentne plantame korake koji podržavaju telesnu masu životinja i frekventno - konzistentnu koordinaciju prednjih i zadnjih ekstremiteta, ali ove životinje pokazuju rotaciju predominantnog položaja šape pri inicijalnom kontaktu sa površinom. Nasuprot tome kod pacova koji primaju tretman sa sNogoR310 - Fc proteinom, lokomotorna ocena nastavlja da se poboljšava u periodu između druge i četvrte nedelje od povrede. Četiri nedelje nakon povrede, svih 9 životinja koje su tretirane sa sNogoR310 - Fc pokazuju konzistentnu koordinaciju prednjih i zadnjih ekstremiteta i paralelni položaj šape pri inicijalnom kontaktu sa površinom za ispitivanje.
Kretanje po žičanoj mreži je korišćeno za procenu deficita descedentnih puteva za finu motornu kontrolu nakon povrede kičmene moždine (Metz et al., 2000). Ovaj test zahteva koordinaciju prednjih i zadnjih ekstremiteta i koordinaciju voljnih pokreta koja je posredovana ventrolateralnim, kortikospinalnim i rubospinalnim putevima. Tokom treninga pre povrede svi pacovi precizno postavljaju svoje zadnje noge na prečke mreže. U periodu 2 do 4 nedelje od povrede, kontrolne životinje prave 8 do 9 grešaka po ispitivanju uz samo minimalno poboljšanje tokom vremena. Nasuprot tome pacovi koji su tretirani sa sNogoR310 - Fc pokazuju progresivno poboljšanje tokom kretanja po mreži i prave znatno manje grešaka (4-7 grešaka po ispitivanju u prošeku). Najznačajnije poboljšanje se javlja 2-3 nedelje nakon povrede. Analiza otisaka zadnje šape u kontrolnoj grupi pokazuje da je dužina koraka značajno smanjena a daje širina koraka povećana 4 nedelje nakon hemisekcije u poređenju sa ne povređenim pacovima ili sa povređenim životinjama koje primaju tretman sa sNogoR310 - Fc (Slika 14c). Stoga, ovi višestruki testovi lokomotornih funkcija pokazuju da blokada funkcije Nogo receptora - 1, korišćenjem lokalnih injekcija antagonista ovog proteina poboljšava lokomotorni oporavak nakon povrede.
Depoziti tkivnih kultura
Hibridomi HB 7E11 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4587), HB 1H2 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4584), HB 3G5 (ATCC ® pristupni broj PTA - 4586), HB 5B10 (ATCC ® pristupni broj PTA - 4588) i HB 2F7 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4585) su deponovani kod Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC<®>), a 10801 Universitv Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209, SAD, 9. avgusta 2002.
Stručnjacima je jasno da se mogu napraviti brojne izmene i modifikacije poželnjih rešenja prema predmetnom pronalasku, bez odstupanja od duha predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da su sve takve varijacije obuhvaćene obimom zaštite predmetnog pronalaska.

Claims (70)

1. Polipeptid, naznačen time što je izabran iz grupe koju čine sekvenca čiji je ID broj 1, sekvenca čiji je ID broj 2, sekvenca čiji je ID broj 3, sekvenca čiji je ID broj 4 i sekvenca čiji je IDbroj 5.
2. Nukleinska kiselina, naznačena time što kodira polipeptid prema zahtevu 1.
3. Nukleinska kiselina prema zahtevu 2, naznačena time što je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
4. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 2 ili 3.
5. Ćelija - domaćin, naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 2 ili 3 ili sadrži vektor prema zahtevu 4.
6. Postupak za dobijanje polipeptida prema zahtevu 1, naznačen time što se ssastoji iz koraka: (a) kultivacije ćelije - domaćina prema zahtevu 5; i (b) dobijanja polipeptida iz ćelije - domaćina ili podloge kulture.
