RS20050327A

RS20050327A - Derivati /6,7-dihidro-5h-imidazo/1,2- alfa/imidazol-3- sulfonilamino/- propionamida

Info

Publication number: RS20050327A
Application number: YUP-2005/0327A
Authority: RS
Inventors: Terence Alfred Kelly; Mi Kim Jin; Rene Marc Lemieux
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.,
Priority date: 2002-10-30
Filing date: 2003-10-27
Publication date: 2007-06-04
Also published as: US20040127534A1; CA2504219A1; CN1708500A; AU2003284938A1; DE60309344D1; NO20052579L; EA008443B1; SI1560830T1; CO5690604A2; JP4366477B2; WO2004041827A2; DK1560830T3; WO2004041827A3; TW200424204A; MXPA05004480A; EP1560830A2; PT1560830E; PL375709A1; EA200500603A1; US6844360B2

Abstract

Derivati [6,7-dihidro-5H-imidazo[1,2a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamida koji ispoljavaju dobro inhibitorsko dejstvo na interakciju CAMs-a i Leukointegrin-a, a koji su korisni za lečenje (tretman) inflamatornog oboljenja.

Description

DERIVATI

[6,7-DIHIDRO-5f/-IMIDAZO[l,2-a]IMIDAZOL-3-SULFONILAMINO]-PROPIONAMIDA

OSNOVNI PODACI O PRONALASKU

1. OBLAST TEHNIKE

Ovaj se pronalazak generalno odnosi na derivate [6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imi-dazol-3-sulfonilamino]-propionamida, na sintezu ovih jedinjenja, na njihovu primenu u lečenju inflamatornog oboljenja i na farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja.

2. OSNOVNE INFORMACIJE

Istraživanje koje obuhvata poslednju dekadu pomoglo je da se objasne molekulska zbivanja koja se odnose na interakcije ćelija-ćelija, u telu, naročito ona zbivanja u kretanju (aktivnosti) i aktiviranju ćelija imunskog sistema. Videti, Springer, T.Nature,1990,346,425-434. Površinski proteini ćelije, a naročito ćelijski adhezioni molekuli (Cellular Adhesion Molecules - "CAMs") i "Leukointegrini", uključujući LFA-1, MAC-1 i gp 150.95 (pojedinačno navedeni u nomenklatiri WHO [= Svetska zdravstvena organizacija] kao CD18/CDlla, CD18/CDllb i CD18/CDllc), jednovremeno su bili predmet farmaceutskog istraživanja i razvoja čiji je cilj, intervencija u procesima leukocitne ekstravazacije ka mestima povrede i leukocitno kretanje prema određenim ciljevima. Na primer, danas se veruje da se pre leukocitne ekstarvazacije, koja je obavezna komponenta inflamatornog odgovora, odigrava aktiviranje integrina, suštinski izraženo pojavom leukocita i da je praćeno snažnom interakcijom ligand/receptor, između integrina (npr. LFA-1) i jednog ili više određenih interćelijskih adhezionih molekula (ICAMs), označenih ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 ili ICAM-4, koji se javljaju na površinama endotelnih ćelija krvnog suda i na drugim leukocitima. Interakcija CAMs sa Leukointe-grin-ima je bitan stupanj u normalnom funkcionisanju imunskog sistema. Imunski procesi, kao pojava antigena, citotoksičnosti posredstvom T-ćelije i leukocitna ekstravazacija, svi zahtevaju ćelijsku adheziju posredstvom ICAMs koji reaguju sa Leukointegrinima. Videti generalno

Kishimoto, T. K.; Rothlein; R. R.Adv. Pharmacol1994,25,117-138 i Diamond, M; Springer, T.Current Biology, 1994, 4, 506-517.

Otkrivena je grupa osoba kod kojih ne postoji odgovarajuća ekspresija Leikointegrin-a, stanja nazvano "Leukocvte Adhesion Deficiencv " (= LAD) (Anderson, D. C;et al, Fed. Proc.1985,44,2671-2677 i Anderson, D. C;etal., J. Infect. Dis. 1985, 152,668-689). Ove osobe ne mogu da uspostave normalan(ne) inflamatorni(ne) i/ili imunski(e) odgovor(e) zbog nesposobnosti njihovih ćelija da prionu (adheriraju) na ćelije supstrata. Ovi podaci pokazuju da su imunske reakcije oslabljene kada limfociti nisu sposobni da prionu na normalan način, usled nepostojanja funkcionalno adhezionih molekula iz CD18 familije. Na osnovu činjenice da LAD pacijenti kojima nedostaje CD18 ne mogu da uspostave inflamatorni odgovor, veruje se da će antagonizam interakcija CD18, CD11/ICAM takođe da inhibira inflamatorni odgovor.

Pokazano je da antagonizam u interakciji između CAMs i Leukointegrin-a može da bude ostvaren pomoću sredstava koja su usmerena protiv jedne ili druge komponente. Specifično je da blokiranje CAMs-a, na primer ICAM-1, ili Leukointegrin-a, kao što je na primer LFA-1, antitelima usmerenim protiv jednog ili oba od tih molekula, efikasno inhibira inflamatorne odgovore.In vitromodeli inflamacije i imunskog odgovora, inhibirani antitelima prema CAMs ili Leukointegrin-ima, obuhvataju limfocitnu proliferaciju izazvanu antigenima ili mitogenima, homotipsku agregaciju limfocita, citolizu posredstvom T-ćelija i antigen-specifično izazvanu toleranciju. Značaj studijain vitropodržavajuin vivostudije sa antitelima usmerenim protiv ICAM-1 ili LFA-1. Na primer, antitela usmerena protiv LFA-1 mogu da spreče odbacivanje tiroidnog grafita (transplantata) i da produže održavanje srčanog alografta kod miša (Gorski, A.;Immunology Today, 1994, 15, 251-255).Značajnije je da su antitela usmerena protiv ICAM-1 pokazala efikasnotin vivo,kao anti-inflamatorni agensi, kod humanih oboljenja, kao što je odbacivanje bubržnog alografta i reumatoidni artritis (Rothlein, R. R.; Scharschmidt, L., in:Adhesion Molecules;Wegner, C. D., Ed.; 1994, 1-8, Cosimi, C. B.;et al, J. Immunol.1990,144,4604-4612 i Kavanaugh, A.;et al, Arthritis Rheum.1994,37,992-1004), a antitela usmerena protiv LFA-1 ispolj ila su imunosupresivne efekte u transplantaciji koštane srži i u prevenciji ranog odbacivanja bubrežnih alograftova (Fischer, A.;et al, Lancet, 1989, 2,1058-1060 i Le Mauff, B.;et al, Transplantation,1991,52, 291-295).

Takođe je dokazano da rekombinantni rastvoran oblik ICAM-1-a može da deluje kao inhibitor interakcije ICAM-l-a sa LFA-l-om. Rastvoran ICAM-1 deluje kao direktan antagonist CD18,CD11/ICAM-l interakcija na ćelije i pokazuje inhibitorsku aktivnost uin vitromodelima imunskog odgovora, kao što su mešani odgovor humanih limfocita, odgovori citotoksičnih T ćelija i proliferacija T ćelija kod dijabetičara, kao odgovor na ineterakciju sa ćelijama ostrvaca (pankreasa) (Becker, J. C; et al,J. Immunol.1993,151, 7224i Roep, B. O.; et al,Lancet, 1994, 343,1590).

Prema tome, stanje tehnike je pokazalo da veliki proteinski molekuli koji antagonizuju vezivanje CAMs za Leukointegrine imaju terapeutsku sposobnost u ublažavanju inflamatornih i imunoloških odgovora, često povezanih sa patogenezom mnogih autoimunskih ili inflamatornih oboljenja. Međutim, proteini imaju značajne nedostatke kao terapeutski agensi, uključujući nemogućnost da se daju oralno i potencijalnu imunoreaktivnost koja ograničava upotrebu ovih molekula za hronično davanje. Pored toga, lekovi na bazi proteina obično su skupi za proizvodnju.

Kao sledeće, proizilazi da bi mali molekuli, koji imaju sličnu sposobnost kao molekuli velikih proteina, da direktno i selektivno antagonizuju vezivanje CAMs za Leukointegrine, mogli da budu povoljni terapeutski agensi.