7. Postupak za dobijanje antitela, naznačen time što se sastoji iz koraka: (a) imunizacije domaćina sa polipeptidom prema zahtevu 1 ili ćelije - domaćina prema zahtevu 5; i (b) dobijanja antitela.
8. Antitelo, naznačeno time što je dobijeno postupkom prema zahtevu 7, ili antigen vezujući fragment tog antitela.
9. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment, naznačeno time što se specifično vezuje za polipeptid prema zahtevu 1.
10. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 8 ili 9, naznačeno time što antitelo: (a) inhibira kolaps konusa rasta neurona; (b) smanjuje inhibiciju rasta i izrastanja neurita iz neurona; i (c) inhibira vezivanje Nogo receptora-1 za ligand.
11. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 10, naznačeno time stoje rast i izrastanje neurita rast aksona.
12. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 10, naznačeno time što neuron predstavlja neuron centralnog nervnog sistema.
13. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 8 ili 9, naznačeno time što je antitelo monoklonsko antitelo.
14. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 8 ili 9, naznačeno time što je antitelo mišije antitelo.
15. Antitelo prema zahtevu 8 ili 9, naznačeno time što je antitelo izabrano iz grupe koju čine humanizovano antitelo, himerično antitelo i jednolančano antitelo.
16. Hibridomska ćelijska linija, naznačena time što je izabrana iz grupe koju čine: HB 7E11 (ATCC ® pristupni broj PTA - 4587), HB 1H2 (ATCC ® pristupni broj PTA - 4584), HB 3G5 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4586), HB 5B10 (ATCC<®>pristupni broj PTA - 4588) i HB 2F7 (ATCC ® pristupni broj PTA - 4585).
17. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment, naznačeno time što je dobijeno iz hibridomske ćelijske linije prema zahtevu 16.
18. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment, naznačeno time što kompetitivno inhibira vezivanje antitela prema zahtevu 17 za polipeptid prema zahtevu 1 ili za Nogo receptor - 1.
19. Postupak inhibicije vezivanja Nogo receptora - 1 za ligand, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta Nogo receptora - 1 sa antitelom ili njegovim antigen - vezujućim fragmentom prema zahtevima 10 ili 17.
20. Postupak prema zahtevu 19, naznačen time što je ligand izabran iz grupe koju čine Nogo A, Nogo B, Nogo C, MAG i OM - gp.
21. Postupak inhibicije kolapsa konusa rasta u neuronu, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta neurona sa antitelom ili njegovim antigen - vezujućim fragmentom prema zahtevu 10 ili 17.
22. Postupak smanjenja inhibicije rasta ili izrastanja neurita iz neurona, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta neurona sa antitelom ili njegovim antigen - vezujućim fragmentom prema zahtevu 10 ili 17.
23. Postupak prema zahtevu 22, naznačen time što rast ili izrastanje neurita predstavlja rast aksona.
24. Postupak prema zahtevu 21 ili 22, naznačen time što neuron predstavlja neuron centralnog nervnog sistema.
25. Rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid, naznačen time što se u osnovi sastoji od N - terminalnog domena (NT), 8 leucinom bogatih repetitivnih domena (LRR) i od LRR C - terminalnog domena (LRRCT) Nogo receptora - 1.
26. Rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid prema zahtevu 25, naznačen time što je spojen sa signalnom sekvencom.
27. Rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid prema zahtevu 25 ili 26, naznačen time što LRR obuhvata heterologi LRR.
28. Rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid, naznačen time stoje izabran iz grupe koju čine: aminokiselinski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 6; aminokiselinski ostaci 26 - 310 sekvence čiji je ID br. 7; aminokiselinski ostaci 26 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; aminokiselinski ostaci 26-310 sekvence čiji je ID br. 9; aminokiselinski ostaci 27 - 344 sekvence čiji je ID broj 8; i aminokiselinski ostaci 27-310 sekvence čiji je ID br. 9.