U literaturi je opisano nekoliko malih molekula koji deluju na interakciju CAMs i Leukointegrina. Na primer, US patent 6,355,664 i odgovarajući WO 98/39303, štite klasu malih molekula, koji sadrže hidantoinsko jezgro, da su oni inhibitori interakcije LFA-l-a i ICAM-l-a. Od većeg značaja za ovaj pronalazak je WO 01/07440 Al, koji štiti jedinjenja koja umesto hidantoinskog imaju 6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazolsko jezgro. Dok jedinjenja koja su izričito opisana u W0 01/07440 Al imaju znatno snažnije inhibitrorsko dejstvo, na interakciju CAMs i Leukointegrina, od onog koje vrše hidantoini prema US patentu 6,355,664 i odgovarajućem WO 98/839303, oni nikada nisu idealni terapeutski agensi pošto je brzina kojom oni bivaju metabolizovani nepoželjno velika.

Prema tome, problem koji treba da bude rešen ovim pronalaskom je da se nađu mali molekuli koji imaju ne samo dobru inhibitorsku efikasnost na interakciju CAMs i Leukointegrina, već koji takođe bivaju metabolizovani brzinom koja nije preterano velika.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Pronalazak je podgrupa, ili selekcija, među 6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazolima, koji su, generički ali ne specifično, opisani u WO 01/07440 Al. Potpuno je iznenađujuće, da jedinjenja obuhvaćena pronalaskom pokazuju ne samo dobar inhibitorski efekat na interakciju CAMs i Leukointegrin-a, nego i znatno sporije bivaju metabolizovani nego jedinjenja koja su opisana u WO 01/07440 Al. Jedinjenja na osnovu pronalaska rešavaju problem preterano brzog metabolizma.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Pronalazak obuhvata jedinjenja formule I

u kojoj:

R<1>je prava ili razgranata alkil grupa sa 1 do 3 atoma ugljenika, koja je, u datom slučaju, mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabrani iz grupe koju čine:

(i) okso i

(ii) morfolino grupa;

R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine:

(A) vodonik, i

(B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je

mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz

grupe koju čine:

(i) CONH2i

(ii) OH,

ili R i R zajedno sa atomom azota između njih obrazuju piperazin prsten; i R<4>je:

(A) cijano grupa,

(B) pirimidin grupa, koja je mono- ili disupstituisana sa NH2, ili

(C) trifluorometoksi grupa.

Prednost imaju jedinjenja na osnovu pronalaska, formule I, u kojoj:

R<1>je metil grupa;

R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine:

(A) vodonik, i

(B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je

mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz

grupe koju čine:

(i) CONH2i

(ii) OH; i

R<4>je:

(A) cijano ili

(B) trifluorometoksi grupa.

Veću prednost imaju jedinjenja formule I, u kojoj:

R<1>je metil grupa;

R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine:

(A) vodonik, i

(B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je

mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz

grupe koju čine:

(i) CONH2i

(ii) OH; i

R<4>je trifluorometoksi grupa.

Korisno je da jedinjenja formule I imaju najmanje dva hiralna centra. Prema generičkom aspektu koji ima konačnu prednost, pronalazak obuhvata jedinjenja formule I čija je apsolutna stereohemija dalje prikazana u formuli I<*>. ;Jedinjenja formule I, koja imaju specifičnu prednost, odabrana su iz grupe koju čine: (S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[ 1, 2- a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamid;(S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-A<r->(2-hidroksi-2-metil-propil)-propionamid; (S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5/f-imidazo[l,2-a]imid-azol-3-sulfonilamino]-propionamid; i (S)-N-karbamoilmetil-2-[(R)-5-(4-cijano-ben-zil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonil-amino]-propionamid. ;Pronalazak takođe obuhvata farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule I. ;Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže neko jedinjenje formule I i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent. ;Pronalazak takođe obuhvata jedinjenja formule I upotrebljena kao lekovi, i upotrebu jedinjenja formule I za pripremanje farmaceutskih kompozicija za lečenje inflamacije ili nekog inflamacionog stanja kod pacijenta. Specifični primeri inflamatornih stanja koji se mogu lečiti (tretirati) navedeni su u ovom opisu. ;Opšti sintetički postupci ;Jedinjenja na osnovu pronalaska mogu se pripremiti prema opštim, dalje opisanim postupcima. Obično, ako se želi, odvijanje (napredovanje) reakcije može da se prati pomoću tankoslojne hromatografije (TLC). Ako se želi, intermedijeri i proizvodi mogu da se prečišćavaju pomoću hromatografije na silikagelu i/ili rekristalizacijom, a da se karakterišu pomoću jedne ili više sledećih tehnika: NMR, masene spektroskopije i tačke topljenja. Polazni materijali i reagensi, mogu se, ili komercijalno nabaviti, ili ih stručnjak može pripremiti, primenom postupaka opisanih u hemijskoj literaturi. ;Jedinjenja formule I mogu se pripremiti od intermedijera formule II. Sintezu intermedijera II prikazali su Wu et al., U.S. ne-provizorna prijava Ser. No. 09/604,312 i Frutos et al., U.S. 6,441,183, obe ovde uključene kao referenca. ;Intermedijer II može da se pripremi prema postupku prikazanom u shemi I. ;Kao što je gore prikazano, intermedijer III se deprotonizuje pogodnom bazom, kao litijum-bis(trimetilsilil)amid, na oko -20 °C do -30 °C, pa zatim alkiluje sa supstituisanim benzilhalogenidom, prvenstveno benzilbromidom (IV), dajući V. Hidroliza trifluoro-acetamidne grupe u V, na primer, tretiranjem sa 40% vodenim rastvorom benziltrimetil-amonijum-hidroksida, u dioksan/50% NaOH, pa zatim tretiranjem sa kiselinom, kao HC1, dobija se VI. Tretman jedinjenja VI sa tiokarbonildiimidazolom, u prisustvu baze, kao 4-(7V,7V-dimetilamino)piridin daje VII. Tretman VII sa aminoacetaldehid-dimetilacetalom i rastvorom J-butilhidroperoksida, pa tretmanom intermedijernog acetala sa kiselinom, kao što je p-toluenesulfonska kiselina daje VIII. Jodovanjem VIII, putem tretiranja sa sredstvom za jodovanje, kao TV-jodosukcinamid daje II. ;Postupak upotrebljen za pripremanje intermedijera III, tretman amida stvorenog odN-Boc-D-alanina i 3,5-dihloroanilina sa trifluorosirćetnom kiselinom, radi uklanjanja Boc-grupe, praćen tretmanom sa pivalaldehidom, pa acilovanje dobij enog imidazolodona sa anhidridom trifluorosirćetne kiseline opisan je u U.S. 6,414,161, navedenom gore, i u hemijskoj literaturi (N.Yee, Org Lett, 2000,2,2781). ;Sinteza jedinjenja formule I, od intermedijera II, prikazana je na shemi II. ; ;Kao što je gore prikazano, tretiranje jedinjenja II sa Grinjarovim reagensom, kao što je ciklopentilmagnezijum-bromid ili hlorid, a zatim tretiranje dobijene magnezijumove soli sa SO2pa sa Af-hlorsukcinimidom, daje sulfonilhlorid IX. Tretiranje IX sa željenim aminom (X), u prisustvu pogodne baze, kao trietilamin, daje željeni proizvod formule (I). Intermedijeri X mogu, ili da se komercijalno nabave, ili lako pripreme od komercijalno dostupnih polaznih materijala, prema postupcima poznatim na osnovu stanja tehnike. Početni proizvod formule I može dalje da bude modifikovan prema postupcima poznatim u struci, radi dobijanja daljih jedinjenja prema pronalasku. Nekoliko primera je dato u delu Primeri sinteza. ;Željeno R<4>u jedinjenjima formule I može se dobiti izborom pogodno supstituisanog intermedijera IV, prema shemi I. Alternativno, intermedijer VIII u kojem R<4>jeste Br (VHIa), može da bude preveden u intermedijere u kojima R<4>jeste CN, ili supstituisana 5-pirimidil grupa, kao što je prikazano na shemi III. ; ;Kao što je gore prikazano, arilbromid VHIa se tretira sa cijanidnom solju, prvenstveno CuCN i zagreva u pogodnom rastvaraču, kao DMF, dajući cijano-intermedijer VHIb. Tretman jedinjenja VHIa sa pirimidinboronatestrom, kao što je 5-(4,4,5,5,-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-pirimidin, u prisustvu paladijumskog katalizatora, kao [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II)«CH2Cl2(PdCl2(dppf)*CH2Cl2) i neke baze, kao kalijum-karbonat, u pogodnom rastvaraču (Suzuki reakcija), na primer, dimetoksietan, daje pirimidinski intermedijer VIIIc. Intermedijeri VHIb i VIIIc mogu zatim da budu prevedeni u željeno jedinjenje formule I, pomoću postupaka prikazanih na shemama I i II. Suzuki reakcija za prevođenje R<4>= Br u R<4>= u datom slučaju, supstituisani pirimidin, može takođe da se izvede sa jedinjenjem formule I. Suzuki reakcija može takođe da se izvede na suprotan način. Bromid VHIa (ili jedinjenje formule I, sa R<4>= Br) može biti prevedeno u boronatestar, na primer, tretiranjem sa bis(pinakolato)-diboronom, u prisustvu nekog paladijumskog katalizatora, kao PdCl2(dppf), pa zatim sa željenim pirimidilbromidom.

Pronalazak je dalje opisan pomoću sledećih primera sinteza.

Primeri sinteza

Primer1:Sinteza (R)-5-(4-bromo-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-

dihidro-5//-imidazo[l,2-o]imidazol-3-sulfonilhlorida

Rastvor(R)-3-(4-bromo-benzil)-1 -(3,5-dihloro-fenil)-3-metil-1 //-imidazo[ 1, 2- a]imida-zol-2-ona, u THF (0.12M), tretiranje sa A^-jodosukcinimidom (1.05 ekv.) ipiridinium p-toluenesulfonatom (0.1 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 17 h, zatim razblažena sa EtOAc i oprana sa 10% vodenim rastvorom Na2Si03. Sjedinjeni vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc. Sjedinjene organske faze su oprane rastvorom soli, osušene preko Na2SC>4, profiltrirane pa uparene. Sirovo ulje je prečišćeno hromatografijom na silikagelu, dajući željeni jodid.

Rastvor gornjeg jodida, u THF (0.12M), ohlađen je na -40°C, pa je opentilmagnezijum-hlorid (1.05 ekv.) dokapan u toku 10 min. Posle mešanja na -40 °C, 1 h, u toku 1.5 min je dodat SO2(g) preko dovodne igle postavljene upravo iznad površine reakcione smeše. Svetložuta smeša je mešana lh, na -20 °C, a zatim 1 h na sobnoj temperaturi. Kroz smešu je 20 min barbotiran N2(g) pa je onda vršeno koncentrovanje, 12 h, putem visokog vakuuma. Dobijena žuta pena rastvorena je u THF (0.1M), ohlađena na -20 °C, pa je u toku 5 min dokapan rastvor iV-hlorosukcinimida (1.2 ekv.) u THF (0.3M). Posle mešanja, 1 h na -20 °C, smeša je izlivena na led pa ekstrahovana dvaput sa EtOAc. Sjedinjeni oganski slojevi su oprani sa ledenim rastvorom soli, osušeni preko Na2S04, profiltrirani pa koncentrovani. Prečišćavanjem hromatografijom na silikagelu dobijen je (R)-5-(4-bromo-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo-[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorid, kao čvsta supstanca.

Primer 2: (S)-2- [(R)-5- [4-(4-amino-pirimidin-5-il)-benzil] -7-(3,5-dihloro-fenil)-5-

metil-6-okso-6,7-dihidro-5/<y->imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-N-(2-hidro-

ksi-etil)-propionamid (660.4, M+l):

U suspenziju hidrohloridne soli (S)-2-amino-Af-(2-hidroksi-etil)-propionamida (0.53 g, 3.2 mmol, 3 ekv.), u 10 ml DMF dodat je DMAP (4 ekv.), pa je dobijena smeša 1 h mešana na sobnoj temperaturi. U taj rastvor dodat je, na sobnoj temperaturi, (R)-5-(4-bromo-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imi-dazol-3-sulfonilhlorid (0.580 mg, 1.06 mmol), u 2 m DMF. Posle mešanja, 15 min na sobnoj temperaturi, smeša je rastvorena u EtOAc i oprana, sa razblaženim HC1, vodom, zasićenim NaHC03i rastvorom soli, osušena preko Na2S04, profiltrirana pa uparena. Prečišćavanjem sirovog proizvoda hromatografijom na silikagelu dobijeno je 0.305 mg željenog proizvoda.

Smeša, (S)-2-[(R)-5-(4-bromo-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5/f-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-A<r->(2-hidroksi-etil)-propionamida (0.310 g, 0.473 mmol), bis(pinakolato)diborona (0.240 g, 0.946 mmol), i KOAc (0.140 g, 1.419 mmol), u 29 ml dioksana, produvavana je 15 min sa N2. Dodat je PdCl2(dppf)

(0.039 g, 0.047 mmol) pa je reakciona smeša 36 h grejana na 80 °C. Posle hlađenja na sobnu temperaturu, smeša je uparena, pa je ostatak razblažen sa 150 ml EtOAc, opran sa vodom i rastvorom soli, osušen preko MgS04, i uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu, dajući 0.204 g (62%) boronata.

Smeša gornjeg boronata (0.204 g, 0.295 mmol), 5-bromo-2-amino-pirimidina (0.078 g, 0.443 mmol), i K2C03(0.122 g, 0.885 mmol), u 8 ml dimetoksietana i 1.2 ml vode, 20 min je produvavana sa N2. Dodat je PdCi2(dppf) (0.025 g, 0.030 mmol), pa je reakciona smeša 2 h grejana na 80 °C. Posle hlađenja na sobnu temperaturu smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa rastvorom soli i uparena. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu i preparativnom TLC, dajući 0.062 g (32%) jedinjenja navedenog u naslovu (660.4, M+l). Sledeće jedinjenje je pripremljeno prema postupku analognom onom koji je opisan u primeru 2:

(S)-2-[(R)-544-(4-amino-pirimidin-5-il)-benzil]-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-propionamid (687.1, M+l):

Primer 3: Sinteza (S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benziI)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo [ 1,2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -propionamida

U rastvor (R)-3-(4-bromo-benzil)-1 -(3,5-dihloro-fenil)-3 -metil-1 //-imidazo[ 1,2-a]imi-dazol-2-ona (3.0 g, 6.6 mmol), u DMF (60 ml), dodat je Zn(CN2) (0.47 g, 4.0 mmol). Dobijeni rastvor je 2 h degaziran jakom strujom N2. Dodati su Pd2dba3i dppf, pa je reakciona smeša zagrevana 2 h na 120 °C. Rastvarač je otparen, ostatak je rastvoren u EtOAc, opran vodom i rastvorom soli, osušen i profiltriran, pa je ostatak prečišćen preko Florisil-a, dajući 2.42 g željenog proizvoda. Taj proizvod je zatim tretiran na način sličan onom koji je opisan u primeru 1, dajući (R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5H-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorid.

L-alaninamid-hidrohlorid (0.151 g, 1.209 mmol) rastvoren je u anhidrovanom DMF, pa je u rastvor dodat DMAP (0.197 g, 1.612 mmol). Reakciona smeša je 1 h mešana na sobnoj temperaturi. Zatim je u reakcionu smešu dodat (R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5/7-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorid

(0.24 g, 0.484 mmol), u anhidrovanom DMF, pa je mešano još 10 min. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i oprana sa vodom, 1 M HC1 i opet sa vodom. Organska faza je osušena preko Na2S04pa koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silikagelu, dajući 0.211 g jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu, čvrstu, ljuspičastu supstancu (M+l, 547.2).