29. Nukleinska kiselina, naznačena time što kodira rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid prema bilo kom od zahteva 25 - 28.
30. Nukleinska kiselina prema zahtevu 28, naznačena time što je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
31. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 29 ili 30.
32. Ćelija - domaćin, naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 29 ili 30 ili sadrži vektor prema zahtevu 31.
33. Postupak za dobijanje rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida prema bilo kom od zahteva 25 - 28, naznačen time što se sastoji iz koraka: (a) kultivacije ćelije - domaćina prema zahtevu 32; i (b) dobijanja polipeptida iz ćelije - domaćina ili podloge kulture.
34. Fuzioni protein Nogo receptora - 1, naznačen time što sadrži rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid i heterologi polipeptid.
35. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema zahtevu 34, naznačen time što se rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid u osnovi sastoji od N - terminalnog domena (NT), 8 leucinom bogatih repetitivnih domena (LRR) i od LRR C - terminalnog domena (LRRCT) Nogo receptora - 1.
36. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema zahtevu 35, naznačen time što je povezan sa signalnom sekvencom.
37. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema zahtevu 34 ili 35, naznačen time što LRR obuhvata heterologi LRR.
38. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37, naznačen time što rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid sadrži polipeptid prema bilo komod zahteva 25 - 28.
39. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37, naznačen time što heterologi polipeptid obuhvata konstantni region imunoglobulina.
40. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema zahtevu 39, naznačen time što konstantni region imunoglobulina predstavlja konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
41. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema zahtevu 40, naznačen time što konstantni region teškog lanca imunoglobulina predstavlja konstantni region teškog lanca IgG.
42. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37, naznačen time što heterologi polipeptid predstavlja Fc.
43. Fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37, naznačen time što je fuzioni protein Nogo receptora - 1 dimer.
44. Nukleinska kiselina, naznačena time što kodira fuzioni protein Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34-37.
45. Nukleinska kiselina prema zahtevu 44, naznačena time što je operativno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
46. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 44 ili 45.
47. Ćelija - domaćin, naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 44 ili 45 ili vektor prema zahtevu 46.
48. Postupak za dobijanje fuzionog proteina Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37, naznačen time što se sastoji iz koraka: (a) kultivacije ćelije - domaćina prema zahtevu 47; i (b) dobijanja Nogo receptor - 1 polipeptida iz ćelije - domaćina ili podloge kulture.
49. Postupak inhibicije vezivanja Nogo receptora - 1 za ligand, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta liganda sa rastvorljivim Nogo receptor - 1 polipeptidom prema bilo kom od zahteva 25 - 28 ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37.
50. Postupak modulacije aktivnosti liganda Nogo receptora - 1, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa polipeptidom prema bilo kom od zahteva 25 - 28 ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37.
51. Postupak inhibicije kolapsa konusa rasta kod neurona, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa polipeptidom prema bilo kom od zahteva 25 - 28 ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34 - 37.
52. Postupak smanjenja inhibicije rasta ili izrastanja neurita kod neurona, naznačen time što se sastoji iz koraka uspostavljanja kontakta liganda Nogo receptora - 1 sa polipeptidom prema bilo kom od zahteva 25 - 28 ili sa fuzionim proteinom Nogo receptora - 1 prema bilo kom od zahteva 34- 37.
53. Postupak prema bilo kom od zahteva 49 - 52, naznačen time stoje ligand izabran iz grupe koju čine Nogo A, Nogo B, Nogo C, MAG i OM - gp.
54. Postupak prema zahtevu 52, naznačen time što rast ili izrastanje neurita predstavlja rast aksona.
55. Postupak prema zahtevu 51 ili 52, naznačen time što neuron predstavlja neuron centralnog nervnog sistema.
56. Preparat, naznačen time što sadrži farmaceutski prihvatljivi nosilac i sastojak izabran iz grupe koju čine: (a) antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 8, 9 i 16; (b) rastvorljivi Nogo - receptor - 1 polipeptid prema bilo kom od zahteva 25 - 28; i (c) fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 34 - 37.
57. Preparat prema zahtevu 56, naznačen time što dalje sadrži jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava.
58. Postupak pospešivanja preživljavanja neurona sa rizikom od umiranja, naznačen time što se sastoji od uspostavljanja kontakta neurona sa efikasnom količinom: (a) anti - Nogo receptor - 1 antitela ili njegovog antigen - vezujućeg fragmenta; ili (b) rastvorljivog Nogo receptor - 1 polipeptida.
59. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što se neuron nalazi uin vitrouslovima.
60. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid predstavlja fuzioni protein.
61. Postupak prema zahtevu 60, naznačen time što fuzioni protein predstavlja Fc fuzioni protein.
62. Postupak prema zahtevu 61, naznačen time što Fc fuzioni protein predstavlja Ig-sNogoR344.
63. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što se neuron nalazi u organizmu sisara.
64. Postupak prema zahtevu 63, naznačen time što sisar pokazuje znake ili simptome multiple skleroze, ALS, Hantingtonove bolesti, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, dijabetične neuropatije, moždanog udara, traumatskih povreda mozga ili povrede kičmene moždine.
65. Postupak pospešivanja preživljavanja neurona u organizmu sisara, pri čemu je neuron u riziku od umiranja, naznačen time što se sastoji od: (a) obezbeđivanja kulture ćelije - domaćina koja eksprimira (i) anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment; ili (ii) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid; i (b) unošenja ćelije - domaćina u organizam sisara na ili u blizini mesta navedenog neurona.
66. Postupak genske terapije za pospešivanje preživljavanja neurona koji je u riziku od umiranja, pri čemu je neuron u organizmu sisara, naznačen time što obuhvata primenu na ili u blizini mesta navedenog neurona virusnog vektora koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira: (a) anti - Nogo receptor - 1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment; ili (b) rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid, pri čemu se anti - Nogo receptor - 1 antitelo, njegov antigen vezujući fragment ili rastvorljivi Nogo receptor - 1 polipeptid eksprimira iz navedene nukleotidne sekvence u organizmu sisara u količini koja je dovoljna da pospeši preživljavanje neurona.
67. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment koje se specifično vezuje za Nogo receptor -1, naznačeno time što navedeno antitelo ili njegov fragment obuhvataju laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 15; (b) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 16; i (c) aminokiselinska sekvenca koja obuhvata aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, čiji su ID brojevi 22, 23 i 24.
68. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 67, naznačeno time što dalje obuhvata teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 17; (b) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 18; i (c) aminokiselinska sekvenca koja obuhvata aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, čiji su ID brojevi 19, 20 i 21.
69. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment koje se specifično vezuje za Nogo receptor - 1, naznačeno time što navedeno antitelo ili njegov fragment obuhvataju teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 17; (b) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 18; i (c) aminokiselinska sekvenca koja obuhvata aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, čiji su ID brojevi 19, 20 i 21.
70. Antitelo ili njegov antigen - vezujući fragment prema zahtevu 69, naznačeno time što dalje obuhvata laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: (a) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 15; (b) aminokiselinska sekvenca čiji je ID br. 16; i (c) aminokiselinska sekvenca koja obuhvata aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, čiji su ID brojevi 22, 23 i 24.