Primer 4: Sinteza (S)-N-karbamoilmetil-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-

fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5/T-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamida

L-alanin-t-butilestar-hidrohlorid (0.88 g, 4.84 mmol) rastvoren je u anhidrovanom DMF (10 ml), pa je u rastvor dodat DMAP (0.79 g, 6.46 mmol). Reakciona smeša je na sobnoj temperaturi mešana 1 h, pa je u reakcionu smešu dodat (R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-57/-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorid (0.80 g, 1.61 mmol), u DMF. Na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je mešana još 10 min. Reakciona smeša je oprana sa vodom (3x), IM HC1 i zasićenim NaHC03. Organska faza je osušena preko Na2S04i uparena. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silikagelu, korišćenjem CFbCk-MeOH (98:2) kao eluenta, dajući 0.94 g sulfonamid-t-butilestra. Dobijeni proizvod je tretiran sa trifluorosirćetnom kiselinom (5 ml) u CH2C12(10 ml), 3 h na sobnoj temperaturi. Reakcioni rastvor je razblažen sa CH2C12pa opran vodom. Organska faza je oprana sa Na2S04, pa uparena, dajući 0.67 g (S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionske kiseline, kao bele pene.

Gornja karboksilna kiselina (0.05 g, 0.091 mmol) rastvorena je u anhidrovanom DMF (2 ml), pa je u reakcioni rastvor dodat benzotriazol-l-il-oksi-tris(pirolidino)fosfonijum-heksafluorofosfat (PyBOP)

(0.071 g, 0.137 mmol). Reakciona smeša je mešana 10 min na sobnoj temperaturi, pa je u smešu dodat glicinamid-hidrohlorid (0.015 g, 0.137 mmol), a zatim N,N-diizopro-piletilamin (0.039 ml, 0.227 mmol). Reakciona smeša je mešana još 15 min, na sobnoj temperaturi. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc (10 ml), oprana sa vodom (2x), sa IM HC1, zasićenim NaHC03pa opet sa vodom (lx). Organska faza je osušena preko Na2S04i uparena. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom tankoslojnom hromatografijom, korišćenjem CH^CVMeOH (95:5), kao eluenta, dajući 0.043 g jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu penu (M+l, 604.2).

Sledeće jedinjenje je pripremljeno prema postupku analognom onom koji je opisan u gornjem primeru: (S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo [ 1, 2- a] imidazol-3 -sulfonilamino] -N-(2-hidroksi-2-metil-propil)-propionamid:

(M+l, 619)

Primer 5: Sinteza (S)-N-((R)-l-karbamoil-etil)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5J<y->imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonil-amino]-propionamida

(S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6J-dihidro-5H-im dazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionska kiselina (vidi primer 14) (0.05 g, 0.091 mmol) rastvorena je u anhidrovanom DMF (2 ml), pa je u reakcioni rastvor dodat TBTU (0.044 g, 0.137 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi, 10 min, pa je u smešu dodat D-alaninamid-hidrochlorid (0.017 g, 0.137 mmol), a zatim N,N-diizopropiletilamin (0.039 ml, 0.227 mmol). Reakciona smeša je mešana još 15 min na sobnoj temperaturi. Smeša je razblažena sa EtOAc (10 ml) i oprana sa vodom, 1 M HC1, zasićenim NaHC03pa opet vodom. Organska faza je osušena preko Na2S04pa uparena. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom tankoslojnom hromatografijom na silikagelu, dajući 0.035 g jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu penu (M+l, 618.2).Primer 6: (S)-2- [(R)-5-(4-cij ano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5/T-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-N-(2-hidroksi-etil)-propionamid

Smeša L-Boc-alanina (0.40 g, 2.11 mmol), etanolamina (0.15 ml, 2.54 mmol) i HOBt (0.29 g, 2.11 mmol), u anhidrovanom CH3CN (9 ml) ohlađena je na 0 °C, pa je u raekcionu smešu dodat l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid-hidrohlorid (EDC)

(0.49 g, 2.54 mmol). Ostavljeno je da se reakciona smeša ohladi na sobnu temperaturu pa je mešano 19 h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i oprana sa 5% limunskom kiselinom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc. Sjedinjene organske faze su oprane sa zasićenim NaHC03i rastvorom soli. Organska faza je osušena preko Na2S04i koncentrovana, dajući 0.38 g kuplovanog proizvoda, kao bezbojno ulje.

Gornji alkohol (0.34 g, 1.45 mmol) je rastvoren u CH2CI2(3 ml) pa je u rastvor dodat 4 M HC1, u dioksanu (3 ml). Reakciona smeša je 2 h mešana na sobnoj temperaturi, a zatim je koncentrovana, dajući (S)-2-amino-N-(2-hidroksi-etil)-propionamid-hidrohlorid.

U rastvor gornje aminske soli (0.043 g, 0.254 mmol) u anhidrovanom DMF, dodat je DMAP (0.037 g, 0.303 mmol). Reakciona smeša je 1 h mešana na sobnoj temperaturi. U reakcionu smešu je onda dodat (R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorid (0.036 g, 0.073 mmol) pa je mešano još 2 h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i oprana sa 1 M HC1 i zasićenim NaHCC»3. Organska faza je osušena preko Na2S04i koncentrovana. Ostatak je prečišćen preparativnom tankoslojnom hromatografijom na silikagelu, dajući 0.035 g jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu penu (M+l, 591.1).

Primer7:(S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-di-

hidro-5/f-imidazo [ 1,2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -5-morfolin-4-il-5-okso-valeri-

janske kiseline amid

U smešu (S)-2-tert-butoksikarbonilamino-glutarne kiseline 1-benzilestra (4.5 g, 13.4 mmol), morfolina (1.29 ml, 14.8 mmol) i HOBt (1.89 g, 14.0 mmol), u CH2C12(18 ml), na 0 °C je polako dodavan rastvor DCC (2.89 g, 14.0 mmol), u CH2C12(18 ml). Ostavljeno je da se dobijena smeša zagreje na sobnu temperaturu, pa je mešano tokom noći. Nastali talog je odfiltriran pa je rastvor razblažen sa CH2C12. Rastvor je opran sa zasićenim NaHC03, 1 M HC1, i na kraju sa rastvorom soli. Organski sloj je osušen preko Na2S04i profiltriran. Otparavanjem rastvarača dobijen je željeni amid (5.42 g), kao bela čvrsta supstanca.

Smeša gornjeg amida (6.17 g, 152 mmol) i 10% Pd/C (0.52 g), u EtOAc (50 ml) hidrogenovana je 24 h pod atmosferskim pritiskom. Smeša je profiltrirana pa uparena, dajući (S)-2-terc-butoksikarbonilamino-5-morfolin-4-il-5-okso- valerijansku kiselinu (3.12 g), kao penu, koja je dalje upotrebljena bez prečišćavanja.

Kroz rastvor gore dobijene karboksilne kiseline (3.12 g, 9.86 mmol) i 0-(7-azaben-zotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijumheksafluorofosfata (HATU) (5.25 g, 13.8 mmol), u DMF (30 ml), 20 min je barbotiran gasoviti amonijak, uz mešanje. U dobijenu žutu suspenziju dodat je N,N-diizopropiletilamin (5.15 ml, 29.5 mmol), preko šprica. Tokom noći, smeša je mešana pod atmosferom azota. Reakciona smeša je profiltrirana pa uparena u vakuumu. Dobijeni ostatak je rastvoren u CH2CI2, opran sa zasićenim NaHCC»3, 1 M HC1, i na kraju, rastvorom soli. Organski sloj je osušen preko Na2S04, profiltriran i uparen. Dobijeni ostatak je prekristalisan iz EtOAc, dajući amid (1.16 g), kao belu čvrstu supstancu.

Boe grupa je uklonjena sa HC1 u EtOAc, a dobijeni (S)-2-amino-5-morfolin-4-il-5-okso-valerijanske kiseline amid-hidrohlorid je izdvojen filtriranjem pomoću vakuuma i upotrebljen dalje bez prečišćavanja. U rastvor (R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5 -metil-6-okso-6,7-dihidro-5Z/-imidazo [ 1, 2- a] imidazol-3 -sulfonilhlorida(76 mg, 0.13 mmol), u DMF (4 ml), uz mešanje su dodati N,N-diizopropiletilamin (60 ul, 0.39 mmol) i amin-hidrohlorid (100 mg, 0.4 mmol). Posle mešanja tokom noći DMF je uklonjen pod vakuumom a dobijeni ostatak je hromatografisan na silikagelu. Proizvod je zatim prečišćen semi-preparativnom HPLC, dajući 32 mg jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu čvrstu supstancu (M+l, 674.04).

Primer 8: Sinteza (S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metiI-6-okso-5-(4-trilfuoromet-

oksi-benzil)-6,7-dihidro-5/f-imidazo[l,2-a]imidazoI-3-sulfonilamino]-propionamida

U toku 25 min, polako je dokapavan litijum-bis(trimetilsilil)amid (LiHMDS) (38.0 ml, 1 M u THF) u rastvor (2S,5R)-2-^rc-butil-3-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-l-(2,2,2-trifluoro-acetil)-imidazolidin-4-ona (10.0 g, 25.17 mmol), u 60 ml THF, na -20 °C. Posle mešanja na -20 °C tokom 20 min, dokapavan je tokom 20 min, rastvor 4-trifluorome-toksibenzilbromida (6.04 ml, 37.76 mmol) u 30 ml THF. Smeša je mešana 45 min, na -20 °C, u toku 1 h zagrejana na -5 °C, pa onda izlivena u 50 ml ledenog, zasićenog rastvora NH4CI. Dobijena smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjene organske faze su oprane rastvorom soli, osušene preko Na2S04, profiltrirane i uparene. Sirovi proizvod je trljan sa heksanom, dajući 12.5 g (87%) (2R,5R)-2-etrc-butil-3-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-l-(2,2,2-trifluoro-acetil)-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-imidazolidin-4-ona, kao žućkasto belu čvrstu supstancu.

U rastvor gonjeg imidazolidinona (6.0 g, 10.5 mmol), u 40 ml dioksana, na sobnoj temperaturi je dodat 40% vodeni rastvor benziltrimetilamonijum-hidroksida (6.59 g, 15.75 mmol). Kada je smeša zagrejana na 40 °C, polako je tokom 5 min dokapavan 50% vodeni rastvor natrijum-hidroksida (1.68 g, 21.0 mmol). Smeša je 18 h mešana na 40 °C, pa je zatim u toku 10 min polako dokapavan rastvor 6.4 g of konc. HC1 u 3.3 ml vode. Smeša je zagrejana na 50 °C i mešana još 5 h, onda je ohlađena na sobnu temperaturu i uparena. U ostatak je dodato 50 ml toluena, pa je dvofazna smeša snažno mešana dok je polako dokapavan 50% vodeni rastvor natrijum-hidroksida (3.0 g) (pH vodene faze > 10). Vodeni sloj je ekstrahovan toluenom, pa su sjedinjene organske faze oprane sa vodom i rastvorom soli, osušene preko Na2SC>4, filtrirane pa uparene, dajući 4.24 g of (R)-2-amino-A<A->(3,5-dihloro-fenil)-2-metil-3-(4-trifluorometoksi-fenil)-propionamida, kao svetio braon ulje.

U rastvor gornjeg propionamida (4.24 g, 10.41 mmol), u 30 ml THF, dodati su tiokarbonildiimidazol (2.81 g, 15.77 mmol) i 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (0.127 g, 1.04 mmol). Smeša je refluksovana 17 h, ohlađena na sobnu temperaturu, i koncentrovana. Oranž uljasti ostatak je rastvoren u 50 ml toluena, pa je polako dokapavano 20 ml 5% vodenog rastvora HC1. Posle 10 min mešanja smeše, vodeni sloj je odvojen i ekstrahovan toluenom. Sjedinjene organske faze su oprane sa vodom i rastvorom soli, osu-šene preko Na2SC>4, profiltrirane i uparene, dajući 4.48 g of (R)-3-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-2-tiokso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-imidazolidin-4-ona, kao oranž penu.

U rastvor gornjeg tiohidantoina (4.47 g, 9.95 mmol) i aminoacetaldehid dimetilacetala (6.50 ml, 59.7 mmol), u 20 ml MeOH, u toku 25 min, dokapavano je 7.69 ml (59.7 mmol, 70% u vodi) rastvora r-butilhidroperoksida. Za vreme dodavanja i još oko 1 h posle toga, interna temperatura smeše je pomoću vodenog kupatila sa ledom održavana ispod 20 °C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 86 h, pa je onda polako dokapano 25 ml zasićenog rastvora NaHSOi, uz održavanje interne temperature pomoću vodenog kupatila sa ledom, ispod 20 °C. Dobij ena mutna bela smeša je uparena. U ostatak je dodat EtOAc, pa je smeša ponovo uparena. Uljasti ostatak je razdeljen između EtOAc i vode, vodena faza je odvojena i ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski slojevi su oprani sa vodom i rastvorom soli, osušeni preko Na2S04, profiltrirani i upareni, dajući 5.21 g (R)-3-(3,5-dihloro-fenil)-2-[(E)-2,2-dimetoksi-etil-imino]-5-metil-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-imidazolidin-4-ona, kao gusto žuto ulje.

Rastvor gornjeg sirovog acetala (5.20 g, 9.95 mmol), u 30 ml acetona, tretiran je sa/?-toluenesulfonskom kiselinom (1.89 g, 9.96 mmol). Smeša je refluksovana 2 h, ohlađena na sobnu temperaturu i koncentrovana. Dobij eno tamno oranž ulje rastvoreno je u 40 ml EtOAc pa je polako dodavan rastvor 2.3 g NaHC03, u 23 ml vode. Kada je prestalo izdvajanje gasa, vodena faza je odvojena i ekstrahovana dvaput sa EtOAc. Sjedinjeni organski slojevi su oprani sa zasićenim rastvorom NaHC03dvaput sa vodom, sa rastvorom soli, osušeni preko Na2S04, pa filtrirani i upareni. Uljasti ostatak je prečišćen hromatografski sa silikagelom, dajući 1.58 g (R)-l-(3,5-dihloro-fenil)-3-metil-3-(4-trifluorometoksi-benzil)-l//-imidazo[l,2-a]imidazol-2-ona (456.2, M+l).

Rastvor (R)-1 -(3,5 -dihloro-fenil)-3 -metil-3 -(4-trifluorometoksi-benzil)-1 //-imidazo-[l,2-a]imidazol-2-ona (primer 1) (1.54 g, 3.38 mmol), u 30 ml THF, tretiran je sa N-jodosukcinimidom (0.846 g, 3.76 mmol) i piridinijum /?-toluenesulfonatom (0.086 g, 3.76 mmol). Smeša je 17 h mešana na sobnoj temperaturi, zatim razblažena sa EtOAc, i oprana sa 10% rastvorom Na2S203, u vodi. Sjedinjeni organski slojevi su ekstrahovani sa 10 ml EtOAc. Sjedinjene organske faze su oprane sa 25 ml rastvora soli, osušene preko Na2S04, profiltrirane i uparene. Sirovo oranž ulje je prečišćeno hromatografijom na silikagelu, dajući 1.27 g (65%) (R)-l-(3,5-dihloro-fenil)-5-iodo-3-metil-3-(4-trifluoro-metoksi-benzil)-l//-imidazo[l,2-a]imidazol-2-ona, kao žuto-belo ulje (582.0, M+l).

Rastvo gornjeg jodida (1.24 g, 2.13 mmol), u 16 ml THF, ohlađen je na -40 °C, kada je dokapan ciclopentilmagnezijum-hlorid (1.17 ml, 2 M u dietiletru) u toku 10 min. Posle 1 h mešanja na-40 °C, uvođen je 1.5 min, S02(g) preko igle, postavljene upravo iznad površine reakcione smeše. Svetio žuta smeša je tokom 1 h zagrejana na -20 °C a onda je na sobnoj temperaturi mešano lh. Kroz smešu je 20 min barbotiran N2(g) a zatim je 12 h vršeno uparavanje pod visokim vakuumom. Dobijena žuta pena je rastvorena u 16 ml THF, ohlađena na -20 °C, pa je tokom 5 min dokapan rastvor AMilorosukcinimida (0.341 g, 2.56 mmol), u 8 ml THF. Posle 1 h mešanja na -20 °C, smeša je izlivena na led, pa dvaput ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski slojevi su oprani sa ledenim rastvorom soli, osušeni preko Na2S04, profiltrirani i upareni. Prečišćavanje hromatografijom na silikagelu dalo je 0.975 g (83%) of (R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilhlorida, kao gusto ulje (554.2, M+l).