YUP-2005/0129A 2002-08-10 2003-08-07 Antagonisti nogo receptora RS20050129A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40286602P 2002-08-10 2002-08-10
PCT/US2003/025004 WO2004014311A2 (en) 2002-08-10 2003-08-07 Nogo receptor antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050129A true RS20050129A (sr) 2007-06-04

Family

ID=31715907

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0129A RS20050129A (sr) 2002-08-10 2003-08-07 Antagonisti nogo receptora
YUP-2006/0089A RS20060089A (sr) 2002-08-10 2004-01-30 Antagonisti nogo receptora

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2006/0089A RS20060089A (sr) 2002-08-10 2004-01-30 Antagonisti nogo receptora

Country Status (21)

Country Link
US (2) US7465705B2 (sr)
JP (3) JP2005535329A (sr)
KR (1) KR20050062525A (sr)
CN (1) CN1681838A (sr)
AT (1) ATE469913T1 (sr)
AU (1) AU2003264033A1 (sr)
BR (1) BR0313331A (sr)
CA (1) CA2495121A1 (sr)
DE (1) DE60332842D1 (sr)
DK (1) DK1534736T3 (sr)
EA (1) EA200500330A1 (sr)
ES (1) ES2346868T3 (sr)
IL (2) IL166659A0 (sr)
IS (1) IS7677A (sr)
MX (1) MXPA05001615A (sr)
NO (1) NO20050685L (sr)
PL (1) PL375301A1 (sr)
PT (1) PT1534736E (sr)
RS (2) RS20050129A (sr)
WO (1) WO2004014311A2 (sr)
ZA (2) ZA200501135B (sr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
DE60141409D1 (de) * 2000-10-06 2010-04-08 Biogen Idec Inc Homologe des nogo rezeptors
US8183350B2 (en) * 2002-05-04 2012-05-22 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth
ES2346868T3 (es) 2002-08-10 2010-10-21 Yale University Antagonistas de receptor nogo.
AU2003265561A1 (en) * 2002-08-15 2004-03-03 Acorda Therapeutics, Inc. Chimeric protein
CA2519227C (en) 2003-03-19 2013-12-03 Biogen Idec Ma Inc. Nogo receptor binding protein
EA009643B1 (ru) * 2003-04-16 2008-02-28 Йейл Юниверсити Лечение состояний, включающих амилоидные бляшки
EP1631234B1 (en) * 2003-05-16 2011-09-14 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of cns injuries
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
EP3211084B1 (en) * 2003-05-16 2019-03-27 Acorda Therapeutics, Inc. Proteoglycan degrading mutants for treatment of cns
US20080274112A1 (en) * 2003-08-07 2008-11-06 Lee Daniel H S Nogo Receptor Antagonists
US8912144B2 (en) 2003-12-16 2014-12-16 Children's Medical Center Corporation Method for treating stroke via administration of NEP1-40 and inosine
KR20070052237A (ko) * 2004-01-30 2007-05-21 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 노고 수용체 길항제를 사용한, 도파민성 신경 퇴행을수반하는 상태의 치료법
MXPA06013345A (es) 2004-05-18 2008-10-31 Acorda Therapeutics Inc Metodos para purificar condrointinasa y sus formulaciones estables.