Na rastvor HC1 soli, L-alaninamida (0.097 g, 0.782 mmol), u 6.5 ml DMF, dodat je trietilamin (0.163 ml, 1.17 mmol), na sobnoj temperaturi. Posle 10 min mešanja, brzo je dokapan rastvor gornjeg sulfonilhlorida (0.217 g, 0.391 mmol), u 1 ml CH2C12, pa je zamućena smeša 5 h mešana na sobnoj temperaturi. Posle dodavanja EtOAc, organski sloj je opran sa vodom, pa sa rastvorom soli, osušen preko Na2S04, profiltriran i uparen. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silikagelu, dajući 0.193 g (81%) jedinjenja navednog u naslovu, kao belu čvrstu supstancu (606.3, M+l).

Sledeće jedinjenje je pripremljeno prema postupku analognom primeru 8:

(R)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihi-dro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamid (606.4, M+l):

Primer 9: Sinteza (S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trilfuoromet-oksi-benzil)-6,7-dihidro-5/T-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-A</->(2-hidro-ksi-etil)-propionamida.

U suspenziju N-Boc-L-(AA'-hidroksietil)alaninamida (0.188 g, 0.809 mmol), 1 ml dioksana, dodat je HC1 (2.0 ml, 4 M u dioksanu), pa je dobijena zamućena smeša mešana 2.5 h na sobnoj temperaturi. Koncentrovanje smeše je dalje vršeno uz dodavanje CH2CI2, a taj je postupak dvaput ponovljen. Finalno uklanjanje isparljivih sastojaka, 12 h pod visokim vakuumom, dalo je bezbojno ulje. Sirova HC1 so amina rastvorena je u 1.5 ml DMF, pa je tretirana sa trietilaminom (0.157 ml, 1.13 mmol). Posle 10 min me-šanja na sobnoj temperaturi, brzo je dokapan preko kanile, rastvor (R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5//-imidazo-[l,2-a]imi-dazol-3-sulfonilhlorida (0.125 g, 0.225 mmol), u 3 ml CH2CI2. Reakciona smeša je 4 h mešana na sobnoj temperaturi. Posle dodavanja EtOAc, organski sloj je triput opran sa 5% rastvorom NaCl, zatim sa rastvotom soli, osušen preko Na2S04, profiltriran i uparen. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom TLC, dajući 0.118 g (81%) jedinjenja navedenog u naslovu, kao belu penu (649.9, M+l).

Sledeće jedinjenje je pripremljeno analogno postupku iz primera 9:

(S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihid-ro-5//-imidazo[l,2-fl]imidazol-3-sulfonilamino]-A<7->(2-hidroksi-2-metil-propil)-propionamid (678.3, M+l):

Opis bioloških svojstava

Biološka svojstva reprezentativnih jedinjenja formule I ispitivana su prema eksperimentalnim protokolima opisanim dole.

Ogled za određivanje inhibicije vezivanja LFA-1 za ICAM-1

Cilj ogleda:

Ovaj protokol ogleda je pripremljen za određivanje direktnog antagonizma, nekog test jedinjenja, na interakciju CAM, ICAM-1 sa Leukointegrin-om CD18/CD1 la (LFA-1).

Opis protokola ogleda:

LFA-1 je imuno-prečišćen primenom TS2/4 antitela iz 20 g peleta humanih JY ili SKW3 ćelija, prema prethodno opisanom protokolu (Dustin, M. J.;et al, J. Immunol.1992,148,2654-2660). LFA-1 je prečišćen iz SKW3 lizata pomoću imuno-afinitetne hromatografije, na TS2/4 LFA-1 mAb sefarozi i eluiran pri pH 11.5, u prisustvu 2 mM MgCl2i 1% oktilglukozida. Posle sakupljanja i neutralizovanja frakcija sa TS2/4 kolone, uzorci su sjedinjeni i prečišćeni sa Protein G agarozom.

Rastvorni oblik ICAM-1 je konstruisan, eksprimovan, prečišćen i okarakterisan kao što je ranije opisano (Marlin, S.;et al, Nature,1990,344,70-72, vidi i Arruda, A.;et al, Antimicrob. Agents Chemoter.1992,36,1186-1192). Ukratko, izoleucin 454 koji se nalazi na pretpostavljenoj granici između domena 5 u ektodomenu i transmembranskog domena, zamenjen je stop-kodonom, primenom standardne mutageneze regulisane oligonukleotidom. Ova konstrukcija daje molekul identičan sa prvih 453 amino kiselina ICAM-l-a vezanog za membranu. Formiran je ekspresioni vektor, sa genom dihidro-folatne reduktaze hrčka, markerom rezistencije na neomicin, i kodirajućom regijom gore opisanog sICAM-1 konstrukta, zajedno sa promotorom, signalima za obradu i poliade-nilacionim signalom prethodne SV40 regije. Rekombinantni plazmid je transfektovan u CHO DUX ćelije primenom standardnih kalcijum-fosfatnih postupaka. Ćelije su prenete (pasažirane) u selektivni medijum (G418) a kolonije koje luče sICAM-1 su umnožene korišćenjem metotreksata. sICAM-1 je prečišćen iz medija koji su bez seruma primenom postupaka ne-afinitetne hromatografije, uključujući jonoizmenjivačku hromatografiju i hromatografiju koja isklučuje prema veličini.

LFA-1 koji se vezuje za ICAM-1 praćenje najpre inkubiranjem 40 u.g/ml sICAM-l-a u fosfatno puferovanom Dulbecco-vom rastvoru, sa solima kalcijuma i magnezijuma, sa dodatnim 2 mM MgCl2i 0.1 mM PMSF (pufer za razblaživanje), u ploči sa 96-buna-rića, 30 min na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim blokirane dodavanjem 2% (mas./vol.) goveđeg serumskog albumina u pufer za razblaživanje, na 37 °C, tokom 1 h. Rastvor za blokiranje je uklonjen iz bunarića, test supstance su razblaživane pa zatim dodavane, uz dodavanje oko 25 ng imuno-afinitetno prečišćenog LFA-1. LFA-1 je inkubiran 1 h, na 37 °C, u prisustvu test jedinjenja i ICAM-l-a. Bunarići su oprani 3 puta sa puferom za razblaživanje. Vezani LFA-1 je detektovan dodavanjem poliklonalnog antitela napeptid koji odgovara citoplazmnom kraju CD 18, u razblaženju 1:100, sa puferom za razblaži-vanje i 1% BSA, pa je inkubiran 45 min na 37 °C. Bunarići su prani 3 puta sa puferom za razblaživanje pa je poliklonalno antitelo koje je se vezalo, detektovano dodavanjem kozjeg imunoglobulina usmerenog protiv imunoglobulina kunića, konjugovanog sa proksidazom rena, sa razblaženjem 1:4000. Ovaj reagens je inkubiran 20 min, na 37 °C, bunarići su oprani pa je supstrat za peroksidazu rena dodavan u svaki bunarić da bi se razvio kvantitativan kolorimetrijski signal proporcionalan količini LFA-1 vezanog za sICAM-1. Rastvorni ICAM-1 (60 ug/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola za inhibiciju interakcije LFA-l/ICAM-1. Odsustvo LFA-l-a, koji se dodaje u ogledu vezivanja, korišćeno je kao osnovna kontrola za sve uzorke. Za sva testirana jedinjenja određivana je kriva, doza-odgovor.

Sva jedinjenja pripremljena u prethodnim primerima ispitana su prema ovom ogledu i za svakoje nađeno da ima Kd< 10 uM.

Ogledza određivanje metabolizma pomoću mikrozomalnih enzima humane jetre

Cilj ogleda:

Ovaj protokola za ogled pripremljen je, za merenje in vitro metabolizma test jedinjenja pomoću mikrozomalnih enzima humane jetre. Dobijeni podaci su analizirani radi izračunavanja polu-života (ti/2, min) test jedinjenja.