US8486893B2 (en) 2004-06-24 2013-07-16 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving demyelination
EP1789070B1 (en) 2004-08-03 2012-10-24 Biogen Idec MA Inc. Taj in neuronal function
EP1805209A4 (en) * 2004-10-01 2008-04-02 Univ Yale NOGO-A POLYPEPTIDE FRAGMENTS, VARIANT OF NOGO RECEPTOR-1 POLYPEPTIDES AND USE
WO2007008732A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Yale University Compositions and methods for suppressing axonal growth inhibition
HRP20131066T1 (hr) 2005-07-08 2013-12-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antitijela i njihova upotreba
US20090062199A1 (en) * 2005-08-25 2009-03-05 Biogen Idec Ma Inc. Nogo Receptor Polypeptides and Polypeptide Fragments and Uses Thereof
JP5189985B2 (ja) 2005-09-26 2013-04-24 アコーダ セラピューティクス、インク． コンドロイチナーゼａｂｃｉ変異体を用いた組成物およびその使用方法
JPWO2007074747A1 (ja) * 2005-12-26 2009-06-04 株式会社クラレ 細胞培養用材料
PT1981902E (pt) 2006-01-27 2015-11-02 Biogen Ma Inc Antagonistas dos recetores nogo
US20110123535A1 (en) * 2006-05-15 2011-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Use of Nogo Receptor-1 (NGR1) for Promoting Oligodendrocyte Survival
EP2068866A4 (en) 2006-07-24 2010-04-07 Biogen Idec Inc METHODS FOR PROMOTING MYELINIZATION, NEURONAL SURVIVAL AND DIFFERENTIATION OF OLIGODENDROCYTES BY ADMINISTERING SP35 OR TRKA ANTAGONISTS
EP2081429A4 (en) * 2006-08-31 2010-01-06 Biogen Idec Inc PROCESS FOR PERIPHERAL ADMINISTRATION OF NOGO RECEPTOR POLYPEPTIDES
CA2663857C (en) 2006-09-20 2017-10-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for delivering volatile anesthetics for regional anesthesia and/or pain relief
CA3009034C (en) 2006-10-10 2020-08-18 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
US7906120B2 (en) * 2006-11-21 2011-03-15 Abbott Laboratories Neutralizing monoclonal antibodies against the Nogo-66 receptor (NgR)
WO2009070957A1 (fr) * 2007-12-05 2009-06-11 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Inhibiteur de l'interaction entre blys et ngr et son utilisation
PL2244737T3 (pl) 2008-01-22 2020-05-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Kompozycje lotnego środka znieczulającego zawierające rozpuszczalniki ekstrakcyjne do znieczulania miejscowego i / albo zwalczania bólu
EP2276500A4 (en) * 2008-03-13 2015-03-04 Univ Yale REACTIVATION OF AXON GROWTH AND AXON RECOVERY IN CHRONIC REVERSE MARKET INJURIES
CA2729961C (en) 2008-07-09 2018-05-01 Biogen Idec Ma Inc. Li113, li62 variant co2, anti-lingo antibodies
JP2011527317A (ja) * 2008-07-11 2011-10-27 グラクソ グループ リミテッド Ｎｏｇｏ−ａアンタゴニストによる筋萎縮性側索硬化症の治療
US20110020359A1 (en) * 2009-07-24 2011-01-27 California Institute Of Technology Methods and compositions for treating neuronal damage or degeneration
CA3233345A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Case Western Reserve University Compositions and methods for inhibiting the activity of lar family phosphatases
KR102142161B1 (ko) 2012-05-14 2020-08-06 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 운동 뉴런 관련 병태 치료용 lingo-2 길항제
KR101685109B1 (ko) * 2014-12-22 2016-12-09 경북대학교 산학협력단 근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도
JP2018504400A (ja) 2015-01-08 2018-02-15 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用
CN113527462B (zh) * 2020-04-22 2023-05-23 北京大学 一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体
CN115060907A (zh) * 2022-04-29 2022-09-16 合肥工业大学 一种Nogo-B蛋白表达量检测ELISA试剂盒

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) * 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) * 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4366241A (en) * 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) * 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP1820858B1 (en) 1991-03-01 2009-08-12 Dyax Corporation Chimeric protein comprising micro-protein having two or more disulfide bonds and embodiments thereof
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
JPH05244982A (ja) * 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
WO2000073452A2 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US20020072493A1 (en) 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
CA2331154A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Human Genome Sciences, Inc. Polypeptides having sequence identity with acid labile subunit of insulin-like growth factor
JP3695642B2 (ja) 1998-12-01 2005-09-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害
US7041474B2 (en) * 1998-12-30 2006-05-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid encoding human tango 509
HK1051543A1 (zh) * 2000-01-12 2003-08-08 Yale University Nogo受体介导的轴突生长封锁
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
DE60141409D1 (de) * 2000-10-06 2010-04-08 Biogen Idec Inc Homologe des nogo rezeptors
WO2003018631A2 (en) 2001-08-27 2003-03-06 Novartis Ag Nogo receptor homologues and their use
EP1440091A1 (en) 2001-10-22 2004-07-28 Novartis AG Nogo receptor homologues and their use
US20030113325A1 (en) * 2001-12-03 2003-06-19 Zhigang He Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
US7309485B2 (en) * 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
EP1354892A1 (en) 2002-04-19 2003-10-22 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Peptides capable of inducing attraction of the axonal growth and their use for treating neurodegenerative diseases
US7745151B2 (en) * 2002-08-02 2010-06-29 Children's Medical Center Corporation Methods of determining binding between Nogo receptor and p75 neurotrophin receptor
ES2346868T3 (es) 2002-08-10 2010-10-21 Yale University Antagonistas de receptor nogo.