Opis protokola za ogled:

Ogled je izvođen u 50 mM kalijum-fosfatnom puferu, pH 7.4 i 2.5 mM NADPH. Test uzorci su rastvarani u acetonitrilu sa finalnom koncentracijom u ogledu od 1-10 uM. Mikrozomi humane jetre su razblaživani u puferu za ogled sa finalnom koncetracijom za ogled, od 1 mg mg proteina/ml. U 825 ul pufera za ogled dodavani su 25 ul rastvora jedinjenja i 50 ul suspenzije mikrozoma. Preparat je inkubiran 5 min, na 37 °C, u vodenom kupatilu. Reakcija je započinjala dodavanjem 100 jal NADPH. Zapremine od po 80 ul su izdvajane iz inkubacione smeše, na 0, 3, 6, 10, 15, 20, 40 i 60 min posle započinjanja reakcije, i dodavane u 160 ul acetonitrila. Uzorci su mućkani 20 sek. pa centrifugirani 3 min sa 3000 o/min. Zapremina od 200 ul supernatanta je prenošena na filter ploče od staklenih vlakana, od 0.25 mm, pa je centrifugirano 5 min sa 3000 o/min. Injekcione zapremine od 10 ul su na isti način unošene u Zorbax SB C8 HPLC kolone, sa mravljom kiselinom u vodi ili acetonitrilu, sa brzinom proticanja od 1.5 ml/min. Procentualni gubitak matičnog jedinjenja je izračunavan na osnovu površine, ispod svake vrmenske tačke, radi određivanja polu-života.

Jedinjenja koja su pripremljena u prethodnim primerima testirana su u ovom ogledu i generalno je nađeno da imaju ti/2> 50 minuta.

Opis terafeutske primene

Novi mali molekuli, formule I, koji se dobijaju na osnovu pronalaska, inhibiraju homotipsku agregaciju humanih limfocita i humanih limfocita, i prijanjanje (adheziju) humanih limfocita na ICAM-1, zavisne od ICAM-l/LFA-1. Ova jedinjenja su terapeutski korisna u modulaciji aktivacije/proliferacije imunske ćelije, npr. kao uporedni (rivalski) inhibitori interćelijskih ligand/receptor vezujućih reakcija u kojima učestvuju CAMs i Leukointegrin-i. Određenije, jedinjenja na osnovu pronalaska mogu biti upotrebljena za lečenje izvesnih inflamatornih stanja, uključujući stanja koja potiču od odgovora ne-specifičnog imunskog sistema kod sisara (npr. respiratorni distres sindrom kod odraslih, šok, kiseonična toksičnost, sindrom multipne organske povrede, pratilac septicemije, sindrom multipne organske povrede, pratilac trauma, reperfuziona povreda tkiva zbog kardiopulmonarnog bajpasa, infarkt miokarda ili upotreba sa tromboliznim sredstvima, akutni glomerulonefritis, vaskulitis, reaktivni artritis, dermatoza sa akutnim inflamatornim komponentama, moždani udar, toplotna povreda, hemodijaliza, leukafereza, ulcerativni kolitis, nekrotizirajući enterokolitis i sindrom povezan sa granulocitnom transfuzijom) i stanja koja nastaju od odgovora specifičnog imunskog sistema kod sisara (npr. psorijaza, odbacivanje transplantata organa/tkiva, graft vs. reakcije domaćina i autoimunska oboljenja, uključujući Raynaud-ov sindrom, autoimunski tiroiditis, dermatitis, multipna skleroza, reumatoidni artritis, dijabetes melitus zavisan od insulina, uveitis, inflamatorno oboljenje creva, uključujući Kronovu bolest i ulcerativni kolitis i sistemski lupus eritematozus). Jedinjenja na osnovu pronalaska mogu takođe da budu upotrebljena za tretiranje astme ili kao dodatak za minimiziranje toksičnosti u citokinskoj terapiji pri lečenju kancera. Generalno, ova jedinjenja mogu biti upotrebljena u lečenju onih oboljenja koja se danas mogu lečiti steroidnom terapijom.

Zbog toga, jedan drugi aspekt pronalaska je davanje postupka za lećenje ili profilaksu gore-opisanih stanja, davanjem, terapeutskih ili profilaksnih količina jednog ili više jedinjenje formule I.

U skladu sa postupkom koji pruža pronalazak, nova jedinjenja formule I mogu da se daju, ili sa profilaksnom ili sa terapeutskom svrhom, sama ili sa drugim imunosupresivima ili antiinfiamatornim agensima. Kada se daju profilaksno, imunodepresivno(a) jedinjenje(a) se daje(u) unapred na bilo koji inflamatorni odgovor ili simptom (na primer, pre vremena, za vreme, ili ubrzo posle vremena transplantacije nekog organa ili tkiva, ali pre bilo kakvih simptoma odbacivanja organa). Profilaksno davanje jedinjenja formule I služi za sprečavanje ili smanjenje nekih potonjih inflamatornih odgovora (kao, na primer, odbacivanje presađenog organa ili tkiva, itd.). Terapeutsko davanje jedinjenja formule I služi za ublažavanje neke aktuelne inflamacije (kao, na primer, odbacivanje presađenog organa ili tkiva). Prema tome, u skladu sa pronalaskom, neko jedinjenje formule I može da se daje ili pre početka inflamacije (tako da spreči očekivanu inflamaciju) ili posle početka inflamacije.

Nova jedinjenja formule I mogu, u skladu sa pronalaskom, da se daju u jednoj dozi ili u podeljenim dozama, oralno, parenteralno ili lokalno. Pogodna oralna doza za jedinjenje formule I, trebalo bi da je u opsegu od oko 0.1 mg do 10 g, na dan. Kod parenteralnih formulacija, pogodna dozirna jedinica može da sadrži od 0.1 do 250 mg pomenutih jedinjenja, dok su za lokalno davanje povoljne formulacije koje sadrže 0.01 do 1% aktivnog sastojka. Ipak, podrazumeva se, da će određivanje doze da se menja od pacijenta do pacijenta, i da će doziranje za svakog pojedinačnog pacijenta zavisiti od kliničke procene, koja će uzeti kao kriterijume za određivanje pogodne doze, veličinu i stanje pacijenta, kao i pacijentov odgovor na lek.

Kada se jedinjenja na osnovu ovog pronalaska daju oralno, ona mogu da se daju kao medikamenti u obliku farmaceutskih preparata koji ih sadrže, zajedno sa kompatibilnim farmaceutskim nosećim materijalom. Takav noseći materijal može biti organski ili neorganski noseći materjal, pogodan za oralnu primenu. Primeri takvih nosećih materijala su, voda, želatin, talk, škrob, magnezijum-stearat, gumi arabika, biljna ulja, polialkilen-glikoli, vazelin i slično.

Farmaceutski preparat može biti pripremljen na konvencijalan način a finalni dozirni oblici mogu biti čvrsti oblici, na primer, tablete, dražeje, kapsule i slično, ili tečni dozirni oblici, na primer, rastvori, suspenzije, emulzije i slično. Farmaceutski preparati mogu biti podvrgnuti uobičajenim farmaceutskim operacijama, kao što je sterilizacija. Dalje, farmaceutski preparati mogu da sadrže konvencijalne adjuvanse, kao konzervanse, stabilizatore, emulgatore, poboljšivače arome, sredstva koja olakšavaju vlaženje, pufere, soli za promenu osmotskog pritiska i slčno. Čvrsti noseći materijali mogu biti upotrebljeni, uključujući, na primer, škrob, laktozu, manitol, metilcelulozu, mikrokristalnu celulozu, talk, silicijumdioksid, dvobazni kalcij um-fosfat i polimere velike molekulske težine (kao polietilen-glikol).

Za parenteralnu primenu, neko jedinjenje formule I može da se daje u vodenom ili nevodenom rastvoru, suspenziji ili emulziji u farmaceutski prihvatljivom ulju ili smeši tečnosti, koja može da sadrži bakteriostatičke agense, antioksidanse, konzervanse, pufere ili druge rastvorene sastojke da bi rastvor bio izotoničan sa krvlju, zgušćivače, sredstva za suspendovanje ili druge farmaceutski prihvatljive aditive. Aditivi tog tipa obuhvataju, na primer, tartaratne, citratne i acetatne pufere, etanol, propilen-glikol, polietilen-glikol, tvorce kompleksa (kao EDTA), antioksidanse (kao natrijum-bisulfit, natrijum-metabisulfit, askorbinska kiselina), polimere velike molekulske težine (kao tečni polietilenoksidi) za regulisanje viskoznosti i polietilenske derivate sorbitol anhidrida. Konzervansi takođe mogu da se dodaju, ako je potrebno, kao benzoeva kiselina, metil ili propil paraben, bentzalkonijumhlorid i druga kvaternerna amonijum jedinjenja.

Jedinjenja na osnovu ovog pronalaska mogu takođe da se daju kao rastvori za nazalnu primenu i mogu dodatno da sadrže pored jedinjenja prema ovom pronalasku pogodne pufere, podešivače toničnosti, konzervanse protiv mikroba, antioksidanse i sredsrva koja povećavaju viskoznost, u bilo kojem vodenom prenosiocu. Primeri sredstava upotrebljenih za povećavanje viskoznosti jesu polivinilalkoholi, derivati celuloze, polivinilpirolidon, polisorbati ili glicerin. Dodati konzervansi protiv mikroba mogu da sadrže benzalkonijumhlorid, timerozal, hlorobutanol il polietilenalkohol.

Osim toga, jedinjenja koja daje pronalazak mogu da se primenjuju lokalno ili preko supozitorija.

Formulacije

Jedinjenja formule I mogu da se formulišu za terapeutsku primenu na više načina. Opisi nekoliko egzemplarnih formulacija dati su u daljem.

Primer A

Jedinjenje formule I je umešano u praškastu smešu sa pred-miksovanim ekscipijentnim materijalima, kao što su prethodno navedeni, sa izuzetkom sredstva koje olakšava presovanje. Zatim je umešan materijal koji olakšava presovanje pa je dobijena mešavina (blend) komprimovana u tablete ili je punjenja u kapsule od čvrstog želatina.

Primer B

Parenteralni rastvori

Ekscipijentni materijali su pomešani, pa zatim dodati ujedno od jedinjenja formule I, u zapremini koja je potrebna za rastvaranje. Sa mešanjem je nastavljeno sve dok rastvor nije postao bistar. Rastvor je onda filtriran u odgovarajuće bočice ili ampule, pa sterilisan u autoklavu.

Primer C

Suspenzija

Ekscipijentni materijal je pomešan sa vodom pa je posle toga dodato jedno od jedinjenja formule I i mešanje je produženo sve dok suspenzija nije bila homogena. Suspenzija je onda preneta u pogodne bočice ili ampule.

Primer D

Formulacija za lokalnu primenu

Odgovarajuće količine Teflose 63, Labrafil-a M 1944 CS, parafinskog ulja i vode, mešane su uz zagrevanje na 75 °C sve dok se sve koponente nisu istopile (obrazovale homogenu pastu). Smeša je onda ohlađena na 50 °C i produženo je sa mešanjem. Uz mešanje su dodati Methvlparaben i Propvlparaben pa je smeša ohlađena na sobnu temperaturu. U smešu je dodato jedinjenje formule I pa dobro umešano.

Claims

1. Jedinjenje formule I u kojoj: R<1>je prava ili razgranata alkil grupa sa 1 to 3 atoma ugljenika, koja je, u datom slučaju, mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabrani iz grupe koju čine: (i) okso i (ii) morfolino grupa; R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine: (A) vodonik, i (B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz grupe koju čine: (i) CONH2i (ii) OH, ili R 2 1 * R 3 zaj• edno sa atomom azota i•zmeđu njih obrazuju piperazin prsten; i R<4>je: (A) cijano grupa, (B) pirimidin grupa, koja je mono- ili disupstituisana sa NH2, ili (C) trifluorometoksi grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.;

2. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj: R<1>je metil grupa; R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine: (A) vodonik, i (B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz grupe koju čine: (i) CONH2i (ii) OH; i R<4>je: (A) cijano ili (B) trifluorometoksi grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.;

3. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1 ili 2, u kojoj: R<1>je metil grupa; R<2>i R<3>svaki od njih je nezavisno odabran iz grupe koju čine: (A) vodonik, i (B) prava ili razgranata alkil grupa, sa 1 do 4 atoma ugljenika, koja je mono- ili disupstituisana sa delovima koji su nezavisno odabranim iz grupe koju čine: (i) CONH2i (ii) OH; i R<4>je trifluorometoksi grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.;

4. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, 2 ili 3, čija je apsolutna stereohemija dalje prikazana u formuli I<*>:

5. Jedinjenje, prema zahtevu 1, 2, 3 ili 4, odabrano iz grupe koju čine: (a) (S)-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo [ 1, 2- a] imidazol-3 -sulfonilamino] -propionamid;(b) S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-A<r->(2-hidroksi-2-metil-propil)-propionamid; (c) (S)-2-[(R)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-5-(4-trifluorometoksi-benzil)-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-ct:]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamid; i (d) (S)-N-karbamoilmetil-2-[(R)-5-(4-cijano-benzil)-7-(3,5-dihloro-fenil)-5-metil-6-okso-6,7-dihidro-5//-imidazo[l,2-a]imidazol-3-sulfonilamino]-propionamid; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje, prema zahtevu 1, 2, 3, 4 ili 5, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

7. Jedinjenje, prema zahtevu 1, 2, 3, 4 ili 5, upotrebljeno kao medikament.

8. Upotreba jedinjenja, prema zahtevu 1, 2, 3, 4 ili 5, za pripremanje farmaceutske kompozicije za lečenje inflamacije ili inflamatornog stanja pacijenta.

9. Upotreba, prema zahtevu 8, pri čemu stanje koja treba da se leči (tretira) jeste, respiratorni distres sindrom kod odraslih, šok, kiseonična toksičnost, sindrom multipne organske povrede, pratilac septicemije, sindrom multipne organske povrede, pratilac trauma, reperfuziona povreda tkiva zbog kardiopulmonarnog bajpasa, infarkt miokarda ili upotreba sa tromboliznim sredstvima, akutni glomerulonefritis, vaskulitis, reaktivni artritis, dermatoza sa akutnim inflamatornim komponentama, moždani udar, toplotna povreda, hemodijaliza, leukafereza, ulcerativni kolitis, nekrotizirajući enterokolitis ili sindrom povezan sa granulocitnom transfuzijom.

10. Upotreba, prema zahtevu 8, pri čemu stanje koja treba da se leči (tretira) jeste, psorijaza, odbacivanje transplantata organa/tkivo, grafit prema reakciji domaćina, ili autoimunska oboljenja, uključujući Raynaud-ov sindrom, autoimunski tiroiditis, dermatitis, multipna skleroza, reumatoidni artritis, dijabetes melitus zavisan od insulina, uveitis, inflamatorno oboljenje creva, uključujući Kronovu bolest, ulcerativni kolitis ili sistemski lupus eritematozus.

11. Upotreba, prema zahtevu 8, pri čemu stanje koja treba da se leči (tretira) jeste astma.

12. Upotreba, prema zahtevu 8, pri čemu stanje koja treba da se leči (tretira) jesu toksični efekti citokinske terapije.

13. Postupak za pripremanje jedinjenja formule I, prema zahtevu 1, koji se sastoji u reakciji jedinjenja formule IX pri čemu je R<4>definisano kao u zahtevu 1, sa jedinjenjem formule X pri čemu su R<1>, R<2>iR<3>definisani kao u zahtevu 1, radi dobijanja jedinjenja formule I.

14. Postupak, prema zahtevu 13, na osnovu kojeg se jedinjenje formule IX dobija prema postupku, u kojem jedinjenje formule II u kojoj je R<4>definisano kao u zahtevu 13, reaguje sa Grinjarovim reagensom, pa zatim sa SO2i JV-hlorosukcinimidom, radi dobij anj a jedinjenja formule IX.