EA009643B1 (ru) * 2003-04-16 2008-02-28 Йейл Юниверсити Лечение состояний, включающих амилоидные бляшки
US20080274112A1 (en) 2003-08-07 2008-11-06 Lee Daniel H S Nogo Receptor Antagonists
BRPI0413426A (pt) 2003-08-07 2006-10-17 Biogen Idec Inc antagonistas de receptor novo
KR20070052237A (ko) * 2004-01-30 2007-05-21 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 노고 수용체 길항제를 사용한, 도파민성 신경 퇴행을수반하는 상태의 치료법
EP2081429A4 (en) 2006-08-31 2010-01-06 Biogen Idec Inc PROCESS FOR PERIPHERAL ADMINISTRATION OF NOGO RECEPTOR POLYPEPTIDES

Also Published As

Publication number Publication date
IL173559A0 (en) 2006-07-05
CN1681838A (zh) 2005-10-12
WO2004014311A2 (en) 2004-02-19
ATE469913T1 (de) 2010-06-15
DE60332842D1 (de) 2010-07-15
DK1534736T3 (da) 2010-09-20
WO2004014311A3 (en) 2004-04-29
RS20060089A (sr) 2008-08-07
MXPA05001615A (es) 2005-08-19
PT1534736E (pt) 2010-09-07
PL375301A1 (en) 2005-11-28
JP2011173899A (ja) 2011-09-08
JP2005535329A (ja) 2005-11-24
IL166659A0 (en) 2006-01-15
EA200500330A1 (ru) 2006-06-30
IS7677A (is) 2005-01-28
US8030456B2 (en) 2011-10-04
US20050271655A1 (en) 2005-12-08
KR20050062525A (ko) 2005-06-23
JP2010207239A (ja) 2010-09-24
AU2003264033A1 (en) 2004-02-25
ES2346868T3 (es) 2010-10-21
ZA200601909B (en) 2007-05-30
US20090215691A1 (en) 2009-08-27
CA2495121A1 (en) 2004-02-19
ZA200501135B (en) 2006-10-25
NO20050685L (no) 2005-05-10
US7465705B2 (en) 2008-12-16
BR0313331A (pt) 2007-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS20050129A (sr) Antagonisti nogo receptora
JP5829373B2 (ja) Ｎｏｇｏレセプターアンタゴニスト
JP2007501612A (ja) Ｎｏｇｏ受容体アンタゴニスト
JP2007501612A5 (sr)
CN101495509A (zh) Sp35抗体及其用途
JP2009513666A (ja) 希乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質組成物およびその使用方法
EP1928905B1 (de) Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
JP5698534B2 (ja) 改良されたｎｏｇｏ−ａ結合分子およびその医薬的使用
US20080274112A1 (en) Nogo Receptor Antagonists
EA032000B1 (ru) Способы лечения демиелинизирующей периферической нейропатии, вызванной травмой
EP1534736B1 (en) Nogo receptor antagonists
KR20060072122A (ko) Ｎｏｇｏ 수용체 길항제
HK1137460B (en) Sp35 antibodies and uses thereof